CN101116744B - 组合式奈瑟球菌组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了从包括奈瑟球菌的基因组序列获得免疫原性蛋白质的方法，包括脑膜炎奈瑟球菌B的氨基酸序列和对应的核苷酸序列、以及基因组序列。这些获得的蛋白质可用作疫苗、免疫原性组合物和/或诊断用抗原。

Description

组合式奈瑟球菌组合物

本发明专利申请是国际申请号为PCT/IB00/00828、国际申请日为2000年5月19日、进入中国国家阶段的申请号为00810600.2、名称为“组合式奈瑟球菌组合物”的发明专利申请的分案申请。 

在本文中提及的所有文件都全部通过引用纳入本文。 

发明领域 

本发明涉及组合物，这些组合物含有来自奈瑟球菌，尤其是脑膜炎奈瑟球菌(Nmeningitidis)和淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)的生物分子的组合。 

背景技术

脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)和淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)是不能动的、对人有致病性的革兰氏阴性双球菌。 

根据该菌的荚膜多糖，已经鉴定出12种脑膜炎奈瑟球菌的血清型。A型是亚撒哈拉-非洲地区流行病中最常见的病原体。B型和C型血清型菌是导致美国以及大多数发达国家内大多数病例的原因。W135和Y型血清型菌是导致美国和发达国家的其余病例的原因。 

目前使用的脑膜炎球菌疫苗是由血清型A、C、Y和W135组成的四价多糖疫苗。然而，脑膜炎球菌B(menB)仍是个问题。不能采用多糖方法，因为menB荚膜多糖是yi,gif种α(2-8)-相连的N-乙酰神经氨酸的聚合物，它也存在于哺乳动物组织中。yi,gif种menB疫苗方法是采用外膜蛋白(零,gifMP)的混合物。为了克服抗原性变异，已经构建了含有高达9种不同膜孔蛋白的多价疫苗(例如，Poolman JT(1992)“脑膜炎球菌疫苗的发展”Infect.Agents Dis.4:13-28)。用于外膜疫苗的其它蛋白是opa和opc蛋白，但是这些方法均不能克服抗原性变异(例如Ala′Aldeen和Borriello(1996)＂脑膜炎球菌运铁蛋白结合蛋白1和2均是外露的，并能产生杀伤同源和异源菌株的杀菌性抗体＂Vaccine14(1):49-53)。 

考虑到在非流行期间的脑膜炎球菌疾病是由多个菌株或变异菌株所造成的倾向(Russel等人(1998)11届国际致病奈瑟球菌大会摘要，第281页)，以及在群落中优势菌株经常发生暂时变动，看来通用的脑膜炎球菌B疫苗将需要yi,gif种 以上的抗原种类。 

发明描述 

奈瑟球菌蛋白和核苷酸序列公开于下列文件中： 

·WO99/24578 

·WO99/36544 

·WO99/57280 

·WO97/28273 

·WO96/29412 

·WO95/03413 

·Tettelin等人(2000)科学(Science)287：1809-1815 

为了方便起见，在这些文件中所公开的序列在本申请中根据下表进行引用。 

  

文件	原来的序列编号	在本申请中的序列编号
			WO99/24578	SEQ ID1-892	SEQ ID1-892
WO99/36544	SEQ ID1-90	SEQ ID893-982
			WO99/57280	SEQ ID1-3020	SEQ ID983-4002
WO97/28273	图4编码DNA图4蛋白   图9编码DNA图13DNA   图13蛋白	SEQ ID4003SEQ ID4004SEQ ID4005SEQ ID4006SEQ ID4007
			WO96/29412	SEQ ID1-26	SEQ ID4008-4033
WO95/03413	SEQ ID1-23	SEQ ID4034-4056
			Tettelin等人(2000)科学  (Science)287：1809-1815	NMB0001-2160(DNA)     NMB0001-2160(编码蛋白)	SEQ ID4057-6216SEQ ID6217-8376

本发明提供了含有来自奈瑟球菌细菌的第一生物分子以及来自奈瑟球菌细菌的第二生物分子的组合物。术语“生物分子”包括蛋白质和核酸。 

该组合物还可含有进一步的生物分子，较佳地也来自奈瑟球菌。换言之，该组合物可含有2种或多种(如3、4、5、6、7、8等)生物分子，其中至少2种来自奈瑟球菌细菌(如3、4、5、6、7、8等)。这样的组合物包括那些含有下列物质的组合物：(i)两种或多种不同的奈瑟球菌蛋白，(ii)两种或多种不同的奈瑟球菌核酸，或(iii)一种或多种奈瑟球菌蛋白以及一种或多种奈瑟球菌核酸的混合 物。 

在一优选例中，第一和第二生物分子来自不同的奈瑟球菌物种(例如一种来自脑膜炎奈瑟球菌，一种来自淋病奈瑟球菌)，但是它们也可来自同一物种。组合物中的生物分子可以来自同一物种的不同的血清型或菌株。 

第一生物分子宜选自由SEQ ID1-8376构成的组。更佳地，选自由SEQ ID1-4002和/或SEQ ID4057-8376构成的组。优选地，它是纯化的或分离的生物分子。 

第二生物分子宜选自由SEQ ID1-8376构成的组。更佳地，选自由SEQ ID1-4002和/或SEQ ID4057-8376构成的组。优选地，它是纯化的或分离的生物分子。 

第一和第二生物分子中的一者或两者可以是在本文中没有具体公开的，以及在本专利申请提交之前还没有被鉴定、发现、为公众所知或纯化的奈瑟球菌生物分子。 

具体地，本发明提供了一种组合物，它含有一种或多种下列的第一和第二生物分子的配对(以SEQ ID列出)： 

因此，本发明包括了SEQ ID1-8376的35074500种可能的配对形式(1&2，1&3，1&4，1&5，......1&8375，1&8376，2&3，2&4，2&5，......2&8375，2&8376，3&4...1000&1001，1000&1002，...1000&8376，...8374&8375，8374&8376，8375&8376)。尽管出于空间原因，并没有全部在此列出。 

