CN101104842A

CN101104842A - 用于加热和冷却的仪器

Info

Publication number: CN101104842A
Application number: CNA2007101364664A
Authority: CN
Inventors: E·萨罗菲姆; G·萨瓦蒂克
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2006-07-14
Filing date: 2007-07-16
Publication date: 2008-01-16
Also published as: US20080014615A1; US7666664B2; EP1878501A1; CA2593249A1; JP2008017843A

Abstract

本发明提供了一种仪器和方法，它们能够方便地快速扩增核酸。该仪器以以下顺序包括：至少一个基本扁平的温度传感器元件；导热基片；以及加热器层，其中，该导热基片包括可供流体透过的一个或多个槽道。

Description

用于加热和冷却的仪器

技术领域

本发明的主题是一种用于以受控方式加热和冷却物体的仪器、一种用于实现热分布型(thermal profile)的方法、一种用于扩增核酸的方法、一种用于加热液体的系统以及一种用于测定核酸的系统。

背景技术

本发明在保健领域特别有用，其中需要对包含于其中的组分进行可靠试样分析。化学反应需要加热例如由分子诊断学可知，其中，已知核酸将通过加热至高于杂交体的解链温度而变性，即从双链的杂交体变成单链。

一种利用反应循环(包括该变性步骤)的方法是聚合酶链反应(PCR)。通过提供工具来使得特定序列的核酸量从可忽略的量增加至可检测的量，该技术使得核酸处理领域产生了革命，特别是核酸分析领域。PCR在EP0201184和EP0200362中有记载。

在EP236069中公开了一种仪器，其利用加热和冷却一伸出的金属块来以受控方式对管中的试样进行热循环。

目前，加热PCR混合物主要利用具有主动加热和冷却的珀尔帖(Peltier)元件来进行。与具有主动加热和被动冷却的系统相比，这些珀尔帖元件需要复杂的电子设备。

在US6633785中公开了一种利用电阻加热或感应加热来加热微管(microtube)的方法。

在US6602473中公开了一种由硅制成的微加工反应腔室。该装置有进口孔和出口孔，并能够用于在插入仪器中时进行PCR反应。然而，该系统不能进行灵敏且快速的温度控制。

在WO98/39487中公开了一种器具，其用于保持具有腔室的装置，该器具包括加热板或冷却板，当该装置插入所述器具中时，该加热或冷却板布置在一扁平装置的相对侧壁上。

由现有技术的仪器所提供的温度变化相对较慢。因此，需要提供更快速的流体温度变化，特别是在扩增核酸的过程中。

发明内容

本发明的第一主题是一种用于以受控方式加热和冷却物体的仪器，所述仪器从顶部至底部以以下顺序包括一个层叠在另一个顶上的：

基本扁平的温度传感器元件；

导热基片；以及

加热层。

其特征在于：所述导热基片包括一个或多个可供流体透过的槽道。

本发明的第二主题是一种用于在装置中实现热分布型的方法，包括：加热本发明的仪器中的该装置。

本发明的第三主题是一种用于测定试样中的核酸的系统，该系统包括本发明的仪器以及包含所述试样的装置，其中，在测定所述试样中的所述核酸的过程中，所述仪器与所述装置物理接触。

本发明的第四主题是一种用于扩增核酸的方法，包括：

a)在一装置中提供包含核酸的液体混合物；以及

b)使所述装置与如权利要求1至9中任意一项所述的仪器物理接触；以及

c)使所述装置中的所述试样经受热循环。

本发明的第五主题是一种用于加热混合物的系统，包括：

包含一个或多个腔室的装置，该腔室用于装所述混合物；以及

本发明的仪器；

其中，在加热所述混合物的过程中，所述装置与所述仪器物理接触。

附图说明

图1示意表示了本发明的仪器的示例组件。

图2表示了穿过本发明仪器的基片的横截面A-A′处的流体槽道的俯视图，它为用于均匀冷却的结构和用于集中冷却的结构。

图3表示了在该仪器上设置的温度分布型，以便产生PCR曲线。

图4以曲线形式表示了通过本发明的仪器进行的两次实验的结果。

参考标号：

温度传感器元件1 基片2 热器层3 流体槽道4

导热密封箔5 反应腔室6 装置本体7

具体实施方式

用于扩增核酸的方法为已知。它们将基于初始存在的目标核酸作为模板来产生大量的核酸，因为酶的活性能够复制所述目标核酸中的碱基序列。该复制子自身用作复制序列(优选是已经进行首次复制的碱基序列)的目标。这样，产生具有相同序列的巨量核酸。这就能够非常灵敏地检测目标核酸。

