CN1006401B - 肌醇三磷酸的制备方法 - Google Patents
肌醇三磷酸的制备方法Info
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Abstract
从D-肌醇-1,2,6-三磷酸,D-肌醇-1,2,5-三磷酸,L-肌醇-1,3,4-三磷酸和肌醇-1,2,3-三磷酸组成中选制出一种肌醇三磷酸(IP3),及由其组成的组合物的制备方法。
Description
本发明涉及一种特殊的肌醇三磷酸(IP3)和制备该肌醇三磷酸及其组合物的方法。
早在1900年,不同的研究者曾报导过发现了植物中的有机磷酸化合物肌醇六磷酸,也就是1,2,3,4,5,6-六(二氢磷酸)肌醇(有时也叫肌醇-六磷酸)。不同植物中肌醇六磷酸的含量变化是相当大的。在谷粒中肌醇六磷酸的含量除某些例外情况通常大约是0.5-2%,去糠稻米中仅含0.1%,而北美稻米中含2.2%的肌醇六磷酸,豆类约含0.4-2%,油类植物约含2-5%以及花粉中约含0.3-2%。植物中肌醇六磷酸的含量在生长期是变化的,在其它的有影响因素中,气候对其含量也有影响。
文献中还报导了在一些植物中含有肌醇五磷酸(IP5)和肌醇四磷酸(IP4)。还进一步得知,低于肌醇六磷酸(IP6)的磷酸衍生物在谷粒的发芽期形成。例如,发芽期最后的产物是肌醇和磷酸。肌醇六磷酸(IP6)的应用已经在几种科学刊物上描述过。这些论文的作者中大多数已经观察到,当在人类和动物身上使用肌醇六磷酸(IP6)或含有肌醇六磷酸(IP6)的物质时有几种副作用。例如,用肌醇六磷酸(IP6)含量过高的食物喂狗,会引起佝偻病。已经观察到,在人类中观察到有缺锌现象,还观察到其结果是造成儿童生长缓慢;也观察到主要在妇女中患贫血症。由于上述对于人类和动物中无机物平衡的副作用,到目前为此,已经做了减少肌醇六磷酸(IP6)和它的衍生物的摄取量至最小的偿试。
此外,众所周知,在增温情况下,用稀盐酸水解肌醇六磷酸以取得低级肌醇磷酸混合物,也就是肌醇五磷酸(IP5),肌醇四磷酸(IP4),
肌醇三磷酸(IP3),肌醇二磷酸(IP2),和肌醇单磷酸(IP1)。例如参见“生物化学通报”(Bull.Ste.Chim.Biol.)36,9(1956)85页。每个肌醇磷酸都可以多种异构体形式存在。肌醇三磷酸(IP3)预计可多达20种异构体。
肌醇三磷酸(IP3)的一种特殊的异构体在“生物化学与生物物理学研究通讯”(Biochem.Biophys.Res.Commun.)120,2(1984),481页中有过报导,即D-肌醇-1,4,5-三磷酸酯。此化合物被认为是人体细胞内一种动员钙的物质,而且它容易从细胞膜分离出来。
人们还不知道不同的其它特殊异构体的肌醇三磷酸以纯态存在时的性质。因此,使大量的肌醇三磷酸(IP3)异构体相互分离并因此鉴别和确定每个异构体的结构式和性质是很困难的。迄今为止,除了前面提到的D-肌醇-1,4,5-三磷酸外,仍然还没有生产或获得IP3的任何一种异构体的已知方法。此外,在生产肌醇三磷酸(IP3)的包括水解系统的工艺方法中,必须把异构体的重排作用和/或进一步脱磷酸成肌醇二磷酸(IP2)、肌醇单磷酸(IP1)或肌醇作为特殊问题加以考虑。
由于上述困难,除上面提到的D-肌醇-1,4,5-三磷酸外,对于实质上为纯物质的特殊肌醇三磷酸(IP3)其他异构体没有任何数据。
根据本发明,已经非常意外地发现能够解决上述问题,即将肌醇三磷酸(IP3)的某些不同异构体相互分离并以基本上纯化的形式进行生产。由此,肌醇三磷酸(IP3)异构体可以以盐或酸的形式取得。最好为盐,因为它比酸更容易浓缩为纯物质。
根据本发明,以基本上纯化的形式生产和分离出了一种酸或盐形式的肌醇三磷酸,此肌醇三磷酸由下述构成的一组中选出:D-肌醇-1,2,6-三磷酸,D-肌醇-1,2,5-三磷酸,L-肌醇-1,3,4-三磷酸和肌醇-1,2,3-三磷酸。