有关如何产生和使用构成SEQ ID1-4056的分子的细节，可以在相关的国际申请中找到。这些细节没有必要在此重复。类似的原则适用于SEQ ID4057-8376。 

在本发明组合物中的SEQ ID1-8376，可以用具有与SEQ ID1-8376同源(即具有序列相同性)的序列的分子加以补充或替换。根据具体的序列，相同性的程度宜大于50％(例如65％、80％、90％或更高)，并且包括突变体和等位基因变体。蛋白质之间的序列相同性宜用Smith-Watemen同源性搜索算法来确定，如在MPSRCH程序(Oxford Molecular)中采用仿射缺口搜寻，其中参数“缺口开口罚分(gap open penalty)”为12，“缺口延伸罚分(gap extension penalty)”为1。

在本发明组合物中的SEQ ID1-8376，可以用包含SEQ ID1-8376片段的分子加以补充或替换。这些片段应包含诸分子中至少n个连续的单体，并且根据具体的序列，(i)对于蛋白质分子，n宜为7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20或更高)，从而使片段宜包含该序列的表位，或者(ii)对于核酸分子，n为10或更高(如12、14、15、18、20、25、30、35、40或更高)。 

当组合物含有以不同新生形式或成熟形式存在的蛋白时，优选使用成熟形式的蛋白质。例如，可以使用没有信号肽的成熟形式的NspA蛋白(SEQ ID4008-4033；WO96/29412；图29)。 

在蛋白质分子情况下，本发明组合物中的SEQ ID1-8376，可以用结合于所述蛋白的抗体加以补充或替换。这种抗体可以是单克隆的或多克隆的。 

在核酸分子情况下，本发明组合物中的SEQ ID1-8376，可以用杂交于奈瑟球菌核酸(较佳地在“高度严紧”条件下杂交(如65℃，0.1×SSC，0.5％SDS溶液中))的核酸加以补充或替换。 

应理解，该组合物中的任何核酸可以是各种不同形式的(例如单链、双链、载体、探针等)。此外，术语“核酸”包括DNA和RNA，以及它们的类似物，如含有修饰骨架的那些类似物，还包括肽核酸(PNA)等。 

在某些例子中，组合物含有来自不同奈瑟球菌物种的分子，例如一种或多种脑膜炎奈瑟球菌分子和一种或多种淋病奈瑟球菌分子。在某些例子中，组合物可含有来自相同物种的不同血清型和/或菌株(例如脑膜炎奈瑟球菌A菌株和B菌株)的分子。进一步的例子还包括，来自不同菌株的一种或多种脑膜炎奈瑟球菌分子和一种或多种淋病奈瑟球菌分子的混合物。 

许多蛋白质在脑膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌的不同物种、血清型和菌株之间是相对保守的(例如SEQ ID52、54、58)。PCT/IB00/00642包含了对这些蛋白中保守区域的更详细的实验分析。为了确保最大的菌株间交叉识别性和反应性，可以在本发明组合物中使用不同奈瑟球菌物种、血清型和菌株之间保守的蛋白质区域。因此，本发明提供了蛋白质，这些蛋白质含有在大多数奈瑟球菌(尤其是脑膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌)中共有的氨基酸序列区段。较佳地，所述组合物含有一蛋白质，该蛋白质含有奈瑟球菌蛋白(宜为SEQ ID1-8376中的蛋白，或更佳地为SEQ ID1-4002中的蛋白)的片段，其中，所述片段包含n个连续的保守氨基酸。根据具体的蛋白质，n为7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20或更高)。所述片段宜包含奈瑟球菌蛋白的抗原性或免疫原性区域。“保守的 ”氨基酸是在至少x％奈瑟球菌中，更佳地在至少x％脑膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌中的特定奈瑟球菌蛋白中存在的氨基酸。x的值可以是50％或更高，例如66％、75％、80％、90％、95％或甚至100％(即该氨基酸存在于所有奈瑟球菌的有关蛋白质中)。为了确定一个氨基酸在特定奈瑟球菌蛋白中是否是“保守的”，需要比较在多种不同奈瑟球菌(“参照群”)的有关蛋白序列中的该氨基酸残基。“参照群”的合适定义可以在PCT/IB00/00642中找到。不同奈瑟球菌的氨基酸序列可以用计算机轻易地进行比较。这通常涉及用算法，例如CLUSTAL[Thompson等人(1994)核酸研究(Nucl.Acids Res.)22：4673-4680；Trends Biochem Sci(1998)23：403-405]或PILEUP算法[GCG Wisconsin软件包的组成部分，优选9.0版]，将多个序列进行比对。保守氨基酸在多序列比对中是很明显的，在有关的氨基酸位置处，大多数被比对的序列会含有特定的氨基酸。还可以通过使用程序，例如BOXSHADE[可从例如NIH在线获得]、PRETTYBOX[GCG Wisconsin，版本10]或JALVIEW[可从EBI在线获得]，可更清楚地看出保守氨基酸。 

因此，本发明具体的组合物包括那些含有以下物质的组合物： 

■两种或多种选自SEQ ID1-4002的生物分子； 

■一种或多种选自SEQ ID1-4002的生物分子，以及一种或多种选自SEQID4003-8376的生物分子； 

■一种或多种选自SEQ ID1-4002的生物分子，以及NspA蛋白(如WO96/29412中所公开：还可参见本申请的图29)(优选成熟形式)； 

■一种或多种选自SEQ ID1-8376(优选SEQ ID1-4002)的生物分子，以及运铁蛋白结合蛋白A(TbpA)和/或B(TbpB)，例如在WO00/25811中公开的TbpA和TbpB(或其免疫原性片段)； 