用于扩增核酸的特别公知方法是聚合酶链反应(PCR)方法，这在EP0200362中公开。在该方法中，反应混合物经受一种热分布型的反复循环，该温度适合于使引物退火至该目标核酸，利用所述目标核酸作为模板来使退火引物延伸，并使该延伸产物与其模板分离。

在第一步骤中，提供包含核酸的液体。该液体可以是包含要扩增的核酸的任何液体。而且，该液体包含扩增核酸所需的试剂。对于各扩增方法，这些试剂为公知的，优选是包括用于延伸引物的试剂，该试剂优选是依赖于模板的DNA-或RNA-聚合酶以及构件，该构件(例如核苷酸)将附在引物上以便延伸。而且，该混合物将包含用于建立延伸反应条件的试剂，例如所使用的酶的缓冲剂和辅助因子，例如盐。

在进一步的步骤中，将该温度调节成能够使双链核酸变性，将引物退火至该单链上，并使该退火引物延伸。该延伸反应将在聚合酶有活性的温度下进行。优选是使用热稳定和热活性的聚合酶。所形成的双链通过如上所述的变性而分开。

该过程能够利用本发明的仪器来进行。为此，装有核酸的试样作为受冷却和加热的物体而装在一装置的腔室内，该装置已插入或要插入本发明的仪器中。在下文中，更上位的术语“物体”将由优选和示例性的术语“装置”来代替。

本发明的仪器的第一部件是至少一个基本扁平的温度传感器元件。在本文中，基本扁平的意思是传感器包含的表面并不在其平均周围环境上升高超过1mm，更优选是并不在其平均周围环境上升高超过0.1mm。这样的优点是要加热的所述装置的表面与传感器元件和相邻层有良好的热接触。它设计成测量在其被布置的位置处的温度。这样的元件是本领域技术人员所公知的，且优选是电阻元件。特别有利的传感器的厚度在0.01μm和10μm之间，优选是在0.8μm和1.2μm之间。一种市场上可获得的示例传感器元件为1μm厚，可从厂家获得，例如Heraeus Sensor Technology(Kleinostheim，德国)、JUMO GmbH &Co.KG(Fulda，德国)或Innovative Sensor Technology IST AG(Wattwil，瑞士)。该元件有连接器，用于将传感器元件永久性或可逆地连接至通向控制单元的电线。该传感器元件能够根据已知方法来制造。它能够独立制造，然后通过已知方式(例如胶接)固定至其它部件。优选是，该传感器元件通过将一层材料溅射至伴随层上来制造。用于施加薄层的该方法也已知。用于该传感器元件的优选材料是镍和铂。优选是，它由铂或铂与其它贵重金属的混合物来制造。

优选是，该温度传感器元件由覆盖层保护防止机械和化学损坏。该覆盖层优选是由玻璃制成，优选是厚度在1μm和25μm之间。它优选是通过本领域公知的厚膜沉积技术来制造。此外，该层优选是具有低导电率和高导热率。

该温度传感器元件优选是设计成与试样的温度充分相关。这可以通过将该元件的形状设计成使它非常类似于装有试样的该装置的形状来实现。优选是，包括有保护覆盖层的该传感器元件的接触表面与该装置的接触表面紧密接触。由于该仪器和该装置的该限定布置，试样中的温度能够由传感器元件中测量的温度非常确定地推算出来。

