CN100538340C - 一种具有多层结构的阅读器 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有多层结构的阅读器,平均粒径范围20nm~1μm;其最内层为光频率转换材料,在其外为包覆一层含OH基团的活化层,在活化层外通过物理吸附或化学共价形式连接一层含有胺基、羧基、硫氢基、醛基的功能基团层;在其功能基团层外层,通过生物分子固定技术,将生物分子与该阅读器连接。通过检测光频率转换材料光频率的变化,达到“阅读”被固定在该阅读器上的生物分子。本发明的有益效果是,发光强度高,斯托克斯位移大,发射峰的半高宽小;作为“阅读”技术的分子或颗粒尺寸小,并且具有较好的生物兼容性;“阅读”技术的载体无自发荧光和光漂白;本身无毒。
Description
技术领域
本发明涉及应用于生物分子免疫标记技术的阅读器,特别是一种具有多层结构的阅读器。
背景技术
随着现代生物学,医学的不断发展,后基因组,功能蛋白质组的研究发展非常迅速,产生了越来越多的生物学数据。生命科学研究正在经历从探究方式向以数据为基础的研究方式转变,生物学数据的采集、处理和运用方法的改进与创新也就越来越迫切。为了研究蛋白质等生物大分子的细胞定位、相互作用及其动态变化,生物科研人员急需新技术和新材料来实现对蛋白质等生物大分子的“阅读”。但以抗原-抗体特异性结合原理为基础的各种免疫学检测方法中,由于抗原-抗体反应后形成的复合物本身无色,无法直接观察,因而需借助某些化学基团染色,使其得以显示,以利于显微镜下观察或成像,即便于“阅读”。免疫标记技术就是这样一种“阅读”技术,它是运用荧光素、酶、胶体金及其它物理、化学和生物发光剂作为示踪物,并结合荧光显微镜、酶标测量仪、射线测量仪等仪器对结果进行检测的一项技术。它可以实现细胞、亚细胞、超微结构以及在分子水平上对目标基因序列,目标蛋白质进行定性、定位的研究。在临床分子病理诊断和研究、新基因和蛋白功能的探索、以及在研究生物大分子在细胞中的合成、转运、分布、以及在生物信号转导研究中得到实际应用。
传统的免疫标记技术如同位素法、化学荧光法、化学发光法、酶标等显示方法进行“分子识别”,然后用精密的扫描仪或CCD摄像技术记录,最后通过计算机软件数据处理以得到综合信息。人们早已认识到传统的免疫标记技术具有3个明显缺点:即生物体的自发光、光漂白和需要在线监测。近十年内,先进的“阅读”技术在国际上相继出现,如荧光团Cy-5,纳米金,半导体量子点CdSe等,解决了光漂白问题。但这些“阅读”技术都有其竞争性,局限性,如量子点技术存在制造成本高、材料本身有毒性的问题,能否推广和最终能否实用最近已有不少学者提出质疑。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的“阅读”技术,具体的说,是一种具有多层结构的生物分子阅读器,该阅读器具有性能好、功能强、成本低、易操作且探测灵敏度高的特点。
本发明的技术方案是,一种具有多层结构的阅读器,该阅读器最内层为光频率转换材料1,在光频率转换材料1的外部包覆一层含OH基团的活化层2,包覆方式可以是全包或点状包覆,在活化层2的外部通过物理吸附或化学共价形式连接一层功能基团层3,功能基团为含有胺基、羧基、硫氢基、或醛基的功能基团中的一种或多种;平均粒径范围为20nm~1μm;在功能基团层3的外层,通过生物分子固定技术,将生物分子与该阅读器连接,通过检测频率转换材料2频率的变化,“阅读”被固定在该阅读器上的生物分子、临床手术(如肿瘤/块切除)成像。所述的含OH基团的活化层2为水合氧化铝、水合氧化硅、硅酸、水合硅铝氧化物、水合氧化锌、水合稀土氧化物、水合氧化铁、水合氧化钴、油酸中的一种或多种。所述的生物分子为蛋白质、抗体/抗原、酶、核酸、DNA、RNA、细胞组织、肿瘤组织等。