■一种或多种选自SEQ ID SEQ ID1-4002的蛋白质的片段，且该片段优选含有保守的氨基酸区段； 

■不同蛋白质的组合，其中该组合整体上含有被参照群中每种菌株所识别的一种或多种蛋白质，尽管在组合中的每个单独蛋白质本身并不被参照群中每种菌株所识别，即参照群中每个成员识别该组合中的至少一个蛋白质。 

本发明还提供了用作药剂(例如作为免疫原性组合物或疫苗)，或作为诊断性试剂的本发明组合物。本发明还提供了本发明组合物在生产下列物质中的应用： (i)用于治疗或预防奈瑟球菌属细菌感染的药剂；(ii)用于检测奈瑟球菌或检测抗奈瑟球菌抗体是否存在的诊断性试剂；和/或(iii)用于产生抗奈瑟球菌属细菌的抗体的试剂。 

本发明还提供了一种治疗患者的方法，该方法包括给予患者治疗有效量的本发明的组合物。 

本发明还提供了一种生产本发明组合物的方法，它包括步骤：将一种或多种SEQ ID 1-8376中与另外的一种或多种SEQ ID 1-8376混合。 

附图简述 

图1显示了ORF6、7、13、65-1、72、73-1、105-1、137-1、143-1、和147-1表达的SDS-PAGE结果。左侧泳道显示了分子量标记(M1组)。 

图2显示了ORF9的(A)SDS-PAGE结果；(B)在针对脑膜炎奈瑟球菌外膜小泡制备物的Western印迹中脑膜炎奈瑟球菌免疫反应条带的位置；(C)FACS分析。 

图3显示了ORF2-1、5-1、22-1、132-1和4表达的SDS-PAGE结果。左侧泳道显示了分子量标记(M1组)。 

图4-28显示了ORF2、5、6、7、9、13a、15、22、23、27、28、32、65、72、73、76、79、89、105、106-1、132、137、138、143和147的亲水性图(上)、抗原性指数(中)和两亲性区域(AMPHI)(下)。 

图29显示了脑膜炎球菌B不同菌株的NspA的序列变异性。这些序列可用作WO96/29412(SEQ ID 4008-4033)的替代物。 

图30显示了用间接荧光流式细胞术确定的多克隆抗-rNspA与有荚膜和无荚膜的menB菌株的结合情况。 

图31显示了对有荚膜的菌株8047、GU385和M986(31A)以及无荚膜的菌株BZ232、MC58、NG3/88和NGB165(31B)的类似结果。 

图32显示了NspA的二级结构模型。 

图33显示了用四价混合物对无荚膜菌株M7(37A)和乙醇处理过(破坏荚膜)的菌株2996、N44776、MC58、1000、BZ232、BZ133、NG6/88、BZ198、NG3/88、297-0、BZ147和BZ169(37B)的FACS分析。 

图34显示了用五价混合物的1：400(34A)、1：200(34B)和1：100(34C)稀释液，对M7菌株的FACS分析。 

图35显示实施例9的结果，显示对于单个抗原以及4种组合的FACS数据。

实施例 

实施例1表达和纯化实验 

将在WO99/24578中公开的ORF6、7、13、65-1、72、73-1、105-1、137—1、143-1、和147-1，如下表所示在大肠杆菌中表达并纯化。 

  

ORF	His-融合蛋白	GST-融合蛋白	纯化	分子量(kDa)
					6		+	GST融合蛋白	23
7	+	+	GST融合蛋白	28
					13		+	GST融合蛋白	10
65-1		+	GST融合蛋白	32
					72	+		His融合蛋白	13.5
73-1		+	GST融合蛋白	13
					105-1	+	+	His融合蛋白	32
137-1		+	GST融合蛋白	31
					143-1	+	+	His融合蛋白	23.5
147-1	+	+	His融合蛋白	32

注：ORF73-1以片段形式表达(氨基酸41-161)。 

用于表达这10个ORF的方案与WO99/24578中所描述的基本相同，其中使用pGEX和pET载体。用于扩增ORF的PCR引物列于下表： 

  

ORF	引物	序列	限制性位点
				ORF65-1	正向反向	CGCGGATCCCATATG-TTTATGAACAAATTTTCCCCCGCTCGAG-TTTGCTTTCGATAGAACGG	BamHI-NdeIXhoI
ORF73-1	正向反向	CGCGGATCCCATATG-GCCGGCGTGCTGATGCCCGCTCGAG-TTCATCTTTTTCATGTTCG	BamHI-NdeIXhoI
				ORF105-1	正向反向	CGCGGATCCCATATG-CCGACCGTCCGTTCCCGCTCGAG-TAAACGAATGCCGTCCAG	BamHI-NdeIXhoI
ORF143-1	正向反向	CGCGGATCCCATATG-GAATCAACACTTTCACCCCGCTCGAG-CACGCGGTTGCTGTAAC	BamHI-NdeIXhoI
				ORF147-1	正向反向	CCGGAATTCTACATATG-TTTCAGAAACATTTGCAGCCCGCTCGAG-TTTGTTTTTCCAAGACAGAG	EcoRI-NdeIXhoI

这10个表达的ORF的SDS-PAGE结果示于图1。 

用ORF7-His融合蛋白免疫小鼠。基本上按WO99/24578中所述，将血清用于ELISA分析，并获得了阳性结果。 

下列蛋白也被表达和纯化(结果未示出)： 

  

ORF	His融合表达	GST-融合表达	作为片段表达	片段的氨基酸位置
					orf1(s)		－	－	43-1087
orf(β)	未做	－	－	1051-1457
					orf35-1	－	－	－
orf41	未做	未做	－	25-619
					orf46	－	－	－	25-433
orf61	未做	未做		1-575
					orf83-1	－	－	－	15-313
orf100-1	未做	－	－	21-376
					orf114-1	未做	－	－	1-1423
orf124-1	未做	未做	－
					orf31-1	未做	－	－	22-135

下列PCR引物用于扩增这些ORF。 

  

