CN101115468A - 用于结构易变的试剂的无副作用微囊包封技术及水相-水相乳剂的应用 - Google Patents

Abstract

一种用于结构易变的试剂的无副作用微囊包封技术及水相－水相乳剂的应用，在不接触有机溶剂和强界面张力的条件下将蛋白大分子、脂质体等不稳定试剂担载于多糖玻璃体微粒中。由于三级结构被固化以及多糖基质对有机溶剂的不渗透性，载于多糖微粒后，蛋白大分子等试剂具有对有机溶剂和其它物理条件的耐受性，可以进一步微囊包与可降解高分子为基质的缓释微球中而不受制备条件的影响。尤其是在缓释条件下，缓释高分子微球中的多糖微粒吸水溶解形成粘稠的胶状充满与微球内的扩散通道。这些胶状多糖一方面滞缓了蛋白大分子相互之间的接触和聚集以及在可降解高分子内表面上的吸附，同时选择性地对小分子缓冲液高度通透，而对蛋白大分子则不然。

Description

用于结构易变的试剂的无副作用微囊包封技术及水相-水相乳剂的应用

与之相关的专利申请

本申请确认2002年6月所申报的(申请号60/384,971)美国专利优先权申请和同年10月所申报的(申请号60/418,100)美国专利优先权申请所覆盖的权力要求。上述专利优先权申请文件作为参考文献列在本申请中。本申请中我们给出了各种相关的文献，公开了其中的技术细节，以便更充分地描述本专利相关的技术状态。

技术领域

该发明揭示了一套制备新型玻璃体颗粒体系的独特方法。这样一个颗粒体系能够有效地在制备、储存以及应用过程中保存蛋白质、多肽、DNA、脂质体和病毒颗粒等的结构和活性。

背景技术

由于吸收性能差、体内半衰期短，大部分的蛋白质药物需要通过频繁的注射给药。为了降低这种注射的频率，1970年代以来[1]，这类药物的缓释剂型的研发吸引了本领域科学家的大量关注，至今仍是尚在攻关的课题。然而，大量的科研投入并没有取得预期的结果[2]。到目前为止，只产生了一个缓释蛋白药物剂型-重组的人类生长激素(而且还由于一系列技术问题与2004年6月被生产厂家撤出了市场)。技术久攻不破主要的障碍在于蛋白质在制剂过程和体内释放过程中的稳定性问题[3，4]以及体内的突释和不完全释放。

在过去的几十年里，文献中见到过各种关于提高蛋白质在微囊包过程中的稳定性的方法的报道[3，5，6]。但是，这些方法只能解决一个或一部分问题，而对于其他问题不能兼顾，甚至引发出新的问题。也有些方法只适用于特定的一种蛋白质。还有一些报导也由于研究者自身所关注的研究领域不同而显得互相矛盾。举个例子说明，对于市场上唯一同类产品--缓释重组人类成长激素(rhGH)来说，其稳定性是靠和锌形成络合物来实现的[7]。而与锌形成络合物是rhGH在体内的自然形态[8]。当这种锌络合制备方法用于另一种蛋白，如促红细胞生成素(EPO)，蛋白分子发生聚集的比率可以高达40％[9]，引起导致免疫原性的顾虑。为避免蛋白在微囊包过程中因解除有机溶剂而变性失活，科学家预先将蛋白分子与糖类、无机盐或者其他保护剂制为固体颗粒状，从而采取一种固体分散在油相，再进一步分散在水相(即油包固体-水包油，S-O-W)的方法微囊包蛋白药物[7，9，10]。这些蛋白稳定化辅料常常由于其高溶解度而产生强渗透压，引起突释[11，12]。比如，当溶解度高的硫酸盐用于提高EPO在微囊包过程中的素稳定性时，突释高达总剂量的55％[9]。

Cleland和Jones研究了在W-O-W〔油包水-水包油〕和S-O-W微囊化过程中各种辅料对重组人类生长激素和干扰素的保护作用，发现甘露醇和海藻糖能够在防止蛋白在微胶囊过程中聚集这个方面起到最好的作用[6]。Sanchez核查了类似的赋形剂对于另一种蛋白-破伤风类酶素的保护作用，结果发现在Cleland和Jones的报告中被认定为对复原重组人类生长激素和干扰素不起有效作用的葡聚糖能在水合条件下的释放阶段对蛋白质起到最好保护功能[10]。这样的实验似乎说明了单糖在干燥过程中对蛋白能起到更好的保护作用，而多糖则在释放阶段起到更好效果[13]。不过，Sanchez的葡聚糖-PLGA复合微球缓释剂型的释放曲线显示60％的载药量发生了突释。这种突释放也许是由于直接冻干法制备的蛋白-辅料颗粒尺寸过大引起的[14，15]。

在S-O-W过程中，预制备的蛋白颗粒的大小十分重要。Morita发现当固体蛋白质颗粒的直径从5微米增大到20微米时，不仅初期的释放速率翻倍，其微囊包封率从80％下降到20％[15]。Cleland讨论了在S-O-W过程前缩小蛋白质微粒体积大小的方法[6]。进一步粉碎蛋白质冻干粉不能得到直径小于10微米的微粒，而把这些粉末研磨成更小的尺寸的方法却受阻于研磨热引起的蛋白质性变。喷雾干燥法或许可以提供足够小的蛋白颗粒，但是喷嘴附近的高剪切力和液体与空气间的界面张力会使蛋白变性[6，16]。更不妙的是，喷雾干燥或喷雾式冷冻干燥中须使用表面活性剂，而表面活性剂又促成了蛋白质在下一步制剂程序中与溶剂互相作用[6]。Maa等报道了在喷雾干燥之前预先将重组人类生长激素和锌络合的方法防止蛋白质成分的聚集[16]。不过锌络合会导致生长激素以外的蛋白性变[9]。Motita等用PEG沉淀蛋白质的方法制备了蛋白超微颗粒[15，17]。但是，在微囊包过程中这些微粒还是直接处于有机溶剂的作用下。由于蛋白质对于聚合物基质的内部表面的吸附作用，未受任何保护的蛋白质和PLGA的直接接触会引起不完全的释放[18]。为了避免亲水-疏水分界面，科学家曾用亲水性双相体系制备多糖微粒[19，20]。然而，在乳化阶段必须靠共价或离子同步交联作用来固化颗粒，从而使蛋白质暴露在活性反应物中。

