CN100416273C - 采用生物化学标记物诊断纤维化疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过采用可容易地检测的生物学标记物的血清浓度来检测患者，特别是肝纤维化，特别是感染丙型肝炎病毒的患者，炎症、纤维化或癌性疾病程度的一种新诊断方法。本发明也涉及实现本方法的诊断试剂盒。

Description

采用生物化学标记物诊断纤维化疾病的方法
技术领域
本发明涉及通过采用可容易地检测的生物学标记物的血清浓度来检测患者，特别是肝纤维化，特别是感染丙型肝炎病毒的患者，炎症、纤维化或癌性疾病程度的一种新诊断方法。本发明还涉及实现本方法的诊断试剂盒。
背景技术
肝活检被认为对于治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的患者，特别是对于纤维化阶段(1-4)的管理是必要的。对于患者和一般的医生来说，这被认为是侵入性的方法(5-6)。许多研究已经显示了几种标记物对诊断肝硬化有显著意义的预测值(6-15)，但都不能在大量仅被HCV病毒感染的人群中预测性诊断早期阶段的纤维化，如很少纤维间隔(桥接纤维化开始)的阶段。
为了改善患者的治疗和随访疾病，能够在肝脏病理进展过程中检测这些早期阶段仍然是重要的。由于肝活检仍然是侵入性的方法，具有一种快速和易于进行的、可对患者的纤维化水平给出较好预测值的检测是有利的。
在感染丙型肝炎病毒后，疾病的进展可导致纤维化，以后成为肝硬化。肝活检可以确定纤维化的阶段，以及肝脏坏死性炎性病变的存在。这些病灶的密度和活动度，补充了纤维化的程度，被医生们确认为是疾病诊断和进展预后的重要因素，并为了确定要给与的治疗类型。
因此，需要开发一种诊断方法，可以对患者中纤维化和/或病变的存在(或不存在)给予很好的预测值，它应是可靠的，足以减少肝活检的需要。
发明概要
本发明提供了一种预测性地评定血清生物化学标记物联合的预测值的诊断方法，以诊断炎症性、纤维化或癌性疾病，特别是在很适于诊断其中具有显著纤维化(从很少纤维间隔到肝硬化)和/或肝坏死性炎性病变的患者的肝脏。随着达到高的阳性预测值(预示明显的纤维化)或阴性预测值，可减少活检指征的数量。这对于患者和社会可能是有用的，以降低活检特别是肝脏活检(6)的费用和危险。
附图描述
图1：结合有了六个(α2-巨球蛋白、α2-微球蛋白、总胆红素、γ球蛋白、apo A1、和GGT)或十个生物化学因子(上述加上白蛋白、α1-微球蛋白、β-球蛋白和ALT)和年龄和性别的纤维化标记物函数的ROC曲线。曲线下面积没有不同：分别为0.853±0.02和0.851±0.02。
图2：根据纤维化分期，六个标记物纤维化计分值(从0.00至1.00)的散点图。
图3：包含了5个(α2-巨球蛋白、触珠蛋白、总胆红素、Apo A1和GGT)、六个(α2-巨球蛋白、α2-微球蛋白、总胆红素、γ球蛋白、apo A1和GGT)或十个生物化学因子(上述加上白蛋白、α1-微球蛋白、β球蛋白和ALT)和年龄和性别的纤维化标记物函数的ROC曲线。曲线下面积没有显著差异：分别为0.837±0.02、0.847±0.02和0.851±0.02。
图4：根据纤维化分期的纤维化计分值
图4a：6个标记物函数F0n＝56中位数＝0.10；F1n＝145中位数＝0.22；F2n＝68中位数＝0.41；F3n＝28中位数＝0.66；F4n＝42中位数＝0.89。
图4b：5个标记物函数F0n＝55中位数＝0.14；F1n＝139中位数＝0.21；F2n＝64中位数＝0.43；F3n＝26中位数＝0.73；F4n＝41中位数＝0.85。
框的顶端和底端是第25和第75百分点。因此，框的长度是四分位数之间的范围。也就是，该框代表中间50％的数据。一条直线在中间点(第50百分点)的位置划过框的中央。上面毗邻的数值是最大观察值，即小于或等于第75百分点加上1.5倍四分位数间的范围。下面毗邻的数值是最小观察值，即大于或等于第25百分点减去1.5倍四分位数间的范围。方差分析显示在所有分期间具有显著差异。(Bonferroni全部配对多重比较检验；p＜0.001)。
图5：根据纤维化分期的α2球蛋白、α2巨球蛋白和触珠蛋白。
图5a：对于α2球蛋白值，仅在4期对比1和3期之间有显著差异。(Bonferroni全部配对多重比较检验；p＝0.01)。
图5b：对于α2巨球蛋白，0和1期值显著低于2、3和4期。(Bonferroni全部配对多重比较检验；p＜0.001)。2期值低于3和4期值。(Bonferroni全部配对多重比较检验；p＜0.001)。在0和1期之间和3和4期之间没有显著差异。
图5c：对于触珠蛋白，1期数值显著高于2、3和4期。(Bonferroni全部配对多重比较检验；p＜0.001)。4期数值低于0、1和2期的数值。(Bonferroni全部配对多重比较检验；p＜0.001)。在0和1期之间和3和4期之间没有显著差异。
优选实施例的描述
本发明因此涉及一种诊断患者炎症性、纤维化或癌性疾病的方法，包括以下步骤：
a)测定所述患者血清中生物化学标记物的数值，
b)通过包含所述标记物的逻辑(logistic)函数结合所述的数值，
c)分析所述逻辑函数的最终数值以确定所述患者中存在肝纤维化和/或肝坏死性炎性病变。
生物化学标记物也可在患者的血浆中测定，当不使用任选的第一个步骤(收集患者的血清或血浆)时，该方法可认为是体外的方法。
特别的是，本发明的方法完全适合诊断所述患者中存在肝纤维化和/或肝坏死性炎性病变。也可用来在患者的肺或肾脏中诊断炎症性和/或纤维化疾病。也适合在例如肺、乳腺、膀胱、结肠中进行癌性病变的诊断。
逻辑函数可通过下面的方法获得：
i)根据患者的疾病程度将其分成不同组；
ii)通过线性分析确定在这些组间显著不同的因子；
iii)逻辑回归分析标记物的独立判别值以诊断纤维化和/或肝坏死性炎性病变；
iv)合并这些已确定的独立因子，构建逻辑函数(一种指数的构建)。
从定义上，根据判别得到的最佳指数(“纤维化计分值”)是合并独立因子的逻辑回归函数。
逻辑函数是通过结合每个参数的相对权重和负号而获得的，前者如在逻辑回归中单独确定的那样，后者是当标记物与纤维化分期呈负相关时。对于数值范围非常大的标记物使用对数。
逻辑函数的品质在ROC曲线的辅助下进行分析，后者是根据诊断需要的阈值来获得的。获得ROC曲线的方法在实施例中进行描述。在本发明中，患者的分类是纤维化的出现，起始于很少纤维间隔，但如果准备仅以大量纤维间隔或肝硬化来诊断患者，也是可以改变的。如在实施例中所描述的那样，这样产生了另一个ROC曲线。
在患者中诊断肝纤维化和/或肝坏死性炎性病变的存在可进一步通过人群中肝纤维化预期发病率的数据进行精确化。
