CN101137907A - 利用荧光测量产生脂质分布的测定 - Google Patents

Abstract

本发明涉及对于样品溶液产生脂质分布的方法。所述方法包含：利用荧光分析确定样品的第一等分部分中总脂蛋白浓度的第一步骤；利用荧光分析确定样品的第二等分部分中总胆固醇浓度的第二步骤；和任选地利用荧光分析确定样品的第三等分部分中HDL浓度的第三步骤。总脂蛋白以及总胆固醇的浓度可以用于计算其它脂质成分并从而产生脂质分布。本发明也涉及可以用于实施本发明方法的装置。

Description

利用荧光测量产生脂质分布的测定

本发明涉及用于区别样品混合物中不同类别脂质分子的测定系统。特别地，本发明涉及确定血浆或血清中特定的脂质浓度的方法，以便产生脂质分布。本发明还涉及实施所述方法所用的装置。

脂质是有生命生物中存在的多种组的有机化合物。它们在水中是不溶的，但是可溶于有机溶剂。将脂质广泛分类成两个类别：(i)复杂脂质；和(ii)简单脂质。复杂脂质是长链脂肪酸的酯并且包括甘油酯类、糖脂类、磷脂类、胆固醇和蜡。不含有脂肪酸的简单脂质，包括类固醇(例如，胆固醇)和萜类。

脂质可以与蛋白质结合形成脂蛋白，其形式为其中诸如胆固醇和甘油三酯的脂质，在血液和淋巴中被输送。血浆中发现的脂蛋白属于三个主要分类：(i)高密度脂蛋白(HDL)，(ii)低密度脂蛋白(LDL)，和(iii)极低密度的脂蛋白(VLDL)，以及中间密度脂蛋白(IDL)。为了简洁，在这里使用术语“血清”，但是涉及“血浆”应当解释为涉及血浆或血清。

充分记载的是，在血浆中多种脂蛋白的浓度和动脉粥样硬化风险之间存在有力的关系，即有害斑块在血管壁上的发展可以导致心脏病发作。同样已知，不同类别的脂蛋白(HDL、LDL和VLDL)在动脉粥样硬化中各自起不同的作用。例如，将HDL认为是抗致动脉粥样化的(anti-atherogenic)，而已知LDL是高度致动脉粥样化的(它携带的胆固醇与动脉粥样硬化的发展密切相关)。VLDL被认为是轻微致动脉粥样硬化的，而且在女性中更显著。

因此，关于多种脂质成分的每一种(胆固醇，甘油三酯和脂蛋白，特别是LDL)在血液中的相对浓度的知识将是有利的，因为这将在治疗具有这些不适当的脂质血液浓度的患者中帮助临床医生。应当理解，具有患者脂质分布的知识对于临床医生将是最有利的。

已经开发了用于确定血液中一些脂质成分浓度的测定。这样的测定通常涉及首先从患者取血样，然后将其送到临床实验室用于分析。这样的测定必须利用昂贵的装置进行，并且需要相当长的时间以产生结果。这耽误治疗。而且，所述测试是复杂的，并且因此是昂贵的。另外，在实验室中使用的装置不容易便携，并且因此不能由GPs或护士在出诊时使用，或者甚至作为家用测试试剂盒使用。已经开发了试图在“治疗点(point of care)”再生实验室测定的装置，但是这些已经证明是昂贵的并且需要熟练的使用者操作。因此，存在提供用于分析血清中脂质分布的改进方法，以及用于实施这些方法的简单并相对便宜设备的需要。

血清是多种蛋白质的复杂混合物，并且虽然分离并直接测量不同类别脂蛋白浓度的方法是已知的，但是这样的方法是复杂而昂贵的。因此，广泛用于临床实验室的脂蛋白测定方法的一种方法是间接方法，其中重要的LDL浓度是利用Friedewald方程由总胆固醇浓度、甘油三酯浓度和HDL浓度的测量计算的：-

(CH-LDL)＝CH-(CH-HDL)-TG/5

其中CH是总胆固醇浓度、(CH-LDL)是胆固醇LDL浓度、(CH-HDL)是胆固醇HDL浓度，并且TG是甘油三酯浓度(包括背景水平的游离甘油)。

在可以计算LDL浓度以前，必须首先确定HDL、总胆固醇和甘油三酯的浓度。应当理解HDL、胆固醇或甘油三酯浓度测量中的任何误差将在LDL浓度的计算中复合。另外，常规的甘油三酯浓度测量不区别甘油三酯和游离甘油，其浓度可以改变，将进一步的误差引入到LDL浓度的计算中。因而，LDL浓度的计算固有地包括误差，其可以是非常显著的。这样的误差是在例如监控广泛使用的LDL减少的治疗(诸如饮食、药物等)的发展中的特别问题，其中必需精确监控相对小的LDL浓度的减少(一般数个百分点的级别)，同时甘油三酯水平可以显著变化。这在治疗具有冠心病史的患者中是特别尖锐的。

测定血清的脂蛋白浓度的备选方法公开在WO01/53829A1中。该文件涉及特别的有机发光体，4-二甲基氨基-4′-二氟甲基-磺酰-苯亚甲基-苯乙酮(DMSBA)，作为荧光探针的使用。所述探针的公式，确定为K-37，给定如下：-

探针K-37在水中不发光，但是在脂蛋白水溶液诸如血清中是高度发光的。特别是，荧光强度高度依赖于血清的脂蛋白含量并因而可以将K-37用作荧光探针以测量可能存在的脂蛋白浓度，即，当结合到脂蛋白的脂质并在适当辐射波长激发时K-37发荧光。因此，脂蛋白混合物的时间分辨荧光衰减的测量可用于直接产生关于存在于那个混合物中的不同脂蛋白(LDL，和VLDL)的相对浓度的信息。

然而，利用K-37时间分辨荧光衰减的问题是它的测量是复杂的并且需要昂贵的装备。而且，它涉及所产生数据的高度专业的计算机分析，其对于正确解释可能是耗时的。因此，当希望决定治疗过程时，使用K-37时间分辨的荧光衰减以确定血液中脂质成分浓度对于临床医生具有严重的限制。

因此，即使存在通过利用具有探针K-37的时间分辨荧光分析而有效确定样品中特定脂蛋白浓度的方法，应当理解该方法具有许多限制。

当临床医生希望获得全面的脂质分布时，重要的是定量胆固醇以及脂蛋白。胆固醇主要以LDLs形式在血流中输送，并且利用肝中的LDL受体从血液中被除去。LDL受体的缺乏，作为一些个体中的遗传缺陷而产生，被认为是受影响个体血液中高胆固醇水平的原因，使他们易于患动脉粥样硬化。

Liebermann-Burchard(L-B)反应测定是测量血液中总胆固醇的众所周知方法，并且被认为是“金标准”。在典型的L-B测定中，首先制备反应试剂(例如由30％冰醋酸、60％乙酸酐、和10％硫酸组成)。其次，然后将5ml该L-B试剂加入到0.2ml由血浆获得的样品，将其混合在一起然后进行放置20分钟。L-B反应通常在包含已经从血浆被萃取到有机溶剂中的胆固醇的样品上进行。L-B反应的产物是两种显色产物，其利用常规吸光度测量可以测量。然后利用分光光度计测量所述产物的吸光度，其浓度与胆固醇浓度相关。可以利用胆固醇标准物，从吸光度对胆固醇浓度的校正曲线确定胆固醇的总浓度(Burke等，Clin.Chem.20(7)，794-801(1974))。

然而，L-B反应测定的问题是它需要相对大量的试剂，这是一个明显的缺点，因为所述试剂是非常具有腐蚀性的并需要特殊关注。通常也需要将胆固醇从血浆萃取并且该萃取步骤构成测定中麻烦的额外步骤。因此，L-B反应测定在许多实验室中已经由酶联测定取代，因为在L-B反应测定中需要相当大量的样品数量并且使用腐蚀性试剂。然而，用于确定总胆固醇浓度的这样的酶-联测定的使用趋向于更容易和更安全地进行，但是不如L-B测定精确。因为产生的结果是不太精确的，所以临床医生将优选L-B反应测定准确度，特别是对于具有更高冠心病危险因素的个体确定治疗过程时。

因此，即使存在测定血液样品中胆固醇浓度的有效方法，应当理解这些方法也具有许多限制。

因此本发明实施方案的目的是用现有技术排除或减轻所述问题，并且提供用于确定个体的脂质分布的改进方法。这样的方法包括测量取自个体的样品中至少总脂蛋白和胆固醇浓度的改进手段。进一步的目的是提供用于实施所述方法的装置。

根据本发明的第一个方面，提供产生包含在样品内的脂质分布的方法，所述方法包含下列步骤：-

(i)利用荧光分析确定样品的第一等分部分中总脂蛋白的浓度；

(ii)利用荧光分析确定样品的第二等分部分中总胆固醇的浓度；和利用总脂蛋白以及总胆固醇浓度以产生脂质分布。

所谓术语“总脂蛋白”，我们指的是样品中至少VLDL、HDL、LDL、IDL和乳糜微粒的集合浓度。

所谓术语“总胆固醇”，我们指的是样品中胆固醇的总浓度。

所谓术语“脂质分布”，我们指的是样品中脂质成分(即总脂蛋白和总胆固醇)的浓度或相对浓度。

因此，根据第一方面的方法确定样品中总胆固醇和总脂蛋白(VLDL、HDL、LDL、IDL、和乳糜微粒)的浓度。假设存在于样品中的大多数脂质结合脂蛋白。因此，假设样品中总脂蛋白浓度等于样品中总脂质(TL)的浓度。

所谓术语“总脂质”(TL)，我们指的是样品中脂质成分(即总胆固醇和甘油三酯)的总浓度。

假设总脂质浓度(TL)等于甘油三酯浓度加上总胆固醇及其酯的浓度。因此，可以从下列方程计算样品中的甘油三酯的浓度：-

TG＝[TL]-[CH]

