CN100460866C - 牛、羊、猪乳房炎快速诊断试剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛、羊、猪乳房炎的快速诊断试剂，其组分及其重量百分比为：十二烷基苯磺酸钠2.5%-30%、氢氧化钠1%-15.5%、迭氮化钠0.05%-0.5%、溴甲酚紫1%-10%、水45%-95%。本发明还公开了所述快速诊断试剂的制备方法，是将氢氧化钠、迭氮化钠按所述重量百分比先与水配制成的水溶液，再按所述比例加入十二烷基磺酸钠、溴甲酚紫，搅拌混合，使其完全溶解制得。本发明提供的快速诊断试剂具有速度快(只需10-15秒)，费用低(检测一次只需2分钱)，准确度高，重复性和稳定性好，操作简单、方便，结果判断简单明了，应用范围广，易普及的特点，是一种具有中国特色的乳房炎诊断产品。

Description

牛、羊、猪乳房炎快速诊断试剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种诊断试剂，尤其涉及一种用于牛、羊、猪乳房炎的快速诊断试剂及其制备方法与应用。

背景技术

乳房炎是哺乳动物(主要指牛、羊、猪，重点指奶牛)对其乳房内部的乳汁分泌组织所受损伤的反应，病原微生物的侵入及其分泌的毒素是引起乳房炎的主要原因。据研究报道国外奶牛乳房炎发病率约为40％—70％，国内奶牛乳房炎发病率约为50％—85％(郑州市奶牛乳房炎调查组，1988)，其中临床型乳房炎发病率约为10％—30％，隐性乳房炎发病率约为40％—70％(蒋武成，1993)。动物发生乳房炎后，会导致牛奶废弃、奶产量明显下降、奶品质降低等巨大损失。据估算，在美国乳房炎会导致每头奶牛每年平均损失约1500元，中国养殖户因乳房炎造成每头奶牛年损失约1000—1500元。2004年底中国奶协统计全国奶牛存栏量约为1030万头，山东省奶牛存栏量约76万头，全国奶牛由乳房炎造成的损失约达100亿元之巨。尽早发现、及时隔离和控制乳房炎患牛，已成为提高奶牛养殖效益亟待解决的重要问题。

临床型乳房炎因有肉眼可见的症状，养殖户和兽医均很重视，国内外兽药厂家能生产多种药品用来控制、治疗，取得了一定效果。然而动物感染隐性乳房炎后，由于无肉眼可见的临床症状，引不起绝大多数养殖户的注意，往往错过最佳治疗时间，最终造成的损失更大。经对比研究发现，隐性乳房炎造成的损失总体超过临床型乳房炎，这与隐性乳房炎发生率远远超过临床型乳房炎直接相关(赵宏坤等，2005)。隐性乳房炎造成的损失包括：(1)产乳量年平均下降7.65％，乳脂肪损失8％—28％，乳蛋白年平均减少7.22％。按每头奶牛年产乳5000公斤计算，因隐性乳房炎每头牛每年会减少产乳量385公斤；(2)如对隐性乳房炎患牛不进行相应的控制和治疗，约有20％—30％患牛会发展为临床型乳房炎，一头临床型乳房炎病牛一个疗程所需的兽医诊疗费、药费约需300—500元；(3)隐性乳房炎还会造成乳品卫生恶化，一方面会严重威胁牛奶饮用者健康，另一方面还会将病原菌传染给其它动物，特别是幼仔，使幼仔成为带菌者，个别的甚至引起幼仔死亡。综上所述，乳房炎已成为影响奶牛场效益的第一大病。