结构脆弱的蛋白大分子药物的缓释剂型的开发需要一个能够全面解决上述所有问题的技术方案。这一方案至今没有诞生的事实说明对于一系列技术难题，常规的方法已经无能为力。我们需要新的关于蛋白微囊化的概念技术。

在与本专利申请相关的前一项专利申请中，我们已经提出了一套独特的微囊包方法：运用稳定的高分子水相-水相乳剂(这一在我们之前尚未见到报道的体系)。这一乳液体系和传统乳剂不同，其分散相和连续相均为水相。这一体系也不同于所谓的亲水两相体系(aqueous two-phasesystem)。后者只要停止搅拌会立即形成两个连续相(two block phases)。而这一新型乳液体系则可不需化学交联固化(离子作用或共价作用)、在不发生分散相溶合的前提下存在至少一周以上。鉴于这些独特性，蛋白质、脂质体、病毒颗粒等稳定性差的治疗物质可以避免有机溶剂、浓缩盐、极端PH值、交联剂、强剪切力、高温和高界面张力等因素影响，而被包封到这种乳剂微滴当中。通过冷冻干燥或者其他干燥方法处理之后，乳剂的分散相形成粒径分布均一的、紧密的玻璃体微粒，(可用于蛋白药物吸入或者缓释输送)。我们先前的工作从概念上证实了这一基于稳定的水相-水相乳液的蛋白质微囊化方案可以全面系统地解决制剂、存放和药物释放过程中的一系列稳定性问题[3]。此外，制剂过程中所使用的辅料都是人体可以注射的。

此次申请进一步证明了稳定的高分子水相-水相乳液用于蛋白药物输送技术的有效性。蛋白药物通过在水相-水相乳液分散相和连续相分配平衡而被包封于分散相中，通过缓慢冷冻干燥形成紧密的玻璃体微粒，整个制剂工艺过程避免了任何物理、化学因素带来的损失，蛋白分子一经制成紧密的玻璃体微粒，便具有了超稳定性，即使在有机溶剂、生理条件下仍旧可以长期保持固有的生物活性，进而用生物可降解高分子进行微囊包，释放过程中没有突释及不完全释放。载于多糖玻璃体微粒(拟命名为AqueSphere)的蛋白质显示了对于有机溶剂的耐受力和在37摄氏度的水合条件下的持续的活性。

发明内容

本发明的目标之一是提供一种蛋白质药物微球的制备方法。这个方法是我们在前一项专利申请中描述过的稳定的高分子水相-水相乳液以及“AqueSphere”(通过水相-水相乳化制备的多糖玻璃体微球)的运用[24]。这个新的方法包括：1)把蛋白质载进稳定的水相-水相乳液的分散相中；2)将载有蛋白分子的乳液分散相制备成直径在1-5微米之间的AqueSphere(这一粒径刚好是吸入剂的最佳尺寸)；3)把AqueSphere微囊包在可用于缓释注射的PLGA或其他可降解聚合物微球中；4)将蛋白以外的其他敏感的治疗试剂(如脂质体或活病毒等)担载于AqueSphere中，用于吸入给药疗法。

蛋白大分子药物缓释剂型或非注射剂型研发中的一个主要难点是蛋白大分子在制剂过程中变形失活。为防止这样的性变，制剂过程中应使蛋白药物避免接触(或在有保护的条件下接触)以上所提及到的物理和化学的不利条件。在选择保护蛋白药物的方案时，必须保证最终产品的性质，比如微球大小和形状、释放曲线、包封率、以及长效作等不打折扣。此外，具有这些优良性质的剂型的制备方法应简便、易于质量控制、而且不造成环境污染。

此发明揭示了一个可以达到上述所有目标的简便可行的技术方案。

首先，像蛋白质这样结构脆弱的生物物质能够通过稳定的水相-水相乳液[24]在不受任何物理、化学因素影响的条件下制备成多糖玻璃体微粒。由于水相-水相乳液的界面张力很低(其基本性质)，制备过程所需的剪切力亦不高，多糖微粒的粒径分布均匀。而且，这种系统可以被冷冻干燥成直径在1-5微米范围的玻璃体微粒。一旦被担载于这些玻璃体微粒，被装载物质的结构将得到有效的保护。由于其亲水性和高玻璃态转化温度，该体系具有对有机溶剂的和周围温度与湿度的强耐受性(有利于保持蛋白活性)。载有生物治疗物质的AqueSphere可直接用于吸入剂，或通过进一步微囊包在可降解聚合物体系中实现缓释的目的。

制备缓释微球时，AqueSphe可以通过常规的S-O-W或者S-O-O微囊化方法被载进PLGA或其他可降解的聚合物微球中。我们在实验中将PLGA微球重新溶解将AqueSpher从中回收，观察到AqueSphere保持着微囊包前的的大小和形状(见实例4)。