优选地，在根据本发明方法的步骤a)中定量的生物化学标记物是“简单的”生物化学标记物，意味着它们容易地用本领域中已知的方法被定量(色谱、电泳、ELISA测定…)。
因此，优选地适合本发明方法的标记物包括α2-巨球蛋白、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、γ谷氨酰转肽酶(GGT)、γ-球蛋白、总胆红素、白蛋白、α1-球蛋白，α2-球蛋白、触珠蛋白、β-球蛋白、载脂蛋白A1(apoA1)、IL10、TGF-β1、apoA2、apoB。根据所研究的疾病，还可以使用其他细胞因子，或本领域专业技术人员已知的特殊标记物。对于肾脏或膀胱疾病的分析，可在患者的尿液标本上很容易地进行一些测定。
在本发明方法中的一个特殊实施例中，可研究至少4个，更优选地5或6个、7或10个生物化学标记物，并在本方法的步骤a)中进行测定。
优选地，当打算诊断肝纤维化时，这些标记物是α2-巨球蛋白、GGT、γ-球蛋白、总胆红素、(α2-球蛋白或触珠蛋白)和apoA1。触珠蛋白可用来代替α2-球蛋白，因为α2-球蛋白是α2-巨球蛋白和α2-微球蛋白的总和，后者主要由触珠蛋白组成。因而α2-微球蛋白和触珠蛋白的相对权重可能在逻辑函数中被调整。
当要诊断肝坏死性炎性病变的存在时，当测定的标记物包括α2-巨球蛋白、GGT、γ-球蛋白、(ALT或AST)和apoA1时是最佳的。由于本申请中所报告的数据显示这些标记物是相关的，AST或ALT的应用不太重要。因此，考虑到相关因子，用另一个标记物代替一个标记物仅引起逻辑函数中系数的平衡。
逻辑函数也可使用其他的标记物如患者的年龄和性别。在逻辑函数中对不同标记物获得的数值使用的不同系数可通过统计学分析来计算，如在实施例中所描述的。
特别的是，可用来实现本发明方法的合适的逻辑函数如下：
采用6个标记物：
f1＝a1×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-a2×[α2-球蛋白(g/l)]+a3×Log[GGT(IU/l)]+a4×[γ-球蛋白(g/l)]+a5×[年龄(岁)]+a6×Log[胆红素(umol/l)]-a7×[ApoA1(g/l)]+a8×[性别(女性＝0，男性＝1)]-a9，其中
a1包含在6.5和6.9之间，
a2包含在0.450和0.485之间，
a3包含在1.100和1.300之间，
a4包含在0.0700和0.0750之间，
a5包含在0.0265和0.0300之间，
a6包含在1.400和1.700之间，
a7包含在0.900和1之间，
a8包含在0.300和0.450之间，和
a9包含在4.200和4.700之间，
特异的可用函数特别是：
f1-a＝6.826×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.479×[α2-球蛋白(g/l)]+1.252×Log[GGT(IU/l)]+0.0707×[γ-球蛋白(g/l)]+0.0273×[年龄(岁)]+1.628×Log[胆红素(umol/l)]-0.925×[ApoA1(g/l)]+0.344×[性别(女性＝0，男性＝1)]-4.544；
或
f1-b＝6.552×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.458×[α2-球蛋白(g/l)]+1.113×Log[GGT(IU/l)]+0.0740×[γ-球蛋白(g/l)]+0.0295×[年龄(岁)]+1.473×Log  [胆红素(umol/l)]-0.979×[ApoA1(g/l)]+0.414×[Sex(女性＝0，男性＝1)]-4.305；
采用10个标记物：
f2＝b1×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-b2×[α2-球蛋白(g/l)]+b3×Log [GGT(IU/l)]+b4×[γ-球蛋白(g/l)]+b5×[年龄(岁)]+b6×Log[胆红素(umol/l)]-b7×[ApoA1(g/l)]+b8×[性别(女性＝0，男性＝1)]+b9[白蛋白(g/l)]+b10[α1-球蛋白(g/l)]-b11[β2-球蛋白(g/l)]2.189-b12×Log[ALT(IU/l)]-b13，其中
b1包括在9.9和10.2之间，
b2包括在0.7和0.77之间，
b3包括在2和2.4之间，
b4包括在0.1和0.2之间，
b5包括在0.04和0.07之间，
b6包括在4和4.6之间，
b7包括在2和2.5之间，
b8包括在0.28和0.32之间，
b9包括在0.025和0.04之间，
b10包括在2和2.2之间，
b11包括在0.1和0.16之间，
b12包括在0.7和0.9之间，和
b13包括在12和14之间，
一个特异的可用函数特别是：
f2＝10.088×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.735×[α2-球蛋白(g/l)]+2.189×Log[GGT(IU/l)]+0.137×[γ-球蛋白(g/l)]+0.0546×[年龄(岁)]+4.301×Log[胆红素(umol/l)]-2.284×[ApoA1(g/l)]+0.294×[性别(女性＝0，男性＝1)]+0.0312[白蛋白(g/l)]+2.109[α1-球蛋白(g/l)]-0.136[β2-球蛋白(g/l)]-0.813×Log[ALT(IU/l)]-13.165。
采用6个标记物来确定显著活动度：
f3＝c1×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-c2×[β2-球蛋白(g/l)]+c3×Log[GGT(IU/l)]+c4×[γ-球蛋白(g/l)]-c5×[年龄(岁)]+c6×Log[ALT(IU/l)]-c7×[ApoA1(g/l)]-c8×[性另(女性＝0，男性＝1)]-c9，其中
c1包括在3.45和3.65之间，
c2包括在0.3和0.4之间，
c3包括在0.8和1之间，
c4包括在0.075和0.09之间，
c5包括在0.0015和0.003之间，
c6包括在2.1和2.5之间，
c7包括在1.55和1.75之间，
c8包括在0.35和0.45之间，和
c9包括在4和4.6之间，
一个特异的可用函数特别是：
f3＝3.513×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.354×[β2-球蛋白(g/l)]+0.889×Log[GGT(IU/l)]+0.0827×[γ-球蛋白(g/l)]-0.0022×[年龄(岁)]+2.295×Log[ALT(IU/l)]-1.670×[ApoA1(g/l)]-0.415×[性别(女性＝0，男性＝1)]-4.311。
