[0001] L'invention concerne un procédé de purification et de renaturation d'une protéine. Elle se rapporte plus particulièrement à un procédé de purification d'une protéine recombinante accumulée sous forme de corps d'inclusion insolubles par des cellules procaryotes ou eucaryotes. Ce procédé comprend en particulier une étape de renaturation, et permet de conduire cette dernière à haute concentration de protéine.
[0002] Alors que la biologie structurale qui prédit la structure tridimensionnelle des protéines issues de séquences brutes est devenue une des approches permettant de donner un sens à ce flot d'information, les méthodes de production de protéines, par contre, sont restées relativement artisanales même si des progrès ont été réalisés dans la mise au point et l'amélioration de systèmes de production et de purification de protéines recombinantes.
[0003] Il existe un très grand nombre de systèmes d'expression (combinaison cellule hôte/vecteur de gêne) spécifiques pour chaque protéine ou famille de protéines recombinantes. Le choix du système d'expression est essentiellement guidé par les modifications que la protéine doit subir pour être biologiquement active.
[0004] Jusqu'au milieu des années 90, la bactérie, et plus particulièrement Escherichia coli (E. coli), était l'hôte de choix pour produire une protéine recombinante. E. coli a été très étudiée depuis les années 60, si bien que c'est un des organismes actuellement les mieux connus. L'ensemble de ces connaissances en biochimie, génétique et biologie moléculaire a été exploité pour exprimer des protéines en grande quantité. Cette bactérie a plusieurs propriétés intéressantes vis-à-vis de l'expression de protéines: elle est facile à manipuler, elle pousse vite dans des milieux relativement peu coûteux et les souches de laboratoires sont inoffensives. De plus tous les laboratoires de biologie moléculaire utilisent E. coli pour d'autres expériences (clonage, séquence...). Cette facilité en a fait le système d'expression le plus populaire.
Par contre la production de protéines recombinantes dans les bactéries mène fréquemment à des protéines inactives, agrégées sous une forme solide appelée corps d'inclusion. Ceux-ci sont denses et peuvent se trouver soit dans le cytoplasme soit dans l'espace péri plasmique de la cellule.
[0005] Actuellement, avec le développement des technologies de cultures cellulaires, environ 70 à 80 % des protéines d'intérêt sont produites dans des cellules animales. La plupart des anticorps recombinants humains ou humanisés sont produits dans des cellules-hôtes de ce type (Brekke & Loset, 2003). En effet, malgré une vitesse de croissance beaucoup plus lente et une grande fragilité notamment vis-à-vis de l'agitation, les cellules animales ont la propriété de glycosyler les protéines qu'elles synthétisent. En tant que modification post-traductionnelle, cette glycosylation est nécessaire à l'activité biologique de molécules comme les anticorps thérapeutiques.
[0006] Pour remplir leur fonction, les protéines doivent adopter une conformation tridimensionnelle précise, l'état natif, acquise au cours du repliement cellulaire. Cependant, de nombreuses protéines recombinantes ne sont pas produites dans leur état natif, mais s'agrègent dans un état le plus souvent biologiquement inactif, que l'on appelle corps d'inclusion. Le phénomène d'agrégation décrit ci-avant conduit à une réduction importante de productivité et de rendement pour ces systèmes d'expression, car il rend nécessaires des étapes de traitement supplémentaires dans le processus. De plus, contrairement à ce qui est couramment admis, la formation des corps d'inclusion n'est pas l'apanage des systèmes bactériens mais s'observe également chez certaines cellules eucaryotes.
[0007] Ces corps d'inclusion ont cependant l'avantage de représenter une forme concentrée et relativement pure de la molécule-cible. De plus, la forme dénaturée et insoluble des protéines qui les composent les rend moins susceptibles à une dégradation par les protéases libérées lors de l'étape de lyse cellulaire.
[0008] Ces corps d'inclusion, granules de protéines agrégées parfois visibles en microscopie optique, facilitent grandement la purification de la protéine. Par contre ils doivent ensuite être solubilisés, le plus souvent en présence d'un agent chaotropique, ce qui provoque leur dénaturation quasi-complète. C'est pourquoi la solubilisation doit impérativement être suivie d'une étape de repliement (ou renaturation) in vitro. Cette dernière étape est empirique, nécessite une mise au point fastidieuse spécifique pour chaque protéine, et son rendement est souvent faible. Ainsi la principale difficulté de ce genre de procédé est de convertir une protéine inactive et insoluble en une protéine active et soluble avec le plus haut rendement possible et de la manière la plus économique possible.
