CN100393739C - 用于毛细管电泳DNA片段分离的低pH筛分溶液体系 - Google Patents

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本发明提供了一种用于毛细管电泳分离DNA片段的低pH筛分溶液体系。其基体缓冲溶液的pH值在6.5～7.5左右，优选为7.0左右。该筛分体系可用于毛细管电泳在紫外检测条件下分离相差一个碱基的DNA片段。

Description

用于毛细管电泳DNA片段分离的低pH筛分溶液体系
技术领域：
本发明提供了一种用于毛细管电泳分离DNA片段的低pH筛分溶液体系。其特征在于基体缓冲溶液的pH值在7.0左右。该筛分体系可用于毛细管电泳在紫外检测条件下分离相差一个碱基的DNA片段。
背景技术：
毛细管无胶筛分电泳的DNA分析在分子生物学基础研究中有重要的应用价值。其技术关键在于使用具有高分辨率的筛分介质。目前用于毛细管无胶电泳的高分子筛分介质是水溶性高分子溶液。目前公开报道的DNA分离介质对DNA片段的分离都是在pH值较高的TBE(Tris-borate-EDTA，即89mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，89mmol/L硼酸(boric acid)，2mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，pH＝8.3)，TTE(Tris-TAPS-EDTA，即50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，50mmol/L TAPS(N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-amino-propanesulfonic acid)，2.0mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，pH＝8.2)，TAPS-NaOH(100mmol/Lol/L N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-amino-propanesulfonicacid，用NaOH调pH值到8.0)等缓冲液中进行的，而且采用的是荧光试剂和激光诱导荧光检测手段的条件下获得的。用于紫外检测条件则分离效果很差。较高pH值的缓冲溶液还有可能使如丙烯酰胺类的DNA筛分介质发生水解，从而影响分离效果。一般使用的荧光试剂价格昂贵，毒性大，如溴化乙锭(EtBr)。激光诱导荧光检测器的价格又使其不易推广。而在紫外检测条件下，毛细管电泳单碱基分离DNA片段还比较困难。
关于聚丙烯酰胺(LPA)、聚N，N-二甲基丙烯酰胺(PDMA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，以及它们的混合溶液体系作为DNA分离介质的情况已有诸多报道。
1990年，已有聚丙烯酰胺(LPA)作为DNA分离介质的报道。多年来的研究结果显示，聚丙烯酰胺(LPA)的黏度大，操作不便，不能在空柱中使用，在碱性条件下容易水解，等等。
关于聚N，N-二甲基丙烯酰胺(PDMA)作为DNA分离介质，文献(MadabhushiR S，Electrophoresis，1998，19：224-230)认为其粘度小，具有动态涂层能力分离能力较强。用TAPS-NaOH(pH8.0)缓冲溶液稀释的6.5％PDMA(Mw98，000)用作四色荧光测序介质在42℃时，空柱条件下，其单碱基分辨率可达600碱基左右，但是其中还是有一些没有分开的片段。
关于聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为DNA分离介质，文献(Gao Q F，Yeung ES，Anal.Chem.，1998，70：1382-1388；Song J M，Yeung E S，Electrophoresis，2001，22：748-754)报道，其水溶性好，粘度小，有自动涂层能力，单色测序时，用TBE缓冲溶液稀释的7％商品化的PVP(Mw1,000,000)能分离350bp的DNA片段。而在四色测序中，发现染料标记的DNA片段的迁移率要比普通条件下更大，需加入10M尿素才能减少这种迁移差异。但是这种特殊条件下使用的含有极高浓度尿素的介质溶液并不易于常规使用。