该温度测量的结果用于控制该仪器中的加热和冷却过程。

本发明的仪器的第二基本部件是导热基片。该基片优选是由导热系数在2×10³和5×10⁶W/m²K之间的材料构成。而且，所述基片为扁平，因为它的厚度优选是在0.1和10mm之间，更优选是在1和5mm之间。该基片优选具有刚性特征，即对于明显的机械扭曲保持稳定。而且，该导热基片优选是由导电率小于0.1Ω^-1m^-1的电隔离材料来制造。此外，优选是该基片的特性具有较低的热时间常数(密度×热容/导热率)，优选是小于10⁵s/m²。合适的材料从以下组中选择：铝、铜、氧化铝、氮化铝、氮化硅、碳化硅、蓝宝石、铜、银、金、钼和黄铜。更优选的是具有较低导电率的材料，例如电隔离材料，如导电率小于10^-9Ω-1m^-1的材料。因此，特别有利的材料是陶瓷材料，例如氧化铝、氮化铝、氮化硅、碳化硅和蓝宝石。

该基片也可以根据已知方法来制造。优选是，该基片通过烧结陶瓷来制造。该基片可以以与该基片形状类似的形式来制备，优选是可重复使用的形式，或者在烧结处理后可以裂开成合适尺寸的片。

本发明需要使该基片包括一个或多个槽道。该槽道可以位于基片内或基片上的任意位置。在第一实施例中，这些槽道形成于该基片内，这样，该槽道的侧壁完全由构成该基片的材料来覆盖。该槽道在设计为冷却流体的进口和出口的位置处到达该基片的表面。该实施例需要仔细制造，以便保证该槽道可用于流体，但是另一方面还不会泄漏。在另一实施例(优选实施例)中，该槽道形成为在基片表面中的槽，并由另一层材料层来覆盖。该材料可以与该基片的材料相同，但是也可以不同。在任何情况下，这些槽都必须仔细封闭，以便保证流体不能在除了用于流体的确定进口孔和出口孔之外的地方从槽道泄漏至环境中。对槽的封闭可以通过直接接合相同材料的两个部件或者通过使用附加薄的粘接剂来实现。这两种方法为本领域公知。在基片表面中包括有槽的本发明实施例又可以有两个可能的实施例。在第一实施例中，这些槽位于基片的朝着传感器元件的表面上。在优选实施例中，这些槽位于基片的朝着加热器层的表面上。

该槽道的尺寸将取决于所需的冷却能力和所使用的冷却流体。优选是，该槽道的横截面积在0.2mm²和4mm²之间，更优选是在0.5mm²和2.5mm²之间。该横截面可以有允许流体快速流过该槽道的任意形状。优选是，该横截面可以为圆形、椭圆形，或者可以为矩形、正方形或梯形直径。该横截面可以在槽道的整个长度上都相同，或者可以不同，并在槽道的整个长度上进行变化。优选是，该直径在基片内的槽道的整个长度上基本相同。槽道可以为所需长度，以便以所需效率来冷却基片。应当知道，更大量的更短槽道的效率比更少量的更长槽道的效率更高。槽道可以在基片中布置成能根据需要均匀冷却基片。例如，它们可以布置成彼此并排，各进口孔处于该基片的远端。该槽道的几何形状可以适合于要冷却的基片和/或装置的尺寸和形状。优选的几何形状是蛇形几何形状。槽道可以为直的，或者可以弯曲，或者甚至可以在它们通过基片的过程中分叉或分成更多通路。

用于冷却该基片的流体可以是具有较大热容量的任意流体。最优选的流体是水或空气，但是也可以使用任意其它传热介质。这些传热介质是公知的。

为了能够将该冷却流体引入槽道，该装置优选是在槽道端部处具有进口孔和出口孔。这些孔通常具有配件，以便接收来自或通向流体供给源的管子。该流体优选是通过向槽道施加压力差而引入槽道中。这优选是通过将受压的冷却流体施加至槽道进口孔和/或向槽道出口孔提供低压或真空来实现。

流体供给源可以是本发明仪器的一部分，优选是冷却流体的储罐。优选是，该储罐包括冷却器单元，从而将热量从流体导向环境中。适合于对该流体进行冷却的任意单元都可以使用，优选是类似于致冷器的冷却器。该冷却器可以由PC来控制，以便使流体到达并保持在冷却基片所需温度下。冷却流体在离开基片时可以被引导返回该储罐，以便被再次冷却并重新用来冷却基片。为了迫使流体流过槽道，该仪器优选是包括马达，以便泵送流体通过槽道。该马达可以由计算机根据流体的粘性和要从基片中除去的热量来控制，以便利用具有给定热容量、确定温度和确定流速的流体来将基片冷却至所需温度。该冷却流体的温度可以从4至35℃的范围内选择，优选是在15和27℃之间。

