CN100399896C - α-三噻吩用于防治松材线虫病的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及α-三噻吩的用途，尤其是用于防治松材线虫病的应用。实验证明，α-三噻吩对松材线虫有很强的毒性，浓度大于等于10-4g/g时很短时间里就能够将松材线虫全部毒杀。α-三噻吩可以直接对松树施用，也可以含有α-三噻吩的组合物不论是可湿粉剂、可乳化浓缩物、水溶液、乳液、可喷洒溶液、油性或水性分散系、悬浮剂、粉剂、颗粒剂还是微胶囊对松树施用，当施用量至施用后松树中α-三噻吩的浓度大于等于10-4g/g，即可防治松材线虫病的发生。α-T作为具杀虫活性的天然植物次生代谢物质，与其他化合农药相比，害虫不易产生抗药性。
Description
(一)技术领域
本发明涉及α-三噻吩(α-terthienyl，以下简称α-T)的用途，尤其是用于防治松材线虫病的应用。
(二)背景技术
松材线虫病(Bursaphelenchus xylophilus(Steiner & Buhrer)Nickle)又称松树萎蔫病，是松树的一种毁灭性流行病。松材线虫主要靠松墨天牛进行传播。松材线虫通过松墨天牛补充营养的伤口进入松树的木质部，并寄生在树脂道中。一般认为，这里光线穿透性很差，尤其对于胸径较大的松树而言，树龄较大其表皮也较厚。松材线虫在大量繁殖的同时移动，逐渐遍及全株，并导致树脂道薄壁细胞和上皮细胞的破坏和死亡，造成植株失水，蒸腾作用降低，树脂分泌急剧减少和停止。所表现出来的外部症状是针叶陆续变为黄褐色乃至红褐色，萎蔫，最后整株枯死。该病致病力强，寄主死亡速度快；传播快，且常常猝不及防；一旦发生，治理难度大。据不完全统计，我国自1982年发生该病后的10年间，发生面积约达38000hm2，造成松树死亡1400000株以上，损失木材50000m3。用于病害的防治经费亦达645万元。它不仅给国民经济造成巨大损失，也破坏了自然景观及生态环境，更对我国松林资源构成严重威胁。
松材线虫在分类学上属线形动物门Nemathelminthes，线虫纲Nematoda，垫刃目Tylenchida，滑刃科Aphelenchoididae，线虫由卵发育为成虫，其间要经过4龄幼虫期。雌、雄虫交尾后产卵，雌虫可保持30天左右的产卵期，1条雌虫产卵约100粒。在生长最适温度(25℃)条件下约4天1代。由卵孵化的幼虫在卵内即蜕皮1次，孵出的幼虫为2龄幼虫。秋末冬初，病死树内的松材线虫已逐渐停止增殖，并有自然死亡，同时开始出现另一种类型的3龄幼虫，称为分散型3龄虫，进人休眠阶段，翌年春季，当媒介昆虫松墨天牛将羽化时，分散型3龄虫蜕皮后形成分散型4龄虫，特称为dauer larvae(DL)，即休眠幼虫(耐久型幼虫)。这个阶段的幼虫即分散型3龄、分散型4龄幼虫在形态上及生物学特性上都与繁殖阶段不同，其抵抗不良环境能力加强，休眠幼虫适宜昆虫携带传播。
松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)又称松天牛或松褐天牛，松墨天牛在华东地区一般为1年1代；广东1年2-3代，以2代为主，在1年1代的地区，春天可见松材线虫分散型3龄虫明显地分布在松墨天牛蛀道周围，并渐渐向蛹室集中。这主要是由于蛹室内含有大量的不饱和脂肪酸，如油酸、亚油酸、棕油酸等对线虫产生趋化活性。当松墨天牛即将羽化时，分散型3龄虫蜕皮形成休眠幼虫，通过松墨天牛的气门进入气管，随天牛羽化离开寄主植物。1只天牛可携带成千上万条线虫，当松墨天牛补充营养时，大量的休眠幼虫则从其啃食树皮所造成的伤口侵入健康树。在松墨天牛产卵期，少量线虫也可从产卵时所造成的伤口侵入寄主，休眠幼虫进入树体后即蜕皮为成虫进入繁殖阶段，大约以4天1代的速度大量繁殖，并逐渐扩散到树干、树枝及树根。被松材线虫侵染了的松树大抵是松墨天牛产卵的对象。翌年松墨天牛羽化时又会携带大量线虫，并接种到健康树上，如此循环，导致松材线虫的传播。
虽然早在20世纪初就有关于松材线虫病的记载，但直到进入70年代才开始对该病害进行较为深入的研究，并取得了一些成果。然而，对松材线虫引起松树枯萎的机理至今尚无为大多数人所接受的解释，至今也未能找到彻底防治松材线虫病的药剂。
防治松褐天牛是控制松线虫病的重要途径。但采用天牛喷药法不能完全消除松材线虫病。
现有从毒杀松材线虫角度出发防治松材线虫病的药剂部分列举如下：
朱克恭等(朱克恭，姚仕义，张井义 克线磷防冶松材线虫病的研究 浙江林业科技1994，14(1)：16-19).进行了克线磷对松材病的防冶试验，结果表明，克线磷浓度在50×10-6以上时，灭虫率可达90％以上；在60×10-6以上时，则可完全抑制线虫的生长繁殖。林间试验，也证实其有一定的防治效果。但克线磷在土壤中被吸附的量，树体内有输导速度以及适宜的施药方法等问题，还没有很好的研究和解决，都有待于深入试验和探讨。
