CN101056620A - 腹膜内给予以脂质为基质的铂化合物制剂治疗癌症的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及治疗患者癌症的方法，包括腹膜内给予患者癌症治疗有效量的以脂质为基质的铂化合物制剂。
Description
相关申请
本申请要求2004年11月8日提交的美国临时专利申请系列第60/626,029号和2005年4月15日提交的美国临时专利申请系列第60/671,593号的优先权。
介绍
胃肠外给药途径包括向身体的不同腔室注射。胃肠外途径包括静脉内(iv)，即通过静脉直接向血管系统给药；动脉内(ia)，即通过动脉直接向血管系统给药；腹膜内(ip)，即向腹腔内给药；皮下(sc)，即皮肤下给药；肌内(im)，即向肌肉给药；和真皮内(id)，即在皮肤各层间给药。在许多时候胃肠外途径优于口服途径。例如，当要给予的药物在胃肠道中部分或全部降解时，胃肠外给药是优选的。相似地，需要在急诊病例中迅速响应时，胃肠外给药通常优于口服给药。
业已发现经由ip给药将化疗局部递送到腹膜区是对局部再生癌症安全和有效的治疗，例如卵巢癌和结肠癌。
腹膜内给予抗肿瘤药用于治疗诸如卵巢癌的癌症的概念已经吸引了很多研究者的兴趣。事实上，烷化剂，第一个被引入临床实践的细胞毒素药物，在20世纪50年代早期就开始被检验用于腹膜内递送。Markman M.，Cancer Treat Rev.，1986，73，219-242。
然而，直到20世纪70年代末期才开始完全探究局部给药在治疗卵巢癌中的问题和可能性。Markman M.，Cancer Treat Rev.，1986，13，219-242；Markman M.，Semin.Oncol，1991，18(suppl 3)，248-254。在发展用于检验腹膜内药物递送的合理策略中一个重要的事件是Dedrick等人发表的now-classic paper，从美国国立癌症研究所(National Cancer Institute)第一次出现了该途径在治疗卵巢癌中的声音药物代谢动力学原理。Dedrick RL，Myers CE，Bungay PM等人，Cancer Treat.Rep.，1978，62，1-9。
顺铂-顺式-二胺-二氯铂(II)-是一种在系统治疗癌症中使用的较有效的抗肿瘤药。该化疗药物在治疗实验室动物和人类肿瘤的肿瘤模型中非常有效，例如子宫内膜、膀胱、卵巢和睾丸肿瘤，及头颈部鳞状细胞癌(Sur，等人，1983 Oncology 40(5)：372-376；Steerenberg，等人，1988 Cancer Chemother Pharmacol.21(4)：299-307)。顺铂还广泛用于治疗肺癌，SCLC和NSCLC(Schiller等人，2001 Oncology 61(Suppl 1)：3-13)。其它活性铂化合物(下述定义的)对癌症治疗有用。
和其它癌症化疗药物一样，活性铂化合物如顺铂是典型的高毒性的。顺铂的主要缺点是其极端肾脏毒性，这是主要的剂量限制因素；其经由肾脏迅速代谢，循环半衰期仅有几分钟；和其对血浆蛋白的强亲和力(Freise，等人，1982 Arch Int Pharmacodyn Ther.258(2)：180-192)。
使活性铂化合物的毒性降到最低的尝试包括联合化疗，类似物的合成(Prestayko等人，1979 Cancer Treat Rev.6(1)：17-39；Weiss，等人，1993 Drugs.46(3)：360-377)，免疫疗法和包埋在脂质体中(Sur，等人，1983；Weiss，等人，1993)。包括顺铂的抗肿瘤药包埋在脂质体中相对于其游离形式具有降低的毒性，同时保留了抗肿瘤活性(Steerenberg，等人，1987；Weiss，等人，1993)。
然而，由于生物活性试剂的低水溶性，室温下约1.0mg/ml，和低亲油性，使得顺铂难于有效地包埋在脂质体或脂质络合物中，这两种性质导致了低的生物活性试剂/脂质比率。
包含顺铂的脂质体和脂质络合物遇到另一问题-组合物的稳定性。尤其是，在贮藏过程中生物活性试剂效能的维持和脂质体中的生物活性试剂的贮留是公认的难题(Freise，等人，1982；Gondal，等人，1993；Potkul，等人，1991 Am J Obstet Gynecol.164(2)：652-658；Steerenberg，等人，1988；Weiss，等人，1993)，且已经报导了包含顺铂脂质体有限的保存限期，属于4℃下保质几周的类型(Gondal，et al，1993 Eur J Cancer.29A(11)：1536-1542；Potkul，等人，1991)。
Alberts等人已经指出与iv顺铂相比，ip顺铂显著地改善了存活率，并显著地减少了对III期卵巢癌和残存2cm或更小肿瘤块患者的毒性作用。Alberts D.S.等人，New England Journal of Medicine，1996，335(26)，1950-5。然而，腹膜内注射顺铂有一些缺点，例如没有改善肾脏毒性，这是剂量限制性毒性。
另外，临床前和临床数据都确定了与使用药物递送腹膜途径治疗卵巢癌的任何益处都被限定到相对界限清楚的患该恶性肿瘤的小部分患者。Markman M.，Cancer Treat Rev.，1986，13，219-242；MarkmanM.，Semin.Oncol，1991，18(suppl 3)，248-254；Markman M，ReichmanB，Hakes T等人，J.Clin.Oncol.，1991，9，1801-1805。例如，在Memorial Sloan-Kettering Cancer Center(MSKCC)以联合顺铂为基础的治疗作为晚期卵巢癌补救治疗的一系列患者中，与仅5％的患者有至少一个肿瘤块最大直径＞1cm相比，32％(17/50)的残存肿瘤块最大直径≤1cm的患者在腹膜内疗法开始时获得了外科手术般证明的完全响应。Markman M，Reichman B，Hakes T等人，J.CHn.Oncol，1991，9，1801-1805。为了克服日益增加的癌症的有害作用明显需要更多而不只是给药的直接途径。
除了顺铂外，许多其它抗肿瘤药已经被检验当通过ip途径递送作为卵巢癌的补救治疗时的安全性和潜在效能。包括卡铂、紫杉醇、米托蒽醌、多柔比星、丝裂霉素-C、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、塞替派、重组干扰素-w、重组干扰素-7、白细胞介素2和肿瘤坏死因子。Markman M.，Cancer Treat Rev.，1986，13，219-242；Markman M.，Semin.Oncol，1991，18(suppl 3)，248-254；Markman M，ReichmanB，Hakes T等人，J.CHn.Oncol，1991，9，1801-1805；Markman M.，Regional antineoplastic drug delivery in the management of malignantdisease.Baltimore：The Johns Hopkins University Press，1991；BerekJ.S.，Markman M.，Int.J.Gynecol.Cancer，1992，1，26-29；MarkmanM，Berek J.S.，Int.J.Gynecol Cancer，1992，1，30-34；Alberts D.S.，Liu P.Y.，Hannigan E.V.等人，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol，1995，14，273a；Rowinsky E.K.，Donehower R.C.，N.Engl.J.Med.，1995，332，1004-1014.还探索了联合用药方法。