奶牛养殖业发达国家早在上个世纪就开展了奶牛乳房炎相关研究工作。美国研究人员(1965)研制出了加利福尼亚乳房炎检测试剂(简称CMT)并申请了专利，现CMT已成为国际通用乳房炎检测试剂，但其主要成份及配方仍未公开。在美国售价每瓶为13.5美元，国内进口价(加邮费、关税等)约为170.00元人民币，可检测250次，平均每头牛每次检测费用约为0.68元。因进口手续繁琐、价格贵等原因限制，CMT试剂在国内市场购买不到，更不用说在中国中、小养殖场尤其是个体养殖户中得到广泛应用，绝大部分养殖户甚至没有听说过此产品。国内外研究人员还发明了乳房炎电子测定仪，通过测定不同乳区的乳汁pH变化来确定动物是否患有乳房炎。该仪器售价几千元到数万元不等，超出个体养殖户购买能力、且操作需要一定的技术及电源等配套条件、不能在牛、羊和猪旁边现场检测等因素限制了它的推广、应用。国内兰州、北京等奶牛研究机构八十年代仿制CMT研制出自己的奶牛乳房炎实验室诊断办法，主要试剂是苯硫酸盐和麝香草酚兰，但不知何因在国内一直没有得到推广应用；西北农林大学研究人员2005年也申请了“一种隐性乳房炎诊断新试剂”专利，按其公布的组成成份看，成份种类较多，因市场上没有成型产品，效果不得而知。

如何尽快研究一种价格低廉、操作简易、效果和重复性较稳定的真正能够让千万个奶牛养殖户用得起的乳房炎诊断产品，是我国乃至全世界奶牛养殖业急需解决的问题。

发明内容

针对现有技术中涉及牛、羊、猪乳房炎诊断产品的不足，本发明要解决地问题是，根据患乳房炎动物乳汁中嗜中性粒细胞数量明显增多且乳汁pH会从弱酸性变为弱碱性的原理，提供一种奶牛乳房炎检测试剂。该试剂具有较好的重复性和稳定性，操作简易、价格较低、可普及推广特点，是一种具有中国特色的乳房炎诊断产品。

本发明所述的牛、羊、猪乳房炎的快速诊断试剂，其组分及其重量百分比为：十二烷基苯磺酸钠 2.5％—30％、氢氧化钠 1％—15.5％、迭氮化钠 0.05％-0.5％、溴甲酚紫 1％—10％、水 45％—95％。

在上述的牛、羊、猪乳房炎的快速诊断试剂中，其组分及其重量百分比优选为：十二烷基苯磺酸钠 4.8％—25％、氢氧化钠 2％—12％、迭氮化钠 0.1％-0.3％、溴甲酚紫 3％—8％、水 55％—90％。

其中，上述组分及其重量百分比进一步优选为：十二烷基苯磺酸钠 7.8％—20％、氢氧化钠 5％—9％、迭氮化钠 0.1％-0.2％、溴甲酚紫 4％—6％、水 65％—83％。

