CN101102742A - 抗衰老的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗衰老的方法和组合物。所述组合物是具有抗氧化和自由基淬灭性能的微团簇水。所述方法包括将经受自由基或氧化损伤的细胞或其部分与微团簇水接触。

Description

抗衰老的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请分别要求2004年12月13日提交的临时申请第60/635,915号及2005年9月6日提交的第60/596,170号的优先权，本申请为2013年4月21日提交的申请序列号10/420,280的部分继续申请；申请序列号为10/420,280的申请是2002年11月21日提交的申请序列号10/301,416的部分继续申请，申请序列号为10/301,416的申请为2000年10月26日提交的申请序列号09/698,537的部分继续申请，申请序列号为09/698,537的申请目前以专利号6,521,248发行，其要求1999年10月26日提交的临时申请第60/161,546号的优先权。

本申请还涉及2005年4月22日提交的临时申请第60/594,612号及2005年4月15日提交的第60/594,540号。通过引用将以上指出的各申请的全部内容并入。

技术领域

本申请公开了一种抗衰老的方法和组合物。所述组合物是具有抗氧化和自由基淬灭性能的微团簇水。所述方法包括将处于自由基或氧化损伤危险中的细胞或其部分与微团簇水接触。

背景技术

衰老是不可避免的生物学过程，通常其特征为生理功能衰退进而导致发病与死亡。衰老过程在人的生命中逐渐出现。在此渐进过程期间的生理功能的衰退表现为体能和脑力的总体性降低。此外，免疫系统的能力递增性地衰退，并伴有衰老性机体康复能力的下降。

衰老涉及细胞死亡或细胞功能障碍，其起因于自由基生成、氧化性损伤及起因于线粒体功能障碍的能量衰竭。Harman(1988)将衰老或死亡与由代谢过程中氧原子的一个电子的还原引起的自由基损伤性作用联系在一起。不同动物种类中的自动氧化速率和相同物种中的预期寿命存在相反的关系(Cutler 1985；Sohal 1995)。线粒体是通过呼吸链的氧自由基的主要来源并且还深受活性氧簇(ROS)的影响，从而使它们的功能经受严重的风险。线粒体的功能障碍可导致下述功能的缺损：电子转移、氧化磷酸化及能量生成，引起细胞损伤并最终导致细胞死亡。

虽然仍不了解引起这些衰退倾向的确切原因，但是已经提出：对细胞膜、电子转移、脑组织中的一种或多种的损伤和由自由基与氧化剂引起的能量相关的代谢途径的中断在其中起到了重要的引发性作用。与年轻，相比，在年老的受试者中观察到了增加的线粒体DNA的氧化损伤。在包括：脑、肌肉、神经和隔膜的很多组织和细胞类型中观察到了这种增加。重要的是，这些增加随着衰老的持续而日益严重。

因为线粒体DNA在能量生成中普遍存在，所以对线粒体DNA的损伤尤为重要。同样地，线粒体是具有最重要功能的普遍存在的细胞器。已将脑线粒体DNA的氧化损伤与伴随衰老的神经退行性疾病发病率的增加联系在一起。肌肉线粒体的氧化损伤与增加的嗜睡有关。也已表明经由氧自由基产生的毒性一般是形成癌症、心脏病与衰老的主要原因。

在过去6千万年的人类演变过程中，寿命已出现显著的延长。同时，人类衰老特异性癌症(age-specific cancer)的发病率也出现了极大的降低。很有可能对抗自由基与其他来源的氧化损伤的有效机理的演变是延长寿命和降低衰老特异性癌症发病率的重要因素。已经提出增加自由基的血浆浓度和淬灭氧化剂的组合物。出于这点考虑，已经广泛地研究了一些组合物，例如尿酸、维生素A、维生素E与维生素C，但仅取得了有限的成功。维生素共有的一个特性是它们水溶性的缺乏。由于这种(水)血液中溶解度的缺乏，造成了它们血浆浓度的有限性。此外，这些维生素共有的特性是均经受消化的分解作用，及难以增加血浆浓度。另一个问题牵涉到这些抗氧化剂至细胞的转运，所述细胞中的氧化损伤是难以解决的。

抗氧化剂或自由基淬灭剂的一个重要特点是具有以非破坏性的生物学方式与氧化剂或自由基进行化学反应的能力。所涉及的一些生物破坏性氧化剂及自由基包括：过氧化物(O₂ ^-)、H₂O₂、羟基自由基(·OH)与单线态氧(¹O₂)。

对具有期望的溶解度与细胞摄取能力的抗氧化和淬灭自由基的组合物存在需求。本发明的微团簇水(micro-cluster water)提供了这些及其他的有益性能。

发明内容

本发明的一个方面涉及用于淬灭细胞内液中的自由基及氧化剂的方法和组合物。

本发明的另一方面涉及用于淬灭细胞外液中的自由基及氧化剂的方法和组合物。

本发明的另一方面涉及用于淬灭细胞间液中的自由基及氧化剂的方法和组合物。

本发明的又一方面涉及用于递送药疗化妆品的方法和组合物。

本发明另一方面为微团簇液(micro-cluster liguid)，其具有抗氧化和淬灭自由基的性能。

本发明的微团簇液例如微束水还提供了至少一种选自下述方面的性能，包括：增加电位能、提高生物利用度、经皮迁移及透皮促进。

术语经皮迁移(transdermal migration)应指具有迁移通过或穿过真皮的能力。而术语透皮促进(transdermal focilitator)应指促使另外的物质穿过与其自身迁移相一致的穿过真皮膜的经皮通过的能力。

术语药疗化妆品(cosmeceuticals)应指化妆品制剂，其包括至少一种营养剂和/或药物。例如，药疗化妆品可在微团簇水载体中引入二氧化钛(如身体防晒霜)与肌酸丙酮酸盐(如细胞的修复药物)。该组合物还可包括渗透促进剂以进一步促使药物更深入地递送至真皮中。总之，本发明微团簇水的抗氧化及抗自由基性能还提供了下述未预期的结果：延长细胞寿命、减少DNA变异的几率、延长线粒体细胞膜的寿命及延长细胞膜寿命。

附图说明

图1为比较摄取到细胞与线粒体中的肌酸的条形图。

图2为对UVA诱发的mtDNA变异应答的摄取肌酸的细胞和正常细胞的凝胶的图和条形图。

图3为慢性氧化应激循环的图。

图4为皮肤衰老的缺损的能量库(defective powerhouse)的模型图。

图5为比较使用微团簇水(Penta)或实验室用水(a.d.)制备的培养基中生长的细胞之间常见的变异数目的图表。

图6为比较使用微团簇水(Penta)或实验室用水(a.d.)制备的培养基中生长的细胞之间常见的缺失变异数目的一组条形图。

图7为比较使用微团簇水(Penta)或实验室用水(a.d.)制备的培养基中生长的细胞之间常见的缺失变异数目的一组条形图。

图8a与8b为显示在标准孵育条件下考虑细胞内pH变化的双蒸水(“DDW”)与微团簇水(Micro-cluster)之间差别的图表。

图9为表示在标准孵育条件下巨噬细胞中细胞内pH变化的条形图。

图10为在标准孵育条件下对细胞膜损伤倾向差别的条形图，其中孵育的培养基由DDW或微团簇水制成。

图11为比较紫外线照射皮肤与紫外线未照射皮肤之间mtDNA中出现常见的缺失变异的条形图。

具体实施方式

本发明的方法通常包括将一定量的微团簇液施用至受试者，其经由下述的途径进行：局部地、口服地、经皮地或其他本领域已知的施用途径。

认为微团簇液调节与过早衰老有关的造成组织氧化性损伤的一种或多种ROS和/或自由基。本发明通常还包括将营养剂与药物连同透皮促进剂一起引入微团簇液中。认为结合肌酸化合物的微团簇液调节了mtDNA变异的一种或多种结构或功能性组成部分和/或充分调节肌酸激酶/磷酸肌酸系统以预防、减少或缓解衰老症状与皮肤损伤。可被调节的系统组成部分包括：mtDNA变异的速率、细胞内pH、细胞间pH、ROS浓度、细胞寿命、肌酸激酶、肌酸底物和磷酸肌酸以及肌酸的转运。术语“调节(modulate)”、“调变(modulation)”或“调整(modulating)”包括肌酸激酶/磷酸肌酸系统中任何组成部分活性的任何增加或降低。

