CN101048661A - 蛋白质微阵列 - Google Patents

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Abstract

通过适当涂布最初用有机官能团衍生的基底表面来制造有最小蛋白质背景结合的微阵列的方法。施加的蛋白质抗性聚合涂层具有通过多官能异氰酸酯部分交联至实质性程度的亲水骨架聚合物。含有捕获剂的三维水凝胶微斑点被添加到表面阵列区域上分离的空间位置以形成微阵列。微斑点被添加到基底或涂层上。聚合涂层优选含有与多官能异氰酸酯交联的异氰酸酯加帽的PEG以形成氨基甲酸酯聚合物。

Description

蛋白质微阵列
本发明涉及用于分析的微阵列产品，更具体是涉及各种类型蛋白质的微阵列产品。
发明背景
大约过去十年内，微阵列技术已经发展成广泛用于包括分子生物学、微生物学和其它生物技术在内的各种研究领域的重要工具。迄今，该领域的许多工作聚焦于使用DNA阵列或其它类型的核酸阵列，其中，许多斑点(即微斑点(microspot))被置于通常是玻璃载玻片或其它类型“芯片”的固体表面。美国专利No.5,143,854传授了将蛋白质以阵列形式的离散斑点粘附到玻璃板上并提到可以从蛋白质扩展到形成固定有细胞的微阵列。在玻璃载玻片或其它芯片上形成活细胞微阵列的概念也可见于美国专利No.6,548,263(2003/4/15)，该专利传授了使用首先用氨基硅烷处理以形成具有反应性氨基的亲水表面的玻璃薄片(wafer)等，这一概念现在是本领域熟知的。已经开始开发用于蛋白质分析的更加专门的阵列，该阵列同时关注粘附和展示作为微阵列一部分的蛋白质和用DNA阵列分析DNA/蛋白质相互作用。
除了在这种蛋白质微阵列中简单使用平板基底外，还开发了使用水凝胶等的三维(3D)微斑点以便更好地结合和呈递作为这种微阵列一部分的蛋白质。公开的国际申请WO02/059372(2002/08/01)显示了一种生物芯片，该芯片具有多个微斑点，所述微斑点附于芯片上表面，为光学透明水凝胶单元形式。这些聚合水凝胶微斑点可用来结合相互作用的蛋白质，或者可结合随后将与加入溶液中的蛋白质或肽反应和/或结合的捕获剂或探针。例如，可将抗原结合到表面以便结合抗体，或者反之亦然。
蛋白质、碳水化合物、细胞溶解产物等与微阵列(其表面带有含蛋白质捕获剂等的微斑点)所用玻璃或其它基底的背景结合造成问题已经多年了。当对微阵列成像或通过其它方式阅读微斑点上生成的信号时，蛋白质与微阵列基底的非特异性结合增加了背景噪声。由于这种背景噪声会干扰和防止获得精确读数，因此难以检测和区分从应特异性结合特定斑点的标记获得的信号，尤其是当信号相对较弱时。
迄今，用来减轻或缓解该问题的众多常用方法中的两种涉及封闭多个微斑点各自周围基底表面的区域的方式。一种封闭方法是化学涂布基底表面，例如，通过与氨基发生化学反应，玻璃表面籍此通常通过与琥珀酸酐反应而被衍生。第二种方法是使小分子粘附到玻璃表面，例如，BSA、tRNA、脱脂乳固体、酪蛋白等。多种这些封闭方法描述于美国专利公开No.2003/0044823，该文献提议，使用“扩散增强剂溶液”估计对采用核酸探针的测定有效。