采用7个标记物，以诊断显著的纤维化或显著的活动度：
f4＝d1×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-d2×[α2-球蛋白(g/l)]+d3×Log[GGT(IU/l)]+d4×[γ-球蛋白(g/l)]+d5×[年龄(岁)]+d6×Log[胆红素(umol/l)]-d7×[ApoA1(g/l)]+d8×[性别(女性＝0，男性＝1)]+d9Log[ALT(IU/L)]-d10，其中
d1包括在5.3和6.7之间，
d2包括在0.45和0.5之间，
d3包括在0.8和1.2之间，
d1包括在0.06和0.08之间，
d5包括在0.0015和0.0025之间，
d6包括在1和1.2之间，
d7包括在1和1.2之间，
d8包括在0.09和1.1之间，
d9包括在1.2和1.5之间，和
d10包括在4和5之间。
一个特异的可用函数是：
f4＝5.981×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.481×[α2-球蛋白(g/l)]+0.965×Log [GGT(IU/l)]+0.0679×[γ-球蛋白(g/l)]+0.0190×[年龄(岁)]+1.143×Log  [胆红素(umol/l)]-1.097×[ApoA1(g/l)]+0.092×[性别(女性＝0，男性＝1)]-1.355Log[ALT(IU/L)]-4.498。
采用5个标记物，以诊断明显的纤维化：
f5＝z1×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-z2×Log[触珠蛋白(g/l)]+z3×Log[GGT(IU/l)]+z1×[年龄(岁)]+z5×Log[胆红素(umol/l)]-z6×[ApoA1(g/l)]+z7×[性别(女性＝0，男性＝1)]-z8，其中
z1包括在4和5之间，
z2包括在1.2和1.5之间，
z3包括在0.9和1.1之间，
z4包括在0.0026和0.03之间，
z5包括在1.6和1.9之间，
z6包括在1和1.3之间，
z7包括在0.25和0.35之间，和
z8包括在5和6之间。
一个特异的可用函数是：
f5＝4.467×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-1.357×Log[触珠蛋白(g/l)]+1.017×Log[GGT(IU/l)]+0.0281×[年龄(岁)]+1.737×Log[胆红素(umol/l)]-1.184×[ApoA1(g/l)]+0.301×[性别(女性＝0，男性＝1)]-5.540。
实际上，不同函数中系数的数字精确度依所研究的患者的数量和特征，可以略有变化(大约10-15％)。因此，不同标记物系数给定的数值必须被解释为能够轻微的不同，而并不减少本发明的范围。
根据分析生物学标记物测定值的逻辑函数所获得的最终数值，能够得出患者存在肝纤维化的结论。也可能通过将肝硬化作为ROC曲线图中的阈值而得出肝硬化存在的结论。
本发明的方法也可用作疾病进展的预测手段。特别是，当患者被丙型肝炎病毒感染时，确定感染的日期(通常经过输血)常常是可能的。因此，应用本方明的方法通过诊断的日期来确定疾病进展的程度也可对疾病的未来进展进行预测。
根据本发明诊断方法获得的数据对医生根据疾病的分期为患者选择适合的治疗方法也是非常有价值的。
依靠就诊的患者人群中肝纤维化的发病率，本发明方法获得的数据可用来确定对患者进行肝活检的必要性。希望本发明的方法将减少大约50％的肝活检需要。
本发明的方法打算用于患有涉及可进展为肝硬化的肝纤维化的任何疾病的患者。特别的是，本发明的方法有利地在患有以下疾病的患者中进行以检测肝纤维化：乙型肝炎和丙型肝炎、酗酒者、血色素沉着病、代谢性疾病、糖尿病、肥胖症、自家免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、威尔逊病。
本发明的方法最好用于肝炎病毒感染的患者，特别是丙型肝炎病毒。
本发明也涉及一种诊断患者炎症性、纤维化或癌性疾病的试剂盒，包括说明书，使得在测定生物化学标记物后，可在所述患者中确定存在所述的炎症、纤维化或癌性疾病。
本发明也涉及一种诊断患者肝纤维化和/或肝坏死性炎性病变的试剂盒，包括说明书，使得在测定生物化学标记物后，可在所述患者中确定存在肝纤维化和/或肝坏死性炎性病变。
说明书可包括在测定生物化学标记物剂量后必须要使用的逻辑函数。它可以打印的载体形式出现，以及计算机可用的载体，如软件。说明书也可包含依赖所寻找的阈值的ROC曲线，可以分析从逻辑函数中获得的最终数据。它们也可包含不同的图表，以便依靠患者人群中的预期纤维化发病率获得预测值。
根据本发明的诊断试剂盒也可含有能够测定目标生物学标记物的成分。
本发明的方法可很容易的自动操作，标记物的测定自动地进行，数据被发送至计算机或计算器，它们将计算逻辑函数的数值并在ROC曲线的辅助下进行分析，最终分析患者人群中肝纤维化的发病率。因此医生获得的数据可更容易地判断，将可以改进决定活检需要或预知适当治疗的过程。
下面的实施例是要描述发明的一个方面，给出方法学以便重复本发明的方法，但并不限制本发明。
实施例
实施例1：患者和方法
1.1患者
入组研究的患者属于一个单中心人群(DOSVIRC)。此人群包括法国巴黎Pitié-Salpêtrièe医院肝和胃肠中心追踪的所有丙型肝炎患者(定义为至少通过改进型ELISA检测的血清学阳性)，1993年以前的为回顾性，之后为前瞻性(16)。一份特殊的问卷由每个患者填写，该问卷包含129个项目，包括社会-人口统计学管理数据、风险因子、和每次回访的临床、生物学、病毒学和治疗的项目，以及进行肝活检时的组织学数据。HCV感染的时间通过输血的日期或暴露于其他胃肠外来源的开始时间来估计，对偶尔发生感染的患者或那些感染源未知的患者无法计算。排除的标准是存在HBsAg或HIV阳性抗体。从1997年八月至2000年3月，预先纳入所有知情同意的通过PCR检测到HCV的患者，他们接受肝活检，在活检的当天取血样。排除标准是同时感染HIV，HBV，其他肝脏疾病，和无法解释的肝活检。
在第一个阶段(首年训练期206个患者)内进行分析并在第二阶段(验证期156个患者)进行确证(表1)。
在训练期排除1个患者和验证期排除22个患者后(表4)进行另一项分析。
1.2血清标记物
