CN100491536C - 氧化还原电势调控厌氧发酵生产1，3-丙二醇方法 - Google Patents
氧化还原电势调控厌氧发酵生产1，3-丙二醇方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了属于化工原料的生物制备技术范围的一种氧化还原电势调控厌氧发酵生产1，3-丙二醇方法。它根据Klebsiella pneumoniae发酵生产1，3-PD性厌氧的特性，在发酵体系中引入了ORP电极。具体工艺过程包括菌种活化、种子培养和ORP调控下的两段双底物集成发酵过渡过程而得到细胞干重最高达到2.13g/L，1，3-PD达到45.1g/L，主要副产物为乙酸、乙醇和乳酸的好结果。本发明在与其它工艺同等生产水平时，生产时间缩短，对发酵体系的控制更加及时和精确，提高目标产物1，3-PD产量和产品的浓度、缩短发酵时间、降低发酵成本。
Description
技术领域
本发明属于化工原料的生物制备技术范围，特别涉及一种氧化还原电势(ORP)调控厌氧发酵生产1，3-丙二醇方法。
背景技术
1，3-丙二醇(1，3-propanediol，1，3-PD)是一种重要的化工原料，除象其他二元醇一样除用做溶剂外，主要用做合成聚酯、聚氨酯的单体，以1，3-PD为单体生产的聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)是一种新型聚酯材料，具有易染色、弹性好、优良的柔软性、悬垂性、低静电、可生物降解等优点，主要用于生产纤维和纺织品，如地毯、袜裤、运动服等。PTT是目前合成纤维新品种开发的热点，由于其优良的特性，成为继PET、PBT后的又一种新型聚酯材料。据Shell公司预测，到2010年，包括非纤维应用在内的全球PTT需求量将达到一百万吨/年。另外，1，3-PD还可以用来合成清洁剂稳定剂、耐热容器、耐磨涂料、喷墨打印机墨水、光稳定聚酯、含酚树脂等。
目前，工业上主要采用化学法合成1，3-PD，包括丙烯醛水合法、环氧乙烷法、环氧丙烷法等，其中德国Degussa公司的丙烯醛水合法、美国Shell公司的环氧乙烷法已投入工业化生产。化学合成法具有设备投资大、技术难度高、需要重金属催化剂、污染环境、原料不可再生等缺点，因此，各国都致力于开发生物法生产1，3-PD的技术。
生物合成法的主要路线是在生物催化的作用下将甘油转化为1，3-PD。目前，自然界中能将甘油转化为1，3-PD的微生物有：Klebsiella、Citrobacter、Clostridium、Ilyobacter、Lactobacillus、Enterobatcer，其中研究最多的是Klebsiella pneumoniae(肺炎克氏杆菌)、Citrobacter freundii(弗氏柠檬菌)和Clostridium butyricum(丁酸梭状芽孢菌)。肺炎克氏杆菌、丁酸梭状芽孢菌比弗氏柠檬菌具有较高的甘油耐受力，发酵速度较快。克氏肺炎杆菌与弗氏柠檬菌属于兼性厌氧菌，而丁酸梭状芽孢杆菌为严格厌氧菌。
Biebl H，等人在文献“production of 1，3-propanediol Appl MicrobiolBiotechnol 1999，52：289-297”中研究表明，甘油在微生物体内的厌氧过程主要有两条基本代谢途径：氧化途径和还原途径。氧化途径主要包括步骤：1)甘油经甘油脱氢酶(GDH)催化，生成2-羟基丙酮(DHA)，此酶为厌氧酶，以NAD+为辅酶；2)DHA在ATP及2-羟基丙酮激酶的作用下，生成磷酸二羟基丙酮(DHAP)；3)DHAP进一步代谢生成丙酮酸，然后通过乙酰CoA进入三羧酸循环或经过厌氧酵解生成其他小分子醇、酸等代谢产物。氧化途径生成生物能ATP和还原当量NADH2，并伴随着微生物细胞的生长。甘油的还原途径有两步酶反应：1)甘油脱水酶(GDHt)在辅酶B12存在下将甘油转化为中间产物3-羟基丙醛(3-HPA)；2)在NADH2存在下，3-HPA在1，3-丙二醇脱氢酶(PDDH)催化下生成1，3-PD。还原途径消耗氧化途径生成的过量NADH2，使微生物细胞内的还原物质达到平衡。
