CN101121043A - 一种工程化子宫组织片层 - Google Patents
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Abstract
一种工程化子宫组织片层,其特点是由子宫平滑肌细胞和基质细胞分别与凝胶材料混合后按顺序叠加而成双层结构,再在其上叠加上皮细胞,进一步形成具有类似于正常子宫壁的组织结构,包括平滑肌层、基质层和上皮层。本发明可用于子宫组织的修复,作为子宫内膜异位症的研究模型和子宫肿瘤的研究模型,同时也可以作为支持胚胎体外发育及发育生物学机制研究的体外模型。
Description
技术领域: 本发明涉及一种工程化子宫组织片层,属于组织工程领域。
背景技术: 组织工程是应用生命科学和工程学的原理与技术,在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下结构与功能关系的基础上,研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态生物替代物的科学。子宫作为雌性哺乳动物的重要生殖器官,在孕育胎儿和各种病理与生殖机制研究中占有重要地位。体外构建出子宫组织具有重要的理论和现实意义,除子宫组织修复外,还可作为子宫肌瘤和内膜异位症等病理机制的体外研究和胚胎植入机制研究提供理想的体外研究模型。鉴于子宫在生殖生理研究中的重要性,2001年美国华裔科学家刘宏清教授在体外构建子宫内膜并在其上进行人胚胎的培养引起了世界的关注。但是因为伦理问题没有报道具体的实施方案,工作也未能进行下去。2003年Park进行了体外子宫内膜肿瘤侵袭模型的研究,为体外进行相关疾病研究提供了一个借鉴。但是这些研究都只是构建了子宫内膜组织,没有平滑肌层,并非完整子宫壁结构,未能完全再现体内子宫的生理状态。本发明提供的一种工程化子宫组织片层提供了完整的子宫壁结构并能有效再现子宫的生理状态。
发明内容: 本发明是一种工程化子宫组织片层,由子宫内膜基质细胞和上皮细胞,子宫平滑肌细胞与凝胶材料复合而成。细胞与材料复合后孵箱内放置一定时间,使凝胶凝固并稳定,再加培养液培养。本发明提供的一种工程化子宫组织片层可以用于临床上子宫内膜的损伤修复,或体内移植替代缺损子宫组织,也可以用于子宫肌瘤和内膜异位症等病理机制的体外研究和胚胎植入机制研究提供理想的体外研究模型。
以下是本发明的完整描述:
1、I型胶原的制备:I型胶原参照文献制备。从大鼠尾跟部切断鼠尾,置于酒精中浸泡30-60min;无菌条件下撕下尾腱,剪碎。取尾腱碎片浸入0.1-0.5%的醋酸中,置4℃冰箱,并用磁力搅拌器进行搅拌。24-72h后离心收集上清即可得胶原溶液。制备的胶原溶液用电子天平称出其中的胶原含量约为1.0-2.5g/ml.
2、子宫片层模具的准备:将无菌细胞培养皿置于超静工作台内,细胞培养皿直径可以是35mm,60mm或100mm,在培养皿底部铺一层琼脂糖凝胶,厚度为1-4mm。静置10-30min后,将自制长方体形小槽置于细胞培养皿中部琼脂糖凝胶层上,再在细胞培养皿中铺第二层琼脂糖凝胶,厚度为3-5mm,静置10-30min后,取出长方体后,在四角距边沿1-3mm处插入四根无菌玻璃支柱,玻璃支柱的长度为5-8mm,直径为1-2mm,子宫片层模具准备完成。
3、子宫内膜上皮细胞和基质细胞以及平滑肌细胞的分离培养:取处在增生期的子宫组织,置入无菌PBS中,再用无菌PBS充分清洗以去除血污和红细胞;放入无血清DMEM培养液中,用手术刀轻轻刮取内膜,加0.01-0.25%胰酶37℃消化2-5min,用含血清的DMEM培养液终止消化,离心,用10ml含血清的DMEM培养液重悬细胞,再以低速离心5-10min,离心管内上层为富含基质细胞组分,余下的为上皮细胞组分,分别培养在5%CO2,37℃孵箱内培养,12-36h后用无血清DMEM培养液清洗两遍去除血细胞,加入新的含血清的DMEM培养液继续培养。充分刮除内膜并用无血清DMEM培养液清洗后,子宫肌层用眼科剪充分剪碎,新鲜的0.01-0.25%胰酶37℃消化2-5min,吸取消化液加入血清中终止消化,再用0.01-0.25%胰酶37℃消化2-5min,再终止,直到消化完全,离心,用含血清的DMEM培养液重悬细胞,在5%CO2,37℃孵箱内培养,12-36h后用无血清DMEM培养液清洗两遍去除血细胞,加入新含血清的DMEM培养液继续培养。5-10d后基质细胞和平滑肌细胞可进行传代培养,细胞传2-5代时状态最好可用于工程化子宫的构建。