下面11项检测在两个阶段均检测：α2-巨球蛋白、AST、ALT、GGT、总胆红素、白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白(主要由α2-巨球蛋白和触珠蛋白组成)，在两个阶段内对触珠蛋白进行回顾性检测。
IL10、TGF-β1、apoA2和apoB仅在第二阶段进行检测。
AST、ALT、GGT、总胆红素采用Roche诊断试剂(Mannheim Germany)通过日立917自动仪进行测定。
白蛋白用溴甲酚绿法(17)检测，不依靠血清蛋白电泳，(α1、α2、β和γ球蛋白馏分)，在Hydrasys和Hyrys自动系统(Sebia，Issy-Les-Moulineaux，法国)上进行。
通过采用自动比浊计BNII(Dade Behring Marburg，德国)在血清样品中(在-80℃保存至测定)测定载脂蛋白A1、-A2、-B和α2巨球蛋白。
采用Quantikine人TGF β1免疫测定法(R和D系统，Inc.Minneapolis，MN，美国)测定血浆TGF β1的浓度。为了激活潜在的TGF β1成为免疫活性形式，样品用酸活化，之后中和。
采用免疫测定试剂盒(Beckman Coulter Company Immunotech，Marseille，法国)测定血浆白介素10。
血浆样品保存在-80℃直至测定(不超过1年)。
1.3组织学分期和分级
肝脏标本的组织学特征根据METAVIR评分系统进行分析(18，19)。肝活检，长度超过10毫米，固定，石蜡包埋，至少用苏木精伊红藏花红染色，Masson’s三色或picrosirius红染胶原。
对每个肝活检，根据下列的标准建立纤维化的分期和活动度的级别。肝活检的分期为0至4期：0＝无纤维化，1＝门脉区纤维化无纤维间隔，2＝少数纤维间隔，3＝大量的纤维间隔无肝硬化，和4＝肝硬化。这种特征在病理学家之间是高度重现性的。
活动度的分级可评价坏死性炎性病变的强度，其含义如下：A0＝无组织学活动度，A1＝轻微活动度，A2＝中等活动度，A3＝严重活动度。METAVIR评分系统通过一个不知道患者特征的病理学家(FC)来进行评价。
实施例2：统计学分析
统计学分析采用逻辑回归和ROC曲线(20)。分析在第一阶段(首年训练期)进行，验证在第二阶段(验证期)进行，患者的组别见表1和4。
然后结合两阶段对总体的人群进行最后的分析(见表2和5)。
根据METAVIR评分系统，患者分为几个组。
主要的终点是确定具有显著的纤维化(F2，F3或F4)的患者和无显著纤维化的患者(F0和F1)。
在第二次分析中，患者也根据活动度的分级分组：无显著活性的患者(A0或A1)和有组织学活性的患者(A2，或A3)。
确定无显著组织学特征的一组(A＜2和F＜2)和显著病变的一组(A≥2和F≥2)。
最后也确定具有广泛纤维化或肝硬化(F3或F4)的一组。
第一阶段包括在这些组中采用卡方，Student t检验或Mann-Whitney检验通过线性分析鉴定明显变化的因子。
第二阶段包括逻辑回归分析测定标记物诊断纤维化的独立判别值。
第三步是构建一个合并这些已鉴定因子的指数。从定义上，根据判别得到的最佳指数(“纤维化计分值”)是合并独立因子的逻辑回归函数。
这些指数和分离因子的诊断价值通过敏感性、特异性、阳性和阴性预测值以及接受者表现特征来评价。预测值可对观察到的显著纤维化发病率(本研究中为40％)进行评价，也可更低(10％)或更高的发病率(90％)。
通过接受者表现特征的曲线下面积比较各自的总体诊断价值。在对患者分类后，根据逻辑函数获得的数值相对不同的阈值(从0至1)，ROC曲线通过绘制敏感性对比值(1-特异性)而制成。应该知道，ROC曲线下面积的值超过0.7是诊断的良好预测曲线。ROC曲线可被认为是一种可预测诊断方法质量的曲线。
这些统计学分析如以前所定义的，可分别对不同的组进行。
为了降低因子的数量，进行的分析仅合并6个最显著的标记物(f1-a，或f1-b)。
因为在分析中观察到，当考虑α2巨球蛋白时，α2球蛋白具有独立的诊断价值，因此触珠蛋白，α2球蛋白的第二个主要成分的诊断价值被回顾性的进行评价。
最终构建了具有5个标记物的指数，除了蛋白电泳成分，结合了触珠蛋白和4个其他的已鉴定标记物(逻辑函数f5)。
实施例3：确定逻辑函数
预先纳入422个患有慢性丙型肝炎的患者。
根据排除下列原因(HIV共同感染，HBV共同感染和移植)后的数目，在其他人中不能进行纤维化的分期，或在11个标记物中至少1个不能测定的数量，总共362(第一个研究)或339(第二个研究)个患有慢性丙型肝炎的患者纳入研究中，在表1和4分别显示。
在患者特征之间，第一次和第二次的样品之间的生物化学标记物没有差异(表1和4)。由组织学确定的显著纤维化的总体发病率为40％(F017-18％，F142-43％，F219-20％，F38％，F4 12-13％)。
3.1明显纤维化的诊断
11个生物化学标记物的每一个诊断数值(ROC曲线下面积)见表2和5，以及它们与纤维化的独立相关性(逻辑回归)。
结合10个或6个最提供信息的标记物(α2巨球蛋白、α2微球蛋白、总胆红素、γ球蛋白、apo A1和GGT)或5个标记物(除去α2-微球蛋白、γ球蛋白后，加进触珠蛋白)、年龄和性别在训练期样品以及验证样品和总体的人群中(表2和5)具有很高的诊断价值。
因为转氨酶ALT和AST是高度相关的(相关系数＝0.88)，当需要此标记物时仅使用ALT。
6个标记物和年龄和性别的逻辑函数被确定为如下：
f1-a＝6.826×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.479×[α2-球蛋白(g/l)]+1.252×Log    [GGT(IU/l)]+0.0707×[γ-球蛋白(g/l)]+0.0273×[年龄(岁)]+1.628×Log [胆红素(umol/l)]-0.925×[ApoA1(g/l)]+0.344×[性别(女性＝0，男性＝1)]-4.544。
或
f1-b＝6.552×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.458×[α2-球蛋白(g/l)]+1.113×Log[GGT(IU/l)]+0.0740×[γ-球蛋白(g/l)]+0.02950×[年龄(岁)]+1.473×Log[胆红素(umol/l)]-0.979×[ApoA1(g/l)]+0.414×[性别(女性＝0，男性＝1)]-4.305。
6个标记物和年龄和性别的逻辑函数被确定为如下：