在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗受试者(如：哺乳动物，优选人类)皮肤病症的方法，其通过将有效量的含有在微团簇液中的肌酸化合物的药疗化妆品施用至受试者以便治疗皮肤损伤。

预测肌酸化合物通过提高皮肤中的能量储备以及还通过阻止参与氧化损伤和细胞死亡的机理来保护组织。预测微团簇液通过阻止参与氧化损伤和细胞死亡的有害的氧化机理来独立地保护组织。肌酸化合物与微团簇液的组合提供了预测通过下述机理来保护组织的协同组合物，其中所述机理包括：提高皮肤中的能量储备、阻止参与氧化损伤和细胞死亡的有害的氧化机制以及增强皮肤的穿透和促进活性剂的迁移。用于此目的的特别有效的化合物包括：微团簇液、微团簇水、螯合的矿物质、螯合的维生素、肌酸、磷酸肌酸、牛磺酸、渗压剂、依克多因(ectoin)及其类似物，在下文中对其进行更为详细的描述。

术语“肌酸化合物”包括肌酸、磷酸肌酸和与肌酸或磷酸肌酸结构相似的化合物以及肌酸和磷酸肌酸的类似物，包括其盐，例如肌酸丙酮酸盐。

术语“肌酸化合物”还包括“模拟”肌酸、磷酸肌酸或肌酸类似物活性的化合物。术语“模拟物”意为包括可以与肌酸结构不相似但模拟肌酸、磷酸肌酸的治疗活性的化合物或结构相似的化合物。术语肌酸化合物还包括“肌酸激酶系统的调节剂”，例如，调节酶活性或调节肌酸运载体活性或调节其它蛋白质或酶或脂质与该系统相互作用能力的化合物。

术语“治疗”包括减少或缓解至少一种与被治疗疾病相关或由治疗疾病引起的症状。例如，治疗可以是疾病的一些症状的减少或者是疾病的完全根除。

术语“皮肤病症的治疗”包括疾病的预防、缓解和/或疾病过程的停止。皮肤病症的例子包括，但不局限于：由太阳辐射、应激、疲劳和/或自由基引起的衰老和损伤。虽然不希望被理论所限制，但仍认为结合此处描述的肌酸化合物的微团簇液对皮肤和其它组织的损伤以及衰老的形成具有治愈和预防效果。该术语还包括与疾病过程相关的任何症状(如：皱纹)的任何缓解或消除。例如，皱纹的治疗可包括预防、延缓、停止或逆转皮肤皱纹形成的过程，其中该皮肤的例子如哺乳动物皮肤，优选人类皮肤。

本发明涉及降低由于自由基和其他氧化剂接触细胞、细胞组成部分或组织后继发的自由基损伤和氧化损伤的。本发明的微团簇水具有淬灭(quenching)自由基与氧化剂的性能。细胞、细胞组成部分或组织与本发明微团簇水的接触，结果可延长细胞寿命、降低DNA变异的几率、改善线粒体的效能、减少线粒体DNA的变异、促进胶原和成纤维细胞的生长、缓解皱纹与其他的皮肤损伤，从而达到抗衰老的目的。本发明组合物的施用经由下述几种方法实现，包括例如通过化妆品局部吸收的应用，或借以充分接触需要治疗的组织或系统的任何其他方法。

用于施用治疗剂或化妆剂(“活性成分”)至人类或动物的常规方式通常在某种程度上受到生物、化学及物理屏障的限制。物理屏障的实例为皮肤和各种器官膜，其必须在药物到达靶点之前被穿越。化学屏障包括pH变化、脂质双层及酶降解。生物与化学活性剂特别容易受到这类屏障的影响。

许多活性剂可局部应用并由此提供便利的施用方式，特别是对于通常应用于受皮肤条件影响的皮肤区域的化妆剂。然而，局部应用活性剂的效力取决于两个主要的因素：a)经皮的吸收和渗透；及b)渗透至皮肤靶向部位的活性剂的生物利用度。

对于有待有效局部施用的活性剂，其需要由角质层(皮肤的外层，其包括多层最终分化的角质化细胞)渗透入表皮层，并随后分布至靶向部位进行生物利用从而提供效应。活性剂的这种经皮迁移应称为经皮施用。

许多化妆剂需要长期地例行施用，且由于这个原因局部应用是有利的，因为施用方案相对地简单并可最便利地实现。然而，为了使治疗的效力达到最高，需要将尽可能多的化妆剂吸收入皮肤并且当该剂通过应用霜或乳液局部应用于皮肤时，通常至少一部分的活性剂通过擦去或蒸发损失。发明人已发现当与微团簇水结合时形成了纳米粒度的活性剂，其减少了这种擦去问题并改善活性剂的吸收。

出于本发明的目的，化妆剂经由举例可优选地选自下述的一种或多种：抗衰老药物、防皱剂、抗氧化剂、抗疤痕剂、植物雌激素、异黄酮、香豆素、唇膏、自由基淬灭剂及抗菌的抗痤疮剂。

如此处所用，术语“化妆剂”指任何化合物、化合物的混合物或由其产生的意欲放置以接触动物机体外部部分或粘膜的制剂。着眼于(特别是人类身体)清洁、改变外观、保护和/或将应用该剂的身体部分保持在良好的状态。

优选地，该化妆剂能够逐渐减少、降低或预防下述一种或多种皮肤病症的作用，包括：明显的衰老作用、皱纹、痤疮、老年斑、疤痕(瘢痕瘤)性毛细血管破裂，并且该化妆剂包括还任选地清洁皮肤的组合物，其优选地以下述的液体组合物形式存在，如：液体皂、洗剂和溶液，所述洗剂和溶液的添加剂与组合物均应用于皮肤、毛发、头皮、指甲、眼或牙。

如此处所用，术语“药疗化妆品”指根据本发明的化妆剂，其适于促进营养组合物的递送，所述营养组合物包括维生素、无机物和渗压剂。

如此处所用，术语“矿物质”指通常为本领域已知的分类中的一部分的无机化合物。在大量的卫生、健康和医学文献中充分地展示了代谢重要的矿物质的实例，例如包括：Sb、As、B、Br、Yb、Pd、Re、F、Ir、La、W、Cs、C、Pt、Tm、N、Ni、Ta、Tb、Fe、K、I、Co、Mo、V、Ag、Mg、Cr、Cu、Zn、Ca、Si、Sn、Ni、P和S。优选地使用作为本发明组合物一部分的螯合基质递送系统来促进这些矿物质的经皮递送。这样的螯合基质递送系统在2000年8月7日提交的Tarbet的专利6,716,458中描述，通过引用将其引入本文的为参考。这些矿物质以在螯合基质中的方式引入，

如此处所用，术语“渗压剂”(osmolyte)指对渗透性应激产生应答的细胞/组织蓄积的有机溶质。通常，渗压剂增加折叠蛋白质的热力学稳定性并提供对抗变性应激的保护作用。渗压剂的实例包括，但不局限于：肌酸、牛磺酸、依克多因、它们的衍生物及相应的生物可相容的盐。