生物法生产1，3-PD目前存在产物浓度低、生产周期长和甘油转化率低等问题，导致缺乏市场竞争力而无法大规模应用。解决上述问题有两条途径，一条途径是S.Abbad-Andaloussi等人在文献“Isolation and characterization ofClostridium butyricum DSM 5431 with increased resistance to1，3-propanediol and altered production of acids，Appl.Environ.Microbiol.1995，61：4413-4417”中报导，利用菌种诱变技术和基因工程技术提高菌种的产物耐受能力和转化能力。另一条途径是Laffend，等在美国专利US6025184中报导，采用连续、补料批式、反应分离耦合等培养方式消除底物抑制和产物抑制，并对发酵过程的重要参数进行有效地调控。
为了提高1，3-PD的产量和产率，Zeng AP、杨东、Nemeth A等人在文献“Pathwayanalysis of glycerol fermentation by Klebsiella pneumoniae：regulation of reducing equivalent balance and product formation.Enzyme Microb Technol 1993，15：770-779”、杨东，李春，杜晨宇，张延平，曹竹安“两段双底物发酵生产1，3-丙二醇过程工程学报2003，3：269-273”和“1，3-propanediol oxidoreductase production with Klebsiella pneumoniaeDSM2026 World J Microb Biot.2003，19：659-663”中，各自开发了两段法生产1，3-PD的发酵工艺。Zeng AP等提出用两种菌耦合直接从葡萄糖生产1，3-PD的工艺，首先利用Osmotolerant yeast Picbia farinosa或者Escherichia coli重组菌从葡萄糖合成甘油，然后利用Klebsiella pneumoniae生产1，3-PD。其中第二个阶段1，3-PD的产率可以达到2.0gL-1h-1转化率为0.53g/g。杨东等开发了两段双底物发酵工艺，首先以葡萄糖和甘油为双底物进行好氧培养，通过控制葡萄糖和甘油的比例，使菌体只利用葡萄糖生长，通过甘油的存在诱导厌氧转化过程的相关酶。当菌体浓度达到一定浓度后，补加甘油同时通入氮气使发酵系统转入厌氧转化阶段，厌氧转化过程中通过流加甘油使甘油维持在一定范围内。1，3-PD的浓度达到50.16g L-1，产率为0.836g L-1h-1。Nemeth A等提出利用Klebsiella pneumoniae两步法发酵生产1，3-PD的工艺，通过好氧期培养，获得高浓度的菌体和甘油脱氢酶的酶活，然后转为厌氧工艺，最后得到1，3-PD的浓度为g L-1。修志龙等提出了Klebsiella pneumoniae微好氧发酵生产1，3-PD工艺，缩短了发酵周期，最终浓度，摩尔转化率和产率分别为59.50g/l，51.75％，and 1.57g L-1h-1。
目前，1，3-PD的生产都是在厌氧条件下进行的，厌氧环境的监控对发酵过程起到重要的作用。对于两段法的工艺，由一个阶段到另一个阶段的过渡过程往往决定了后一个阶段(1，3-PD生产阶段)中菌体适应的时间和1，3-PD的产量。对于微耗氧工艺，由于发酵体系中氧气的浓度比较低，用溶氧电极检测不到发酵体系中微量氧气的变化，而通过氧气阀门的流量检测氧气通入的多少会由于气体压力的波动、流量计的精度等问题，会引起较大的误差。