其中，上述组分及其重量百分比最优选为：十二烷基苯磺酸钠 15％、氢氧化钠 6.3％、迭氮化钠 0.2％、溴甲酚紫 5％、水 73.5％。

本发明所述的牛、羊、猪乳房炎的快速诊断试剂的设计及所述诊断试剂的作用原理是基于如下的基础：

奶牛、羊、猪乳房炎是泌乳期动物乳腺的炎性变化，伴有乳汁的生理变化和化学性变化，以及微生物和体细胞数的增加，最显著特征就是乳汁中的白细胞数增加和乳腺的病理学变化。正常乳汁中体细胞数约在10000至200000之间，当乳房发生炎症时血液中白细胞会聚集到乳腺，导致乳汁中白细胞数明显升高，且升高幅度与乳房炎症程度呈正相关；正常乳汁的pH值介于6.5～6.8之间，乳房炎乳汁的pH呈碱性，并且碱性的高低与炎症的程度呈正相关。因此，本发明所述的牛、羊、猪乳房炎的快速诊断试剂就是利用这一原理，通过检测乳汁中体细胞数多少及乳汁pH变化来判定泌乳动物是否患有乳房炎的。诊断试剂中使用的十二烷基苯磺酸钠是阴离子表面活性剂，能溶解体细胞细胞膜，破坏乳中的体细胞，产生核酸；氢氧化钠有利于DNA的释放；DNA再与试剂结合产生沉淀或凝胶。乳腺感染程度越高，乳汁中体细胞数越多，释放的DNA就多，产生的沉淀或凝胶就越多。诊断试剂中加入了一定浓度的盐，主要成份是氢氧化钠，能加速细胞电荷的改变，有利于变性细胞之间出现凝结。诊断试剂中加入了指示剂溴甲酚紫，能够利用指示剂颜色反应有效指示乳房是否发生炎症。乳房发生炎症时，乳汁pH发生变化，主要从弱酸性变成弱碱性。诊断试剂中加入了防腐剂迭氮化钠是为了试剂的防腐，以延长本发明所述的牛、羊、猪乳房炎的快速诊断试剂在农村、在夏季的使用寿命。

本发明所述牛、羊、猪乳房炎的快速诊断试剂的制备方法，其步骤是：将氢氧化钠、迭氮化钠按所述重量百分比先与水配制成水溶液，再按所述比例加入十二烷基磺酸钠、溴甲酚紫，搅拌混合，使其完全溶解，即制备成溶液呈浅紫红色的牛、羊、猪乳房炎的快速诊断试剂。

本发明所述牛、羊、猪乳房炎的快速诊断试剂的应用方法，其特征是，取奶样1ml～5ml，再加入等量的上述牛、羊、猪乳房炎的快速诊断试剂，成同心圆方向摇动10～20秒钟，根据测试乳样是否出现沉淀或凝胶及颜色变化进行结果判定。

其中，所述结果判定的标准是：①阴性：测试乳样混合均匀，不出现任何沉淀，溶液呈浅紫红色；②可疑：测试乳样有微量沉淀出现，摇动后消失，溶液呈紫红色；③弱阳性：测试乳样有少量沉淀出现，摇动后不消失，溶液呈深紫红色；④阳性：测试乳样中有多量胶状沉淀出现，摇动时向中心聚集，溶液呈绛紫红色；⑤强阳性：测试乳样迅速形成胶状沉淀，摇动时中心凸起，粘着盘底，溶液呈绛紫色。

需要注意的是：新近产犊的牛、羊、猪(产后7天内)诊断值偏高，原因是初乳中高球蛋白量干扰引起。

利用本发明所述的乳房炎的快速诊断试剂进行牛、羊、猪乳房炎的诊断具有如下突出的优点(1)速度快：检测一个样品只需10—20秒钟；(2)费用低：检测一个样品费用只需2分钱人民币；(3)准确度高：与传统病原菌分离检测方法相比，符合率达99.5％；(4)操作简单、方便：无需专业技术人员操作，可在牛舍、羊和猪圈边现场测定；(5)结果判断简单明了：根据生成沉淀量及凝胶量多少及颜色变化程度来判别结果，简单明了；(6)应用范围广，不仅可用于奶牛乳房炎的检测，还可检测羊、猪乳房炎；(7)原料易得：所用试剂皆为国产试剂，且国内有众多厂家生产。因此，特别适合在个体散养农户及中小型养殖场推广，以实现快速诊断、提前预防、控制牛、羊、猪乳房炎的目的，有效避免因乳房炎造成乳废弃、产乳量明显减少、乳品质下降及兽医诊疗费和药费等经济损失。

附图说明

图1向诊断盘中加乳样。

图2加等量诊断试剂，成同心圆方向摇动10—20秒，肉眼观察结果。

图3阴性结果。无沉淀和凝胶出现。

图4弱阳性结果。明显出现沉淀。

图5强阳性结果。试剂颜色也发生了明显变化。

具体实施方式

实施例1

以重量百分比称取如下组分：十二烷基苯磺酸钠2.5％、氢氧化钠5％、迭氮化钠0.5％、溴甲酚紫6％、水86％。

将氢氧化钠、迭氮化钠按所述重量百分比先与水配制成水溶液，再按所述比例加入十二烷基磺酸钠、溴甲酚紫，搅拌混合，使其完全溶解，即制备成溶液呈浅紫红色的牛、羊、猪乳房炎的快速诊断试剂。