另外，阿维菌素也被证实可用于防治松材线虫病。试验表明，2％阿维菌素乳油按木材体积为400和600mL/m3(60～90mL/株)的剂量，注入树干防治黑松和马尾松上的松材线虫，持效期可达两年，第一年的防治效果为100％，第二年为88％。通过取样检查线虫在树体内的分布证实，阿维菌素可扩散到树的顶部。大剂量用药(210mL/株)对黑松生长无影响，药剂注入树体内对环境无污染(周明国林茂松2％阿维菌素乳油对松材线虫的生物活性测定 农药学学报.2001，3，40-44.)。
李周直等(李周直等.数种农药对松材线虫病的毒效试验.森林病虫通讯.1994(1)：23-26)对68％氧乐果原油、40％久效磷乳油、3％呋喃丹颗粒剂、25％滴滴涕乳油、2.5％杀螟硫磷乳油、98％硫酸铜(化学纯)、88％克线磷、5％涕灭威颗粒剂、L1210杀虫油烟剂及L1210杀菌油烟剂、乳化剂MPE、OP-3及0号柴油进行杀线试验，针对药剂不同的特性采用药液注射法、药液喷雾法、烟雾载药法、原木喷药法、天牛喷药法、松针枝条浸药法进行了杀线的试验，结果表明经过药剂注射处理的松林中，松树枯死率明显减少，仅为对照死树的1/7-1/2，但未能全部消除死树的发生；硫酸铜对松材线虫有一定有毒杀作用，但是要注意施药的浓度，树径在20cm左右，药液浓度1％不会产生药害，10％浓度就会造成药害；采用喷施的滴滴涕对减轻松材线虫病危害具有一定的防治效果，但需多次喷施才好，仅用一次的滴滴涕油乳剂防治效果不明显；采用喷雾施药也表明需多次施药才有效果。
赵博光(赵博光.双稠哌啶类生物碱分子结构与杀线活性间关系.林业科学1998，34(5)：61-68.)对双稠哌啶类生物碱与杀线活性间关系进行了研究，结果表明在苦豆碱、野靛碱、甲基野靛碱、苦参碱中，苦豆碱对松材线虫杀线活性最好。提出了双稠哌啶类生物碱对松材线虫的杀线活性强弱主要受其分子结构中官能团对的类型及其中的官能团的类型控制的假说。根据这一假说，推测了具高杀线活性的生物碱的分子结构。使用含苦豆碱的培养基培养灰葡萄孢菌菌丝的生物测定方法，当浓度为1×10-4g/ml和2.63×10-5g/ml时，苦豆碱对松材线虫的杀线活性为LC50＝2.63×10-5g/ml(赵博光，苦豆碱对松材线虫的杀线活性.林业科学，1996，32(3)：244～247)。
孙建华(孙建华，土壤真菌培养物对松材线虫虫生长和繁殖抑制作用的研究南开大学学报1997，30(5)：64~69.)从土壤分离的99株真菌以PSM(potato-sucrose-malt extract)培养基培养，检测其培养物对松材线虫生长和繁殖的抑制作用，结果发现18号菌株(经鉴定为总状共头霉，Syncephatastrum racemosum)显示了极强的抗线虫活性，经初步分析其活性成分为水溶性的物质。李国红，张克勤(李国红，张克勤 一种新的杀线虫担子菌 云南大学学报(自然科学版)2001，23(2)：149～152)首次发现一种具杀线虫活性的担子菌YL14，12h内对松材线虫的致病率达90％以上。
Cromopton，(Crompton D.Ascariasisad its public healthsignificance.Toylor and Francis，London and Philadelphia，1985：243~244)首次在试验中用抗生素抑制致病细菌的方法控制了松材线虫病病状的发生。另外赵博光等(赵博光，郭道森，高蓉，郭建细菌分离物B619与松材线虫病关系的初步研究南京林业大学学报2000，24(4)：72-74)对抗生素对松材线虫病的影响作了研究，结果证明了通过控制致病细菌的方法可以控制松材线虫病。
α-三噻吩(α-T)是近年来人们从一些植物的次生物质中发现的植物源光敏毒素。其分子式为C12H8S3、结构式为：
植物源光敏毒素在光照条件下对害虫的毒杀效果成几倍、几十倍甚至上千倍地提高，显示出光活化的特性。环境的光照条件，对它的作用效果有巨大的影响。甚至于目标物昆虫的体壁的透光性也对药效有影响。植物源光活化毒素对人畜低毒、在环境中能迅速降解并以高效杀虫活性成为合成杀虫剂潜在的替代物。已发现的植物源光敏毒素主要有呋喃香豆素、噻吩类、聚乙炔类、醌类以及由色氨酸衍生的生物碱和异喹啉生物碱等。其中噻吩类化合物是存在于菊科植物中的一类特征性次生物质，Heitz等人称其对多种传病蚊虫、线虫、螨类都具有很好的光活毒杀作用。(Heitz J.R..Downum K.R.ACS Symposium Series 339，1987)；(J.R.Heitz，K.R.Downum Light-activated Pesticides Control，ACS SymposiumSeries 339，1987)；(Hertz et al.1995 J.R.Heitz，K.R.DownumLight-activated Pesticides Control，ACS Symposium Series 616，1995)。但Heitz等人的上述文献中是对噻吩类化合物的光活化作用机理做了分析，并提出了上述论点，而没有对噻吩类具体化合物的杀线虫研究报道。徐汉虹、赵善欢在华南农业大学学报，1995.16(1)：127-132.及万树青、徐汉虹、赵善欢等在第十届中国农药年会论文集，2000，339-343.中的文章中也引用Heitz等人的上述结论。产业中，噻吩类化合物已开始用于田间防治蚊子幼虫。