厌氧发酵具有悠久的历史，至今在工业生产上仍然广泛的应用在乳酸、丙酮、乙醇、甘油等化工产品的生产上。除了1，3—PD生物法生产外，厌氧、兼性厌氧发酵工艺还在废水处理、生物制氢和生物柴油等领域具有重要的研究价值。但长期以来，由于厌氧发酵过程缺少合适的发酵状态指示参数，而其发酵工艺优化一直难以进行。近期，Riondet C，等在文献“Extracellular oxidoreductionpotential modifies carbon and electron flow in Escherichia coli JBacteriol 2000，182：620-626”中报导，关于氧化还原电势(ORP，Oxidoreduction potential)研究表明，不同的菌种都有自己合适的ORP范围，在此范围内，菌体生长最快，并且，ORP会通过影响一些酶的表达，影响菌体的代谢途径，从而调整副产物的分布。
文献中1，3-PD生物法合成工艺，在由氧化过程到还原过程中，通过测定OD，确定发酵时间等方式作为判定好氧、厌氧的标准，在转入厌氧之后，对发酵体系并不进行调节，或者只是根据经验进行调控发酵体系中通入空气的流量。对于微耗氧工艺，由于发酵体系中氧气的浓度比较低，用溶氧电极检测不到发酵体系中微量氧气的变化，而通过氧气阀门的流量控制氧气通入的多少会由于气体压力的波动、流量计的精度等问题，会引起较大的误差。
发明内容
本发明的目的是提供一种氧化还原电势调控厌氧发酵生产1，3-丙二醇方法，其特征在于：根据克氏肺炎杆菌发酵生产1，3-PD性厌氧的特性，在发酵体系中引入了ORP电极，对发酵体系的ORP进行调节，并根据前期实验测定厌氧发酵过程中ORP变化的规律及ORP的影响，调控ORP以提高目标产物1，3—PD产量、缩短发酵时间为准；具体实施工艺是利用ORP调控克氏肺炎杆菌厌氧合成1，3-丙二醇工艺，其实施步骤如下：
菌种：肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)；
步骤1：菌种活化
由菌种保藏斜面挑取一环肺炎克氏杆菌菌苔接入LB固体培养基进行活化，在30—40℃下培养20—30小时后，再挑取一环菌苔接入固体LB平板，35—40℃培养24小时后获得单菌落；
步骤2：种子培养
从步骤1的LB平板上挑取一个单菌落，接入250ml摇瓶培养，装种子培养基液量50ml，在30—40℃，200rpm下，培养8—10小时；
步骤3：两段双底物集成发酵好氧过程
装有2L预先灭菌的集成发酵培养基，将步骤2的种子液接入发酵罐中，ORP电极在紫外灯下照射2小时表面灭菌，再加入电极前用酒精棉球轻轻擦洗表面，在无菌间中用无菌风吹干后，将ORP电极放入发酵罐中，好氧培养过程条件，35—40℃，400rpm，空气流量2.0L/min，以4N NaOH控制pH值为7，好氧过程在2—3小时，此时ORP为—70～+70之间，因培养基组分以及灭菌条件不同而不同；
步骤4：ORP调控下的两段双底物集成发酵过渡过程
过渡过程是指由好氧过程转为厌氧过程的初始阶段，这一阶段没有1，3—丙二醇生成，当菌体浓度(OD)达到1～2之间(即细胞干重达到0.25～0.5g/L之间)时，补加甘油至20g/L，减少空气通入量，并开始通入氮气，开始调控ORP，通入氮气后，ORP由初始迅速下降到—400mV以下，按体积比调节空气和氮气的比例(1～20):(20～1)和总流量0.05-6L/min，使得ORP稳定到—350mV；过渡过程工艺条件：35—40℃，400rpm，以4N NaOH控制pH值为7，过渡过程时间为4—7小时；
步骤5：多次ORP调控下的两段双底物集成发酵厌氧转化过程
厌氧转化过程指开始1，3—丙二醇生成的过程。转化过程工艺条件：35—37℃，400rpm，在发酵体系中通入氮气约2.0L/min，同时通入空气或同时滴加过氧化氢溶液，控制通入发酵体系中的按体积比调节空气和氮气的比例(1～20):(20～1)和总流量0.05-6L/min，分别在发酵的不同时间调节ORP在—370mV、—450mV、—400mV的三个不同条件，在转化过程中，当甘油浓度低于15g/L时，向发酵罐中补加甘油至20g/L，从而使发酵液中甘油浓度维持在15—25g/L的范围内，以4N NaOH控制pH值为7，将ORP恒定在—400mV的两段双底物集成发酵工艺中，生产周期为80小时，细胞干重最高达到2.53g/L，1，3-PD达到45.2g/L，主要副产物为乙酸、乙醇和乳酸。