实施例2

以重量百分比称取如下组分：十二烷基苯磺酸钠15％、氢氧化钠6.3％、迭氮化钠0.2％、溴甲酚紫5％、水73.5％。

将氢氧化钠、迭氮化钠按所述重量百分比先与水配制成水溶液，再按所述比例加入十二烷基磺酸钠、溴甲酚紫，搅拌混合，使其完全溶解，即制备成溶液呈浅紫红色的牛、羊、猪乳房炎的快速诊断试剂。

实施例3

以重量百分比称取如下组分：十二烷基苯磺酸钠30％、氢氧化钠10.7％、迭氮化钠0.3％、溴甲酚紫4％、水55％。

将氢氧化钠、迭氮化钠按所述重量百分比先与水配制成水溶液，再按所述比例加入十二烷基磺酸钠、溴甲酚紫，搅拌混合，使其完全溶解，即制备成溶液呈浅紫红色的牛、羊、猪乳房炎的快速诊断试剂。

实施例4

取奶样5ml，再加入等量的实施例1所述牛、羊、猪乳房炎的快速诊断试剂，成同心圆方向摇动15秒钟，根据测试乳样是否出现沉淀或凝胶及颜色变化进行结果判定(见图1～5)。

诊断试剂结果判定标准及对应的体细胞数如下表：

 

诊断试剂反应结果	大致体细胞数(万个/毫升)
		阴性：测试乳样混合均匀，不出现任何沉淀，溶液呈浅紫红色。	0-10
可疑：测试乳样有微量沉淀出现，摇动后消失，溶液呈紫红色。	10-30
		弱阳性：测试乳样有少量沉淀出现，摇动后不消失，溶液呈深紫红色。	30-90
阳性：测试乳样中有多量胶状沉淀出现，摇动时向中心聚集，溶液呈绛紫红色。	90-270
		强阳性：测试乳样迅速形成胶状沉淀，摇动时中心凸起，粘着盘底，溶液呈绛紫色。	270-1000

Claims (5)

1.一种牛、羊、猪乳房炎的快速诊断试剂，其组分及其重量百分比为：十二烷基苯磺酸钠2.5％—30％、氢氧化钠1％—15.5％、迭氮化钠0.05％-0.5％、溴甲酚紫1％—10％、水45％—95％。

2.如权利要求1所述的牛、羊、猪乳房炎的快速诊断试剂，其组分及其重量百分比为：十二烷基苯磺酸钠4.8％—25％、氢氧化钠2％—12％、迭氮化钠0.1％-0.3％、溴甲酚紫3％—8％、水55％—90％。

3.如权利要求2所述的牛、羊、猪乳房炎的快速诊断试剂，其组分及其重量百分比为：十二烷基苯磺酸钠7.8％—20％、氢氧化钠5％—9％、迭氮化钠0.1％-0.2％、溴甲酚紫4％—6％、水65％—83％。

4.如权利要求3所述的牛、羊、猪乳房炎的快速诊断试剂，其组分及其重量百分比为：十二烷基苯磺酸钠15％、氢氧化钠6.3％、迭氮化钠0.2％、溴甲酚紫5％、水73.5％。

5.权利要求1所述牛、羊、猪乳房炎的快速诊断试剂的制备方法，其步骤是：将氢氧化钠、迭氮化钠按所述重量百分比先与水配制成水溶液，再按所述比例加入十二烷基磺酸钠、溴甲酚紫，搅拌混合，使其完全溶解，即制备成溶液呈浅紫红色的牛、羊、猪乳房炎的快速诊断试剂。

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