Un autre point important est qu'aucune variation du procédé ne doit apparaître lors de la mise à l'échelle industrielle; ce procédé doit être facilement automatisable et être générique pour une large gamme de protéines similaires afin que la technologie ne doive pas être réinventée à chaque fois. La fig. 1 montre une séquence d'étapes couramment utilisées pour l'isolation des corps d'inclusion, leur solubilisation et la renaturation de la protéine-cible.
[0009] La demande internationale de brevet WO9202540, déposée au nom de BioEurope, décrit précisément un de ces procédés de purification, avec cependant une approche différente de celle décrite à la fig. 1. Cette demande divulgue un procédé de purification d'une protéine sécrétée sous forme de corps d'inclusion insolubles par une bactérie, caractérisé en ce que:
a) on récolte, après broyage des cellules microbiennes et centrifugation, un culot ("pellet") ou fraction solide réunissant les fragments cellulaires et les corps d'inclusion susmentionnés, b) on met le culot en suspension dans une solution de substance hydrosoluble pouvant être gélifiée, c) on injecte goutte à goutte le mélange des particules solides du culot et de la solution de substance hydrosoluble, dans une solution de gélification, par exemple une solution contenant des cations multivalents, réalisant ainsi l'encapsulation des particules solides du culot dans la substance gélifiée, d) on met les pellets encapsulés en suspension dans une solution de dissolution contenant au moins un agent chaotropique et éventuellement un agent réducteur, e) on obtient la protéine dénaturée et purifiée en solution,
les débris cellulaires et autres composés insolubles restant prisonniers de la matrice gélifiée. Cette approche permet donc de séparer de façon simple et efficace les corps d'inclusion (soit le produit d'intérêt) des fragments cellulaires, une étape importante et difficile à maîtriser mais souvent occultée dans les descriptions de la littérature. Un inconvénient majeur de cette approche réside dans le fait qu'on va solubiliser d'autres composés en même temps que les corps d'inclusion, réduisant ainsi la pureté du oproduit ainsi récupéré par rapport à l'isolation directe de corps d'inclusion solides. La renaturation devra donc se faire en présence de quantités plus ou moins importantes de contaminants, qui peuvent avoir un impact négatif sur les rendements de renaturation.
De plus cette demande internationale ne va pas au-delà de la solubilisation des corps d'inclusion, et ne traite en aucune manière des moyens d'obtenir une protéine native à partir du matériel dénaturé, si ce n'est par les méthodes classiques de dilution.
[0010] La protéine est ensuite renaturée par suppression des agents dénaturants dans son environnement; ceci est réalisé en diluant le milieu ayant servi à la dissolution des corps d'inclusion. Cette technique de renaturation, par contre, ne permet pas une renaturation conforme aux exigences de la biologie actuelle. Par ailleurs, bon nombre de protéines ne peuvent être renaturées de la sorte et le résultat obtenu ne permet pas toujours une utilisation ultérieure efficace de ces protéines recombinantes.
[0011] En effet il est connu que les protéines obtenues par ce genre de procédé le sont avec un très bon degré de purification, suffisant pour certaines expériences (en particulier pour des immunisations). Cependant d'autres utilisations, requièrent l'obtention d'une protéine soluble purifiée et ayant recouvré sa conformation tridimensionnelle originale.
[0012] La demande internationale de brevet WO9 402 625, déposée au nom d'immunex Corporation, ne propose pas non plus de procédé de renaturation efficace et fiable. En effet, cette demande décrit un procédé d'isolation d'un polypeptide de recombinaison produit sous forme d'un composant d'une fraction insoluble dans une cellule hôte transformée, consistant à emprisonner les cellules hôtes (avant ou après la lyse de celles-ci) dans une matrice poreuse; à briser, si cela n'avait pas déjà été fait, la membrane des cellules hôtes pour permettre la diffusion des protéines solubles contenues dans lesdites cellules; à laver les cellules hôtes emprisonnées pour en extraire les protéine solubles, tout en laissant la fraction insoluble dans la matrice poreuse;
et à mettre en contact la fraction insoluble dans la matrice poreuse avec un agent chaotropique afin d'isoler le polypeptide de recombinaison de la fraction insoluble. Là encore, les aspects liés à la renaturation et au rendement de cette dernière étape ne sont pas décrits dans l'invention.
[0013] Les deux demandes de brevet cités plus haut, bien qu'utilisant des matériaux et une approche similaires, ne traitent pour l'essentiel que de la solubilisation facilitée d'une protéine recombinante à partir de corps d'inclusion, tout en maintenant les résidus solides prisonniers dans une matrice de type hydrogel. La phase de renaturation de la protéine recombinante ainsi solubilisée, pourtant critique et le plus souvent limitante en termes de coûts et de temps, n'y est pour ainsi dire pas abordée.