为防止蛋白质与3D微斑点周围区域表面非特异性结合从而降低背景信号，上述国际出版物提议，使用在将共价结合到氨基的一端具有反应性部分(如异氰酸酯)的单官能聚乙二醇(mPEG)聚合物来涂布未被水凝胶微斑点占据的这种芯片的表面区域或者平板内的孔。美国专利No.5，672,662(Shearwater Polymers)提到用于此用途的PEG-SPA可用于制造涂布的基底，以用于涉及蛋白质的测定。该专利报道，通过使5％(w/v)的甲氧基-PEG-SPA(MW 5000)溶液在0.05M碳酸氢钠(pH8.3)中于40℃反应4小时来将其移植到氨基功能化的玻璃载玻片上。如此固定PEG之后用甲苯冲洗表面，真空干燥并用水冲洗。据报道，随后用血纤蛋白原进行的吸附研究显示，吸附到PEG涂布表面的血纤蛋白原大大减少。Shearwater Polymers，Inc.的美国专利No.5,932,462公开了多种此类单官能PEG(包括分支的单官能PEG)的制造方法，并指出它们可通过避免蛋白质吸附而防止表面污染，从而产生了可用于与血液有关的操作的生物材料。
在‘263专利中进行了微图式(micropatterning)反应，其中，光不稳定性保护基或者可通过化学方法除去的保护基首先被施加到表面。微图式之后，加入疏水物质如脂肪酸，使其与未保护的氨基反应，并使这些表面区域不与细胞和蛋白质反应。随后通过除去保护材料和施加细胞粘附材料来活化图式中需要粘附微斑点的位置。或者，据教导可将双官能分子施加在含有反应性羟基的整个表面；然后用机械模板来掩蔽随后需要粘附细胞的区域，同时施加甲苯基氯(tresyl chloride)活化的聚乙二醇(PEG)，使其与作为细胞排斥部分的剩余区域内的双官能分子反应。
在这些专利中提到，各种标记可用于这种测定技术以提供需要阅读或成像的信号，所述信号如荧光发射、光密度或放射性。荧光成像技术由于发展最快而最常见，现在的许多发展涉及改进平板上或多孔板上的这种微阵列的荧光测量。
已知当制造要和荧光标记一起使用的微阵列时，为增强粘附到微斑点所携带探针上的标记配体的荧光信号，使用镜像基底是有利的。如美国公开申请No.2003/001310(2003/01/16)所述，可用反光金属(例如铝)层涂布玻璃载玻片等，然后再用绝缘材料(如二氧化硅或氧化铝)层涂布，然后再用有机表面层如氨基修饰的硅烷使该层官能化。其中提到，可通过商业途径获得这种涂布的玻璃载玻片以用于制造微阵列以形成阵列，并提到可用适配器(adapter)(如蛋白质结合剂，例如抗生物素蛋白、A蛋白和双官能化学接头)来粘附捕获剂。还教导，在将阵列元件点到基底上之后，其剩余的未涂布表面应用显示出亲水末端的分子封闭以防止随后的非特异性结合。公开了各种封闭剂，其中包括半胱氨酸和BSA以及聚合封闭剂，如在至少一个末端被修饰以结合衍生的基底表面的PEG类似物，例如分子量约为3400-5000的二硫酚修饰的PEG。提到的其它化学封闭剂是用亲水侧链衍生的N-取代的甘氨酸的寡聚物。
尽管这些解决非特异性蛋白质结合的已有努力已经显示出一些希望，但结果不完全令人满意，因此需要考虑解决该问题的其它方法。
发明概述
我们现在发现，将具有多官能亲水骨架的聚合物移植到基底表面从而涂布该表面，并通过连接到多官能异氰酸酯分子使这种聚合物实质性交联，可以产生非常有效的蛋白质抗性微阵列基底表面。与Shearwater Polymers，Inc.出售的并用于消除背景噪音目的的单官能和双官能PEG相比，这种涂层将具有改进的消除背景噪音的性能。
在一具体方面，本发明提供了一种微阵列，其包括：具有(a)经衍生以携带有机官能团的平坦的不可渗透的上表面的基底，(b)在所述表面的阵列区域的离散空间位置上的多个三维(3D)微斑点，所述微斑点含有有机捕获剂或者适合直接或间接连接有机捕获剂，和(c)覆盖微斑点周围阵列区域表面的蛋白质抗性聚合涂层，聚合涂层是多官能的，含有亲水骨架聚合物，所述聚合物经多官能异氰酸酯分子交联至实质性程度，所述多官能涂层通过异氰酸酯连接共价结合所述表面的所述有机官能团，提供游离异氰酸酯基团(being covalently bound to said organic functiaonal groups on saidsurface via isocyanate linking and providing free isocyanate groups)。