如上所述,个别肌醇三磷酸(IP3)异构体可以以酸或盐的形式取得。
这是第一次能以这两种形式获得大体纯的肌醇三磷酸(IP3)。
所提供的以酸式存在的肌醇三磷酸(IP3)一般为水溶液。以溶液的总重量计酸的浓度可达10到45%,优选15到45%,或最优选20到45%。
用标准方法,很容易由肌醇三磷酸(IP3)异构体酸式获得盐式。因此,可以制成盐,如碱金属和碱土金属盐,如锂、钠、钾、钙或镁。然而,铝,锌和铁盐以及NH+ 4和有机胺盐也都很有用。而且,也可使用含不同阳离子的混合盐。
胺类举例来说有三乙醇胺,二乙醇胺,三异丙醇胺,N,N-二甲基-2-氨基-2-甲基-1-丙醇,N,N-二甲基-乙醇胺,四丁胺和环己胺。别的盐也许亦有用。在生理上可接受的盐是尤其优选的。
根据本发明,为了生产一种或多种肌醇三磷酸(IP3)的异构体,可用一种或多种肌醇六磷酸(IP6),肌醇五磷酸(IP5)或肌醇四磷酸(IP4)的化合物或至少含一种此类化合物为起始原料。最好是使用含有肌醇六磷酸(IP6)的原料,因为它们最容易得到。在原料是天然产物情况下,优选肌醇磷酸(IP6+IP5+IP4)以重量计含量至少为0.3%的原料,更优先选用含量为1%的肌醇磷酸。
最适宜的作物是稻谷,特别是糠,花粉,豆类和油料植物。这些作物都含肌醇六磷酸(IP6)。
在理论上,人们相信,肌醇三磷酸(IP3)异构体可用例如下面的工艺方法生产。
(1)从肌醇四磷酸(IP4),肌醇五磷酸(IP5)和/或肌醇六磷酸(IP6)出发的酶促分解。
(2)从肌醇四磷酸(IP4),肌醇五磷酸(IP5)和/或肌醇六磷酸(IP6)出发的化学水解。
(3)化学合成法,例如,用肌醇,肌醇单磷酸(IP1),肌醇二磷酸(IP2)和磷酸作为起始原料。
(4)酶促合成法,例如,用肌醇,肌醇单磷酸(IP1),肌醇二磷酸(IP2)和磷酸作为起始原料。
(5)微生物法生产(还包含DNA杂交技术)。
(6)肌醇磷酸的化学或酶促迁移,或取代的肌醇磷酸的化学或酶促水解。
上述的工艺方法中两个或几个方法的结合也是可以的。然而这些方法中大都产生一些异构体的混合物,把混合物分离成异构体单纯物是非常困难的,即便能分离的话。
如前所述,本发明优先采用的方法是使用含肌醇六磷酸(IP6)物质的方法。因此,用肌醇六磷酸酶把肌醇六磷酸(IP6)酶促分解成肌醇三磷酸(IP3)。肌醇六磷酸酶通常在所有的包含肌醇磷酸酯的植物和种子中都存在。由此原因,根据本发明,如果用天然作物作为原料通常是不必再加入酶的。在天然产物的酶活性很低时或以肌醇六磷酸(IP6),肌醇五磷酸(IP5)或肌醇四磷酸(IP4)或其混合物作为起始原料时,加入例如由糠取得的肌醇六磷酸酶。
根据本发明,从植物、种子和微生物中得的肌醇六磷酸酶具有意想不到的效果,使得生产上述的高浓度和实际上纯净的特殊肌醇三磷酸(IP3)的异构体成为可能。
所用的肌醇六磷酸(IP6)可以是纯肌醇六磷酸(IP6)物质或含有肌醇六磷酸(IP6)的物质。处理含肌醇六磷酸(IP6)的天然起始原料(如糠)的适宜的方法是将其做预处理,例如,破掉和去除外层膜,并除去不需要的组分。然后,将这物质在水中浸泡,以便可获得肌醇磷酸酯使之分解并使酶活化。在必须补充酶时,可在此步骤或在以后步骤中加入酶。然后视需要允许此酶作用一段时间,以达到预定的水解程度。
在pH值为4到8时,发生水解的适宜温度通常是20-70℃,最好是30-60℃。为了在预定的程度停止水解可以使酶破坏或钝化,例如,对
水解原料迅速加热。为了将它转变成稳定贮藏的形式,可将它进行适当的冷冻干燥。
本发明特别叙述了制备以酸或盐形式存在的下列肌醇三磷酸的方法:D-肌醇-1,2,6-三磷酸,D-肌醇-1,2,5-三磷酸,L-肌醇-1,3,4-三磷酸和肌醇-1,2,3-三磷酸。该方法包括将含肌醇六磷酸(IP6)的原料在这样的条件下保温,即温度范围是20℃到70℃,最好为30℃到50℃,pH值为4到8,且具有肌醇六磷酸酶,保温直至释放的全部磷酸酯达到20-60%,通常为50%为止。在所述及的步骤里,通过使含肌醇六磷酸(IP6)原料进行水解,已经形成高比率的所希望取得的肌醇三磷酸(IP3)的一种或几种异构体。