α-T最初是从万寿菊花、叶中分离出的一种光活化毒素。它主要分布集中于菊科植物中的Ambrosia，Hymenatherum，Pectis，Porophyllum等几个属中，我国是从1992年开始对此进行研究。研究发现，万寿菊Tageteserecta、孔雀草Tagetes patula、广泛分布于我国的杂草鲤肠Ecliptaprostrata和分布于新疆的植物深裂刺头菊(Cousinia dissecta Kar etKir)中也含有α-T。Yamazaki(1985)、Kagan和Arora(1983)Kagan，J.and Arora S.K.1983.2.5-Di(2’-thienyl)furan and an imporovedsythesis of alpha-terthienyl.Heterocycles 20：1941-1943等已在实验室成功合成α-T，B.J.R.Philogene，J.T.Arnason(1985)(B.J.R.Philogene，J.T.Arnason，et al.Synthesis and Evaluation of the NaturallyOccurring Phototoxin，Alpha-terthienyl，as a Control Agent for Larvae of Aedesintrudens，Aedes atropalpus(Diptera：Culicidae)and Simulium verecundum(Diptera：Simuliidae).J.Econ.Entomol.79：121-126(1985))对Yamazaki的方法进行了改进，设计了两种合成路线。一种是以2，2-二噻吩和2-溴噻吩为反应物，以铜粉为催化剂经过提取纯化，可得到纯度达99％的目标物。另一种是以2-溴噻吩和镁在一定条件下反应得到2-噻吩溴化镁，2-噻吩溴化镁与2，5-二溴噻吩反应得到目标物。陈祖兴、张胜利(1997)用等效剂法，将α-三噻吩醛转化为氰醇碳酸酯，并以其作为α-噻吩甲酰基负离子的等效剂与1，2二溴乙烷进行亲核取代反应，继而环化，得目标物。
已有实验证实，α-T在光照条件下通过吸收光线，引发单线态氧产生光动力作用而对细胞造成损害，主要靶标为脂类、蛋白质和核酸等重要细胞组分。具有蛋白质本质的多种生物酶系，可因光动力作用引发酶活性部位或结合部位附近必需氨基酸的破坏，或引起维持酶正常催化功能的分子结构所需的远端氨基酸残基的降解，导致酶的失活。α-T对昆虫体内的6-磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、乙酰胆碱酯酶、超氧化物歧化酶等均有抑制作用。
自Zechmeister和Sease(Zechmeister L..and sease，J.W，Ablue-fluorescing compound，terthienyl，isolated from marigolds.J.Am.Chem.Soc.1947，69：273-275)从Tagetes.erecta的花中提取出分离物α-T之后，开始了对α-T的光敏化生物学的研究。Uhlenbroek和Bijloo(Uhlenbroek J.H，and Bijloo J.D.1960.Investigations onnematocides.III.Polythienyls and related compounds.Rec.Trav.Chim79：1181-1196)发现有灭蚊作用。且有无紫外光照对α-T的毒性影响很大，在近紫外光照的条件下，α-T对斑须按蚊(Anopheles stephensi)4龄幼虫的LC50为11mg/L，黑暗时则为154mg/L，其光活化毒杀活性提高了14倍；α-T对埃及伊蚊(Aedes aegypti)、白纹伊蚊(Aedes alpopictus)和致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)的光活化毒性也有类似结果(1994)；有资料表明α-T对果蝇卵的毒杀活性则可提高4333倍(1975)。Philogene等(1979)对Blackfly的幼虫试验结果为LC50为28ppb，LC90为70ppb。
