CN100494344C - 利用来源于感染亚洲梨树之新病原体Erwinia pyrifoliae WT#3的基因的新生物农药 - Google Patents
利用来源于感染亚洲梨树之新病原体Erwinia pyrifoliae WT#3的基因的新生物农药 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及利用植物病原体的生物农药，更具体地讲，涉及通过利用从WT#3(Erwinia pyrifoliaeWT#3)[KCCM 10283]中分离的基因、具有对植物病原体的增强抗性和促进植物生长效果的生物农药，它优于从解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)ATCC 15580中分离的植物敏感蛋白质HrpH，因而可被用作肥料和生物农药。
Description
技术领域
本发明涉及利用来源于从Chunchon，Kangwon Province，Korea分离之新植物病原体Erwinia pyrifoliaeWT # 3(KCCM 10283)的基因的新生物农药。此病原体仅存在于韩国。这种新型生物农药具有比HrpN更有效的性能，例如，对植物疾病的抗性增强、植物生长促进作用及驱虫性，HrpN是从解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)(ATCC15580T)中分离的过敏反应诱导蛋白，在韩国不存在。因而，它可被用作有效防治由病原体和昆虫引起的植物疾病并促进植物生长的生物农药及肥料。
背景技术
粮食短缺已经显现为目前全世界人民正面临的最严重问题之一。然而，作物的产量已经由于如病原体和昆虫等病虫害的爆发而大大降低。当前，主要使用化学农药预防或控制害虫的传播。然而，其过度的和持续的应用诱导了害虫对这些化学农药的抗性，尽管快速的杀虫效果可以通过采用更容易的喷雾方法来直接杀死害虫而得到证明。此外，大部分有效的农药毒性强烈，已经由于严重的土壤和水污染而导致了许多社会问题。因此，非常迫切需要开发一种有利于环境的生物农药，它不会诱导害虫的任何抗性而又具有有效的杀虫活性。
使用生物农药的一般目的是通过向植物直接应用拮抗微生物本身去防治病虫害，但这在害虫的防治中不被认为是非常有效的。因此，最近的研究已经正在向通过利用拮抗微生物的产物来刺激植物的自身防御系统以防治病害虫上发展，而不是利用微生物本身。换句话说，生物防治的根本目标是通过用来源于微生物的物质对植物进行处理以激活植物的自身免疫功能来减少或预防害虫。
植物的抗病主要通过植物凭借诸如表皮细胞中的角质，蜡质层和各种类型的多孔性等结构障碍的防御体系来实现。当植物病原体渗透到植物细胞中时，由植物分泌的诸如皂角苷或凝集素等化学物质可以防止病原体群数量的增加[Agrios，G.N.1997.Plant Pathology.4th ed.Academic Press，New York；Dong，X.1998.SA.JA，乙烯及在植物中抗病性.Curr.Opin.Plant.Biol.1：316-323；Feys，B.J.& Parker，J.E.2000.植物抗病中信号路径的相互作用.Trends Genet.16：339-455]。
从更本质上讲，植物的抗病性涉及到过敏反应(HR)，它是防止病原体扩散的一种快速的局部坏死，这种坏死与植物利用某些来源于微生物的物质来刺激其自身防御系统，以抵抗许多病原体的积极防御相关[Richberg，M.H.，Aviv，D.H.& Dangl，J.L.1998.死亡细胞在说话.Curr.Poin.PlantBiol.1：480-485]。植物与HR诱导相关的抗病性的第一种方法是植物向邻近感染细菌病原体的细胞启动早期预警系统，以使其邻近的细胞能够增强对病原体的抗性。这种防御体系被称为“LAR”(局部获得性抗性)。
第二种方法是通过激活植物非感染部位的防御系统，从而激活对第二次感染更有效的防御系统。结果，整个植物都可以作为对抗病原体的更强大的防御系统。这种防御系统被称为“SAR”(系统获得性抗性)。SAR可以持续几周或更长，使植物对许多其它无关病原体也表现出一定的抗性[Hunt，M.D.，Neuenschwander，U.H.，Delaney，T.P.，Weymann，K.B.，Friedrich，L.B.，Lawton，K.A.，Steiner，H.Y.和Ryals，J.A.1996.系统获得抗性研究新进展评述.Gene 179：89-95]。
除此之外，也报道了对害虫的ISR(诱导性全身抗性)和伤害反应作为另一种植物抗性的类型[Pieterse，C.M.，van Wees，S.C.，vanPelt，J.A.，Knoester，M.，Laan，R.，Gerrits，H.，Weisbeek，P.J.和vanLoon，L.C.1998.控制拟南芥诱导性系统抗性的新信号路径.PlantCell 10：1571-1580；Ryan，C.A.and Pearce，G.1998.SYSTEMIN：植物防御基因的多肽信号.Annu.Rev.Cell Dev.Biol.14：1-17]。
植物的抗病机制由诱导植物防御系统的诱导物而启动[Kessmann，H.，Staub，T.，Hofmann，C.，Maetzke，T.，Herzog，J.，Ward，E.，Uknes，S.和Ryals，J.1994.植物系统获得抗病性的化学诱导.Annu.Rev.Phytopathol.32：439-459]。典型的SAR诱导物包括由植物产生的酚信号化合物SA(水杨酸)以及从病原体中分离的elicitin和harpin[Ponchet，M.，Panabieres，F.，Milat，M.L.，Mikes，V.，Montillet，J.L.，Suty，L.，Triantaphylides，C.，Tirilly，Y.and Blein，J.P.1999.诱导素是植物-卵菌通信中的密码吗.Cell Mol.Life Sci.56：1020-1047]。
Harpin是由植物致病菌hrp基因岛(gene island)产生的蛋白质之总称，其中一种Harpin，称为HrpN，是由hrpN基因产生的蛋白质，此基因位于解淀粉欧文氏菌的约40kb的hrp基因岛中，而解淀粉欧文氏菌在韩国是不存在的。当以HrpN接种宿主植物，例如苹果时，它起致病因子的作用。相反，当以HrpN接种非宿主植物时，它被植物视为外源化合物从而诱出HR。
HrpN是一种酸性的热稳定(100℃)蛋白质，其分子量为44kDa[分子量测定的方法是进行丙稀酰胺凝胶电泳后，蛋白质以0.025％的考马斯兰R-250染色，并与Bio-Rad公司(Catalog# 161-0305，Bio-RadLaboratories，2000 Alfred Nobel Drive Hercules，CA 94547，USA)的分子量标准进行比较]，富含甘氨酸而不含半胱氨酸[Zhong-Min，W.，Laby，R.J.，Zumoff，C.H.，Bauer，D.W.，He，S.Y.，Collmer，A.andBeer，S.V.1992.harpin，植物病原体解淀粉欧文氏菌产生的过敏反应诱导物.Science 257：85-88；US Pat.Nos.6,001,959，5,850,015，6,172,184-B1，6,174,717-B1，5,849,868，6,977,060，5,859,324，和5,776,889；韩国已审专利申请Nos.1999-022577，2000-075771，2000-070495，和2000-057395]。
这些植物防御诱导物已经通过各种制剂而销售。由于SA(水杨酸)已经被报道为SAR诱导物，发现与SA具有类似结构的INA(2，6-二氯异烟酸)和BTH(苯并噻二唑)诱导SAR并被成功地注册为植物激活剂。目前，ActigardTM和已经在美国和欧洲作为蔬菜、番茄和烟草的防病剂得到销售。在日本，PBZ(噻菌灵(Probenazole))也被以商品名