得到肌醇磷酸混合物以后,用柱色谱法将其分离,以分离出含肌醇三磷酸(IP3)的组分。在色谱分离的情况下,可以选择将所说的组分进行另一次色谱分离,最好是在柱中分离。这样的分离有好处的,如果该组分含有不只一种肌醇三磷酸(IP3)异构体,那么,这些肌醇三磷酸(IP3)异构体最好以酸的形式分离。必要时,可通过加碱入酸中,得到肌醇三磷酸(IP3)的盐。
根据本发明,在可利用的肌醇六磷酸酶的许多来源中,酵母,而且最好是面包酵母更为可取。例如,由瑞典的贾斯特博拉盖特(Jastbolaget,Sweden)制造的瑞典面包酵母以及由芬兰的雷加马克(Rajamaki Finland)和瑞士的海弗厂(Hefefabriken AG,Switzerland)制造的面包酵母都可使用。当使用这种酵母时,已非常意外地得到了基本上只含有一种异构体的物质,即D-肌醇-1,2,6-三磷酸。当然,当只需要所说的唯一的异构体时,酵母的应用就是非常有价值的方法。
根据目前的知识,没有其它方法可提供单一异构体产品。通常得到的是大量异构体的混合物。
当以一种或多种肌醇六磷酸(IP6),肌醇五磷酸(IP5)或肌醇四磷
酸(IP4)化合物本身作为原料时,上述方法经适当修改也可使用。
在另一个具体实例中,本发明还涉及一种肌醇磷酸组合物,包括D-肌醇-1,2,6-三磷酸和D-肌醇-1,2,5-三磷酸,L-肌醇-1,3,4-三磷酸和肌醇-1,2,3-三磷酸这三种IP3中的至少一种酸或盐。此组合物通常含重量计为20-99.5%,最好是30-99.5%的所述肌醇三磷酸(IP3)。按所说肌醇磷酸类的总含量的重量计算,D-肌醇-1,2,6-三磷酸的含量在50-100%范围内,剩余部分包括肌醇三磷酸以外的其它肌醇磷酸类。
有时,组合物中的IP3优选基本由D-肌醇-1,2,6-三磷酸一种组成。
除肌醇三磷酸(IP3)外,肌醇磷酸组合物中的其余部分可能还含有肌醇五磷酸(IP5)和肌醇二磷酸(IP2)。
以重量计算,该组合物含有肌醇三磷酸为20-99.5%,较好的为60%;含其他肌醇磷酸80-0.5%,最好是少于40%。所说的其它肌醇磷酸以重量计,要含有肌醇二磷酸(IP2)和肌醇四磷酸(IP4)40-85%,最佳是50-85%,所说肌醇三磷酸(IP3)优选基本上由D-肌醇-1,2,6-三磷酸组成。
该组合物有时含有少量的一个或多个肌醇单磷酸(IP1)和肌醇六磷酸(IP6),其含量根据组合物中肌醇磷酸酯的总含量按重量计小于10%,最佳是1-8%。
这种类型的组合物可通过在最初发酵的肌醇磷酸产品中添加D-肌醇-1,2,6-三磷酸直到组合物中所述的异构体达到所期望的最终浓度来制备。这种方法在本技术领域中是众所周知的,并且包括如简单的机械混合。另一种方法是这种组合物也可以通过用酵母发酵,最好是通过用面包酵母作为肌醇六磷酸酶的发酵直接生产。如前面已指出的那样,使用面包酵酶所产生的几乎全部是D-肌醇-1,2,6-三磷酸,也就是说,基本上全部肌醇三磷酸酯(IP3)都是D-肌醇-1,2,6-三磷酸酯。
本发明肌醇三磷酸的酸或盐可作药品或食品用,且可以添加剂形式或作为稳定剂用于各种产品。此外肌醇三磷酸(IP3)能给种子以保护作
用。还可以作为牙膏的添加剂;作为涂料、油漆、润滑油和金属表面处理时的腐蚀抑止剂;也可以作为净化剂的一个组分;作为一种抗燃剂,应用于石版印刷,可用于例如抑制微生物中黄曲霉毒素的产生和改进或增加淀粉酶的活性。
通过发酵直接制备或用前述的加浓方法制备的肌醇-磷酸酯组合物在前面描述过的所有各种应用中都有效。
上面叙述的肌醇三磷酸(IP3)-异构体有如下的化学式:
D-肌醇-1,2,6-三磷酸的化学式为:
这里x是氢,至少是一价的,二价的或多价的阳离子,或它们的混合物,n是离子的数目,z是各离子所带的电荷。