[0014] La méthode la plus fréquemment utilisée pour réaliser une renaturation est la dilution, qui consiste à diluer la protéine soluble mais dénaturée à l'aide d'un tampon de renaturation. C'est une méthode simple, mais qui peut conduire à des difficultés lors d'applications commerciales. En effet, elle requiert la manipulation de grands volumes de tampon pour la dilution, ce qui rend nécessaire une étape ultérieure de concentration et augmente le coût du procédé [De Bernardez Clark, 1998]. La dilution est cependant nécessaire pour la renaturation en solution car les hautes concentrations de protéine favorisent l'agglomération, caractérisé par une cinétique de 2eme ordre (Schlegl et al., 2005), au détriment du processus parallèle et concurrent de renaturation, qui suit quant à lui une cinétique de 1er ordre.
[0015] Différentes approches ont été proposées afin de permettre la renaturation de protéines à haute concentration. Parmi elles on peut citer les techniques où l'on cherche à réduire la mobilité de la protéine pendant le processus; ceci doit permettre de limiter le phénomène d'agrégation, qui implique que les molécules de protéine se rencontrent. On peut citer dans cette catégorie les approches décrites par Ferré et al. (2005), Middelberg (2002), ou Lanckriet & Middelberg (2004). La protéine est en général adsorbée sur une colonne chromatographique, ce qui limite sa mobilité, pendant que l'agent dénaturant est éliminé. Un inconvénient majeur de cette approche est que la protéine dénaturée, même si elle porte la même charge globale, ne s'adsorbe souvent pas de la même façon sur la phase stationnaire que la protéine native.
Une solution possible à ce problème consiste à utiliser des protéines portant un marqueur (communément appelé "tag" en anglais) de type (His)6 par exemple, et de les adsorber sur une colonne d'affinité de type "IMAC" (Immobilized Métal Affinity Chromatography) porteuse d'ions de métaux de transition tels que Cu2, Co2, Ni2 ou Zn2+ et pour lesquels l'histidine a une forte affinité (Hutchinson & Chase, 2006).
[0016] Dans une autre approche, on utilise de hautes pressions hydrostatiques afin de favoriser le repliement des protéines recombinantes vers leur structure native même à hautes concentrations. Le principe et des exemples d'applications de cette technologie développée et exploitée par la compagnie BaroFold, Inc. sont décrits dans des publications (Randolph et al., 1999 et 2002) ainsi que dans une série de demandes de brevets (AU 2007 202 306, WO 2007 062 174). Si cette méthode a démontré son efficacité dans de nombreux cas d'applications, les équipements permettant d'atteindre des pressions de plusieurs kbar sont cependant extrêmement coûteux et les temps de séjour dans la machine peuvent atteindre 24h.
[0017] Par conséquent, compte tenu de l'état de la technique décrit plus haut, il existe toujours un besoin pour un procédé efficace à grande échelle de renaturation d'une protéine recombinante, si possible à haute concentration.
[0018] L'invention décrite ci-après permet de travailler à large échelle, avec une haute concentration de protéines, avec des matériaux peu coûteux, dans des conditions facilement reproductibles et avec un rendement important. L'utilisation de hautes concentrations de protéines permet ainsi de réduire les volumes et donc de faciliter leur manipulation.
[0019] La présente invention concerne principalement un procédé de purification et de renaturation d'une protéine recombinante accumulée sous forme d'un corps d'inclusion insoluble par des cellules procaryotes ou eucaryotes, caractérisée en ce que:
a) on récolte les corps d'inclusion sous la forme d'un culot après la lyse des cellules procaryotes ou eucaryotes et la centrifugation,
b) on met le culot en présence d'une solution dénaturante contenant au moins un agent dénaturant et/ou un agent réducteur et/ou un agent détergent, afin de dissoudre les protéines contenues dans le culot à haute concentration,
c) on dissout un polymère gélifiant dans la solution dénaturante,
d) on met en contact la solution dénaturante comprenant le polymère gélifiant avec un bain provoquant la gélification du polymère gélifiant dissout,
conduisant ainsi à l'encapsulation des protéines dénaturées et de l'agent dénaturant et/ou de l'agent réducteur et/ou de l'agent détergent dans la solution ainsi gélifiée,
e) on permet à l'agent dénaturant et/ou à l'agent réducteur et/ou à l'agent détergent (qui sont des molécules de relativement faibles poids moléculaires) de diffuser à travers la solution ainsi gélifiée comprenant les protéines dénaturées encapsulées beaucoup plus rapidement que ces dernières, entraînant ainsi une renaturation progressive de ces protéines dénaturées tout en limitant leur agrégation (du fait d'une mobilité fortement réduite),
f) on met les capsules contenant la protéine renaturée en présence d'une solution permettant la dissolution du gel,
g) on obtient la protéine renaturée et purifiée en solution à une concentration élevée
[0020] L'invention concerne aussi un kit et un appareil pour la mise en oeuvre du procédé de purification et de renaturation d'une protéine recombinante accumulée sous forme d'un corps d'inclusion insoluble par des cellules procaryotes ou eucaryotes.