对于光频率转换材料1主要有两类:一类是将高频率(如蓝紫可见光)转换为低频率(如蓝、绿、红、红外),另一类则相反,低频率(如红外)转换为高频率(如可见光子)。
将高频率转换为低频率,要求所选择的光频率转换材料1有较宽的吸收频率,而且,尽量接近能量较低的蓝紫光区,同时,它本身的化学性质也要求稳定。这样,它对要固定的生物分子的损伤要小一些、灵敏度高一些,而且应用范围更广。这样的频率转换材料有:
1)、铝酸盐基质材料,其组成表达式为(Y1-xGdx)3(Al1-yGay)5O12:C3+,其中x、y为摩尔系数,0≤x≤1,0≤y≤1。在400~500nm光照射下,发射光谱峰值为520~570nm。其光谱特性见图1,x,y的变化能使光谱的峰值变化。Gd取代部分Y,发射光谱峰值向长波方向偏移,Ce3+离子加入量增加也有相似的效果,而Ga的加入则使波长变短。可以根据需要调节发射波长,从而可以应用于不同生物分子的阅读。2)、硅酸盐基质材料,其组成表达式为aLO·bMO·cSiO2·dR:Eux,Lny,其中L=Sr,Ca,Ba,Zn;M=Mg,Cd,Zn;R=B2O3,P2O5,卤族元素;Ln=Nd,Dy,Ho,Tm,La,Pr,Ce,Mn,Bi,Sn,Sb;0.6≤a≤6,0≤b≤5,1≤c≤9,0≤d≤0.7,0.00001≤x≤0.2,0≤y≤0.3。在300~520nm光照射下,发光光谱峰值范围460~620nm,它取决于a、b、c值的变化。如2LO·SiO2:Eu,L=Sr波长为560nm左右,Ca和Ba替代部分Sr,都会使波长变短,图2为Sr1.92Ba0.06SiO4:0.02Eu2+的光谱特性。2LO·MgO·2SiO2:Eu中,L=Ca时波长为540nm左右,Sr和Ba替代部分Ca,都会使波长变短,L=Sr时波长为470nm左右。
3)、硅氮(碳)基质材料,其组成表达式为LxMyN(2x/3+4y/3):R,LxMyOzN(2x/3+4y/3-2z/3):R,0.5≤x≤3,1.5≤y≤8,0<z≤3或LxMyXtOzN(2x/3+4y/3+t-2z/3):R,0.5<x<1.5,1.5<y<2.5,0<t<0.5,1.5<z<2.5;L=Be,Mg,Ca,Sr,Ba,Zn;M=C,Si,Ge,Sn,Ti,Zr,Hf;X=B,Al,Ga,In;R=Y,La,Ce,Pr,Nd,Sm。在300~520nm光照射下,发光光谱峰值为520~630nm。图3为Sr0.6Si2O2N2:0.4Eu2+的光谱特性。上述材料的吸收范围都很宽,延展到了蓝绿光区(≈500nm,即20000cm-1),可以使用能量较低的蓝光作为转换源,而转换后的频率范围也很宽,而且可以按需要变化。
将低频率转换为高频率的光频率转换材料1,则要求它具有高的转换效率,本身化学稳定性要高。这样的频率转换材料有:
1)、硫氧化物基质材料,其组成表达式为Ln2O2S:Yb,Re,其中,Ln=Y、La、Gd、Lu中的一种或多种元素的组合;Re=Tm、Er、Ho、Tb、Pr、Nb中的一种或多种元素的组合。在790~990nm、1040~1640nm激光照射下,发光颜色可以是蓝、蓝绿、绿、黄、红、红外。图4为Y2O2S:Yb,Tm的光谱特性,它可以实现蓝色和红外输出。图5~7为Y2O2S:Yb,Er的光谱特性,它可以实现黄绿、黄和红色输出。图8为Y2O2S:Yb,Pr的光谱特性,它可以实现蓝绿色输出。图9为Y2O2S:Yb,Ho的光谱特性,它可以实现绿色输出,特别地,它的转换效率非常高,是Y2O2S:Yb,Er的两倍以上(图10)。变化Ln的种类,可以使转换效率和发光颜色发生变化。至于入射源,为了简便,本发明采用的是激光,当然也可以其他相同波长的光源,甚至波长变化范围超出上述范围,也有相似效果,只是效率有差别。
2)、氟化物基质材料,其组成表达式为MLnF4:Yb,Re,其中M=Li、Na、K中的一种或多种元素的组合;Ln=Y、La、Gd、Lu中的一种或多种元素的组合;Re=Tm、Er、Ho、Tb、Pr、Nb中的一种或多种元素的组合。在790~990nm、1040~1640nm激光照射下,发光颜色可以是蓝、蓝绿、绿、黄、红、红外。它的光谱特性和变化规律与硫氧化物基质材料相似。
3)、钨(钼)酸盐基质材料,其组成表达式为Ln2(RO4)3:Yb,Re,其中R=Mo、W中的一种或多种元素的组合;Ln=Y、La、Gd、Lu中的一种或多种元素的组合;Re=Tm、Er、Ho、Tb、Pr、Nb中的一种或多种元素的组合。在790~990nm、1040~1640nm激光照射下,发光颜色可以是蓝、蓝绿、绿、黄、红、红外。它的光谱特性和变化规律与硫氧化物基质材料相似。
4)、氧化物基质材料,其组成表达式为Ln2O3:Yb,Re,其中Ln=Y、La、Gd、Lu中的一种或多种元素的组合;Re=Tm、Er、Ho、Tb、Pr、Nb中的一种或多种元素的组合。在780~990nm、1040~1640nm激光照射下,发光颜色可以是蓝、蓝绿、绿、黄、红、红外。它的光谱特性和变化规律与硫氧化物基质材料相似。
但是,上述光频率转换材料本身是惰性较强的无机材料,抗体等生物大分子很难直接固定在其上,我们将其制成层状结构,在惰性较强的无机材料的表层覆盖一层含OH基团的活化层2,该活化层2可以是无机物,如水合氧化铝、水合氧化硅(硅酸)、水合硅铝氧化物、水合氧化锌、水合稀土氧化物、水合氧化铁、水合氧化钴;也可以是有机物层,如油酸。采用的覆盖方式可以是全包(图11)或点状包覆(图12),可以通过物理或化学方法将该活化层2覆盖在频率转换材料1表面。该活化层2的作用有两个:一是使惰性较强的频率转换材料1具有一定的亲水性、为生物应用打好基础;其次,通过这层活化层2,与一层含有胺基、羧基、硫氢基、醛基的功能基团层3相连接。功能基团的选择是根据要固定的生物分子(如蛋白质、抗体、酶、核酸等)性质来选择的。功能基团层3的连接方法是根据功能基团来确定的,采用经典方法即可,图13是胺基与水合氧化硅连接的原理流程图。多层结构的阅读器与生物分子的连接可以采用常规的生物分子固定技术。多层结构的阅读器的平均粒径范围是20nm~1μm,粒度太小(<20nm),会影响光频率转换效率,需要加大照射/激发源的功率,对固定的生物分子造成的损伤也会加大;粒度太大,容易沉降,会影响应用效果,如要进入血液循环,要求粒子的粒径小于<300nm,要进入骨髓,则要求粒子的粒径小于<100nm。粒度大于1μm,应用领域受到限制。我们发现,最佳的粒径范围是20nm~500nm。
该新型的多层结构的生物分子阅读器具有10-18的灵敏度,相当于最优传统标记探测技术的极限灵敏度。最主要的应用领域是快速免疫测定,高通量药物筛选,基因组和药物基因组的应用,手术成像,兽医检验,食品和环境检验,化学和生物战,以及便携式图像分析仪、试剂分析盒、小型分析仪等。