文献(Song L，Liu T，Liang D，et al，Electrophoresis，2001，22：3688-3698)提供的一种新的DNA分离介质，即聚丙烯酰胺和聚乙烯吡咯烷酮的互穿网络(interpenetrating  networks of polyacrylamide and polyvinylpyrrlidone，LPA/PVP)体系。这种体系的粘度小，具有动态涂层能力，分离效率高，分离的重现性好。用TBE缓冲溶液稀释的2％PVP(Mw1,000,000)和1％LPA(Mw400,000)的混合物溶液可以将DNA标准样品pBR322/HaeIII中的22个片段很好地分开，而且123/124bp达到了单碱基分离。但是其中使用了荧光试剂溴化乙锭(EtBr)，它具有很强的基因透变性，对人体和环境都有很大的毒性。
文献(Wang Y，Hao J.，Liang D.，et al，Electrophoresis.，2002，23：1460-1466)也提供了一种新的DNA分离介质，聚N，N-二甲基取代聚丙烯酰胺和聚乙烯吡咯烷酮的互穿网络(interpenetrating networks of(poly(N，N-dimethylacrylamide)and polyvinylpyrrlidone)。在以TBE缓冲溶液为背景电解质的PVP溶液中聚合N，N-二甲基取代丙烯酰胺，得到的高分子混合溶液不经纯化，直接用于dsDNA的分离。在优化条件下，DNA标准样品pBR322/HaeIIIDNA中的22个片段在15分钟内成功分离，并且123/124bp的分离度达到了1.0(激光诱导荧光检测)。但是同样也使用了荧光试剂溴化乙锭(EtBr)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于毛细管电泳分离DNA片段的低pH(pH7.0左右)筛分溶液体系，这种分离体系在紫外检测条件下就可以达到对DNA片段的单碱基分辨。
本发明提供了一种可用于DNA分离的筛分溶液体系，该筛分溶液体系的pH为6.5-7.5之间，优选pH值为7.0。
该筛分溶液体系由筛分介质和基体缓冲溶液组成。优选的基体缓冲溶液可以为NaH2PO4-Na2HPO4磷酸盐溶液，KH2PO4-K2HPO4磷酸盐溶液，(NH4)H2PO4-(NH4)2HPO4磷酸盐溶液，N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)-NaOH缓冲溶液，等等。优选缓冲液摩尔浓度在5-50mmol/L之间，进一步优选20mmol/L。进一步优选的基体缓冲溶液为NaH2PO4-Na2HPO4磷酸盐溶液，其磷酸盐浓度优选为20mmol/L，pH值为7.0。优选的NaH2PO4是至少是分析纯的。优选的Na2HPO4的至少是分析纯的。
所述的筛分介质为水溶性高分子，优选的水溶性高分子介质可以是LPA，PDMA，LPA/PVP，PDMA/PVP。优选的DMA单体是购于日本东京工业化成株式会社。其优选质量浓度范围在1～20％(质量百分比)，进一步优选在1～10％，最优选是6％。优选的PVP系进口分装(购于中国医药(集团)上海化学试剂公司)。其优选质量浓度范围在1～20％(质量百分比)，进一步优选在1～10％，最优选是6％。PVP的K值优选为10～110，更优选在20～50，最优选为30。预定质量的DMA单体与预定质量的PVP之比在1∶1～6∶1之间。优选在1∶1～3∶1。最优选为1∶1。优选的AM单体是购于日本东京工业化成株式会社。其优选质量浓度范围在1～20％(质量百分比)，进一步优选在1～10％，最优选是6％。上述高分子介质的制备可以采用水溶液中的自由基聚合法。例如，先将预定质量的PVP(K值为30)粉末溶解在预定体积的基体缓冲液磷酸盐溶液中，然后加入至少分析纯的预定质量的DMA单体。混匀，除氧，在惰性气体氛围下加入引发剂。该反应可以在室温，常压下进行，两个小时内聚合反应可以完成。或者例如，将预定质量的至少分析纯AM单体溶解在预定体积的基体缓冲液磷酸盐溶液中。混匀，除氧，在惰性气体氛围下加入引发剂。该反应可以在室温，常压下进行，两个小时内聚合反应可以完成。能生成自由基的引发剂可以是过硫酸铵(APS和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)；过硫酸铵和3-二甲胺丙腈(3-dimethylaminopropionitrile，DMAPN)；过硫酸铵和3-二甲胺丙腈亚硫酸盐；过氧化氢和硫酸亚铁-抗坏血酸；过硫酸铵和亚硫酸氢钠等。