CN101066473A

CN101066473A - 纤维蛋白凝胶与钙磷纳米粒子复合支架的制备方法

Info

Publication number: CN101066473A
Application number: CN 200710069109
Authority: CN
Inventors: 高长有; 马列; 赵海光; 沈家骢
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2007-05-29
Filing date: 2007-05-29
Publication date: 2007-11-07
Anticipated expiration: 2027-05-29
Also published as: CN101066473B

Abstract

本发明公开了纤维蛋白凝胶与钙磷纳米粒子复合支架的制备方法，步骤包括：1)分别配制磷酸氢二氨的聚乙烯醇水溶液和氯化钙的聚乙烯醇水溶液；将上述两种水溶液混合，得非晶态的钙磷粒子；2)煅烧非晶态的钙磷纳米粒子，超声振荡，得分散的晶态钙磷纳米粒子；3)将纤维蛋白原粉末溶于生理盐水中；将凝血酶溶解于氯化钙溶液中；4)将晶态钙磷纳米粒子均匀分散在纤维蛋白原溶液中，然后与凝血酶溶液混合，在37℃恒温孵育形成凝胶。本发明以纤维蛋白凝胶为输运载体，采用混合的方法将钙磷纳米粒子引入到纤维蛋白凝胶体系中，得到复合结构的可注射型支架，具有微创修复、生物相容好和使用方便等优点，利于提高骨组织的修复效率。本发明制备方法简单，材料来源广泛。

Description

纤维蛋白凝胶与钙磷纳米粒子复合支架的制备方法

技术领域

本发明涉及一种纤维蛋白凝胶与钙磷纳米粒子复合支架的制备方法。具体说是通过对人体骨结构和功能的仿生模拟，采用纤维蛋白凝胶和钙磷粒子模拟骨细胞的细胞外基质，为骨修复提供一种制备复合结构支架的方法。

背景技术

骨损伤是目前常见的疾病。由于风湿、类风湿等各种骨关节疾病或运动创伤所造成的关节骨损伤给许多病人带来痛苦。迄今为止，临床上仍然缺少有效的方法修复大尺寸的骨缺损。应用再生医学的方法和原理来进行骨组织的修复是目前的一个重要手段，且取得了良好的效果。其中，骨修复支架在骨再生中起着十分重要的作用。

骨是一族生物矿物材料的总称，主要发育于脊椎动物中。虽然每一种类型的骨的结构和组成稍有变化，但都有一个共同的特点：它们主要成分都是由I型胶原纤维、碳羟磷灰石和水组成。骨是最复杂的生物矿化系统之一，也是最典型的天然有机-无机复合材料。骨中的碳羟磷灰石晶体都是板形的，平均长度和宽度分别为50nm和25nm；晶体厚度极薄，且非常一致，一般1.5nm至4.0nm。骨的主要有机相为胶原纤维，另外还有少量骨涎酸蛋白、硫酸软骨素、脂类、肽类等。胶原纤维中的原胶原分子具有三重螺旋结构，骨中的矿物相位于原胶原分子间的间隙孔内，排列成层，构成骨的基本结构。

模仿天然骨的成分及结构特征制造的骨替代材料，可为细胞提供与天然骨相类似的微环境。这有助于骨系细胞的粘附、增殖及功能发挥。这种材料不仅可直接作为骨缺损修复材料，也是优异的骨组织工程载体材料，尤其适用于无需承力的骨组织部位。

传统的骨修复材料难以在较小的尺度上原位实现受损骨的修复。手术的可操作性同样限制了大尺度材料在微创部位的应用。近年来，注射型水凝胶材料由于其体内培养和微创修复等优点而广受关注。水凝胶的前驱物均为溶液状态，极易注射，在物理或者化学刺激下在体内能够快速成型。模拟天然骨组织的化学组成，将纤维蛋白凝胶和钙磷纳米粒子混合，制备复合型的可注射凝胶，利用液态的水凝胶前驱物为运输载体注射到体内受损部位后，前驱物在体内快速固化形成凝胶。纤维蛋白凝胶的强大的粘结作用，可以有效地粘结受损的骨组织，为骨组织的再生提供良好的微环境。同时钙磷纳米粒子更有利于成骨细胞的生长，促进成骨细胞活性的正常表达。

发明内容

本发明的目的是提供一种在体内快速成型并快速粘结受损的组织，为受损的骨组织提供良好的微环境并且能够有效地促进骨细胞的迁移、生长与分化，促进受损骨修复的纤维蛋白凝胶与钙磷纳米粒子复合支架的制备方法。