经过细胞增殖实验，我们证实了载于AqueSphere的蛋白质的生物活性在和有溶剂互相作用与微胶囊化过程后依旧得到有效的保存(见实例5，6，7)，说明蛋白大分子的构象在多糖玻璃体基质中得到很好保护。除此之外，AqueSphere在微囊化并回收后的活性保持实验(见实例7)说明蛋白质药物微囊化的包封率很高。

蛋白大分子缓释剂型研发中最大的挑战是如何在体温度及水合条件下长时间地保证蛋白质的活性[21]。潮湿和高温增加了蛋白分子的可动性同时降低了其水解、聚合以及构象改变的能量势垒。利用这个技术，载于AqueSphere中的蛋白质能够在37摄氏度的水合状态下保持持久的活性(见实例8)。比如，重组的人类促红细胞生成素(EPO)的体内半衰期为8.5小时，载于AqueSpher的EPO在水化和37度下的半衰期长达一周。吸水溶解的AqueSpher在蛋白质周围形成高黏度的基质，降低了蛋白大分子的可动性，制约了蛋白分子之间以及蛋白分子与其他物质(可降解聚合物基质或体内的酶)的接触的机会。

突释，即相当剂量的担载药物在用药初期快速释出，是蛋白大分子缓释技术研发的又一难题。尽管原因可能不同，但是这种效应在植入剂型和注射微球中都存在。另外还有不完全释放，即一部分蛋白质由于和聚合物基质的吸附作用而不被释放出来。通过将蛋白质先载于AqueSpher再微囊包在可降解聚合物微球中的方法可以同时解决突释和不完全释放的问题(见实例9)。

此外，AqueSphere还可以起到降低由于聚合物降解引起的微球内部局部酸性的作用。这种局部酸性被认为是引起释放阶段中蛋白质性变的另一原因。水化条件下，AqueSphere在可降解聚合物基质中形成互相联系的扩散通道，其高黏度基质一方面限制蛋白大分子的扩散，同时却对小分子缓冲剂畅通无阻。这种自然属性使得局部酸性在缓释过程中得到缓冲。除此之外，表面活性分子(钠藻酸盐)本身也具有缓冲效应。

这项发明提供了一种简便且有效的方案，使蛋白大分子缓释微球剂型的研发过程中长期存在的技术难题[3，5]迎刃而解。

附图说明

图1：载有肌红蛋白的稳定的水相-水相乳液。该图拍摄于样本制备好一个星期之后。

(1)分散相：1ml，含5w/w％的肌红蛋白和20w/w％的葡聚糖；连续相：5ml，含1w/w％钠藻酸盐和20w/w％PEG.

(2)分散相：1ml，含5w/w％的肌红蛋白和20w/w％的葡聚糖；连续相：10ml，含1w/w％钠藻酸盐和20w/w％PEG.

(3)分散相：0.5ml，含5w/w％的肌红蛋白和20w/w％的葡聚糖；连续相：10ml，含1w/w％钠藻酸盐和20w/w％PEG.

(4)分散相：1ml，含5w/w％的肌红蛋白和20w/w％的葡聚糖；连续相：5ml，含20w/w％PEG.

(5)分散相：1ml，含5w/w％的肌红蛋白和20w/w％的葡聚糖；连续相：5ml，含1w/w％钠藻酸盐，20w/w％PEG和10mMNaCL.

(6)分散相：1ml，含5w/w％的肌红蛋白和20w/w％的葡聚糖；连续相：5ml，含1w/w％钠藻酸盐，20w/w％PEG和100mMNaCL.

样本4和6中所示的棕色分散相，(肌红蛋白/葡聚糖)制备后立即发生聚集，一夜后在容器底部形成一个分层。样本1，2，3和5中的在显微镜观察下没发现任何的变化。

图2：稳定的水相-水相乳液和多糖玻璃体微粒的显微镜图像；

2A)在图表1-1中所示的稳定的水相-水相乳液的显微镜图像；

2B)将(2A)冷冻干燥并用二氯甲烷洗去其表面上所附的干燥PEG成分后的多糖玻璃体微粒的显微镜图像。

图3：S-O-W法制备PLGA微球的过程

3A)S-O-W法制备过程中AqueSpheres载于PLGA-有机溶剂乳珠的显微镜图像；

3B)固化后的含有AqueSpheres的PLGA微球。

图4：从PLGA微球体(图3B所示)中回收后的AquSphere的显微镜图像。

回收的AqueSpheres的大小和形状与微囊包在PLGA微球之前没有明显变化(见图2B)。

图5：使用水相-水相乳液和AqueSphere技术进行缓释微球制备的每一步骤后中的B-半乳糖酐酶的催化作用的比较分析。

比起载于新鲜的水相-水相乳液中的β-半乳糖酐酶，经过一系列制剂过程后，其对o-nitrophenyl-b-D-galactopyrannoside(ONPG)的降解反应的催化活性只是稍微的降低了一些。

图6：经历了各个制备步骤之后的rhEPO对TF1细胞增殖的生物活性。

同样单位的rhEPO在经历了乳化、冷冻干燥、二氯甲烷洗涤之后对TF1细胞增殖的生物活性。细胞增殖活性通过在显微镜下统计每个培养皿中细胞的平均个数进行评价。

图7：经历了各个制备步骤之后的rhGM-CSF对TF1细胞增殖的生物活性。

同样量的rhGM-CSF在经历了乳化、冷冻干燥、二氯甲烷洗涤之后对TF1细胞增殖的生物活性。细胞增殖活性通过在显微镜下统计每个培养皿中细胞的平均个数进行评价。

图8：加水并在37摄氏度放置后的rhEPO对TF1细胞增殖的生物活性。

样品分析：对含有rhEPO的AqueSphere添加相当于其质量两倍的水，在37度下放置不同时间，取出测试对TF1细胞的增殖活性；对照分析：把同等量的rhEPO置于TF1细胞培养液在37度下放置与样品分析相当的时间，测试对TF1细胞的增殖活性。

