CN100539863C - 一种麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法 - Google Patents

一种麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，包括取成熟风干麻疯树种子胚乳，用研钵研磨成精细的粉末，然后加入预冷匀浆缓冲液，在冰上研磨至匀浆后转移到离心管中，4℃下于10000-20000g离心10-20分钟，弃沉淀，在上清液中加入10%(v/v)的三氯乙酸，然后在冰浴中沉淀20-50分钟；再次离心后，去掉上清液，沉淀用丙酮清洗后离心，再取沉淀；重复用丙酮清洗2-3次，4℃下于10000-20000g离心10-20分钟，去上清液，将沉淀真空干燥得到蛋白干粉。本发明解决了麻疯树种子胚乳因含油高达60%而蛋白质提取难的问题，创建了麻疯树种子胚乳蛋白质大量、快速和高效的提取方法。

Description

一种麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法
一、技术领域
本发明涉及一种植物种子蛋白质提取方法，更特别的涉及一种麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法。
二、背景技术
麻疯树(Jatropha curcas L.)是大戟科麻疯树属多年生落叶亚乔木植物，生长快，当年可开花结果，种子含油高，还具有抗干旱、耐贫瘠、抗逆性强。随着能源危机和环境污染问题的日益加剧，可再生能源的开发利用迫在眉睫。正是麻疯树的这些优点使其成为生物质能研究中一个被相当看好的树种。联合国已将麻疯树及其提取物用于贫穷的干热河谷地区生态建设，并作为扶贫的重大项目加以扶持。在我国四川、云南等省水土流失严重区域，麻疯树在保水固土，防沙化、增加有机土质、建防护林等方面发挥了重要作用，并被国家列为发展再生能源生物柴油的重要树种。麻疯树种子含有大量的油分，除主要做生物燃料外，还可做肥皂、化妆品，同时含有多种活性成分可用于农药和医药领域。因此广泛分布于热带亚热带地区的麻疯树是集环保、能源建设、生态建设、医药产品、扶贫等为一体的多年生木本。
麻疯树种子含有很多有用蛋白质，对其研究较多的是一种麻疯树毒蛋白质(Curcin)，又称核糖体失活蛋白(RIPs)，它具有抑制真核细胞无细胞系统蛋白质合成的作用，对肿瘤癌症、真菌病害有较强的抑制和杀伤能力，在临床医学及农业应用上表现出诱人的前景。
麻疯树胚乳约占种子重量的55％以上，是储藏脂肪、蛋白等有效成分的重要部位，其蛋白质含量约占种仁干重的25％以上。但对其蛋白质组分和种类至今知之甚少，为了很好的研究、开发和利用麻疯树种子生物学问题和经济价值，必须建立高效的种子胚乳蛋白质的提取方法。
三、发明内容
本发明的目的之一是提供一种以麻疯树种子胚乳为原料，提取蛋白质的方法。
本发明的目的之二是提供一种麻疯树种子胚乳蛋白质大量、快速和高效的提取方法。
本发明的这些以及其他目的将通过下列详细描述和说明来进一步体现和阐述。
本发明的麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，是以麻疯树种子胚乳为原料。
进一步的，本发明的麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，包括如下步骤：
A、取成熟风干麻疯树种子胚乳，用研钵研磨成精细的粉末，然后加入预冷匀浆缓冲液，在冰上研磨至匀浆；
B、将匀浆转移到离心管中，4℃下于10000-20000g离心10-20分钟，弃沉淀，在上清液中加入10％(v/v)的三氯乙酸，然后在冰浴中沉淀20-50分钟；
C、与B步骤相同条件下再次离心后，去掉上清液，沉淀用丙酮清洗后离心，再取沉淀；
D、重复用丙酮清洗2-3次，4℃下于10000-20000g离心10-20分钟，去上清液，将沉淀真空干燥得到蛋白干粉。
可以选择的是，本发明的麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，包括如下步骤：
A、取200毫克成熟风干麻疯树种子胚乳，用研钵研磨成精细的粉末，然后加入2毫升预冷匀浆缓冲液，在冰上研磨至匀浆；
B、将匀浆转移到离心管中，4℃下于12000-18000g离心12-15分钟，弃沉淀，在上清液中加入10％(v/v)的三氯乙酸，然后在冰浴中沉淀30-50分钟；
C、与B步骤相同条件下再次离心后，去掉上清液，沉淀用丙酮清洗后离心，再取沉淀；
D、重复用丙酮清洗2-3次，4℃下于12000-18000g离心30-50分钟，去上清液，将沉淀真空干燥得到蛋白干粉。
在本发明的麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法中，所述的预冷匀浆缓冲液含有Tris-HCl、蔗糖、乙二胺四乙酸、二硫叔糖醇和1％辛基苯氧基聚乙氧乙醇X-100，余量是去离子水。较好的是所述的2毫升预冷匀浆缓冲液含有15-25mM Tris-HCl、200-300mM蔗糖、5-13mM乙二胺四乙酸、0.5-1.5mM二硫叔糖醇和1％辛基苯氧基聚乙氧乙醇X-100，余量是去离子水。所述的Tris-HCl的PH值为7-9，较好的是7-8。粉末的粒径为0.01-0.1mm，研磨时间为3-10分钟，转速为120-200转/分钟。
本发明通过三氯乙酸/丙酮沉淀法解决了麻疯树种子胚乳因含油高达60％而蛋白质提取难的问题，并且创建了麻疯树种子胚乳蛋白质大量、快速和高效的提取方法。
用本发明的方法提取的麻疯树种子胚乳蛋白质对胃癌细胞生长具有强抑制作用，并且毒性低，麻疯树毒蛋白属I型核糖体失活蛋白，细胞毒性极低，对正常细胞的生长几乎没有影响；作用谱广，在一定的浓度范围下，对多种主要农作物和森林树种的真菌病害的生长有抑制作用，并且可与其它抗真菌病资源协同作用，提高作用强度和增加作用谱。
四、附图说明
图1是麻疯树种子蛋白质双向电泳蛋白质组表达谱。
五、具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明，但实施例仅用于说明，并不能限制本发明范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、量均为以总重量为基础的重量单位，所有的原料均可以从市场购得。
实施例1
按如下步骤进行提取：
A、取200毫克成熟风干麻疯树种子胚乳，用研钵研磨成精细的粉末(粒径约为0.01mm)，然后加入2毫升预冷匀浆缓冲液，该缓冲液含有20mM Tris-HCl、230mM蔗糖、8mM乙二胺四乙酸、0.8mM二硫叔糖醇和1％辛基苯氧基聚乙氧乙醇X-100，余量为去离子水。在冰上研磨至匀浆(研磨时间为3分钟，转速为200转/分钟左右)；
B、将匀浆转移到离心管中，4℃下于13000g离心15分钟，弃沉淀，在上清液中加入10％(v/v)的三氯乙酸，然后在冰浴中沉淀50分钟；
C、与B步骤相同条件下再次离心后，去掉上清液，沉淀用丙酮清洗后离心，再取沉淀；
D、重复用丙酮清洗2-3次，4℃下于14000g离心50分钟，去上清液，将沉淀真空干燥得到蛋白干粉。
实施例2
按如下步骤进行提取：
A、取200毫克成熟风干麻疯树种子胚乳，用研钵研磨成精细的粉末(粒径为0.1mm左右)，然后加入2毫升预冷匀浆缓冲液，该缓冲液含有20mM Tris-HCl、250mM蔗糖、10mM乙二胺四乙酸、1.0mM二硫叔糖醇和1％辛基苯氧基聚乙氧乙醇X-100、余量为去离子水。在冰上研磨至匀浆(研磨时间为10分钟，转速为120转/分钟左右)；
B、将匀浆转移到离心管中，4℃下于15000g离心15分钟，弃沉淀，在上清液中加入10％(v/v)的三氯乙酸，然后在冰浴中沉淀40分钟；
C、与B步骤相同条件下再次离心后，去掉上清液，沉淀用丙酮清洗后离心，再取沉淀；
D、重复用丙酮清洗2-3次，4℃下于15000g离心40分钟，去上清液，将沉淀真空干燥得到蛋白于粉。