所述流加补料过氧化氢：过氧化氢溶液浓度为0.5-3％的H2O2，由30％的H2O2经过稀释得到，在4℃冰箱遮光保存，实验时遮光并放在冰水浴中。
本发明的效果是通过ORP电极的监测、调控，可以很好控制两阶段过程的变化，使得菌体在从耗氧阶段进入到厌氧阶段的过渡过程中，保持较高的比生长速率。同时，以厌氧发酵过程中ORP作为重要参数，可以调节厌氧发酵过程中氧化还原途径的进行程度，从而调控的厌氧氧化途径和还原途径很好的耦合起来，提高发酵体系的氧化还原效率，提高1，3-PD的产量和产率。本发明采用ORP电极测定1，3-PD发酵体系的氧化还原电位，并利用氧化还原电位监控发酵体系的变化，具有重要的理论意义和应用价值。
附图说明
图1为ORP调控(多级调控)的两阶段双底物集成发酵过程菌体生长曲线和ORP变化曲线以及产物1，3—丙二醇积累曲线。
图2为ORP调控(-400mV)的两阶段双底物集成发酵过程菌体生长曲线和ORP变化曲线以及产物1，3—丙二醇积累曲线。
图3为ORP调控(-370mV)的两阶段双底物集成发酵过程菌体生长曲线和ORP变化曲线以及产物1，3—丙二醇积累曲线。
具体实施方式
本发明提供利用氧化还原电势进行调节的一种氧化还原电势调控厌氧发酵生产1，3-丙二醇方法。根据克氏肺炎杆菌发酵生产1，3-PD性厌氧的特性，在发酵体系中引入了ORP电极，根据前期实验测定厌氧发酵过程中ORP变化的规律及ORP的影响，调控ORP以提高目标产物1，3—PD产量、缩短发酵时间为准。具体实施工艺是利用ORP调控克氏肺炎杆菌厌氧合成1，3-丙二醇工艺，其实施步骤如下：
菌种：肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)；
步骤1：菌种活化
由菌种保藏斜面挑取一环肺炎克氏杆菌菌苔接入LB固体培养基进行活化，在30—40℃下培养20—30小时后，再挑取一环菌苔接入固体LB平板，35—40℃培养24小时后获得单菌落；
步骤2：种子培养
从步骤1的LB平板上挑取一个单菌落，接入250ml摇瓶培养，装种子培养基液量50ml，在30—40℃，200rpm下，培养8—10小时；
步骤3：两段双底物集成发酵好氧过程
装有2L预先灭菌的集成发酵培养基，将步骤2的种子液接入发酵罐中，ORP电极在紫外灯下照射2小时表面灭菌，再加入电极前用酒精棉球轻轻擦洗表面，在无菌间中用无菌风吹干后，将ORP电极放入发酵罐中，好氧培养过程条件，35—40℃，400rpm，空气流量2.0L/min，以4N NaOH控制pH值为7，好氧过程在2—3小时，此时ORP为—70～+70之间，因培养基组分以及灭菌条件不同而不同；
步骤4：ORP调控下的两段双底物集成发酵过渡过程
过渡过程是指由好氧过程转为厌氧过程的初始阶段，这一阶段没有1，3—丙二醇生成。当菌体浓度(OD)达到1～2之间(即细胞干重达到0.25～0.5g/L之间)时，补加甘油至20g/L，减少空气通入量，并开始通入氮气，开始调控ORP，通入氮气后，ORP由初始迅速下降到—400mV以下，按体积比调节空气和氮气的比例(1～20):(20～1)和总流量0.05-6L/min，使得ORP稳定到—350mV；过渡过程工艺条件：35—40℃，400rpm，以4N NaOH控制pH值为7，过渡过程时间为4—7小时；
步骤5：多次ORP调控下的两段双底物集成发酵厌氧转化过程
厌氧转化过程指开始1，3—丙二醇生成的过程。转化过程工艺条件：35—37℃，400rpm。在发酵体系中通入氮气约2.0L/min，同时通入空气或同时滴加过氧化氢溶液，控制通入发酵体系中的按体积比调节空气和氮气的比例(1～20):(20～1)和总流量0.05-6L/min，分别在发酵的不同时间调节ORP在—370mV、—450mV、—400mV的三个不同条件，在转化过程中，当甘油浓度低于15g/L时，向发酵罐中补加甘油至20g/L，从而使发酵液中甘油浓度维持在15—25g/L的范围内，以4N NaOH控制pH值为7，将ORP恒定在—400mV的两段双底物集成发酵工艺中，生产周期为80小时，细胞干重最高达到2.53g/L，1，3-PD达到45.2g/L，主要副产物为乙酸、乙醇和乳酸。