本发明的另一形式提供了一种促进化妆品和/或营养剂通过皮肤的方法，该方法包括将含有下述成分的组合物应用于皮肤的步骤：至少一种化妆品或营养剂和真皮渗透促进剂。这种组合物的局部应用使得活性剂递送入角质层以及使得活性剂递送入表皮和真皮。

虽然不为提出的理论所限制，但本发明的微团簇水与双蒸水相比，已增加了潜在的能量。或许由于这种增加的能量，本发明的微团簇水能够淬灭自由基并作为抗氧化剂起作用。

如此处所用，术语“微团簇的组合物”(micro-clusteredcomposition)指包含微团簇水的组合物。形容词“微团簇的”指在那种组合物中的微团簇水，即该组合物溶解、混合或以其他方式与微团簇水组合，所述“微团簇的”改良了组合物中的任何一种生物效应剂、机体治疗剂、佐剂或载体或其中的组份。微团簇液可为任何的液体，以及无论是否易混，可为任何液体的混合物或组合，其已根据美国专利6,521,248描述和要求保护的装置进行生产，通过引用将其并入本文。

主要通过水在所有生物系统中的独特作用来确定水和改良的水介质与各种生物结构和过程之间的相互作用。在大部分的生物学过程中，水是重要的组成部分，并且通过液体介质蛋白质与核酸发生相互作用。除了被认为是生物反应的主要介质之外，水还在确定和稳定亲水的与亲脂的(lipophyllic)结构中起到了重要作用。由于水的无以取代的性能，其能够影响各种过程的效应。然而，与水的生物学功能相关的许多方面仍不清楚。有事实指出水具有生物学活性是由于其改变了物理/化学参数。有待在细胞水平对控制水的生物学活性机制进行研究加以了解，这是衰老的一个重要方面。水与内部的调节系统高度相关，包括细胞内pH和细胞膜状态。因此，在这种分析中，巨噬细胞的反应和生存能力是有用的指示标识。

肌酸激酶/磷酸肌酸能量系统仅仅是在具有高和波动的能量需求的组织中发现的产生能量的复杂系统中的一个组成部分。肌酸能量系统的组成部分包括肌酸激酶、底物肌酸和磷酸肌酸及肌酸的运载体。与这种系统相关的某些功能包括在具有波动和高能量需求的细胞中有效的产生能量、将能量运输至细胞的不同部分、磷酰基转运活性、离子运输的调节以及涉及信号传导途径。

本发明涉及用于防止皮肤组织遭受衰老相关的损伤或创伤，并用于阻止自由基形成与防止氧化应激的方法，其中衰老相关的损伤或创伤的例子为有害的紫外线辐射、由能量库(energy pool)引起的应激与疲劳。这种方法通过施用一定量的肌酸化合物或施用与微团簇液结合的化合物来实现，其充分调节一种或多种与能量和衰老相关的生物学途径以预防、减少或缓解皮肤损伤或皮肤衰老。对于此目的有效的化合物包括：微团簇液，如微团簇水；渗压剂如牛磺酸与依克多因以及以其不同的水合物或盐和类似物形式存在的天然肌酸化合物及其组合。化合物可与有待在皮肤表面容易涂布的霜、油、乳剂等混合。可选地，化合物还可以添加物的形式包装用于摄取。

本发明还提供了基于微团簇液的组合物，其含有与药用或化妆可接受载体结合的肌酸化合物及起组织保护作用的有效量的其他成分，例如抗氧化剂(如：辅酶Q10)、维生素(如：C、B₅、B₆、B₉、E)、能量促进剂(如：肌酸、螯合的无机物、丙酮酸盐、烟碱)、渗压剂和减缓衰老过程的皮肤柔软剂。

术语“调节(modulate)”、“调变(modulation)”或“调整(modulating)”包括对任何影响生物学通道或系统的组分活性的任何增加或降低。

预测结合肌酸化合物的微团簇液通过提高皮肤中的能量储备并且还通过阻止参与氧化损伤和细胞死亡的机理来保护组织。用于此目的的特别有效的化合物包括：结合肌酸、磷酸肌酸及其类似物的微团簇水，在下文中对其进行更为详细的描述。术语“肌酸化合物”包括肌酸、磷酸肌酸和与肌酸或磷酸肌酸结构相似的化合物以及肌酸和磷酸肌酸的类似物。术语“肌酸化合物”还包括“模拟”肌酸、磷酸肌酸或肌酸类似物活性的化合物。术语“模拟物”意为包括可以与肌酸结构不相似但模拟肌酸、磷酸肌酸的治疗活性的化合物或结构相似的化合物。术语肌酸化合物还包括“肌酸激酶系统的调节剂”，例如，调节酶活性或调节肌酸运载体活性或调节其它蛋白质或酶或脂质与该系统相互作用能力的化合物。

术语“治疗”包括减少或缓解至少一种与被治疗疾病相关或由治疗疾病引起的症状。例如，治疗可以是一些疾病症状的减少或者是疾病的完全根除。

术语“皮肤病症的治疗”包括疾病的预防、缓解和/或疾病过程的停止。皮肤病症的例子包括，但不局限于：由太阳辐射、应激、疲劳和/或自由基引起的衰老和损伤。虽然不希望被理论所限制，但仍认为结合此处描述的肌酸化合物的微团簇液对皮肤和其它组织损伤与衰老的形成具有治愈和预防效果。该术语还包括与疾病过程相关的任何症状(如：皱纹)的任何缓解或消除。例如，皱纹的治疗可包括预防、延缓、停止或逆转皮肤皱纹形成的过程。

术语“局部施用”包括递送的方法，如在皮肤上涂抹或涂布。其包括任何形式的施用，包括皮肤施用。适用于局部施用的组合物实例包括但不局限于：软膏、洗剂、霜、化妆用品及皮肤清洁用品。其他的例子包括气雾剂、固体(如块皂)和凝胶。

术语“药物上可接受的”包括适用于与人类和低等动物组织接触的，而无不适当的毒性、不相容性、不稳定性、刺激、过敏反应等，相当于具有合理的效益/风险比的药物、药剂或惰性剂。该术语还包括化妆上可接受的成分。

术语“治疗或化妆有效量”意为包括足以预防皮肤衰老或皮肤损伤的发作或显著延缓被治疗受试者的损伤进程的化合物的量。可基于或至少部分考虑有待治疗的症状的严重程度和当使用类似物时，所选择的特定类似物的活性来确定个体(individual basis)的治疗或化妆有效量。此外，根据被治疗受试者的年龄可改变化合物的有效量。因此，可通过本领域的普通技术人员在考虑如上描述的此类因素的基础上，使用卫生保健管理中的常规实验方法来确定化合物的治疗或化妆有效量。

可将本发明的局部药物组合物制成广泛的产品类型。这些包括但不局限于：溶液、洗剂、霜、沙滩产品(beach products)、凝胶、胶粘剂(sticks)、喷雾剂、垫、软膏、糊剂、摩丝和化妆品。这些产品类型可包括一些载体系统类型，包括但不局限于溶液、乳剂、凝胶和固体。

如果本发明的局部药物组合物被配制为喷雾剂并喷雾施用于皮肤时，应将抛射剂加入该溶液组合物中。可在Sagarin，Cosmeticsscience and Technology，第2版，卷2，第443-465页(1972)中找到此处有用的抛射剂的更为充分的公开。

本发明的局部药物组合物还可配制为化妆产品，如粉底。

本发明的局部药物组合物还可配制为含药的垫。这些垫的适当的实例在1990年1月2日发行的、Thaman等人的美国专利第4,891,227和4,891,228中充分公开，本文将其发明内容并入。