发光亮度的测量采用LS-100亮度计(测量范围:0.001 to 299900Cd/m2,MINOLTA)。其光谱响应与人眼的光谱敏感度相符。将样品置于一个暗箱内,用亮度计接收由激发源照射样品而产生的发光,用标准白板替换样品时,其发光亮度应低于0.01cd·m-2。
本发明的有益效果是,发光强度高,斯托克斯位移大,发射峰的半高宽小;作为“阅读”技术的分子或颗粒尺寸小,并且具有较好的生物兼容性;“阅读”技术的载体无自发荧光和光漂白;本身无毒。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明。
图1是本发明的(Y1-xGdx)3(Al1-yGay)5O12:Ce3+的光谱特性。
图2是本发明的Sr1.92Ba0.06SiO4:0.02Eu2+的光谱特性。
图3是本发明的Sr0.6Si2O2N2:0.4Eu2+的光谱特性。
图4是本发明的Y2O2S:Yb,Tm的蓝色/红外光(视觉为蓝色、可调)。
图5是本发明的Y2O2S:Yb,Er黄绿光(视觉为黄/绿色、可调)。
图6是本发明的Y2O2S:Yb,Er红绿光(视觉为黄/橙色、可调)。
图7是本发明的Y2O2S:Yb,Er红光(视觉为红色、可调)。
图8是本发明的Y2O2S:Yb,Pr蓝绿光(视觉为蓝绿色、可调)。
图9是本发明的Y2O2S:Yb,Ho纯绿光。
图10是本发明的Y2O2S:Yb,Ho和Y2O2S:Yb,Er发光亮度的比较。
图11是本发明的全包覆方式的多层结构阅读器示意图。
图12是本发明的点状包覆的多层结构阅读器示意图。
图13是本发明的胺基与水合氧化硅连接的原理流程图。
图14是本发明的Y2O2S:Yb,Ho纳米粒子的透射电境照片。
图15是本发明的980nm LD激发的Y2O2S:Yb,Ho生物阅读器发光效果照片。
图中:1、光频率转换材料,2、活化层,3、功能基团层。
具体实施方式
实施例1
采用固相反应法制备粒径约5μm的2CaO·MgO·2SiO2:0.02Eu,后将其破碎,采用沉降法选出200~400nm之间的粒子,彻底清洗后超声分散于无水乙醇中,然后用1~2%的硅酸钾溶液中(K2O·xSiO2)浸泡30min(硅酸钾溶液中加入适量的表面活性剂),用稀盐酸调节pH值到8~9。离心沉降后于110℃老化脱水5h(含水合氧化硅的活化层)。然后,根据图13的流程在水合氧化硅的表面连接胺基,即得生物分子阅读器,放入4℃的冰箱中待用。该阅读器在450nm蓝光照射下,发光颜色为黄绿色。
用该方法得到的水合氧化硅的活化层2是全包覆型的,如果直接采用纳米级SiO2或Al2O3胶体,则可得到点状包覆型的SiO2或Al2O3活化层。
使用同样的方法可得到其他频率转换材料1制备的阅读器。
实施例2
先制备平均粒径50nm的Y2O2S:Yb,Ho纳米粒子(如图15),彻底清洗后超声分散于无水乙醇中待用待用。将异丙醇铝溶于异丙醇铝+甲苯中(体积比1%),充分搅拌后加入2%的水进行水解,形成水合氧化铝。将二者混合,并加入适量的表面活性剂,离心沉降后于150℃老化脱水5h(含水合氧化铝的活化层)。然后采用碘乙酰和溴乙酰活化法连接上硫氢基层,即得生物分子阅读器,放入4℃的冰箱中待用。该阅读器在980nm IR LD照射下,发光颜色为黄绿色(如图16)。