尽管ip给予铂化合物取得了进步，铂化合物在靶组织中的剂量限制性毒性和低药物水平使得大多数治疗未能增加患者的预期寿命。
发明概述
本发明的目标是提供治疗癌症的方法，包括给予以铂化合物作为一部分的以脂质为基质的制剂，其比没有脂质制剂给予铂化合物的亚急性毒性低，有时候低2倍。
通过局部引入铂化合物以避免经常与口服给药相关的胃肠道降解而治疗癌症也是本发明的目标。
本发明是由本文提出的以脂质为基质的铂制剂可以被有效地腹膜内给药的实现而完成的。
在一个实施方案中，本发明治疗患者癌症的特征方法包括腹膜内给予患者癌症治疗有效量的以脂质为基质的铂制剂。在某些实施方案中，铂制剂中铂化合物以约0.8mg/ml到约1.2mg/ml的浓度腹膜内给予。在某些实施方案中，铂制剂中铂化合物以约0.9mg/ml到约1.1mg/ml的浓度腹膜内给予。在某些实施方案中，铂制剂中铂化合物以约约1mg/ml的浓度腹膜内给予。
在某些实施方案中，本发明涉及上述方法，其中铂化合物选自：顺铂、卡铂(二氨(1，1-环丁烷二羧酸)-铂(II))、四铂(奥马铂)(四氯化(1，2-环己二胺-N，N’-铂(IV))、thioplatin(二(O-乙基二硫代碳酸)铂(II))、沙铂、奈达铂、奥沙利铂、heptaplatin、异丙铂、transplatin、洛铂、顺式-胺二氯(2-甲基吡啶)铂、JM118(顺式-胺二氯(环己胺)铂(II))、JM149(顺式-胺二氯(环己胺)-反式-二羟基铂(IV))、JM216(二-醋酸-顺式-胺二氯(环己胺)铂(IV))、JM335(反式-胺二氯(环己胺)二羟基铂(IV))和(反式，反式，反式)二-mu-(己烷-1，6-二胺)-mu-[二胺-铂(II)]二[二胺(氯)铂(II)]四氯化物和其混合物。在某些实施方案中铂化合物是顺铂。
在某些实施方案中，本发明涉及上述方法，其中脂质由选自下组的成员组成：卵磷脂酰胆碱(EPC)、卵磷脂酰甘油(EPG)、卵磷脂酰肌醇(EPI)、卵磷脂酰丝氨酸(EPS)、磷脂酰乙醇胺(EPE)、磷脂酸(EPA)、大豆卵磷脂(SPC)、大豆磷脂酰甘油(SPG)、大豆磷脂酰丝氨酸(SPS)、大豆磷脂酰肌醇(SPI)、大豆磷脂酰乙醇胺(SPE)、大豆磷脂酸(SPA)、氢化卵磷脂酰胆碱(HEPC)、氢化卵磷脂酰甘油(HEPG)、氢化卵磷脂酰肌醇(HEPI)、氢化卵磷脂酰丝氨酸(HEPS)、氢化磷脂酰乙醇胺(HEPE)、氢化磷脂酸(HEPA)、氢化大豆卵磷脂(HSPC)、氢化大豆磷脂酰甘油(HSPG)、氢化大豆磷脂酰丝氨酸(HSPS)、氢化大豆磷脂酰肌醇(HSPI)、氢化大豆磷脂酰乙醇胺(HSPE)、氢化大豆磷脂酸(HSPA)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷酯酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷酯酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC)、棕榈酰硬脂酰磷脂酰甘油(PSPG)、单-油酰-磷脂酰乙醇胺(MOPE)、胆固醇、麦角固醇、羊毛甾醇、生育酚、脂肪酸铵盐、磷脂铵盐(ammonium salts ofphospholids)、甘油酯铵盐、肉豆蔻酰胺、棕榈酰胺、月桂酰胺、硬脂酰胺、二月桂酰乙基磷酸胆碱(DLEP)、二肉豆蔻酰乙基磷酸胆碱(DMEP)、二棕榈酰乙基磷酸胆碱(DPEP)和二硬脂酰乙基磷酸胆碱(DSEP)、N-(2，3-二-(9-(Z)-十八烯基氧)-丙-1-基-N，N，N-三甲基铵氯化物(DOTMA)、1，2-二(油酰氧)-3-(三甲基铵基)丙烷(DOTAP)、磷脂酰甘油(PGs)、磷脂酸(PAs)、磷脂酰肌醇(PIs)、磷脂酰丝氨酸(PSs)、二硬脂酰磷酯酰甘油(DSPG)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇(DMPI)、二棕榈酰磷脂酰肌醇(DPPI)、二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPI)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)和其混合物。在某些实施方案中，以脂质为基质的铂制剂中的脂质是磷脂例如二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)或甾醇，如胆固醇，或者两者。在进一步的实施方案中，脂质是50-65mol％的DPPC与35-50mol％的胆固醇的混合物。
在进一步的实施方案中，所治疗的癌症选自：黑素瘤、睾丸癌(生殖细胞)、骨肉瘤、软组织肉瘤、甲状腺癌、结肠癌、卵巢癌、肾脏癌症、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、子宫癌、肺癌、胃癌、肝脏癌、子宫内膜癌或头颈部鳞状细胞癌。在某些实施方案中，所治疗的癌症是卵巢癌或结肠癌。
在进一步的实施方案中，本发明涉及上述方法，其中以脂质为基质的铂化合物制剂中的铂化合物与脂质的重量比为1∶5到1∶50。在进一步的实施方案中，以脂质为基质的铂化合物制剂包含平均直径为0.01微米到3微米的脂质体。
在进一步的实施方案中，本发明涉及上述方法，其中脂质是DPPC和胆固醇的混合物，以脂质为基质的铂化合物制剂中铂化合物与脂质的重量比为1∶5到1∶50，且以脂质为基质的铂化合物制剂包含平均直径1.01微米到3.0微米的脂质体。在进一步的实施方案中，铂化合物是顺铂。
在进一步的实施方案中，本发明涉及上述方法，其中脂质是重量比为2∶1的DPPC和胆固醇的混合物，以脂质为基质的铂化合物制剂中的铂化合物与脂质的重量比为1∶20，以脂质为基质的铂化合物制剂包含平均直径为0.40微米的脂质体，且其中铂化合物是顺铂。
在进一步的实施方案中，患者是人。在进一步的实施方案中，以脂质为基质的铂化合物制剂至少每3周给予患者1次。在进一步的实施方案中，以脂质为基质的铂化合物制剂至少每3周给予患者2次。在进一步的实施方案中，以脂质为基质的铂化合物制剂至少每3周给予患者3次。在进一步的实施方案中，以脂质为基质的铂化合物制剂中铂化合物的量为60mg/m2或更多，100mg/m2或更多，140mg/m2或更多，或180mg/m2或更多。在进一步的实施方案中，以脂质为基质的铂化合物制剂中铂化合物的量为100mg/m2或更多，且以脂质为基质的铂化合物制剂至少每3周给予患者1次。
在另一个实施方案中，本发明涉及上述方法，其中以脂质为基质的铂化合物通过下述制备(a)将铂化合物与疏水基质载体系统混合；(b)在第一温度下建立混合物；(c)此后在第二温度下建立混合物，其中第二温度比第一温度低；其中的步骤(b)和(c)有效地增加铂化合物的包封。在进一步的实施方案中，第一温度为约4℃到约70℃。在进一步的实施方案中，第二温度为约-25℃到约25℃。在进一步的实施方案中，维持步骤b)和c)约5到300分钟。
从下述说明书、附图和权利要求来看本发明的这些实施方案，其它实施方案，和它们的特征和特性是显而易见的。