除前述的组份外，本发明的局部药物组合物可包含多种在局部组合物中，以本领域确定的浓度使用的其他油溶的材料和/或水溶的材料。

本发明的组合物中还可存在不同的水溶的材料。这些包括保湿剂、蛋白质和多肽、防腐剂及碱剂。此外，此处的局部组合物可包含常规的化妆佐剂，如染料、色素和香料。

本发明的局部药物组合物还可包括安全及有效量的真皮渗透促进剂。渗透促进剂优选的量为组合物的约1％至约5％。另一种对于本发明有用的渗透促进剂为CTFA指定的非离子聚合物：聚丙烯酰胺和异链烷烃(isoparrafin)及聚乙二醇单十二醚-7，以Sepigel由SeppicCorporation获得。也有用的渗透促进剂是聚季铵-32(polyquaternium-32)及由Allied Colloids，Suffolk，Va获得的称为SalCare SC92的矿物油。这是一类阳离子聚合物，其通常在1986年12月9日发行的、Glover等人的美国专利第4,628,078号和1986年7月8日发行的、Flesher等人的美国专利第4,599,379号中描述，通过引用将两者引入本文。

除了其他的之外，有用的渗透促进剂的实例在下述专利中公开：1985年8月27日发行的、Cooper的美国专利第4,537,776号；1985年11月12日发行的、Cooper等人的美国专利第4,552,872号；1985年12月10日发行的、Cooper的美国专利第4,557,934号；1978年12月19日发行的、Smith的美国专利第4,130,667号；1976年11月2日发行的、Rhaadhyaksha的美国专利第3,989,816号；1977年4月12日发行的、DiGiulio的美国专利第4,017,641号以及1982年1月13日公布的、Cooper等人的欧洲专利申请0043738。

本发明的组合物中还可包括其他常规的皮肤保健产品添加剂。例如可使用：胶原、透明质酸、弹性蛋白、水解产物、樱草油、希蒙得木油、表皮生长因子、大豆皂角酐、粘多糖、及其混合物。

本发明的组合物还可包括各种维生素和矿物质。例如预期使用：维生素A、抗坏血酸、维生素B、生物素、泛酸、维生素D、维生素E及其混合物与衍生物。

还预期使用的是皮肤清洁组合物，其包含本发明的活性化合物及化妆上可接受的表面活性剂。术语“化妆上可接受的表面活性剂”指不仅是有效的皮肤清洁剂，而且可以使用却不产生有害的毒性、刺激、过敏反应等的表面活性剂。此外，表面活性剂必须能够以不产生相互作用的方式与活性化合物混合，其中所述相互作用大大地降低了组合物用于调节皮肤损伤的效力，如皱纹。

本发明的皮肤清洁组合物优选地含有约0.1％至约20％，优选约1％至约5％的肌酸化合物(如：肌酸、环氧肌酸或另外的肌酸化合物)和约

1％至约90％的微团簇液以及约0.1％至约10％的化妆上可接受的表面活性剂。

皮肤清洁组合物的外观形态并不是关键所在。例如，组合物可配制成盥洗块(toilet bars)、液体、糊剂、摩丝或垫。

本发明的清洁组合物可任选地含有在皮肤清洁组合物中以本领域确定的浓度常规使用的材料。

还预期结合微团簇液与肌酸化合物的防晒剂及遮光剂(sunscreen)。术语“防晒剂”或“遮光剂”包括防止紫外线的组合物。例如，防晒剂的实例包括氧化锌和二氧化钛。

太阳辐射是引起皮肤损伤的一个主要原因，其中所述损伤的例子为：皱纹。因此，出于治疗或预防皱纹的目的，微团簇液和肌酸化合物与UVA和/或UVB遮光剂的组合将是有利的。本发明组合物中所包含的遮光剂将提供即时对抗急性紫外线损伤的保护作用。因此，遮光剂将进一步预防经由紫外线辐射引起的皮肤损伤，而本发明的化合物是调节现有的皮肤损伤。

多种常规的遮光剂适于与活性化合物结合使用。Segarin等人在cosmetics Science and Technology的第VIII章、189页后连续地公开了大量适当的成分。例如，适当的遮光剂具体包括：对氨苯甲酸及其盐与衍生物(乙基、异丁基、甘油酯；对二甲基氨基苯甲酸)、氨基苯甲酸酯(即：邻氨基苯甲酸酯；甲基、薄荷基、苯基、苯甲基、苯乙基、沉香基、松油基及环己烯酯)、水杨酸酯(戊基、苯基、苯甲基、薄荷基、甘油基及双丙二醇酯)、肉桂酸衍生物(甲基和苯甲基酯、α苯基肉桂腈、丁基桂皮烯醛基丙酮酸盐)、二羟基肉桂酸衍生物(伞形酮、甲基伞形酮、甲基乙酰伞形酮)、三羟基肉桂酸衍生物(七叶亭、甲基七叶亭、瑞香素及葡糖苷、七叶灵与瑞香甙)、碳氢化合物(二苯基丁二烯、均二苯乙烯)、二亚苄基丙酮和亚苄基苯乙酮、萘酚磺酸盐(2-萘酚-3，6-二磺酸钠盐及2-萘酚-6，8-二磺酸钠盐)、二羟基-萘酸及其盐；对羟基双苯二磺酸盐；香豆素衍生物(7-羟基、7-甲基、3-苯基)、二唑(2-乙酰基-3-溴代吲唑、苯基苯噁唑、甲基萘噁唑、各种芳基苯并噻唑)、奎宁盐(重硫酸盐、硫酸盐、盐酸盐、油酸盐及单宁酸盐)、喹啉衍生物(8-羟基喹啉盐、2-苯基喹啉)、羟基或甲氧基取代的苯甲酮；尿酸及酵母酸(vilouric acid)、单宁酸及其衍生物(如：六乙醚)；(丁基carbotol)(6-丙基胡椒基)醚、氢醌、苯甲酮(苯酚、磺异苯酮、二羟苯酮、苯并间苯二酚、2，2＇，4，4＇-四羟基苯甲酮、2，2＇-二羟基-4，4′-二甲氧基苯甲酮、辛苯酮)、4-异丙基二联苯酰基甲烷、丁基甲氧基二联苯酰基甲烷、氰双苯丙烯酸乙酯和4-异丙基-二-苯甲酰基甲烷。

在本发明组合物中优选的有用遮光剂为分散在微团簇液及其混合物中的TiO₂、ZnO纳米粒子。

本发明的组合物中可使用安全及有效量的遮光剂。遮光剂必须与活性化合物相容。该组合物通常可包含约1％至约20％，优选约2％至约10％的遮光剂。遮光剂精确的量将根据所选的遮光剂以及期望的防晒系数(SPF)而变化。

本发明的任何组合物中还可加入一种成分以改善那些组合物的皮肤直接性，特别是加强它们对水刷洗的抵抗力或对摩擦的抵抗力。将提供这种益处的优选成分为乙烯与丙烯酸的共聚物。1987年5月5日发行的、Brock的美国专利第4,663,157号公开了包含这种共聚物的组合物，通过引用将其并入本文。