所述流加补料过氧化氢：过氧化氢溶液浓度为0.5-3％的H2O2。由30％的H2O2经过稀释得到，在4℃冰箱遮光保存。实验时遮光并放在冰水浴中。
所述LB固体培养基：每升体积培养基含酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl10.0g，琼脂18.0g，pH7.0。
所述种子培养基：每升体积培养基含葡萄糖20g，K2HPO4·3H2O 4.45g，KH2PO4，1.3g，(NH4)2SO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCO3 2.0g，酵母粉1.0g，微量元素溶液I2.0ml，Fe2+溶液(5gL-1FeSO4·7H2O加入4ml HCl(37％))1.0ml，pH7.0。本专利中所述微量元素溶液I的组成如下：MnSO4·4H2O 100mg/L，ZnCl270mg/L，Na2MoO4·2H2O 35mg/L，H3BO360mg/L，CoCl2·6H2O 200mg/L，CuSO4·5H2O29.28mg/L，NiCl2·6H2O 25mg/L，37％HCl 0.9ml/L。
所述发酵培养基：每升体积培养基含葡萄糖2.5g，甘油2.5g，K2HPO4·3H2O4.45g，KH2PO4，1.3g，(NH4)2SO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2·2H2O 0.02g/L，酵母粉1.0g，微量元素溶液I2.0ml，Fe2+溶液1.0ml(5gL-1FeSO4·7H2O加入4mlHCl(37％)，pH7.0。
下面例举具体实验对本发明予以进一步说明。
实验过程一
步骤1：菌种活化
由菌种保藏斜面挑取一环肺炎克氏杆菌菌苔接入LB固体斜面进行活化，37℃培养24小时后，再挑取一环菌苔接入固体LB平板，37℃培养24小时后获得单菌落。
步骤2：种子培养
从步骤1的LB平板上挑取一个单菌落，接入250ml摇瓶培养，装液量50ml，37℃，200rpm，培养8—10h。
步骤3：两段双底物集成发酵好氧过程
在实验装置内，装有2L预先灭菌的集成发酵培养基，将步骤2的种子液接入发酵罐中。ORP电极在紫外灯下照射2h表面灭菌，再加入电极前用酒精棉球轻轻擦洗表面，在无菌间中用无菌风吹干后，将ORP电极放入发酵罐中。好氧培养过程条件，37℃，400rpm，空气流量2.0L/min，以4N NaOH控制pH为7.0±0.5。好氧过程在2—3小时。此时ORP为—70～+170之间，因培养基组分以及灭菌条件不同而不同。
步骤4：ORP调控下的两段双底物集成发酵过渡过程
过渡过程是指由好氧过程转为厌氧过程的初始阶段，这一阶段没有1，3—丙二醇生成。当菌体浓度(OD)达到1～2之间(即细胞干重达到0.25～0.5g/L之间)时，补加甘油至20g/L，减少空气通入量，并开始通入氮气，开始调控ORP。通入氮气后，ORP由初始迅速下降到—400mV以下。调节空气和氮气的比例和流量，使得ORP稳定到—350mV。过渡过程工艺条件：37℃，400rpm，以4N NaOH控制pH7.0。过渡过程时间为4—7小时。
步骤5：多次ORP调控下的两段双底物集成发酵厌氧转化过程
厌氧转化过程指开始1，3—丙二醇生成的过程。转化过程工艺条件：37℃，400rpm。发酵体系中通入氮气约2.0L/min，同时通入空气，控制通入发酵体系中的氮气和空气的流量和比例，分别在发酵的不同时间调节ORP在—370mV，—450mV，—400mV三个不同条件。在转化过程中，当甘油浓度低于15g/L，向发酵罐中补加甘油至20g/L，从而使发酵液中甘油浓度维持在15—25g/L的范围内，以4N NaOH控制pH为7.0±0.5。
实验结果