ORF	引物	序列	限制性位点
				ORF1(s)	正向反向	CGCGGATCCGCTAGC-GGACACACTTATTTCGGCCCGCTCGAG-CAGCGCGTCAAGGCTT	BamHI-NdeIXhoI
ORF1(β)	正向反向	CGCGGATCCGCTAGC-GAGTTCCGCCTGCATAACCCGCTCGAG-CCAGCGGTAGCCTAATT	BamHI-NdeIXhoI
				ORF35-1	正向反向	CGCGGATCCGCTAGC-AGGGGCGACGACGTGCCCGCTCGAG-AAACAGCCATTTGAGCGA	BamHI-NdeIXhoI
ORF41	正向反向	CGCGGATCCCATATG-TATTTGAAACAGCTCCAAGCCCGCTCGAG-TTCTGGGTGAATGTTA	BamHI-NdeIXhoI
				ORF46	正向反向	CGCGGATCCCATATG-TCAGATTTGGCAAACGATCCCCGCTCGAG-CGTATCATATTTCACGTGC	BamHI-NdeIXhoI
ORF61	正向反向	CGCGGATCCGCTAGC-ACGGTTTTGAAGCTTTCGCCCCGCTCGAG-AATGACGAGGTTGTCCG	BamHI-NdeIXhoI

  

ORF83-1	正向反向	CGCGGATCCCATATG-TGCGGCACACTGACCGCCCGCTCGAG-GCCGCCTTTGCGGC	BamHI-NdeIXhoI
				ORF100-1	正向反向	CGCGGATCCCATATG-TCGGGCATTTACACCGGCCCGCTCGAG-TTCGTCGAAAACCTTTGC	BamHI-NdeIXhoI
ORF114-1	正向反向	CGCGGATCCCATATG-AATAAAGGTTTACATCGCATCCCGCTCGAG-AATCGCTGCACCGGCT	BamHI-NdeIXhoI
				ORF124-1	正向反向	CGCGGATCCCATATG-ACTGCCTTTTCGACACCCGCTCGAG-GCGTGAAGCGTCAGGA	BamHI-NdeIXhoI
ORF31-1	正向反向	CGCGGATCCCATATG-TGCCGGCTGGCGGGCCCGCTCGAG-CCAGCGGACGCGTTC	BamHI-NdeIXhoI

这些ORF中的每一个都可与一种或多种SEQ ID1-8376相混合。 

实施例2ORF9表达与纯化 

将在WO99/24578中公开的ORF9克隆入pET载体并在大肠杆菌中表达。纯化的ORF-His融合蛋白用SDS-PAGE分析，如图2A所示。用纯化的ORF9-His免疫小鼠，将血清用于Western印迹分析(图2B)、FACS分析(图2C)和ELISA分析。所用方案与WO99/24578中所给出的方案基本相同。 

结果证实，ORF9是一个暴露于表面的蛋白。ORF9适合用于与SEQ ID1-8376中的其他一种或多种进行混合。 

实施例3进一步的表达实验 

按下表所示，对于WO99/24578中公开的ORF2-1、5-1、22-1和132-1在大肠杆菌中进行进一步的表达和纯化实验。 

  

ORF	His-融合蛋白	GST-融合蛋白	纯化	分子量(kDa)
					2-1		+	GST融合蛋白	26
5-1	+	+	GST融合蛋白	33
					22-1	+	+	His融合蛋白	49
132-1	+	+	GST融合蛋白	48

用于表达这4个ORF的方案与WO99/24578中所描述的基本相同，其中使用pGEX和pET载体。用于扩增ORF的PCR引物列于下表：

  

ORF	引物	序列	限制性位点
				ORF5-1	正向反向	CGCGGATCCGCTAGC-GACGGCGCACAACCGACCCGCTCGAG-TGTTTGGCGGATGGGG	BamHI-NdeIXhoI
ORF22-1	正向反向	CGCGGATCCCATATG-ATTAAAATCAAAAAAGGTCCCCGCTCGAG-GCCTTCCTTCTCAATGG	BamHI-NdeIXhoI
				ORF132-1	正向反向	CGCGGATCCCATATG-AAAGAAGCGGGGTTTGAACCCGCTCGAG-TCTCAAAGCTTCCAGCAG	BamHI-NdeIXhoI

这4个表达的ORF的SDS-PAGE结果示于图3。 

这些ORF中的每一个都可与一种或多种SEQ ID 1-8376相混合。 

实施例4ORF4脂蛋白的表达和纯化 

作为一个含有脂肽信号信号序列(LPSS)的ORF4公开于WO99/24578。用下列PCR引物扩增全长的ORF： 

orf4-L正向　　CGGATCCCATATGAAAACCTTCTTCAAAAC 

orf4-L反向    CCCGCTCGAGTTATTTGGCTGCGCCTTC 

将扩增的DNA片段克隆入载体pET21b+，以便以C末端带His尾标记的融合蛋白形式表达。对含pET21b+orf4-LPSS的大肠杆菌的对数期培养物，在30℃用1.0mM IPTG诱导3小时，通过8000g离心10分钟而收集，并重新悬浮于PBS中。悬浮液在冰上进行超声波处理，加入Triton X-114至终浓度为0.6％(v/v)。材料在冰上保温20分钟，然后升温至37℃，直至相分离发生(以高度浑浊为标志)。在20℃，10000g离心10分钟后，弃去上层水相，并在不影响细菌沉淀的情况下收集下层去污剂相。向去污剂相中加入13倍体积的20mM组氨酸、2mMEDTA、30mM NaCl(pH5.8)。在4℃离心10分钟，将上清液分批与Q SepharoseFast Flow树脂(Pharmacia)在4℃混合30分钟。混合物被离心、保留上清液，用20mM组氨酸、2mM EDTA、30mM NaCl(pH5.8)、Tritron X-1000.3％(v/v)洗涤树脂，并用相同缓冲液配的1M氯化钠进行洗脱。大部分Orf4脂蛋白在结合后获得的上清液中发现。最后的纯化是在Hi-Trap^TM Q柱(Pharmacia)上，通过色谱法完成。通过加入0.1M HCl使结合上清液的pH调至7.0，然后上样于用50mM Tris-HCl(pH7.0)，2mM EDTA，0.3％Triton X-100，10mM NaCl平衡过的Hi-Trap^TMQ柱。用5.0毫升平衡缓冲液洗涤柱，使用10mM至1M的氯化钠梯度。洗脱出了两种电泳上截然不同的蛋白形式。一种在洗涤液中，一种在150-300mM氯化钠之间的氯化钠梯度中。在洗涤液中获得的蛋白被用于免疫小鼠。这种形式的蛋白可能代表了完全加工的脂化分子。 