其中CH是总胆固醇浓度，TL是总脂质浓度，并且TG是通过从总脂质浓度(其等于总脂蛋白浓度-步骤(i))减去总胆固醇浓度(步骤(ii))的甘油三酯浓度。

临床研究室中进行的常规测试不测量总脂蛋白。因此，通常，需要首先确定它，然后将胆固醇浓度加到甘油三酯浓度以确定总脂蛋白浓度。然而，根据本发明的方法的发明人已经发现，临床实验室中甘油三酯的常规测量受显著(substantial)误差影响，因为它依赖在血液中天然循环的甘油的测量。因此，有利地是，根据本发明的方法不受该误差的影响，因为利用步骤(i)直接测量脂蛋白颗粒的数量(体积)以确定等于总脂质浓度的总脂蛋白浓度。因此，消除了由样品中循环的甘油所引起的甘油三酯浓度误差。

所述样品可以是需要其脂质分布的食品。优选地，所述样品是可以从要测试的受试者获得的生物样品。所述“受试者”可以是哺乳动物并且优选是人受试者。所述样品可以包含任何生物学流体，例如，血清或血浆，或淋巴。特别优选的是，所述样品包含血清。

步骤（i)

根据第一方面的方法的步骤(i)包含将探针物质加入到样品的第一等分部分，所述探针物质结合所述脂蛋白，并且当结合于此时，在适当的激发下发荧光。

优选所述探针物质是K-37。本发明人已经开发了简化测定，所述测定基于将K-37用于测量生物分子中的脂蛋白，当临床医生希望迅速并有效获得脂质分布时，所述测定是特别有用的。为了利用K-37荧光测量确定血样中总脂蛋白(即HDL，LDL，和VLDL)的浓度，本发明人认识到将优选，来自结合到多种脂蛋白类别的探针物质的荧光应答必须对于给定的总脂蛋白浓度，即不考虑它的组成(即样品中HDL∶LDL∶IDL∶VLD的比率)的总脂蛋白浓度基本上是相同的。因此，优选在这样一种方式中使用K-37，来自探针物质的荧光强度的响应在脂蛋白分子的浓度范围内基本上是线性的，所述脂蛋白分子的浓度范围是从临床测试中将遇到的样品所预期的。

虽然本发明人不希望受限于任何假设，但是他们相信来自探针物质的荧光强度将取决于它对于样品中特定脂蛋白分子(HDL、LDL、IDL或VLDL)的亲合性，取决于脂蛋白分子络合物内环境的荧光量子收率，以及由压紧在一起的探针分子之间的能量传递所引起的荧光猝灭的程度。因此，本发明人推断，可能可以选择适合的探针物质浓度，通过简单的荧光测量，可以将所述探针物质用于进行总脂蛋白的精确测量。本发明人还认识到，与对于HDL具有更高亲合性的VLDL和LDL相比，这样一种浓度的探针将优选地平衡HDL中K-37的更高量子收率，和因此在HDL内更高的猝灭程度，以在全部脂蛋白颗粒上产生恒定的荧光信号响应。

本发明人因此进行一系列实验以研究是否可以获得探针物质K-37的荧光和各自脂蛋白颗粒类型(HDL、LDL和VLDL)的脂蛋白浓度之间跨越真实血清样品中遇到的脂蛋白浓度范围的线性和相等的关系。令他们惊奇的是，他们发现存在K-37的限定浓度，在所述浓度在K-37的荧光和脂蛋白浓度之间存在线性关系。

因此，优选通过将0.1mM-1.0mM之间的K-37加入到样品的第一等分部分而测量样品溶液中总脂蛋白浓度，所述K-37结合到样品中的脂蛋白，并且当其如此结合时在适当的激发下发荧光；并且利用荧光分析确定样品中的总脂蛋白浓度。

有利地，在0.1-1.0mM的K-37浓度，总脂蛋白浓度的更精确测定是可以的，因为从荧光测量的分析意外地获得显著更少的信号失真。

适合地，加入到样品的K-37浓度可以在近似0.2-1.0mM之间，更适合地在近似0.3-0.9mM之间，并且甚至更适合地在近似0.5-0.8mM之间。优选地，加入到样品的K-37浓度近似在0.65-0.75mM之间。0.65mM的K-37是优选的浓度并且特别地优选的浓度约是0.7mM的K-37。本发明人已经发现，虽然当测定含有蛋白质的生物样品时，0.7mM表示该探针的优选浓度，但是0.65mM的K-37在许多实验条件中是有用的。

因此，在一种优选实施方案中，将近似0.7mM的探针物质K-37加入到根据本发明方法步骤(i)的第一等分部分中。

优选地，步骤(i)包括在约400 nm-500nm之间，并且更优选在约420nm-480nm之间，并且甚至更优选在约440nm-470nm之间的激发波长激发样品。可以使用约为450nm的特别优选的激发波长，即使在约450-470nm之间的任何波长的激发也是特别优选的。

优选地，所述方法包含在约500-650nm之间，并且更优选在约520nm-620nm之间的发射波长观察所述荧光。可以使用约为540nm(或更高)的特别优选的发射波长，在所述发射波长可以观察到确定总脂蛋白浓度(即HDL、IDL LDL和VLDL，但是如果存在，还有乳糜微粒的浓度)的最精确读数。

步骤(ii)

用于确定样品中胆固醇浓度的常规“金标准”方法是通过利用基于吸光度测定的Liebermann-Burchard(L-B)反应测定。示意性显示L-B反应如图8所提供。

本发明人研究了L-B反应并且惊奇发现L-B反应的产物发荧光。通过在600nm或600nm左右测量带的吸光度而进行常规的L-B测定(参见图9)。然而，当在更短波长(即小于约500nm)激发吸收带时，L-B反应的产物意外地高度发荧光。图10显示L-B产物的荧光发射光谱，并且意外发现所述荧光在470-600nm范围上延伸。

因此，根据本发明的方法步骤(ii)包含将引起Liebermann-Burchard(L-B)反应的试剂加入到样品的第二等分部分中。然而，如在常规L-B反应测定中，不在600nm和更长波长测量显色产物的吸光度，根据本发明的方法的步骤(ii)包含测量荧光以确定样品中的胆固醇浓度。

优选步骤(ii)包含通过下列步骤确定总胆固醇浓度：将引起Liebermann-Burchard(L-B)反应的试剂加入到样品；和利用荧光分析确定样品中总胆固醇浓度。

该步骤(ii)的另一个好处是可以在所述方法中直接使用液体样品(例如血清或血浆)。这与常规L-B反应测定相反，在将初次样品与L-B试剂相结合以前，所述常规L-B反应测定可能需要从所述初级样品萃取胆固醇。

优选地，加入到样品的试剂导致存在于样品中的全部总胆固醇即可能存在于样品中的胆固醇及其酯的反应，其可以是与脂蛋白(例如LDL或HDL)缔合的。所述L-B试剂优选地将双键添加到样品中的胆固醇，如图8中所图解。因此，由术语“引起L-B反应的试剂”，我们指的是，当加入到含有胆固醇的样品时，引起或诱导样品中的胆固醇愈加不饱和的试剂。

步骤(ii)可以采用与一般的Liebermann-Burchard反应测定(L-B)，或可以是基于L-B反应的确定胆固醇浓度的其它测定例如本领域技术人员已知的Abell-Kendal测定(Abell等，J.Biol.Chem.195(1)p357-366)的相同试剂。然而，不在如常规L-B反应测定中的550nnm测量所述显色产物的吸光度，步骤(ii)包含测量荧光以确定样品中的胆固醇浓度。

L-B反应试剂可以包含三种不同试剂，

第一种试剂包含胆固醇溶剂。适合的胆固醇溶剂的实例包括乙酸、二噁烷、和/或氯仿。优选地，胆固醇溶剂包含冰醋酸。

第二L-B反应试剂是强酸。本发明人不希望受限于任何假设，但是相信酸进行从胆固醇萃取水的消除反应而保持更高程度的共轭。本发明人相信当根据本发明激发时，该共轭(即增加的双键的数量)发荧光。所述强酸优选是含氧酸类(X-OH)诸如磷酸(H₃PO₄)并且更优选H₂SO₄。所述酸也可以是HNO₃、H₂SeO₄、HClO₄、和HMnO₄。备选地，所述酸可以是路易斯酸诸如Al₂Cl₆、SnCl₄和FeCl₃或二氧化钛。

最优选的是，所述强酸包含硫酸，优选地，以约3-20％(v/v)的浓度，或约0.5-2.5摩尔浓度的Al₂Cl₆。

第三L-B反应试剂包含乙酸酐。优选乙酸酐对溶剂的比率是0.25∶1至10∶1之间，更优选0.5∶1至5∶1之间，并且甚至更优选1∶1至3∶1之间。在优选实施方案中，乙酸酐对溶剂的比率约是2∶1。

优选L-B试剂包含约30％(v/v)的冰醋酸，约60％(v/v)的乙酸酐，和约10％(v/v)的硫酸。

另外，L-B试剂也可以包含添加剂诸如，无水硫酸钠，或水杨酸钠等，将其用于稳定所述试剂以进行更长期的贮存。可以在约0.5-3％(v/v)的范围内添加所述添加剂。

步骤(ii)优选包含在低于约500nm并且更优选低于约470nm的激发波长处激发样品第二等分部分(即L-B反应产物)的步骤。特别优选，可以使用450nm或更短波长的激发波长，以便引起L-B反应的产物发荧光。

然后可以在500-650nm之间并更优选在520-600nm之间的发射波长观察并测量得到的荧光。可以使用特别优选的540nm的发射波长。

因此优选的步骤(ii)包含将L-B试剂(例如约30％(v/v)的冰醋酸、约60％(v/v)的乙酸酐和约10％(v/v)的硫酸)加入到样品的第二等分部分；在大约450nm激发样品并且在约540nm或以上的发射波长测量荧光。