f5＝4.467×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-1.357×Log[触珠蛋白(g/l)]+1.017×Log[GGT(IU/l)]+0.0281×[年龄(岁)]+1.737×Log[胆红素(umol/l)]-1.184×[ApoA1(g/l)]+0.301×[性别(女性＝0，男性＝1)]-5.540。
逻辑函数是通过结合每个参数的相对权重和负号而获得的，前者如在逻辑回归中单独确定的那样，后者是当标记物与纤维化分期呈负相关时。对于数值范围非常大的标记物使用对数。
当使用10个标记物来计算确定纤维化的逻辑函数时，该函数如下：
f2＝10.088×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.735×[α2-球蛋白(g/l)]+2.189×Log [GGT(IU/l)]+0.137×[γ-球蛋白(g/l)]+0.0546×[年龄(岁)]+4.301×Log [胆红素(umol/l)]-2.284×[ApoA1(g/l)]+0.294×[性别(女性＝0，男性＝1)]+0.0312[白蛋白(g/l)]+2.109[α1球蛋白(g/l)]-0.136[β2-球蛋白(g/l)]-0.813×Log[ALT(IU/L)]-13.165。
采用10个或6个最提供信息的标记物(图1)，或10个、6个或5个最提供信息的标记物(图3)的ROC曲线，对纤维化计分值是相同的。曲线下面积没有不同。
6个标记物纤维化计分值(范围从0.00至1.00)的散点图，根据纤维化的分期在图2中显示。
5或6个标记物纤维化计分值的框图(范围从0.00至1.00)，根据纤维化的分期在图4中显示。
采用6个标记物的纤维化计分值，对于0至0.20范围的计分值(125例患者(第一个研究)，或119例患者(第二个研究))得到高度阴性的预测值(＞90％缺少F2 F3 F4)，即大约患者的35％，其中13个假阴性，年龄从34至59岁：4个F2A0、6个F2A1、3个F2A2)。对于0.80至1的计分值(分别为53个患者(第一个研究)，50个患者(第二个研究)，即患者的15％，其中分别有4和5个假阳性，年龄从47至68岁：分别为1、2个F1A1，3个F1A2)(表3和6)，获得高度阳性的预测值(＞90％存在F2 F3 F4)。
这些数值为纤维化(F＞1)发病率40％的被检测人群而计算。如果检测人群的纤维化发病率是90％或10％，要考虑的预测值也在表3和6中显示。
神经连接法给出了相似的结果：训练期、验证和检测样品的被正确分类的患者百分比分别为77％、74％和79％(未显示)。
在第二个样品中，IL10、TGFβ1、apoA2和apoB的加入可轻微增加曲线面积至0.889±0.030，与6个标记物纤维化计分值无差别。
3.2.在低ALT患者中诊断显著的纤维化(第二个研究)
ALT低于35IU/l的总共43例患者，其中10例患者具显著的纤维化。6个标记物纤维化函数的诊断值还是高的，其ROC曲线下面积为0.758±0.090。两个计分值超过0.80的患者有肝硬化。在计分值低于0.20的29例患者中，25例没显著的纤维化。
3.3.诊断肝硬化或弥温性纤维化(第一个研究)
对于诊断肝硬化或弥漫性纤维化，用相同6个标记物(R2＝0.345P＜0.001)的纤维化计分值达到非常高的ROC曲线下面积：0.929±0.020。
用此函数，获得了计分值在0至0.80的高度阴性预测值(＞90％没有F3F4)(309例患者中，即85％的患者，有32例年龄从27至74岁的假阴性：13例肝硬化和19例F3)。对于计分值＞0.80者有较高的阳性预测值(＞85％存在F3F4)，53例患者，即15％的患者中，有8例年龄从47至68岁的假阳性：4例F2和2例F1。
3.4.诊断肝硬化或弥漫性纤维化(第二个研究)
对于诊断肝硬化或弥漫性纤维化，用相同6个标记物(R2＝0.347P＜0.001)的纤维化计分值达到非常高的ROC曲线下面积：0.923±0.020。
用此函数，获得了计分值在0至0.80的高度阴性预测值(＞90％没有F3 F4)。在这289例患者中，即总数的85％，有30例假阴性：11例肝硬化和19例F3。对于计分值＞0.80者有较高的阳性预测值(＞85％存在F3 F4)。在这50例患者中，即总数的15％，有10例假阳性：5例F2和5例F1。
3.5.诊断显著的活动度或纤维化或活动(第一和第二个研究)
对于诊断显著的活动度(A2A3)，最好的终极逻辑回归结合了ALT、α2-巨球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白、apo A1、和GGT(R2＝0.243P＜0.001)。
所使用的逻辑函数是：
f3＝3.513×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.354×[β2-球蛋白(g/l)(g/l)]+0.889×Log[GGT(IU/l)]+0.0827×[γ-球蛋白(g/l)]-0.0022×[年龄(岁)]+2.295×Log[ALT(IU/l)]-1.670×[ApoA1(g/l)]-0.415×[性别(女性＝0，男性＝1)]-4.311。
就单独的有实际意义纤维化加上ALT而言，(R2＝0.290 P＜0.001)对于诊断显著的纤维化(F2F3F4)或显著的活动度(A2A3)，最好的终极逻辑回归结合了同样的6个标记物。
应当用于此诊断读数的逻辑函数是：
f4＝5.981×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.481×[α2-球蛋白(g/l)]+0.965×Log[GGT(IU/l)]+0.0679×[γ-球蛋白(g/l)]-0.0190×[年龄(岁)]+1.143×Log[胆红素(umol/l)]-1.097×[ApoA1(g/l)]+0.092×[性别(女性＝0，男性＝1)]+1.355Log[ALT(IU/l)]-4.498。
3.6.细胞因子和生物化学标记物间的联系(第二个研究)
TGF-β1与触珠蛋白正性相关(R＝0.39；p＜0.001)，与α2巨球蛋白(R＝-0.20；p＝0.02)、胆红素(R＝-0.32；p＜0.001)和GGT(R＝-0.20；p＝0.01)负性相关。HGF与α2巨球蛋白(R＝0.45；p＝0.006)和GGT(R＝0.54；p＜0.001)相关。IL10仅与γ-球蛋白(R＝0.20；p＝0.01)相关。
实施例4：数据分析
获得的结果显示，5个或6个简单生化标记物的联合与纤维化发生不直接相关，但可以达到诊断有实际意义纤维化的高度阳性或阴性的预测值，甚至在很少纤维间隔的早期阶段。