在图3中可看见该纯化的31kDa脂蛋白。ORF4适合与SEQ ID1-8376中其他的一种或多种混合。 

实施例5计算机预测 

对ORF2、5、6a、7、9、13a、15、22、23、27、28、32、65、72、73、76、79、89、105、106-1、132、137、138、143和147(如WO99/24578中所公开)进行了计算机分析。图4-28显示了这些ORF中每一种ORF的亲水性图(上)、抗原性指数图(中)和两亲性区域(AMPHI)分析(下)。使用AMPHI程序来预测T细胞表位(Gao等人1989，J.Immunol143：3007；Roberts等人.1996，AIDS Res HumanRetroviruses12：593；Quakyi等人.1992，Scand J Immunol Suppl11：9)，该测序可在DNASTAR Inc.公司(1228South Park Street，Madison，Wisconsn53715，USA)的Protean软件包中获得。 

这些ORF中的每一种都可与SEQ ID1-8376中其他的一种或多种混合。 

实施例6四价混合物 

制备蛋白质919(WO99/57280)、225(WO99/57280)、ORF4(WO99/24578，实施例26)和ORF40(WO99/36555，实施例1)的混合物，并用ELISA和FACS进行分析。针对13种测试菌株的ELISA效价如下： 

  

菌株	M7conF	2996	MC58	BZ133	BZ232	H44/76	1000
								效价	38176	7892	17216	41488	17945	83990	6575
菌株	BZ198	NG6/88	BZ169	BZ147	NG3/88	297-0
								效价	3329	59275	-	-	12877	25640

FACS结果示于图33。很明显，无论使用何种特定menB菌株，该四价混合物都给出了优异结果。此外，产生的针对混合物的抗血清在菌株2996中，在高达1：2048倍的稀释度下是杀菌性的。

实施例7-五价混合物 

制备蛋白质ORF4-L(脂化蛋白，见上面的实施例4)、ORF37(WO99/24578，实施例1)、ORF40(WO99/36544，实施例1)、502(WO99/57280，第687-690页)和8(WO99/57280，第165-167页)。针对13种测试菌株的ELISA效价如下： 

  

菌株	M7conF	2996	MC58	BZ133	BZ232	H44/76	1000
								效价	-	-	25428	-	58300	>109350	>109350
菌株	BZ198	NG6/88	BZ169	BZ147	NG3/88	297-0
								效价	10999	109532	42888	28324	104212	33996

FACS结果示于图34。很明显，无论使用何种特定menB菌株，五价混合物都给出了优异结果。此外，产生的针对混合物的抗血清在菌株2996中是杀菌性的。 

实施例8-三价混合物 

混合蛋白质ORF1(例如WO99/24578，实施例77；还可见WO99/55873)、287(例如WO99/57280，图21；还可参见本文SEQ ID3103-3108)和919(例如WO99/57280，图23和本文的SEQ ID3069-3074)，并与Al(OH)₃佐剂混合。这些蛋白质来自MenB的2996菌株。 

该混合物还与MenC多糖偶联抗原[如Costantino等人(1992)Vacine10：691-698]组合。OMV被用作对照。 

该混合物还被用于针对同源菌株以及异源MenB菌株的杀菌性分析。效价如下： 

  

	2996	BZ133	BZ232	1000	MC58	NGH38
							三价	2048	2048	4	<4	64	4
+MenC	2048	>32000	4	128	1024	128
							对照	32765	4096	8192	16384	16384	8192

实施例9蛋白质287、919和953 

蛋白质287、919和953公开于WO9957280。这些来自脑膜炎奈瑟球菌B 血清型菌株2996的蛋白被表达，并在针对菌株2996的杀菌性分析中单独地和组合地进行测试。来自2996的OMV被用作阳性对照。 

  

抗原	287	919	953	对照
					效价	8192	2048	128	65536
组合	287+919	287+953	919+953	287+919+953
					效价	32000	8192	8192	8192

图35显示了对于单个抗原以及4种组合的FACS数据。 

显然，抗原混合物比分离的抗原更有效，而且尤其是919+953组合给出了出乎意料的好结果。 

还针对不同的血清型A、B和C菌株(即异源性侵袭)，测试了2996的各抗原及其组合。杀菌性效价如下所示： 

很明显，抗原混合物可用于提供菌株间交叉反应性。 

在第二组实验中，各抗原的效价如下： 

用于该实验的3种蛋白质是以如下方式表达和使用的：

(1)蛋白质287在大肠杆菌中以GST融合蛋白表达； 

(2)蛋白质919在大肠杆菌中表达，没有前导肽、没有其成熟的N末端半胱氨酸、并且没有任何融合配对物(919-未标记型)(919-untag)；和 

(3)蛋白质953使用组氨酸尾标记进行表达。 

3种免疫接种都加Freund氏佐剂，第一次包括CFA，最后二次包括IFA。 

实施例10-进一步的多价组合 

在CD1小鼠中测试了进一步的组合： 

  