在另一具体方面，本发明提供了一种制造使背景结合最小化的微阵列的方法，该方法包括：提供具有用有机官能团衍生的平坦的不可渗透的上表面的基底；施加蛋白质抗性涂层，通过使该蛋白质抗性涂层共价结合到所述有机官能团来覆盖所述表面的至少一个测定区域，聚合涂层是多官能的，含有亲水骨架聚合物，所述骨架聚合物经多官能异氰酸酯分子交联到实质性程度；固化所述涂层；在所述表面的所述阵列区域内的离散空间位置附加多个三维水凝胶斑点；和将感兴趣的不同有机捕获剂连接到所述不同三维斑点上。
优选实施方案详述
使用酶、抗体、肽或其它生物活性分子如适体在产生生物测定和蛋白质组学领域的筛选工具中日益受到关注，同时最近更加重视在微阵列中使用用于这些生物活性材料的三维水凝胶支持物。水凝胶是含水聚合基质。具体地说，水凝胶为生物材料提供了更加接近细胞天然含水环境的支持物，这与当用一些其它分子尺度(molecularscale)的键合基将蛋白质或其它此类材料直接附加到固体支持物表面时导致的更加变性的环境不同。据信，本发明特别适合制造由众多以矩阵形式均匀排列在固体基底上的三维(3D)水凝胶材料微斑点形成的微阵列。然而，这里所述的用来提供在三维微斑点周围有蛋白质抗性区域的微阵列的钝化方法也可有利地用于有机探针或其它部分被直接或通过短接头附加到基底的官能化表面的二维微阵列。
用于实现本发明特征的微阵列的固体支持物或基底可根据产品的所需用途而改变。固体支持物可以是任何与阵列要用于的分析方法兼容的合适材料，但优选不可渗透的刚性材料。合适的材料包括玻璃如石英玻璃，和硅，以及聚合物，例如聚氯乙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚碳酸酯和它们的共聚物，例如氯乙烯/丙烯的聚合物、氯乙烯/乙酸乙烯酯的聚合物、苯乙烯共聚物等。也可采用金属和金属涂层，如金、铂、银、铜、铝、钛和铬以及它们的合金。
基底通常是两层或多层不同材料层的复合物，即，如上所述具有一层或多层表面涂层的基底。例如，可在玻璃基底上涂布一层反射金属层，例如金、铝或钛，然后在该金属层上先用二氧化硅涂布，再在其上表面用有机基团如氨基修饰或硫醇修饰的硅烷官能化。
尽管固体基底根据其用途可以有不同形状和尺寸，但通常使用具有至少一个基本平坦的表面的平板，例如成长方形的载玻片或平板。使用通常平坦的长方形载玻片，其长度和宽度约为1-40厘米；平板的尺寸通常不超过约30厘米，更通常约为20厘米或更小。支持物的厚度通常约为0.01-10毫米，这部分取决于构成基底的材料以便确保所需刚性。通常使用标准的显微镜载玻片的尺寸，即约为2.54厘米×7.62厘米，厚约1-2毫米。
一个例子是，可在玻璃载玻片上涂布反射铝层，再在其上涂布厚度约为500-2,000的二氧化硅或一氧化硅层，一般说来，该厚度对应于许多比色标记产生的发射或激发光的波长的1/4。在氧化物表面涂布一层氨基烷基三烷氧基硅烷，如氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)、三氯硅烷、三甲氧基硅烷或任何其它合适的三烷氧基硅烷；也可使用其它合适的氨基硅烷。该硅烷层的厚度约为3-100，更优选约为5-50，最优选约为7-20。一个合适的例子是厚约7的APS层。这些氨基修饰的表面被用于直接附加改进的蛋白质抗性涂层和/或三维微斑点。