ORP恒定在—400mV的两段双底物集成发酵工艺中，生产周期为80小时，细胞干重最高达到2.53g/L，1，3-PD达到45.2g/L，主要副产物为乙酸、乙醇和乳酸。其发酵过程曲线及产物生成曲线(如图1所示)。
实验过程二
步骤1：菌种活化
由菌种保藏斜面挑取一环肺炎克氏杆菌菌苔接入LB固体斜面进行活化，37℃培养24小时后，再挑取一环菌苔接入固体LB平板，37℃培养24小时后获得单菌落。
步骤2：种子培养
从步骤1的LB平板上挑取一个单菌落，接入250ml摇瓶培养，装液量50ml，37℃，200rpm，培养8—10h。
步骤3：两段双底物集成发酵好氧过程
在实验装置内，装有2L预先灭菌的集成发酵培养基，将步骤2的种子液接入发酵罐中。ORP电极在紫外灯下照射2h表面灭菌，再加入电极前用酒精棉球轻轻擦洗表面，在无菌间中用无菌风吹干后，将ORP电极放入发酵罐中。好氧培养过程条件，37℃，400rpm，空气流量2.0L/min，通气比1vvm，以4N NaOH控制pH为7.0±0.5。好氧过程在2—3小时。此时ORP为—70～+170之间，因培养基组分以及灭菌条件不同而不同。
步骤4：ORP调控下的两段双底物集成发酵过渡过程
过渡过程是指由好氧过程转为厌氧过程的初始阶段，这一阶段没有1，3—丙二醇生成。当菌体浓度(OD)达到1～2之间(即细胞干重达到0.25～0.5g/L之间)时，补加甘油至20g/L，减少空气通入量，并开始通入氮气，开始调控ORP。通入氮气后，ORP由初始迅速下降到—400mV以下。调节空气和氮气的比例和流量，使得ORP迅速稳定到—400mV。过渡过程工艺条件：37℃，400rpm，以4N NaOH控制pH为7.0±0.5。过渡过程时间为4—7小时。
步骤5：ORP调控下的两段双底物集成发酵厌氧转化过程
厌氧转化过程指开始1，3—丙二醇生成的过程。转化过程工艺条件：37℃，400rpm。发酵体系中通入氮气约2.0L/min，同时通入微量空气调节ORP在—400±20mV。在转化过程，当甘油浓度低于15g/L，向发酵罐中补加甘油至20g/L，从而使发酵液中甘油浓度维持在15—25g/L的范围内，以4N NaOH控制pH为7.0±0.5。
实验结果
ORP恒定在—400mV的两段双底物集成发酵工艺中，生产周期为65小时，细胞干重最高达到3.17，1，3-PD达到57.3g/L，主要副产物为乙酸、乙醇和乳酸。其发酵过程曲线及产物生成曲线(如图2所示)。
实验过程三
步骤1：菌种活化
由菌种保藏斜面挑取一环肺炎克氏杆菌菌苔接入LB固体斜面进行活化，37℃培养24小时后，再挑取一环菌苔接入固体LB平板，37℃培养24小时后获得单菌落。
步骤2：种子培养
从步骤1的LB平板上挑取一个单菌落，接入250ml摇瓶培养，装液量50ml，37℃，200rpm，培养8—10h。
步骤3：两段双底物集成发酵好氧过程
在实验装置内，装有2L预先灭菌的集成发酵培养基，将步骤2的种子液接入发酵罐中。ORP电极在紫外灯下照射2h表面灭菌，再加入电极前用酒精棉球轻轻擦洗表面，在无菌间中用无菌风吹干后，将ORP电极放入发酵罐中。好氧培养过程条件，37℃，400rpm，空气流量2.0L/min，以4N NaOH控制pH为7.0±0.5。好氧过程在2—3小时。此时ORP为—70～+170之间，因培养基组分以及灭菌条件不同而不同。
步骤4：ORP调控下的两段双底物集成发酵过渡过程
过渡过程是指由好氧过程转为厌氧过程的初始阶段，这一阶段没有1，3—丙二醇生成。当菌体浓度(OD)达到1～2之间(即细胞干重达到0.25～0.5g/L之间)时，补加甘油至20g/L，同时通入氮气维持厌氧条件发酵转入两段双底物集成发酵。ORP由初始迅速下降到—400mV以下。滴加过氧化氢稀溶液，使得ORP稳定到—370mV。过渡过程工艺条件：37℃，400rpm，以4N NaOH控制pH为7.0±0.5。过渡过程时间为4—7小时。
步骤5：用过氧化氢调控ORP到-370mV的两段双底物集成发酵厌氧转化过程