除了上面提到的α-T对于几种常见的卫生害虫的作用研究，研究人员也就α-T对于农林害虫中鳞翅目的害虫的作用进行了研究。Lyengar(LyengarS.Arnason J.T.Philogene B.J.R.Toxicokinetics of the phototoxicallelochemical α-terthienyl in three herbivorous Lepidoptera[J].Pestic.Biochem.Physicl，1987.29：1-9)研究了α-T对3种鳞翅目害虫烟草天蛾、烟芽夜蛾、欧洲玉米螟的毒杀作用。点滴处理的LD50值，烟草天蛾为10μg/g(虫重)，烟芽夜蛾为474μg/g(虫重)，欧洲玉米螟为698μg/g(虫重)。Helson等(Helson B.Kaupp W.Cecearelli，et al.Variation in susceptibility of tree-feeding insect species tophotoactivted thiophene insecticides.J Economic Entomology，1996.89(4).821-825)等用α-T对云杉卷叶蛾(Choristomeurafumiferana)、黑行军虫(Actebia fennica)、白斑天幕毛虫(Orgyialeucostigma)等16种森林昆虫进行了试验。其LD50在7ng/虫到5000ng/虫之间。扣除虫种影响下，敏感性差异达500倍。产生这种差异的原因推测可能由于虫种的体表透光性、体内抗氧化剂及抗氧化酶的含量和代谢酶的活性的不同而产生的，其中多底物单氧化酶的活性，在敏感种与抗性种上的差异达10倍。
另外，Singh(Singh S.P.Sharma P.Vats L.K.1987Light-depentent toxicity of the extract of plant Tagetes erecta andalpha-terthienyl toward larvae of mosquito Culex tritaeniorhynchus.Toxicological Environ Chem 16.81-88)等报道万寿菊花的乙醇提取物在阳光照射下可以显著提高对三带喙库蚊幼虫的毒杀效果，可能是由于提取物中含有如α-T一类的光敏物质。Salloum(Salloum G.S.Isman M.B.Crudeextracts of Asteracaous weeds，growth inhibitors for variegated worm.J.Chem.Ecol.1986，15(4)：1379-1389.)发现2种菊科植物(Artemisiatridentata和Chamomilla suaveolens)的石油醚及乙醇提取物以及另外2种植物(Chrysothamnus nauseosus和Centaurea diffusa的乙醇提取物在自然含量的5倍浓度时能强烈抑制豆杂色夜蛾(Peridromasaucia)幼虫的生长。前两种植物的自然含量也对夜蛾幼虫有生物活性。Weaver(1997)分析了墨西哥万寿菊(Tagetes minuta)花的提取物对玉米象(Sitophilus zeama)成虫的光活化毒性，在光照下雌虫LD50为35μg/虫、LD90为319μg/虫，雄虫LD50为47μg/虫、LD90为816μg/虫。
国内专门研究α-T的报道不多，研究人员对含有α-T的提取物进行了一些试验。乐海洋(乐海洋.胜红蓟、万寿菊和柔毛水蓼对农业害虫生物活性初试.广东农业科学，1992.6：34-36)报道了万寿菊根和花的提取物对中华按蚊(Anopheles sinensis)幼虫的具有光活化毒杀作用。乐海洋等(乐海洋赵善欢万寿菊提取物对白纹伊蚊幼虫的光活化活性及有效成分研究华南农业大学学报199819(2)：8～12)报道了万寿菊提取物对白纹伊蚊幼虫的光活化活性及有效成分研究，模拟室外防治试验结果表明，12mg/L的万寿菊根甲醇索氏提取物能有效防治白纹伊蚊。另外乐海洋(乐海洋，赵善欢.几种菊科植物提取物对蚊幼虫的光活化性初试.华南农业大学学报.1997，18(1)：20-24)研究了8种菊科植物的20种提取物对白纹伊蚊(Aedes albopictus)和致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)及菜粉蝶(Pieris rapae)的光活化毒性及非光活化毒性，结果发现万寿菊(Tagetes erecta)、三叶鬼针草(Bidens pilos)、胜红蓟(Ageratumconyzoides)、加拿大飞蓬(Conyza canadensis)和希莶(Siegesbeckiaorientalis)的提取物有较好的光活化毒性。崔德君(崔德君.万寿菊粗提取物对小菜蛾的生物活性和作用机制研究[博士论文].华南农业大学，1997.)也进行了万寿菊粗提物和α-T对小菜蛾(Plutella xylostella)的卵、幼虫和成虫的毒杀试验。研究发现两者都对小菜蛾幼虫有拒食作用和生长发育抑制作用。万树青等(万树青.多炔类化合物杀虫活性及其作用机理研究：[博士论文]：华南农业大学，1998)以茵陈二炔为母体合成了10多个聚乙炔类化合物，对这些化合物的生物活性进行了广泛的测定。试虫包括致倦库蚊、赤拟谷盗、亚洲玉米螟、甘兰蚜、米象、大豆蚜、菜粉蝶、美洲大蠊、槐尺蠖及棉红蜘蛛。除活性测定外，还从酶化学及电生理方面对聚乙炔类化合物的作用机理进行了研究。