尽管这样使用三维微斑点是优选的，但用于阵列的用来连接有机探针或其它捕获部分的结合剂也可以：(1)直接附加到基底的无机固体表面，或(2)采用官能化的顶部有机层附加。例如，当基底如玻璃的表面涂布有金属(如铝、金或钛)薄层时，可将结合剂直接结合于金属基底表面而无需将其官能化。例如，可用硫醇锚定基团来直接结合金属(例如，金)而无需插入官能化的层；然而优选使用官能化的有机层，如上述氨基修饰的烷基硅烷(氨基硅烷)。当使用这种官能化的有机层时，该层有机分子的末端提供了可在其上稳定地连接结合剂或水凝胶等的反应性基团。合适的末端基团是本领域熟知的，且优选用于将三维微斑点附加于基底的上表面。
如先前所述，据信，当用于制造蛋白质或细胞芯片，特别是利用三维微斑点的微阵列时，本发明将具有明显的优点。用于形成这种微阵列水凝胶微斑点的异氰酸酯官能化预聚物通常是从与双官能或多官能异氰酸酯化合物反应的聚氧化烯二醇或多元醇制备的。优选的预聚物是从分子量相对较低的聚氧化烯二醇或多元醇制备的，包括环氧乙烷单元的均聚物或含有环氧乙烷单元和氧化丙烯或氧化丁烯单元的混合物的嵌段或随机共聚物。若是这种嵌段或随机共聚物，至少75％的单元优选是环氧乙烷单元。这种聚氧化烯二醇或多元醇的分子量优选约500-10,000道尔顿，更优选约1,000-6,000道尔顿。合适的预聚物可将所选聚氧化烯二醇或多元醇与聚异氰酸酯反应制备，异氰酸酯与羟基的比例约为1.2-2.2，这样可使几乎所有的羟基被聚异氰酸酯加帽。通常优选聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)或其共聚物。所用异氰酸酯官能化预聚物优选含有一定量的活性异氰酸酯，所述含量约为0.1-2meq/g，更优选约为0.2-1.5meq/g。也可使用分子量特别低的预聚物，例如小于2,000道尔顿，此时它们优选具有相对高的异氰酸酯含量(约1meq/g或更高)。
这种常规类型预聚物固有的反应性有助于聚合物在聚合期间迅速共价结合到化学官能化的基底上。优选在用于制造微阵列的基底上提供这种用有机官能团衍生的表面，它们有助于聚合的水凝胶微斑点以已知模式附加到这种基底上，以及有助于蛋白质抗性涂层的周围区域的添加。
如上所述，Shearwater Polymers，Inc.销售的单官能PEG包括多种可用于将PEG偶联到伯胺以便不造成表面污染的末端修饰的PEG；这些包含修饰剂如N-羟基琥珀酰亚胺基活性酯(NHS)、缩水甘油醚(“环氧化物”)和异氰酸酯(NCO)。这些修饰的PEG可从市场上购得，有各种大小；例如，mPEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯-NHS(mPEG-SPA-NHS)以2K、5K和20K三种大小在销售。PEG-NHS、PEG-环氧化物、PEG-NPC可在水性溶剂中使用。PEG-NCO可在以三乙胺作为碱性催化剂的有机溶剂中使用(NCO与水反应)。
体现本发明特征的蛋白质抗性聚合涂层可在附加到水凝胶材料三维微斑点之前或之后施加到微阵列的基底表面。下面描述了各种制造顺序。官能化表面的有机基团优选用来使蛋白质抗性涂层固定到基底上。
当在特定测定中研究蛋白质时，如果基本上是非特异性结合，则所存在的将在互补探针所位于的微阵列特定位置上结合的该蛋白质的量被减少；因此测定的整体灵敏度降低。这种聚合涂层能有效消除许多可能非特异性结合并对成荧光信号或其它比色信号的成像产生不需要的背景(被称为背景噪声)的蛋白质的这种非特异性结合问题。已知信号背景比的任何降低都会妨碍成像/分析软件。