相似地,采用Sol-Gel法,很容易得到水合硅铝氧化物、水合氧化锌、水合稀土氧化物、水合氧化铁、水合氧化钴活化层2。值得注意的是,应该控制活化层2的厚度,特别水合氧化铁、水合氧化钴活化层2超过20nm,就会使发光效率大大下降。活化层2的厚度可以通过控制反应时间,反应物浓度来调节,活化层2的结合强度通过两个方法来加强:一是适当添加表面活性剂,二是控制老化脱水的温度和时间。
实施例3
采用常温EDTA络合沉淀法制备NaGdF4:Yb,Ho纳米材料,溶于甲醇,并与N-(2-氨基乙基)乙醇胺混合。用旋转蒸发器驱除甲醇,并在50-80℃的真空中驱除水分,随后加热到200℃,保温1h,并通Ar,冷却到80℃。然后将十八烯(90%)和油酸(90%)加入到上述反应容器中。在磁力搅拌下,将上述溶液缓慢加热到100℃,保温30min,并抽真空,以驱除残留的水和氧。周期性通入Ar气以净化溶液,该溶液呈淡黄色。然后以10℃/min的加热速度升温到300℃,保温1h,并通入Ar气。冷却到室温,加入己烷/丙酮(1∶4),离心分离,用乙醇洗涤一次,然后用少量的氯仿纯化,并用过量的乙醇令颗粒沉淀下来,真空干燥至少24h。该纳米材料可在非极性溶液超声10-20min分散。油酸分子将覆盖在合成的NaGdF4:Yb,Ho纳米材料表面,得到含油酸基团的活化层2。通过双功能交联剂(如NH2-PEG-COOH)在其表面可进一步表面连接胺基,即得生物分子阅读器,放入4℃的冰箱中待用。该阅读器在980nmIR LD照射下,发光颜色为黄绿色。
实施例4
原料:尿素、钼酸铵((NH4)6Mo7O24·4H2O)、镧系稀土硝酸盐(Gd(NO3)3·6H2O、Yb(NO3)3·6H2O、Ho(NO3)3·6H2O)。
按化学计量比(Gd0.79Yb0.18Ho0.03)2Mo3O12准确称量各种反应物(其中Gd/Mo/尿素摩尔比为1∶2∶5),将其在玛瑙研钵中研磨,混合均匀后将前驱物放入电炉中加热引发燃烧反应。具体过程是,前驱物的制备:
(1)首先按比例准确称量各种反应物。
(2)将称量的原料倒入玛瑙研钵中,研磨约30分钟混合物为凝胶状。
(3)将混合物快速转移到刚玉坩埚中,即得到可用于燃烧合成的前驱物。样品的燃烧合成:先将高温电阻炉加热到燃烧反应的引发温度,燃烧将装有前驱物的刚玉坩埚快速放进高温的电阻炉中,约几分钟后,即可观察到反应物剧烈沸腾、膨胀,然后开始燃烧,可见明显得燃烧蔓延现象,反应大约十分钟内完成。燃烧完成后取出样品,冷却后将产物再经400~800℃热处理2h,去除未反应完全的碳等杂质,即得到所需的纳米级(Gd0.79Yb0.18Ho0.03)2Mo3O12合成产物。后面的工艺同实施例1。即得生物分子阅读器,放入4℃的冰箱中待用。该阅读器在980nm IR LD照射下,发光颜色为黄绿色。
Claims (10)
1、一种具有多层结构的阅读器,其特征在于,该阅读器最内层为光频率转换材料(1),在光频率转换材料(1)的外部包覆一层含OH基团的活化层(2),在活化层(2)的外部通过物理吸附或化学共价形式连接一层功能基团层(3),功能基团为含有胺基、羧基、硫氢基、或醛基的功能基团中的一种或多种;平均粒径范围为20nm~1μm;在功能基团层(3)的外层,通过生物分子固定技术,将生物分子与该阅读器连接,通过检测光频率转换材料(1)频率的变化,可以“阅读”被固定在该阅读器上的生物分子。
2、根据利要求1所述的一种具有多层结构的阅读器,其特征在于,所述的光频率转换材料(1)的组成表达式为Ln2O2S:Yb,Re,其中,Ln=Y、La、Gd、Lu中的一种或多种元素的组合;Re=Tm、Er、Ho、Tb、Pr、Nb中的一种或多种元素的组合,在790~990nm、1040~1640nm激光照射下,发光颜色可以是蓝、蓝绿、绿、黄、红、红外。