优选过硫酸铵(APS，98％)和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED，99％)(均为电泳纯，进口分装)。引发剂体系推荐使用量(按聚合前基体缓冲液的体积10ml计)：APS溶液的浓度优选为10～40％(质量体积百分比)，最优选为10％；用量优选为10～50ul，更优选为20～30ul。TEMED溶液的浓度优选为10～40％(体积百分比)，最优选为10％；用量优选为20～100ul，更优选为40～60ul。引发剂加入顺序例如先加TEMED溶液，在待聚合溶液充分除氧后，在惰性气体氛围下迅速向反应体系中加入APS溶液。本发明提供的制备反应可以在10～40℃之间进行，优选20～30℃。
基体缓冲液选用磷酸盐溶液时，为了消除体系中金属或其它杂质的影响，除了使用高纯度的反应试剂外，还可以向体系中加入螯合剂EDTA。例如在10ml，20mmol/L的NaH2PO4-Na2HPO4溶液中加入100ul，1mmol/LEDTA。还可以向体系中加入DNA变性剂尿素或者甲酰胺，体系中尿素的含量优选为3.5-8mol/L；或者体系中甲酰胺的含量优选为10％-50％，浓度单位为v/v。
用做DNA分离介质的高分子的分子量可以根据被分离DNA的大小在很宽范围内变化。例如，高分子可达100,000～10,000,000。优选500,000～5,000,000。更优选500,000～1,000,000。可以用多角度激光光散射与分子排阻色谱联用技术(MALLS-SEC法)来测定高分子的分子量及其分布。
本发明提供的低pH(pH7.0左右)筛分溶液体系在紫外检测条件下就可以达到对DNA片段的单碱基分辨。
附图说明：
1，图1是2％PDMA/PVP溶液(含15％v/v甲酰胺)对DNA标准样品pBR322/HaeIII Markers的毛细管电泳分离谱图。
2，图2是图1中123/124片段的局部放大图。
3，图3是2％LPA溶液(含7M尿素)对DNA标准样品pBR322/HaeIIIMarkers毛细管电泳分离谱图。
4，图4是图3中123/124片段的局部放大图。
5，图5是2％LPA溶液(含7M尿素)对DNA标准样品pBR322/Msp I Markers和φχ174/HaeIII Markers的1∶1混合溶液的毛细管电泳分离谱图。
6，图6是图5中309/310片段的局部放大图。
具体实施方式：
实施例一
筛分介质PDMA/PVP(去活条件)的制备和配制：
取一只干燥洁净的25ml的三颈瓶，向其中加入0.6g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.619ml N，N-二甲基丙烯酰胺(DMA)，10ml NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(20mmol/L，pH7.0)，将两者充分混匀。再加入100μl的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(1mmol/L)溶液，100μl的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)(10％v/v)溶液。混匀，抽气，除氧(惰性气体保护)，加入50μl的过硫酸铵(APS)(10％w/v)溶液。混匀，静置。反应结束后，可不经纯化，直接将聚合产物装入塑料瓶中，置于冰箱中冷藏保存。使用时将制得的PDMA/PVP高分子用NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(20mmol/L，pH7.0)溶解并稀释到2％(高分子溶液浓度单位为w/v)。再分别取2％(w/v)的高分子体系PDMA/PVP溶液和甲酰胺按85∶15的体积比混匀，作为DNA筛分介质。
毛细管电泳实验的条件如下：
使用紫外260nm检测。恒压操作模式，电压为4kV(-→+)。电动进样，-4kV×3s。转盘、柱温设定为25℃。数据由工作站收集并处理。实验时，先将聚丙烯酰胺涂层毛细管柱用水冲洗180秒，之后用筛分介质溶液冲洗180秒。在进样前，最好将毛细管柱的进样端在蒸馏水中浸一次以清洗毛细管柱的外壁，以免污染DNA样品。
高分子体系2％(w/v)PDMA/PVP用作筛分介质所得到的DNA分离谱图，如图1所示。其中123/124组分的峰分离函数p＝0.39，Rs＝0.75。
实施例二
筛分介质LPA(去活条件)的制备和配制：
