CN100418423C - 一种从除虫菊中提取的活性物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从除虫菊中提取的活性物及其应用，属生物农药技术领域。由下列步骤得到：a.将采集到的白花除虫菊全株用水洗净，置于50℃烘箱中烘干；b.将烘干的白花除虫菊茎、根叶粉碎并混匀；c.分别取30g粉碎后的白花除虫菊装于250ml三角瓶中；其中：两瓶分别加入200ml 80%乙醇进行提取，另外两瓶分别加入200ml 100%甲醇进行提取；d.对两种溶剂分别提取的样品进行两种处理；其中：将一瓶用80%乙醇提取的样品和一瓶用100%甲醇提取的样品放在50℃水浴锅中静置30小时；另外两瓶在室温下静置72小时；e.将上述不同条件下处理后的样品浸提液分别过滤，在50℃的温度下浓缩后即为白花除虫菊的活性提取物。本发明具有成本低，高效低毒等优点，可作为制备生物农药杀线剂应用。
Description
技术领域：
本发明涉及一种从除虫菊中提取的活性物及其应用，属生物农药技术领域。
背景技术：
松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是世界松林的恶性疫病原，由该线虫引起的松材线虫病能造成松林成片枯死，被称为松树的“癌症”。该病发病期短、病树死亡快、易传播、难防治。目前对松材线虫的防治主要包括化学防治、抗病育种、防治传媒昆虫天牛等，但效果都不明显或有局限性。因此，研究开发高效低毒的杀松材线虫(B.xylophilus)剂受到普遍的关注。植物是产生活性天然产物的主要源泉之一，从植物中寻找具有对松材线虫(B.xylophilus)有毒杀活性的天然代谢产物成为线虫生物防治研究的重点之一。
除虫菊(Chrysanthemun cinerariifolium)属于双子叶植物纲(Dicotyledoneae)、菊目(Astcrales)、菊科(Asteraceae)、菊属(Chrysanthemum)，是传统杀虫植物之一。因其对人畜安全，对植物无药害，对环境无污染而受到市场欢迎。除虫菊(C.cineraefolium)是多年生草本植物，适应性强，对土壤要求不严，一般凉爽干燥通风的中性或微酸性土壤均适合种植。我国云南已发展成为世界除虫菊主产区之一，天然除虫菊产业在我国迅速发展，其产品逐渐进入杀虫剂市场，并倍受瞩目。但到目前为止，还没有除虫菊(C.cinerariifolium)对松材线虫(B.ylophilus)具有毒杀活性的报道。除虫菊(C.cineraefolium)主要包括红花除虫菊(Pyrethrum coccineum)和白花除虫菊(Pyrethrum cinerariifolium)，其中白花除虫菊(P.cinerariifolium)杀虫效力最大。
发明内容：
本发明的目的是从白花除虫菊(Pyrethrum cinerariifolium)中制备具有强抑制松材线虫(B.xylophilus)作用的活性提取物，用于开发高效低毒杀松材线虫(B.xylophilus)的生物制剂。
本发明是这样实现的：
1、制备活性提取物
(1)样品的采集和预处理：本实验使用的白花除虫菊(P.cinerariifolium)采自中国科学院昆明植物研究所植物园内。将采集到的白花除虫菊(P.cinerariifolium)全株用自来水冲洗，把根部泥土及茎、叶上的尘土洗干净，置于50℃烘箱中烘干备用；
(2)粉碎：将烘干的白花除虫菊(P.cinerariifolium)茎、根剪成0.5cm长的小段，叶用手粉碎，混匀；
(3)装瓶浸泡：分别取30g粉碎后的白花除虫菊装于250ml三角瓶中；其中：两瓶分别加入200ml 80％乙醇进行提取，另外两瓶分别加入200ml 100％甲醇进行提取；对两种溶剂分别提取的样品进行两种处理；其中：将一瓶用80％乙醇提取的样品和一瓶用100％甲醇提取的样品放在50℃水浴锅中静置30小时；另外两瓶在室温下静置72小时；
(4)浓缩溶解：将上述不同条件下处理后的样品浸提液分别过滤，在50℃的温度下浓缩后即为白花除虫菊(P.cinerariifolium)的活性提取物；用100％甲醇溶解样品，定量到0.1g/ml，放入冰箱内备用。