测量L-B反应产物的荧光而不是如常规方法中测量它的吸光度的优点是需要更小体积的试剂。这是特别有利的，因为L-B测定的试剂是非常具有腐蚀性的，并因此对使用有危险。因此，减少所述方法的步骤(ii)的荧光测定中需要的试剂量对于技术人员而言是比常规L-B吸光度测定更安全的。利用较小体积的试剂也意味着可以使用更小的装置进行所述测定。另外，测量荧光比测量吸光度更灵敏。因此，利用荧光进行比测量吸光度更精确的胆固醇浓度的测定是可能的。

应当理解，在根据本发明方法的步骤(i)中用于确定总脂蛋白浓度以及在所述方法的步骤(ii)中确定总胆固醇浓度的激发波长在两个情况中都是450nm。另外，用于两个测量的发射波长都是540nm。因此，可以同时并且迅速地确定两个参数(总胆固醇和总脂蛋白)。这是超过常规测定的显著改善，所述常规测定必须分别进行而引起结果产生的延迟。另外，可以同时测量两个参数的事实也简化了需要进行所述测量的装设仪器。这便于装置的设计，如下所述，其可以在外科中乃至在家产生脂质分布，并且避免在专用实验室中测定样品的需要。

因此，应当理解，根据本发明的方法可以利用步骤(i)用于迅速并精确测定样品中的总脂蛋白的浓度，以及利用步骤(ii)测定样品中的总胆固醇及其酯的浓度。另外，如上所述可以通过从总脂蛋白浓度减去总胆固醇浓度而计算甘油三酯的浓度。因此，从而产生样品的更详细脂质分布，所述脂质分布由总脂蛋白浓度、总胆固醇浓度以及甘油三酯浓度组成，其对于临床医生将是有用的。

本发明第一方面的方法的其它的实施方案可以包括下列：步骤(iii)：样品中脂蛋白类型之间的鉴别

本发明人认识到，如果他们可以采用鉴别测试样品中脂蛋白的其它的测定步骤，则可以获得更详细的脂质分布。因此，本发明人研究了除K-37以外的探针物质的使用以观察是否可以鉴别多种脂蛋白分子。他们惊奇地发现许多染料将结合到脂蛋白并且将取决于特定的脂蛋白结合而显示不同的荧光响应。用这些染料的荧光测量使鉴别存在于样品中的脂蛋白类型成为可能。这通过下列比较而进行，将由脂蛋白混合物中一种类型的脂蛋白所引起的增强的或减少的荧光与从校准曲线确定的另一个脂蛋白(不存在特定性质的脂蛋白)预期的荧光和由步骤(i)的K-37测定给出的总脂蛋白含量的已知值进行比较。

例如相比于其它脂蛋白诸如LDL和VLDL，荧光染料尼罗红(Nile red)在HDL中显示显著更高的荧光。因此，本发明人认识到，可以将第二探针物质(例如尼罗红，或对于特定脂蛋白显示专一性、或荧光增强或减少的任何其它亲脂性探针)用于鉴别样品中的脂蛋白类别或亚类。在已经根据步骤(i)确定总脂质浓度以后，这是可能的。

因此本发明的方法还可以包括下列步骤：

(iii)利用荧光分析确定样品的第三等分部分中脂蛋白的特定类别或亚类的浓度。

步骤(iii)优选包括利用第二探针由特异于该脂蛋白的染料的荧光响应移位(shift)而确定脂蛋白特定类别或亚类的浓度。

可以将第二探针物质加入到样品的第三等分部分，其探针结合到脂蛋白的特定类别或亚类并且当其结合到那里时，在适当激发下更改荧光产率，其指示脂蛋白的特定类别或亚类的浓度。

优选步骤(iii)包含将探针尼罗红加入到样品的第三等分部分，然后利用来自所述方法步骤(i)的结果以确定样品中的HDL浓度。

优选地，为了利用尼罗红确定样品中HDL浓度，由于HDL的存在，必须对来自尼罗红的过量荧光进行计算。首先，通过K-37荧光与脂蛋白浓度(如通过步骤(i)确定)的线性相关而测量总脂蛋白浓度(测量“A”)。

第二，然后在多种浓度将尼罗红荧光与LDL(和/或VLDL，因为荧光对于浓度响应必须基本相同)校准以获得具有斜率“X”和截距“Y”的校正曲线。技术人员将知道如何制备LDL(和/或VLDL)的浓度范围，并且对于每个浓度确定各自的荧光。

第三，然后对于HDL的一系列浓度和LDL的恒定浓度构建另外的校正曲线以产生斜率“Z”。第四，已知来自K-37测量的总脂蛋白浓度“A”和未知样品的过量尼罗红荧光“B”，未知样品中的HDL浓度“C”可以通过下列方程确定：-

C＝(B-(AX-Y))/Z

应当理解，在本发明的实施中，可以使用那预制备的或标准的校准曲线。而且，为了产生脂质分布而开发的装置(见下文)可以具有内标和/或具有将在没有用户介入的情况下允许自动计算HDL水平的处理手段。

因此，根据本发明的方法还可以包含利用荧光分析确定样品中的HDL浓度。所述方法包含另外步骤(步骤(iii))，其中将探针物质尼罗红加入到样品的第三等分部分，其探针结合到HDL及其它脂蛋白。在适当的激发下，与样品中HDL的浓度成比例，尼罗红越来越强烈地发荧光。当在本发明方法中进行此另外的步骤时，可以产生甚至更详细的样品的脂蛋白分布，所述脂蛋白分布由总脂蛋白浓度和HDL浓度组成，其将在受试者的临床评价中是非常有用的。

本发明人进行一系列实验以确定应该加入到样品的尼罗红的最佳浓度，以改善样品中HDL测定的准确度，并且这需要相当大的创造性。因此，加入到样品的探针物质尼罗红的浓度可以是近似0.1-1mM之间。有利地，在这个浓度的尼罗红，更精确的HDL浓度的浓度测定是可能的。

适合地，加入到样品的第三等分部分的尼罗红浓度可以在大约0.1-0.9mM之间，更适合地，在大约0.2-0.7mM之间，并且甚至更适合地，在大约0.3-0.6mM之间。特别地优选的是将尼罗红加入到样品至终浓度约为0.4mM。

优选尼罗红的荧光是通过在约400nm-650nm之间的激发波长激发样品而诱导的。

优选所述激发波长是400nm-650nm；优选在约420nm-620nm之间，更优选在约500nm-610nm之间并且甚至更优选在约590nm-610nm之间。关于尼罗红，可以使用约600nm的激发波长，当与其它的脂蛋白相比较时，其在来自HDL的尼罗红的荧光响应之间得到最大的鉴别(5X)。

然后可以观察得到的来自尼罗红的荧光，并且将其在约540-700nm之间并且更优选在约570-650nm之间的发射波长测量。可以使用约620nm的优选发射波长，在那里可以观察对于确定HDL浓度最精确的读数。

因此，应当理解可以使用荧光测量用于确定HDL、总脂蛋白以及总胆固醇的浓度。可以通过在非常类似的波长范围内激发和测量荧光，同时并迅速确定全部三个参数(总胆固醇、总脂蛋白、和HDL)。如上所述，这是超过常规测定的显著改善，所述常规测定必须分别并且经常在专用实验室中进行，引起结果产生的延迟。另外，可以同时测量全部三个参数的事实显著简化了进行所述测量所需要的装设仪器。

人血清白蛋白对于脂蛋白测定的影响

本发明人研究了是否可以进一步改善用于根据本发明的方法的步骤(ii)和(iii)单独测定的准确度，并且如此将它们的关注转到人血清白蛋白(HSA)，所述人血清白蛋白是血清的主要成分，具有大约30-50mg/ml的浓度。

已知HSA具有至少两种类型的能够结合多种配体的结合位点。第一类型在这里指的是“疏水性域”，而第二类型的域在这里指的是“药物结合域”。这些域是本领域技术人员已知的并且在Nature StructuralBiology(V5p827(1998))的论文中相互进行了区分。该论文将疏水性域确定为脂肪酸可以结合的域，而所述药物结合域能够结合许多可以与HSA缔合的药物。

从他们的实验，本发明人意外地确定，探针物质K-37和尼罗红可以独立地都结合至HSA的疏水性结合位点/域。因此，K-37和尼罗红都是HSA的配体。另外，意外地是，本发明人发现当结合到HSA时，K-37和尼罗红发荧光。因此，虽然本发明人不希望受限于任何假设，但是本发明人相信当结合至HSA时该另外的K-37荧光可以引起显著的背景信号，其可以失真并在根据本发明的方法的步骤(i)中的总脂蛋白浓度测定中产生显著误差。类似地，本发明人相信当结合至HSA时，该另外的尼罗红荧光可以引起显著的背景信号，其可以失真并且当将步骤(iii)用于根据本发明的方法时在HDL浓度测定中产生显著误差。

结果，本发明人研究了抑制配体K-37和配体尼罗红与HSA结合的影响。特别是，他们尝试封闭HSA的疏水性结合位点，在所述位点探针K-37和尼罗红结合并发荧光。该工作描述在实施例3和4中。虽然本发明人不希望受限于任何假设，但是出乎他们的预料，他们发现，当结合至所述脂蛋白分子(HDL、LDL、VLDL)时，抑制所述配体K-37与疏水性结合位点的结合导致探针物质的荧光，相比于如果不添加配体结合抑制剂，这是样品中总脂蛋白浓度的更精确测量。本发明人也发现抑制配体尼罗红对于HSA的结合改善HDL测定的准确度。

因此，优选根据本发明的方法包含将配体结合抑制剂加入到样品的第一等分部分，并且如果适当，加入到样品的第三等分部分，所述配体结合抑制剂适合于基本上抑制所述探针物质(K-37和/或尼罗红)对于HSA并且优选其疏水性结合位点的结合。特别优选的是，在将所述探针加入到样品之前或同时，也将配体结合抑制剂加入到样品中。