蛋白质抗性聚合涂层被设计成与官能化基底表面的有机基团共价结合；它具有优选通过氨基甲酸酯(urethane)或脲键交联至实质性程度的亲水骨架聚合物。可使用各种合适的聚烯烃醚骨架聚合物，包括PEG、PPG及其共聚物。优选的是用异氰酸酯修饰的PEG(或其PPG共聚物)，这样将易于与官能化基底表面的有机基团反应和共价结合。如上所述，连接于表面的有机基团可以是本领域已知的任何基团，如羟基、氨基、硫醇或马来酰亚胺，并因此选择衍生的亲水聚合物分子，以实现共价结合。优选用将与各种可用来衍生基底的有用的有机基团共价反应的异氰酸酯修饰PEG末端。以溶液形式施加涂层材料，并使其在适合与微斑点周围区域基底官能化表面上几乎所有氨基交联和共价结合的时间和其它条件下反应，该过程在这里被称为固化。涂层也可被施加到整个阵列区域，或者可在附加3D微斑点之前以环绕在将要放置3D微斑点的位置周围的图案(pattern)施加。这些异氰酸酯修饰的分子与已经用氨基硅烷等衍生的表面上的氨基形成强脲键。
当PEG骨架聚合物被用于涂层时，可使用任何合适的有机聚异氰酸酯(如脂族、脂环族、芳脂族(araliphatic)或芳族聚异氰酸酯)中的单独一种或者两种或多种混合物来衍生这些分子；优选芳族和脂族异氰酸酯。相比脂族异氰酸酯化合物，芳族异氰酸酯化合物通常更加经济且可与羟基反应，因此通常更加优选。合适的芳族异氰酸酯化合物包括：2，4-甲苯二异氰酸酯(TDI)、2，6-甲苯二异氰酸酯(存在于市售TDI中)、TDI和三羟甲基丙烷的加合物(购自Bayer公司(Pittsburgh，Pa.)，名为DESMODURCB)、TDI的异氰脲酸酯三聚体(购自Bayer，名为DESMODUR IL)、二苯基甲烷4，4’-二异氰酸酯(MDI)、二苯基甲烷2，4’-二异氰酸酯、1，5-二异氰酸根合-萘、1，4-亚苯基二异氰酸酯、1，3-亚苯基二异氰酸酯、1-甲氧基-2，4-亚苯基二异氰酸酯、1-氯苯基-2，4-二异氰酸酯以及它们的混合物。在芳族异氰酸酯中特别优选TDI和MDI。
有用的脂环族异氰酸酯化合物的例子包括以下这些：二环己基甲烷二异氰酸酯(购自Bayer，名为DESMODUR W)、4，4’-异丙基-双(环己基异氰酸酯)、异氟尔酮二异氰酸酯(IPDI)、环丁烷-1，3-二异氰酸酯、环己烷1，3-二异氰酸酯、环己烷1，4-二异氰酸酯(CHDI)、1，4-环己烷二(亚甲基异氰酸酯)(BDI)、1，3-二(异氰酸甲酯基)环己烷3-异氰酸甲酯基-3，5，5-三甲基环己基异氰酸酯，以及它们的混合物。
有用的脂族异氰酸酯化合物的例子包括：1，4-四亚甲基二异氰酸酯、六亚甲基(hexamethylene)1，4-二异氰酸酯、六亚甲基1，6-二异氰酸酯(HDI)、1，12-十二烷基二异氰酸酯、2，2，4-三甲基-六亚甲基二异氰酸酯或2，4，4-三甲基-六亚甲基二异氰酸酯(TMDI)、2-甲基-1，5-五亚甲基(pentamethylene)二异氰酸酯、二异氰酸酯二聚体、六亚甲基二异氰酸酯的脲、六亚甲基1，6-二异氰酸酯(HDI)的缩二脲(购自Bayer，名为DESMODUR-100和-3200)、HDI的异氰脲酸酯(购自Bayer，名为DESMODUR-3300和-3600)、HDI的异氰脲酸酯和HDI的uretdione(购自Bayer，名为DESMODUR-3400)的混合物，以及它们的混合物。
有用的芳脂族包括间-四甲基亚二甲苯基二异氰酸酯(m-TMXDI)、对-四甲基亚二甲苯基二异氰酸酯(p-TMXDI)、1，4-亚二甲苯基二异氰酸酯(XDI)、1，3-亚二甲苯基二异氰酸酯、对-(1-异氰酸根合乙基)-苯基异氰酸酯、间-(3-异氰酸根合丁基)-苯基异氰酸酯、4-(2-异氰酸根合环己基-甲基)-苯基异氰酸酯，以及它们的混合物。