图9：加水并在37摄氏度放置后的rhGM-CSF对TF1细胞增殖的生物活性。

样品分析：对含有rhGM-CSF的AqueSphere添加相当于其质量两倍的水，在37度下放置不同时间，取出测试对TF1细胞的增殖活性；对照分析：把同等量的rhEPO置于TF1细胞培养液在37度下放置与样品分析相当的时间，测试对TF1细胞的增殖活性。

图10：加水并在37摄氏度放置后的β-半乳糖酐酶之催化活性。

样品分析：对含有β-半乳糖酐酶的AqueSphere添加相当于其质量两倍的水，在37度下放置不同时间，取出并测试对ONPG的降解反应的催化活性；对照分析：把同等量的β-半乳糖酐酶置于海澡糖溶液在37度下放置与样品分析相当的时间，测试对ONPG的降解反应的催化活性。海藻糖溶液的浓度为30w/w％.

图表11：肌红蛋白从PLGA微球体中的释放曲线。该释放过程的研究是采用让50mg微球体悬浮在2ml的0.1MBPS缓冲液中来进行的。我们使用BCA方法对所释放的肌红蛋白进行定量。◆：将肌红蛋白颗粒直接微囊包于PLGA微球的释放曲线；PLGA中的L/G为50/50，分子量为6K。◇：将肌红蛋白-葡聚糖微粒载于PLGA微球后的释放曲线；PLGA的参数同上。

图12：肌红蛋白从不同分子量及L/G的PLGA微球体中的释放曲线。○：PLGA的L/G比为50/50，分子量为12K；□：PLGA的L/G比为65/35，分子量为12K；△：PLGA的L/G比为75/25，分子量为12K；■：PLGA的L/G比为65/35，分子量为20K。

具体实施方式

本发明阐述了运用稳定的高分子水相-水相乳液[24]制备蛋白药物及其他生物分子的缓释微给药体系的制备方法。当生物分子被溶于多糖溶液，经(水相-水相)乳化、冷冻干燥处理，其结构在将会“固化”在亲水性玻璃体微球中。这样的玻璃体微球(AqueSphere)具有以往报导过的体系所不具有的一系列优点。

在S-O-W或者S-O-O微囊包过程中，预制备的蛋白质-多糖的细小而均匀的玻璃体颗粒对于防止突释以及提高包封率非常重要[6，13]。本发明提供了将蛋白质担载于的细小均匀的多糖玻璃体微粒的新方法(1-3um，见实例1，2)，使蛋白大分子的构象不再受有机溶剂、强界面张力、高温、大量表面活剂、(共价或离子的)交联剂等各种不利因素的影响。关于这些因素在缓释剂型制备的不同步骤中造成蛋白分子变性失活已有报道[3，6，21]。如我们上面所提及，目前为止还没有一种方法(无论是W/O乳化、喷雾干燥、喷雾冷冻干燥、冷冻干燥、研磨、化学交联等)能够在满足上述所有条件下用于制备蛋白大分子缓释微球。

此外，利用喷雾干燥和喷雾冷冻干燥法只能将小分子量的糖或盐类稳定剂的制成微粒。多糖溶液因其高黏度而不易喷雾。本发明中的稳定乳化方法可以很容易地将高黏度的多糖溶液制成微粒。在稍后的论述中，我们将进一步证明多糖作为蛋白稳定剂在提高蛋白稳定性和改善蛋白释放动力学中具有一系列优点。

一旦被载进多糖微粒中，蛋白质便在微囊包过程中得到有效的保护，具有了对有机溶剂的耐受性。实验中，我们将β-半乳糖酐酶、rhEPO和rhGM-CSF载进AqueSphere中、并用二氯甲烷(DCM)洗涤或者用二氯甲烷当溶剂将其微囊包在PLGA微球中。这些蛋白分子的生物活性在上述制备过程的每一个阶段都得到很好保护(见实例5，6，7)。一般来说，蛋白质和有机溶剂的接触是制备可降解聚合物缓释微球时的一个有害因素[3]。

除了对有机溶剂的耐受性外，AqueSphere还可以保护蛋白质使其不会在37摄氏度水化条件下发生聚集和构象变化。在如此条件下保护蛋白质是蛋白缓释技术研发中最大的技术障碍[21]。我们将载于AqueSphere中的rhEPO、rhGM-CSF和β-半乳糖酐酶在水化条件，37摄氏度下培养，发现蛋白质的活性还是可以得到较好的保存(见实例8)。对于rhEPO来说，它在溶解状的AqueSphere中的半衰期是在细胞培养液中的态水球体中的7倍(见图8和实例8)。对于rhGM-CSF来说，即使在37度、水化条件下经过9天的培养，它的生物活性也没有明显的下降(图9和实例8)。在同等条件下我们对在于β-多乳糖酐酶Aquesphere和海藻糖溶液(一种常用的蛋白质稳定剂)中的活性做了比较。水化条件、37度下培养一周的结果证明AqueSphere保护下的蛋白活性是在海藻糖之中的5倍(见图9及实例8)。