附图简要说明
图1描述了ip给予以脂质为基质的顺铂(L-CDDP-ip)与ip给予顺铂(CDDP-ip)相比毒性的巨大降低。
图2描述了腹膜内和静脉内给予以脂质为基质的顺铂与腹膜内给予游离顺铂相比血流中顺铂增加的量。
图3描述了腹膜内给予以脂质为基质的顺铂与腹膜内给予游离顺铂相比血流中顺铂增加的量。
图4描述了腹膜内给予以脂质为基质的顺铂与腹膜内给予游离顺铂相比肾脏中顺铂增加的量。
图5描述了腹膜内给予以脂质为基质的顺铂与腹膜内给予游离顺铂相比肝脏中顺铂增加的量。
图6描述了腹膜内给予以脂质为基质的顺铂与腹膜内给予游离顺铂相比肺中顺铂增加的量。
图7描述了腹膜内给予以脂质为基质的顺铂与腹膜内给予游离顺铂相比脾脏中顺铂增加的量。
图8描述了腹膜内给予以脂质为基质的顺铂与腹膜内给予游离顺铂的血液/肾脏浓度比率。
图9描述了当游离顺铂以静脉内或腹膜内递送时与两种方法给予以脂质为基质的顺铂相比血液尿素氮(BUN)水平的升高。
图10描述了ip给予游离顺铂和以脂质为基质的顺铂后植入活的人类卵巢癌细胞系SK-OV3-ipl的小鼠的存活率。
图11描述了ip给予以脂质为基质的顺铂、非循环温度顺铂脂质体和可溶性顺铂后植入L1210肿瘤细胞的小鼠的存活率。
发明详述
定义
为了方便，在进一步描述本发明前，此处收集了说明书、实施例和附加权利要求中使用的某些术语。这些定义应当根据发明公开的剩余部分来理解，并且由本领域技术人员理解。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意思与本领域普通技术人员理解的相同。
冠词″a″和″an″用于本文指代该冠词的一种或多于一种(即至少一个)语法目的。例如，″an成分″是指一种或多于一种的成分。
术语″生物可利用的″是本领域公认的，指所被所给予的个体或患者吸收，掺入，或对所给予的个体或患者其他方式生理学可获得的本发明的一种形式，或给予量的一部分。
本文使用的术语″癌症治疗有效量″指有效治疗癌症的以脂质为基质的铂化合物制剂的量。在一个实施方案中，向人ip递送以脂质为基质的铂化合物制剂的癌症治疗有效量典型地为约100mg/m2。
术语″CDDP″代表顺二氯化二氨亚铂，其在本文中可与″顺铂″替换使用。
术语″包含(comprise)″和″包含(comprising)″是指包含在内的，开放的意思，指可包含附加的成分。
术语″疏水性基质载体系统″是在下面描述的溶剂浸渍方法中制备的脂质/溶剂混合物。
术语″包括″用于本文是指″包括而不限于″。″包括″和″包括而不限于″可替换使用。
本文使用的术语″腹膜内(intraperitoneal)″或″腹膜内(intraperitoneally)″或″ip″是指将治疗剂，例如抗肿瘤化合物，例如铂化合物，给予患者的腹膜腔。本文使用的术语″腹膜腔″是指衬套腹腔骨盆壁和包埋内脏的桨膜。
术语″L-CDDP″代表顺铂的以脂质为基质的制剂，其在本文中可与″以脂质为基质的顺铂″替换使用。
本文使用的术语″以脂质为基质的铂化合物″是指包含脂质和铂化合物的组合物。在一些实施方案中，以脂质为基质的铂化合物可以是脂质体的形式。在一些实施方案中，以脂质为基质的铂化合物中铂化合物与脂质的重量比可以为约1∶5到1∶50。在进一步的实施方案中，以脂质为基质的铂化合物中铂化合物与脂质的重量比可以为约1∶5到约1∶30。在进一步的实施方案中，以脂质为基质的铂化合物中铂化合物与脂质的重量比可以为约1∶5到1∶25。在其它实施方案中，铂化合物可以是顺铂。
术语″哺乳动物″是本领域已知的，示例性哺乳动物包括人类、灵长类、牛类、猪类、犬类、猫类和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。
通过本方法治疗的″患者(patient)″、″个体(subject)″或″宿主(host)″可指人或非人类动物。
术语″药学可接受的盐″是本领域公认的，指化合物相对无毒的、无机和有机酸加成盐，包括，例如包含于本发明组合物中的那些。
术语″溶剂浸渍″是一种方法，包括将一种或多种脂质溶于少量，优选最小限度量的方法相容的溶剂中形成脂质混悬液或溶液(优选溶液)，然后将该溶液加入到包含生物活性剂的含水介质中。代表性的方法相容的溶剂是在诸如透析的含水处理中可以被洗去的溶剂。被冷/热循环的组合物优选通过溶剂浸渍形成。优选醇类作为溶剂，乙醇是优选的醇。
″乙醇浸渍″是一种类型的溶剂浸渍，包括将一种或多种脂质溶于少量，优选最小限度量的乙醇中形成脂质溶液，然后将该溶液加入到包含生物活性剂的含水介质中。″少量″的溶剂是在浸渍过程中适合于形成脂质体或脂质络合物的量。
术语″治疗剂″是本领域公认的，指任何的化学部分，是局部或系统用于患者的生物学、生理学或药理学活性物质。治疗剂，也称作“药物”，其实例描述于公知的参考文献中，例如Merck Index、PhysiciansDesk Reference和The Pharmacological Basis of Therapeutics，它们包括而不限于，药品；维生素；矿物补充物；用于处理、预防、诊断、治疗或减轻疾病或病症的物质；影响身体结构或机能的物质；或者前药，被置于生理学环境中后它们变为生物学活性的或活性更高。
术语″治疗指数″是本领域公认的术语，是指定量鉴定药物的毒性与定量鉴定药物的有效性的比值，例如动物的LD50/ED50。术语″LD50″是领域公认的，指给定毒性物质引起受试有机体50％致死响应的量。它有时候也指半数致死量。术语″ED50″是领域公认的，指半数有效量。
术语″治疗″是本领域公认的，指治疗和改善任何病症或疾病的至少一种症状。
II.脂质
用于形成脂质体以ip或iv递送抗肿瘤药的脂质可是合成、半合成或天然存在的脂质，包括磷脂类、生育酚类、甾醇类、脂肪酸类、糖蛋白类如白蛋白、带阴性电荷的脂质类和阳离子脂质类。对于磷脂类，它们可包括脂质诸如卵磷脂酰胆碱(EPC)，卵磷脂酰甘油(EPG)，卵磷脂酰肌醇(EPI)，卵磷脂酰丝氨酸(EPS)，磷脂酰乙醇胺(EPE)和磷脂酸(EPA)；大豆类似物，大豆卵磷脂(SPC)；SPG，SPS，SPI，SPE和SPA；氢化的卵和大豆类似物(例如HEPC、HSPC)，脂肪酸在2和3甘油为形成酯键的包含12到26个碳原子链的其它磷脂，在I位甘油上的不同首基包括胆碱，甘油，肌醇，丝氨酸，乙醇胺和相应的磷脂酸。这些脂肪酸上的链可以是饱和的或未饱和的，磷脂可由不同链长和不同饱和度的脂肪酸组成。尤其是，该制剂组合物可以包含DPPC。其它实例包括二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)和二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)二硬脂酰磷酯酰胆碱(DSPC)和二硬脂酰磷酯酰甘油(DSPG)，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和混合磷脂如棕榈酰硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC)和棕榈酰硬脂酰磷脂酰甘油(PSPG)，和单酰化磷脂如单-油酰-磷脂酰乙醇胺。
甾醇类可以包括胆固醇，包括胆固醇半琥珀酸酯的胆固醇酯，包括胆固醇硫酸氢盐和胆固醇硫酸盐的胆固醇盐，麦角固醇，包括麦角固醇半琥珀酸酯的麦角固醇酯，包括麦角固醇硫酸氢盐和麦角固醇硫酸盐的麦角固醇盐，羊毛甾醇，包括羊毛甾醇半琥珀酸酯的羊毛甾醇酯，包括羊毛甾醇硫酸氢盐和羊毛甾醇硫酸盐的羊毛甾醇盐。生育酚类包括生育酚，包括生育酚半琥珀酸酯的生育酚酯，包括生育酚硫酸氢盐和生育酚硫酸盐的生育酚盐。术语″甾醇化合物″包括甾醇类，生育酚类等。