在本发明的另一个实施方案中，抗炎剂连同结合本发明的肌酸化合物的微团簇液一起作为活性成分被包括在内。抗炎剂在UVA辐射范围中具有强效的保护作用(尽管其也同样提供了某些UVB保护作用)，从而防止了由紫外线辐射引起的进一步皮肤损伤，而结合本发明肌酸化合物的微团簇液却是用于治疗现有的损伤。因此，该组合提供了对抗进一步损伤的广泛的保护作用，同时促进了对先前存在的损伤的修复。抗炎剂的局部使用减少了由长期暴露于紫外线辐射引起的皮肤光老化。(参见1989年7月11日发行的、Bissett，Bush和Chatterjee的美国专利第4,847,071号，通过引用并入本文；以及1989年7月11日发行的、Bissett和Chatterjee的美国专利第4,847,069号，通过引用并入本文。)

本发明的组合物中可加入安全及有效量的抗炎剂，优选约为组合物的0.1％至约10％，更优选约0.5％至约5％。因为此类成分的效力普遍不同，所以有待在组合物中使用的抗炎剂的精确量将取决于所利用的特定的抗炎剂。

在另一个实施方案中，药疗化妆品还包含安全及有效量的皮肤保护剂。优选包含的皮肤保护剂为组合物的约0.001％至约2％，更优选约0.01％至约1％。有用的皮肤保护剂在联邦登记档案48卷、第32页中公开，并且包括：尿囊素、氢氧化铝凝胶、次硝酸铋、硼酸、炉甘石、可可脂、玉米淀粉、二甲基硅油、甘油、白陶土、活酵母细胞衍生物、凡士林、鲨鱼肝油、碳酸氢钠、硫磺、单宁酸、白凡士林、醋酸锌、碳酸锌和氧化锌及其混合物。

本发明的制剂包括适用于下述施用途径的那些制剂：局部的、口服、鼻、经皮的、口腔、舌下、直肠、阴道和/或胃肠外施用。该制剂可方便地以单位剂型存在并且可通过任何药学领域公知的方法制备。

这些制剂或组合物的制备方法包括下述步骤：将配方中的所有组分进行混合，包括助剂。这种组分的混合物通过如美国专利6,521,248中所描述的装置进行加工处理直至得到期望的纳米粒度和/或直至解决疏水性药物的溶出度。

除含有活性化合物之外，混悬液可含有混悬剂，例如：乙氧基化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和西黄蓍胶及其混合物。

本发明化合物用于局部或经皮施用的剂型包括粉末、喷雾剂、软膏、糊剂、霜、洗剂、凝胶、溶液、贴剂及吸入剂。活性化合物可在无菌条件下与可药用载体以及与任何需要的防腐剂、缓冲剂或抛射剂混合。

除含有本发明的活性化合物之外，软膏、糊剂、霜和凝胶还可含有赋形剂，如：动植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙烯醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石粉和氧化锌或其混合物。

经皮贴剂具有另外的优势：其提供了本发明化合物至机体的控制递送。此类剂型可通过将化合物溶解或分散在适当的介质中制备。还可使用吸收促进剂来加速化合物熔化并流经皮肤。此类熔化的速率可通过提供速率控制的膜或通过将活性化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制。

这些组合物还可含有佐剂，如：防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。微生物作用的预防可通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂来确保，其中所述抗菌剂和抗真菌剂的例子为对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等。还预期将等渗剂包括入组合物中，所述等渗剂的例子为糖、氯化钠等。此外，延长吸收的可注射的药物形式可通过包含延缓吸收的成分来实现，所述延缓吸收的成分的例子为单硬脂酸铝和明胶。

在另一实施方案中，皮肤病症与自由基、衰老、太阳辐射、应激或疲劳有关。在另一个实施方案中，受试者深受皱纹之苦或经受皮肤病症的风险。

术语“与自由基相关的”包括由自由基直接或间接引起的任何皮肤病症或损伤。例如，自由基可由太阳辐射(如：紫外线辐射)或污染引起。

术语“衰老”包括具有氧化损伤、能量衰竭或线粒体功能障碍的过程，其中所述过程的发作、缓解、停止或消除受此处描述的与肌酸化合物结合的微团簇液影响。衰老的症状包括，但不局限于：皱纹、皮肤弹性的缺失以及不均匀的皮肤色素沉着。

本发明还展示了用于治疗受试者皮肤的组合物。该组合物包含有效量的微团簇液，其与肌酸、磷酸肌酸、肌酸化合物或其盐组合。优选地，该有效量可有效地治疗或预防皮肤病症。优选地，该组合物适于皮肤施用。该组合物可配制成洗剂、霜或软膏、凝胶或固体。在一个有利的实施方案中，该组合物还含有防晒或遮光剂(如：氧化锌或二氧化钛)。

在又一实施方案中，组合物可配制成化妆粉底或皮肤清洁剂。有利地，该组合物可含有渗透剂。可结合入本发明组合物中的化合物实例包括，但不局限于：羟酸、视黄醇、芦荟油、甘菊或其混合物。

在又一实施方案中，皮肤病症与自由基、衰老、太阳辐射、应激或疲劳有关。

在又一实施方案中，本发明预期将有效量的皮肤保护剂联合施用于受试者。皮肤保护剂的实例包括抗氧化剂、油溶的抗氧化剂以及金属螯合剂，所述抗氧化剂的例子有微团簇水、抗坏血酸、维生素、辅酶Q10(CoQ10)及其衍生物、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏重亚硫酸钠、亚硫酸钠等；所述油溶的抗氧化剂的例子有抗坏血酸棕榈酸盐、丁羟基茴香醚(BHA)、丁羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；所述金属螯合剂的例子有柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。优选的抗氧化剂包括CoQ10和维生素E。皮肤保护剂的其他实例包括能量促进剂(如：ATP、烟酰胺或丙酮酸盐)、维生素(如：E、C、B5、B6和B9)及维生素前体。

术语“能量促进剂”还包括线粒体功能的刺激物或在细胞中的其他地方产生ATP的刺激物。例如，所述能量促进剂的实例包括中间物丙酮酸盐、烟酰胺和CoQ10。

衰老的氧化应激与线粒体的功能障碍：

所有多细胞生物体生命周期的一个本质上共有的特征为：当生命的产生期结束时，各种生理过程的效能将逐渐衰退。已有资料证明下述假设：功能性能力缺失继发的衰老细胞死亡起因于分子氧化损伤的累积(Harman 1956；Stadtman 1992；Ames等人，1993；Sohal 1995)。该假设是基于下述事实提出的：虽然氧是需氧菌生存所必须的，但是氧是潜在的毒性物质且经由需氧菌的使用，氧对它们的长期生存还可能是危险的。分子氧是超氧化物、过氧化氢和羟基的前体。这些物质进一步反应后紧接着产生活性氧簇，其引起广泛的大分子氧化损伤。脂质过氧化反应、DNA损伤以及蛋白质的羰基化具有某种破坏性的作用。在衰老期间，氧化应激的数量增加，其可能是下述原因导致的结果：生成活性氧簇的速率增加、或者是抗氧化的防御能力降低、或修复或除去损伤分子的效力下降(Sohal等人，1996)。随着衰老的进程，由线粒体生成的ROS(活性氧簇，Reactive Oxygen Species)增加，其致使线粒体的内膜出现损伤。经由正反馈机理，其致使ROS进一步增加。在苍蝇中，那些具有较长预期寿命的显示出较低的线粒体超氧化速率、较低的过氧化氢生成速率、较低的蛋白质氧化损伤速率、较少的DNA氧化损伤、较高的SOD及过氧化氢酶活性、促使谷胱甘肽成为通用的细胞内还原剂。不同物种中最长寿命的变化经常与代谢速率(氧耗的速率)、代谢能力(生存期间每克体重消耗的能量总量)以及氧化应激的水平有关。最高程度的氧化损伤出现在主要由分裂期后长期存活的细胞组成的组织中，如脑、心脏和骨骼肌。这些组织还是一些衰老相关的退化病症的靶点，其中该病症包含氧化应激(Davies 1995；Weindruch等人，1993)。预测减少活性氧簇形成的成分具有保护作用。