<tb>La fig. 1<sep>représente un schéma classique d'isolation, solubilisation et renaturation de protéines recombinantes accumulées dans une cellule-hôte sous forme de corps d'inclusion.
<tb>La fig. 2<sep>représente la cinétique de relargage du chlorure de guanidiniun (GdnCI) et de Povalbumine hors de billes de 3 mm de diamètre préparées avec différentes concentrations d'alginate. Température = 22 [deg.]C.
<tb>La fig. 3<sep>représente la cinétique de relargage du chlorure de guanidiniun (GdnCI) et de Povalbumine hors de billes de 5 mm de diamètre préparées avec différentes concentrations d'alginate. Température = 22 [deg.]C.
<tb>La fig. 4<sep>montre l'influence de la vitesse d'agitation sur la cinétique de libération du chlorure de quanidinium à partir de billes de 5 mm de diamètre préparées avec de l'alginate 2%. Température = 22 [deg.]C.
[0021] Par protéine recombinante, on entend une protéine produite par des cellules (eucaryotes ou procaryotes) dont l'ADN a été modifié par recombinaison génétique. L'emploi d'un vecteur d'expression (en général un plasmide ou un virus -pour les vecteurs eucaryotes-), jouant le rôle de transporteur génétique du gène d'intérêt codant pour la protéine recherchée est le moyen le plus souvent utilisé pour modifier l'ADN des cellules servant à la production de la protéine recombinante.
[0022] Par protéine on entend une macromolécule composée par une ou plusieurs chaîne(s) (ou séquence(s)) d'acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques. En général, on parle de protéine lorsque la chaîne contient plus de 50 acides aminés. Dans le cas contraire, on parle de peptides et de polypeptides. Par conséquent, la présente invention considère aussi un procédé de purification et de renaturation d'une protéine recombinante de moins de 50 acides aminés ou peptides (selon la définition donnée plus haut) accumulée sous forme d'un corps d'inclusion insoluble par des cellules procaryotes ou eucaryotes.
[0023] En général, la protéine recombinante est produite par des cellules hôtes procaryotes ou eucaryotes. Les cellules procaryotes sont dépourvues de noyau cellulaire et sont généralement unicellulaires. Elles comprennent les bactéries, les cyanobactéries, les archéobactéries. Leur matériel génétique est de l'acide désoxyribonucléique (A.D.N ou ADN) circulaire diffus dans le cytoplasme de la cellule. Les cellules procaryotes sont considérées comme plus primitives sur le plan de l'évolution et elles possèdent généralement un nombre de gènes inférieur aux cellules eucaryotes.
[0024] Les cellules eucaryotes, quant à elles, sont caractérisées principalement par le fait qu'elles possèdent un noyau composé d'une double membrane entourant l'ADN. Ces cellules regroupent tous les organismes compris dans quatre grands règnes du monde vivant: les animaux, les champignons, les plantes et les protistes.
[0025] Il n'existe pas, pour le moment, de règle absolue permettant de prédire la stabilité, la solubilité, l'activité et la conformation d'une protéine recombinante (hétérologue) exprimée par une cellule eucaryote ou procaryote du type E. coli. Le principal problème rencontré est la formation de corps d'inclusion insolubles dans le cytoplasme de ces cellules hôtes. En effet chez E. coli l'expression importante de protéines hétérologues entraîne souvent l'apparition de granules appelés corps d'inclusion insolubles qui sont visibles en microscopie à contraste de phase. Ils contiennent généralement la protéine recombinante surexprimée ainsi que des acides nucléiques et quelques protéines bactériennes.
Ces corps d'inclusion insolubles peuvent être assez facilement isolés permettant ainsi d'obtenir la protéine recombinante avec un bon degré de purification, suffisant pour certaines expériences (en particulier pour des immunisations classiques). Cependant d'autres approches comme par exemple les traitements thérapeutiques à l'aide de peptides ou d'anticorps, requièrent l'obtention d'une protéine soluble purifiée et native.
[0026] En effet, la protéine recombinante est produite sous forme de corps d'inclusion insolubles. Classiquement, on va d'abord concentrer les cellules eucaryotes ou procaryotes à partir du milieu de culture de ces cellules, par centrifugation ou ultrafiltration. La présente invention permettant de travailler à haute concentration de protéines, ceci permet donc de faciliter leur manipulation.