而得到销售用于防治水稻稻瘟病和细菌性叶枯病[Yoshioka，K.，Nakashita，H.，Klessig，D.F.and yamaguchi，I.2001.噻菌灵以新作用方式诱导拟南芥系统获得性抗性.Plant J.25：149-157]。
HrpN，是一种非化学蛋白质，首先在解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)，一种导致蔷薇科植物疫病的革兰氏阴性菌中发现。当将其直接向植物喷雾时，它作为防治各种植物病害、几种昆虫、螨和线虫的SAR诱导物而起作用，并通过增强光合作用与营养吸收而表现出促进植物生长的效果[Dong，H.S.，Delaney，T.P.，Bauer，D.W.和Beer，S.V.1999.HrpN通过由水杨酸和NIM1基因介导的系统获得抗性途径诱导拟南芥抗病性.Plant J.20：207-215]。HrpN毒性很小且由于其可以生物降解而不会产生任何环境污染，且它由于对甚至100℃煮沸的耐热性而易于配制[Zhong-Min，W.，Laby，R.J.，Zumoff，C.H.，Bauer，D.W.，He，S.Y.，Collmer，A.和Beer，S.V.1992.Harpin，植物病原体解淀粉欧文氏菌产生的过敏反应诱导物.Science 257：85-88]。
因此，来源于解淀粉欧文氏菌的HrpN于2000年在美国被EdenBioscience公司以商品名
成功商品化以防治诸如棉花、番茄、烟草、胡椒、黄瓜、草莓和小麦等作物的病害。它已经被有效用作杀真菌剂、杀细菌剂、杀虫剂及植物生长促进剂[US Pat.Nos.6,174,717 B1，5,849,868，6,977,060，5,859,324，和5,776,889；KoreaExamined Pat.Appl.Nos.1999-022577，2000-075771，2000-070495，和2000-057395]。
发明内容
本发明人在韩国Chunchon的梨园中，从正表现出坏死的植株上受感染的损伤部位中分离并鉴定出了一些细菌病原体，并发现了新的种Erwinia pyrifoliaeWT # 3(KCCM 10283)，它在形态学上不同于最近由德国研究者报道的Erwinia pyrifoliae，即Erwinia pyrifoliaeWT #3(KCCM 10283)没有鞭毛，而由德国研究小组报道的Erwiniapyrifoliae则具有周鞭毛。它也不同于已经熟知的导致火疫病的解淀粉欧文氏菌。
在从新种Erwinia pyrifoliaeWT # 3(KCCM 10283)中分离出诱导非宿主植物过敏反应的基因和蛋白质后，注意到，这种蛋白质被证明比来源于导致火疫病的解淀粉欧文氏菌的HrpN能更有效地赋予植物对病原体和昆虫的抗病性及促进植物生长。为此，我们完成了本发明。
从而，本发明的一个目的是提供一个新种Erwinia pyrifoliaeWT #3(KCCM 10283)和来源于这种病原体的蛋白质以作为一种有效的生物农药、植物生长激活剂、种子处理剂、驱虫剂及肥料。
本发明另一方面是提供编码Erwinia pyrifoliae中对植物非感染形式的蛋白质或多肽之基因(KCCM 10282)，此基因在当植物细胞与其接触或以其处理时，诱导非宿主的过敏反应或在植物中诱导对病原体的抗性。
本发明的另一方面是提供包含编码来源于Erwinia pyrifoliaeWT# 3(KCCM 10283)的以对植物非感染形式存在的蛋白质或多肽之基因(KCCM 10282)的转化体。
本发明的另一方面是提供包含该蛋白质或多肽及载体的生物农药组合物。
本发明的另一方面是提供能被作为农药、植物生长激活剂、种子处理剂、驱虫剂和肥料施用给植物的组合物。
本发明的另一方面是提供通过从Erwinia pyrifoliaeWT # 3(KCCM 10283)和包含来自Erwinia pyrifoliaeWT # 3(KCCM 10283)的菌株(KCCM 10282)的植物HR诱导基因的转化体的培养物中分离和纯化蛋白质或多肽，从而大规模生产诱导过敏反应或抗性的蛋白质或多肽的方法。
本发明的新型Erwinia pyrifoliaeWT # 3(KCCM 10283)是在Chun chon(Kangwon Prorince，Korea)的梨园中，从一株坏死植株受感染的茎分离的。此菌株被鉴定为欧文氏菌属，与火疫病的致病病原体解淀粉欧文氏菌、及导致坏死病的Erwinia pyrifoliae(导致亚洲梨树坏死病，1999年由德国研究小组报道的Erwinia pyrifoliae)同属。解淀粉欧文氏菌和Erwinia pyrifoliae都是周鞭毛菌，然而我们的病原体Erwinia pyrifoliaeWT # 3(KCCM 10283)是无鞭毛的，表现出与在韩国仅发现的Erwinia pyrifoliae巨大的形态学差异。我们将此新型菌株命名为Erwinia pyrifoliaeWT # 3(KCCM 10283)，于2001年6月11日保藏于韩国微生物保藏中心，并分配以保藏号No.KCCM10283。
特别地，将从Erwinia pyrifoliaeWT # 3中分离的编码诱导非宿主植物中过敏反应的蛋白质之基因与编码被美国Cornell大学发现并由Eden Bioscience公司销售的HrpN蛋白质之基因进行了比较。结果，我们的新基因表现出与编码HrpN之hrpN基因的低相似性。值得注意的是，在来源于Erwinia pyrifoliaeWT # 3、编码诱导非宿主植物中过敏反应的蛋白质之基因中，发现有核苷酸序列片段的若干插入，这在来源于解淀粉欧文氏菌的hrpN基因中是不存在的。更具体地讲，这些核苷酸序列片段插入在位点222-230bp、249-263bp、348-371bp和397-411bp处。因此，由此基因表达的蛋白质或多肽具有不同于HrpN肽的氨基酸序列和分子量。
构建了包含来源于Erwinia pyrifoliaeWT # 3的基因的高表达重组体pKEP3并向大肠杆菌(Escherichia coli)进行了转化。此转化体于2001年6月11日保藏于韩国微生物保藏中心，并分配以保藏号No.KCCM 10282。
诱导过敏反应及抗病性的蛋白质或多肽可以通过大量培养大肠杆菌重组体而获得高产，此重组体包含表达载体，与来源于解淀粉欧文氏菌的HrpN相比，它具有更有效的性质，诸如对植物疾病的增强抗性，促进植物生长及驱虫性。
结果，通过对诱导过敏反应或植物抗病性之蛋白质或多肽的生物活性进行评估，证明了其在抗黄瓜白粉病、胡椒炭疽病、胡椒枯萎病、甜瓜(Oriental melon)霜霉病、甜椒(Sweet pepper)枯萎病及稻叶枯病(leaf blight)中具有比HrpN增强的有效性。此外，其对黄瓜、胡椒、甜椒及草莓产率的提高上也比HrpN蛋白强。来源于ErwiniapyrifoliaeWT # 3的诱导非宿主植物中过敏反应的蛋白质或多肽也在增强黄瓜和胡椒的光合作用和叶绿素含量上表现突出。因此，来源于Erwinia pyrifoliaeWT # 3的蛋白质或多肽能被作为农药、植物生长激活剂及肥料施用给植物。
除此之外，本发明的蛋白质或多肽能被以常规方法应用于植物作为驱虫剂(例如，蚜虫)处理植物的茎和叶。此外，以本发明蛋白质或多肽处理的稻种子在育秧期表现出快速生长。因此，本发明的蛋白质或多肽能被以常规方法应用于植物作为驱虫剂及种子处理剂。
附图简述
图1显示根据本发明的新Erwinia pyrifoliaeWT # 3(KCCM10283)、Erwinia pyrifoliaeEp16T和解淀粉欧文氏菌ATCC15580T的TEM(透射电子显微镜)照片。
图2显示Erwinia pyrifoliaeWT # 3与解淀粉欧文氏菌ATCC15580T对温度的生长曲线。