肌酸激酶皮肤衰老和皮肤损伤

肌酸的浓度和肌酸激酶系统的效能随着衰老而降低。衰老与一些创伤促成了氧化应激态及能量妥协(energy compromise)。氧化损伤有关的分子生成速率的最小化与氧化损伤的减少具有良好的相关性。此类与能量加速效应结合的最小化将减缓衰老或创伤暴露期间的损伤。通过肌酸激酶改变ATP合成速率的肌酸及肌酸类似物可维持能量形成、线粒体的功能，并防止自由基形成。此类作用可对衰老或创伤相关的皮肤损伤具有积极的效果。

虽然不希望被理论所束缚，但认为调节肌酸激酶的活性将调节能流并影响皮肤细胞的功能、完整性及存活率。活化的能量状态应使氧化损伤最小并使得细胞经受住衰老或如紫外线辐射的创伤后继发的创伤。

运动员服用肌酸以提升爆发运动和竞赛期间的肌肉功能(参见1999年Wyss和Kaddurah-Daouk的综述)。肌酸在一些神经变性疾病的动物模型中显示出具有神经保护的性能(Matthews等人，1988；Kliveny等人，1999；Matthews等人，1999)。

已经证明肌酸类似物的摄取促使组织磷酸肌酸库替换为具有不同动力学和热力学性能的合成的磷酸肌酸。这种替换使得细胞内的能量代谢产生了微妙的变化，包括高能磷酸盐储量的增加(参见Roberts，J.J.和J.B.Walker，Arch Biochem.Biophys 220(2)：563-571(1983))。使用缓慢起效的合成的磷酸肌酸对磷酸肌酸库进行的替换可经由提供更长久的能源来促使神经学病症的消除，所述合成磷酸肌酸的例子为肌酸类似物。一种这样的类似物，环氧肌酸(1-羧甲基-2-氨基咪唑烷(aminoimidazolidine))改变了应激细胞的能流且可干涉在细胞工作部位利用的ATP。

同样地，已经证明微团簇水的摄取改善了细胞的能量代谢。此外，已经证明局部应用微团簇水提供了显著降低的mtDNA变异几率。

皮肤护理中有用的肌酸化合物

本发明中有用的肌酸化合物包括调节肌酸激酶/磷酸肌酸系统的一种或多种结构或功能性组成部分的化合物。对此目的有效的化合物包括肌酸、磷酸肌酸及其类似物、模拟它们活性的化合物以及如上定义的这些化合物的盐。典型的肌酸化合物在下文中描述。

肌酸(也称为N-(氨基亚胺基甲基)-N-甲基甘氨酸、甲基糖苷或N-甲基-醋酸鸟嘌呤)是一种众所周知的物质。(参见(1989)年的TheMerck Index，第11版，第2570号)。

环氧肌酸实质上是肌酸的平面环状类似物。虽然环氧肌酸与肌酸的结构相似，但是这两种化合物是动力学与热力学可区别的。环氧肌酸在前述的体外和体内反应中通过肌酸激酶有效地磷酸化。Rowley，G.L.，J.Am.Chem.Soc.93：5542-5551(1971)；McLaughlin，A.C.等人，J.Biol.Chem.247，4382-4388(1972)。

磷酸化的化合物磷酸环氧肌酸与磷酸肌酸结构相似，但是，磷酸环氧肌酸的磷氮(P--N)键比磷酸肌酸的更稳定。LoPresti，P.和M.Conn，Biochem.Biophys.Acta 998：317-320(1989)；Annesley，T.M.和J.B.Walker，J.Biol.Chem.253；8120-8125，(1978)；Annesley，T.M.和J.B.Walker，Biochem.Biophys.Res.Commun.74：185-190(1977)。

胍基醋酸酯是肌酸的又一类似物并且是其生物合成途径中的前体。胍基苯甲酸与肌酸结构相关。将类氨基酸分子共价连接至肌酸的化合物也是受到关注的肌酸化合物。这样的实例为肌酸抗坏血酸盐和肌酸丙酮酸盐。也可共价连接其它类型的分子。

产生干扰肌酸生物合成酶活性效果或干扰肌酸运载体的肌酸类似物及其他成分在本发明治疗或预防衰老相关损伤的方法中是有用的。因此，此类化合物的效应经由下述机制直接或间接地产生，所述机制包括但不局限于：影响肌酸的摄取或生物合成、影响磷酸肌酸来回运输的功能、酶活性或相关的酶的活性、或改变反应底物或产物的浓度以改变反应的速度。

直接或间接改变肌酸激酶/磷酸肌酸系统结构或功能的化合物可用于预防和/或治疗衰老相关的组织损伤，例如皮肤损伤。

调节肌酸运载体或调节肌酸激酶与其他蛋白质或脂质分子在膜中的结合、调节肌酸及磷酸肌酸底物浓度的分子还可用于预防和/或治疗衰老相关的组织损伤，例如皮肤损伤。

本发明中有用的化合物可以是底物、酶活性的改性剂或肌酸激酶的底物类似物。此外，目前可设计结合肌酸激酶起效的酶调节剂并单独、组合或加上肌酸化合物使用。提出了肌酸化合物与其他添加物或其他药物的组合。

肌酸和磷酸肌酸的生物合成及代谢途径可靶向选择和设计化合物，所述化合物可经肌酸激酶系统改变能量的形成或高能磷酰基运转。对特定步骤具有靶向的化合物可取决于肌酸或其前体的结构类似物。新型的肌酸类似物与肌酸的不同之处在于可设计它的取代、链延伸和/或环化作用。多底物酶的底物可以是共价连接的或是可设计不同底物模拟部分的类似物。还可设计不水解的磷酰化类似物以模拟磷酸肌酸而不持续形成ATP。

肌酸、磷酸肌酸及许多肌酸类似物可商购获得。此外，可使用常规的技术来合成肌酸类似物。

例如，除其他的之外，当前可获得的或已经合成的肌酸化合物包括：肌酸、b-胍基丙酸、胍基乙酸、磷酸肌酸二钠盐、环氧肌酸、高环氧肌酸、次磷酸肌酸、高肌酸、乙基肌酸、磷酸环氧肌酸二锂盐和磷酸胍基乙酸二钠盐、4胍基苯甲酸及衍生物、肌酸丙酮酸盐、肌酸抗坏血酸盐。

术语“施用”意欲包括允许本发明组合物施行它们预期功能的施用途径。

实施例

多数类型的非矿化的饮用水由于各种自由基组分而具有潜在的诱变效应，该自由基可在进行水净化及加工系统的多步处理后存在。细胞遗传学方法代表一种用于评价水的潜在诱变效应的步骤。该步骤是基于染色体畸变频率的测定、姐妹染色单体互换(SCE)及细胞分裂周期的持续时间建立的。该方法用于测试在美国市场具有商标名AQUA RX的微团簇研究用水的细胞遗传效应。这种水由生物水合研究实验室(Bio-Hydration Research Lab美国)提供。微团簇水通过根据美国专利第6,521,248号的多步加工方法进行生产，该专利提供了具有独特特征及纯度小于0.5ppm的总溶解物质(TDS)的研究用水。在最终步骤将药用级的氧加入水中以对塑料瓶进行加压从而用于装运。通过在标准去离子水18莫姆(对照)或在微团簇水中溶解RPMI 1640(Gibco)来制备细胞培养基。使用人类淋巴细胞进行实验，该淋巴细胞根据标准的实验方案孵育。在孵育48小时后固定细胞以测定染色体畸变的频率。在48小时后测定SCE的频率，接着将5-BDU(10mg/ml)加至细胞培养物中。孵育80小时后固定细胞。根据本领域已知的步骤进行样品制备和染色。对3个供体中的每个供体施行两次实验。分析1200个分裂中期以测定对照及微团簇水中的染色体畸变。