出于本申请的目的，多官能是指3个或多个官能团，而聚异氰酸酯用来指2个或多个官能团。合适的三异氰酸酯可将3摩尔二异氰酸酯与1摩尔三元醇反应获得。例如，甲苯二异氰酸酯、3-异氰酸甲酯基-3，4，4-三甲基环己基异氰酸酯或间-四甲基二甲苯二异氰酸酯可与1，1，1-三(羟甲基)丙烷反应形成三异氰酸酯。与间-四甲基二甲苯二异氰酸酯反应得到的这种产品可以商品名CYTHANE 3160购得(AmericanCyanamid，Stamford，Conn.)。
如上所述，需要施加的聚合蛋白质抗性涂层交联至实质性程度。交联至实质性程度是指在至少约2.5％的骨架聚合物和优选至少约5％的多官能异氰酸酯分子(因此能够连接至少3个不同的骨架聚合物)之间发生交联；更优选至少约10％、最优选至少约20％的多官能分子具有这种三键。当骨架分子是聚氧化烯二醇或多元醇或其它此类聚醚时，可将它们作为被上述双官能或三官能异氰酸酯衍生的聚氨酯(polyurethane)预聚物施加。它们的交联或固化可与有机部分共价结合到基底表面同时完成，如通过采用这种预聚物作为水溶液的一部分；或者，如本领域所熟知的，所述交联反应可被催化。
所施加的聚合涂层没有真实的显著厚度，它实质上可以是单分子层。通常，它至少为约3分子层的厚度，且通常该厚度不会超过约0.1微米。然而，当首先用蛋白质抗性涂层涂布基底的整个阵列区域时，需要选择和调节涂层的特征以提供足量的3D微斑点随后可强烈结合的反应性基团。此时，当微斑点是由异氰酸酯加帽的聚氨酯形成的水凝胶时，其中约50％或更多的聚异氰酸酯分子具有至少1个未反应的异氰酸酯部分的蛋白质抗性涂层能够为随后附加这种3D微斑点提供足够的平台。
总之，本发明提供了各种制造具有这些蛋白质抗性表面的微阵列的顺序或方法。作为这种微阵列的一个实施方案，采用市售玻璃载玻片，其上具有反射铝层并再用二氧化硅层涂布，然后用氨基硅烷涂布以提供官能化氨基。载玻片可购自ErieScientific Company和TeleChem International，Inc。
以下实施例阐述了蛋白质芯片的一些应用。当然应该理解，这些抗原-抗体相互作用(以及这里提到的其它相互作用)的例子只是为了说明工作实施例而不是要限制本发明，本发明的由附带的权利要求所限定。
实施例1.当已经存在微斑点时施加涂层以阻止非特异性结合和降低载玻片的背景噪声
本试验采用水凝胶平台作为基质以锚定其中的抗体。抗体-抗原相互作用通常被用于各种生物测定，锚定任一组分(抗体或抗原)的能力是基质抗原所必需的特征，是形成这种微阵列的基质所必需的特征。当含有所需捕获剂的微斑点到位时再施加聚合蛋白质抗性涂层。
在终体积50μl的水凝胶制剂中加入海藻糖储备溶液，即50％w/v D(+)海藻糖二水合物的50mM硼酸钠缓冲水溶液，pH8.0。所述水凝胶制剂包含终浓度为3.5重量％的HYPOL PreMAG-50水凝胶预聚物(含有w/w/w比分别为1∶3∶3的HYPOL、乙腈和甲基-2-吡咯烷酮的预混合的储备溶液)、抗-运铁蛋白(4mg/ml磷酸缓冲盐水1X(PBS)、2μl牛IgG(50/mg/ml，用PBS和1.25％甘油配制)。加入海藻糖以提供最终约5w/v％的海藻糖。还包括不含蛋白质的空白3D水凝胶斑点。
用排针(multiple pin)将多个测试溶液微滴和多个空白水凝胶微滴点到氨基硅烷涂布的玻璃载玻片上。被捕获的测试蛋白质是抗-运铁蛋白，并使水凝胶制剂在约19℃和94-95％RH下充分固化至少约180分钟。
在合适的溶剂即乙腈中制备含0.05％MDI衍生的PEG三元醇的溶液。PEG骨架的分子量约10,000分子量单位(道尔顿)。在20ml乙腈/PEG中加入20μL三乙胺(TEA)作为碱性催化剂。不要使蛋白质水凝胶微斑点干燥，将载玻片浸入PEG/乙腈/TEA溶液约10秒，然后在干净的乙腈中冲洗10秒，再用pH7.4的1xPBS冲洗。