图3显示Erwinia pyrifoliaeWT # 3与解淀粉欧文氏菌ATCC15580对pH值的生长曲线。
图4显示根据Biolog系统对Erwinia pyrifoliaeWT # 3(KCCM10283)进行的数值分类。
图5显示本发明Erwinia pyrifoliaeWT # 3(KCCM 10283)基于16S rRNA基因的系统发生分类。
图6显示本发明Erwinia pyrifoliaeWT # 3(KCCM 10283)的ITS区中tRNAAla编码区的系统发生分类结果。
图7显示本发明Erwinia pyrifoliaeWT # 3(KCCM 10283)的ITS区中tRNAGlu编码区的系统发生分类结果。
图8显示携含5个质粒的Erwinia pyrifoliae(WT # 3、Ep1、Ep16)及携含1个质粒的解淀粉欧文氏菌(ATCC15580T、LMG1877、LMG1946)的质粒图谱分析[泳道1：1kb序列梯，2：ErwiniapyrifoliaeEp1，3：Erwinia pyrifoliaeEp16T，4：Erwinia pyrifoliaeWT#3，5：解淀粉欧文氏菌ATCC15580T，6：解淀粉欧文氏菌LMG1877，7：解淀粉欧文氏菌LMG1946]。
图9显示在烟草叶片上接种从Erwinia pyrifoliaeWT # 3(KCCM10283)构建的基因组文库克隆后24小时观察到的过敏反应[B：MES缓冲液，C：解淀粉欧文氏菌ATCC 15580T的植物HR诱导蛋白(HrpN)，1：来源于1号克隆的植物HR诱导蛋白，2：来源于2号克隆的植物HR诱导蛋白，3：来源于pCEP33的植物HR诱导蛋白，4：来源于4号克隆的植物HR诱导蛋白，以及NC：来源于pLAFR3载体的蛋白质]。
图10显示Erwinia pyrifoliaeWT # 3基因组文库克隆(pCEP33)中编码植物HR诱导基因的物理图谱。
图11显示本发明Erwinia pyrifoliaeWT # 3(KCCM 10283)编码植物HR诱导蛋白之基因(KCCM 10282)与解淀粉欧文氏菌ATCC15580T的HR诱导基因(hrpN)间的基因比较[A：来源于ErwiniapyrifoliaeWT#3的植物HR诱导基因，B：来源于解淀粉欧文氏菌ATCC15580T的植物HR诱导基因(hrpN)]。
图12显示来自Erwinia pyrifoliaeWT # 3的基因在质粒载体pKEP3中表达的植物HR诱导蛋白(下文称之为“Pioneer”)[M：蛋白质大小标志，1：Pioneer，41.1kD，2：HrpN，39.7kD，3：pET15b载体]。
图13显示Pioneer与来源于解淀粉欧文氏菌ATCC15580T的植物HR诱导蛋白(HrpN)氨基酸序列间的比较[A：Pioneer，B：HrpN]。
图14显示以不同浓度来源于Erwinia pyrifoliaeWT # 3的Pioneer及来源于解淀粉欧文氏菌ATCC15580T(对照)的HrpN处理的烟草叶片上的HR。
图15显示分别接种Pioneer和缓冲液(对照)4天后未成熟梨果实表面上的疾病症状。
下列实施例用于举例说明本发明，但不应被认为是将本发明的范围限定为在此的化合物或实施例所限定的范围。
实施例
实施例1：新菌株的分离与鉴定
1)基于Schaad实验指导和Bergey手册的生理/生化测定
为了从Chunchon(Kangwon Province，韩国)果园梨上受坏死病感染的受损部位鉴别病原体细菌，基于Schaad实验指导[Schaad，N.W.1988.常见属别的初步鉴定.In：植物病原体细菌鉴定实验指导，N.W.Schaad编.American Phytopathological Society，Minnesot.PP.44-59]及Bergey手册[Lelliott，R.A.和Dickey，R.S.1984.Erwinia属.In：Bergey系统细菌学手册vol.1，pp.469-476，Williams and WillkinsCo.，Baltimore/London]进行了不同的生理和生化测试，如下列表1所示。
表1
总体来说，分析结果显示，对此菌株在生理测定(例如，明胶的液化、在3％琼脂中的运动性及果胶酸酯的分解)上与Erwiniapyrifoliae菌株Ep16T中的接近。与此形成对照的是，对碳源利用的生化检测揭示了不同的结果，尤其是海藻糖和L-阿拉伯糖，表明根据本发明分离的菌株之生理和生化特性与菌株Erwiaia pyrifoliaeEp16T和解淀粉欧文氏菌ATCC15580T不同。
2)菌株WT # 3的形态学特性
在TEM(透射电子显微镜)中观察到的菌株WT # 3的形态学特性与最近报道的导致亚洲梨树坏死病的Erwinia pyrifoliaeEp16T及导致苹果和梨火疫病的解淀粉欧文氏菌ATCC15580T的不同[图1]。
结果，欧文氏菌属物种，包括Erwinia pyrifoliaeEp16T和解淀粉欧文氏菌ATCC15580T具有周鞭毛而成棒状，而新菌株ErwiniapyrifoliaeWT # 3无鞭毛而稍成椭圆棒状。
3)在不同温度条件下菌株WT # 3的生长
为了调查生理和生化特性，绘制了Erwinia pyrifoliaeWT # 3在不同温度条件下的生长曲线，生长情况采用Bioscreen根据浊度而测定。
每隔3℃在12℃至39℃的温度范围内进行测量，计算ErwiniapyrifoliaeWT # 3和解淀粉欧文氏菌ATCC15580T的倍增时间及在不同温度下的比生长速率[图2]。
结果显示Erwinia pyrifoliaeWT # 3具有比解淀粉欧文氏菌更高的生长速率(27-30℃)和更短的倍增时间。菌株WT#3的最适温度为27℃。
在低于20℃的更低温度下，Erwinia pyrifoliaeWT # 3也显示出比解淀粉欧文氏菌ATCC15580T更好的生长，表明Erwinia pyrifoliaeWT# 3具有耐冷性，因为此病原体在Chunchan附近具有很好的适应性。Chunchan是一个在冬季相对寒冷的地区并与解淀粉欧文氏菌ATCC15580T的环境条件不同。
4)菌株WT # 3在不同pH值水平下的生长
为了调查pH值对Erwinia pyrifoliaeWT # 3生长的影响，采用Bioscreen C根据浊度测定其在不同pH值水平的生长。在恒温28℃条件下在pH5.5至9.5的范围内每隔0.5进行测定，并计算ErwiniapyrifoliaeWT # 3和解淀粉欧文氏菌ATCC15580T的倍增时间和在不同pH值水平下的比生长速率[图3]。
结果显示Erwinia pyrifoliaeWT # 3的最适生长pH范围为7.0至8.0，并在pH7.5的碱性条件下观察到了其快速生长，这与解淀粉欧文氏菌ATCC15580T的不同。
5)采用Biolog系统分析菌株WT # 3的特性
应用设计以检测96种不同碳源和氮源利用的Biolog系统[BIOLOG，Hayward，CA 94545，USA]详细调查菌株WT # 3的生化特性。
在TSA(triptic soy琼脂)中于28℃温育24小时后，将分离的菌株悬浮于含0.4％NaCl，0.03％ pluronic F-68和0.01％吉兰糖胶的溶液中至浊度为63％并接种于包含96种不同碳源和氮源的孔室中。
然后，将菌株WT # 3进一步在35-37℃于培养箱中培养。利用示读器记录作为碳源和氮源利用的紫色变化，并将其值按数值进行分类。
如图4所示，属于解淀粉欧文氏菌的菌株ATCC15580、LMG2068、LMG1877、LMG1946及ea246菌株(USA)被显示为同组。与此对照的是，菌株WT # 3位于Erwinia pyrifoliae(Ep4、Ep8、Ep16T)组中。因此，很清楚，菌株WT # 3不同于火疫病病原体解淀粉欧文氏菌。