[0027] On obtient ensuite la lyse des cellules eucaryotes ou procaryotes en rompant la membrane plasmique de ces cellules par l'action d'un agent physique, chimique ou biologique, menant ainsi à la mort de la cellule.
[0028] De manière préférentielle, on utilisera le broyage mécanique (p.ex. dans un moulin à billes, un homogénéisateur à haute pression ou une "french press") ou la sonication (traitement par ultrasons) mais des agents chimiques tels que les détergents (anioniques, cationiques, neutres), les solvants organiques, les bases ou acides forts ou des préparations enzymatiques sont également envisageables.
Etape A:
[0029] Les corps d'inclusion sont ensuite récoltés par centrifugation. Lors de cette centrifugation, le surnageant contient les constituants solubles de la bactérie. Mais la fraction particulaire ainsi recueillie, encore appelée culot, contient outre les corps d'inclusion insolubles renfermant les protéines recombinantes, des cellules non lysées, des débris cellulaires et des contaminants protéiques, solubles ou non.
[0030] Optionnellement, le culot est lavé, au préalable à l'étape de dissolution, avec une solution tampon aqueuse afin d'éliminer les contaminants solubles. Des solutions tampons couramment employées sont, suivant le pH désiré, de type acétate, citrate, phosphate, Tris, ou Glycine et tout autre tampon que l'homme du métier jugera utile d'employer.
Etape B:
[0031] Ce culot est ensuite mis en présence d'une solution dénaturante contenant au moins un agent dénaturant et/ou un agent réducteur et/ou un agent détergent, afin de dissoudre les protéines contenues dans le culot. La solution dénaturante comprend au moins un agent dénaturant sélectionné parmi les agents chaotropiques connus de l'homme du métier comme l'urée ou le chlorure de guanidinium, ces exemples n'étant pas limitatifs. Le rôle de cet agent dénaturant est de provoquer la dissociation des protéines en altérant leur configuration spatiale ou leur conformation. La solution peut contenir également au moins un agent réducteur, choisi parmi le groupe non-limitatif comprenant le (3-mercaptoéthanol, la glycine, le dithiothreitol, la glutathione. Un agent préféré est la glutathione.
[0032] La solution peut aussi contenir un agent détergent connu de l'homme du métier et pouvant être sélectionné parmi le groupe non-limitatif comprenant des détergents anioniques, neutres, cationiques ou zwitterioniques. De préférence l'agent détergent sera sélectionné parmi le groupe non exhaustif comprenant le Triton X100, le CHAPS, le dodécyl maltoside, le DTAB, le CTAB.
[0033] Ces trois agents (dénaturant, réducteur et détergent) peuvent se trouver ensemble dans la même solution ou seuls ou par groupe de deux.
[0034] Une fois la protéine recombinante solubilisée, on peut, si nécessaire, la séparer facilement par filtration ou centrifugation des débris cellulaires et autres particules insolubles résultant de l'étape de lyse.
[0035] De façon alternative on peut procéder à la lyse des cellules et récupérer (après centrifugation et/ou filtration et lavage) la matière solide insoluble. Cette fraction solide contient les débris cellulaires et les corps d'inclusion. On peut dissoudre ces derniers en contactant le culot de centrifugation avec une solution dénaturante contenant au moins un agent dénaturant et/ou un agent réducteur et/ou un agent détergent, afin de dissoudre les protéines contenues dans le culot à haute concentration, et isoler par centrifugation et/ou filtration le surnageant contenant la molécule-cible dénaturée,
Etape C:
[0036] Dans l'étape suivante, on dissout un polymère gélifiant dans la solution dénaturante. Parmi les polymères gélifiants les plus couramment rencontrés on peut citer, entre autres exemples, Palginate, le carraghénane, le chitosan, la pectine, l'amidon (modifié ou non), la gélatine, le sulfate de cellulose, la carboxyméthyl-cellulose, la gomme de xanthane, la locust bean gum, la gomme de gellane ou l'agar agar.
[0037] A part ces polysaccharides, la gélatine et d'autres protéines ont elles aussi des propriétés intéressantes vis-à-vis de la formation de gels plus ou moins perméables.
[0038] Des polymères synthétiques donnant lieu à la formation d'un hydrogel sont également utilisables, pour autant qu'on puisse désagréger le gel à la fin du processus de renaturation, que ce soit par dissolution ou dégradation du polymère.
[0039] Les polymères dits intelligents, qui ont la propriété de changer de phase selon la température sont une autre possibilité de confinement de la protéine dénaturée.
[0040] Le carraghénane (ou carraghénine) est un polysaccharide extrait d'algues rouges servant d'agent d'épaississement et de stabilisation dans l'industrie alimentaire. Il porte le code E407 de la classification des additifs alimentaires. Les carraghénanes permettent de former des gels à chaud (jusqu'à 60[deg.]C) et présentent donc un intérêt par rapport aux gélatines animales traditionnelles.