如果研究样本是偏倚的，不代表多数患者，那么诊断方法的结论通常是不充分的。本研究中预定人群的临床、组织学和生物化学特征在研究的33个月期间是稳定的，在最近的大型随机试验(22)中的入组人群与之相似。有明显的失代偿性肝硬化的患者不入组。包括严重肝病的患者可人工地改善逻辑函数的预测值。另一方面，还有值得注意数量的患者有极小的组织学特征(13-18％没有纤维化)，9％的患者ALT低于30IU/ml，13％者ALT低于35IU/ml，他们通常不入组随机化试验。
纤维化计分的诊断值在2个分期间是重现性的(表2和5)。这些结果的分析得到这样的结论，在慢性丙型肝炎的管理中，活检的数量可以减少50％。
实际上，患者是根据纤维化的分期和等级治疗的(1-4)。根据纤维化计分值＜0.20，如果未活检就作出不治疗的决定，在125至119例患者中仅有13例是假阴性。其中没有一个是肝硬化或弥漫性纤维化(F3-F4)，且仅有2例是中度活动度。根据纤维化计分值＞0.80，如果未活检就作出治疗的决定，在53例中仅有4例患者或50例中仅有5例患者是假阳性。其中3例患者有中度活动度，证明治疗是合理的，尽管按照共同声明(2)只有肝门纤维化。
这3例患者中的2例接受了经静脉的肝活体组织检查，显示门-腔梯度的升高，分别是19和13mmHg。因此很可能这些患者事实上有显著的纤维化。
在此情况下，仅有1或2例患者(4％)可能被过度治疗。因此，此计分值也可以探测大多数具有中重度组织学活动度但没有显著纤维化的患者。最后，纤维化计分值还可以用于未活检的肝硬化的管理。
非常重要的是注意到，本发明的方法不引起患者大量不适当的治疗，或排除需要治疗的患者。此申请中提供的数据确实强化了根据本发明的诊断方法的可靠性。
纤维化计分值也可以用于未活检的肝硬化的管理。因此，对纤维化计分值＞0.80的患者可以推荐筛选脉管曲张和肝细胞肿瘤。
最提供信息的标记物以降序是：α2-巨球蛋白、α2-球蛋白、GGT、γ球蛋白、总胆红素和apoA1。
α2-球蛋白(正常范围4-6g/l)是由α2-巨球蛋白(1.4-4.0g/l)和α2-微球蛋白组成的：触珠蛋白(0.4-2g/l)、天兰色胞浆素(0.2-0.4)、抗凝血酶III(0.2-0.3)和维生素A结合蛋白(0.03-0.07)(23)。由于纤维化伴有α2-巨球蛋白增加和α2-微球蛋白下降，在单变量分析中没有观察到α2-球蛋白的诊断值(图5)。
报告的数据提示，α2-微球蛋白的主要成分触珠蛋白在纤维化增加时下降，并成为预测因素。的确，α2-球蛋白和α2-巨球蛋白之间主要由触珠蛋白构成的差异与纤维化强烈地负相关(R＝-0.33，p＜0.001)。α2-巨球蛋白的其它成分(天兰色胞浆素、抗凝血酶III和维生素A结合蛋白)在血清中浓度很低，其独立的诊断值尚未评定。
纤维化和α2-巨球蛋白之间(正性相关R＝0.46 p＜0.001)与纤维化和α2-微球蛋白(富有触珠蛋白，负性相关R＝-0.40)之间相比，可以观察到相反的相关关系。
有5个标记物的逻辑函数强化了此假设。
α2-巨球蛋白升高对纤维化分期的显著诊断价值已经在酒精性肝病患者中观察到。α2-巨球蛋白属于急性期蛋白，由肝细胞、星形细胞和肉芽瘤细胞在炎症和肝纤维化的部位局部产生。此外，α2-巨球蛋白作为星形细胞活化的特征与纤维化特异地相关。α2-巨球蛋白还是一个蛋白酶抑制剂，其合成增加可以抑制基质蛋白的分解代谢并增进肝的纤维化过程。
纤维化增加时触珠蛋白下降，因此解释了α2-球蛋白与α2-巨球蛋白结合时的预测值。正如已经观察到的，触珠蛋白与纤维化强烈地负性关联。此关联与溶血、脾功能亢进、或肝功能不全不相关。相似地，在此研究中(数据未显示)发现与非结合胆红素没有显著关联。
纤维化与α2-巨球蛋白(正性)和触珠蛋白(负性)之间相反的相关关系可以通过HGF和TGF-β1在纤维化发生和急性期反应过程中的不同作用来解释。对于α2-巨球蛋白，观察到与HGF的强正性关联，以及与TGF-β1血清浓度的负性相关。
相反，观察到触珠蛋白与TGF-β1的强正性相关。在实验性纤维化中已经观察到，用HGF基因转导抑制了TGF-β1的增加，且HGF刺激α2-巨球蛋白的合成和减少触珠蛋白的合成。因此，看起来这两个蛋白提供了很多的信息，成为两个主要的纤维化发生细胞因子的代表：α2-巨球蛋白是HGF的代表，触珠蛋白是TGF-β1的代表。
GGT已经数次观察到与纤维化有关，并与凝血酶原和载脂蛋白A1PGA指数一起应用(7-8，13-14，34)。在此研究中，GGT的诊断值不依赖于其它因子，特别是转氨酶和胆红素。目前，不能解释总血清胆红素在非肝硬化患者中的独立诊断值。GGT和胆红素均与HGF相关。除早期胆汁淤积外，表皮生长因子增加可能是GGT升高的一个解释。
γ球蛋白血清浓度已经与肝硬化和门-体分流相关联多年(36)。在此研究中显示，尽管比肝硬化患者低，但非肝硬化性纤维化的患者与F1或F0的患者相比，γ-球蛋白浓度已经升高了。
ApoA1血清浓度已经数次观察到与纤维化有关，并与凝血酶原和GGT一起应用：PGA指数(参见上面)。在此研究中发现，apo-AII或apoB与apoA1单独相比，没有显著的辅助诊断价值。
在此研究中，观察到随纤维化分期意外的血清TGF-β1下降，尽管这没有为6个标记物的联合增加显著的诊断价值。在TGF-β1和α2-巨球蛋白之间观察到最强的相关(R＝0.42 p＜0.001)，提示触珠蛋白可能是慢性丙型肝炎中TGF-β1活化的一个简单标记物。
最后，血清细胞因子的评估不增加生物化学标记物的显著诊断价值，而后者的检测是容易且廉价的。检测电泳化合物(α2-球蛋白和γ-球蛋白)可以看作是半定量测定的老方法。在5个标记物函数中用触珠蛋白代替它们给出了相似的预测值。
总之，本发明提出了一个用于检测肝纤维化和/或存在炎性病变的5个、6个或更多生物化学标记物的联合。在本发明中使用的标记物还从未用这样的方法与患者的年龄和性别结合在一起以得到这样好的预测值，正如以ROC曲线下面积所说明的。
本发明的诊断方法可以在自动测量标记物的数值后被自动分析，并能够有利地应用于慢性丙型肝炎的患者以降低肝活检的指征。
表1：确定函数f1-a、f2、f3、f4的入组患者的特征
ND：未定。
表2：对表1中患者的f1-a、f2，显著性纤维化(很少F2、许多纤维间隔F3、肝硬化F4)的生物化学标记物的诊断值(ROC曲线下面积±sd)。
Figure C0081991200281
*6个标记物和年龄、性别的逻辑函数：6.826×Log α2巨球蛋白(g/l)-0.479×α2球蛋白(g/l)+1.252×LogGGT(IU/l)+0.0707×γ球蛋白(g/l)+0.0273×年龄(岁)+1.628×Log胆红素(umol/l)-0.925×ApoA1(g/l)+0.344×性别(女性＝0，男性＝1)-4.544。
ND：未定          R2＝R的平方