另，有报道称，利用万寿菊根的水抽提物，对于多种植物根结线虫有毒杀作用，如马铃薯的金线虫、甜菜异皮线虫、林果及花卉上的根结线虫等。这些植物线虫属于线形动物门线虫纲根结线虫属，它主要分布在5-30厘米土壤中，主要危害根部，严重时，引起植株凋萎，甚至枯死。
推测，万寿菊中含有α-三联噻吩(α-T)、5-(3-J烯-1炔基)-α，2′-二噻吩及其它活性物质，它们中的一种可能能杀死根结线虫。但究竟是哪种物质起作用未见确切的研究报道。同时，根结线虫所生活的浅表层土壤的透光性稍好，这就可能给光活化活性物质发挥有效作用提供了条件。
至今尚未有专门研究α-T用于杀死松材线虫及应用于防治松材线虫病的报道。一般认为：1、α-T只对于卫生害虫及农林害虫中的鳞翅目害虫起毒杀作用；2、松材线虫寄生在光照条件很差的松树的木质部的树脂道中，任何可能毒杀松材线虫但需依赖于光照条件的光活化毒素在此都无法发挥作用。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供已知化合物α-三噻吩的新用途。
实际上，本发明涉及α-三噻吩用于防治松材线虫病的应用。
进一步的，本发明涉及α-三噻吩在防治松材线虫病的药剂中的应用。
具体的说，以任意的施用方法，不论是打孔注药、根部施药、喷雾防治，对松树施用α-三噻吩或含有α-三噻吩的组合物对松材线虫病有防治作用，当施用至松树中α-三噻吩的浓度大于等于10-4g/g，即可防治松材线虫病的发生。
上述含有α-三噻吩的组合物含有有效量的α-三噻吩和载体。
上述含有α-三噻吩的组合物中，α-三噻吩的含量占组合物总重量的0.0005-99％，较佳地为10-99％，更佳地为60-99％。
含有α-三噻吩的组合物可为下组的剂型：可湿粉剂，可乳化浓缩物，水溶液，乳液，可喷洒溶液，油性或水性分散系，悬浮剂，粉剂，颗粒剂，微胶囊。
含有α-三噻吩的组合物可为α-三噻吩的丙酮水溶液或乙醇水溶液，α-三噻吩的含量占组合物总重量的0.001-99％。
上述含有α-三噻吩的组合物对下列的松树施用至松树中α-三噻吩的浓度大于等于10-4g/g时，即可防治松材线虫病：赤松、黑松、马尾松、黄松、海岸松、火炬松、湿地松、琉球松、白皮松等松属植物及冷杉属、云杉属、雪松属、落叶松属植物。
上述含有α-三噻吩的组合物通常含0.001-95％的活性成分(即α-三噻吩)。浓缩型的农药中活性成分的含量较高，如85-95％，而稀释型的农药中活性成分的含量较低，通常为0.001-20％。此外，还可以含有其它合适的化学杀菌剂、增效剂、微量元素、稳定剂、粘合剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、渗透剂、溶剂、充填剂等常用成分。
上述含有α-三噻吩的组合物还可以含有其它具有杀虫活性的物质，化肥和、或生长调节剂。
上述含有α-三噻吩的组合物的适用的形式包括适合喷洒、喷雾的气雾剂、水性或非水性溶液或分散系。优选方式是水性母液和易溶于水的颗粒形式。特别是α-三噻吩的丙酮水溶液或乙醇水溶液。
上述含有α-三噻吩的组合物可由α-三噻吩和载体采用一般方法均匀混合而成。
为了更好地理解本发明的实质，下面将通过α-三噻吩对松材线虫的毒杀试验及结果来说明其在防治松材线虫病的药剂中的新用途。
首先，测定松材线虫在生理盐水中生存的最适浓度：
取一定的氯化钠溶于蒸馏水中配制成0.95％、0.85％、0.75％、0.65％、0.5％、0.45％六个浓度，将各浓度溶液依列倒入血球计数器，然后在每个小格中加入准备好的已分离的松材线虫300条。2天后观测松材线虫的存活情况，结果表明当浓度为0.85％时松材线虫存活数最多。本试验目的是想在室内保证松材线虫有较好的活性。让它尽量与林间松材线虫有相同的活性，在今后相关的实验中，就可取0.85％氯化钠溶液与其他试剂相配，保证松材线虫本身能有很好的活性增加杀线剂试验的准确性。
二、测定同一光照强度下不同浓度的α-T对松材线虫的毒杀作用
配制1升0.85％的生理盐水作为溶液，α-T作为溶质，配制浓度分别为10-9，10-8，10-7，10-6，10-5，10-4g/mL六个浓度的溶液。将配制好的溶液倒入血球计数器中，每一列倒入一个浓度，一个浓度为一种处理，每个处理四个重复即每一浓度倒入一列中的4个小格，另外留一列只加入0.85％的生理盐水作为对照，每个小格中加入200条松材线虫，将血球计数器放置25℃的保温箱中，取光度计测得箱内光照强度为450Lux，每隔两小时观察松材线虫数，记录不同时间不同浓度下的松材线虫数。计算公式如下：