[0041] Un polysaccharide plus particulièrement préféré selon la présente invention est l'alginate. L'alginate est un polymère formé de deux monomères liés ensemble: le mannuronate ou acide mannuronique et le guluronate ou acide guluronique. La proportion et la distribution de ces deux monomères sont déterminantes pour une large expansion des propriétés physiques et chimiques de l'alginate.
[0042] Les alginates peuvent former des gels durs et thermostables utilisés comme additifs alimentaires (E400 à E405) permettant la reconstruction des aliments (jambon, cordons bleus, poisson pané...). Des billes d'alginates peuvent également être utilisées en médecine pour encapsuler des médicaments ou des substances biologiques fragiles (enzymes, microorganismes, cellules animales ou humaines). En général la concentration d'alginate utilisée selon l'invention est comprise entre 2 et 10%, préférablement entre 4 et 5%. A noter que la concentration en alginate nécessaire pour atteindre une fermeté de gel donnée dépendra du poids moléculaire de l'alginate, de sa pureté, ainsi que des proportions respectives en manuromate et guluronate.
[0043] Le choix et la concentration de la matrice d'encapsulation seront faits par l'homme du métier en fonction de la taille et de la charge de la protéine ainsi que de son activité. Une meilleure rétention peut par exemple être obtenue par l'encapsulation d'une protéine positivement chargée (à un pH inférieur à son point isoélectrique) au sein d'une matrice porteuse de charges négatives.
[0044] De plus, il est envisagé la possibilité d'ajouter au sein de la matrice d'encapsulation ou dans les solutions environnantes tous composés susceptibles de faciliter ou d'accélérer la renaturation de la molécule-cibles. De nombreux exemples sont cités dans la littérature scientifique et sont connus de l'homme du métier. On peut citer brièvement et de façon non-exhaustive les systèmes oxydo-réducteurs comme la glutathione réduite/oxydée (GSH/GSSG), certains acides aminés tels que l'arginine, la proline, des polyols comme le glycérol ou le polyéthylène-glycol, des sucres comme le saccharose ou des polymères comme l'héparine, un glycosaminoglycane.
Etape D:
[0045] La solution dénaturante comprenant le polymère gélifiant est ensuite mise en contact avec un bain provoquant la gélification du polymère gélifiant dissout, conduisant ainsi à l'encapsulation des protéines dénaturées et de l'agent dénaturant et/ou de l'agent réducteur et/ou de l'agent détergent dans la solution ainsi gélifiée.
[0046] En général la mise en contact entre la solution dénaturante et le bain provoquant la gélification du polymère est effectuée en laissant tomber goutte à goutte la solution dénaturante dans le bain provoquant ainsi la gélification du polymère. Cependant, toute autre technique permettant d'obtenir des capsules ou billes de polymère convient à la réalisation de la présente invention. Le diamètre des billes ainsi obtenues peut se situer typiquement entre 1 et 10 mm, mais une extrusion sous forme de spaghetti ou une gélation en bloc ou sous toute autre forme est aussi envisageable.
Les essais réalisés par le demandeur de la présente invention ont montré que des billes de grosse taille (4-5 mm de diamètre) ne constituaient pas un handicap dans la mesure où l'agent dénaturant pouvait encore s'en échapper assez rapidement et où la protéine-cible, quant à elle, était mieux retenue par des billes de 4-5 mm que par des billes plus petites.
[0047] Préférentiellement, si le polymère gélifiant est de l'alginate alors le bain provoquant la gélification du polymère est constitué d'une solution de chlorure de calcium entre 3 et 10%, encore plus préférentiellement aux alentours de 5%.
[0048] En général c'est la nature du polymère gélifiant qui déterminera celle du bain provoquant la gélification du polymère. Aussi chaque couple polymère/bain gélifiant sera à déterminer précisément par l'homme du métier selon ses connaissances.
[0049] Il en est de même avec la concentration du composant présent dans le bain de gélification; cette concentration est directement dépendante de la concentration du polymère gélifiant et sera également à déterminer précisément par l'homme du métier selon ses connaissances.
Etape E:
[0050] Dans l'étape suivante, on permet à l'agent dénaturant et/ou à l'agent réducteur et/ou à l'agent détergent de diffuser à travers la solution ainsi gélifiée comprenant les protéines dénaturées encapsulées, entraînant ainsi une renaturation progressive de ces protéines dénaturées tout en limitant leur agrégation. En effet et de manière surprenante, les inventeurs de la présente invention ont remarqué que l'utilisation d'un polymère gélifiant pour encapsuler les protéines dénaturées et en solution dans la solution dénaturante permettait d'obtenir un taux de renaturation élevé de la protéine recombinante dénaturée tout en limitant l'agrégation de ces mêmes protéines.