厌氧转化过程指开始1，3—丙二醇生成的过程。转化过程工艺条件：37℃，400rpm。发酵体系中通入氮气约2.0L/min，同时滴加过氧化氢溶液，调节ORP在—370±20mV。在转化过程，当甘油浓度低于15g/L，向发酵罐中补加甘油至20g/L，从而使发酵液中甘油浓度维持在15—25g/L的范围内，以4N NaOH控制pH为7.0±0.5。
实验结果
ORP恒定在一370±20mV的两段双底物集成发酵工艺中，生产周期为65小时，细胞干重最高达到2.13g/L，1，3-PD达到45.1g/L，主要副产物为乙酸、乙醇和乳酸。其发酵过程曲线及产物生成曲线(如图3所示)。
从上述三个实验过程都得到很好的实验结果来看，本发明具有以下特点：①将氧化还原电势的概念引入到肺炎克氏杆菌发酵生产1，3-PD当中。②在使用pH电极、温度电极、溶氧电极检测、调控的发酵体系中，加入ORP电极调控发酵体系的氧化还原状态。③在从好氧到厌氧转化的过程中，通过检测发酵体系中的ORP来确定发酵过程中通空气的流量。④在厌氧生产1，3-PD过程中，调节发酵体系中的ORP到-200mV～—450mV。以上特点导致本发明在与其它工艺同等生产水平时，生产时间缩短，对发酵体系的控制更加及时和精确，有利于提高产品的浓度，降低发酵成本。
Claims (2)
1.一种氧化还原电势调控厌氧发酵生产1，3-丙二醇方法，其特征在于：根据肺炎克氏杆菌发酵生产1，3-PD性厌氧的特性，在发酵体系中引入了ORP电极，利用ORP调控肺炎克氏杆菌厌氧合成1，3-丙二醇的具体实施工艺步骤如下：
菌种：肺炎克氏杆菌；
步骤1：菌种活化
由菌种保藏斜面挑取一环肺炎克氏杆菌菌苔接入LB固体培养基进行活化，在30—40℃下培养20—30小时后，再挑取一环菌苔接入固体LB平板，35—40℃培养24小时后获得单菌落；
步骤2：种子培养
从步骤1的LB平板上挑取一个单菌落，接入250ml摇瓶培养，装种子培养基液量50ml，在30—40℃，200rpm下，培养8—10小时；
步骤3：两段双底物集成发酵好氧过程
装有2L预先灭菌的集成发酵培养基，将步骤2的种子液接入发酵罐中，ORP电极在紫外灯下照射2小时表面灭菌，在加入电极前用酒精棉球轻轻擦洗表面，在无菌间中用无菌风吹干后，将ORP电极放入发酵罐中，好氧培养过程条件，35—40℃，400rpm，空气流量2.0L/min，以4N NaOH控制pH值为7，好氧过程在2—3小时，此时ORP为—70～+70之间，因培养基组分以及灭菌条件不同而不同；
步骤4：ORP调控下的两段双底物集成发酵过渡过程
过渡过程是指由好氧过程转为厌氧过程的初始阶段，这一阶段没有1，3—丙二醇生成，当菌体浓度OD达到1～2时，即细胞干重达到0.25～0.5g/L时，补加甘油至20g/L，减少空气通入量，并开始通入氮气，开始调控ORP，通入氮气后，ORP由初始迅速下降到—400mV以下，按体积比调节空气和氮气的比例为1～20:20～1和总流量0.05-6L/min，使得ORP稳定到—350mV；过渡过程工艺条件：35—40℃，400rpm，以4N NaOH控制pH值为7，过渡过程时间为4—7小时；
步骤5：多次ORP调控下的两段双底物集成发酵厌氧转化过程
厌氧转化过程指开始1，3—丙二醇生成的过程，转化过程工艺条件：35—37℃，400rpm，在发酵体系中通入氮气约2.0L/min，同时通入空气或同时滴加过氧化氢溶液，控制通入发酵体系中的按体积比调节空气和氮气的比例为1～20:20～1和总流量0.05-6L/min，分别在发酵的不同时间调节ORP在—370mV、—450mV、—400mV三个不同条件，在转化过程中，当甘油浓度低于15g/L时，向发酵罐中补加甘油至20g/L，从而使发酵液中甘油浓度维持在15—25g/L的范围内，以4N NaOH控制pH值为7，将ORP恒定在—400mV的两段双底物集成发酵工艺，生产周期为80小时。
2.根据权利要求1所述氧化还原电势调控厌氧发酵生产1，3-丙二醇方法，其特征在于：所述流加补料过氧化氢为过氧化氢溶液浓度为0.5-3％，由30％的H2O2经过稀释得到，在4℃冰箱遮光保存，实验时遮光并放在冰水浴中。
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