3、根据利要求1所述的一种具有多层结构的阅读器,其特征在于,所述的光频率转换材料(1)的组成表达式为MLnF4:Yb,Re,其中M=Li、Na、K中的一种或多种元素的组合;Ln=Y、La、Gd、Lu中的一种或多种元素的组合;Re=Tm、Er、Ho、Tb、Pr、Nb中的一种或多种元素的组合,在790~990nm、1040~1640nm激光照射下,发光颜色可以是蓝、蓝绿、绿、黄、红、红外。
4、根据利要求1所述的一种具有多层结构的阅读器,其特征在于,所述的光频率转换材料(1)的组成表达式为Ln2(RO4)3:Yb,Re,其中R=Mo、W中的一种或两种元素的组合;Ln=Y、La、Gd、Lu、Nb中的一种或多种元素的组合;Re=Tm、Er、Ho、Tb、Pr中的一种或多种元素的组合,在790~990nm、1040~1640nm激光照射下,发光颜色可以是蓝、蓝绿、绿、黄、红、红外。
5、根据利要求1所述的一种具有多层结构的阅读器,其特征在于,所述的光频率转换材料(1)的组成表达式为Ln2O3:Yb,Re,其中Ln=Y、La、Gd、Lu中的一种或多种元素的组合;Re=Tm、Er、Ho、Tb、Pr、Nb中的一种或多种元素的组合,在790~990nm、1040~1640nm激光照射下,发光颜色可以是蓝、蓝绿、绿、黄、红、红外。
6、根据利要求1所述的一种具有多层结构的阅读器,其特征在于,所述的光频率转换材料(1)的组成表达式为(Y1-xGdx)3(Al1-yGay)5O12:Ce3+,其中x、y为摩尔系数,0≤x≤1,0≤y≤1,在400~500nm光照射下,发射光谱峰值为520~570nm。
7、根据利要求1所述的一种具有多层结构的阅读器,其特征在于,所述的光频率转换材料(1)的组成表达式为aLO·bMO·cSiO2·dR:Eux,Lny,其中L=Sr,Ca,Ba,Zn;M=Mg,Cd,Zn;R=B2O3,P2O5,卤族元素;Ln=Nd,Dy,Ho,Tm,La,Pr,Ce,Mn,Bi,Sn,Sb;0.6≤a≤6,0≤b≤5,1≤c≤9,0≤d≤0.7,0.00001≤x≤0.2,0≤y≤0.3,在300~520nm光照射下,发光光谱峰值为460~620nm。
8、根据利要求1所述的一种具有多层结构的阅读器,其特征在于,所述的光频率转换材料(1)的组成表达式为LxMyN(2x/3+4y/3):R,LxMyOzN(2x/3+4y/3-2z/3):R,0.5≤x≤3,1.5≤y≤8,0<z≤3或LxMyXtOzN(2x/3+4y/3+t-2z/3):R,0.5<x<1.5,1.5<y<2.5,0<t<0.5,1.5<z<2.5;L=Be,Mg,Ca,Sr,Ba,Zn;M=C,Si,Ge,Sn,Ti,Zr,Hf;X=B,Al,Ga,In;R=Y,La,Ce,Pr,Nd,Sm;在300~520nm光照射下,发光光谱峰值为520~630nm。
9、根据利要求1所述的一种具有多层结构的阅读器,其特征在于,所述的含OH基团的活化层(2)为水合氧化铝、水合氧化硅、硅酸、水合硅铝氧化物、水合氧化锌、水合稀土氧化物、水合氧化铁、水合氧化钴、油酸中的一种或多种。
10、根据利要求1所述的一种具有多层结构的阅读器,其特征在于,所述的生物分子为蛋白质、抗体/抗原、酶、核酸、DNA、RNA、细胞组织、肿瘤组织。
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