[0051] Cette renaturation progressive est obtenue par une combinaison favorable de deux effets:
<tb>1)<sep>on permet d'une part à l'agent dénaturant et/ou à l'agent réducteur et/ou à l'agent détergent, qui sont des molécules de relativement petites tailles, de diffuser à travers la matrice gélifiée, réduisant ainsi la concentration de ces substances à des valeurs permettant la renaturation de la protéine.
<tb>2)<sep>D'autre part, en limitant fortement la mobilité de la protéine au sein de la matrice pendant l'étape de renaturation, on l'empêche de former des agrégats, ce qui conduit à des rendements de renaturation supérieurs malgré la haute concentration de protéine.
[0052] La diffusion de l'agent dénaturant et/ou de l'agent réducteur et/ou de l'agent détergent à travers la solution ainsi gélifiée comprenant les protéines dénaturées encapsulées est réalisée en mettant en contact lesdites protéines dénaturées encapsulées, en général sous forme de capsules ou billes, en présence d'eau, préférablement distillée ou d'un tampon fournissant à la protéine des conditions de pH favorables à sa stabilité. Le volume d'eau distillée est en général 10 à 30 fois, préférablement 20 fois, plus grand que le volume de billes. Une légère agitation peut être appliquée pour permettre une diffusion plus rapide et plus homogène. Au fur et à mesure de l'élimination de l'agent dénaturant, la molécule-cible se trouvera donc placée dans des conditions favorables à sa renaturation et limitant sa tendance à l'agglomération.
Ce procédé de renaturation permet d'obtenir d'excellents résultats. La température peut être maintenue à une valeur connue de l'homme du métier et garantissant la stabilité de la protéine pour la durée de cette étape.
Etape F:
[0053] Après cette étape de renaturation in silico, on met les capsules contenant les protéines dénaturées en présence d'une solution permettant la dissolution du gel. Cette dernière est choisie parmi des solutions de citrate de sodium, d'EDTA ou de fluorure de sodium, soient des composés connus de l'homme du métier et permettant de complexer le calcium, conduisant ainsi à la désagrégation du réseau d'alginate.
[0054] De manière préférentielle, l'on utilise une solution de citrate de sodium tamponné à une des concentrations suivantes: 100 m M, 200 m M, 300 mM ou 500 mM, avec une préférence pour une concentration à 200 mM.
[0055] Ces concentrations peuvent aussi être avantageusement appliquées aux autres composés à la base de la solution permettant la dissolution du gel. Celle-ci sera conduite sur une durée de 30 à 180 minutes (préférentiellement 60 min) et à une température entre 5 et 40[deg.]C (préférentiellement 10-25 [deg.]C).
[0056] En général, il est préférable de réaliser cette étape de dissolution du gel dans de petits volumes de solution, afin d'obtenir au final une concentration moyenne à élevée de protéine recombinante renaturée et purifiée dans la solution.
Etape G:
[0057] On obtient ensuite la protéine sous forme renaturée et purifiée en solution concentrée.
[0058] La présente invention comprend aussi un appareil pour la mise en oeuvre du procédé de purification et de renaturation d'une protéine recombinante accumulée sous forme d'un corps d'inclusion insoluble par des cellules procaryotes ou eucaryotes tel que décrit supra.
[0059] La présente invention comprend aussi un kit pour la mise en oeuvre du procédé de purification et de renaturation d'une protéine recombinante accumulée sous forme d'un corps d'inclusion insoluble par des cellules procaryotes ou eucaryotes tel que décrit supra. Ce kit peut comprendre, entre autres, i) l'agent dénaturant et/ou l'agent réducteur et/ou l'agent détergent en général sous forme de solutions, ii) le polymère gélifiant, iii) une solution de bain provoquant la gélification dudit polymère gélifiant et iv) des cellules procaryotes ou eucaryotes nécessaires à l'expression de la protéine recombinante. Optionnellement, le kit peut également comprendre un vecteur d'expression (plasmidique ou autre) nécessaire à l'expression de la protéine recombinante d'intérêt.
[0060] Les exemples suivants ont pour but de démontrer la faisabilité de la présente invention et ne sauraient limiter l'invention à ces seules descriptions.
[0061] Le premier exemple ci-après est une preuve de concept qui démontre qu'une protéine emprisonnée dans une matrice d'alginate diffuse beaucoup plus lentement que l'agent dénaturant qui y est également encapsulé. La modèle choisi pour la protéine est l'ovalbumine, d'un poids moléculaire de 45 kDa environ, et de point isoélectrique 4.6.