所使用的阳离子脂质包括脂肪酸、磷脂和甘油酯的铵盐。脂肪酸包括碳链长为12到26个碳原子的脂肪酸，它们是饱和或未饱和的。一些具体的实例包括：肉豆蔻酰胺、棕榈酰胺、月桂酰胺和硬脂酰胺、二月桂酰基乙基磷酸胆碱(DLEP)、二肉豆蔻酰乙基磷酸胆碱(DMEP)、二棕榈酰乙基磷酸胆碱(DPEP)和二硬脂酰乙基磷酸胆碱(DSEP)、N-(2，3-二-(9-(Z)-十八烯基氧)-丙-1-基-N，N，N-三甲基铵氯化物(DOTMA)和1，2-二(油酰氧)-3-(三甲基铵基)丙烷(DOTAP)。
可以使用的带阴性电荷的脂质包括磷脂酰甘油(PGs)、磷脂酸(PAs)、磷脂酰肌醇(PIs)和磷脂酰丝氨酸(PSs)。实例包括DMPG、DPPG、DSPG、DMPA、DPPA、DSPA、DMPI、DPPI、DSPI、DMPS、DPPS和DSPS。
III.脂质体
脂质体是含有包埋含水容积的完全闭合的脂质双分子层膜。用于胃肠外递送抗肿瘤化合物的脂质体可是单层泡囊(具有单一薄膜双分子层)或多层泡囊(特征为多层薄膜双分子层的洋葱状结构，通过含水层相互分离)。该双分子层由两个具有疏水“尾巴”区域和亲水“头部”区域的脂质单层组成。薄膜双分子层结构是脂质单层的疏水(非极性)“尾巴”朝向双分子层的中心，而亲水性“头部”朝向水相。
脂质体可以通过许多方法制备(作为回顾，参见如Cullis等人(1987))。Bangham′s procedure(J.MoI.Biol.(1965))制备了普通的多层泡囊(MLVs)。Lenk等人(美国专利号4,522,803、5,030,453和5,169,637)，Fountain等人(美国专利号4,588,578)和Cullis等人(美国专利号4,975,282)公开了制备在它们各个含水间隔中基本相等层间溶质分布的多层脂质体的方法。Paphadjopoulos等人，美国专利号4,235,871，公开了通过反相蒸发制备少层脂质体的方法。
通过许多技术可是从MLVs制备单层泡囊，例如，Cullis等人(美国专利号5,008,050)和Loughrey等人(美国专利号5,059,421))的挤压方法。因此声波处理和均质化可以用于由较大脂质体制备较小单层脂质体(参见，例如Paphadjopoulos等人(1968)；Deamer和Uster(1983)；和Chapman等人(1968))。
Bangham等人(J.MoI.Biol.，1965，13：238-252)制备最初的脂质体包括将磷脂类混悬于有机溶剂中，然后蒸干，在反应容器上留下脂质薄膜。然后，加入适量的水相，使混合物“膨胀”，所得包含多层泡囊(MLVs)的脂质体通过机械方式而分散。该制备方法为Papahadjopoulos等人描述的小的声波处理的单层泡囊(Biochim.Biophys，Acta.，1967，135：624-638)和大单层泡囊的发展提供了基础。
制备大单层泡囊(LUVs)的技术，例如，反相蒸发法，浸渍方法和清洁剂稀释法，可以用于制备脂质体。在本文中可发现对制备脂质体这些那些方法的回顾。Liposomes，Marc Ostro，ed.，MarcelDekker，Inc.，New York，1983，Chapter 1，其有关部分引入本文以作参考。还参见Szoka，Jr.等人，(1980，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，9：467)，其有关部分引入本文以作参考。
用于制备泡囊的其它技术包括形成反相蒸发泡囊(REV)的那些，Papahadjopoulos等人，美国专利号4,235,871。另一类可使用的脂质体是特征为具有大体上相等层溶质分布的脂质体。该类脂质体在授予Lenk，等人的美国专利号4,522,803中被命名为稳定的多层泡囊(SPLV)，包括授予Fountain等人的美国专利号4,588,578中描述的单相泡囊和如上所述的冷冻和融化的多层泡囊(FATMLV)。
许多甾醇和它们的水溶性衍生物如胆固醇半琥珀酸酯已经被用于制备脂质体；特别是参见1988年1月26日发行的标题为″SteroidalLiposomes″的Janoff等人的美国专利号4,721,612。Mayhew等人，PCT公布号WO 85/00968，1985年3月14日公开，描述了通过包埋于包含α-生育酚和其某些衍生物的脂质体中来降低药物毒性的方法。并且，许多生育酚和它们的水溶性衍生物已经被用于形成脂质体，参见Janoff等人，PCT公布号87/02219，1987年4月23日公开，标题为″Alpha Tocopherol-Based Vesicles″。
制备脂质体的另一方法是″溶剂浸渍″法。溶剂浸渍是一种方法，包括将一种或多种脂质溶于少量，优选最小限度量的方法相容的溶剂中形成脂质混悬液或溶液(优选溶液)，然后将该溶液加入到包含例如铂化合物的含水介质中。代表性的方法相容的溶剂是在诸如透析的含水处理中可以被洗去的溶剂。被冷/热循环的组合物优选通过溶剂浸渍形成，优选乙醇浸渍。
制备以脂质为基质的铂化合物制剂的方法可包括将铂化合物与适当的疏水基质混合，将该混合物在两个不同的温度下循环。该方法被认为形成了活性的铂化合物缔合物。
在含水溶液中，当铂化合物是顺铂时，可形成直径大于几微米的大的不溶性聚集物。在两亲性基质系统的存在下，例如脂质双分子层，顺铂-脂质缔合物形成。例如，该缔合物可在内部含水空间、脂质双分子层的碳氢化合物核心区域或脂质体界面或首基中形成。在该方法的加热循环过程中，应当相信的是顺铂在该过程混合物的含水区域中以比从脂质-基质快的速度被恢复为溶液。作为进行一次以上冷/热循环的结果，顺铂从脂质-基质中进一步积聚。不将本发明限制于已经提出的理论，实验表明顺铂-脂质缔合物导致了界面双分子层区域的紧靠环境更加疏水和致密。这使得在重复冷却和加热循环中产生了高水平的活性铂化合物的包埋。
该方法包括将铂化合物与疏水基质载体系统混合，将溶液在较热和较冷温度下循环。优选循环进行一次以上。更优选该步骤进行2次或多次，或者3次或多次。循环的较低温度部分可以，例如使用约-25℃到约25℃。更优选该步骤使用约-5℃到约25℃或约1℃到约20℃的温度。为了制备方便，且为了确信所需的温度已被确定，冷却和加热步骤可以被维持一段时间，例如约5到300分钟或30到60分钟。加热的步骤包括加热反应容器到约4℃到约70℃。更优选的加热步骤包括加热反应容器到约45℃或到约55℃。上述温度范围特别优选用于主要包含二磷脂酰胆碱(DPPC)和胆固醇的脂质组合物。
考虑温度循环另一方面是该循环加热和冷却步骤间的温度差别。该温度差别可以是，例如，约25℃或更大，例如差别约25℃到约70℃，优选差别约40℃到约55℃。冷却和加热步骤的温度根据渐增的活性铂化合物的包埋而选择。不限于理论，应当认为选择较高温度有效地大量增加活性铂化合物在受处理混合物中的溶解度是有用的。优选地，加热步骤温度为约50℃或更高。温度也可以选择低于和高于脂质在脂质组合物中的转换温度。
在某些情况下，适合该方法的温度可根据所使用脂质组合物变化，这可以通过普通实验确定。
本发明使用的以脂质为基质的铂制剂中的铂化合物与脂质的重量比可为约1∶5到约1∶50。更优选的铂化合物与脂质的重量比为1∶5到约1∶30。最优选的铂化合物与脂质的重量比为约1∶5到约1∶25。