所述配体结合抑制剂可以是疏水性的。所述抑制剂可以是两亲性的(amphipathic)。配体结合抑制剂可以包含脂肪酸或其功能衍生物，以及其它疏水性分子。可以封闭HSA疏水性结合位点的适合的脂肪酸衍生物实例可以包含脂肪酸、它的酯、酰卤、羧酸酐、或酰胺等。优选的脂肪酸衍生物是脂肪酸酯。

脂肪酸或其衍生物可以包含C₁-C₂₀脂肪酸或其衍生物。优选所述脂肪酸或其衍生物可以包含C₃-C₁₈脂肪酸或其衍生物，更优选，C₅-C₁₄脂肪酸或其衍生物，并且甚至更优选，C₇-C₉脂肪酸或其衍生物。

特别优选的是，所述配体结合抑制剂包含辛酸(C₈)或其衍生物，例如，辛酸盐(酯)。优选地，将所述配体结合抑制剂作为碱金属辛酸盐加入，优选I族的碱金属辛酸盐，例如，辛酸钠或辛酸钾。

优选地，在进行所述方法的步骤(i)之前，将约10-400mM之间，更优选约20-200mM之间，并且甚至更优选约50-150mM之间的配体结合抑制剂加入到样品。特别优选的是，加入约100mM的抑制剂。因此，在所述方法的优选实施方案中，可以在进行步骤(i)以前或同时将约100mM的辛酸钠加入到样品。

当本发明的方法也延伸至步骤(iii)中尼罗红的用途时，优选将约10-400mM之间，更优选约20-200mM之间，并且甚至更优选约50-150mM之间的配体结合抑制剂加入到样品。最优选的是使用约100mM的抑制剂。因此，在所述方法的优选实施方案中，优选将约100mM的辛酸钠加入到样品的第三等分部分，之后加入尼罗红并进行根据所述方法的HDL测定。

在本发明的优选实施方案中，将配体结合抑制剂，例如，约100mM辛酸钠和大约0.7mM的K-37探针首先加入到取自所述样品的第一等分部分，之后进行所述方法步骤(i)中总脂蛋白浓度的荧光测量。在涉及HDL测定的实施方案中，将配体结合抑制剂，例如，约100mM辛酸钠与大约0.4mM的尼罗红探针首先加入到第三等分部分，之后进行所述方法中的HDL浓度的荧光测量。

有利地，与确定浓度的K-37探针组合的配体结合抑制剂导致获得高度精确的总脂蛋白测量(以及当加入尼罗红探针时的HDL浓度)，其又改善随后计算期间的甘油三酯测定的准确度(见下文)。

本发明人另外发现了尼罗红也与上面参考的HSA上的药物结合域相互作用。该药物结合域的配体包括药物分子诸如：甲状腺素、布洛芬、安定、甾类激素和它们的衍生物(药物)、血红素、胆红素、亲脂性前药、丙酮苄羟香豆素(warfarin)、基于香豆素的药物、麻醉药、安定、布洛芬和抗抑郁药(例如硫代黄嘌呤(thioxanthine))。

本发明人发现了试剂可以用于封闭该药物结合域而且这导致用尼罗红的测定结果的进一步改善。上述药物，或对于该域具有亲合性的任何其它分子可以用作用于封闭HSA的药物结合域的试剂。然而最优选的是，将苯甲酸或其衍生物(例如三氯苯甲酸或三碘苯甲酸)用于封闭所述药物结合域。因此最优选的步骤(iii)也包括加入用于封闭HSA药物结合域的试剂。

实施例1和4说明染料K-37的荧光测量如何可以用于确定样品中总脂蛋白的浓度，和尼罗红荧光测量如何可以用于确定样品中HDL浓度。两种染料都可以在450nm波长激发，并且可以在540nm或更长的波长测量所述染料的发射。实施例3和4也描述了用配体(K37或尼罗红)结合抑制剂封闭HSA以便改善由K-37和尼罗红荧光产生的结果准确度。

另外，实施例2描述了L-B测定产物的荧光测量(即，非吸光度)如何可以用于确定样品中总胆固醇浓度。幸运地是，当用K-37和尼罗红时，L-B反应产物也可以在450nm的波长激发。另外，当用K-37时，也可以在540nm测量它的发射。因此，本发明人认识到产生单一方法用于分析患者血样的脂质组成，以便产生该患者的脂质分布是可能的。

因此，优选的方法由两种或三种荧光测定(步骤(i)、(ii)和(iii))组成，其全部可以在非常类似的条件下进行，由此可以非常迅速地产生结果。临床医生可以使用该信息以决定某一治疗过程。本发明第一方面的方法的最优选实施方案可以包含从患者取血样，然后从血细胞分离血清。这可以通过已知技术，诸如过滤或离心来实现。然后可以将血浆分成三个等分部分，将其每个进行荧光分析以确定脂质成分的浓度。第一等分部分可以用于确定样品中总脂蛋白浓度；第二等分部分可以用于确定样品中总胆固醇的浓度；并且第三等分部分可以用于确定样品中HDL的浓度(已知来自第一等分部分的样品中的总脂蛋白)。

可以将HSA配体结合抑制剂，例如，辛酸钠加入到第一等分部分至终浓度约为100mM。优选也将探针K37加入到步骤(i)中的第一等分部分，优选至终浓度约为0.7mM。然后可以将第一等分部分在大约450nm激发，以便使所述探针发荧光。然后可以在540nm或以上的发射波长测量所述荧光。由此值，然后确定样品中的总脂蛋白(HDL、LDL、IDL和VLDL，如果存在，以及乳糜微粒)的浓度是可能的。

将L-B试剂(例如约30％(v/v)的冰醋酸、约60％(v/v)的乙酸酐、和约10％(v/v)的硫酸)加入到第二等分部分；在大约450nm激发样品；并且在约540nm或以上的发射波长测量荧光。由此值，然后确定样品中胆固醇的浓度是可能的。

可以将HSA配体结合抑制剂，例如，辛酸钠加入到第三等分部分至终浓度约为100mM。也可以将结合至HSA药物结合域的试剂诸如苯甲酸加入至1-10mM之间或者更具体而言是大约5mM的浓度。然后可以将探针尼罗红加入至终浓度约为0.4mM。然后可以将该样品在大约600nm激发，以便使所述探针发荧光。可以在大约620nm的发射波长测量所述荧光，并且由此值，然后如实施例4中所述确定样品中HDL的浓度是可能的。

通过从第一方面方法的步骤(i)的结果减去步骤(ii)的结果可以容易地计算甘油三酯浓度。因此，目前产生的脂质分布也包括甘油三酯浓度，其辅助临床医生治疗患者。因此，利用本发明的方法可以确定四个参数的值。

可以设想，如通过测定第三等分部分计算的HDL浓度是结合HDL的胆固醇浓度的直接测量。因此，在知道通过测定第二等分部分确定的总胆固醇浓度、通过测定第三等分部分确定的HDL浓度和如前面段落中所描述计算的甘油三酯浓度的情况下，然后通过将已知的值代入到Friedewald方程而计算结合至样品中的LDL的胆固醇的浓度是可能的：-

(CH-LDL)＝CH-(CH-HDL)-TG/5

其中，CH是总胆固醇浓度，(CH-LDL)是胆固醇LDL浓度，(CH-HDL)是胆固醇HDL浓度，以及TG是甘油三酯浓度。

结果，由本发明方法产生的脂质分布目前也包括结合至样品中LDL的胆固醇浓度。特别地有利的是，知道LDL胆固醇浓度，因为它是高度导致动脉粥样硬化的。因此，所述方法提供样品中脂质组成的至少五个参数的多读出(read-out)。而且，从甘油三酯浓度计算/估算CH-VLDL浓度是可能的，因为一般认为在VLDL中携带大多数甘油三酯并且VLDL的胆固醇成分是20％。这对于帮助临床医生决定适合的治疗过程是特别有利的。

除根据第一方面开发所述方法之外，本发明人也开发了用于进行所述方法的装置。

因此，根据本发明的第二方面，提供用于对样品溶液产生脂质分布的装置，所述装置包含用于进行胆固醇和脂蛋白测定的反应储器；适合于含有根据第一方面方法所需试剂的容纳装置；可操作用于激发样品以便使它发荧光的激发装置，和可操作用于检测由样品发射的荧光的检测装置。

优选地，所述装置包含用于在反应储器中混合样品和试剂的装置。

优选地，所述装置包含许多类型的储器。

第一类型的储器可以是用于含有样品并且在这里称为样品储器。可以存在单一储器，从所述单一储器可以采用样品的第一、第二和任选地第三等分部分用于进行根据本发明方法的步骤(i)、(ii)和任选地(iii)的测定。备选地，可以存在用于样品的每个等分部分的单独样品储器。应当理解，在一些实施方案中，可以设计所述装置，以便可以将样品直接引入到所述反应储器。这将避免样品储器的需要。

所述反应储器可以是第二类型的储器，其中可以进行确定样品等分部分中胆固醇和脂蛋白浓度的测定(在引入样品和试剂以后)。所述装置可以包含单一反应储器并且可以在不同样品等分部分上的反应之间清洗。备选地，可以将多种(例如单一用途)反应储器与所述激发装置进行接触。因此，对于根据本发明第一方面方法的每个步骤，可以存在一种反应储器。

所述容纳装置可以包含第三类型的储器，即试剂储器。第一试剂储器可以含有K-37染料及其它用于总脂蛋白测定的试剂(例如配体结合抑制剂)。第二试剂储器可以含有用于胆固醇测定的试剂(即L-B反应试剂)。当要确定HDL(例如利用尼罗红)时，所述容纳装置可以包含第三试剂储器，所述第三试剂储器含有尼罗红染料及其它用于确定HDL的试剂(例如配体结合抑制剂和用于封闭HSA药物结合域的试剂)。备选地，可以将用于每种测定的试剂包括在单独的容纳装置中。因此用于K-37测定的试剂可以在第一容纳装置中的第一试剂储器之内；用于胆固醇测定的试剂可以在第二容纳装置中的第二试剂储器之内；以及用于尼罗红测定的试剂可以在第三容纳装置中的第三试剂储器之内。