抗原	佐剂	FACS	ELISA	杀菌性
					919-his+Orf4-his+225-his+orf40-his	Freund佐剂	+++	+	8192
Orf4-L+Orf37-GST+orf40-his+502-his+8-his	Freund佐剂	+++	+	抑菌
					919-untag+791-his+792-his	Freund佐剂	+++	+	4096
919-untag+287-GST+953-his	Freund佐剂	+++	+	8192
					919-untag+287-GST	Freund佐剂	+++	+	32000
287-GST+953-his	Freund佐剂	+++	+	8192
					919-untag+953-his	Freund佐剂	+++	+	8192
919-untag+Orfl-his+287-GST	Al(OH)3	+++	+	2048
					919-untag+Orf1-his+287-GST+MenC糖偶联物	Al(OH)3	+++	+	2048
Orf-46.1-his+287-GST	Al(OH)3	未做	+	128

^*：″his″表示以组氨酸尾标志蛋白形式表达和免疫； 

“ORF4-L”是脂化形式的ORF4； 

“GST”表示用GST融合蛋白形式表达和免疫； 

“919-untag”如实施例9中所定义； 

“MenC糖偶联物”是实施例8中所述的MenC糖偶联物。 

在豚鼠中测试了进一步的抗原组合： 

  

抗原	佐剂	FACS	ELISA	杀菌性
					919-untag+287-GST+953-his+Orf46.1-his	Freund佐剂	+	+	4096
919-untag+287-GST+953-his	Freund佐剂	+	+	4096
					287-GST+953-his	Al(OH)3	未做	+	256

明显地，这些组合给出了优异的免疫学结果。

实施例11NspA组合 

NspA蛋白公开于WO96/29412，在本文中以SEQ ID4008-4033表示。该蛋白质的学术文献公开内容(Martin等人(1997)J.Exp.Med.185：1173-1183)，报道了该蛋白质在奈瑟球菌菌株中是高度保守的(抗NspA抗体与250种脑膜炎球菌A、B和C菌株有99％交叉反应性)，而且可有效保护免受活细菌的致命侵袭。还有报道称，吸附在明矾上的NspA可在兔和猴中引发血清的脑膜炎球菌杀菌性抗体应答[Martin等人(1998)11届国际致病奈瑟球菌大会摘要，第198页]。基于这些资料，rNspA(重组的NspA)正在被开发作为预防所有血清型造成的脑膜炎球菌疾病疫苗。 

尽管序列保守，然而已出乎意料地发现，rNspA细胞表面表位仅在下面测试的65％血清型B菌株中检测到，而且对抗NspA杀菌活性的易感性也小于Martin等人的报道。这些结果与Martin等人的结果相反，并且暗示基于rNspA的脑膜炎球菌B疫苗需要补充额外的抗原以便成为有效的疫苗。 

在该实施例中测试的脑膜炎奈瑟球菌是从在超过30年的期间内，在不同国家居住的病人中分离出的(见第72页的表格)。选定这些菌株作为用多基因座同工酶分型法[Seiler等人(1996)Mol.Microbiol.19：841-856]和/或多基因座序列分型法[Maiden等人(1998)PNAS USA95：3140-45]所确定的广泛不同的“克隆”组的代表。菌株M7衍生自菌株NMB，它含有一个能阻断荚膜多糖生物合成的转座子插入(Stephens等人(1991)Infect.Immun.59：4097-4102)。但所有其他菌株是荚膜化的。 

根据Martin等人(1997)中的核苷酸序列，设计PCR引物并从菌株8047中扩增出NspA基因。含有启动子区域的该序列被克隆入pSK+质粒(rNspA)。还使用质粒pTrc.NspA.1，该质粒编码一种蛋白质，其中一部分信号序列被多聚氨酸尾标志所替换。两种质粒都在大肠杆菌BL21(BE3)菌株中表达，并纯化蛋白质。在大肠杆菌中，rNspA是分泌的，而不是与外膜相结合。通过用55％(w/v)硫酸铵沉淀，从培养基中部分纯化该蛋白质，Western印迹证实其表观分子量为18.6kDa。 

两种形式的NspA(rNspA和变性的带His尾的NspA)被注入6周大的雌性CD-1小鼠中，以产生抗血清。用间接荧光分析的流式细胞术检测(Granoff等人(1998)J.Immunol.160：5028-36)，测定它们与脑膜炎奈瑟球菌B菌株表面的结合 能力。对于菌株NMB和M7(一种NMB的无荚膜的突变株)的结果示于图30。如预期的那样，抗B型多糖的单克隆抗体SEAM-3(Granoff等人)仅结合于荚膜化菌株，而阳性抗-P1.2(PorA)对照单克隆抗体结合于两种菌株。产生的抗rNspA抗血清能够结合于两种菌株。然而，抗带His尾NspA的抗血清给出了阴性结果。这些抗血清对于菌株8047、CU385和M986(图31A)也是阴性的，但用Western印迹时这些抗血清给出了阳性结果。 

这些数据提示，用带His尾的NspA制备的抗体，识别存在于变性NspA上但不存在于体内细胞表面上天然NspA的表位。与之相反，制备的抗rNspA的抗体似乎可识别有构象的NspA表位。 

对第72页表格中所示的菌株进行流式细胞术分析。图31A显示了针对rNspA产生的鼠抗体结合于菌株8047(NspA基因是从该菌株克隆出的)和菌株CU385的表面，但不结合于M986。图31B显示了对菌株BZ232、MC58、NG3/88和NGP165的类似的阴性结果。然而，在所有这些阴性情况下，抗荚膜的单克隆抗体对照是阳性的。 

在第72页上的表格总结了流式细胞术的结果。尽管据报道NspA在所有测试的完整的脑膜炎奈瑟球菌菌株表面是可达到的(Martin等人(1997)J.Exp.Med185 1173-1183；Plante等人(1999)Infect.Immun.67：2855-61)，但在17种测试菌株中仅11种(65％)与抗rNspA的血清反应。在给定菌株中细胞表面的表达与分类(通过血清型、亚型或电泳型进行的分类)之间、或分离的年代和国家之间，没有明显的关系。 