6)菌株WT#3中16S rRNA基因的分析
为了调查菌株WT # 3的系统发生，鉴于它为控制生命的基本成分，其核苷酸序列很保守并易于进行系统发生分析的事实，对其16S
rRNA基因的核苷酸序列进行了分析。
使用fD1引物(SEQ.ID.NO.1)和rP2引物(SEQ.ID.NO.2)对16S rRNA基因进行PCR扩增，然而将其克隆到pGEM-T载体中以分析其核苷酸序列。
图5显示了采用mega程序绘制的基于16S rRNA核苷酸序列的系统发生树[Kumar，S.，Tamura，K.and Nei，M.1993.MEGA：分子进化遗传分析，version 1.0.The Pennsylvania State University，University Park]。
菌株WT # 3分别与Erwinia pyrifoliaeEp16T和解淀粉欧文氏菌15580T具有98.9％和97.5％序列一致性的相似性，与解淀粉欧文氏菌相比更接近Erwinia pyrifoliae。表2显示了每个菌株16S rRNA基因的相似性。
表2
| 类目 | Erwinia pyrifoliaeWT#3 | Erwinia pyrifoliaeEp16<sup>T</sup> | Enterobacter pyrinus(梨形肠杆菌) | 解淀粉欧文氏菌ATCC 15580<sup>T</sup> |
| Erwinia pyrifoliaeWT#3 | 100 | |||
| Erwinia pyrifoliaeEp16<sup>T</sup> | 98.9 | 100 | ||
| Enterobacter pyrinus | 92.7 | 92.9 | 100 | |
| 解淀粉欧文氏菌ATCC15580<sup>T</sup> | 97.5 | 97.7 | 91.8 | 100 |
同样，16S rRNA基因的分析揭示了菌株WT # 3属于与Erwiniapyrifoliae同组而不同于解淀粉欧文氏菌ATCC15580T及几年前报道的在韩国感染苹果及梨的梨形肠杆菌(Enterobacter pyrinus)。
7)菌株WT # 3 16S-23S ITS(基因间转录间隔区)的分析
为了分析韩国来源病原体Erwinia pyrifoliae和国外来源病原体解淀粉欧文氏菌的ITS，采用R16-1F引物(SEQ.ID.NO.3)和R23-1R引物(SEQ.ID.NO.4)对16S-23S ITS区进行PCR扩增，然而将其克隆到pGEM-T载体以分析16S-23S ITS区的核苷酸序列。
结果，16S-23S ITS区被分为2个组：解淀粉欧文氏菌具有约1215、970和720bp大小的3种带型，而本地病原体Erwinia pyrifoliae具有970和720bp大小的带型。
目前，所有菌株被显示为两组：分别为具有约70bp tRNAAla区的970bp带型和具有tRNAGlu区的720bp带型。
图6显示了通过分析菌株Erwinia pyrifoliaeWT # 3和解淀粉欧文氏菌ATCC15580T 16S-23S ITS区核苷酸序列而绘制的系统发生树。
通过分析编码70bp tRNAAla区的970bp带的核苷酸序列，结果揭示菌株WT # 3不同于解淀粉欧文氏菌组并与解淀粉欧文氏菌具有47.4％的相似性。然而，我们不能与德国研究者们命名的Erwiniapyrifoliae的tRNAAla区进行比较，因为它还没在GenBank中注册。
编码tRNAGlu区的720bp带的核苷酸序列的分析表明，菌株Erwinia pyrifoliaeWT # 3具有与德国研究者们报道的Erwiniapyrifoliae具有85.2％-92.7％序列一致性，因而视为同组[图7]
8)根据质粒图谱分析Erwinia pyrifoliaeWT # 3
将韩国来源的Erwinia pyrifoliae和国外来源的解淀粉欧文氏菌分为以下两组[图8]。
组I：解淀粉欧文氏菌(ATCC15580、LMG1877、10296)(一个大于29kb质粒)。
组II：Erwinia pyrifoliae(WT # 3、Ep1、Ep16)(一个大于29kb质粒，一个5kb质粒及3个2-4kb大小的质粒)。
即亚洲梨树上的包括菌株WT # 3的坏死病病原体Erwiniapyrifoliae包含5个质粒，而火疫病病原体解淀粉欧文氏菌则仅包含1种质粒。
9)根据DNA-DNA杂交的DNA相关性分析
调查韩国来源的Erwinia pyrifoliae和国外来源的解淀粉欧文氏菌间的全基因组相关性。
将分离纯化的总DNA溶于100μl TE缓冲液中至浓度为1ng/μl，加入10N NaOH，然后于80℃煮沸变性10分钟。采用slot-blot装置将变性DNA转移到Hybond-N+尼龙膜上。用作探针的天然DNA用Dig-High Prime[Roche Molecular Biochemicals，Sandhofer Strasse116，德国]以DIG 11-dUTP标记，在存在已经固定于尼龙膜的DNA情况下于49℃预杂交3小时，然后于同样温度下杂交16小时。采用DIG Luminescent Detection Kit[Roche Molecular Biochemicals，Sandhofer Strasse 116，德国]进行膜的显色。
结果显示，国外来源的解淀粉欧文氏菌(ATCC15580T，LMG1877，LMG1946，LMG2068)属于组I，而韩国来源的Erwinia pyrifoliae(WT# 3、Ep16T)则属于组II。
更具体地讲，国外来源的病原体解淀粉欧文氏菌属于组I而韩国来源的病原体Erwinia pyrifoliae属于组II。此结果清楚表明包括菌株WT#3的韩国病原体Erwinia pyrifoliae与国外病原体解淀粉欧文氏菌明显不同，表明Erwinia pyrifoliae是韩国本地的。下列表3显示了相关菌株的相似性。
表3
以上菌株WT # 3的生理、生化和遗传特性显示，根据基于Schaad实验指导和Bergey手册的生理和生化特性、温度和pH水平相关特性、Biolog system、16S rRNA基因、16S-23S ITS、质粒图谱及DNA-DNA杂交相关性，菌株WT # 3属于Erwinia pyrifoliae组，Erwinia pyrifoliae仅于1999年在韩国存在，尽管在Erwinia pyrifoliaeWT # 3和Ep16T之间还存在其它几种不同特性。
然而，由于菌株WT # 3在形态学上不具有在欧文氏菌属中最初报道的鞭毛，它看起来不同于那些由德国研究者报道的Erwiniapyrifoliae及解淀粉欧文氏菌。
我们将菌株WT # 3命名为Erwinia pyrifoliaeWT # 3(KCCM10283)并于2001年6月11日保藏于韩国微生物保藏中心。保藏号为KCCM 10283。同样，构建了包含来源于Erwinia pyrifoliaeWT # 3的基因的高表达重组体pKEP3并向大肠杆菌进行了转化。此转化体于2001年6月11日保藏于韩国微生物保藏中心，并分配以保藏号No.KCCM 10282。
实施例2：来自Erwinia pyrifoliaeWT # 3的触发植物过敏反应的
特定蛋白质及其编码基因的特性
1)来自Erwinia pyrifoliaeWT # 3的植物HR诱导基因的分析
为了分析编码诱导植物过敏反应的特定蛋白质的基因，将ErwiniapyrifoliaeWT # 3的总DNA于37℃温育以保证其被Sau3 AI部分消化。然后每隔1小时取1μl DNA电泳检测是否适当地消化，结果表明约6小时的消化最适合。经过这样处理的总DNA被预备作为插入DNA并使用DNA连接酶于14℃温育12小时而连接到克隆载体pLAFR3的BamHI多接头位点。将完整的连接有插入DNA及载体的质粒DNA通过CaCl2转化方法转化入大肠杆菌(HB101)。然后，将大肠杆菌菌株于37℃在含有四环素(30mg/ml)的Luria琼脂培养基上培养24小时，由此获得了2000个基因组文库克隆。