表3：6个标记物纤维化函数f1-a的灵敏度、特异性和预测值
Figure C0081991200291
表4：确定逻辑函数f1-b和f5的入组患者的特征
Figure C0081991200301
ND：未定*对于触珠蛋白，在第一周期有8个患者，第二周期有一个患者未测定。
表5：对表4中患者的f1-b、f2、f5、显著性纤维化(很少F2、许多纤维间隔F3、肝硬化F4)的生物化学标记物的诊断值(ROC曲线下面积±sd)。
Figure C0081991200311
§回顾性评估触珠蛋白。在第一周期有8个患者，第二周期有一个患者未测定。当触珠蛋白代替α2球蛋白时，有逻辑回归显著性。
*6个标记物和年龄、性别的逻辑函数：6.552×Logα2巨球蛋白(g/l)-0.458×α2球蛋白(g/l)+1.113×LogGGT(IU/l)+0.0740×γ球蛋白(g/l)+0.0295×年龄(岁)+1.473×Log胆红素(umol/l)-0.979×ApoA1(g/l)+0.414×性别(女性＝0，男性＝1)-4.305。
**5个标记物和年龄、性别的逻辑函数：4.467×Logα2巨球蛋白(g/l)-1.357×Log触珠蛋白(g/l)+1.017×LogGGT(IU/l)+0.0281×年龄(岁)+1.737×Log胆红素(umol/l)-1.184×ApoA1(g/l)+0.301×性别(女性＝0，男性＝1)-5.540。
ND：未定               R2＝R的平方
表6：6个标记物纤维化函数f1-b的灵敏度、特异性和预测值
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Claims (15)

1. 一种非治疗诊断目的的在体外对来自患者的血清或血浆进行检测的方法，包括下列步骤：
a)测定所述患者的选自α2-巨球蛋白、AST、ALT、GGT、γ-球蛋白、总胆红素、白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、触珠蛋白、β-球蛋白、apoA1、IL10、TGF-β1、apoA2或apoB的至少4个血清或血浆中生物化学标记物的数值，
b)通过包含所述标记物的逻辑函数合并所述的数值和，
c)分析所述逻辑函数的最终值。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述的逻辑函数是通过以下方法获得的：
i)根据患者的疾病程度将其分成不同组；
ii)通过线性分析确定在这些组间显著不同的因子；
iii)逻辑回归分析评价标记物的独立判别值；
iv)通过结合这些确定的独立因子，构建逻辑函数。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述的逻辑函数进一步考虑了患者的年龄和性别。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述检测的生物化学标记物包括α2-巨球蛋白、GGT、γ-球蛋白、总胆红素、α2-球蛋白和apoA1。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述检测的生物化学标记物包括α2-巨球蛋白、GGT、γ-球蛋白、总胆红素、触珠蛋白和apoA1。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述检测的生物化学标记物包括α2-巨球蛋白、GGT、γ-球蛋白、ALT和apoA1。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述检测的生物化学标记物包括α2-巨球蛋白、GGT、γ-球蛋白、AST和apoA1。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中所述的逻辑函数包括：
-f1＝a1×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-a2×[α2-球蛋白(g/l)]+a3×Log[GGT(IU/l)]+a4×[γ-球蛋白(g/l)]+a5×[年龄(岁)]+a6×Log[胆红素(umol/l)]-a7×[ApoA1(g/l)]+a8×[性别(女性＝0，男性＝1)]-a9，其中
-a1包含在6.5和6.9之间，
-a2包含在0.450和0.485之间，
-a3包含在1.100和1.300之间，
-a4包含在0.0700和0.0750之间，
-a5包含在0.0265和0.0300之间，
-a6包含在1.400和1.700之间，
-a7包含在0.900和1之间，
-a8包含在0.300和0.450之间，和
-a9包含在4.200和4.700之间；
-f2＝b1×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-b2×[α2-球蛋白(g/l)]+b3×Log[GGT(IU/l)]+b4×[γ-球蛋白(g/l)]+b5×[年龄(岁)]+b6×Log[胆红素(umol/l)]-b7×[ApoA1(g/l)]+b8×[性别(女性＝0，男性＝1)]+b9[白蛋白(g/l)]+b10[α1-球蛋白(g/l)]-b11[β2-球蛋白(g/l)]2.189-b12×Log[ALT(IU/l)]-b13，其中
-b1包括在9.9和10.2之间，
-b2包括在0.7和0.77之间，
-b3包括在2和2.4之间，
-b4包括在0.1和0.2之间，
-b5包括在0.04和0.07之间，
-b6包括在4和4.6之间，
-b7包括在2和2.5之间，
-b8包括在0.28和0.32之间，
-b9包括在0.025和0.04之间，
-b10包括在2和2.2之间，
-b11包括在0.1和0.16之间，
-b12包括在0.7和0.9之间，
-b13包括在12和14之间；
-f3＝c1×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-c2×[β2-球蛋白(g/l)]+c3×Log[GGT(IU/l)]+c4×[γ-球蛋白(g/l)]-c5×[年龄(岁)]+c6×Log[ALT(IU/l)]-c7×[ApoA1(g/l)]-c8×[性别(女性＝0，男性＝1)]-c9，其中
-c1包括在3.45和3.65之间，
-c2包括在0.3和0.4之间，
-c3包括在0.8和1之间，
-c4包括在0.075和0.09之间，
-c5包括在0.0015和0.003之间，
-c6包括在2.1和2.5之间，
-c7包括在1.55和1.75之间，
-c8包括在0.35和0.45之间，和