脂质体的平均直径为约0.01微米到约3.0微米，优选在约0.1到1.0微米的范围内。更优选地，平均直径为约0.2到0.5微米。脂质体产品的持续释放性质可以通过脂质薄膜的性质和通过在组合物中包含其它赋形剂(例如甾醇)来调节。
在本发明优选的实施方案中，脂质体包含约50到约100mol％的DPPC和约0到约50mol％的胆固醇。更优选地，脂质体包含约50到约65mol％的DPPC和约35到约50mol％的胆固醇。
脂质体还可以通过共同未决的美国专利申请：2003年3月5日提交的10/383,004；2003年8月4日提交的10/634,144；2002年8月20日提交的10/224,293；和2003年10月29日提交的10/696,389中描述的方法制备，它们的说明书的全部内容引入本文以作参考。
IV.铂化合物
可用于本发明的铂化合物包括显示预防肿瘤细胞的发展、成熟或扩散性质的任何化合物。铂化合物的非限制性实例包括顺铂、卡铂(二氨(1，1-环丁烷二羧酸)-铂(II))、四铂(奥马铂)(四氯化(1，2-环己二胺-N，N’-铂(IV))、thioplatin(二(O-乙基二硫代碳酸)铂(II))、沙铂、奈达铂、奥沙利铂、heptaplatin、异丙铂、transplatin、洛铂、顺式-胺二氯(2-甲基吡啶)铂、JM118(顺式-胺二氯(环己胺)铂(II))、JM149(顺式-胺二氯(环己胺)-反式-二羟基铂(IV))、JM216(二-醋酸-顺式-胺二氯(环己胺)铂(IV))、JM335(反式-胺二氯(环己胺)二羟基铂(IV))和(反式，反式，反式)二-mu-(己烷-1，6-二胺)-mu-[二胺-铂(II)]二[二胺(氯)铂(II)]四氯化物。在另一个实施方案中，铂化合物是顺铂。取决于环境，顺铂可以阳离子水合形式存在，其中两个阴性带电氯原子被两个中性水分子移位。由于顺铂的水合形式是阳离子形式的，所以阴离子形式的脂质例如甘油有助于稳定以脂质为基质的制剂，但是还可能妨碍顺铂的释放。非水合的、中性形式的顺铂较难稳定，具有不同的释放动力学。在某些实施方案中以脂质为基质的顺铂制剂包含中性顺铂和中性脂质被认为是本发明的优点。由于中性、非水合形式的顺铂和阳离子、水合形式的顺铂间的平衡，有助于中性、非水合形式的顺铂制备低pH值和高NaCl浓度的制剂。在该实施方案中，直至中性、非水合形式的顺铂递送到细胞内部，将不会形成大量的阳离子的、水合形式的顺铂。
在其它实施方案中，其它治疗剂可与铂化合物一起使用。这些其它的治疗剂可具有抗肿瘤性质。抗肿瘤化合物非限制性的实例包括六甲蜜胺、甲氨蝶呤、氨柔比星、annamycin、三氧化二砷、门冬酰胺酶、BCG、苄基鸟嘌呤、比山群、硫酸博来霉素、白消安卡莫司汀(busulfan carmustine)、恶病质素、chlorabucil、2-氯脱氧腺苷、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、咪唑羧酰胺、放线菌素D、柔红霉素、3′-脱氨-3′-吗啉代-13-脱氧-10-羟基去甲柔红霉素、4-脱甲氧-3-脱氨-3-氮丙定基-4-甲磺酰基-柔红霉素、dexifosfamide、地塞米松、diarizidinylspemine、二溴卫矛醇、二溴螺氯铵、1-(11-十二烷基氨基-10-羟十一烷基)-3，7-二甲基黄嘌呤、多柔比星、依利奈法德、表鬼臼毒素、雌莫司汀、氟尿苷、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、fiudarabine、福莫司汀、加柔比星、葡磷酰胺、戈舍瑞林、GPX100、羟基脲、盐酸伊达比星、异环磷酰胺、英丙舒凡甲苯磺酸盐(improsulfantosilate)、异磷酰胺、干扰素α、干扰素α2a、干扰素α2b、干扰素αn3、干扰素γ、白细胞介素2、伊立替康、伊罗夫文、甲酰四氢叶酸钙、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、甲地孕酮、左旋苯丙氨酸氮、左旋溶肉瘤素、盐酸美法仑、氮芥、MEN10755、巯嘌、MESNA、甲泼尼龙、甲氨蝶呤、丝裂霉素、丝裂霉素-C、米托蒽醌、尼莫司汀、紫杉醇、吡萘非特、吡柔比星、普卡霉素、泼尼莫司汀、泼尼松、丙卡巴肼、甲基丝裂霉素、嘌嘧替派、雷莫司汀、sertenef、链佐星、链唑霉素、他莫昔芬、他索纳明、替莫唑胺、6-硫鸟嘌呤、塞替派、tirapazimine、Methylene thiophosporamide、曲磷胺、肿瘤坏死因子、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春瑞滨酒石酸盐和佐柔比星。
还包括作为适当铂化合物用于本法方法的是铂化合物的药理学可接受的加成盐和络合物。在化合物具有一个或多个手性中心的情况下，除非指定，本发明包含各自唯一的化合物和各自唯一的非消旋化合物。
在铂化合物具有未饱和的碳-碳双键的情况下，顺式(Z)和反式(E)异构体都在本发明的范围之内。在肿瘤化合物以互变异构形式存在的情况下，例如酮-烯醇互变异构体，例如
和
每一互变异构形式都被认为包含在本发明的范围内，无论是否以平衡或者以被R′适当取代的固定形式存在。在任何一种情况下任何取代基的含义都独立于任何其它情况下的它的含义，或独立于任何其它情况下任何其它取代基的含义。
还包括作为适当铂化合物用于本发明方法的是铂化合物的前药。前药被认为是在体内释放活性母体化合物的任何共价键合的载体。
本发明部分地公开了更加有效地治疗癌症的方法，其具有先前所没有公开的较低的肾脏毒性。通过使用以脂质为基质的制剂和ip递送，获得了更有力和有效的癌症疗法。
V.剂量
本发明任何组合物的剂量将依赖于症状、患者的年龄和体重、要治疗或预防病症的性质和严重性、给药途径和组合物的形式而变化。任何制剂都可以单一剂量或分剂量给予。本发明组合物的剂量可通过本领域技术人员已知的技术或本文的教导容易地确定。
在某些实施方案中，受试化合物的剂量通常为约0.01ng到约10g每千克体重，特别是约1ng到约0.1g每千克，更特别是约100ng到约50mg每千克。
给药量也通常以mg/m2给予，其代表毫克药物(例如铂化合物)每体表面积。通常，铂化合物的给药量可是约60mg/m2或更多，100mg/m2或更多，140mg/m2或更多，或180mg/m2或更多。约140mg/m2或更多的给药量通常被认为是耐受的最高程度，而本发明的优点是铂化合物作为以脂质为基质的制剂的一部分给予，这降低了铂化合物的亚急性毒性。因此，发明者构想可给予患者高于正常给药量的铂化合物而没有有害的毒副作用。较高的剂量可产生用药间更长的持续周期，且对患者更加方便。例如，通常每3周给予患者1次给药量。如果铂化合物较高的给药量可以安全地给予患者，那么周期可增加到每4、5、6、7或甚至8周1次。较长的周期意味着对于治疗护理装置出现的差错更少，患者经受更少次数的给药过程。
对于本发明任何特别的组合物都需要鉴定有效剂量或有效量，和影响制剂给药周期的任何可能。这可通过如本文描述的常规实验来完成，使用一组或多组动物(优选每组至少5只动物)，或如果合适以人体试验进行。任何组合物和治疗或预防方法的作用可通过如下评价，给予组合物，测量一种或多种可应用的指数来评估给药的作用，比较这些指数治疗后的数值和治疗前的数值。
任何特别的组合物在给定患者中产生最有效治疗的给药精确时间和量依赖于受试组合物的活性、药物代谢动力学和生物利用度，患者的生理条件(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体健康状况、对给定药物剂量和类型的响应性)，给药途径等。本文提出的指导方针可用于优化治疗，例如确定最适宜的给药时间和/或给药量，这需要的只是包括监测患者和调整剂量和/或时间的常规实验。