包括槽道的基片可以通过保护覆盖层而与相邻层(例如加热器层)隔开。该保护覆盖层可以由玻璃、玻璃陶瓷或聚合物来制造。

本发明仪器的第三基本部件是加热器。该加热器优选是基本扁平，更优选是电阻加热器。这样的加热器为本领域公知。优选是，该加热器是一层具有高电阻的材料，例如从以下组中选择：氧化钌、银、金、铂、铜、钯或者其它金属。该材料最优选是氧化钌。优选是，该层的厚度优选在10μm和30μm之间，更优选是在15μm和20μm之间。优选是，该加热器的加热强度在15和40W/cm²之间。

该加热层优选是这样制备，即以特定形状涂覆或丝网印刷由该材料构成的糊状物，并加热所述组合物至足以使该特定材料烧结的温度。优选是，该材料由此而粘附在其被烧结时所在的该层上。

本发明的加热器优选是电阻加热器。电阻加热利用小直径电线的电阻在电流流过时由于热量而产生能量损失的效应。一种优选设计是具有用于电阻加热的预定电阻的加热线圈。该线圈可以由电线形成，或者它能够以其它方式设计，例如位于印刷电路板上或者设计为位于基片(例如陶瓷或聚酰亚胺)上的任何材料的导体。一种选择是该线圈通过薄膜或厚膜技术而在合适基片上形成。该线圈可以位于该容器的底部、顶部或侧部，或者甚至以这样一种方式环绕该装置，即，取决于线圈的设计而使得该装置处于该线圈内部。

上述仪器的不同层优选是布置成彼此紧密接触，以便允许热量高效地流向物体和从物体流出。优选是，该冷却能力大大高于加热能力。

与本发明的仪器和/或方法一起使用的装置是容器，用于在该方法条件下保持包含有试样的混合物。因此，该装置应当对提供至该混合物的热量大小和类型有耐热性、能够抵抗包含于该混合物中的试剂、并且密封以便使混合物不能从该容器溢出。

在图1中表示了组装好的示例系统的基本部件，包括一些优选的附加部件。该装置装有试样，该装置包括在本体7中的腔室6，该腔室由导热密封箔5来封闭。它布置成紧邻温度传感器元件1。传感器元件1将该基片2与该装置隔开。该基片包括流体槽道4，该流体槽道允许流体通过槽道传送，以便大大降低该基片的温度。最后，该仪器还包括加热器层3，以便能够升高该基片的温度。

在图2中表示了在穿过本发明仪器的基片2的截面A-A′处的流体槽道4的俯视图。该流体槽道可以平行布置，以便均匀冷却整个基片。在另一结构中，为了进行集中冷却，冷却的是基片中处于流体槽道附近的一个特定区域或各种特殊区域。在流体槽道的这两个示例结构中，流体在进口孔处引入，并在出口孔处离开该流体槽道。

本发明仪器的用途优选是包括有效控制温度，以便保证实现一种温度分布型，优选是实现反复的温度循环，这对于(例如PCR中的)热循环是有用的。该温度和热量控制优选包括：

--利用传感器元件来测量该装置中的所述试样的温度；

--将所测得的温度与想要在试样中达到的温度进行比较；

--通过加热器元件向试样施加热量，以便当试样的温度低于所需温度时升高温度，或者当试样的温度与所需温度相同时保持所述试样中的温度。

因此，在非常优选的模式中，本发明包括根据液体的温度通过计算机程序来控制和调节该加热过程。用于控制加热器的单元称为热量控制器。

由于该扁平传感器元件，温度的测量非常快，且并不需要大量的电子设备。用于对测量温度和所需温度进行比较所需的算法也相当简单，本领域已知的简单的PID(比例-积分-微分)控制算法就足够了。

能够利用加热器而以任意已知方式来施加热量，例如通过向电阻加热器连续施加电流，或者以电流脉冲输入所述热量，或者使用交流电。获得特定温度增量所需的所述脉冲长度或电流大小能够在简单实验中这样来确定，即，测定示例试样中的温度并且以给定的冷却能力来改变电流大小和/或脉冲长度。