优选安排所述反应储器以便可以将其与激发装置进行光学接触。应该安排所述反应储器，以致从所述测定产生的荧光可以由检测装置检测。

在优选实施方案中，所述装置包含具有三个试剂储器的单一容纳装置。第一试剂储器在适合的稀释剂中含有探针物质K-37，并且还可以含有HSA配体结合抑制剂，例如，辛酸钠。第二试剂储器含有L-B反应试剂。第三试剂储器可以包含探针物质尼罗红和HSA配体结合抑制剂，例如辛酸钠并且，还有用于封闭HSA上药物结合域的试剂诸如苯甲酸。在使用中，可以将所述试剂推进到各自的反应储器(也在单一容纳装置之内)中并与样品的三个各自的等分部分混合。然后可以进行本发明第一方面方法的反应步骤(i)、(ii)和(iii)并且进行荧光测量。

所述装置可以包含阅读器，并优选地，包含适于放在与之功能通信的盒。优选地，可以将所还盒插入到，或连接到所述阅读器。所述阅读器可以包含其中插入所述盒的对接装置。所述对接装置可以是槽。因此，优选地，可以从所述阅读器除去所述盒。

所述盒可以包含或各自包含容纳装置和反应以及样品储器(如果存在)。因此，一旦已经排空所述试剂，可以从阅读器除去携带测定试剂的盒，并且用含有新的测定试剂的新盒替换。应当理解，可以将自身包含的盒(包含全部储器)容易地用作单一用途的反应盒。可以简单地从所述阅读器除去盒并用包含试剂的新盒替换，并且可以将样品等分部分配置到所述盒之内的一个或多个反应储器中。

阅读器可以包含激发装置并且优选包含检测装置。

优选地，所述装置包含适合于基于检测的荧光而确定样品中胆固醇和总脂蛋白浓度的处理装置。在优选实施方案中，所述处理装置也适合于基于荧光分析而确定样品中HDL的浓度。所述处理装置可以适合于以总脂蛋白和HDL的浓度为基础计算样品中的LDL、VLDL和IDL浓度。

所述装置可以包含用于显示样品中的胆固醇和总脂蛋白浓度并且优选地HDL浓度的显示装置，优选作为读出。例如，所述显示装置可以包含LCD屏幕，或者可以依赖于计算机以驱动和/或计算和/或显示。

优选地，所述装置是便携的，并且可以用于通过从患者取样然后在取样的部位进行所述测定而产生患者的脂质分布。

所述装置应该适合于含有样品，所述样品可以是任何生物流体，例如，血液、血清、淋巴等。

优选地，所述激发装置包含照明源，可操作用于在大约400nm-500nm照亮所述样品(用于胆固醇和K-37测定)，并且对于尼罗红测定的优选实施方案，在大约600nm。因此优选所述光源能够在约400nm-600nm之间照亮所述样品。照明源可以包含灯泡或者一个或多个LEDs并且可以利用450nm干涉滤波器和600nm的干涉滤波器改变激发波长。所述激发装置可以包含极化装置，可操作用于极化由照明源产生的光。所述激发装置可以包含适合于将光聚焦在样品上的聚焦装置。所述聚焦装置可以包含透镜。

优选地，所述检测装置包含光电二极管或光电倍增管，其优选是黄色-红色敏感的。对于胆固醇测定和K-37测定，由样品发射的荧光优选在大约500nm-650nm，并且更优选在540nm，以及更长的波长检测。检测装置应该能检测在620nm发射的荧光用于测定涉及的尼罗红。所述荧光可以用第二透镜收集，并且可以经过起偏振器。可以用截止滤波器除去散射的激发光。为了测量荧光强度，来自光电二极管的电流或来自光电倍增管的计数速率可以从安培计、伏特计或速率表模块读出。

在一个实施方案中，所述装置可以包含适合于接收两个或三个盒(即本发明方法的每个测定步骤-步骤(i)、(ii)任选(iii)用的盒)的阅读器。这样一种阅读器可以包含两个(或更多)激发装置，所述激发装置可以与每个反应储器对齐。另外，所述装置可以包含用于每个反应储器的检测装置。

所述装置也可以包含激发校正系统以便可以解释光源的波动。所述装置可以包含至少一个荧光标准，以在确定脂蛋白浓度之前用于校准。所述标准可以是内标。

因此，将所述装置配置成当所述盒进入阅读器时或其后一段时间，同时或依次检测并测量每个测定的荧光强度，从而产生由胆固醇、总脂蛋白浓度和HDL浓度组成的脂质分布。

有利地，根据第二方面的装置可以用于进行快速和容易的测定，其可以同时进行以产生来自生物流体的脂质分布。然后，具有胆固醇、脂蛋白和HDL浓度知识的临床医生可以决定有效的治疗过程。另外，所述装置是便携的并且可以由出诊的GPs或护士使用，或者甚至作为家用测试试剂盒。

所述装置可以包含荧光标准以自动校准所述仪器。

将所述装置配置成当所述盒进入阅读器时或其后一段时间，同时或依次检测并测量三个测定的每一个的荧光强度，从而产生由总脂蛋白浓度，HDL浓度和胆固醇浓度组成的脂质分布。临床医生或助理然后可以计算甘油三酯的浓度以及LDL浓度，如实施例5中所描述。

有利地，根据第二方面的装置可以用于进行快速和容易的测定，其可以同时进行以产生来自生物流体的脂质分布。然后，具有LDL、甘油三酯和HDL浓度知识的临床医生可以决定有效的治疗过程。另外，所述装置是便携的并且可以由出诊的GPs或护士使用，或者甚至作为家用测试试剂盒。

描述于此的全部特征(包括任何伴随的权利要求、摘要和附图)，和/或如此公开的任何方法或过程的全部步骤，可以以任何组合与任何以上方面相结合，其中至少一些这样特征和/或步骤是相互排他的组合除外。

为了更好理解本发明，并且为了显示本发明实施方案如何可以起作用，经由实例，现在将对附图进行参考，其中：-

图1是显示如实施例1中涉及的在HDL中三个浓度(0.4mM、0.65mM和0.9 mM)K-37的相对于总脂质浓度的荧光强度的曲线图；

图2是显示如实施例1中涉及的在LDL中三个浓度(0.4mM、0.65mM和0.9mM)K-37的相对于总脂质浓度的荧光强度的曲线图；

图3是显示如实施例1中涉及的在VLDL中三个浓度(0.4mM、0.65mM和0.9mM)K-37的相对于总脂质浓度的荧光强度的曲线图；

图4是显示如实施例1中涉及的HDL、LDL和VLDL中的0.4mM的K-37的相对于总脂质浓度的荧光强度的曲线图；

图5是显示如实施例1中涉及的HDL、LDL、和VLDL中0.65mM的K-37的相对于总脂质浓度的荧光强度的曲线图；

图6是显示如实施例1中涉及的HDL、LDL、和VLDL中0.9mM的K-37的相对于总脂质浓度的荧光强度的曲线图；

图7是显示如实施例1中涉及的一系列HDL、LDL、和VLDL混合物中0.65mM的K-37的相对于总脂质浓度的荧光强度曲线图；

图8显示如实施例2中涉及的Liebermann-Burchard反应的示意图；

图9显示如实施例2中涉及的Liebermann-Burchard反应产物的吸光度光谱；

图10显示如实施例2中涉及的Liebermann-Burchard反应产物的荧光发射光谱；

图11是显示如实施例2中所涉及的相对于胆固醇浓度的荧光强度的曲线图；

图12是显示如实施例2中涉及的确定胆固醇浓度的百分比误差的曲线图；

图13显示如实施例4中所涉及的染料尼罗红的结构；

图14是如实施例4中所涉及的相对于荧光强度的LDL浓度的校正曲线；

图15是如实施例4中所涉及的相对于HDL浓度的过量荧光的校正曲线；

图16是显示如实施例4中所涉及的相对于HDL浓度的误差的曲线图；

图17显示如实施例5中涉及的根据本发明的盒的实施方案的示意性视图；

图18显示如实施例5中涉及的根据本发明的阅读器的实施方案的透视图；

图19显示如实施例5中所涉及的插入到所述阅读器中的盒的正视图；

图20图解了，当在如实施例6中所涉及的本发明的方法中使用路易斯酸Al₂Cl₆(A)；SnCl₄(B)和FeCl₃(C)时，光源的激发光谱(Ex-黑色迹线)和L-B测定产物的发射光谱(Em-较浅的迹线)；

图21表示当在如实施例6中所涉及的分别在L-B反应中利用路易斯酸Al₂Cl₆(A)；SnCl₄(B)和FeCl₃(C)代替硫酸时，显示相对于标准胆固醇(以LDL形式)浓度的荧光强度的校准曲线图。

图22是图解如实施例7中所涉及的相对于HDL浓度的尼罗红荧光(ex460nm和em620nm)的曲线图；

图23是图解如实施例7中所涉及的相对于HDL浓度的尼罗红荧光(ex600nm和em620nm)的曲线图；和

图24是图解如实施例7中所涉及的在HDL(+辛酸盐)或HSA(+辛酸盐)存在下，在460nm和600nm的激发波长上的尼罗红荧光的光谱分析的曲线图。

本发明人进行一系列实验以便研究荧光探针对于确定血样中脂蛋白和胆固醇浓度的用途，以便产生患者的脂质分布。患者脂质分布的知识，特别是样品中LDL、甘油三酯、和HDL的水平，将在帮助临床医生决定特定的治疗过程中是有利的。然后将描述在下列实施例中的这些实验的结果用于开发根据本发明的方法和装置。

实施例1-总脂蛋白浓度的测量

本发明人研究了荧光染料K-37对于检测一系列样品中的总脂蛋白浓度(其等于总甘油三酯加上胆固醇加上胆固醇酯，因为假设全部脂质结合到脂蛋白)的应用。染料K-37对于技术人员是已知的，并且是容易利用的。首先将所述染料在确定波长激发，然后在如下所述的另一个确定波长测量荧光。将荧光强度用于计算样品中总脂蛋白浓度(即根据本发明的方法的步骤(i))。