为了从Erwinia pyrifoliaeWT # 3的2000个基因组DNA文库克隆中选择编码诱导植物过敏反应的特定蛋白质之克隆，按以下方法从每个克隆提取总蛋白质。将于LB培养基中培养12小时的溶液离心以收获沉淀，在沉淀悬浮于包含5mM MES缓冲液和0.1mM PMSF的混合物中后，以超声裂解混合物并100℃煮沸10分钟。然后，收集离心后的上清液并利用注射器注射到烟草(Nicotiana tabacum L.Samsun)叶背面，这些烟草长有4片以上的真叶，每一片叶子直径大于15cm。注射后24小时烟草叶子的坏死被视为HR，然后选择显示HR的基因组DNA文库克隆[图9]。
将所选定的克隆pCEP33中包含HR诱导基因的8.5kb DNA片段克隆到pUC19载体并利用限制性核酸内切酶构建物理图谱[图10]。
图11通过分析选定基因的核苷酸序列，比较了本发明来自ErwiniapyrifoliaeWT # 3(KCCM10283)的植物HR诱导蛋白的编码基因(KCCM 10282)与来自解淀粉欧文氏菌ATCC15580T的HR诱导基因(hrpN)。
从本发明的Erwinia pyrifoliaeWT # 3中，可以获得编码植物过敏反应蛋白质的1287bp基因。这1287bp基因被命名为“WT # 3的植物HR诱导基因”并调查了其与解淀粉欧文氏菌ATCC15580T的hrpN基因(1212bp)的相似性。
结果表明，有5个新核苷酸序列片段插入到WT # 3的植物HR诱导基因的如下位点：222-230bp(TTTAACGGG)，249-263bp(TGGCGGCGGTCTGCT)，327-333bp(TCTGGGT)，348-371bp(CGGCATTGGCGGCGGCATTGGTGG)，及397-411bp(ACCGTGGGGACCTCT)，因而使此基因的分子量增加。WT # 3的植物HR诱导基因与解淀粉欧文氏菌的hrpN基因具有83.2％同源的低序列相似性。
因此，证明了编码Erwinia pyrifoliaeWT # 3的植物HR-诱导蛋白的基因具有不同于解淀粉欧文氏菌的hrpN基因的核苷酸序列，并包含新核苷酸序列片段的插入，因此表明WT # 3的植物HR诱导基因具有在解淀粉欧文氏菌的hrpN基因中没有的新基因结构。
Erwinia pyrifoliaeWT # 3的植物HR诱导蛋白的编码基因之核苷酸序列见SEQ.ID.No.5。
2)构建Erwinia pyrifoliaeWT # 3的植物HR诱导蛋白的表达载体
为了通过Erwinia pyrifoliaeWT # 3的植物HR诱导基因大规模提取和纯化植物过敏反应诱导蛋白，按下文构建了包含此基因的表达载体pKEP3：
应用大肠杆菌重组蛋白质表达系统(Novagen，Inc.Madison，WI53711 USA)构建表达载体pKEP3。此系统来源于pBR322质粒，其中在外源基因插入位点之前，T7启动子和操纵基因能与lac阻遏物结合。该结构能容易地通过宿主大肠杆菌基因组产生的T7 RNA聚合酶利于插入基因的大量表达。特别地，当在孵育3小时后加入IPTG底物时，lacI基因产生的Lac阻遏物与IPTG的结合不阻遏T7 RNA聚合酶的表达，从而使蛋白质大量合成。为了选择完全转化体，构建包含氨苄青霉素抗性基因的pKEP3，氨苄青霉素可被用于培养基中作为一种选择标记。将编码Erwinia pyrifoliaeWT # 3的植物HR诱导蛋白的基因及重组蛋白表达系统的质粒以限制性核酸内切酶NdeI和BamHI于37℃消化12小时以产生同样的5′-和3′-末端。然而利用DNA连接酶于14℃经过16小时将它们连接到限制位点，并采用CaCl2转化法转移到大肠杆菌中。
pKEP3具有许多优点：(1)氨苄青霉素抗性基因可用作选择标记，(2)它拥有His标签，使其更易于纯化，(3)它拥有T7 Lac强启动子，可保证由连接的插入DNA产生大量蛋白质。
包含表达载体pKEP3的大肠杆菌转化体于2001年6月11日在韩国微生物保藏中心保藏，保藏号为KCCM 10282。
在本发明中，采用同样的重组蛋白表达系统(Novagen，Inc.，Madison，WI 53711，USA)克隆解淀粉欧文氏菌ATCC15580T中的hrpN基因，并用作pKEP3的生物学检测的对照，pKEP3包含来自Erwinia pyrifoliaeWT # 3的新植物HR诱导基因。
3)植物HR诱导蛋白的表达
为了从包含pKEP3的大肠杆菌转化体(KCCM 10282)产生大量蛋白质，将细菌细胞接种于LB培养基中，并通过加入氨苄青霉素(50ug/ml)作为选择标记以及加入氯霉素(33ug/ml)以抑制大肠杆菌基因组产生的其它蛋白质的合成，并于37℃继代培养12小时。然后利用同样的培养基将本发明的细菌转化体(KCCM 10282)于30℃培养7小时，在培养约3小时后转化体(KCCM 10282)的OD值达到0.6时，在培养物中加入0.4mM IPTG并冷却到30℃，然后再培养4小时。在总共培养7小时后，将混合物于6000rpm离心15分钟。然后弃去上清液并以包含5mM MES缓冲液及0.1mM PMSF的溶液悬浮沉淀。以超声波法裂解转化体(KCCM 10282)的悬浮液直到悬浮液变得透明，然后于100℃煮沸10分钟。然后，将混合物于15,000rpm离心10分钟并弃掉上清液。在以1/1000的比率加入蛋白质抑制剂混合物后，以0.45um的滤膜过滤混合物并精确称量蛋白质。
经过上述处理后，从编码Erwinia pyrifoliaeWT # 3植物HR诱导基因(KCCM 10282)的转化体产生的植物HR诱导蛋白被命名为“Pioneer。”
根据本发明，采用同样的重组蛋白表达系统(Novagen，Inc.Madison，WI53711 USA)克隆解淀粉欧文氏菌ATCC15580T中的hrpN基因，并作为Pioneer的生物测定的对照。
如图12所示，证明了采用重组体蛋白表达系统，编码植物HR诱导蛋白的基因Erwinia pyrifoliaeWT # 3和解淀粉欧文氏菌ATCC15580T都成功得到了表达并合成了大量植物HR诱导蛋白。
4)植物HR诱导蛋白(Pioneer)的相似性分析
通过分析纯化Pioneer的氨基酸序列比较Pioneer与解淀粉欧文氏菌中HR诱导蛋白的相似性[图13]。
结果，注意到Pioneer的蛋白质新结构域产生于N末端位点76-79(Thr-Gly-Leu-Leu)，88-92(Leu-Gly-Gly-Gly-Ser)，102-113(Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Ser-Thr)，和131-137(Gly-Ala-Thr-Val-Gly-Thr-Ser)处。
Pioneer具有与HrpN 85.9％同源的低氨基酸序列一致性。Pioneer的分子量为41.4kD，与此比较的HrpN为39.7kD。Pioneer和HrpN的分子量都没有在丙烯酰胺凝胶中与分子量标准比较，而是采用Winstar程序从基因的核苷酸序列推测的每个氨基酸的分子量。
因此，Pioneer由于新肽域的插入而成为新型蛋白质，预期这样的差异会导致许多改进的生物学活性，这在HrpN中没有。
5)植物HR诱导蛋白(Pioneer)的过敏反应
直到最近，植物HR诱导蛋白被认为是宿主植物中的致病因子，但诱导非宿主植物中的HR。
采用注射器将来源于Erwinia pyrifoliaeWT # 3的Pioneer及来源于解淀粉欧文氏菌ATCC15580T的HrpN接种于烟草(非宿主植物)叶片上，并同时接种MES缓冲液(蛋白质裂解缓冲液)以作为对照[图14]。