AqueSphere载于可降解聚合物微球中可带来理想的线性释放，克服突释和不完全释放的问题。一般来说，基于PLGA微球的蛋白大分子缓释常显示三个阶段[22]：由于吸附在微球表面[25]或内部大孔径扩散通道[14]分子的初期扩散；其后的滞后阶段，以及由于聚合物的大范围降解引起的加速释放阶段。对于一些临床治疗来说，第一天50％药量的突释可能是相当危险的。由于颗粒小而均匀，AqueSphere可以均匀分布在可降解聚合物基质中(见实例3)，从而降低蛋白质在微球表层的分布。同时，小分子量的蛋白质稳定剂在聚合物基质中快速溶解(造成高渗透压[11])和扩散，AqueSphere吸水后则形成高黏度胶质，充满扩散通道。由于多糖分子自己从聚合物基质中扩散出来的速率很慢，这一高黏度稳定剂存在制约了蛋白质的突释(见实例9)。而且，这种缓慢扩散可以和稍后的降解过程重叠，改善三段式的释放模式(见实例9)。

蛋白质和可降解聚合物的互相作用是引起不完全释放及不溶解的蛋白质聚集物的重要原因[18]。用目前这种新方法，在整个释放过程中，蛋白质分子都被高黏度的多糖所环绕[23]，从而降低了蛋白质与聚合物的接触吸附。在图表11(实例9)中，我们比较了以纯蛋白颗粒的形式直接微囊包在PLGA微球和通过AqueSphere微囊包在PLGA微球的肌红蛋白释放曲线。直接微囊包的肌红蛋白，在45天时间里只有少于20％的装载蛋白质释放出来；而后一种情况在同样时间里却释放了70％的装载物。

PLGA基质中的局部酸性是引起蛋白质性变的另一原因[3]。聚合物降解时产生的降解物(乳酸和乙二醇酸及它们的低聚物)可能滞留在聚合物基质内部从而使局部的pH值下降。本发明的体系里，AqueSphere吸水溶解后在PLGA基质中形成高黏度的胶状态充满扩散通道。这一结构一方面滞缓大分子蛋白质通过，另一方面对小分子缓冲剂通透性很好，从而使局部酸性得以缓冲。此外，被作为乳化剂的海藻酸钠(见实例1)具有一定缓冲作用。在一个滴定测试中，当100ul的0.1N HCl加到0.9ml150mM(以单体计算)的海藻酸钠溶液中时，pH值保持在5左右。而同样体积的水的话，那么加入10ul同样的酸则会使PH值下降到1。

本发明针对于蛋白大分子药物缓释输送体系的一系列技术挑战，第一次提供了一种简便且全面的技术方案。这一方案，不仅使蛋白大分子药物在缓释剂型的制备过程和释放过程中得到很好的保护，而且能够制约突释和不完全释放，获得理想的释放曲线。这一技术在类似蛋白的结构敏感的治疗物质的输送体系的研发中当有着广泛的应用。

以下的实例为更好地理解这一发明提供了参考；但本领域的专家应能够理解：这些例子只是为了更好地演示技术原理，而绝不会限定本发明的应用范围。

实例

实例1：聚合物水相-水相乳剂的稳定性。

我们通过在显微镜下观察水相-水相乳液的分散相的聚集和直接观察带颜色分散相是否沉积为一断层(block phase)。这个分散相是由葡聚糖溶液来形成的。用溶度分别为5，20，40w/w％的葡聚糖溶液进行实验表明结果没有明显的不同，不管是用哪一种溶度的溶液，都会形成稳定的水状乳剂。实验中，平均分子量为10,000、67,000和500,000的葡聚糖，结果也是大约一致。分别用溶度为5，20，40w/w％的PEG作为连续相进行试验，也都可以形成稳定的水相-水相乳液。变换PEG的平均分子量，取8000和22,000，均获得稳定的乳液。作为乳化剂，我们测试了海藻酸钠、甲基羧基葡聚糖和甲基羧基纤维素。所有都可起到在稳定水相-水相乳液的作用。因为海藻酸钠资源十分丰富，所以在大部分的实验中予以采用。实验中海藻酸钠的溶度分别取了0.2，1，1.5w/w％。乳液稳定剂海藻酸钠被分别置于分散相和连续相进行实验，没有发现对乳液稳定性产生影响。为了便于观察，我们可在分散相中加入有色分子、如兰色的葡聚糖(分子量为50,000和1,000,000)或者肌红蛋白作为指示剂。

我们还变换葡聚糖和PEG溶液的比例(1∶5到1∶20之间)，以及添加氯化钠进行了实验，将制备的水相-水相乳液滴放于显微镜下观察并将图象拍摄下来。最后将试验所用的这些样本放于瓶子里以待继续观察。

图1显示了搅拌停止并被储存于室温环境里一个星期之后的聚合水状乳液的图象。我们用肌红蛋白作为被装载在扩散层的蛋白质样本，结果肌红蛋白显现出褐色。在所有的六个样本中，只有样本四是在没有使用海藻酸钠的情况下配制的。样本六和样本一的不同之处在于后者中添加了100mM的氯化钠。在四和六这两个样本中，搅拌一停止，分散相便开始聚集，很快在几个小时里面形成两个断层。再看看图1中的另外四个样本(1、2、3、5)：分散相粒径一周后仍保持在3-7微米这样一个范围(图2A)。这个结果正好支持了我们的下述理论：带电荷的海藻酸钠分子会吸附在分散相表面形成扩散双电层，阻断了分散相粒珠的聚集和融合。随着氯化钠浓度的增加，钠离子屏蔽了海藻酸钠形成的扩散双电层，分散相便得以聚集。将葡聚糖和PEG溶液的比例降低到1∶15就将保持乳液长达两个星期的稳定性。

在这个实验里，肌红蛋白在连续相和分散相间的分配系数为1∶50，这也意味着大部分的肌红蛋白都存在于葡聚糖层中。除了肌红蛋白以外，rhGM-CSF和携带AmB分子的脂质体也都装载在这个系统里并形成和在图2B里一样的玻璃体微粒。经过活性试验(详见后面分析)或UV吸收测试，大约93％的rh-CSF和95％的AmB/脂质体存在于分散相中(UV吸收波长为408nm)。图2A显示了不含氯化钠的聚合物水相-水相乳液的显微镜图像。我们得到了直径在3-8微米之间的分散相液珠。