D-肌醇-1,2,5-三磷酸的化学式为:
n·xZ+
式中X,n和z与上面的意义相同。
D-肌醇-1,2,3-三磷酸的化学式为:
式中x,n和z与上面叙述的意义相同;和
L-肌醇-1,3,4-三磷酸的化学式为:
n·XZ+
式中z,n和z与上面叙述的意义相同。
在上述各个化学式中,n的范围在6到1之间包括6和1,z的范围从1到6包括1和6,n最好是从3到6包括3和6,而z是3,2或1。
本发明的新的肌醇三磷酸(IP3)异构体在前述的医疗应用中有特殊疗效,尤其是它们在此应用中没有任何不希望的副作用。特别是D-肌醇-1,2,6-三磷酸具有特殊的效应,且证明与其它异构体相比特别是与D-肌醇-1,4,5-三磷酸相比有高数量级的活性。由D-肌醇-1,2,6-三磷酸与镉(Cd)形成的络合物比例如D-肌醇-1,4,5-三磷酸与镉(cd)形成的络合物要稳定的得多。由于许多相同的原因对于较低级的D-肌醇-1,2,5-三磷酸,L-肌醇-1,3,4-三磷酸和肌醇-1,2,3-三磷酸在医疗应用上比D-肌醇-1,4,5-三磷酸更合需用的。
与下面的最佳实例和附图及附表相联系,本发明将进一步得到解释。实例1和2表明肌醇六磷酸钠用小麦肌醇六磷酸酶进行水解和肌醇-磷酸混合物的分离。实例3和实例4涉及肌醇三磷酸(IP3)异构体结构的测定。实例5说明对肌醇三磷酸(IP3)的pKa值的测定。实例6表明肌醇三磷酸(IP3)分别与钙(Ca),锌(Zn)和镉(Cd)的相对结合常数的测定。实例7-10涉及本发明的肌醇三磷酸(IP3)-异构体钙盐的制备方法。实例11图示说明D-肌醇-1,2,6-三磷酸钙盐的红外光谱。实例12和实例13表明用麦麸水解肌醇六磷酸钠和得到的肌醇磷酸混合物的分离。实例14
涉及D-肌醇-1,2,6-三磷酸锌盐的制备方法。实例15-17表明肌醇六磷酸钠用面包酵母进行的水解作用,得到的肌醇磷酸混合物的分离和得到的肌醇三磷酸(IP3)的唯一异构体的测定。
实例18说明D-肌醇-1,2,6-三磷酸钠盐的制备方法。实例19表明肌醇六磷酸钠用盐酸进行化学水解和得到的肌醇磷酸混合物的分离。实例20涉及由多磷酸和肌醇进行肌醇磷酸的化学合成和用H-核磁共振(H-NMR)对于肌醇三磷酸(IP3)结构的测定。实例21表明米糖中肌醇六磷酸的水解,和得到的肌醇磷酸的提取和分析。实例22是关于D-肌醇-1,2,6-三磷酸不同盐的性能。实例23表明肌醇三磷酸(IP3)防止由于吸烟引起的人体血小板聚集作用的增加。
实例1
用小麦肌醇六磷酸酶水解肌醇六磷酸钠以及肌醇磷酸的分离。
将1.6克肌醇六磷酸钠〔美国密苏里州圣路易斯市,西格马化学公司(Sigma Chemical Co.,St.Louis,Missouri,USA)由玉米制备的〕溶解在650毫升pH值为5.2的乙酸钠缓冲液中。加入2.7克小麦肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.26,0.015u/毫克Sigma Chemical Co.生产),并且使混合物于38℃保温培养。
脱磷酸过程通过测定释出的无机磷进行监测。三小时后,当已释出50%无机磷时,加入30毫升氨使pH值调至12以停止水解。得到了含肌醇磷酸的液态混合物。
使350毫升混合物流过离子交换柱(强碱性阴离子交换树脂(Dowexl),氯化物型,25毫米×250毫米),并且用盐酸(0-0.7N)的线性梯度洗脱。为确定磷和肌醇的含量,使洗脱组分彻底水解。附图1给出了磷含量与洗脱液体积的关系曲线。不同的肌醇磷酸对应于不同的峰,例如,磷/肌醇为3/1的峰值由肌醇三磷酸组成等等。得到具有磷/肌醇比值为3/1的两个组分。
实例2 肌醇三磷酸类的分离