本发明的纤维蛋白凝胶与钙磷纳米粒子复合支架的制备方法，其制备过程包括以下步骤：

1)将氯化钙和磷酸氢二氨分别溶解在50g/L聚乙烯醇水溶液中，分别配制浓度为0.1mol/L的磷酸氢二氨的聚乙烯醇水溶液和浓度为0.1mol/L的氯化钙的聚乙烯醇水溶液；将磷酸氢二氨的聚乙烯醇水溶液加入到氯化钙的聚乙烯醇水溶液中，搅拌混合；磷酸氢二氨的聚乙烯醇水溶液与氯化钙的聚乙烯醇水溶液的体积比为0.6或0.67；调节pH值至11；在0℃水浴中反应至少15分钟，陈化至少48小时，得非晶态的钙磷粒子；

2)将非晶态的钙磷粒子在900℃煅烧至少6小时，再超声振荡5～15分钟，得分散的晶态钙磷纳米粒子；

3)将纤维蛋白原粉末溶于生理盐水中，于37℃恒温水浴中孵育，使纤维蛋白原充分溶解，纤维蛋白原溶液的浓度为10～40mg/ml；将凝血酶溶解于浓度为40mM氯化钙溶液中，放入37℃恒温水浴中孵育，配制成浓度为10～40U/ml的溶液；

4)将步骤2)获得的晶态钙磷纳米粒子与纤维蛋白原溶液混合，其中晶态钙磷纳米粒子的最终质量百分浓度为1.5％～6％，在振荡器上震荡使钙磷纳米粒子均匀分散在纤维蛋白原溶液中，然后将分散有晶态钙磷纳米粒子的纤维蛋白原溶液与凝血酶溶液等体积均匀混合，放入37℃恒温烘箱中孵育2～5分钟，促使纤维蛋白原交联，形成凝胶，得到纤维蛋白凝胶与钙磷纳米粒子复合支架。

上述步骤2)得到的晶态钙磷纳米粒子是指晶态羟基磷灰石纳米粒子或β晶型磷酸钙纳米粒子。

本发明的有益效果在于：采用了纤维蛋白凝胶为输运载体，以混合的方法将钙磷纳米粒子引入到纤维蛋白凝胶体系中，得到具有复合结构的可注射型支架。纤维蛋白凝胶具有良好的粘结性能，钙磷纳米粒子能够有效地促进成骨细胞的正常生长和功能表达。本发明的支架具有微创修复、生物相容性好、综合性能优良和使用方便等优点，有利于提高骨组织的修复效率。材料的制备方法简单、材料来源广泛、生产效率高，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是非晶态磷酸钙粒子的扫描电镜照片；

图2是非晶态磷酸钙粒子的X射线衍射图；

图3是β晶型磷酸钙纳米粒子的X射线衍射图；

图4是β晶型磷酸钙纳米粒子的扫描电镜照片；

图5是β晶型磷酸钙纳米粒子的透射电镜照片；

图6是纤维蛋白凝胶复合β晶型磷酸钙纳米粒子复合支架的扫描电镜照片(β晶型磷酸钙纳米粒子的最终质量百分浓度为6％)；

图7是纤维蛋白凝胶复合β晶型磷酸钙纳米粒子复合支架的透射电镜照片(β晶型磷酸钙纳米粒子的最终质量百分浓度为6％)；

图8是纤维蛋白凝胶复合β晶型磷酸钙纳米粒子复合支架的动态粘弹性能随β晶型磷酸钙纳米粒子加入量的变化曲线；

图9是晶态羟基磷灰石纳米粒子的透射电镜照片。

具体实施方法

以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。

实例1：

1)将氯化钙和磷酸氢二氨分别溶解在50g/L的聚乙烯醇水溶液中，分别配制成浓度为0.1mol/L的磷酸氢二氨的聚乙烯醇水溶液和氯化钙的聚乙烯醇水溶液；将磷酸氢二氨的聚乙烯醇水溶液加入到氯化钙的聚乙烯醇水溶液中，搅拌速度为750转/分；磷酸氢二氨的聚乙烯醇水溶液与氯化钙的聚乙烯醇水溶液的体积比为0.67；用氢氧化钠将此混合溶液的pH值调节到11后，在0℃水浴中反应15分钟后，陈化48小时，即获得非晶态的磷酸钙粒子。图1是非晶态磷酸钙粒子的扫描电镜照片；图2是非晶态磷酸钙粒子的X射线衍射图；

2)将非晶态的磷酸钙粒子在900℃的高温烘箱中煅烧6小时，然后超声振荡处理5分钟，即获得β晶型的磷酸钙纳米粒子；图3是β晶型磷酸钙纳米粒子的X射线衍射图；

3)将纤维蛋白原粉末溶于生理盐水中，于37℃恒温水浴中孵育10分钟，使纤维蛋白原充分溶解，纤维蛋白原溶液的浓度为10mg/ml；将凝血酶溶解于40mM氯化钙溶液中，放入37℃恒温水浴中孵育10分钟，配制成10U/ml的溶液；