方法

将溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中的染料K-37以不同浓度范围加入到一个浓度系列的溶解在磷酸盐缓冲液中的HDL、LDL、和VLDL。实验的目的是对于每个颗粒类型(HDL、LDL、和VLDL)在将要在真实血浆或血清样品中遇到的脂蛋白浓度范围内获得荧光和脂蛋白浓度之间的线性和相等关系。在Perkin-Elmer LS50荧光计中在450nm的激发波长和540nm的发射波长测量荧光强度。

结果

图1至3说明磷酸盐缓冲液中HDL、LDL、和VLDL中的K-37在三个浓度即0.4mM、0.65mM、和0.9mM的荧光强度对总脂蛋白浓度。对于线性拟合至每个系列(在顶部的0.4mM、在中央的0.65mM和在下面的0.9mM)显示R²值。相同数据也绘制在图4至6中，并且由K-37浓度分组。

来自实验的结论是：

1)对于全部三个脂蛋白颗粒类型(HDL、LDL、和VLDL)，R²显示在K-37浓度为0.65mM的总脂蛋白浓度和荧光强度之间存在良好的线性关系。对于LDL和VLDL中的0.9mM的K-37也观察到良好的线性关系，但是在HDL中0.9mM的K-37的线性度不太好。对于具有0.4mM的K-37的全部脂蛋白，线性度是不良的。值得注意的是，虽然它在线性度不良的浓度仍起作用，但是它是不准确的。然而，可以利用多项式拟合处理非线性度。

2)认为影响线性度的两个因素。在低染料浓度，在高总脂蛋白浓度下存在响应的平化。虽然本发明人不希望受限于任何假设，但是他们相信这因为存在可用于充分占据所述脂蛋白颗粒的染料不足而发生。在高染料浓度，随着低的总脂蛋白浓度存在一个平面响应。这是当所述染料非常接近地充满在所述颗粒中时由荧光的自猝灭所引起的。

3)当在磷酸盐缓冲液中测量时，0.65mM的K-37浓度对于跨越适当范围的全部脂蛋白颗粒类型给出了线性的和非常类似的荧光响应。

因此，然后将0.65mM的K-37加入到一系列HDL/LDL/VLDL混合物，如上所述测量荧光强度。所述数据图解在图7中。如图可以看出，总脂蛋白浓度与荧光强度是高度相关的(R²＝0.9983)，证实该浓度的K-37(0.65mM)适于总脂蛋白浓度的高度精确的测量。当将这个施加至来自患者的生物样品时，本发明人在高脂质浓度观察到一些弯曲。因而，选择0.7mM浓度的K-37作为用在血清或血浆中最理想的K-37浓度。因此，选择该浓度作为根据本发明方法所用的最适浓度。

实施例2-总胆固醇的测量

然后本发明人研究了是否可以使用荧光测量以确定样品中总胆固醇浓度(根据本发明的方法的步骤(ii))。这将与胆固醇常规测定中测量吸光度相反。

方法

根据本发明的方法类似于常规Liebermann-Burchard反应测定(L-B)，因为使用相同的试剂。图8图解了Liebermann-Burchard反应。关于图9，显示了L-B产物的吸光度光谱。可以看到，所述吸光度光谱在400和700nm之间显示广泛的吸光度范围，这是为什么用常规测定进行吸光度测量以测量样品中的胆固醇浓度。

然而，代替如常规L-B反应测定和它的变化中在550nm或600nm测量显色产物的吸光度，在本发明中，测量荧光。关于图10，显示L-B产物的荧光发射光谱。在造成显色的波长(即550nm至700nm)的激发不有助于此。然而，当选择450nm的激发波长时，因为这用于描述于此的另一个测定，所述荧光意外延伸到470-600nm的范围。

代替测量吸光度而测量荧光的优势是增加的灵敏度和减少的体积需要。目前修改的程序使用50微升的血浆和1ml的试剂。这是因为可以使用常规的1cm光程长度比色杯进行荧光测量。然而，十微升区域中的试剂体积将容易地是可能的。这不能利用吸光度实现，因为所述单元光程长度对于精确测量将是太短的(为了准确，将需要至少0.01Au的吸光度)。除非另有陈述，在Perkin-Elmer LS-50发光分光计中进行荧光测量。

总胆固醇的测量

具有0和20mM之间的总胆固醇范围的校准标准是从Chris Packard教授实验室(Glasgow)供给的特征性LDL样品制成的。将50微升的样品加入到1ml的L-B试剂，并在室温下温育5分钟(虽然较短或较长的温育时间对于成功测量可以是充分的)。利用450nm的激发波长和540nm的发射波长测量每个样品的荧光。相对于总胆固醇浓度绘制荧光，如图11中图解。相关系数R²接近1显示所述测量的高度线性度。

将拟合线的梯度用于从每个样品的荧光计算总胆固醇。真实的和测量的总胆固醇之间的百分比误差显示在图12中。所述结果显示，荧光L-B测定可以用于以非常高的准确度在从零至20mM的范围中测量血清胆固醇，所述范围覆盖来自临床样品所预期的范围。

因此，本发明人认识到，在450nm激发血样，并在540nm测量所述发射，以便同时确定样品中的总脂蛋白(所述方法的步骤(i))和胆固醇(步骤(ii))二者的浓度是可能的。作为实施例1和2中进行的实验的结果，本发明人开发了根据第一方面的方法，所述方法用于产生由样品中总脂蛋白和胆固醇浓度组成的脂质分布。这是一个超过当前可利用的测定的显著改进，所述当前可利用的测定需要使用两个完全独立的测定。

实施例3-HSA的封闭

然后本发明人还进行了优化根据本发明的方法的研究。结果，他们认识到作为血浆主要成分的人血清白蛋白(HSA)具有K-37结合并发荧光的疏水性结合位点。当结合至HSA时的这个K-37的另外的荧光引起显著的背景信号，其失真并从而引起脂蛋白分子即HDL、LDL和VLDL测量中的显著误差。他们因此决定用配体结合抑制剂诸如辛酸钠封闭HSA上的疏水性结合位点，以观察是否可以将另外的荧光最小化。设想，以这种方法抑制K37与HSA的结合将改善利用K37荧光测量获得的结果的准确度。

方法

在50mg/ml HSA存在和不存在情况下，将染料K37以0.5mM的浓度加入到总脂质浓度为5mM的LDL中。在有和没有加入0.1M辛酸钠的情况下进行测量，所述辛酸钠作为配体结合抑制剂发挥作用。

结果

对于全部样品测量荧光强度并概况在下面的表中：

样品	荧光强度
		K-37加5mM LDL	213500
K-37加50mg/ml HSA	79300
		K-37加5mM LDL+辛酸盐	209700
K-37加50mg/ml HSA+辛酸盐	3600

所述结果显示单独LDL中的K-37的荧光强度是213500单位。当辛酸盐加入到LDL时K-37的荧光强度是209700单位(即与无辛酸盐的情况大致相同)，这说明辛酸盐的存在无助于独自结合到LDL的K-37的荧光强度。结合到HSA的K-37的荧光强度是79300单位，然而在HSA和辛酸盐存在下K-37的荧光强度是3600。这说明HSA有助于K-37荧光并且因此有助于干扰信号。辛酸盐的加入显著减少所述干扰并从而消除样品中HSA的破裂作用。所述结果因此显示在辛酸盐存在下，大大抑制了K-37与HSA的荧光强度，但是对于LDL中的K37荧光的影响小。这显示辛酸盐在封闭HSA上的K-37结合位点方面是显著成功的，使K-37荧光成为总脂蛋白浓度的真实测量。

因此，本发明人相信可以结合到HSA疏水性结合位点的配体结合抑制剂诸如辛酸盐，可以在测量K-37荧光之前加入到血样以改善总脂蛋白浓度的准确性。另外，本发明人认为该技术还可以用于封闭其它配体(例如尼罗红探针)对于HSA疏水性结合位点的结合，并且用于代替可能已经结合于此的配体，所述配体与辛酸盐相比具有更低的对HSA的亲合性。在该工作之后，本发明人发现0.7mM的K37和100mM的辛酸盐是最佳的。

实施例4-HDL的测量

然后本发明人研究了是否可以鉴别血样中存在的不同类型脂蛋白。因此，他们测试了利用除K-37以外的荧光探针例如尼罗红的功效，以考察是否可以区别脂蛋白类型。令他们意外的是，他们发现通过利用尼罗红代替K-37，确定血样中HDL的浓度是可能的。

方法

测量的原则是探针尼罗红在HDL中比在LDL和VLDL中更有荧光性。尼罗红的结构图解在图13中。对于总脂蛋白，所述测量比K37测量更复杂，因为必须对来自HDL中尼罗红的过量荧光进行计算，而不仅仅是全部脂蛋白的总荧光。程序如下：-

１)校准

将溶解在二甲基甲酰胺中的0.5mM尼罗红以通常在4和10mM之间的多种总脂蛋白浓度与LDL混合(一般地，将50微升染料与50微升脂蛋白和1ml磷酸盐缓冲液混合)。将样品放在荧光计中并测量荧光强度(激发波长450nm，发射波长600nm)。将荧光强度相对于LDL总脂质浓度绘图，给出了具有斜率“X”和截距“Y”的校准直线，如图14中所示。

然后对于LDL和HDL的混合物重复所述程序。将HDL以0和3.0mM之间的浓度加入，加入LDL而对于全部样品将总脂蛋白浓度保持在5mM。然后测量这些样品的荧光强度。然后对由于HDL存在而产生的过量荧光进行绘图，给出了具有斜率“Z”的校准直线，如图15中图解。