实例2：AqueSphere的制备

AqueSphere将上述稳定水相-水相乳液进行冷冻干燥而制备。在冷冻干燥后，葡聚糖液滴就会转变成固体微粒。然而，大部分的葡聚糖微粒却还是都分散在由PEG连续相所形成的固体基质上。PEG可用二氯甲烷或者乙腈冲洗除去。这些溶剂既不溶解(dissolve)也不溶胀(swell)干燥的葡聚糖微粒。图2A和2B显示的是在不同制备阶段的葡聚糖微粒的显微镜图像：乳化、冷冻干燥后用二氯甲烷冲洗(以除去`PEG)，以及从PLGA微球中回收。冷冻干燥后，分散相粒径从3-7微米下降到1-3微米。这是由于水分丢失而引起的体积缩小(见图表2B)。这些图象也说明在冻干过程中不会发生任何的溶液微滴溶合。这样的直径范围大小正好很适合于吸入性使用治疗药剂的传输，同时也十分适合于通过双乳化法(S-O-W)制备微球。

实例3：AqueSphere在PLGA微球的微囊包。

通过S-O-W乳化过程，AqueSphere可以进一步被微囊包在`PPLGA基质或其他可生物降解的微球中。在这个研究实验中，我们使用的PLGA的L/G比分别为50∶50和75∶25。实例2中所制备的AqueSphere先被悬浮在PLGA的二氯甲烷溶液中；AqueSphere与PLGA的比例在1∶2和1∶20之间。然后将这一悬浊液进一步分散到含有0.1-10％氯化钠和0.1-4％聚乙烯乙醇或者PEG、PVP的水溶液中。这两相的体积比例在1∶2到1∶10之间。在乳液形成之后，将其倒进体积大的多的冷水(体积为乳液的10倍以上)中并缓慢搅拌，这样就可以把有机溶剂提取出来。图表3A和3B显示的分别是在有机溶剂提取之前的PLGA微滴和其后的PLGA微粒。在溶剂提取前，PLGA微滴是透明的，且AqueSphere分布在其中；之后，因为溶剂的提取而硬化，失去透明度。

实例4：AqueSphere从PLGA微粒中的回收

AuqeSphere可以从实例3所描述的PLGA微球中回收回来。将载有AqueSphere的PLGA微球在二氯甲烷或乙腈中重新溶解后离心，去掉上清液，如此反复4至6次，AqueSphere得以回收。图4显示了从PLGA微球中回收后的AqueSphere。回收后的AqueSphere的大小与形状和被微囊包进PLGA微球之前一样。该结果说明了在微囊化处理过程中AqueSphere的水化作用不明显。

为了评价包封率，我们测量了回收后的AqueSphere的重量。PLGA微囊包前后的葡聚糖AqueSphere的重量基本一致，分别为1∶19和1.06∶19---说明了本发明中的微球制备方法有很高的包封率。这个结论和微囊包前、后对蛋白质活性试验的结果是一致的。

实例5：使用有机溶液的制备过程中，AqueSphere对β-半糖乳糖酐酶的保护作用

为了验证有机溶液存在条件下AqueSphere对结构易变的蛋白大分子的保护作用，我们把β-半糖乳糖酐酶(一个具有四级结构、分子量为434KD的酶)载进AqueSphere进行了测试。先将蛋白质以10-100单位/ml的比例溶于葡聚糖溶液(MW＝10-500KD，浓度＝5-25％)，然后将其加入实例1所描述的PEG溶液中乳化。冷冻干燥后，像实例4那样用二氯甲烷反复洗涤几遍除去PEG。接下来的步骤中，将所回收的载着蛋白质的AqueSphere在缓冲液中重新溶解，加入o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)，测试对底物-ONPG的水解催化活性。如图5中所示，酶的催化作用在经历了从实例1到实例2所描述的操作过程(包括乳化、冷冻干燥以及二氯甲烷洗涤)后，只是下降了不到10％。此10％的活性下降还包括了由于在乳化过程中被分配在PEG相的部分蛋白以及冷冻干燥过程中损失的蛋白活性。也就是说，在与微囊包过程所用的有机溶液-二氯甲烷的接触中，AqueSphere有效地保存了蛋白酶的活性。

实例6：水相-水相乳液中，rhEPO和rhGM-CSF在分散相和连续相中的分配

首先，按照实例1的方法和条件制备含有rh-EPO和rhGM-CSF的稳定的水相-水相乳液。然后将乳液离心，分离其分散相和连续相。将分离的两相分别溶解稀释，加入TF1细胞培养皿中测试其对细胞增殖的活性。蛋白质的活性可以通过在显微镜下计量细胞的数目来衡量。实验结果发现大约93％的rhEPO和93％的rhGM-CSF分配于葡聚糖相中。

实例7：使用有机溶液的制备过程中，AqueSphere对rhEPO和rhGM-CSF的保护作用

接下来我们考察了AqueSphere对提高rhEPO和rhGM-CSF对有机溶剂的耐受性的作用。首先将蛋白质按照实例5中的方法载进AqueSphere。其生物活性的测试通过细胞增殖法进行(如实例6)。将用二氯二甲烷洗过的AqueSphere重新溶解，加入同样的细胞悬浮液中培养。图6显示了rhEPO细胞增殖活性。冷冻干燥之后，85％的活性仍然保存下来-细胞数目从冷冻干燥前的27800减少到冷冻干燥后的23700。将冻干后的样品置于二氯甲烷洗涤，导致细胞增殖数目减少到22600，相当于95％的蛋白质活性被保存下来。由于重量测试显示有机溶液洗涤后有大约94％的蛋白质分配在葡聚糖相(实例6)，可以认为存在于AqueSphere中的蛋白质的活性基本上不受有机溶剂影响。