-c9包括在4和4.6之间；
-f4＝d1×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-d2×[α2-球蛋白(g/l)]+d3×Log[GGT(IU/l)]+d4×[γ球蛋白(g/l)]+d5×[年龄(岁)]+d6×Log[胆红素(umol/l)]-d7×[ApoA1(g/l)]+d8×[性别(女性＝0，男性＝1)]+d9Log[ALT(IU/l)]-d10，其中
-d1包括在5.3和6.7之间，
-d2包括在0.45和0.5之间，
-d3包括在0.8和1.2之间，
-d4包括在0.06和0.08之间，
-d5包括在0.0015和0.0025之间，
-d6包括在1和1.2之间，
-d7包括在1和1.2之间，
-d8包括在0.09和1.1之间，
-d9包括在1.2和1.5之间，和
-d10包括在4和5之间。
-f5＝z1×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-z2×Log[触珠蛋白(g/l)]+z3×Log[GGT(IU/l)]+z4×[年龄(岁)]+z5×Log[胆红素(umol/l)]-z6×[ApoA1(g/l)]+z7×[性别(女性＝0，男性＝1)]-z8，其中
-z1包括在4和5之间，
-z2包括在1.2和1.5之间，
-z3包括在0.9和1.1之间，
-z4包括在0.0026和0.03之间，
-z5包括在1.6和1.9之间，
-z6包括在1和1.3之间，
-z7包括在0.25和0.35之间，和
-z8包括在5和6之间。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述的逻辑函数选自：
f1-a＝6.826×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.479×[α2-球蛋白(g/l)]+1.252×Log[GGT(IU/l)]+0.0707×[γ-球蛋白(g/l)]+0.0273×[年龄(岁)]+1.628×Log[胆红素(umol/l)]-0.925×[ApoA1(g/l)]+0.344×[性别(女性＝0，男性＝1)]-4.544；
f1-b＝6.552×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.458×[α2-球蛋白(g/l)]+1.113×Log[GGT(IU/l)]+0.0740×[γ-球蛋白(g/l)]+0.0295×[年龄(岁)]+1.473×Log[胆红素(umol/l)]-0.979×[ApoA1(g/l)]+0.414×[性别(女性＝0，男性＝1)]-4.305；
f2＝10.088×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.735×[α2-球蛋白(g/l)]+2.189×Log[GGT(IU/l)]+0.137×[γ-球蛋白(g/l)]+0.0546×[年龄(岁)]+4.301×Log[胆红素(umol/l)]-2.284×[ApoA1(g/l)]+0.294×[性别(女性＝0，男性＝1)]+0.0312[白蛋白(g/l)]+2.109[α1-球蛋白(g/l)]-0.136[β2-球蛋白(g/l)]-0.813×Log[ALT(IU/l)]-13.165；
f3＝3.513×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.354×[β2-球蛋白(g/l)]+0.889×Log[GGT(IU/l)]+0.0827×[γ-球蛋白(g/l)]-0.0022×[年龄(岁)]+2.295×Log[ALT(IU/l)]-1.670×[ApoA1(g/l)]-0.415×[性别(女性＝0，男性＝1)]-4.311；
f4＝5.981×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.481×[α2-球蛋白(g/l)]+0.965×Log[GGT(IU/l)]+0.0679×[γ球蛋白(g/l)]+0.0190×[年龄(岁)]+1.143×Log[胆红素(umol/l)]-1.097×[ApoA1(g/l)]+0.092×[性别(女性＝0，男性＝1)]+1.355Log[ALT(IU/l)]-4.498；
f5＝4.467×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-1.357×Log[触珠蛋白(g/l)]+1.017×Log[GGT(IU/l)]+0.0281×[年龄(岁)]+1.737×Log[胆红素(umol/l)]-1.184×[ApoA1(g/l)]+0.301×[性别(女性＝0，男性＝1)]-5.540。
10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述的逻辑函数最终值被用于决定对所述患者进行肝活检。
11. 根据权利要求1所述的方法，其中所述的患者患有涉及肝纤维化的疾病，可选择地是正在形成的肝硬化。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述的疾病包括乙和丙型肝炎、酒精中毒、血色沉着病、代谢性疾病、糖尿病、肥胖症、自身免疫性肝病、原发胆汁性肝硬化、α1-抗胰蛋白酶缺陷、Wilson病。
13. 根据权利要求11所述的方法，其中所述的疾病是丙型肝炎病毒感染。
14. 在患者中诊断炎症、纤维性或癌性疾病的试剂盒，其在使用至少4种生物化学标记物后可以确定所述患者中存在所述的炎症、纤维性或癌性疾病，其特征在于所述的生物标记选自α2-巨球蛋白、AST、ALT、GGT、γ-球蛋白、总胆红素、白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、触珠蛋白、β-球蛋白、apoA1、IL10、TGF-β1、apoA2、apoB。
15. 在患者中诊断肝纤维化和/或肝坏死性炎性病变的试剂盒，其在使用至少4种生物化学标记物后可以确定所述患者中存在肝纤维化、和/或肝坏死性炎性病变，其特征在于所述的生物标记选自α2-巨球蛋白、AST、ALT、GGT、γ-球蛋白、总胆红素、白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、触珠蛋白、β-球蛋白、apoA1、IL10、TGF-β1、apoA2、apoB。
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