4)将步骤2)所获得的β晶型磷酸钙纳米粒子与纤维蛋白原溶液混合，其中β晶型磷酸钙纳米粒子的最终质量百分浓度为1.5％，在振荡器上震荡使β晶型磷酸钙纳米粒子均匀分散在纤维蛋白原溶液中，然后将分散有β晶型磷酸钙纳米粒子的纤维蛋白原溶液与凝血酶溶液等体积均匀混合，放入37℃恒温烘箱中孵育2分钟，促使纤维蛋白原交联，形成凝胶，即获得纤维蛋白凝胶与β晶型磷酸钙纳米粒子复合支架。

实例2：

步骤1)同实例1的步骤1)；

步骤2)同实例1的步骤2)，制备了β晶型磷酸钙纳米粒子，但煅烧时间为8小时；其余步骤同实例1。

实例3：

步骤1)同实例1的步骤1)；

步骤2)同实例1的步骤2)，制备了β晶型磷酸钙纳米粒子，但超声处理时间为15分钟；图4为β晶型磷酸钙纳米粒子的扫描电镜照片；图5为β晶型磷酸钙纳米粒子的透射电镜照片；其余步骤同实例1。

实例4：

步骤1)～2)同实例3的步骤1)～2)；

步骤3)同实例1的步骤3)，但纤维蛋白原溶液的浓度为40mg/ml；其余步骤同实例1。

实例5：

步骤1)～2)同实例3的步骤1)～2)；

步骤3)同实例4的步骤3)，但凝血酶溶液的浓度为40U/ml；其余步骤同实例1。

实例6：

步骤1)～3)同实例1的步骤1)～3)；

步骤4)同实例1的步骤4)，但凝胶时间为5分钟。

实例7：

步骤1)～3)同实例5的步骤1)～3)。

步骤4)同实例1的步骤4)，但β晶型磷酸钙纳米粒子的最终质量百分浓度为1.5％、3％或6％；图6为纤维蛋白凝胶复合β晶型磷酸钙纳米粒子复合支架的扫描电镜照片(β晶型磷酸钙纳米粒子的最终质量百分浓度为6％)；图7为纤维蛋白凝胶复合β晶型磷酸钙纳米粒子复合支架的透射电镜照片(β晶型磷酸钙纳米粒子的最终质量百分浓度为6％)；图8为纤维蛋白凝胶复合β晶型磷酸钙纳米粒子复合支架的动态粘弹性能随β晶型磷酸钙纳米粒子加入量的变化曲线。

实例8：

1)同实例1的步骤1)，但磷酸氢二氨的聚乙烯醇水溶液与氯化钙的聚乙烯醇水溶液的体积比固定为0.6，制备了非晶态的羟基磷灰石粒子；

2)将非晶态的羟基磷灰石粒子在900℃的高温烘箱中煅烧6小时，再通过超声处理5分钟后，即获得晶态的羟基磷灰石纳米粒子；

4)将步骤2)所获得的晶态羟基磷灰石纳米粒子与纤维蛋白原溶液混合，其中羟基磷灰石纳米粒子的最终质量百分浓度为1.5％，在振荡器上震荡使晶态羟基磷灰石纳米粒子均匀分散在纤维蛋白原溶液中，然后将分散有晶态羟基磷灰石纳米粒子的纤维蛋白原溶液与凝血酶溶液等体积均匀混合，放入37℃恒温烘箱中孵育2分钟，促使纤维蛋白原交联，形成凝胶，即获得纤维蛋白凝胶与晶态羟基磷灰石纳米粒子复合支架。

实例9：

步骤1)同实例8的步骤1)；

步骤2)同实例8的步骤2)，但煅烧时间为8小时，制备了晶态羟基磷灰石纳米粒子；其余步骤同实例8。

实例10：

步骤1)同实例8的步骤1)；

步骤2)同实例8的步骤2)，制备了晶态羟基磷灰石纳米粒子，但超声时间为15分钟；其余步骤同实例8；图9为晶态羟基磷灰石纳米粒子的透射电镜图。

实例11：

步骤1)～2)同实例10的步骤1)～2)；

步骤3)同实例8的步骤3)，但纤维蛋白原溶液的浓度为40mg/ml；其余步骤同实例8。

实例12：

步骤1)～2)同实例10的步骤1)～2)；

步骤3)同实例11的步骤3)，但凝血酶溶液的浓度为40U/ml；其余步骤同实例8。

实例13：

步骤1)～3)同实例8的步骤1)～3)；

步骤4)同实例8的步骤4)，但凝胶时间为5分钟。

实例14：

步骤1)～3)同实例12的步骤1)～3)；

步骤4)同实例8的步骤4)，但晶态羟基磷灰石纳米粒子的最终质量百分浓度为6％。

Claims

1.一种纤维蛋白凝胶与钙磷纳米粒子复合支架的制备方法，其制备过程包括以下步骤：

2.按权利要求1所述的纤维蛋白凝胶与钙磷纳米粒子复合支架的制备方法，其特征在于步骤2)得到的晶态钙磷纳米粒子是指晶态羟基磷灰石纳米粒子或β晶型磷酸钙纳米粒子。