优选是，这通过使用包含于该仪器中的控制单元来完成，该控制单元从传感器接收温度测量值，并命令加热器不加热或者连续或间歇加热，直到达到所需温度。更具体地说，在液体中的温度能够利用与装有试样的该装置接触的温度传感器所进行的测量以及对该相互作用的物理状态的了解来确定。为了控制该液体中随时间变化的所需温度分布型，该PID控制算法将设置所需的加热/冷却功率，以便考虑到所需温度以及以最小时间间隔测量的温度而在所需点处及时地获得正确温度。与装有试样的该装置接触的温度传感器将以已知方式检测温度，即，对于与该装置接触的传感器来说，其检测温度与整个接触表面上的设计横向温度强度分布成比例。当在与该装置接触的传感器处测到比预期更低的温度时，则认为该仪器与该装置之间的机械接触不充分。当测量温度和预期温度彼此相关时，则认为该机械接触处于工作状态。在另一实施例中，可以使用第二传感器元件来确定试样中的温度，并评估该仪器与该装置之间的接触。这时，测量温度的分辨率是只有一个传感器时的两倍，且明显降低了在试样中获得不适当温度的危险。

本发明的另一实施例是一种用于在一装置中实现热分布型的方法，它包括：

--加热和冷却本发明的仪器中的该物体。

热分布型是要在该试样中达到的一系列温度。优选是，所述分布型的所有温度都高于室温，更优选是在37和98℃之间，最优选是在40和96℃之间。该分布型可以是上升分布型，其中，这些温度随时间升高，或者可以是下降分布型，其中，这些温度随时间降低。最优选的是一种具有最大和最小温度的分布型，即温度升高和降低。在本发明的最优选实施例中，所述热分布型包含重复的热循环，这是PCR所需要的。这些热循环将包括：最高温度，其允许双链核酸变性成单链；以及最低温度，从而允许单链核酸退火成双链。

优选是，本发明的方法还包括冷却所述装置。这里，优选是通过使得所述仪器(更优选是使得包含在该基片中的槽道经由其进口孔)遭受流体流来进行冷却的，该流体优选是经过槽道的气体(例如空气)。流体的量及其温度将确定冷却速度。当冷却能力足够大时，即使在仍然有热量由所述加热器施加给仪器时，也能够进行该冷却过程。将该加热器布置在该基片的背离要加热/冷却物体的一侧，从而在冷却物体的过程中由加热器产生的热量不足以使该冷却过程的效率大大降低。冷却一停止(例如通过减慢或停止冷却流体得流动或者通过使更高温度的流体流过槽道)，在加热器中产生的热量将不会由该流体带走，因此能够加热该物体。

如上所述，对物体的加热通过操作该加热器来进行，例如通过使电流流过电阻加热器。通过使冷却流体流过槽道来进行冷却。加热和冷却过程所进行的时间与使得物体呈现预定温度所需的时间一样长，或者当温度要在某个时间段保持恒定时，该时间还将更长。加热、冷却或保持温度的时间可以选择为与为用途(例如用于PCR)所需的时间一样长。用于加热、冷却和保持的时间长度可以根据电流和流体的量而通过温度传感器组合计算机单元来控制，以便直接起动加热和冷却过程以及它们的强度。该传感器可以用于测量该物体中的温度。计算机可以用于判断该物体的温度是否与要遵循的分布型的温度相同。

本发明的另一实施例是一种用于测定试样中的核酸的系统，该系统包括本发明的仪器以及装有所述试样或设计成接收所述试样的装置。该系统可以用于本发明的用于扩增核酸的方法中。因此，一种系统优选是包括用于进行该测定的试剂和消耗品，且任选地可以通过包括用于处理该装置和/或试样的机器人而自动操作。该装置能够插入在该系统中，以便保证向该仪器的各部件适当地施加电流和冷却能力，并最终加热和冷却装在有效位置中的该装置。