4、 体外构建组织工程化子宫:将I型液态胶原与DMEM培养液混合,用0.1-0.5mol/LNaOH调为中性,将培养到第三代子宫平滑肌细胞与混合物混合,使其终浓度达到1×105-1×107/ml,接种于自制片层组织构建模具中。5-20min后再将第三代基质细胞与混合物混合,使其终浓度达到1×105-1×107/ml接种于混合物上。24h后将获得的原代子宫内膜上皮细胞以终浓度为1×103-1×105个腺体/cm2接种于混合物C上。30min后加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,37℃,5%CO2培养箱中培养。
5、组织工程化子宫应用于体外支持胚胎的培养:将组织工程化子宫在37℃,5%CO2培养箱中培养一段时间后,即可用于胚胎的培养。取1-细胞期或2-细胞期的正常胚胎,在组织工程化子宫片层上培养。小鼠胚胎用CZB培养基培养,兔胚胎则用M199培养基培养。每天统计发育率。
具体实施方式1
子宫片层组织的构建
将培养到1-5代子宫平滑肌细胞和基质细胞分别与凝胶材料,如液态I型胶原和ECM-gel混合,终浓度达到1×105/ml-1×107/ml,依次接种于自制片层组织构建模具中。形成下层为平滑肌层,上层为基质层的双层子宫壁结构。胶原凝固后将原代培养的子宫内膜腺上皮细胞以终浓度为1×104/ml-1×106/ml接种于双层结构上,形成三层子宫结构。30-60min后加入10%胎牛血清的DMEM/F12条件培养基,其中含有10-100nM雌激素和10-100nM孕激素,37℃,5%CO2培养箱中培养,每天换液。
本发明中的自制片层组织构建模具设计了静态力学拉伸效果,更进一步地模仿了正常子宫自然条件下的状态。通过力学刺激,工程化子宫组织片层具有典型的子宫壁三层结构,在形态学上更类似于正常子宫,内部平滑肌细胞和基质细胞排列有序,生长状态良好。功能分析显示工程化子宫组织片层具有正常子宫组织对激素的反应和表达胚胎植入相关分子的功能。
具体实施方式2
组织工程化子宫应用于体外支持小鼠胚胎和兔胚胎的培养
将工程化子宫组织片层在37℃,5%CO2培养箱中培养12-36h后,即可用于胚胎的培养。用经过激素超排处理后受孕的雌性小鼠或兔取1-细胞期或2-细胞期的正常胚胎,在组织工程化子宫片层上培养。小鼠胚胎用CZB培养基培养,兔胚胎则用M199培养基培养。每天统计发育率。结果表明工程化子宫组织片层能够明显地提高胚胎体外发育率及胚胎质量,囊胚发育率可达85%以上。
附图说明
图1组织工程化子宫片层模具示意图。图中1为琼脂糖凝胶;2为玻璃支柱;3为培养皿。
图2模具中构建的组织工程化子宫片层示意图。图中1为体外构建的工程化子宫片层。
图3构建的组织工程化子宫片层示意图。图中1为上皮层;2为基质层;3为平滑肌层。
Claims (6)
1.一种工程化子宫组织片层,其特点是由子宫平滑肌细胞和基质细胞分别与凝胶材料混合后按顺序叠加而成双层结构,再在其上叠加上皮细胞,进一步形成具有类似于正常子宫壁的组织结构,包括平滑肌层、基质层和上皮层。
2.权利要求1所述的细胞包括子宫平滑肌细胞,基质细胞和上皮细胞,可以是来源于正常和病理缺损的兔子宫组织,也可以是正常和病理缺损的人子宫组织,也可以是来源于其他哺乳动物子宫组织。
3.权利要求1所述的支架材料可以是I型胶原凝胶,ECM-gel,也可以是硫酸软骨素和壳聚糖凝胶,其中最优选的是I型胶原凝胶和ECM-gel。
4.权利要求1所述的一种工程化子宫组织片层,其底层是平滑肌层,中间层是基质层,表层是上皮层。
5.权利要求1所述的工程化子宫组织片层,在含血清的DMEM/F12条件培养基中培养,DMEM/F12条件培养基中含有10-100nM雌激素和10-100nM孕激素。
6.权利要求1所述的工程化子宫组织片层可以用于临床上子宫内膜的损伤修复,或体内移植替代缺损子宫组织,也可以作为支持胚胎体外发育及发育生物学机制研究的体外模型,用于小鼠或兔或其它哺乳动物的正常胚胎或核移植重构胚胎或单精子注射胚胎的支持培养,提高胚胎的体外发育率和发育质量。
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