2)未知物的测量

在用辛酸盐预处理之后的研究下，将溶解在二甲基甲酰胺中的0.5mM尼罗红与样品混合。在对于上述校准的相同条件下，将样品放入荧光计中并测量荧光强度。

3)HDL浓度的计算

HDL的计算需要知道总脂蛋白浓度“A”，其可以从K37的荧光强度测量。对于特定的样品，将要预期样品是否没有包含HDL的荧光强度是从显示在图14中显示的校准线获得的。测量的荧光强度减去该计算的荧光强度是由于样品中存在的HDL而产生的过量荧光。

然后可以利用图15中所示的校准线和下列等式获得未知样品中的HDL浓度“C”：-

C＝(B-(AX-Y))/Z

制备HDL/LDL/VLDL混合物的浓度范围，意欲包括在实际临床样品中将预期的浓度范围。将上面论述的校准数据用于计算来自所述混合物的HDL浓度。图16图解了真实HDL浓度和从尼罗红荧光确定的HDL浓度之间的误差，显示最大误差仅为大约0.15mM。

作为这些数据的结果，本发明人已经显示鉴别存在于样品中的脂蛋白类型，并且利用染料尼罗红确定HDL浓度是可能的。

在实施例3中描述的发现之后，关注于加入辛酸盐以封闭HSA的疏水性结合位点，本发明人然后观察到，尼罗红也结合到HSA(与K37相同的疏水性结合位点)并且发荧光。当结合到HSA时，尼罗红的这个另外荧光也引起显著的背景信号，其失真并从而引起HDL测量中的显著误差。他们因此决定用与用于K-37封闭相同的配体结合抑制剂即辛酸钠封闭HSA中的疏水性结合位点。用尼罗红和HSA进行的实验是基于实施例3中所论述的那些，并且全部利用0.5mM尼罗红。

样品	荧光强度
		尼罗红加5mM LDL	187.532
尼罗红加50mg/ml HSA	58.905
		尼罗红加5mM LDL+50mM辛酸盐	183.786
尼罗红加50mg/ml HSA+50mM辛酸盐	9.118
		尼罗红加PBS+50mM辛酸盐	7.382

所述结果显示单独在LDL中的尼罗红的荧光强度是187.532单位。当辛酸盐加入到LDL时尼罗红的荧光强度是183.786单位(即与无辛酸盐的情况大致相同)，这说明辛酸盐的存在未有助于独自结合到LDL的K-37的荧光强度。结合到HSA的尼罗红的荧光强度是58.905单位，而在HSA和辛酸盐存在下的尼罗红荧光强度是9.118。这说明HSA有助于尼罗红荧光并且因此有助于干扰信号。辛酸盐的加入显著减少所述干扰并从而消除样品中HSA的破裂作用。所述结果因此显示在辛酸盐存在下，大量抑制尼罗红与HSA的荧光强度，但是对于LDL中的尼罗红荧光的影响小。

这显示，辛酸盐在封闭HSA上的尼罗红结合位点是显著成功的，使尼罗红荧光成为脂蛋白浓度的真实测量。因此，本发明人相信可以结合到HSA疏水性结合位点的配体结合抑制剂诸如辛酸盐，可以在测量尼罗红荧光之前加入到血样以改善脂蛋白(HDL)浓度的准确性。在该工作之后，本发明人发现0.4mM尼罗红和50mM或更优选约100mM的辛酸盐对于血清样品的分析是最佳的。

实施例5-产生脂质分布的同时测定

实施例1和3说明染料K-37的荧光测量如何可以根据本发明方法的步骤(i)用于确定样品中总脂蛋白浓度。

实施例2描述了L-B测定产物的荧光测量(即，非吸光度)如何可以根据本发明方法的步骤(ii)用于确定样品中总胆固醇的浓度。幸运地是，当用K37时，可以在约450nm的波长激发L-B测定产物并且也可以在大约540nm或以上测量它的发射。

考虑到来自步骤(i)的总脂蛋白测量，实施例4说明尼罗红的荧光测量如何可以根据本发明方法的步骤(iii)用于确定样品中的HDL浓度。

因此，本发明人认识到产生基于单一荧光的方法用于分析患者血样的脂质组成以便产生该患者的脂质分布是可能的。优选方法由三个测定组成，它们全部可以在非常类似的条件下进行，由此，可以非常迅速地产生结果。临床医生可以使用该信息以决定治疗过程。

下列描述了本发明人如何根据本发明的第一方面开发了所述方法，以致可以从单一样品迅速产生脂质分布，对所述单一样品进行了三个同时的基于荧光的测定。

方法

首先从患者取血样，然后利用充分建立的常规技术离心以便分离血清。然后将血清分成三个等分部分(a、b&c)，将其每个进行生物化学分析以确定脂质成分的浓度。将等分部分(a)用于确定总脂蛋白浓度；将等分部分(b)用于确定胆固醇浓度；并且将等分部分(c)用于确定HDL浓度，如下所述。

等分部分(a)-将HSA配体结合抑制剂辛酸钠加入到2mlPBS至50mM的浓度，如上面实施例3中所描述。然后将25微升血清等分部分(a)加入到PBS/辛酸盐溶液。然后将溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中的探针K-37在搅拌下缓慢加入到样品至0.65mM的终浓度。然后在450nm激发样品以便引起所述探针发荧光。在540nm的发射波长测量所述荧光，并且然后由此值确定样品中总脂蛋白(HDL、LDL、和VLDL)的浓度是可能的，如上面实施例1中所描述。

等分部分(b)-将10微升血清加入到2ml的L-B反应试剂(60％乙酸酐、30％乙酸和10％硫酸)。然后在450nm激发样品以便引起L-B反应产物发荧光。在540nm的发射波长测量所述荧光，并且然后由此值确定样品中胆固醇浓度是可能的，如上面实施例2中所描述。

等分部分(c)-将HSA配体结合抑制剂辛酸钠加入到2mlPBS至50mM的浓度，如上面实施例4中所描述。然后将25微升血清等分部分(c)加入到PBS/辛酸盐溶液。然后在搅拌之下缓慢将探针尼罗红加入到样品至0.5mM的终浓度。然后在450nm激发样品以便引起所述探针发荧光。在600nm的发射波长测量所述荧光，并且然后由此值确定样品中HDL浓度是可能的，如上面实施例4中所描述。

应当理解，在类似的条件下进行全部三个等分部分的荧光测量。因此，根据本发明的方法的优点是全部三个等分部分可以用相同仪器同时分析。因此，以上方法的使用迅速产生样品中的由(a)总脂蛋白浓度、(b)总胆固醇浓度和(c)HDL浓度组成的脂质分布。

可以通过从通过测定等分部分(a)确定的总脂蛋白浓度的值减去通过测定等分部分(b)确定的胆固醇浓度的值，而容易地计算甘油三酯浓度。因此，目前产生的脂质分布也包括甘油三酯浓度，其辅助临床医生治疗患者。

在知道通过测定等分部分(b)确定的总胆固醇浓度、通过测定等分部分(c)确定的HDL浓度和如上所述计算的甘油三酯浓度的情况下，然后通过将所述值代入到Friedewald方程中而计算样品中的LDL的浓度是可能的：

(CH-LDL)＝CH-(CH-HDL)-TG/5

其中，CH是总胆固醇浓度，(CH-LDL)是胆固醇LDL浓度，(CH-HDL)是胆固醇HDL浓度，以及TG是甘油三酯浓度。结果，目前产生的脂质分布也包括样品中的LDL浓度。

实施例6-用于产生脂质分布的装置

已经说明了脂质分布可以基于三个类似的荧光测定的使用而产生，本发明人根据本发明的第二方面继续设计了可以用于产生脂质分布的装置。

关于图17-19，显示了由本发明人开发的便携装置，其可用于产生患者的脂质分布。所述装置由详细显示在图17中的盒1和显示在图18中的阅读器50组成。

盒1具有一系列互连的储器，沿着所述储器流体可以流动，以便进行根据本发明的测定。将盒1经由缝52插入到阅读器50用于对盒1中进行的这些测定的每一个检测和测量荧光强度。

关于图17，盒1具有样品储器2，其中包含取自患者的生物流体诸如血液。提供过滤器18，用于从血液除去血细胞、留下血浆或血清或其它体液，用其进行所述测定。将所述流体分成三个等分部分(根据本发明方法的第一、第二和第三等分部分)，并沿着通道分别推进到反应储器4、6、8中。

将分别含有K-37和辛酸钠的两个试剂储器10、12连接到反应储器4(K-37反应储器)。将染料和辛酸盐推进到储器4中并启动总脂蛋白测定。

试剂储器14含有用于L-B反应的试剂，并且所以当将这些推进到反应储器6中，它们与生物流体混合，并且启动胆固醇测定。

将分别含有尼罗红；和HSA封闭剂(例如辛酸钠和苯甲酸-见实施例8)的两个试剂储器16、17连接到反应储器8(用于确定HDL)。将尼罗红和HSA封闭剂推进到储器8中，与所述流体混合，并启动HDL测定。

所述盒也包括荧光标准20、22、24，可以将其分别用于校准步骤(i)、(ii)和(iii)所用的阅读器50。

将盒1插入到阅读器50前面的缝52，如图18所示。将盒1开槽到阅读器50中，引起三个反应储器4、6、8与相应的光源30、32、34以及存在于所述阅读器中的相应的检测光电二极管36、38、40各自对齐。备选地，阅读器50可以仅具有一个光源或LED，代替用于每个储器4、6、8的单独LEDs。

LEDs(或来自LED的波导管(guide))30、32、34每个提供相应的测定，用于每个测定需要的荧光激发照明以发荧光。来自LEDs 30、32的每一个光波长大约在450-470nm，而来自LED(或来自LED的波导管)34的光波长是在大约600nm。当使用白色LED时，所述光可以经过450nm或600nm的干涉滤波器(未显示)以产生正确的激发波长，之后将其定向到适当的反应储器。阅读器50可以具有激发校正系统46。因此，将三个同时测定的荧光用透镜或类似的收集光学器件收集，并且可以在540nm的波长(用于总脂蛋白和胆固醇测定)和在用于第三测定(HDL)的约620nm的波长经过起偏振器。备选地，可以将普通的起偏振器用于这两个测定。为了测量荧光强度，光电二极管36、38、40的电流输出被放大并读出为电流或电压。