将浓度取其对数值后全部加10的值为x，致死率查“反应率-机率值转换表”换成机率值为y值，用回归方法求出毒力的回归方程y＝a+bx，并以y＝5时(致死率为50％的机率值)代入回归方程，求出x，再取x-10的10次方求出EC50(致死中浓度)。
由统计方法，计算出α-T的不同浓度在16h后对松材线虫的致死率，求出α-T在保温箱中即光照强度450Lux，25℃下的EC50：1.48×10-6g/ml，数据列于表1。做出随处理时间延长不同浓度中松材线虫的死亡曲线，图1、图2、图3、图4分别是10-8g/ml、10-7g/ml、10-6g/ml、10-5g/ml浓度的α-T溶液对松材线虫的作用。
表1α-T对松材线虫的毒杀作用
本试验表明α-T对松材线虫是有很强的毒性的，而且在很短时间里就能够全部将松材线虫毒杀，浓度越大毒杀松材线虫速度越快，我们看到在10-4g/ml时，在6h后就将全部松材线虫杀死。同时考虑到α-T作为光敏毒素，光对它是很重要的，在试验中，我们一直将被处理物置于光照条件下，这也可能是导致作用效果迅速的一个原因。但是在保温箱中光照强度是很小，即使这样却已能激发了α-T的活性。
三、不同光照强度下不同浓度的α-T对松材线虫的毒杀试验
以0.85％的生理盐水作为溶液，α-T作为溶质，配制浓度为10-4，10-5，10-6，10-7g/ml溶液。将配好的溶液倒入血球计数器一个浓度倒入一列，倒入7个血球计数器，向每个小格内加入松材线虫200条。用光度计在日光灯下分别在不同高度测量光照强度，使光照强度分别为20000，10000，5000，2500，1250，625，312.5Lux。将血球计数器放置在已固定好位置的不同光照强度下，在每个血球计数器取一列加入0.85％的生理盐水和200条松材线虫作为对照。处理8h后观测松材线虫的存活数，并作记录。见下：
表2不同浓度的α-T在不同光照强度下对松材线虫的作用
图5为不同光照强度和不同浓度α-T中松材线虫的存活曲线
由表2可看出光照强度在20000Lux时，对照中松材线虫存活不好，说明此时光线太强影响到松材线虫的正常的存活。究其原因，作者认为不可能是受热过大而引起的，因为在本试验之前就已发现如果要达到本实验要用的光照强度，一般的日光灯是不行的，初期的试验发现虽然光照强度达到试验要求，但是由于取用一般日光灯，光照强度变大同时发热也增强，导致试验中的松材线虫溶液温度高，松材线虫常发生全部死亡的现象。故而在本试验中是采用特别的灯具，要求发热很小，但是光强却能达到试验要求。在发现对照中松材线虫数不多时，发现光照下的血球计数器发热的，测表面温度约27℃左右，这对松材线虫是不会致命的，对照中的松材线虫数小可能是由于松材线虫对光照强度过大的反应所致。在光照强度在10000Lux时，对照中松材线虫存活则很好，相反加入试剂的处理则全部死亡，这是由于光照强度大使得α-T毒素发挥强作用，即使是10-7g/mL这么小的浓度松材线虫也全部死亡。图3.2是将10-5、10-6、10-7g/mL不同光照强度和不同浓度下松材线虫的存活曲线，由于10-4g/mL在观测时松材线虫全部死亡故未做图示，当浓度10-7g/mL时，松材线虫随光照强度的变化其松材线虫数曲线较为平缓，在小于2500Lux后基本很少再发现有松材线虫死亡，对松材线虫的致死率也很小约14.5％；浓度10-5g/mL和浓度10-6g/mL在光照强度大于1250Lux时，对松材线虫毒杀效果好，致死率约92％和80.5％。
采用如下的生测方法进行α-T对松材线虫的毒杀试验：
在新鲜黑松枝上取直径为0.3cm、0.6cm、0.9cm，厚度0.5cm的小木块，每个直径取6木块，将木块放入干燥箱中干燥4h，用电子天平测木块干燥后的重量，计算出木块的平均干重。另取相同的木块干燥4h后，滴水使木块含水量近饱和，记录滴水量，计算出平均滴水量。根据所得的平均滴水量和木块的平均干重来配制不同浓度的α-T溶液使干燥的木块在加入配制的α-T溶液后木块含水量近饱和易于药剂在木块的完全分布，且α-T在木块中的浓度也符合试验的要求。每个直径取3个木块在同一面上加入α-T使得木块中α-T含量为10-5g/g，在加有α-T的木块的另一面滴加松材线虫300条。在余下的3块木块中也加入300条松材线虫作为对照。将所有木块置于10000Lux光照强度下，使得木块每天受光照12h并每天翻动一次保证木块两面受光均匀，四天后用贝尔曼漏斗法分离木块中的松材线虫，观测并记录木块中松材线虫的存活数。
数据见表3，当α-T在木块中浓度为10-5g/g，光照强度10000Lux下，直径0.3cm的木块中松材线虫致死率为93％；直径0.6cm、0.9cm的木块中的松材线虫致死率为88.5％和84％，出现这种结果推测可能由于直径较大透光性不如直径小的好，直径大小对试剂的毒杀作用产生一定的影响。另外对照中的松材线虫无论是直径大小松材线虫都存活良好，说明药剂对木块中的松材线虫还是产生了毒杀作用。但是否对松材线虫实际防治工作有所帮助那要在下面做进一步的研究。