图7显示了rhGM-CSF在经历了每个制备步骤后的活性测试结果。将含有蛋白质的水相-水相乳液冷冻干燥，每个容器中细胞的平均数由130900下降到122600，相当于蛋白活性保存了94％。继续用二氯甲烷清洗冻干粉以除去残余的PEG后，细胞增殖数目下降到111100，即活性减少了大约9％，。减少的这9％和乳化时分配在PEG连续相中的rhGM-CSF部分相当(大约为rhGM-CSF总数的7％，见实例6)。将含有蛋白质成分的葡聚糖微粒(AqueSphere)载进PLGA微球体中没有再引起蛋白质活性的下降，每个容器中平均的细胞增殖数量此时为118900。这种蛋白活性保存率也反应出较好的包封率，这点与重量测试的结果是一致的(实例4)。

实例8：生理温度、水化条件下AqueSphere对rhEPO，rhGM-CSF和β-半乳糖酐酶活性的保护作用

在生理温度、水溶液存在的条件下能否保证蛋白质药物在漫长的缓释周期中保持生物活性是蛋白缓释剂型研发中所面临的最严峻的技术挑战。缓释过程中，可降解聚合物微球会吸收水分溶胀，而其中的蛋白质分子会处在体温和水化状态中。水化和温度的升高将增加蛋白质分子的可动度(mobility)，从而使得蛋白质产生物理和化学变化的机会增加。为了测试蛋白质在体温下的稳定性，我们将水加入装载有rhEPO或者rhGM-CSF的葡聚糖微粒(AqueSphere)中然后在37摄氏度下放置，然后在不同时间取出蛋白样品，加入FT1细胞培养皿中培养，观察细胞增殖情况。结果显示在图8和图9中。

对于rhEPO来说，载于AqueSphere的，其活性在一个星期里下降到50％(图表8)，而直接用细胞培养液稀释的rhEPO，一天里面其活性就会下降相同的幅度。由于酶的催化作用，rhEPO在人体里的存活时间为8.5小时。很明显，水化作用而形成的高黏度的多糖相(水化的AqueSphere基质)可大大延长rhEPO在生理条件下蛋白质的活性。

同样的结果出现在对rhGM-CSF(图9)的测试中。那些受到AqueSphere保护的rhGM-CSF，其10天放置后活性的存留程度为85％；而直接置于细胞培养液的蛋白样品，其活性就下降到56％。

我们对多糖对β-半乳糖酐酶在水化状态下所起的稳定化作用与海藻糖在这方面的功能进行了对比。活性测试采用了实例5中的方法。在37摄氏度条件下放置7天，处于多糖稳定剂(水化AqueSphere)的样品活性保持了原来的89％，而海藻糖溶液中的样品活性只有原来的17％。如果延长放置时间到两个星期，那么水化AqueSphere的活性将进一步下降到48％，但是相比之下，用海藻糖溶液中的样品下降到0(图10)。

实例9：无明显突释和不完全释放的蛋白质从PLGA微球中释放曲线

突释和不完全释放是蛋白药物缓释剂型研发中的另一个常见难题。由于突释效应，30％-70％但载蛋白药可能在用药初期立即释放。不完全释放指的是20-40％的蛋白质成为不溶残渣不再释放出来。这类问题可以通过将蛋白质预载进AqueShere中的方法避免。先通过水相-水相乳化，将蛋白药物载于AqueSphere(0.1-20％)，然后用S-O-W法将含有蛋白质的AqueSphere微囊包在PLGA微球中。在PLGA中的肌红蛋白的装载容量为0.25-5％。微囊包时，PVA，PEG和PVP则作为表面活剂加在水相中。图11所显示的分别通过AqueSphere保护或直接微囊包在(端头甲基化的)PLGA微球中的肌红蛋白的释放曲线。当纯肌红蛋白颗粒直接微囊包进PLGA微球时，45天里面只有17％的蛋白质释放出来。对于预载进AqueSphere然后微囊包的肌红蛋白，75％的蛋白质担载量在45天时间释放，而且在开始阶段不出现突释。我们也用端头非甲基化的PLGA制备了微球，实验中观察到了同样的无突释的肌红蛋白的线性释放(图12)。

图12显示的是肌红蛋白从分别由L/G比为50∶50，65∶35和75∶25的PLGA(MW＝12K)制备的微球中释放出来动力学曲线。所有这些PLGA微球都先将肌红蛋白预制备在AqueSphere后通过S-O-W法制备的，其第一天的释放量大约为载药量的7％-12％，随后释放亦为线性的。对于PLGA的L/G比分别为50/50和65/35分子量为12K的微球，释放90％的载药量需50天时间。PLGA的L/G比增加到75/25时，同样的时间里只有80％的载药量得到释放。如PLAG的分子量增加到20K，也引起了释放速率的降低。对于L/G比例为65/35的PLAG来讲，在50天释放了65％载药量。不管是上述情况中的哪一种，肌红蛋白的释放曲线都几乎是线性的。根据对微球制备后的上清液中蛋白质的含量进行的分析，肌红蛋白在上述PLGA微球中的包封率大概为90％。