Claims (7)

1、一种麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，其特征在于是以麻疯树种子胚乳为原料，包括如下步骤：
A、取成熟风干麻疯树种子胚乳，用研钵研磨成精细的粉末，然后加入预冷匀浆缓冲液，在冰上研磨至匀浆；
B、将匀浆转移到离心管中，4℃下于10000-20000g离心10-20分钟，弃沉淀，在上清液中加入10％(v/v)的三氯乙酸，然后在冰浴中沉淀20-50分钟；
C、与B步骤相同条件下再次离心后，去掉上清液，沉淀用丙酮清洗后离心，再取沉淀；
D、重复用丙酮清洗2-3次，4℃下于10000-20000g离心10-20分钟，去上清液，将沉淀真空干燥得到蛋白干粉。
2、根据权利要求1所述的麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，其特征在于是以麻疯树种子胚乳为原料，包括如下步骤：
A、取200毫克成熟风干麻疯树种子胚乳，用研钵研磨成精细的粉末，然后加入2毫升预冷匀浆缓冲液，在冰上研磨至匀浆；
B、将匀浆转移到离心管中，4℃下于12000-18000g离心12-15分钟，弃沉淀，在上清液中加入10％(v/v)的三氯乙酸，然后在冰浴中沉淀30-50分钟；
C、与B步骤相同条件下再次离心后，去掉上清液，沉淀用丙酮清洗后离心，再取沉淀；
D、重复用丙酮清洗2-3次，4℃下于12000-18000g离心30-50分钟，去上清液，将沉淀真空干燥得到蛋白干粉。
3、根据权利要求2所述的麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，其特征在于所述的预冷匀浆缓冲液含有Tris-HCl、蔗糖、乙二胺四乙酸、二硫叔糖醇和1％辛基苯氧基聚乙氧乙醇X-100。
4、根据权利要求3所述的麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，其特征在于所述的2毫升预冷匀浆缓冲液含有15-25mM Tris-HCl、200-300mM蔗糖、5-13mM乙二胺四乙酸、0.5-1.5mM二硫叔糖醇和1％辛基苯氧基聚乙氧乙醇X-100。
5、根据权利要求3或4所述的麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，其特征在于所述的Tris-HCl的PH值为7-9。
6、根据权利要求1或2所述的麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，其特征在于所述粉末的粒径为0.01-0.1mm。
7、根据权利要求1或2所述的麻疯树种子胚乳蛋白质提取方法，其特征在于所述研磨时间为3-10分钟，转速为120-200转/分钟。
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麻疯树籽油提取技术. 曾虹燕，方芳，苏杰龙，李昌珠，蒋丽娟.江苏农业学报，第2005卷第1期. 2005 *

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