在患者受到治疗的同时，可通过在治疗期过程中以预定次数测量一个或多个相关指数来监测患者的健康状态。治疗，包括给予的组合物，给药量，给药次数和制剂，可根据这些监测的结果而被最优化。通过测量相同的参数，可周期性地再评估患者以确定改善的程度。可基于这些再评故对受试组合物给予的量且可能对于给药时间进行调整。治疗可从较小的剂量开始，该剂量低于化合物最优剂量。此后，以很小的增量增加剂量直到获得最佳的治疗效果。
本发明组合物的使用可减少包含于该组合物中任何个体试剂(例如抗肿瘤化合物)所需的剂量，因为不同试剂作用的开始和过程是可被补合的。
本发明组合物的毒性和治疗效果可通过细胞培养或实验动物中的标准药物方法测定，例如测定LD50和ED50。
从细胞培养分析和动物研究中获得的数据可用于形成在人类中使用的剂量范围。任何本发明组合物的剂量优选地在循环浓度的范围之内，该范围包括低或者无毒性的ED50。剂量依赖于所使用的剂型和所利用的给药途径可在该范围内变化。对于本发明的组合物，治疗有效量可从细胞培养测定法开始评价。
VI.药物制剂
该抗肿瘤化合物的药物制剂可包含脂质体的水分散系。该制剂可包含形成脂质体的脂质赋形剂，和提供适当渗透性和pH值的盐/缓冲液。药物赋形剂可是液体，稀释剂，溶剂或包囊材料，涉及将任何本发明组合物或其成分从身体的一个器官，或部位带入或转移到身体的另一器官，或部位。每一赋形剂必须是“可接受的”，也就是于本发明组合物和其成分相容并对患者无害。适当的赋形剂包括海藻糖、棉子糖、甘露醇、蔗糖、亮氨酸、trileucine和氯化钙。其它适当赋形剂的实例包括(1)糖类，例如乳糖和葡萄糖；(2)淀粉类，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)西黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡类；(9)油类，例如花生油、棉子油、红花油、麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)乙二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇类，例如甘油、山梨醇和聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原的水；(17)等渗盐水；(18)格林溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；和(21)其它用于药物制剂的无毒相容物质。
例证
实施例1
当作为以脂质为基质的制剂给药时，顺铂iv或ip给药的亚急性毒性降低。将6-7周龄的雄性和雌性ICR小鼠分成24组，每组10只小鼠。每个笼内圈养5只小鼠，它们可自由接近标准鼠食和水。将根据以下方法制备的以脂质为基质的顺铂制剂注射给各组小鼠。此处所用的以脂质为基质的顺铂制剂在0.9％ NaCl溶液中包含1mg/ml顺铂、16mg/ml DPPC和7.9mg/ml胆固醇。冷却到4℃再加温至50℃，如此循环3次处理一份(50％)样品。将试管内的那份样品冷却，并在水浴中加热。透析洗去最终的未被包埋的顺铂(游离顺铂)。通过iv(尾静脉)或ip途径注射脂质体形式的以脂质为基质的顺铂。该脂质体具有约0.39μm的平均粒径。制剂、剂量和给药途径列于表1中。
表1.以脂质为基质的顺铂亚急性毒性研究的剂量和给药途径
| 制剂 | 途径 | 剂量(mg顺铂/kg小鼠) | ||||||
| 以脂质为基质的顺铂 | ip | 23 | 27 | 31 | 35 | 40 | 45 | 50 |
| 顺铂 | ip | 9 | 12 | 15 | 18 | 21 | 24 | 27 |
从给药前一周开始，每两天测量一次小鼠的体重，直至实验结束。每天观察动物并记录死亡情况。计算用各个注射途径进行的各个制剂给药后的存活百分数相对于时间(天)的曲线(图1)。评价各个注射途径下各个制剂的LD10、LD50和LD90。计算机拟合的结果列于表2中。
表2.以脂质为基质的顺铂和顺铂ip和iv注射后的致死性毒性
| 制剂 | 途径 | 致死剂量(mg顺铂/kg小鼠) | ||
| LD10 | LD50 | LD90 | ||
| 以脂质为基质的顺铂 | ip | 22.4 | 29.5 | 38.9 |
| 顺铂 | ip | 9.9 | 14.3 | 20.7 |
结果表明，ip以脂质为基质的顺铂的亚急性毒性比ip顺铂低2倍，然而iv以脂质为基质的顺铂却远没有观察到如此巨大的改变。
实施例2
ip和iv注射以脂质为基质的顺铂和顺铂的动物的药代动力学和器官分布(第I部分)。将小鼠(与实施例1的小鼠相同)分成4组，每组24只。给它们分别ip注射以脂质为基质的顺铂(12mg/kg)、ip注射顺铂(12mg/kg)、iv注射以脂质为基质的顺铂(8mg/kg)和iv注射顺铂(8mg/kg)。用与实施例1相同的方式制备以脂质为基质的顺铂制剂。在各个计划时间点，例如注射后2-5min、20min、40min、2h、8h、1天、2天和3天或5天，ip注射35-50mg/kg戊巴比妥使各组的3只小鼠麻醉，然后取血，切除心、肾脏、肝脏、肺、小肠和脾脏，加入4倍纯水后均质处理。用AA法测量各个样品中的铂浓度。计算Pt的含量(1ml血液或1克组织中的Pt的μg数)，并用于表现在两种不同给药途径下各个制剂的动力学特征。
结果表明，血液中以脂质为基质的顺铂的Cmax和AUC分别高于顺铂3倍和6倍(图2)。
实施例3
ip和iv注射以脂质为基质的顺铂和顺铂的动物的药代动力学和器官分布(第II部分)。将60只ICR小鼠(雌性，7周龄)分成4组。它们分别接受L-CDDP或CDDP的腹膜内或静脉内注射。ip L-CDDP的剂量是12mg/kg，剩余处理组的剂量是8mg/kg。在各个计划时间点，ip注射70mg/kg戊巴比妥使3-4只小鼠麻醉(例如3、20和40min，和2、8、24、48和72h)。从下腔静脉取血。从小鼠切除包括十二指肠、肾脏、肝脏、肺和脾脏在内的器官。在蒸馏水(样品重量的4倍)中均质处理血液和器官样品，并用硝酸消化。用感应耦合等离子体-质谱(ICP-MS)测量各个样品的铂浓度。模拟并计算各个制剂的药代动力学曲线(图3-7，所有Y-轴都是1克组织或液体中μg铂每mg注射剂量的浓度)和参数(表3和4)。发现：1)不论注射途径如何，脾脏内铂的吸收都被脂质体制剂显著增强，AUC和Cmax比CDDP高26～47倍，p＜0.0003；2)通过ip注射，L-CDDP的循环AUC和消除t1/2比CDDP高4倍和15倍(p＜0.006)，但这个现象在iv注射后没有发现；3)ip L-CDDP的AUC和t1/2也比iv L-CDDP高(ip对iv：AUC，1.9倍，p＝0.04；t1/2，5.7倍，p＝0.006)；4)iv L-CDDP的肺和肝脏铂吸收略高于iv CDDP(肺：p＝0.043；肝脏：p＝0.051)；5)L-CDDP的肾脏铂吸收高于CDDP(p＝0.046)。这些结果暗示了制剂和给药途径对于药物的PK和器官分布都起着重要作用，并且ip L-CDDP表现出了持续释放功能。
表3.循环AUC和t1/2
| AUC(h μg/g/μg) | t1/2(h) | |