为了解释与抗rNspA血清的反应性的差异，测序了6种阴性菌株中5种菌株(BX232、NG3/88、NGP165、M136和M986)以及3种阳性菌株(8047、CU385和NG6/88)的NspA基因。第6种阴性菌株(MC58)的序列早已可从完整的基因组序列中获得。 

所有10种菌株的NspA序列是高度保守的，变化最多不过与Martin等人的原型序列有5个核苷酸的差异。变化最大的蛋白质仅有3个氨基酸差异(见图29)。除了一个例外之外，所有的氨基酸变异蛋白都涉及到该蛋白质各区段中相同的各个残基。这些包括信号肽(它并不存在于成熟蛋白)和C端50个残基中的两个短区段。这些差异不能解释抗血清的结果，因为它们代表了那些阳性菌株和那些阴性菌株中相同变异序列(比较M136和8047；NGP165和NG6/88；MC58和CU385)。

因为无法用基因缺失或多态性来解释抗血清结果，所以测试了在5种菌株(8047、CU385和NG6/88，都是抗rNspA阳性菌株；M986和M136，都是阴性菌株)外膜中的NspA蛋白的数量。用月桂基肌氨酸酯抽提细菌的细胞沉淀物，并分析不溶性外膜组份。在全部5种菌株中都看见18.6kDa条带，且该条带在Western印迹中与抗-His尾NspA的抗体起交叉反应。因此，NspA表达的菌株差异也不能解释结果。 

抗rNspA抗体结合于细菌细胞表面的能力可能受到荚膜上多糖数量的影响。因此，用抑制性ELISA法，分析了17种测试菌株所产生的荚膜多糖数量。 

根据Corn等人(J.Infect.Dis.(1993)167：356-364)所述的方法，制备荚膜多糖的提取物。各个细菌克隆在7毫升Mueller-Hinton肉汤中生长至OD₆₂₀为0.5-0.7。通过5000g离心15分钟而收集细菌，在0.6毫升10mM Hepes(pH8.0)中洗涤，然后再悬浮于含10mM EDTA的相同缓冲液中并在37℃孵育1小时。细胞在10000g离心1分钟而沉淀，然后，按Azmi等人(Infect.Immun.(1995)63：1906-13)所述的方法，用抑制性ELISA法测定释放入上清液中的脑膜炎球菌B多糖抗原的相对数量。在ELISA中的固相抗原是吸附在亲和素包被的微量滴定板上的脑膜炎球菌B多糖-ADH-生物素(Granoff等人)。将脑膜炎球菌B多糖反应性人副蛋白LIP(Azmi等人)用作第一抗体(0.2微克/毫升)。在没有抑制剂时，这种浓度的抗体与底物一起在30分钟孵育后足以产生约0.7-1.0的OD值(Azmi等人)。通过确定可导致50％抗体结合受抑制的上清液稀释度，而测定释放入上清液的多糖效价。在该分析中的对照是从菌株M7中制备的EDTA提取物(该菌株不产生任何荚膜多糖)和纯化的脑膜炎球菌B多糖。为了确保所有的荚膜多糖均通过EDTA处理而被释放，用悬浮在与荚膜提取物相同的缓冲液和体积中的细胞沉淀，进行相同的抑制性ELISA。可观测的细胞沉淀的抑制活性，是荚膜提取物中观测值的0-10％，后者较高的百分比值来自产生最大数量荚膜的菌株细胞沉淀。 

每一种菌株的结果示于第72页的表中。平均地，6种阴性抗-rNspA菌株比11种阳性菌株产生多3倍的荚膜多糖(各自的几何平均稀释度倒数为676对224，p<0.05)。这可以解释用抗血清所获得的结果：可以理解，存在更多数量的荚膜会干扰抗rNspA抗体结合于NspA表位的能力，而在具有较少数量荚膜的菌株中NspA表位是可达到的。 

用与Mandrell等人(J.Infect.Dis.(1995)172：1279-89)所述方法相类似的分析法，测试了抗rNspA的抗血清的补体依赖性杀菌活性。补体源是来自健康成 人的人血清，其中没有可检测的针对B型多糖的抗荚膜抗体也没有针对测试菌株的内在杀菌活性。血清的杀菌效价定义为：与在时间0时的对照CFU/毫升相比，在反应混合物中细菌孵育60分钟后，导致CFU/毫升下降50％的血清稀释度。 

典型地，在60分钟孵育期间，与阴性对照抗体孵育的细菌会表现出CFU/毫升上升150-200％。阳性对照抗体[抗荚膜IgG2a单克隆抗体SEAM12，Granoff等人]对全部17种菌株都表现出补体介导的杀菌活性。与之相反，在流式分析中对抗rNspA抗血清结合呈阴性的6种菌株是抗性的，表现出没有杀菌或抑菌效果。其他11种阳性菌株中的10种或者被补体和抗血清杀死(SWZ107、J351、CU385、NG6/88、BZ198、H44/76、NMB和8047)，或者被抑制(H355和S3446)；然而，菌株1000不受影响。 

用Saukkonen(J.Infect.Dis.(1988)158：209-212)的方法，在幼大鼠中测试了抗rNspA抗血清提供抗脑膜炎球菌B菌血症的被动保护的能力。简而言之，将6-7日龄的大鼠随机分配给哺乳母鼠。每组5-6只动物的各组，通过腹膜内注射用100微升约5000CFU的脑膜炎奈瑟球菌B型细菌进行侵袭。测试了一种NspA表位的阴性菌株(M986)和一种阳性菌株(8047)，每种菌株都已经在幼大鼠中传代3次。就在施用之前，将细菌悬浮液与不同稀释度的测试或对照抗体(阳性对照：抗荚膜单克隆抗体；阴性对照：抗-大肠杆菌)混合。在侵袭后18小时，从心脏获得血液样本。将各等份血样平板接种于巧克力琼脂，在37℃5％二氧化碳中孵育过夜后，测定CFU/毫升。 