使100ml实例1得到的磷酸/肌醇比值为3/1的组分中和,并加入10%过量的0.1M乙酸钡溶液使它作为钡盐而沉淀。将600毫克沉淀的盐溶在50毫升稀盐酸中。使该溶液在盐酸作为洗脱液的离子交换柱(强碱性阴离子交换树脂(Dowexl),氯化物型,25毫米×2500毫米)上分离。将洗脱组分进行磷分析。附图2给出了磷量与洗脱液体积的关系曲线。在附图2中可看到肌醇三磷酸异构体构成的三个峰。
实例3
使用H-核磁共振(H-NMR)测定肌醇三磷酸异构体的结构
用H-核磁共振(H-NMR)分析实例2中得到的三个峰。在附图3a、3b及3c中给出了它们的核磁共振谱。数据指出,三个峰分别由肌醇-1,2,6-三磷酸、肌醇-1,2,3-三磷酸及肌醇-1,3,4-三磷酸组成。
用H-核磁共振(H-NMR)分析第二个组分,即实例1中制备的具有磷/肌醇比值为3/1的组分。附图4给出了它的核磁共振谱。数据指出,该组分由肌醇-1,2,5-三磷酸组成。在本实例中以及后面所有使用H-核磁共振(H-NMR)的地方,H-核磁共振(H-NMR)装置均为一种尼科莱特(Nicolet)360WB分光计。内标物是四甲基硅烷。
实例4
肌醇三磷酸旋光异构体的测定
取20毫克实例3中通过H-核磁共振(H-NMR)法被确定为是肌醇-1,2,6-三磷酸和肌醇-1,3,4-三磷酸的化合物,用以乙酰化纤维素为基础的手性柱〔默克(Merck)制品、20毫米×300毫米〕进行一步层析,用乙醇和水的混合物作为洗脱液。用旋光仪分析洗脱组分。如图5所示,每种化合物由一种旋光异构体组成,即分别为D-肌醇-1,2,6-三磷酸及L-肌醇-1,3,4-三磷酸。
实例5
肌醇三磷酸的pKa值的测定
使用0.01M的氢氧化钠(NaOH)滴定10毫升实例1中得到的磷/肌醇比值为3/1的第一组分。在滴定过程中,用一个电极测量pH值。附图6给出了与氢氧化钠(NaOH)体积相对应的pH值曲线。
下面是得到的pKa值:
pKa1=4.7
pKa2=7.5
实例6
肌醇三磷酸与钙、锌及镉的相对结合常数的测定
在分别有0.2mM的钙、锌及镉的情况下,用0.01M的氢氧化钠(NaOH)滴定10毫升实例1中制备的磷/肌醇比值为3/1的第一组分。在加入一定体积的NaOH后,如果形成肌醇三磷酸-金属络合物的趋势越大,则导致溶液的pH值越低。如图7所示,肌醇三磷酸(IP3)的金属结合常数递增顺序如下:
Ca<Zn<Cd
实例7
D-肌醇-1,2,6-三磷酸钙盐的制备步骤
用氢氧化钙〔Ca(OH)2〕水溶液将实例2中制得的含有D-肌醇-1,2,6-三磷酸的组分100毫升中和至pH值约为7。加入100毫升乙醇使钙盐沉淀。沉淀物经离心过滤及再结晶并在真空中干燥。
用H-核磁共振(H-NMR)法分析其结构,证实得到的是提纯了的D-肌醇-1,2,6-三磷酸的钙盐。
为确定碳、磷、氧及钙的含量,将以上再结晶的D-肌醇-1,2,6-三磷酸钙盐进行化学分析。其结果列入表1。盐的分子式是Ca3IP3。
实例8
L-肌醇-1,3,4-三磷酸钙盐的制备步骤
用氢氧化钙〔Ca(OH)2〕水溶液将实例2中制得的含有L-肌醇-1,3,4-三磷酸的组分100毫升中和至pH值约为7。加入100毫升乙醇使钙盐沉淀。沉淀物经离心过滤及再结晶并在真空中干燥。
用H-核磁共振(H-NMR)法分析其结构,证实得到的是提纯的L-肌醇-1,3,4-三磷酸钙盐。
为确定碳、磷、氧及钙的含量,将以上再结晶的L-肌醇-1,3,4-三磷酸钙盐进行化学分析。结果列入表1。盐的分子式是Ca3IP3。
实例9
肌醇-1,2,3-三磷酸钙盐的制备方法
用氢氧化钙〔Ca(OH)2〕水溶液将实例2中制得的含有肌醇-1,2,3-三磷酸的组分100毫升中和至pH值约为7。加入100毫升乙醇使钙盐沉淀。沉淀物经离心过滤及再结晶并在真空中干燥。
用H-核磁共振(H-NMR)法分析其结构,证实得到的是提纯的-肌醇-1,2,3-三磷酸的钙盐。
为确定碳、磷、氧及钙的含量,将以上再结晶的-肌醇-1,2,3-三磷酸钙盐进行化学分析。其结果列入表1。盐的分子式是Ca3IP3。
实例10
D-肌醇-1,2,5-三磷酸钙盐的制备方法