取一只干燥洁净的25ml的三颈瓶，向其中加入0.6g丙烯酰胺(AM)，10mlNaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(20mmol/L，pH7.0)，将两者充分混匀。再加入100μl的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(1mmol/L)溶液，100μl的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)(10％v/v)溶液。混匀，抽气，除氧(惰性气体保护)，加入50μl的过硫酸铵(APS)(10％w/v)溶液。混匀，静置。反应结束后，可不经纯化，直接将聚合产物装入塑料瓶中，置于冰箱中冷藏保存。使用时将制得的LPA高分子用NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(20mmol/L，pH7.0)溶解并稀释到2％(高分子溶液浓度单位为w/v)。实验时将的2％LPA高分子用含有7mol/L尿素的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(20mmol/L，pH7.0)溶解，并稀释到2％(高分子溶液浓度单位为w/v)。
毛细管电泳实验的条件如下：
使用紫外260nm检测。恒压操作模式，电压为4kV(-→+)。电动进样，-5kV×5s。转盘、柱温设定为25℃。数据由工作站收集并处理。实验时，先将聚丙烯酰胺涂层毛细管柱用水冲洗180秒，之后用筛分介质溶液冲洗180秒。在进样前，最好将毛细管柱的进样端在蒸馏水中浸一次以清洗毛细管柱的外壁，以免污染DNA样品。
2％的高分子体系LPA用作筛分介质所得到的DNA分离谱图，如图2所示。其中123/124组分的峰分离函数p＝0.66，Rs＝0.79。
实施例三
筛分介质LPA(去活条件)的制备和配制：
筛分介质LPA(去活条件)的制备和配制同实施例二。
毛细管电泳实验的条件同实施例二。
2％高分子体系LPA用作筛分介质所得到的DNA分离谱图，如图5所示。其中309/310组分的峰分离函数p＝0.93，Rs＝0.67。

Claims (13)

1.一种用于毛细管电泳分离DNA片段的筛分溶液体系，其特征在于所述的筛分溶液体系由筛分介质和基体缓冲溶液组成，所述的筛分介质为水溶性高分子，所述的基体缓冲溶液为磷酸盐溶液或N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸-NaOH缓冲溶液，所述的磷酸盐溶液为NaH2PO4-Na2HPO4磷酸盐溶液，KH2PO4-K2HPO4磷酸盐溶液或(NH4)H2PO4-(NH4)2HPO4磷酸盐溶液，所述的筛分溶液体系的pH为6.5-7.5之间。
2.根据权利要求1所述的筛分溶液体系，其特征在于该筛分溶液体系的pH为7.0。
3.根据权利要求1所述的筛分溶液体系，其特征在于所述的基体缓冲溶液为NaH2PO4-Na2HPO4磷酸盐溶液。
4.根据权利要求1所述的筛分溶液体系，其特征在于所述的缓冲液摩尔浓度在5-50mmol/L之间。
5.根据权利要求1所述的筛分溶液体系，其特征在于所述的缓冲液摩尔浓度在20mmol/L。
6.根据权利要求1所述的筛分溶液体系，其特征在于所述的水溶性高分子为线性聚丙烯酰胺、线性聚N，N-二甲基丙烯酰胺、线性聚丙烯酰胺与聚乙烯吡咯烷酮的混合物、或者线性聚N，N-二甲基丙烯酰胺与聚乙烯吡咯烷酮的混合物。
7.根据权利要求1所述的筛分溶液体系，其特征在于所述的水溶性高分子的含量为0.5-4％，其中高分子溶液浓度单位为w/v。
8.根据权利要求1所述的筛分溶液体系，其特征在于所述的水溶性高分子的含量为2％，其中高分子溶液浓度单位为w/v。
9.根据权利要求1所述的筛分溶液体系，其特征在于体系中加入乙二胺四乙酸二钠。
10.根据权利要求9所述的筛分溶液体系，其特征在于体系中乙二胺四乙酸二钠的含量在0-2mmol/L。
11.根据权利要求1所述的筛分溶液体系，其特征在于体系中加入尿素或甲酰胺。
12.根据权利要求11所述的筛分溶液体系，其特征在于体系中尿素的含量为3.5-8mol/L；甲酰胺的含量为10％-50％。
13.权利要求1～12中任意一项所述的筛分溶液体系用于毛细管电泳在紫外检测条件下分离相差一个碱基的DNA片段的用途。
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