2、对照实验
由于植物样品经过有机溶剂浸泡浓缩后均用甲醇溶解定量并测定活性，所以用未加白花除虫菊(P.cinerariifolium)提取物、含有5％和10％两种甲醇浓度(体积比)的线虫悬浮液为参考进行对照实验。
3、制备试验用的松材线虫(B.xylophilus)
将真菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)接种到马铃薯培养基(马铃薯：200.0g，葡萄糖：20g，琼脂18-20g，水：1000ml)平板上，25℃培养至长满平板，接入一块带有松材线虫(B.xylophilus)的培养基，25℃下培养至菌丝消失，培养基表面有光泽即为线虫长满平板，放入4℃冰箱中备用。使用时将载有线虫的培养基挑出，用擦镜纸包裹培养基，放入盛有无菌水的干净平板中将线虫洗出，调整线虫悬浮液的浓度在100条/ml备用。
4、活性测定方法：
用两种浓度的提取物分别做活性测定：取1.9ml松材线虫(B.xylophilus)悬浮液和100ul白花除虫菊(P.cinerariifolium)提取物(0.1g/ml)加到直径为6cm的培养皿中，此时活性提取物浓度为5mg/ml，轻轻混匀后将培养皿放于室温下静置。在解剖镜下随机选择5-7个视野，定时于12小时、24小时、48小时和72小时分别进行观察，计数死虫数(以线虫僵直不动作为标准，辅以机械刺激，如针尖挑刺等)和总线虫数；另取1.8ml松材线虫(B.xylophilus)悬浮液和200ul白花除虫菊(P.cinerariifolium)提取物(0.1g/ml)加到直径为6cm的培养皿中，此时提取物浓度为10mg/ml，其他实验方法与5mg/ml浓度的提取物的活性测定方法相同，分别统计不同时间内的线虫死亡率。每个测试样品设二个重复，计算测试样品对线虫的平均致死率，以平均致死率高低评定样品对线虫的毒力。同时做含5％和10％两种浓度甲醇(体积比)的线虫悬浮液的对照实验。线虫死亡率按下面公式计算：
本发明的活性提取物具有成本低，高效低毒等优点，可作为制备生物农药杀线剂应用。
具体实施方式：
实施例一：
250ml三角瓶装入30g白花除虫菊(P.cinerariifolium)烘干样品，80％乙醇浸泡，室温下静置72h，将浸泡液过滤后，在不高于50℃的温度下浓缩至衡重，称量，用甲醇溶解样品，定量到0.1g/ml，按照上述的实验方法做5mg/ml浓度和10mg/ml浓度的提取物对松材线虫(B.xylophilus)的毒杀活性，并分别用相应浓度的有机溶剂作为对照，结果见表1。
表1室温静置时80％乙醇提取物对松材线虫的致死率(％)
| 时间12小时 | 时间24小时 | 时间48小时 | 时间72小时 | |
| 提取物(5mg/ml) | 18.09 | 27.85 | 55.71 | 65.71 |
| 提取物(10mg/ml) | 53.03 | 71.83 | 90.5 | 100 |
| 5％甲醇对照(％) | 2.78 | 5.48 | 7.78 | 9.33 |
| 10％甲醇对照(％) | 9.86 | 14.47 | 15.38 | 17.89 |
结果表明：本发明的白花除虫菊(P.cineraefolium)活性提取物对松材线虫(B.xylophilus)有较高的毒杀效果，其80％乙醇提取物对线虫具有强的抑制作用，48小时达到90.5％(10mg/ml提取物浓度)和55.71％(5mg/ml提取物浓度)。对照说明，有机溶剂对松材线虫(B.xylophilus)有一定的影响，但致死率在相同时间、相同浓度条件下显著低于白花除虫菊(P.cinerariifolium)活性提取物，说明本发明的活性提取物对松材线虫(B.xylophilus)有较强的毒杀效果。
实施例二：
基本同实施例一，不同之处是用于提取的有机溶剂为100％甲醇；250ml三角瓶装入30g白花除虫菊(P.cinerariifolium)烘干样品，甲醇浸泡，室温下静置72h，过滤浓缩定量(0.1g/ml)处理后得到的有机溶剂提取物作为测试样品。活性结果见表2，有机溶剂对照结果见表1。