本发明的另一实施例是一种用于扩增核酸的方法，它包括：在本发明仪器的一装置中提供包含所述核酸和扩增试剂的液体混合物；以及使所述装置中的所述试样承受热循环。

示例1

制造本发明的仪器

在第一步骤中，制造扁平和图案化的陶瓷基片。该扁平陶瓷基片可以从CeramTec AG公司(Plochingen，德国)以各种标准厚度定购。在这里，该基片由氧化铝制成，厚度为635μm。该图案化陶瓷基片包含流体槽道，即在一侧上敞开的槽道，它通过本领域公知的陶瓷注模技术来模制。两个陶瓷板形成接触，并通过进一步的烧结步骤而熔合在一起。在下一步骤中，将从Hereaus公司购得的由铂制成的薄膜温度传感器涂覆在陶瓷体的其中一个较大表面上，并由覆盖层来保护，该覆盖层由玻璃陶瓷制成，厚度为20μm。薄膜传感器也可以用作加热器。在还一制造步骤中，厚膜加热器(材料为氧化钌，厚度为15μm)制成于陶瓷体的另一相对侧。该厚膜层也由保护层来保护，该保护层也由玻璃陶瓷制成，厚度为20μm。

示例2

利用本发明的仪器来实现PCR

使用在示例1中所述的热循环器，通过市场上可购得的LightCycler ParvoB19工具包(Cat No 3246809，Roche DiagnosticsGmbH，德国)来进行多次PCR运行，以便进行实时PCR检测，并遵循制造商在该工具包中提供的用法说明，并利用LightCycler Parvo B19Standard作为模板。设置图3中所示的温度分布型来产生PCR曲线。温度斜率选择为使得PCR效率仍然良好、而热循环器将处理快得多的斜率，例如20℃/s。

图4中以曲线形式表示了两个实验的结果，该曲线形式是在具有所述热循环器的试验板上测量得到的，利用了所述温度传感器，并且使用了试验板实时荧光光度计，该荧光光度计能够激励和测量在LightCycler ParvoB19工具包(Roche Diagnostics GmbH，德国)中所记载的荧光物质。

Claims

1.一种用于以受控方式加热和冷却物体的仪器，所述仪器从顶部至底部以以下顺序包括一个层叠在另一个顶上的：

至少一个基本扁平的温度传感器元件；

导热基片；以及

加热层；

其特征在于，所述导热基片包括一个或多个可供流体透过的槽道。

2.根据权利要求1所述的仪器，其中，所述传感器元件包括电阻元件和覆盖层，所述覆盖层保护所述电阻元件不与环境直接接触，且厚度小于25μm。

3.根据权利要求2所述的仪器，其中，所述覆盖层具有物体接触表面，该物体接触表面反映所述物体的表面形状，并朝向所述物体的传感器接触表面。

4.根据前述任意一项权利要求所述的仪器，其中，所述传感器元件的厚度在0.01μm和10μm之间，优选是在0.8μm和1.2μm之间。

5.根据前述任意一项权利要求所述的仪器，其中，所述基片的厚度在1mm和10mm之间。

6.根据前述任意一项权利要求所述的仪器，其中，所述导热基片由电隔离材料制成。

7.根据前述任意一项权利要求所述的仪器，其中，所述加热器的厚度小于30μm。

8.根据前述任意一项权利要求所述的仪器，还包括热量控制器。

9.根据权利要求1至8中任意一项所述的仪器，还包括流体储罐，该流体的温度小于35℃。

10.一种用于在一装置中实现热分布型的方法，包括：

加热如权利要求1至9中任意一项所述的仪器中的该装置。

11.根据权利要求10所述的方法，还包括：使冷却流体流过所述装置的所述基片的槽道。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述流体是气体。

13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述流体是液体。

14.根据权利要求10至13中任意一项所述的方法，其中，所述热分布型包含重复的热循环。

15.一种用于测定试样中的核酸的系统，包括如权利要求1至9中任意一项所述的仪器以及包含所述试样的装置，其中，在测定所述试样中的所述核酸的过程中，所述仪器与所述装置物理接触。

16.一种用于扩增核酸的方法，包括：

a)在一装置中提供包含核酸的液体的混合物；以及

c)使所述装置中的所述试样经受热循环。

17.一种用于加热混合物的系统包括：

如权利要求1至9中任意一项所述的仪器；