将该系统与Cy3荧光染料标记的运铁蛋白(Amersham，约0.1μg/ml，用含0.1％Triton X100(PBST)和1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS配制)一起在45℃孵育，同时周期性振荡。孵育后载玻片用PBST洗涤两次，每次10分钟，然后用ScanArray Lite载玻片扫描仪成像。空白水凝胶斑点显示无可检测信号，而海藻糖-抗体斑点有强烈信号。Cy3标记的运铁蛋白特异性结合水凝胶微斑点内的它的天然配体，而对水凝胶自身或对玻璃基底几乎没有可检测的结合活性。微斑点周围的载玻片区域没有显著信号说明，这种涂层可有效防止蛋白质非特异性结合基底，同时不会妨碍在3D微斑点内获得复合物。
实施例2.预先施加的涂层的使用
如上一实施例所述，抗体-抗原反应通常被用于生物测定。在本实施例中，涂层是预先施加的，且与锚定抗体不同，抗原被锚定在3D水凝胶基质内。
在合适的溶剂即乙腈中制备1％MDI衍生的PEG三元醇的溶液。加入Repel-SilaneES作为疏水剂以减弱PEG的亲水作用。Repel-Silane是溶于八甲基环辛基硅烷的2％的二甲基二氯硅烷溶液。PEG骨架的分子量约10,000分子量单位。在20ml乙腈/PEG中加入20μL三乙胺(TEA)作为碱性催化剂。将载玻片在PEG/乙腈/TEA溶液中于室温孵育10分钟，同时搅动。然后用干净的乙腈洗涤3次，每次搅动10分钟。最后一次乙腈洗涤之后用DI水洗涤载玻片1小时，然后用乙醇冲洗并干燥。
采用实施例1所述的方法，将蛋白质抗原，即人运铁蛋白(0.2mg/ml)以在含有5％海藻糖、2mg/ml BSA的3.3％的水凝胶中的不同稀释度直接固定于在这种预处理的玻璃载玻片上，作为多个3D微斑点。载玻片与含不同浓度抗-人运铁蛋白的小鼠腹水液一起培育1小鼠。培育之后，载玻片用PBST洗涤3次，每次10分钟。通过将载玻片与Cy3标记的驴抗小鼠IgG一起培育然后通过激光扫描仪成像来显现结合的小鼠抗-运铁蛋白抗体。在三个稀释度数量级即0.1-0.001上观察到线性剂量响应，这说明锚定在水凝胶基质内的抗原的官能度和水凝胶基质的渗透性，支持了抗体连续扩散入作为整个测定方法一部分的基质。
Cy3标记的第二抗体证实抗-运铁蛋白第一抗体特异性结合水凝胶微斑点内的它的天然配体，而对水凝胶自身或对涂布的玻璃基底几乎没有可检测的结合活性。3D微斑点周围的载玻片区域没有显著信号说明，这种涂层可有效防止蛋白质非特异性结合基底，同时不会妨碍在3D微斑点内获得复合物。
尽管已经参照许多不同的实施方案描述了本发明，其中包括发明者目前预期的最佳方式，但应理解，在附带的权利要求中列出了对于精通本领域的技术人员而言将是显而易见的变化和修饰。例如，尽管使用具有多个携带不同捕获剂的微斑点的生物芯片有诸多优点，但在某些情况下也可能需要使用仅携带一种捕获剂的生物芯片。

Claims (20)

1.一种微阵列，其包括：
具有经衍生以携带有机官能团的平坦的不可渗透的上表面的基底，
在所述表面阵列区域离散空间位置上的多个三维(3D)微斑点，微斑点含有有机捕获剂或者适合直接或间接连接有机捕获剂，和
覆盖微斑点周围阵列区域表面的蛋白质抗性聚合涂层，该聚合涂层是多官能的，含有亲水骨架聚合物，所述聚合物经多官能异氰酸酯分子交联至实质性程度，所述多官能涂层通过异氰酸酯连接共价结合所述表面上的所述有机官能团，提供游离异氰酸酯基团。
2.如权利要求1所述的微阵列，其特征在于，所述亲水骨架聚合物是聚烯烃醚。