表310-5g/g的α-T在10000Lux光照强度下对不同直径黑松木块中松材线虫的作用
四、α-T对松材线虫毒杀作用的林间试验
取两年生的黑松苗一棵，截松苗枝上一段松枝用电子天平测其重量，按这一段松枝在整个松苗上的重量比例估算整棵黑松苗的重量。
选12棵两年生长势良好的黑松苗，每两棵为一组。在松苗基部用小刀切深约0.4cm的切口，取一个小塑料离心管，将管顶端用刀斜切一小口，将离心管插入伤口处，用封口膜将离心管与伤口接触处密封，从离心管的另一端注入α-T。使得黑松苗中α-T含量分别为10-4，10-5，10-6g/g，每种浓度处理两棵黑松。取已注药处理过的6棵松树苗和2棵未处理的松苗，在每棵松苗侧枝顶端，用刀削去顶梢部针叶露出侧枝枝端，在侧枝端顶用小刀切小口，取塑料离心管一支切去离心管下端一截使得离心管可与切开的侧枝端相接，用封口膜密封接口确保当从离心管另一端加入松材线虫时松材线虫不发生泄漏，在每棵树苗中加入松材线虫5000条。取2棵如前面的方只加入松材线虫5000条，另取2棵健康松树作为空白对照。一个月后观测树苗的存活情况。
一个月观测树苗发现，作为空白对照树苗(即未加药处理也未加注松材线虫)长势良好，没有发现有松脂减少和松针变色；两棵只注入松材线虫的松苗松脂明显减少、叶发黄，说明用这种方法注入的松材线虫已经发病；在用α-T浓度为10-4g/g的处理过的松苗中，松脂未发现减少，松树生长正常，说明在黑松上加入10-4g/g的α-T时可对松材线虫有毒杀作用，可以防治松材线虫病的发生。而浓度为10-5g/g处理过的松苗有一棵表现了松脂减少、失水、少量叶发黄变色。10-6g/g处理过的两棵松苗也全部发病。
上述试验表明，α-T对松材线虫是有很强的毒性，而且在很短时间里就能够全部将松材线虫毒杀，浓度越大毒杀松材线虫速度越快，我们看到在10-4g/ml时，在6h后就将全部松材线虫杀死。同时我们考虑到α-T作为光敏毒素，有光的照射对它是发生作用是很重要的。在试验中，我们一直将被处理物置于光照条件下，虽然光强很小但是却能够激活其活性，表现了很好的毒杀效果。
进一步的试验研究了光对于α-T的活性的重要性，配制了不同浓度的试剂溶液放在不同光照强度下，试验结果也很好地说明了光照强度的不同会大大的影响α-T的活性，影响其作用速度，我们看到在10000Lux时，即使10-7g/g这么小的浓度也将松材线虫全部杀死，这就充分说了明了光对其活性的重要性了。
其后，应用所述的生测方法，用木块在室内进行了模拟林间的的杀线试验。结果表明要木块中α-T浓度为10-5g/g，光照强度10000Lux时，其致死率高达93％，随采用的树枝变粗致死率有所下降但也达到84％。致死率下降有可能是由于树枝变粗，树龄较大其表皮也较厚，光线穿透不良，但是可看出影响并不是很大，其致死率也是较高的，如此高的致死率如能林间也达到那将可能对松材线虫的防治有很大的帮助。
最后对两年生的黑松苗进行了林间接种加药处理，结果表明在10-4g/g的浓度下，接种黑松苗没有发病，长势良好，而接种未加药处理的黑松苗则表现了发病症状，浓度为10-5g/g处理过的松苗有一棵表显了松脂减少、失水、少量叶发黄变色，另一棵则没有发病，推测原因可能树体对药液的吸引可能不好。在浓度10-6g/g处理过的两棵松苗也全部发病。需要说明的是由于松苗移植后管理不善发生大量死亡，只留下少量存活，故而在本试验设计的很多重复不能够进行，只能每种处理重复两棵，但是所选的树苗是长势均是很好很健壮的树苗，得到的结果是可信的。
从上述结果，可以得出本发明的优点在于：
1、本发明对已知植物源光敏毒素α-三噻吩发掘了新的用途，开拓了一个新的应用领域。
2、本发明的α-三噻吩对松材线虫是有很强的毒性，在很短时间里就能够全部将松材线虫毒杀，浓度越大毒杀松材线虫速度越快，在10-4g/ml时，在6h后就将全部松材线虫杀。在光照条件下对害虫的毒杀效果成几倍、几十倍甚至上千倍地提高，显示出光活化的特性。
3、本发明的α-三噻吩是一种植物源光活化毒素，对人畜低毒、在环境中能迅速降解且杀虫高效。它具有传统杀虫剂无法比拟的优点。首先就是它的光敏性，在光照的情况下，其药效显著增强；其次，目标物对它不易产生抗性，对非靶标生物的毒性极低；第三，它在细胞上的生化作用位点较多，决定了它与传统杀虫剂之间不易产生交互抗性。此外，它还具有高效的特点，光敏物质如染料分子本身并不介入毒性反应，致使起催化剂的作用，光敏剂从被激发到单重态，最后回到基态，大约只要10ms或更短。但同时我们也应看到，它是光活化杀虫剂，这就要求环境要有较好的光照条件，如果环境中光照条件不良会影响到它作用效果。尽管如此，α-T药效强、害虫不易产生抗性、残留时间短，将其开发用于农林上的杀虫剂有广阔前景。