实施例1.在FALS小鼠中1％的肌酸添加物对3-硝基酪氨酸/酪氨酸浓度的影响。

氧化损伤包含一氧化氮生产的活化以及导致蛋白质硝化的过氧化亚硝酸盐的活化。蛋白质的硝化可经由测量3-硝基酪氨酸对酪氨酸的比例来确定。FALS小鼠为转基因动物，其表达超氧化Cu/超氧化Zn歧化酶的突变体形式，所述超氧化Cu/超氧化Zn歧化酶是在患有家族性ALS(肌萎缩侧索硬化)的患者中发现的。这些动物随着运动神经元的逐步减少、肌无力产生了ALS症状并在135天内死亡。氧化应激与运动神经元的死亡有关。在这些小鼠脊髓中的3-硝基酪氨酸的浓度显著增加(Ferrante 1997)。在成年的第70天给具有G93A突变的转基因小鼠与Httermate对照小鼠(每组八只小鼠)进食添加1％肌酸或未添加1％肌酸的饮食并随后在成年的第120天杀死小鼠用于测量所述的3-硝基酪氨酸(Ferrante 1997)。摄取的肌酸可显著地淬灭转基因FALS小鼠低段脊髓中3-硝基酪氨酸/酪氨酸的高浓度。

实施例2.通过水杨酸盐在FALS小鼠中转化为其副产物的速率来测定1％的肌酸添加物对羟基生产的影响。

可使用微量渗析技术来测定体内自由基产物的浓度(Matthews等人，1998)。施用线粒体毒性的3-硝基丙酸导致纹状体中水杨酸盐至2，3-DHBA转化的显著增加，其在过表达Cu、Zn SOD的小鼠中被阻断了(Bogdanov等人，1998)。发明人在此证明了全身施用3-硝基丙酸(3-NP)引起进食未添加1％肌酸饮食的G93A转基因小鼠中4-HBA至3，4-DHBA转化的显著增加。在进食添加1％肌酸的饮食的动物中，在施用3-NP后3，4 DHBA/4HBA没有显著增加。这证明了肌酸可将衰老相关损伤中涉及的羟基生产减到最少。

实施例3.在进食肌酸的对照动物及进食环氧肌酸的动物进行纹状体内注射丙二酸盐后2，3和2，5DHBA与3硝基酪氨酸(氧化应激的指示剂)的形成

水杨酸盐羟基诱捕方法用于测量丙二酸盐注射后纹状体组织中的羟基浓度。在纹状体内注射丙二酸盐之前给每组中的八只动物进食正常饮食或进食加入1％肌酸或1％环氧肌酸的饮食两周。恰好在丙二酸盐注射前给动物腹腔内注射200mg/kg的水杨酸盐并在1小时后将动物处死。随后快速地将纹状体切割成2-mm厚的切片并放入0.25ml冷却的0.1M高氯酸中。此后将样品进行超声处理、快速冻结和解冻并离心两次。通过使用具有16电极电化学检测器的HPLC来分析等分的上清液(Beal等人，1990)。通过在840、240、120、600和840mV分别使用20.5、9.4、6.3、10.5、18.2分钟的保留时间的氧化作用来电化学地测量水杨酸盐、2，3和2，5DHBA、酪氨酸、3-硝基酪氨酸。该数据表示为2，3和2，5DHBA对水杨酸盐的比率，以标准化DHBA浓度用于区别水杨酸盐的脑部浓度。同样地，3-硝基酪氨酸的浓度被标准化至酪氨酸的浓度。发明人还考察了添加1％的肌酸两周对3-NP诱发的3-硝基酪氨酸浓度增加的影响。腹腔内使用20mg/此剂量的3-NP对雌性Sprague Dawley大鼠进行治疗且随后在3小时时将其处死。对每组中的十只动物进行考察。将纹状体进行切割并放入冷却的0.1M高氯酸中。通过具有电化学检测器的HPLC来测量3-硝基酪氨酸和酪氨酸的浓度(Matthews 1998)。通过不成对的Student’s t检验或单向方差分析，然后通过用于事后比较的Fisher＇s保护最小显著差异检验来进行统计学比较。

这些实施例证明肌酸和环氧肌酸可防止注射线粒体毒性的丙二酸盐后，水杨酸衍生物2，3DHBA和2，5DHBA浓度的增加。这证实了肌酸化合物的确可以防止氧化应激和线粒体功能障碍中涉及的羟基的形成。这些实施例还证明了肌酸和环氧肌酸具有防止由线粒体毒性的丙二酸盐诱发的蛋白质硝化的保护效应。一氧化氮和过氧化亚硝酸盐的形成是氧化损伤级联反应的一部分。

实施例4.

与标准的去离子水相比(2.50％)，微团簇(MICRO-CLUSTER)(0.92％)的分裂中期畸变频率有效地降低(df＝1；x2＝8，96；P＝0.0028)。为了评价每个细胞SCE的平均数目，在所有情况下分析了300个分裂中期。显示了当微团簇水用作为RPMI 1640干燥培养基的溶剂时，与标准的去离子水相比(4,01±0,145)(df＝598；t＝3，311；P＝0，000985)，SCE的数目降低(3.38±0.120)。还可施行染色体染色来确定细胞分裂周期的持续时间，其经由计数第1、第2和第3次有丝分裂的数目进行。使用式：(∑ni/2^i-1)/(∑ni/2^i-1)来确定细胞培养物中分裂的平均数目，其中i＝有丝分裂数目，且ni＝BDU存在32小时后i-有丝分裂的细胞数目。细胞周期的持续时间按32小时除以分裂的平均数目来计算。两种类型水的细胞分裂周期的持续时间为21.2小时，其与文献数据相符。

因此，与标准的去离子水相比，微团簇水没有产生诱变效应。基于获得的数据，似乎微团簇水具有稳定效应，其与标准的去离子水相比，产生了更低的姐妹染色单体互换及染色体畸变频率。

实施例5.

本实施例考察了微团簇水对小鼠腹膜巨噬细胞细胞内pH的影响，并且还评价了短期和长期暴露于水的细胞膜状态。

步骤：在使用双蒸水和微团簇水制备的标准实验室用培养基中孵育15和240分钟的时间后测定巨噬细胞的细胞内pH。研究在使用双蒸水和微团簇水制备的标准实验室用培养基中的前15分钟期间的动力学pHi值并估计在15和240分钟的孵育时间后，巨噬细胞群中具有损伤的质膜的细胞数目。

试剂：

二醋酸荧光素(FscDA，Sigma)

溴化乙啶(EthBr，Sigma)

Hanks平衡盐溶液

标准实验室粉末培养基(标准实验室培养基)

HEPES(Sigma)

双蒸水(DDW)

微团簇水

尼日利亚菌素(Sigma)

小鼠腹膜巨噬细胞

将小鼠处死用于巨噬细胞分离。将2ml Hanks溶液(10mM HEPES，pH7.2)注射入腹膜中。注射后，从腹膜收集含有巨噬细胞的液体。通过EthBr和FSCDA的双重染色来控制收集的细胞中的质膜完整性。使用Hanks溶液来实现每ml混悬液中10⁶个细胞的最终细胞浓度。将少量的细胞混悬液(20ml)放置在玻璃盖玻片上，于湿室中孵育45分钟且随后使用Hanks溶液洗涤以除去附着在玻璃表面的细胞。这是用于与细胞混悬液和盖玻片相关的所有实验的方法。