各种一起施用的抗体的保护活性如下：

^ap>0.5，与对照大鼠的几何平均CFU/毫升相比。 

^bp<0.001，与对照大鼠的几何平均CFU/毫升相比。 

可见，2微克/大鼠的阳性抗荚膜对照(抗体)可提供抗两种菌株的保护。抗-rNspA抗血清的1：5或1：25稀释液保护免患菌株8047造成的菌血症。然而，两种稀释都不能有效预防M986菌血症。 

因此，尽管有Martin等人的正面结论，NspA似乎并不能有效地预防脑膜炎球菌B感染。约有1/3菌株的NspA表位的细胞表面表达是下降的，它们在体外生长时可耐受抗-NspA诱导型补体介导的溶菌作用，并且可耐受被动的抗血清免疫。这些菌株产生大量的荚膜多糖，并因此预期具有最高的毒性。因此，仅含有NspA的荚膜能够提供广泛的抗脑膜炎球菌B的保护性免疫力，这一点是必须受到怀疑的。 

因此，含有NspA(SEQ ID4008-4033；图29)的组合物应有利地含有其他的抗原。因此，本发明的一个优选方面是NspA蛋白与一种或多种其他奈瑟球菌抗原的组合。 

实施例12NspA片段 

NspA的二级结构模型示于图32，它含有8个跨膜β-链和4个暴露于表面的 连接环。这符合NspA中疏水和亲水氨基酸交替的模式，是许多β-桶的孔蛋白特有的[Weiss等人，(1990)FEBS Letts267：268-272]。 

在模型中的灰色阴影区表示与来自脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、N.flavius、干燥奈瑟球菌(N.sicca)和流感嗜血杆菌(H.influenzae)的，编码的浑浊度蛋白(Opa)的氨基酸序列相比，用非冗余GenBank CDS的BLAST检索时有>40％相同性和>70％相似性的区段。交替的序列是预测的两亲性β-链；垂直区段对应于跨膜区段；图的上方对应于表面暴露的区段，标记为环1-4。 

根据Martin等人，在NspA的推定氨基酸序列与其他蛋白质的氨基酸序列之间仅有的显著同源性，是与奈瑟球菌浑浊度蛋白(Opa)家族，在靠近蛋白质C末端的2个小区段(约20个氨基酸)有弱同源性。然而，将NspA的N端和C端单独地与GenBank进行的比较揭示，在NspA和脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、N.flavius、干燥奈瑟球菌(N.sicca)和流感嗜血杆菌(H.influenzae)的Opa蛋白之间有高度同源性(>40％相同性和>70％相似性)。Opa蛋白被认为是整合性膜蛋白，它有8个跨膜区段和在膜中的β-桶结构，这与孔蛋白相似(Merker等人(1997)Mol.Microbiol.23：281-293)。在去污剂不溶性膜制备物中存在NspA表明了NspA位于外膜，这与模型中所示的Opa样膜拓扑结构是一致的。此外，与Opa蛋白质的区段最同源的NspA区段，是图32中阴影区域所示的假设跨膜区段。 

在某些情况下，奈瑟球菌的浑浊度蛋白可引发保护性抗体。然而，抗体达到荚膜菌的浑浊度蛋白受限制，在暴露的环区段存在氨基酸序列变异性，以及在临床感染期蛋白质表达的阶段差异等问题，限制了Opa始终如一地诱导保护性抗体的能力(Malorny等人(1998)J.Infect.Dis.172：172：1279-89)。相反，在图32中rNspA的表面暴露的环中似乎很少或没有序列变异性。然而，最近已报道，一组与所有测试的脑膜炎球菌菌株反应的抗脑膜炎奈瑟球菌NspA单克隆抗体，仅与有限数目的淋病奈瑟球菌菌株反应，尽管在这2个物种之间各氨基酸序列是92％相同的。当比较脑膜炎球菌和淋病球菌菌株各自的NspA序列时(图29)，所有各个氨基酸差异都造成疏水性或电荷的改变，并且位于推定的暴露于表面的连接环中(图32)。该发现暗示，在脑膜炎奈瑟球菌中高度保守的NspA中的这些连接环，可能是结合于天然NspA的抗体的重要表位。因此，该分子的这些区段，对于与保护性抗体的相互作用而言似乎是最令人感兴趣的。然而，NspA的推定的表面环较小(10-14个氨基酸)。例如与PorA和Opc的高度免疫原性的外环(24-45个氨基酸)相比。更短长度的环，可能会限制与血清抗体发生结合相互作用时所需的 NspA表面表位的可接近性，尤其是在存在丰富的荚膜多糖时。 

因此，本发明提供了图32中暴露于细胞表面的NspA区段，即SSSLGSAKG、NYKAPSTDFKLY、NRASVDLGGSDSFSQT、和NYIGKVNTVKNVRSG，还提供了来自NspA的等位基因变异体的对应片段。此外，本发明提供了这些片段的亚序列，它们含有这些片段的7个或更多个连续氨基酸。本发明还提供了含有这些片段的蛋白质。还提供了编码这些片段和蛋白质的核酸。 

这些NspA片段、含有这些片段的蛋白质、以及核酸，可以用于本发明的组合物，尤其是作为全长NspA的替代物。另一方面，这些片段、蛋白质和核酸可以以分离中的产品形式使用，换言之，在与其他生物分子联用时没有必要排他性地使用。 

应理解，本发明是仅通过实施例进行描述的，在不违背本发明精神和范围的情况下可以进行改动。

Claims (1)

1.一种组合物，它含有第一纯化的生物分子，该第一纯化的生物分子选自SEQ ID NO：2182、SEQ ID NO：2184和SEQ ID NO：2186，和第二纯化的生物分子，该第二纯化的生物分子选自SEQ ID NO：3516、SEQ ID NO：3518和SEQ IDNO：3520。

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