3.如权利要求2所述的微阵列，其特征在于，所述聚合物是通过氨基甲酸酯键用异氰酸酯基末端加帽的聚烯烃醚多元醇。
4.如权利要求3所述的微阵列，其特征在于，所述聚烯烃醚多元醇是聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)或其共聚物。
5.如权利要求4所述的微阵列，其特征在于，所述多元醇是分子量约为500-30,000道尔顿的PEG、PPG或其共聚物。
6.如权利要求3所述的微阵列，其特征在于，所述末端加帽的聚烯烃醚聚合物通过脲键与所述多官能异氰酸酯部分交联。
7.如权利要求6所述的微阵列，其特征在于，所述骨架聚合物通过芳族、脂环族或脂族多官能异氰酸酯分子交联。
8.如权利要求7所述的微阵列，其特征在于，至少约2.5％的所述存在的多官能异氰酸酯分子的每个官能团与单独的骨架聚合物连接以使所述交联达到实质性程度。
9.如权利要求1-8中任一项所述的微阵列，其特征在于，衍生所述基底的所述有机官能团是胺部分。
10.如权利要求9所述的微阵列，其特征在于，所述基底是玻璃载玻片，其上表面被氨基硅烷衍生化。
11.如权利要求1-8中任一项所述的微阵列，其特征在于，所述3D斑点是是聚氨酯基水凝胶。
12.如权利要求11所述的微阵列，其特征在于，所述水凝胶斑点通过所述有机官能团直接结合所述基底。
13.如权利要求11所述的微阵列，其特征在于，所述水凝胶斑点通过所述游离异氰酸酯基附加到所述聚合涂层上，该聚合涂层在整个阵列区域结合于所述基底。
14.一种制造使背景结合最小化的微阵列的方法，该方法包括：
提供具有用有机官能团衍生的平坦的不可渗透的上表面的基底，
施加蛋白质抗性聚合涂层，通过使该涂层共价结合到所述有机官能团而覆盖所述表面的至少一个测定区域，所述聚合涂层是多官能的，含有亲水骨架聚合物，所述骨架聚合物经多官能异氰酸酯分子交联到实质性程度，
固化所述涂层，
在所述表面所述阵列区域内的离散空间位置附加多个三维水凝胶斑点，和
将感兴趣的不同有机捕获剂连接到所述各个三维斑点内。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述有机捕获剂的所述连接在将所述三维斑点附加到所述表面之后发生。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，在施加所述涂层之前将所述水凝胶斑点通过所述有机官能团直接结合到所述基底。
17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，将所述聚合涂层结合到阵列区域的所述基底之后，将所述水凝胶斑点附加到所述涂层，使所述斑点与所述涂层结合。
18.如权利要求14所述的方法，其特征在于，施加所述蛋白质抗性涂层之前，所述上表面用保护性材料形成图案，以覆盖随后将附加三维斑点的区域，且其中在所述蛋白质抗性涂层到位后所述保护性材料随后被除去以附加所述三维斑点。
19.如权利要求14-18中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚合涂层包含通过氨基甲酸酯键用异氰酸酯基末端加帽的聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)或其共聚物的骨架聚合物，该骨架聚合物通过脲键与所述多官能异氰酸酯分子交联。
20.如权利要求14-18中任一项所述的方法，其特征在于，在附加所述斑点时所述有机捕获剂含在所述水凝胶斑点中。
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