4、当今使用的有机合成杀虫剂大多是光分解的或在光照条件下药效降低，而且许多植物体内具有杀虫活性的次生产物也是光分解的，例如人们熟知的除虫菊酯、鱼藤酮等。同时由于长期使用化学合成杀虫剂而带来了害虫的抗药性(Resistence)、害虫再猖獗(Resurgence)、残留(Residue)问题，即著名的“3R”问题。为了解决这些问题，需要高效、低毒、低抗性、低残留的安全的杀虫剂，α-T作为具杀虫活性的天然植物次生代谢物质，在有光照条件下，药效不但不会降低而且会由于光活化作用而增强，达到高效杀虫的目的。对于杀虫剂带来的″3R″问题，由于其充分利用生物生长环境中无所不在的两个自然因子——光和氧，提高了化合物的杀虫效果。与其他化合农药相比，光不仅提高了α-T的药效，而且它是植物抵御害虫的长期进化中所形成的，害虫不易产生抗药性。
5、本发明的α-三噻吩已有较简单的人工合成工艺。获取方便。
6、α-T作为一种植物中的次生物质，由植物中提取，它具有很好的内吸性且能够在树体中输送，这样就给α-T的施用提供了多种能达到杀虫效果的方法。不论是打孔注药、根部施药、喷雾防治均可。施用方便。
(四)附图说明
图1、图2、图3、图4分别是10-8g/ml、10-7g/ml、10-6g/ml、10-5g/ml浓度的α-T溶液中松材线虫的存活曲线
图5为不同光照强度和不同浓度α-T中松材线虫的存活曲线
(五)具体实施方式
实施例1：购进Sigma公司产品α-三噻吩，用少量丙酮溶解，加水配成浓度为100g/L的溶液，使用江苏博华生物技术有限公司生产的高压大容量树木注干机6HZ-0503型注干机在树干基部注射(距地面15cm以内)，每年6月底之前对松树林进行施用。注射量按树的材积计算，实际注射量＞100g/m3。在施用后当年松树不会发生松材线虫病。
实施例2
使用Sigma公司生产的纯度＞95％的α-三噻吩，以少量丙酮溶解，加水配成浓度为100g/L的溶液，于每年5-6月，使用背负式打孔机在距离地面10cm以下的树干四周均匀打孔(胸径每增加3cm多打1个孔)，孔向下倾斜45°左右，深度1.0～1.2cm，每孔注射α-T溶液，总注射量按树的质量和溶液中溶质α-三噻吩的质量计算，每克质量的树中注射α-三噻吩的质量大于10-4g。用稀泥堵塞孔眼。在施用后当年松树不会发生松材线虫病。
实施例3
使用Sigma公司生产的纯度＞95％的α-三噻吩，以少量丙酮溶解，加水配成浓度为100g/L的溶液，于每年5-6月，采用树干包扎法施药。具体做法是，用砍刀在树干胸高处刮去粗皮至形成层(不能伤及形成层)，刮皮面积100cm2，然后用药棉吸附α-T水溶液贴于刮皮处，再用塑料布包紧扎好。胸径10cm以下，用药量30ml，胸径每增加3cm，用药量增加10ml，胸径20cm以上，用药量250ml以上。施药后当年，松树不会发生松材线虫病。
实施例4
每年在6月之前，使用Sigma公司生产的纯度＞95％的α-三噻吩，以少量丙酮溶解配制成100g/L的水溶液，对郁闭林地进行地面喷雾用药量为200g/亩。如有机场条件，可考虑利用飞机喷施防治。施药后当年，松树不会发生松材线虫病。
实施例5
每年在6月之前，使用Sigma公司生产的纯度＞95％的α-三噻吩，以乙醇配制成10g/L的贮备母液，加水配成浓度为100g/L的溶液，对林木进行地面喷雾用药量为300g/亩。施药后当年内，松树不会发生松材线虫病。
实施例6
每年在6月之前，在二甲苯和水的混合液中加入Sigma公司生产的α-三噻吩，再加入适量的壬基酚聚氧乙烯醚作分散剂，搅拌，配制成油乳剂，其中α-三噻吩的含量为100g/L，对林木进行地面喷雾，用药量为200g/亩。施药后当年松树不会发生松材线虫病。
实施例7
用Sigma公司的α-三噻吩及乙撑三胺和三乙胺反应制成胶囊，其中α-三噻吩为胶囊质量的55％，每年在6月之前对林木进行施药，用药量为400g/亩，施药后当年松树不会发生松材线虫病。
以实施例1所示的注干法是最经济的施用方法，它不会象喷施法中部分α-三噻吩不可避免地浪费在土壤及植物表面。
当然，本发明有多种实施形式，只要对松树施用α-三噻吩或含有α-三噻吩的组合物如α-三噻吩的丙酮水溶液或α-三噻吩的乙醇水溶液或其它形式的α-三噻吩的溶液，施用量至施用后松树中α-三噻吩的浓度大于等于10-4g/g，即可防治松材线虫病的发生。这对本领域技术人员而言，阅读本说明书后毋需付出创造性劳动即可再现出，在此就不详述了。
Claims (4)
1.α-三噻吩用于防治松材线虫病的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：以任意的施用方法，对松树施用α-三噻吩或含有α-三噻吩的组合物，施用量至松树中α-三噻吩的浓度大于等于10-4g/g。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：以注干法对松树施用α-三噻吩的丙酮水溶液或乙醇水溶液，施用量至松树中α-三噻吩的浓度大于等于10-4g/g。
4.α-三噻吩在防治松材线虫病的药剂中的应用。
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