用氢氧化钙〔Ca(OH)2〕水溶液将实例2中制得的含有D-肌醇-1,2,5-三磷酸的组分100毫升中和至pH值约为7。加入100毫升乙醇使钙盐沉淀。沉淀物经离心过滤及再结晶后在真空中干燥。
用H-核磁共振(H-NMR)法分析其结构,证实了得到的是提纯的D-肌醇-1,2,5-三磷酸的钙盐。
为确定碳、磷、氧及钙的含量,将以上再结晶的D-肌醇-1,2,5-三
磷酸钙盐进行化学分析。其结果列入表1。盐的分子式是Ca3IP3。
实例11
D-肌醇-1,2,6-三磷酸钙盐的红外(IR)光谱
用红外(IR)分析实例7中制得的纯化的D-肌醇-1,2,6-三磷酸钙盐。其特征谱带是:
3500厘米-1-OH
2900厘米-1-CH
1600厘米-1-OH
1100厘米-1-C-O和-P
1000厘米-1-C-O和-P
800厘米-1-C-C
实例12
用麦麸水解肌醇六磷酸钠以及肌醇磷酸混合物的分离
将10克肌醇六磷酸钠〔西格马化学公司(Sigma Chemical Co.)由玉米中提取〕溶于500毫升pH值为5.0的乙酸钠缓冲液中。随着温度升至37℃,搅拌的同时加入10克麦麸。在37℃下,开始持续保温。通过测定无机磷的释放监测脱磷酸作用。两小时后,当已经释放50%的无机磷时,加入100毫升的氨停止水解。使得到的悬浮液经过离心过滤并且收集上层清液。
使300毫升的上清液流过离子交换柱(强碱性阴离子交换树(Dowex1),氯化物型,25毫米×250毫米),并用线性梯度的盐酸(0-0.7N HCl),洗脱。为确定磷和肌醇的含量,将已洗脱的组分完全水解,收集两个磷/肌醇的比值为3/1(IP3)的组分。
实例13
肌醇三磷酸的分离
使用与实例2中所述相同的方法,不同处只是进行层析的是实例12
中收集到的第一组分。得到了三个峰并且用H-核磁共振(H-NMR)进行分析。这些峰分别由肌醇-1,2,6-三磷酸、肌醇-1,2,3-三磷酸及肌醇-1,3,4-三磷酸所构成。
实例14
D-肌醇-1,2,6-三磷酸的制备方法
用一种氧化锌(ZnO)水溶液将实例13中制得的含有D-肌醇-1,2,6-三磷酸的组分100毫升中和至pH值均为7。加入100毫升的乙醇使锌盐沉淀。将沉淀物离心过滤及再结晶并且在真空中干燥。为确定磷、碳、氧及锌的含量,用化学方法分析上面的D-肌醇-1,2,6-三磷酸的再结晶锌盐。其结果列入表1。盐的分子式是Zn3IP3。
实例15
用面包酵母水解肌醇六磷酸钠以及肌醇磷酸混合物的分离
将0.7克肌醇六磷酸钠〔西格马化学公司(Sigma Chemical Co.)由玉米中提取〕溶在600毫升pH值为4.6的乙酸钠缓冲液中。在搅拌下加入50克瑞典(Sweden)、Jastbolaget的面包酵母(固态含量28%、氮含量2%、磷含量0.4%)。在45℃持续保温。通过测量无机磷的释放监测脱磷酸作用。7小时后,当50%无机磷已经释放时,加入30毫升氨调至pH值为12以停止水解。悬浮液经离心过滤并收集上层清液。
使400毫升上层清液通过离子交换柱(强碱性阴离子交换树脂(Dowex 1),氯化物型,25毫米×250毫米),并且用线性梯度的盐酸(0-0.7N HCl)洗脱。
为确定磷及肌醇的含量,使洗脱组分完全水解。附图8给出了磷与洗脱液体积的关系曲线。不同的峰对应不同的肌醇磷酸(例如:磷/肌醇比值为3/1时,表示由肌醇三磷酸组成等等)。
实例16
肌醇三磷酸异构体结构的测定
用H-核磁共振(H-NMR)分析之前,中和并且蒸发实例15中得到的具磷/肌醇比值为3/1的组分。光谱证明与附图3a完全相同。数据表明,峰由肌醇-1,2,6-三磷酸构成。
实例17
肌醇-三磷酸的旋光异构体的测定
用与实例4中所述相同的方法,不同处只是取10毫克实例16中经核磁共振法测定过的化合物进行分析。如附图9所示,化合物由旋光异构体,即D-肌醇-1,2,6-三磷酸构成。使用一种酸(例如盐酸)处理能使所说异构体重排成L-肌醇-1,3,4-三磷酸。