如图14所示，很显然，Pioneer和HrpN分别于10ug/ml和20ug/ml的剂量在烟草叶正面表现出明显的HR，在同一烟草叶片背面，Pioneer和HrpN分别于5ug/ml和10ug/ml的剂量表现出明显的HR。这反应了Pioneer可在比HrpN相对低的浓度诱导HR。
如下列表4所示，表明当Pioneer以5ug/ml和10ug/ml接种时，分别于接种后24小时和14小时观察到明显的HR，然而HrpN在同样浓度下分别于接种后48小时和18小时诱导明显的HR。这表明在5ug/ml时Pioneer表现出HR比HrpN快24小时，而在10μg/ml时Pioneer表现出HR比HrpN快4小时。
该实验重复进行3次，结果表明，Pioneer在比HrpN更低的剂量比HrpN更快地诱导植物免疫系统。
表4：
6)植物HR诱导蛋白(Pioneer)对梨的致病性试验
将纯化的Pioneer以500ug/ml的剂量通过打洞(直径0.5mm，深10mm)接种到未成熟果实的表面。
如图15所示，与对照相比，处理后4天，未成熟果实作为进行性症状变黑。因此，尽管还需进一步研究，Pioneer可能对梨具有强致病性。
如上所述，Pioneer及其编码基因的特性可总结如下：
(1)编码Pioneer的基因显示出几个新核苷酸序列片段插入到Pioneer基因的几个位点中，这在hrpN基因中没有发现；Pioneer基因的大小为1287bp，与之对比的hrpN基因大小为1212bp。
(2)在蛋白质结构上，具新肽域的Pioneer的分子量(41.4KD)比HrpN(39.7KD)的大[Pioneer和HrpN的分子量都没有在丙烯酰胺凝胶中与分子量标准比较，而是采用Winstar程序从基因的核苷酸序列推测其每个氨基酸的分子量]。
(3)在烟草叶上所观察的HR中，注意到Pioneer可以以比HrpN更低的剂量比HrpN更快地诱导植物免疫系统。
因此，很显然Pioneer比解淀粉欧文氏菌中的HrpN更适合于开发更好的、诱导优良HR的生物农药。
实施例3：使用植物HR诱导蛋白(Pioneer)进行的生物学活性
研究
1)对黄瓜白粉病(Sphaerotheca fuliginea)的防治效果
为了评估Pioneer对白粉病的防治效果，将编码植物HR诱导蛋白的基因克隆到pKEP3载体中以纯化该蛋白质。
采用在农场中盛行的常规“rain-protecting”(遮雨)方法栽培黄瓜。基于3次重复随机化完全区组设计，施用测试材料。以HR诱导蛋白Pioneer，按EDEN Bioscience公司的推荐剂量以20μg/ml处理黄瓜的茎和叶。
以同上剂量的EDEN Bioscience公司之作为对照，同时还按使用说明施用本地生产的Fenarimol(化学农药)作比较。处理方法如下：
(1)3次处理：在白粉病(Sphaerotheca fuliginea)的早期阶段以后，用Pioneer、
及Fenarimol向黄瓜的茎和叶喷雾3次，每次间隔10天。
(2)4次处理：在移植后的第7、21、35和49天，用Pioneer、
和Fenarimol向黄瓜的茎和叶喷雾3次。
在处理后7天，基于下列标准(0：没发病；1：1-5％；2：5.1-20％；3：20.1-40％；4：大于40％)衡量黄瓜从上部8叶到底部3叶的白粉病严重程度。
表5
如表5所示，预期Pioneer可用作优良的农药，因为3次和4次处理表现出其与
相比在防治效果上增加了122.6％和l87.0％。
2)增加黄瓜产量
为了确定Pioneer处理对黄瓜的增产效果，从移植前7天开始，以20μg/ml剂量的Pioneer处理黄瓜的茎和叶5次，每次间隔14天。此外，用对照HrpN按上述同样剂量处理黄瓜的茎和叶。
用于本实验的黄瓜于移植后第8、10、12、14、16、18、21、23、25和30天收获。以黄瓜长度达20cm时可被出售作为判定标准，以可销售率将结果显示如下：
表6
| 处理 | 第8天 | 第10天 | 第12天 | 第14天 | 第16天 | 第18天 | 第21天 | 第23天 | 第25天 |
| Pioneer | ＊27/31 | 19/27 | 13/15 | 14/25 | 12/17 | 11/14 | 26/27 | 16/22 | 21/22 |
| HrpN | 23/31 | 10/21 | 16/16 | 23/31 | 12/16 | 3/8 | 21/27 | 9/9 | 22/28 |
| 未处理 | 17/25 | 10/18 | 12/15 | 17/23 | 6/9 | 7/13 | 16/20 | 17/19 | 16/20 |
| 处理 | 第30天 | 可销售率(％) | 产量的增加，Pioneer比未处理(％) | 产量的增加，Pioneer比HrpN(％) |
| Pioneer | 16/25 | 77.8 | 8.1 | 4.6 |
| HrpN | 18/24 | 74.4 | 3.3 | - |
| 末处理 | 13/20 | 72.0 | - | - |
＊注：可销售果实/总果实
根据上表，显然，与没经处理的相比，经Pioneer处理后可销售率增加了8.1％；与经HrpN处理的相比增加了4.6％。
因此，Pioneer比HrpN能更有效地用作植物生长促进剂和肥料。
3)增加黄瓜光合作用和叶绿素含量
为了确定黄瓜的生理反应，即在以Pioneer处理后，黄瓜光合作用和叶绿素含量的增加，从移植前7天开始，以20此/ml剂量的Pioneer处理黄瓜的茎和叶5次，每次间隔14天。以对照HrpN按上述同样剂量处理黄瓜的茎和叶。
用于本实验的黄瓜于移植后第34、42和56天收获，并使用便携式光合测定仪(LCA-4系统，ADC BioScientific Ltd.，UNK；光源：1,500μmole)和叶绿素测定仪(Chlorophyll meter SPAD-502，Minolta，日本)进行测定。
表7
＊注：P，光合作用量；C，叶绿素含量
根据上表，显然，与没经处理的相比，黄瓜经Pioneer处理后，光合作用和叶绿素的量分别增加了16.2％和5.4％；与HrpN相比，分别增加了9.8％和2.0％。
因此，Pioneer比HrpN能更有效地用作植物生长促进剂和肥料。
4)对胡椒枯萎病(Phytophthora capsici)的防治效果
为了评估Pioneer对胡椒枯萎病(Phytophthora capsici)的防治效果，将编码植物HR诱导蛋白的基因克隆到pKEP3载体中以纯化该蛋白质。采用在农场中盛行的常规“open field culture(露地栽培法)”方法栽培胡椒。以10、20和40μg/ml剂量的Pioneer处理胡椒的茎和叶。以对照HrpN按上述同样剂量处理胡椒的茎和叶。处理按如下进行：
①在移植后第8天和第12天的间隔，以各自浓度的Pioneer和HrpN处理胡椒的茎和叶。以Phytophthora capsici(2×106个细胞/ml)接种经如此处理的胡椒，在处理后63天测定其疾病严重程度。
表8
如表8所示，显然，Pioneer(10μg/ml)比HrpN(40μg/ml)表现出更好的防治效果。
因此，Pioneer比HrpN蛋白质能以更低的剂量有效地用作农药。
5)对胡椒炭疽病(Colletotrichum orbiculare)的防治效果
为了评估Pioneer对胡椒炭疽病(Colletotrichum orbiculare)的防治效果，将编码植物HR诱导蛋白的基因克隆到pKEP3载体中以纯化此蛋白。采用在农场中盛行的常规“露地栽培”方法栽培胡椒。从处理前7天开始，在移植后第14天，以10μg/ml剂量的Pioneer处理胡椒的茎和叶5次。以对照HrpN按上述同样剂量处理胡椒的茎和叶。处理按如下进行：