| ip | ip | |
| L-CDDP | 37.60a | 26.58b |
| CDDP | 7.08 | 1.82 |
ap＝0.008(L-CDDP对CDDP)；bp＝0.006(L-CDDP对CDDP)，通过两侧Log秩和检验(two side Log rank test)。
表4.器官AUC和Cmax
| ip | ||||
| AUC(h μg/g/μg) | Cmax(h μg/g/μg) | |||
| L-CDDP | CDDP | L-CDDP | CDDP | |
| 十二指肠 | 5.49 | 8.32 | 0.30 | 0.45 |
| 肾脏 | 15.60c | 8.61 | 0.46 | 0.46 |
| 肝脏 | 29.99 | 28.99 | 0.71 | 0.71 |
| 肺 | 26.90 | 29.00 | 0.73 | 1.61 |
| 脾脏 | 331.86e | 10.45 | 11.32f | 0.43 |
| 心脏 | 2.63 | 2.67 | 0.07 | 0.18 |
用两侧Log秩和检验评价L-CDDP对CDDP的AUC或Cmax值之间的区别的显著性。用上标标记统计学显著的对子(p＜0.05)。它们的p值如下：c，p＝0.046；d，p＝0.008；e，p＝0.0002；f，p＝0.0001；g，p＝0.0003；h，p＝0.0002。
实施例4
肾脏毒性。将7周龄的雌性ICR小鼠分成4组，每组3到4只小鼠。通过iv或ip给它们注射最大耐受剂量(MTD)的L-CDDP或CDDP。注射后4天，用戊巴比妥ip麻醉小鼠。取血并分离血浆。用比色法以Antech诊断法定量测量血液尿素氮(BUN)。从小鼠切除包括十二指肠、心脏、肾脏、肝脏、肺和脾脏在内的器官，并用10％缓冲福尔马林固定。用对于苏木精-伊红染剂的标准程序处理固定的组织。Memorial Sloan-Kettering Cancer Center的病理学专家Dr.Carman Tornos检查了肾脏组织并对各个肾脏组织样品给出了毒性级别。分级是以肾脏毒性的病理学总论指南为基础的。
病理学结论证明，不论给药途径如何，CDDP在接受治疗的超过50％的小鼠中引起了严重的肾脏毒性，而L-CDDP没有引起任何肾脏毒性。类似的结论也可以从BUN试验中得出(图9)，其中，与正常对照相比，iv CDDP显著增大了BUN水平6.8倍(p＝0.008)，并且ipCDDP引起了较低的BUN蓄积，与正常对照相比，只增大了2.1倍(p＝0.04)，而通过任一途径注射的L-CDDP没有引起BUN水平提高。
实施例5
在鼠L1210肿瘤模型中，以脂质为基质的顺铂的临床前体内抗肿瘤活性。本实验的目的是评价以脂质为基质的顺铂通过局部ip给药对抗被限制在体腔内的肿瘤(腹水L1210白血病)的体内抗肿瘤活性。用L1210肿瘤细胞比较以脂质为基质的顺铂与游离顺铂。检品和材料列于下表5中。用与实施例1相同的方式制备以脂质为基质的顺铂。
表5.检品和材料
| 检品 | 0.9％盐水溶液中的顺铂1.0mg/ml顺铂 |
| 以脂质为基质的顺铂0.82mg/ml顺铂 | |
| 试验动物 | 得自Harlan的B6D2F1/Hsd杂交小鼠除了对照组(9只雄性)以外，5只雄性/组，7组 |
| 肿瘤细胞 | 活的L1210肿瘤细胞，每只小鼠一百万个，体内移植 |
过程列在下面，并总结在表6中：
1.第0天，通过ip注射，接种5只雄性小鼠的6个组和9只雄性对照小鼠的1个组，一百万个L1210活细胞每只小鼠。
2.给5只动物的组施用增大剂量的顺铂溶液或以脂质为基质的顺铂。顺铂剂量：在第3、7和11天以3.0和4.5mg/Kg的剂量ip。各个剂量水平代表5只小鼠的一个组。以脂质为基质的顺铂：在第3、7和11天以3.0、4.5、6.0和9.0mg/Kg的剂量ip。对照组包含9只未处理的小鼠。
3.每天监测小鼠的死亡情况和/或临床生病情况。为了实验终点的目的，记录安乐死的日期。研究被分成7组的总共39只小鼠。终点时评价存活率，并表示成％T/C(治疗组的生存中值∶对照组的生存中值的百分数)。
表6.过程参数
| 组 | 小鼠 | 试验药物 | ip剂量 | 第0天 | 第3天 | 第7天 | 第11天 |
| 1 | 9只雄性 | 未处理 | 对照 | 接种 | |||
| 2 | 5只雄性 | 游离顺铂 | 3mg/kg | 接种 | 1mg/kg | 1mg/kg | 1mg/kg |
| 3 | 5只雄性 | 游离顺铂 | 4.5mg/kg | 接种 | 1.5mg/kg | 1.5mg/kg | 1.5mg/kg |
| 4 | 5只雄性 | 以脂质为基质的顺铂 | 3mg/kg | 接种 | 1mg/kg | 1mg/kg | 1mg/kg |
| 5 | 5只雄性 | 以脂质为基质的顺铂 | 4.5mg/kg | 接种 | 1.5mg/kg | 1.5mg/kg | 1.5mg/kg |
| 6 | 5只雄性 | 以脂质为基质的顺铂 | 6mg/kg | 接种 | 2mg/kg | 2mg/kg | 2mg/kg |
| 7 | 5只雄性 | 以脂质为基质的顺铂 | 9mg/kg | 接种 | 3mg/kg | 3mg/kg | 3mg/kg |
实验结果总结在表7中。
表7.以％T/C测量出的存活数据
| 组 | 试验药物 | 剂量 | 生存中值* | ％T/C |
| 1 | 未处理 | 对照 | 13.5 | 100 |
| 2 | 游离顺铂 | 3mg/kg | 26.5 | 196 |
| 3 | 游离顺铂 | 4.5mg/kg | 29.5 | 218 |
| 4 | 以脂质为基质的顺铂 | 3mg/kg | 19.5 | 144 |
| 5 | 以脂质为基质的顺铂 | 4.5mg/kg | 23.5 | 174 |
| 6 | 以脂质为基质的顺铂 | 6mg/kg | 25.5 | 189 |
| 7 | 以脂质为基质的顺铂 | 9mg/kg | 25.5 | 189 |
*生存中值被定义为各组的50％小鼠的死亡天数
测定各组内50％小鼠的死亡天数，将最初的％处理/对照(T/C)值记录在上表中。相对于游离顺铂，最佳剂量的以脂质为基质的顺铂中的顺铂没有损失任何抗肿瘤活性。
实施例6
L-CDDP对抗人卵巢癌异种移植物的抗肿瘤活性。用人卵巢癌细胞系SK-OV3-ip 1(1.5×106细胞/小鼠)腹膜内接种6-7周龄的雌性裸鼠。接种后一周，将小鼠随机分成3组，每组5只小鼠。以MTD(9mg/kg)快速推注ip注射给予一组小鼠CDDP，以模拟目前通用的化疗(阳性对照)。以MTD(23mg/kg)快速推注ip注射给予另一组L-CDDP。未经处理的第三组小鼠用作阴性对照。以每天为基础观察小鼠。记录小鼠的死亡情况，并计算延长的寿命(ILS)。结果表示在图10中。
实施例7
比较以循环温度渗析法制备的以脂质为基质的顺铂和非循环温度顺铂脂质体。和实施例1一样，制备以循环温度渗析法制备的以脂质为基质的顺铂，它包含1.1mg/ml顺铂和27mg/ml总脂质。根据下列方法制备非循环温度顺铂脂质体。
1.将DPPC(3.0g)和胆固醇(1.2g)一起溶于20mL乙醇。
2.将顺铂(200mg)溶于0.9％盐水(200ml)。
3.将脂质/乙醇溶液注入顺铂溶液中，同时适当搅拌该溶液(脂质体形成)。
4.透析脂质-顺铂混悬液，以洗去未包埋的顺铂。
5.所得的脂质体顺铂包含0.03mg/ml总顺铂(总顺铂的75％被包埋，25％未被包埋)；总脂质浓度是21mg/ml。