实例18
D-肌醇-1,2,6-三磷酸钠盐的制备方法
使用氢氧化钠(NaOH)水溶液将实例15制得的含有D-肌醇-1,2,6-三磷酸的组分100毫升中和至pH值约为7。加入100毫升乙醇后,蒸发溶液以减缩它的体积,并使钠盐沉淀、离心过滤再结晶及在真空中干燥。使用H-核磁共振(H-NMR)法分析其结构,证实得到的是提纯了的D-肌醇-1,2,6-三磷酸钠盐。
为确定它的碳、磷、氧及钠的含量,用化学方法分析D-肌醇-1,2,6-三磷酸的再结晶钠盐。其结果列入表1。盐的分子式是Na6IP3。
实例19
肌醇六磷酸钠的化学水解以及肌醇磷酸混合物的分离
将1.0克肌醇六磷酸钠〔西格马化学公司(Sigma Chemical Co.)由玉米中提取〕溶解在15毫升6N的盐酸(HCl)中。将样品于真空下封入试管中在烘箱(105℃)中加热5小时。5小时后,已经释放34%的无机磷。
用氢氧化钠(NaOH)水溶液中和5毫升液体混合物,使其pH值调至7,然后,使它通过离子交换柱(强碱性阴离子交换树脂(Dowex 1),氯化物型,10毫米×150毫米),用呈线性梯度的盐酸(0-0.7N HCl)洗脱。为
确定磷及肌醇的含量,使洗脱组分完全水解。附图10给出了磷与洗脱液体积的关系曲线。收集磷/肌醇比值为3/1的组分。H-核磁共振(H-NMR)谱指出了异构体产物的实际数量。
实例20
肌醇磷酸的化学合成
将多磷酸3.5克〔80%的五氧化二磷(P2O5)〕放入一个有玻璃塞的玻璃烧瓶中,并且将它加热至150℃。加入0.2克肌醇并且将混合物维持在所说温度大约2小时,然后用氢氧化钠(NaOH)水溶液将它中和至pH值为7。加入0.1M乙酸钡溶液至10%过量,得到钡盐沉淀。
通过加入稀盐酸使20克钡盐转化为酸形式,然后使用高效液态色谱(HPLC)分析。分析方法要用已知的肌醇磷酸校正,图11示出色谱图像,收集被确定为是肌醇三磷酸的组分。
H-核磁共振(H-NMR)谱显示有许多异构体。
实例21
在25℃下,将含肌醇六磷酸(约含1%)的米糠1.0公斤悬浮在10升pH为5的乙酸钠缓冲液中。4小时后,当50%的无机磷已释放出来,加入1升2M的盐酸(HCl)提取浆渣。将悬浮液摇动1小时后,进行离心过滤。用氢氧化钙〔Ca(OH)2〕溶液把上层清液的pH值中和至7。加入5升乙醇后,得到沉淀物。把不同的肌醇磷酸组合物的钙盐离心过滤、干燥及再结晶。20毫克的再结晶钙盐加入稀释的盐酸转化成酸形式后,用高效液相色谱(HPLC)分析。组合物由40%的肌醇三磷酸组成,其中有70%是D-肌醇-1,2,6-三磷酸。其余部分由其它的肌醇磷酸组成。
实例22
不同的D-肌醇-1,2,6-三磷酸盐的特性
把70毫升实例15制得的磷/肌醇比值为3/1的组分分为7份。用0.1M氢氧化钠(NaOH)调节pH值后,加入不同阳离子的氯化物,一部分
中只加一种离子。所用的盐分别是:三氯化铁(FeCl3)、氯化镁(MgCl2)、氯化铝(AlCl3)、氯化钾(KCl)、氯化铵(NH4Cl)、氯化四丁铵〔(CH3CH2CH2CH2)4NCl〕以及氯化己基铵(C6H13NH3Cl)。
加入10毫升乙醇后生成沉淀。将盐进行再结晶后分析磷、碳、氧和金属的含量。下面的表1表示了纯盐的组成。
实例23
人类吸烟后肌醇三磷酸(IP3)对血小板聚集作用的研究
四名健康的不吸烟的男青年分为两次进行,一次是吞服含50毫克肌醇三磷酸(IP3)的胶囊,另一情况下吞服50毫克的空白对照剂胶囊。所用的肌醇三磷酸酯(IP3)是D-肌醇-1,2,6-三磷酸钙盐。受试验者与试验者均不知吞服的是肌醇三磷酸酯(IP3)还是空白对照剂。
吞下胶囊二小时后,取一次血样。随后,受试验者迅速连续地吸两支卷烟。吸烟后,取第二次血样。根据两次试样,确定血小板对于腺苷二磷酸(ADP)及胶原聚集作用的反应,所用的方法是与实例1基本相同的方法。吸烟前与吸烟后试样聚集作用的改变揭示了结果。