①在移植后第8天和第12天，以各自浓度的Pioneer和HrpN处理胡椒的茎和叶。在移植后的第20、27、34和40天，经这样处理后的移植的胡椒表现为健康和不健康的果实。
表9
| 处理 | 第20天健康/不健康 | 第27天健康/不健康 | 第34天健康/不健康 | 第40天健康/不健康 | 果实感染比率(％) | 防治效果(％) | 防治效果的增加；Pioneer对HrpN(％) |
| Pioneer | 8/4 | 9/3 | 10/6 | 5/2 | 31.9 | 52.8 | 14.3 |
| HrpN | 5/3 | 7/4 | 8/5 | 8/4 | 36.4 | 46.2 | - |
| 未处理 | 3/5 | 2/6 | 4/6 | 2/6 | 67.6 | - | - |
如表9所示，Pioneer比HrpN表现出对胡椒炭疽病有高14.3％的更好防治效果。因此，Pioneer比HrpN能更有效地用作农药。
6)增加胡椒产量
为了确定Pioneer处理对胡椒的增产作用，在移植后第8和12天，以10μg/ml剂量的Pioneer喷雾胡椒的茎和叶5次。以对照HrpN按同样剂量处理胡椒的茎和叶。处理按如下进行：
①浸泡加喷雾方法：于28℃将胡椒种子浸泡到10μg/ml剂量的Pioneer和HrpN中24小时。然后将这些胡椒种子播种到装有土壤的盆中，生长46天后移植到露地。在移植后第8和12天，以Pioneer和HrpN蛋白质喷雾胡椒的茎和叶。本试验的胡椒在移植后第18、25、32、39和46天收获。
表10
| 处理 | 第18天 | 第25天 | 第32天 | 第39天 | 第46天 | 总计 | 产量的增加；Pioneer比未处理(％) | 产量的增加；Pioneer比HrpN(％) |
| Pioneer浸泡和喷雾 | 19 | 12 | 21 | 16 | 24 | 92 | 84.0 | 22.7 |
| HrpN浸泡和喷雾 | 16 | 12 | 16 | 10 | 21 | 75 | 50.0 | |
| 未处理 | 10 | 9 | 13 | 9 | 9 | 50 | - |
如表10所示，显然，Pioneer表现出比HrpN增产22.7％。因此，Pioneer比HrpN能更有效地用作植物生长促进剂和肥料。
7)增加胡椒光合作用和叶绿素含量
为了确定胡椒的生理反应，即在以Pioneer处理后，胡椒光合作用和叶绿素含量的增加，从处理前7天开始，以20μg/ml剂量的Pioneer处理胡椒的茎和叶5次，每次间隔14天。以对照HrpN按上述同样剂量处理胡椒的茎和叶。
本实验的胡椒于移植后第34、42和56天收获，并使用便携式光合测定仪(LCA-4系统，ADC BioScientific Ltd.，UNK；光源：1,500μmole)和叶绿素测定仪(Chlorophyll meter SPAD-502，Minolta，Japan)进行测定。
表11
＊注：P，光合作用量；C，叶绿素含量
根据上表，显然，与没经处理的相比，胡椒经Pioneer处理后，光合作用和叶绿素含量分别增加了16.0％和6.7％；与HrpN相比，分别增加了7.5％和4.9％。
因此，Pioneer比HrpN能更有效地用作植物生长促进剂和肥料。
8)对甜瓜霜霉病(Pseudoperonospora cubensis)的防治效果
为了评估Pioneer对甜瓜(Oriental melon)霜霉病(Pseudoperonospora cubensis)的防治效果，将编码植物HR诱导蛋白的基因克隆到pKEP3载体中以纯化该蛋白。以40μg/ml剂量的Pioneer处理甜瓜的茎和叶5次。以对照HrpN按上述同样剂量处理甜瓜的茎和叶。处理按如下进行：
①浸泡加喷雾方法：将甜瓜种子浸泡到10μg/ml剂量的Pioneer和HrpN中24小时。然后将这些种子播种到盆中。在移植后第17和28天，以Pioneer和HrpN处理甜瓜的茎和叶。
②喷雾方法：在移植后第17和28天，以Pioneer和HrpN处理甜瓜的茎和叶。
在处理后55天测定霜霉病严重程度。
表12
| 处理 | 0 | 较小 | 中等 | 严重 | 最严重 | 疾病严重程度(％) | 防治效果(％) | 防治效果的增加；Pioneer对HrpN(％) |
| 喷雾Pioneer | 17 | 13 | 7 | 3 | 2 | 16.1 | 68.6 | 96.0 |
| Pioneer浸泡加喷雾 | 18 | 14 | 5 | 5 | 0 | 12.5 | 75.6 | 44.6 |
| 喷雾HrpN | 13 | 8 | 7 | 9 | 5 | 33.3 | 35.0 | - |
| HrpN浸泡加喷雾 | 13 | 12 | 10 | 6 | 1 | 24.2 | 523 | - |
| 未处理 | 1 | 9 | 14 | 14 | 4 | 51.2 | - | - |
如表12所示，显然，喷雾及浸泡加喷雾Pioneer分别表现出比HrpN高96.0％和44.6％的更好防治效果。因此，Pioneer比HrpN能更有效地用作农药。
9)对甜椒枯萎病(Phytophthora capsici)的防治效果
为了评估Pioneer对甜椒(Sweet peppers)枯萎病(Phytophthoracapsici)的防治效果，将编码植物HR诱导蛋白的基因克隆到pKEP3载体中以纯化该蛋白。
将甜椒移植到25cm的盆中并栽培于温室。按EDEN Bioscience公司推荐的剂量，以20μg/ml剂量的Pioneer处理甜椒的茎和叶。以对照HrpN按同样剂量处理甜椒的茎和叶。处理按如下进行：
①在移植后第8天，以Pioneer和HrpN处理甜椒的茎和叶。以Phytophthora capsici(2×106个细胞/ml)接种如此处理的甜椒，在处理后45天测定疾病严重程度。
表13
| 处理 | 0 | 较小 | 中等 | 严重 | 最严重 | 疾病严重程度(％) | 防治效果(％) | 防治效果的增加；Pioneer对HrpN(％) |
| Pioneer | 6 | 16 | 6 | 0 | 0 | 25.0 | 63.8 | 87.1 |
| HrpN | 0 | 12 | 9 | 7 | 0 | 45.5 | 34.1 | - |
| 未处理 | 0 | 1 | 11 | 11 | 6 | 69.0 | - | - |
如表13所示，显然，Pioneer表现出比HrpN高87.1％的更好防治效果。
因此，Pioneer比HrpN能更有效地用作农药。
10)增加甜椒产量
为了确定Pioneer处理对甜椒的增产效果，从移植后8天，以40μg/ml剂量的Pioneer处理甜椒的茎和叶。以对照HrpN按同样剂量处理甜椒的茎和叶。
将甜椒移植到25cm的盆中并栽培于温室。对经这样处理后的甜椒，在移植后第41和45天进行调查。
表14
| 处理 | 第41天(ea) | 第45天(ea) | 总计(ea) | 产量的增加；Pioneer比未处理(％) | 产量的增加；Pioneer比HrpN(％) |
| Pioneer | 42 | 48 | 90 | 69.8 | 21.6 |
| HrpN | 30 | 44 | 74 | 39.6 | - |
| 未处理 | 27 | 26 | 53 | - | - |
如表14所示，显然，Pioneer比HrpN对甜椒表现出高21.6％的增产效果。
因此，Pioneer比HrpN能更有效地用作植物生长促进剂和肥料。
11)提高草莓产量
为了确定Pioneer处理对草莓的增产效果，以20μg/ml剂量的Pioneer处理栽培在温室中的草莓的茎和叶。用对照HrpN按同样剂量处理草莓的茎和叶。
在移植后第30、33、38、41、48和55天，收获草莓并以总重量值(g)表示。
表15
| 处理 | 第30天(g) | 第33天(g) | 第38天(g) | 第41天(g) | 第48天(g) | 第56天(g) | 平均 | 产量的增加；Pioneer比未处理(％) | 产量的增加；Pioneer比HrpN(％) |