给予小鼠等量的含顺铂的治疗剂，以脂质的量为基础，而不是以顺铂的量为基础。这是必需的，因为在非循环温度顺铂脂质体中，脂质对顺铂的比例非常高，以至于不可能施用与按照实施例1制备的以脂质为基质的制剂中顺铂的量相等的如此多的脂质。
使用雌性DBA/2小鼠(Charles Rivers)。在第0天，用2×106个L1210细胞ip注射30只小鼠。在第1天，小鼠称重并随机分成10只小鼠的3个组。在第5天，小鼠接受快速推注腹膜内注射可溶性顺铂(6mg/kg)、以脂质为基质的顺铂(6mg/kg，ip)或非循环温度顺铂脂质体(与以脂质为基质的顺铂脂质相等，0.2mg/kg)。监测存活率。在第10天后每天称量小鼠重量。通过CO2吸入使起始体重减少了20％或更多的小鼠安乐死。它们的死亡日期记录在数据表格中。用PrismGraphPad计算生存中值。
两种类型的顺铂制剂都腹膜内给予植入了L1210活肿瘤细胞的小鼠，该实验结果描述在图11中。腹膜内接受以脂质为基质的顺铂的小鼠和腹膜内接受可溶性顺铂的小鼠的存活曲线之间没有区别(p＝0.20)。顺铂-处理组的所有存活曲线都显著区别于接受非循环温度顺铂脂质体的小鼠(分别是p＝0.0035和p＜0.0001)。对于以脂质为基质的顺铂ip来说，生存中值的天数是19天；对于游离顺铂ip来说是19.5天；对于非循环温度顺铂脂质体ip来说是14天。
参考文献的引入
本文引用的所有专利和公开出版物都由此引入作为参考。
等价方案
本领域技术人员将会认识到，或者只使用常规实验就能够确定，本文所述的发明的具体实施方案的很多等价方案。这些等价方案打算被下列权利要求所包括。
Claims (20)
1.治疗患者癌症的方法，所述方法包括腹膜内给予患者癌症治疗有效量的以脂质为基质的铂化合物制剂。
2.权利要求1的方法，其中以脂质为基质的铂化合物制剂中的铂化合物以1mg/ml的浓度给予。
3.权利要求1的方法，其中所述铂化合物选自：顺铂、卡铂(二氨(1，1-环丁烷二羧酸)-铂(II))、四铂(奥马铂)(四氯化(1，2-环己二胺-N，N’-铂(IV))、thioplatin(二(O-乙基二硫代碳酸)铂(II))、沙铂、奈达铂、奥沙利铂、heptaplatin、异丙铂、transplatin、洛铂、顺式-胺二氯(2-甲基吡啶)铂、JM118(顺式-胺二氯(环己胺)铂(II))、JM149(顺式-胺二氯(环己胺)-反式-二羟基铂(IV))、JM216(二-醋酸-顺式-胺二氯(环己胺)铂(IV))、JM335(反式-胺二氯(环己胺)二羟基铂(IV))和(反式，反式，反式)二-mu-(己烷-1，6-二胺)-mu-[二胺-铂(II)]二[二胺(氯)铂(II)]四氯化物和其混合物。
4.权利要求1的方法，其中，铂化合物是顺铂。
5.权利要求1的方法，其中，脂质由选自下组的成员组成：卵磷脂酰胆碱(EPC)、卵磷脂酰甘油(EPG)、卵磷脂酰肌醇(EPI)、卵磷脂酰丝氨酸(EPS)、磷脂酰乙醇胺(EPE)、磷脂酸(EPA)、大豆卵磷脂(SPC)、大豆磷脂酰甘油(SPG)、大豆磷脂酰丝氨酸(SPS)、大豆磷脂酰肌醇(SPI)、大豆磷脂酰乙醇胺(SPE)、大豆磷脂酸(SPA)、氢化卵磷脂酰胆碱(HEPC)、氢化卵磷脂酰甘油(HEPG)、氢化卵磷脂酰肌醇(HEPI)、氢化卵磷脂酰丝氨酸(HEPS)、氢化磷脂酰乙醇胺(HEPE)、氢化磷脂酸(HEPA)、氢化大豆卵磷脂(HSPC)、氢化大豆磷脂酰甘油(HSPG)、氢化大豆磷脂酰丝氨酸(HSPS)、氢化大豆磷脂酰肌醇(HSPI)、氢化大豆磷脂酰乙醇胺(HSPE)、氢化大豆磷脂酸(HSPA)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷酯酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷酯酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC)、棕榈酰硬脂酰磷脂酰甘油(PSPG)、单-油酰-磷脂酰乙醇胺(MOPE)、胆固醇、麦角固醇、羊毛甾醇、生育酚、脂肪酸铵盐、磷脂的铵盐、甘油酯的铵盐、肉豆蔻酰胺、棕榈酰胺、月桂酰胺、硬脂酰胺、二月桂酰乙基磷酸胆碱(DLEP)、二肉豆蔻酰乙基磷酸胆碱(DMEP)、二棕榈酰乙基磷酸胆碱(DPEP)和二硬脂酰乙基磷酸胆碱(DSEP)、N-(2，3-二-(9-(Z)-十八烯基氧基)-丙-1-基-N，N，N-三甲基铵氯化物(DOTMA)、1，2-二(油酰氧)-3-(三甲基铵基)丙烷(DOTAP)、磷脂酰甘油(PGs)、磷脂酸(PAs)、磷脂酰肌醇(PIs)、磷脂酰丝氨酸(PSs)、二硬脂酰磷酯酰甘油(DSPG)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇(DMPI)、二棕榈酰磷脂酰肌醇(DPPI)、二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPI)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)和其混合物。
6.权利要求1的方法，其中，脂质是磷脂和甾醇的混合物。
7.权利要求1的方法，其中，脂质是DPPC和胆固醇的混合物。
8.权利要求1的方法，其中，脂质是50到65mol％的DPPC和35到50mol％的胆固醇的混合物。
9.权利要求1的方法，其中，癌症选自：黑素瘤，睾丸癌(生殖细胞)，骨肉瘤，软组织肉瘤，甲状腺癌，结肠癌，卵巢癌，肾脏癌症，乳腺癌，结肠直肠癌，前列腺癌，膀胱癌，子宫癌，肺癌，胃癌，肝脏癌，子宫内膜癌，或头颈部鳞状细胞癌。
10.权利要求1的方法，其中，癌症是卵巢癌。
11.权利要求1的方法，其中，癌症是结肠癌。
12.权利要求1的方法，其中，以脂质为基质的铂化合物制剂中铂化合物与脂质的重量比为1∶5到1∶50。
13.权利要求1的方法，其中，以脂质为基质的铂化合物制剂包含平均直径为0.01到3.0微米的脂质体。
14.权利要求1的方法，其中，脂质是DPPC和胆固醇的混合物，以脂质为基质的铂化合物制剂中的铂化合物与脂质的重量比为1∶5到1∶50，且其中以脂质为基质的铂化合物制剂包含平均直径为0.01微米到3.0微米的脂质体。
15.权利要求1的方法，其中，脂质是DPPC和胆固醇的混合物，以脂质为基质的铂化合物制剂中的铂化合物与脂质的重量比为1∶5到1∶50，以脂质为基质的铂化合物制剂包含直径为0.01微米到3.0微米的脂质体，且其中铂化合物是顺铂。
16.权利要求1的方法，其中，脂质是重量比为2∶1的DPPC和胆固醇的混合物，以脂质为基质的铂化合物制剂中的铂化合物与脂质的重量比为约1∶20，以脂质为基质的铂化合物制剂包含直径为约0.40微米的脂质体，且其中铂化合物是顺铂。
17.权利要求1的方法，其中，患者是人。
18.权利要求1的方法，其中，以脂质为基质的铂化合物制剂至少每3周给予患者1次。
19.权利要求1的方法，其中，以脂质为基质的铂化合物制剂中铂化合物的量为60mg/m2或更多，100mg/m2或更多，140mg/m2或更多，或180mg/m2或更多。
20.权利要求1的方法，其中，以脂质为基质的铂化合物制剂中铂化合物的量为100mg/m2或更多，且以脂质为基质的铂化合物制剂至少每3周给予患者1次。
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