因此，将阅读器50配置成保持盒1以检测并测量三个测定的每一个的荧光强度，从而产生由总脂蛋白浓度、HDL浓度和胆固醇浓度组成的脂质分布。在一个实施方案中，所述装置具有LCD读数显示42，在其上显示每一血液组分的浓度。在另一个实施方案，所述阅读器50可以由PC的USB端口、便携式电脑、PDA或移动电话26提供动力并且具有通过其提供的它的读数，使临床医生读出关于甘油三酯、HDL以及LDL的浓度信息，如实施例5中所描述。备选地，所述装置可以包含所述盒和测量仪器的两个方面并且包含可以计算每一脂质组分本身浓度的微处理器44，自动包括Friedewald方程。

所述盒1和阅读器装置50的优势在于快速并容易的测定系统，其可以同时进行以产生来自生物流体的脂质分布。然后临床医生可以具有临床重要的脂质知识(例如LDL浓度)，然后决定有效的治疗过程。

所述盒1是一次性的并且可以便宜地制造。可以用密封在适当试剂储器10、12、14、16、17之内的试剂形成所述盒1，从而避免试剂制备的不便并且甚至避免与试剂的接触。

实施例6：在步骤(ii)中使用的备选强酸

本发明人重复实施例2中描述的实验以说明，除硫酸以外的强酸可以根据本发明方法用于测量样品的第二等分部分中的胆固醇浓度。本发明人因此利用路易斯酸进行实验。

本发明人首先研究了从L-B测定产物产生的光谱，其中在所述反应中使用路易斯酸Al₂Cl₆、SnCl₄和FeCl₃代替硫酸。每个酸的终浓度是1.8M(如实施例2中硫酸)。图20图解了当使用路易斯酸Al₂Cl₆(A)；SnCl₄(B)和FeCl₃(C)时，光源的激发光谱(Ex-黑色迹线)和L-B测定产物的发射光谱(Em-较浅的迹线)。所述发射光谱等价于使用硫酸时所获得的。这说明了当进行根据本发明的测定时，其它强酸，在该情况下是路易斯酸，可以用于L-B测定。

图21表示校准曲线图，显示L-B反应中利用路易斯酸Al₂Cl₆(A)；SnCl₄(B)和FeCl₃(C)代替硫酸时，相对于标准胆固醇浓度(以LDL形式)的荧光强度。这些曲线图的线性度说明当根据本发明方法在L-B反应中使用路易斯酸时，可以获得胆固醇浓度的可靠测量。

实施例7：根据本发明方法的步骤(iii)的进一步优化

在人血清样品上进行进一步测试以研究用于诱导根据本发明方法的指示HDL水平的荧光的最佳激发波长。

本发明人测试了许多波长并且确定，当利用尼罗红时，600nm的激发波长和620nm的发射波长提供最佳结果(参见图22)。令本发明人意外的是，该激发波长是最佳的，因为它达到所述光谱的非常长波长的边缘。

对于某些样品，本发明人观察到具有460nm激发波长和620nm发射波长的更有噪声的图(参见图23)。

本发明人相信，当在600nm激发时，尼罗红在HDL中比VLDL和LDL多发约5倍的荧光，与之相反，在460nm激发时，在那里它仅多发约2倍的荧光。当从LDL加VLDL的标准曲线减去时，这为噪声提供了更好的信号。

虽然本发明人不希望受限于任何假设，但是他们相信在460nm激发时在血清样品中观察到的“噪声”是信噪比的效应。本发明人注意到尼罗红结合至HSA并且特别是在低脂质浓度。他们因此在HDL(+辛酸盐)或HSA(+辛酸盐)存在下都在460nm和600nm的激发波长进行尼罗红荧光的光谱分析(参见图24)。这些实验产生出乎意料的光谱行为，本发明人相信这可以由下列事实解释，即尼罗红是在刚性的但是是极性的环境(HSA上的结合位点)中，并且尼罗红显示扭曲的分子内电荷传递(TICT)(Joumal ofPhotochem and Photobiol A：Chemistry93(1996)57-64)，所述TICT将激发和发射移位(shift)至更长的波长。在这激发状态中的分子具有不同的偶极矩并且因此表现类似一个不同的种类。在600nm激发时，由于与其它脂蛋白相比较的HDL中尼罗红之间超过TICT状态激发补偿的较大信号差异，产生更好的信噪比，因为TICT荧光是通过620nm发射波长设置排除的。换言之，虽然我们在600nm更理想地激发HSA/尼罗红，但是它的荧光受到仪器拒绝。

这引导本发明人认识到，通过利用另外封闭剂可以进一步改进HDL/尼罗红测定。他们尝试封闭HSA药物结合域的试剂。令他们意外的是，他们发现试剂诸如苯甲酸以及它的三氯和三碘衍生物在大约5mM，全部对于取代来自HSA的尼罗红起作用，而不影响脂蛋白发荧光。苯甲酸具有猝灭溶液中尼罗红残留荧光约20％的附加优点。

实施例5-产生脂质分布的同时测定

实施例1和4说明染料K-37的荧光测量如何可以根据本发明方法的步骤(i)用于确定样品中总脂蛋白浓度。

另外，实施例2和6描述了L-B测定产物的荧光测量(即不是吸光度)如何可以根据本发明方法步骤(ii)用于确定样品中总胆固醇浓度。幸运地是，当用K37时，可以在约450nm的波长激发L-B测定产物并且也可以在大约540nm或以上测量它的发射。

而且鉴于来自步骤(i)的总脂蛋白测量，实施例4和7说明尼罗红荧光测量如何可以根据本发明方法步骤(iii)用于确定样品中HDL浓度。

因此，本发明人认识到，产生基于单一荧光的方法用于分析患者血样的脂质组成以便产生该患者的脂质分布是可能的。优选方法由三个测定组成，其全部可以在非常类似的条件下进行，由此，可以非常迅速地产生结果。临床医生可以使用该信息以决定治疗过程。

Claims (21)

1.一种产生样品溶液的脂质分布的方法，所述方法包含下列步骤：-

(i)利用荧光分析确定所述样品的第一等分部分中总脂蛋白的浓度；

(ii)利用荧光分析确定所述样品第二等分部分中总胆固醇浓度；和利用所述总脂蛋白和总胆固醇的浓度以产生脂质分布。

2.根据权利要求1的方法，其中所述样品是生物流体。

3.根据权利要求2的方法，其中所述生物流体是血清或血浆，或淋巴。

4.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(i)包含将探针物质加入到所述样品，所述探针物质结合于脂蛋白，并且当其结合于此时，在适当激发下发荧光。

5.根据权利要求4的方法，其中所述探针物质是4-二甲基氨基-4′-二氟甲基-磺酰-苯亚甲基-苯乙酮(DMSBA或K-37)。

6.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(ii)包含将Liebermann-Burchard测定(L-B)试剂加入到所述第二等分部分并在适当激发以后测量荧光。

7.根据权利要求4-6任何一项的方法，其中将基本上抑制所述探针物质对于人血清白蛋白结合的配体结合抑制剂加入到所述样品的第一等分部分，之后确定脂蛋白浓度。

8.根据权利要求7的用途，其中所述配体结合抑制剂是辛酸盐(酯)。

9.根据前述权利要求任一项的方法，所述方法还包含另外步骤：

(iii)利用荧光分析确定所述样品的第三等分部分中脂蛋白的特定类别或亚类的浓度；和

利用所述总脂蛋白；总胆固醇和脂蛋白特定类别或亚类的浓度以产生脂质分布。

10.根据权利要求9的方法，其中所述步骤(iii)包含将结合到HDL的第二探针物质加入到所述样品的第三等分部分，并且当所述第二探针物质结合到那里时，在适当的激发之下发荧光。

11.根据权利要求10的方法，其中所述第二探针物质是尼罗红。

12.根据权利要求9-11任何一项的方法，其中将根据权利要求7或8的配体结合抑制剂加入到所述第三等分部分。

13.根据权利要求9-12任何一项的方法，其中还将封闭HSA的药物结合域的试剂加入到所述第三等分部分，之后确定HDL浓度。

14.根据权利要求13的方法，其中所述试剂是苯甲酸或其盐或其衍生物。

15.根据前述权利要求任一项的方法，其中，对于每个步骤，通过在约400nm-500nm之间的激发波长激发所述样品而引起荧光，并且在约500-650nm之间的发射波长测量得到的荧光。

16.一种用于样品溶液产生脂质分布的装置，所述装置包含至少一个用于进行胆固醇和脂蛋白测定的反应储器；适合于含有根据权利要求1-15任何一项的方法所需试剂的容纳装置；可操作以激发所述样品以便使它发荧光的激发装置，和可操作以检测由所述样品发射的荧光的检测装置。

17.根据权利要求16的装置，其中所述装置包含第一反应储器，其中可以进行确定所述样品中总脂蛋白浓度的测定；第二反应储器，其中可以进行确定所述样品中总胆固醇浓度的测定；和第三反应储器，其中可以进行确定所述样品中HDL浓度的测定。

18.根据权利要求16或17的装置，其中所述装置包含阅读器和盒，所述盒包含所述至少一个反应储器和所述容纳装置。

19.根据权利要求16-18任何一项的装置，所述装置还包含处理装置，所述处理装置适合于在检测的荧光基础上确定所述样品中总脂蛋白和总胆固醇浓度并且任选地用于确定所述样品中HDL的浓度。

20.根据权利要求19的装置，其中所述处理装置可以操作用于：(a)通过从总脂蛋白的浓度减去胆固醇浓度而计算所述样品中甘油三酯的浓度；和/或(b)利用Friedewald方程计算所述样品中LDL的浓度。

21.根据权利要求16-20任何一项的装置，所述装置还包含用于显示所述样品脂质分布的显示装置。

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