实例10：从PLGA微球中释放的GM-CSF的生物活性

含有rhGM-CSF装载进PLGA微球通过实例1，2和3中所描述的方法制备。蛋白质与葡聚糖的比例为1∶500，而AqueSphere与PLGA的比例则为1∶5。载有rhGM-CSF的PLGA微球悬浮在缓冲液中并在37摄氏度条件下缓慢摇动。每天都将上清液收集起来并代之以新鲜的缓冲液。将收集的上清液稀释20倍，并采用实例7中的方法进行测试。在不同的日期所测试出来的活性的水平标记在图13中。蛋白质的活性在施放实验开始后的第24天前基本保持在相同水平，其后逐渐下降至第32天活性降至零。

缓释过程中聚合物的降解在PLGA微球中产生的局部酸性也是造成蛋白质性变的重要原因[26]。为了考察酸性对rhGM-CSF活性的影响，我们将蛋白质置于pH值分别为1，2，3，4，5，和6的葡聚糖溶液中在37 C下摇动一天。相对于在pH值为6的溶液，rhGM-CSF在pH值为4的溶液中的活性下降到了原来的75％。当pH值小于2时，活性下降到45％。但是对于蛋白质从PLGA微球中释放的情况来说，却不会观察到这种类似的情况发生。这个结果表明局部酸性不会在PLGA微球中形成。这可能是由于AqueSphere在水合状态下形成了具有胶状扩散通道所致。虽然这种充满多糖分子的通道滞缓蛋白大分子的渗透，却对小分子畅通无阻。因此在蛋白质缓释过程中由PLGA的降解产生的酸性得到缓冲。

引用文献

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Claims (22)

1.使用有稳定性的水相-水相乳液将化学成分进行微囊包制备微球的方法，其中包括：

A.选择多糖作为水相-水相乳液的分散相，选择亲水性聚合物作为其连续相，并选择水相-水相乳液的稳定剂及其浓度，以制备稳定的高分子水相-水相乳液以及通过这样的乳液将有用化学成分载于乳液的多糖分散相中；

B、包括至少一种有用的化学成分；

C.将载有化学成分的多糖分散相的尺寸与形状控制在适当范围内；

D.干燥水相水相乳液；以及

E.干燥后通过有机溶剂的洗涤除去连续相。溶剂不得对载于分散相中的化学成分造成影响。

2.权利要求1中所用到的材料组合，包括：亲水性的分散相，亲水性的连续相，以及亲水性的表面活性成分等能够形成稳定的水相-水相乳液的所有成分。

3.权利要求2所指的材料组合包括：足够量的、能够形成水相-水相乳液分散相并且担载化学成分的多糖或者多糖衍生物。

4.权利要求3所指材料组合中的多糖包括：葡聚糖、淀粉、纤维素及其衍生物、和琼脂糖、以及所有具有相似结构的糖的高聚物或多聚物

5.权利要求4所指材料组合中的多糖的分子量在2,000至2,000,000之间。

6.权利要求3所指材料组合中的化学成分为有生物活性的物质。

7.权利要求6所指材料组合中的化学成分包括：蛋白质、多肽、DNA/RNA、脂质体以及活病毒。

8.权利要求7所指材料组合中的蛋白质和多肽包括：EPO、G-CSF、GM-CSF、干扰素、生长激素、TPA、VIII及IX遗传因子和其他用于治疗的蛋白质或多肽。

9.权利要求3所指材料组合还包扩作为辅助成分的小分子糖类化合物。这类小分子糖类具有在多糖相中协助保护活性成分不受微囊包过程破坏的功用。

10.权利要求9所指材料组合中的小分子糖类包括：海藻糖、甘露醇、蔗糖、乳糖或甘油。

11.权利要求2所指材料组合中的亲水性高分子与多糖溶液不相容从而能够作为水相-水相乳液的连续相。

12.权利要求11所指材料组合中的作为连续相的亲水性高分子包括：PEG、PEO、PEV或PVA。

13.权利要求12中的高分子的分子量在2,000和2,000,000之间。

14.权利要求2所指的材料组合中的表面活性成分为亲水性高分子。

15.权利要求14所指的材料组合中的作为表面活性成分的亲水性高分子包括：海藻酸钠、透明质酸盐、羧基甲基纤维素、羧基甲基葡聚糖、硫酸修饰葡聚糖、以及葡聚糖或纤维素的其他衍生物等骨架带有负电荷的聚合物盐类。

16.权利要求1所指的方法包括：将乳液通过冻干、喷雾式干燥或传统的干燥方式进行干燥使之固化成为载有化学成分的多糖玻璃体微粒。

17.权利要求16的方法所制备的多糖玻璃体微粒的直径在作为吸入给药方法时为1-5微米之间，作为其他用途时为1-50微米之间。

18.一种将干燥的多糖微粒微囊包进可生物降解的聚合物微球中，并用于生物活性物质的可控释放的方法，包括：

A.使用S-O-W或S-O-O方法，其中多糖分散相为其中的固相；

B.选择一种可生物降解的聚合物，将该聚合物溶于有机溶液，之后让干燥的多糖分散相悬浮在此聚合物溶液中；

C.选择表面活性的聚合物用来帮助将可降解聚合物溶液分散到含有少量盐的水溶液中；

D.上述含盐水溶液的溶度在0.5％-50％之间；

E.采用提取或者蒸发的方式将有机溶剂除去。

19.权利要求18所指的方法中的可降解聚合物为PLGA、聚伪(polypseudo)丝氨酸或其他的聚合物。

20.采用权利要求11所讲的方法制备的可降解聚合物的微粒中分布着干燥的多糖扩散相颗粒。

21.权利要求20所述的微粒中干燥的多糖分散相和可降解聚合物的比例在1∶2到1∶40之间。

22.上述权力要求2-15中任何所指的材料组合均可用于药物治疗。

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