| Pioneer | 348.0 | 139.9 | 316.0 | 195.9 | 279.1 | 0 | 213.2 | 21.1 | 13.8 |
| HrpN | 418.7 | 224.0 | 242.1 | 83.2 | 150.6 | 5.32 | 187.3 | 6.4 | - |
| 未处理 | 408.9 | 220.7 | 251.8 | 82.1 | 92.8 | 0 | 176.1 | - | - |
如表14所示，显然，Pioneer对草莓表现出比HrpN高13.8％的增产效果。
因此，Pioneer比HrpN能更有效地用作植物生长促进剂和肥料。
12)对水稻叶枯病(Magnaporthe grisea)的防治效果
为了评估Pioneer对水稻叶枯病(Magnaporthe grisea)的防治效果，将编码植物HR诱导蛋白的基因克隆到pKEP3载体中以纯化此蛋白。
采用在农场中盛行的常规“open field culture”方法栽培水稻。以10μg/ml剂量的Pioneer处理水稻的茎和叶，并于28℃浸泡24小时。将水稻种子播种于苗床，生长16天后移栽到测试圃。
然后，在第45和52天以Pioneer喷雾水稻的茎和叶。以对照HrpN按同样剂量和前述方法处理水稻的茎和叶。在处理后85天测定疾病严重程度。
表16
如表16所示，显然，Pioneer(10μg/ml)比HrpN(20μg/ml)表现出更好的防治效果。
因此，Pioneer比HrpN能以更低的剂量更有效地用作农药。
13)驱蚜虫效果
为了评估Pioneer对蚜虫的驱虫效果，将编码植物HR诱导蛋白的基因克隆到pKEP3载体中以纯化此蛋白。
选择黄瓜作为蚜虫的宿主植物。
采用在农场中盛行的常规“遮雨”方法栽培黄瓜。以20μg/ml剂量的Pioneer处理黄瓜的茎和叶。以对照HrpN按同样剂量处理黄瓜的茎和叶。
当黄瓜的高度达到1m时，以Pioneer和HrpN处理黄瓜的茎和叶。在处理后7天，计算黄瓜上自然出现的蚜虫数量。
表17
如表17所示，显然，Pioneer比HrpN以低剂量产生高29.4％的更好驱蚜虫效果。
因此，Pioneer比HrpN能更有效地用作驱虫剂。
14)在水稻育苗期促进生长的效果
为了确定Pioneer处理在水稻育苗期对生长的促进效果，将编码植物HR诱导蛋白的基因克隆到pKEP3载体中以纯化此蛋白质。
以稀释在MES缓冲液中的10、20和40μg/ml剂量的Pioneer处理水稻的茎和叶，并于28℃浸泡24小时。将水稻种子播种于苗床，生长16天后移栽到测试圃。以对照HrpN按同样剂量和前述方法处理水稻的茎和叶。
结果，观察到以Pioneer处理时水稻育苗期生长更好，比未处理的高约3-4cm，比HrpN处理的高1cm。
更高剂量(40μg/ml)的Pioneer对更好地促进水稻生长是必需的。因此，Pioneer比HrpN能更有效地用作可促进水稻种子生长的种子处理剂。
工业实用性
如上所述，根据本发明的新Erwinia pyrifoliaeWT # 3(KCCM10283)得到了分离和鉴定，从此菌株的植物HR诱导基因(KCCM10282)翻译而来的新蛋白质(Pioneer)或多肽比来源于解淀粉欧文氏菌ATCC15580T中的HrpN在诱导植物抗性、促进植物生长、驱昆虫效果、提高光合作用和增加叶绿素含量及种子处理效果方面具有改进的特性。前者比HrpN可以以更低剂量、更快地易于引起植物过敏反应，因此，来源于Erwinia pyrifoliae WT # 3(KCCM 10283)的此蛋白质十分适合于开发新型及更好的诱导植物过敏反应的生物农药。
因此，本发明在开发新型和改良的生物农药和肥料上具有优势。
序列表
<110>Pioneer Co.，Ltd.
<120>利用来源于感染亚洲梨树之新病原体Erwinia pyrifoliae WT # 3的基因的新生物
杀虫剂
<150>KR2001-0049047
<151>2001-08-14
<160>6
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>fD1引物
<400>1
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>rP2引物
<400>2
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>R16-1F引物
<400>3
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>R23-1R引物
<400>4
<210>5
<211>1287
<212>DNA
<213>Erwinia pyrifoliae WT # 3
<400>5
<210>6
<211>429
<212>PRT
<213>Erwinia pyrifoliae WT # 3
<400>6
Claims (17)
1.保藏号为KCCM 10283的欧文氏菌病原体Erwiniapyrifoliae WT # 3。
2.其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的基因。
3.编码其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的蛋白质或多肽的基因。
4.根据权利要求2的基因，其中所述核苷酸序列来自保藏号为KCCM 10283的Erwinia pyrifoliae WT # 3。
5.包含根据权利要求2的基因的重组表达载体。
6.包含根据权利要求2的基因的转化体。
7.根据权利要求6的转化体，其中所述转化体选自由细菌和植物组成的组。
8.非感染形式的蛋白质或多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示且其在与植物细胞接触时诱导植物中对病原体的抗性或过敏反应。
9.根据权利要求8的蛋白质或多肽，其中所述氨基酸序列来自保藏号为KCCM 10283的Erwinia pyrifoliae WT # 3。
10.根据权利要求8的蛋白质或多肽，其中所述蛋白质或多肽为重组体。
11.包含根据权利要求8或9的所述蛋白质或多肽和载体的生物农药组合物。
12.利用根据权利要求8或9的所述蛋白质或多肽及载体的农药。
13.利用根据权利要求8或9的蛋白质或多肽及载体的植物生长促进剂。
14.利用根据权利要求8或9的所述蛋白质或多肽及载体的种子处理剂。
15.利用根据权利要求8或9的所述蛋白质或多肽及载体的驱昆虫剂。
16.利用根据权利要求8或9的所述蛋白质或多肽及载体的肥料。
17.通过从保藏号为KCCM 10283的Erwinia pyrifoliae WT # 3的培养物中及从包含来源于保藏号为KCCM 10283的Erwiniapyrifoliae WT # 3的菌株KCCM 10282之植物过敏反应诱导基因的转化体中分离或纯化诱导过敏反应或抗性的蛋白质或多肽，从而大规模生产该蛋白质或多肽的方法。
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| Molecular characterization and expression of the Erwiniacarotovora hrpNEcc gene,which encodes an elicitor of thehypersensitive reaction.. Mukherjee A.Mol Plant Microbe Interact,Vol.10 No.4. 1997 |
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