正号表明吸烟后聚集作用是较强的。
块结剂 肌醇三磷 空白 肌醇三磷酸(IP3)酯
块结剂 浓度 酸(IP3) 对照剂 与空白对照剂的差值
腺苷二磷酸(ADP) 0.5毫摩尔 +1.5 +7.25 5.85
腺苷二磷酸(ADP) 1毫摩尔 -1.5 +0.25 1.75
腺苷二磷酸(ADP) 2.5毫摩尔 -1.5 0 1.5
腺苷二磷酸(ADP) 5毫摩尔 -2.5 -0.75 1.75
胶原 0.5毫摩尔 +5.15 +12.25 6.5
胶原 1毫克 -8.25 +1.75 10.0
胶原 2.5毫克 -3.75 0 3.75
胶原 5毫克 -1.5 -0.25 1.25
在空白对照剂组中,吸烟使得聚集作用增加,此作用在块结剂浓度较低时尤为显著。在所有情况下,肌醇三磷酸都抵消了这些作用。因此,肌醇三磷酸(IP3)防止了由于吸烟而引起的血小板聚集作用的增加。
实例24
对十只为一组的小鼠腹膜内注入三种剂量的肌醇三磷酸(IP3)(D-肌醇-1,2,6-三磷酸钠盐)或生理盐水。注入三十分钟后,除以一组作为控制对照组外,所有的小鼠都静脉注射在盐水中的四氧嘧啶,注射量为50毫克/公斤。
小鼠在注射四氧嘧啶前饿12小时,注射后饿1小时。注入四氧嘧啶72小时后,根据葡萄糖含量分析小鼠的血样。其结果如下:
肌醇三磷酸酯的剂量(IP3) 四氧嘧啶 血糖
毫克/公斤 毫克/公斤
0 0 216
0 50 864
800 50 857
1600 50 677
四氧嘧啶由于促进产生胰岛素的细胞内的游离基反应而引起糖尿病并增加血糖量。使用肌醇三磷酸(IP3)具有剂量依赖的血糖降低作用,并且最高的剂量对于四氧嘧啶具有防护作用。
为了进一步理解本发明的目的,下面给出了本发明肌醇三磷酸酯(IP3)异构体的分子式。也给出了肌醇六磷酸(IP6)、肌醇五磷酸(IP5)、肌醇四磷酸(IP4)及肌醇二磷酸(IP2)的分子式。
低级肌醇磷酸酯的命名取决于磷酸基在肌醇环中的位置以及给予尽可能低的位置数码编码。L和D分别表示顺时针及逆时针计数,并取决于哪一种能给出最低位置的编码。具有轴向磷酸基的碳原子其位置编码总是2。对于酸的形式其简化结构式如下:
肌醇;C6H6(OH)6
1,2,3,4,5,6-六(二氢磷酸)-
肌醇或者肌醇六磷酸盐或者IP6
6-IP3
D-肌醇-1,2,5-三磷酸或者D-1,
2,5-IP3
肌醇-1,2,3-三磷酸或者1,2,3-
IP3
L-肌醇-1,3,4-三磷酸或者L-1,
3,4-IP3
L-肌醇-1,2-二磷酸或者L-1,2-
-IP2
1,2,5,6-IP4
L-肌醇-1,2,3,4,5-五磷酸或者
L-1,2,3,4,5-IP5
Claims (5)
1、制备肌醇三磷酸酯(IP3)化合物的方法,这些化合物包括:D-肌醇-1,2,6-三磷酸、D-肌醇-1,2,5-三磷酸、L-肌醇-1,3,4-三磷酸和肌醇-1,2,3-三磷酸,可为酸或盐的形式,该方法的特征是:含有肌醇六磷酸的原料在有肌醇六磷酸酶及温度由20℃到70℃,pH值为4到8的条件下保温,直到磷酸酯总量约30-60%释出为止,此后用色谱法分离得到的混合物,以分离出含肌醇三磷酸IP3的部分,然后进一步用色谱分离法在溶液中分离出肌醇三磷酸(IP3)的酸或盐形式的特殊异构体。
2、根据权利要求1的方法,其中肌醇六磷酸酶是酵母肌醇六磷酸酶。
3、根据权利要求2的方法,其中酵母为面包酵母。
4、一种制备D-肌醇-1,2,6-三磷酸盐或酸的方法,其中,含肌醇六磷酸的原料在温度范围为20-70℃同酵母肌醇六磷酸酶一起保温,直到磷酸酯总量约30-60%释出为止,此后用色谱法分离所得的混合物,以分离出含肌醇三磷酸的部分,及分离出溶液中以酸或盐的形式存在的D-肌醇-1,2,6-三磷酸。
5、根据权利要求4的方法,其中酵母为面包酵母。
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