表2室温静置时100％甲醇提取物对松材线虫的致死率(％)
| 时间12小时 | 时间24小时 | 时间48小时 | 时间72小时 | |
| 提取物(5mg/ml) | 18.31 | 36.00 | 46.75 | 71.23 |
| 提取物(10mg/ml) | 40.26 | 59.72 | 81.78 | 97.77 |
结果表明：本发明的白花除虫菊(P.cinerariifolium)活性提取物对松材线虫(B.xylophilus)有较高的毒杀作用，其甲醇提取物对线虫具有较强的抑制作用，48小时达到81.78％(10mg/ml提取物浓度)，72小时达到71.23％(5mg/ml提取物浓度)和97.77％(10mg/ml提取物浓度)。
实施例三：
基本同实施例一，不同之处是浸泡时的条件是50℃水浴；250ml三角瓶装入30g白花除虫菊(P.cinerariifolium)烘干样品，80％乙醇浸泡，50℃水浴静置48h，过滤浓缩定量(0.1g/ml)处理后得到的有机溶剂提取物作为测试样品。活性结果见表3，有机溶剂对照结果见表1。
表3 50℃水浴提取时80％乙醇提取物对松材线虫的致死率(％)
| 时间12小时 | 时间24小时 | 时间48小时 | 时间72小时 | |
| 提取物(5mg/ml) | 52.78 | 58.90 | 61.43 | 74.65 |
| 提取物(10mg/ml) | 44.00 | 81.69 | 98.32 | 100 |
结果表明：本发明的白花除虫菊(P.cinerariifolium)活性提取物对松材线虫(B.xylophilus)有良好的毒杀作用，48小时达到98.32％(10mg/ml提取物浓度)，72小时达到74.65％(5mg/ml提取物浓度)和100％(10mg/ml提取物浓度)。
实施例四：
基本同实施例一，不同之处是有机溶剂是100％甲醇，浸泡条件是50℃水浴；250ml三角瓶装入30g白花除虫菊(P.cinerariifolium)烘干样品，甲醇浸泡，50℃水浴静置48h，过滤浓缩定量(0.1g/ml)处理后得到的有机溶剂提取物作为测试样品。活性结果见表4，有机溶剂对照结果见表1。
表4 50℃水浴提取时100％甲醇提取物对松材线虫的致死率(％)
| 时间12小时 | 时间24小时 | 时间48小时 | 时间72小时 | |
| 提取物(5mg/ml) | 36.00 | 47.95 | 60.81 | 73.91 |
| 提取物(10mg/ml) | 45.33 | 66.23 | 97.18 | 100 |
结果表明：本发明的白花除虫菊(P.cinerariifolium)活性提取物对松材线虫(B.xylophilus)有良好的毒杀作用，48小时达到60.81％(5mg/ml提取物浓度)和97.18％(10mg/ml提取物浓度)，72小时达到73.91％(5mg/ml提取物浓度)和100％(10mg/ml提取物浓度)。
Claims (2)
1. 一种从除虫菊中提取的活性物质，其特征在于该活性物由下列步骤得到：
a.将采集到的白花除虫菊全株用自来水冲洗干净，置于50℃烘箱中烘干备用；
b.将烘干的白花除虫菊茎、根剪成0.5cm长的小段，叶用手粉碎，混匀；
c.分别取30g粉碎后的白花除虫菊装于250ml三角瓶中；其中：两瓶分别加入200ml 80％乙醇进行提取，另外两瓶分别加入200ml 100％甲醇进行提取；
d.对两种溶剂分别提取的样品进行两种处理；其中：将一瓶用80％乙醇提取的样品和一瓶用100％甲醇提取的样品放在50℃水浴锅中静置30小时；另外两瓶在室温下静置72小时；
e.将上述不同条件下处理后的样品浸提液分别过滤，在50℃的温度下浓缩后即为白花除虫菊的活性提取物；用100％甲醇溶解样品，定量到0.1g/ml。
2. 权利要求1所述活性物质的应用，其特征在于该活性物质作为制备杀松材线虫药物的应用。
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