获取具有损伤膜的细胞的计数：

使用EthBr(5mg/ml)和FSCDA(5mg/ml)的双重染色步骤来计数具有损伤的细胞膜的细胞。该方法是基于EthBr进入具有损伤细胞膜的细胞以及与DNA结合的能力来建立的。当结合DNA时，EthBr产生鲜红色的荧光。FSCDA很容易地从培养基中渗透入细胞中并且从结构上转化为具有亮绿色荧光的荧光素。因此，荧光素很容易地从具有损伤细胞膜的细胞离开并在完整的细胞中蓄积。作为这种双重染色的结果，技术人员可在与染料孵育的5分钟时间内观察到具有绿色荧光的完整细胞和红色荧光的具有损伤细胞膜的细胞。

细胞内pH的测量

巨噬细胞的细胞内pH测量是基于显微分光光度法和使用型号为LUMAM I3(LOMO，俄罗斯)的荧光显微镜进行的。这种特殊的显微镜具有改良的荧光激发和发射系统。通过使用蓝色(λmax＝435nm)光电二极管来施行荧光激发。同时以两个不同的、分别为λ＝520nm和λ＝567nm的干涉滤光片测量荧光。使用机内的微控制器(LA-70M4)进行荧光激发和同步的发射测量。巨噬细胞与pH指示剂FSCDA染料(5mg/ml)孵育15分钟。在孵育周期后洗掉培养基中游离的染料。测微法经由使用水浸物镜(x40)实现。使用pH标准曲线以确定细胞内的pH值。根据巨噬细胞的细胞内pHi，该标准曲线表示为比例K＝(I520/I570)(其中I520、I570分别为520nm和570nm的荧光强度)。为了获得不同的pHi值，将巨噬细胞在140mM KCl、1mM CaCl₂、0.5mM MgCl₂和20mMHEPES培养基中孵育。细胞内pH值在6.8至7.6的范围内变动。已经通过加入5mg/ml的离子载运体抗生素尼日利亚菌素来将细胞内pH调节至培养基的pH，其具有仅在3分钟内将H+调换成OH-的能力。尼日利亚菌素对K+具有高亲和力。这种性能允许其稳定下述的经膜平衡：其中i和o分别指内部和外部的浓度。因此，细胞内pH应接近于细胞外培养基中的pH，在细胞的外侧与内侧具有相同的K+浓度。

孵育介质：Hanks溶液(10mM Hepes)pH7.2；

标准实验室培养基在具有10mM Hepes、pH7.2的双蒸水中制备；

标准实验室培养基在具有10mM Hepes、pH7.2的微团簇水中制备；

组1.

将细胞在含有EthBr和FSCDA的介质中孵育15分钟。使用细胞外介质将它们彻底洗涤。将细胞介质替换为以双蒸水或微团簇水制备的标准实验室培养基。计算死亡的细胞数并在显微镜下观察30次以上，且将使用两种类型培养基替换的实验重复三次。细胞与FSCDA染料孵育15分钟且随后洗掉在细胞周围介质中的游离染料。将细胞培养基替换为以双蒸水或微团簇水制备的标准实验室培养基。使用至少30个显微观察值进行细胞内pH的动力学测定，所述观察被完整地重复三次。

组2.

细胞在使用双蒸水或微团簇水制备的标准实验室细胞培养基中孵育230分钟。随后，细胞使用用于细胞内pH的FSCDA和用于死细胞的EthBr进行染色。以如上描述和如本领域已知的类似方法施行定量测量。

在使用微团簇水或双蒸水制备的标准实验室细胞培养基中孵育15分钟、190分钟和230分钟后，改变巨噬细胞中的细胞内pH(δpHi)。在使用微团簇水制备的细胞培养基中孵育230分钟使得pHi增加0.43。当使用双蒸水制备的培养基时，还观察到巨噬细胞的细胞内pH的增加统计学上不显著。

pH的增加是淬灭代谢氧化剂的结果。羟基的淬灭将导致氢氧化物的形成，引起pH的增加。同样地，其他自由基和氧化剂的淬灭产生了增加pH的化学物质(chemical species)。重要的是，这些自由基和氧化剂的减少防止了它们与线粒体或其他生物学组成部分的有害的相互作用。其使得线粒体DNA以及其他DNA和细胞膜的突变减少。这种自由基、氧化剂及它们引起的损伤的减少增强了健康、提高了血氧浓度以及提供了更有效的氧利用。同样，线粒体衰败和破坏几率的降低使得继健康线粒体群增加后出现能量的增加。

总之，增加微团簇水的血浓度使得氧化损伤减少。实际上，本发明的水通过减少对线粒体DNA的损伤并且降低在相关能量学中的效能来提供抗衰老的结果。

上述讨论的实验结果的结论证实了本发明与功能性化妆化合物结合的微团簇液在防止氧化应激的级联反应中的重要性。认为衰老的过程牵涉到线粒体功能障碍和由下述分子的产生引起的氧化损伤，所述分子如羟基、一氧化氮和过氧化亚硝酸盐。发明人的结果强有力地提示微团簇液真正能够影响衰老的过程并由此适当地标为具有抗衰老作用。

虽然此处已通过参考特定的方法、材料和实施方案对本发明进行了描述，但是本发明不预期限制此处公开的特定内容，相反，本发明意欲将所有功能相当的结构、方法和用途延伸至例如所附权利要求的范围内。

Claims (20)

1.一种药疗化妆品，其包含：抗氧化剂、能量供应剂、营养剂和递送剂，其中所述抗氧化剂包含微团簇液，且所述能量供应剂包含渗压剂。

2.根据权利要求1所述的药疗化妆品，其中所述营养剂为维生素。

3.根据权利要求1所述的药疗化妆品，其中所述营养剂为在螯合基质中的矿物质。

4.根据权利要求1所述的药疗化妆品，其中所述递送剂为真皮渗透促进剂。

5.根据权利要求1所述的药疗化妆品，其中所述渗压剂为肌酸化合物。

6.根据权利要求1所述的药疗化妆品，其还包含遮光剂。

7.根据权利要求1所述的药疗化妆品，其中所述营养剂促进了胶原的增殖。

8.根据权利要求1所述的药疗化妆品，其中所述抗氧化剂为自由基淬灭剂。

9.根据权利要求1所述的药疗化妆品，其中所述抗氧化剂为ROS淬灭剂。

10.一种用于治疗皮肤损伤的方法，其包括施用有效量的药疗化妆品，其中所述药疗化妆品包含：抗氧化剂、能量供应剂、营养剂和递送剂，其中所述抗氧化剂含有微团簇液，且所述能量供应剂含有渗压剂。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述皮肤损伤选自：银屑病、衰老、不均匀的色素沉着、光诱发的损伤、感染、脱发、晒伤、干燥、皱纹及物理损伤。

12.根据权利要求10所述的方法，由此改善线粒体的能量生成。

13.一种组合物，其包含：粒化的遮光剂和微团簇液。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述粒化的遮光剂为无机遮光剂，选自：TiO₂、ZnO及其混合物，且其中所述微团簇液为抗衰老剂。

15.根据权利要求13所述的组合物，其还包含渗压剂。

16.根据权利要求14所述的组合物，其中所述抗衰老剂为有机化合物且所述微团簇液为微团簇水。

17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述有机化合物选自：羟基酸、富勒烯、胶原、胶原生长促进剂及肌酸。

18.一种药疗化妆品，其包含微团簇液。

19.根据权利要求18所述的药疗化妆品，其中所述微团簇液为微团簇水。

20.根据权利要求19所述的药疗化妆品，其中所述微团簇水是抗衰老的。

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