[0062] Le second exemple montre un essai de renaturation d'a-amylase de B. amyloliquefaciens (poids moléculaire 55 kDa, point isoélectrique aux environs de 5.2) à haute concentration (10 mg/ml) réalisé de deux manières différentes:
Dans la première l'agent dénaturant (chlorure de guanidinium) a été éliminé par dialyse, l'enzyme restant en solution à l'intérieur de la chambre de dialyse. L'activité de l'amylase a été mesurée avant dénaturation et après la dialyse.
Dans la seconde approche l'enzyme dénaturée (10 mg/ml) et l'agent dénaturant (3.0 M) ont été encapsulés dans une matrice d'alginate. Les capsules ainsi formées ont été immergées dans une solution tampon, ce qui a permis une élimination rapide de l'agent dénaturant. Les billes ont ensuite été récupérées et dissoutes par complexation du calcium à l'aide de citrate.
L'activité de l'amylase a été mesurée avant dénaturation et après le traitement de renaturation.
[0063] Tous les essais décrits ci-après ont été réalisés à température ambiante (22[deg.]C).
Exemple 1: Preuve de concept - mesures des vitesses de diffusion de la BSA et du chlorure de guanidinium hors d'une matrice d'alginate.
Produits chimiques et réactifs
[0064] Alginate de sodium, Lot# KLTV45184A, Inotech AG, Basel (Suisse) Chlorure de calcium dihydrate (CaCI2-2H20), Fluka Chemicals, Buchs (Suisse). Chlorure de Guanidinium, Sigma Aldrich, Buchs (Suisse) Ovalbumine 5x cristallisée, Fluka Chemicals, Buchs (Suisse) Tri-sodium Citrate dihydrate, Panreac Chemicals, Barcelona (Espagne)
Description de l'essai
[0065] Dans un tampon Tris 10 mM à pH 7.0 on a dissout de l'ovalbumine à raison de 10 mg/ml, du chlorure de guanidinium (GdnCI) à raison de 3.0 mol/l ainsi que de l'alginate de sodium à des concentrations variant entre 2 et 5%. La solution a ensuite été dégazée et les bulles d'air éliminées par centrifugation et/ou sous vide.
[0066] On a ensuite laissé tomber goutte à goutte ce mélange dans une solution tampon Tris 10 mM à pH 7.0 contenant 5% de CaCl2ainsi que de l'ovalbumine et du GdnCI aux mêmes concentrations qu'avant (10 mg/ml et 3.0 mol/l, respectivement) afin d'éviter les pertes pendant le stockage des billes. Des billes d'alginate d'un diamètre de 5 mm environ ont ainsi été formées.
[0067] Pour le début de l'essai les billes, d'un volume total de 10 ml, ont été récupérées et égouttées à l'aide d'une passoire avant d'être plongées dans un récipient contenant 190 ml d'une solution tampon Tris 10 mM à pH 7.0. La suspension était agitée à l'aide d'un barreau magnétique.
[0068] On a mesuré dès ce moment la migration du chlorure de guanidinium et de l'ovalbumine hors de la matrice d'alginate vers la solution extérieure. Le dosage du GdnCL a été fait en continu par conductimétrie. La concentration de l'ovalbumine dans le liquide a quant à elle été déterminée par des prises d'échantillons régulières et par la mesure de l'absorbance de la solution à 280 nm.
[0069] Deux tailles de billes ainsi que différentes concentrations d'alginate et des vitesses d'agitation variables ont été testées lores de ces essais.
Résultats
[0070] Les résultats des essais décrits ci-avant sont montrés à la fig. 2. On peut y voir que 20 minutes suffisent pour éliminer la quasi-totalité de l'agent dénaturant contenu dans des billes de 3-4 mm de diamètre, et ce quelle que soit la concentration d'alginate utilisée pour la fabrication des billes (entre 2 et 5%), La fig. 3 montre exactement les mêmes tendances pour des billes plus grosses, de 5 mm de diamètre. On constate également pour les deux tailles de billes que l'ovalbumine, du fait de sa taille, ne diffuse quant à elle que beaucoup plus lentement hors de la matrice d'alginate.
La fig. 2 met aussi en évidence l'influence de la concentration en alginate sur la vitesse de libération des composants: première constatation, un gel à 5% d'alginate ne semble pas retenir plus fortement l'agent dénaturant qu'un gel à 2%; ceci n'est pas trop surprenant vu la petite taille de la molécule de GdnCI. L'ovalbumine par contre, avec un poids moléculaire de 45 kDa, est libérée nettement moins rapidement d'un gel à 5% d'alginate que d'un gel à 2%. Le réseau plus "serré" du gel à 5% retient donc mieux la protéine étudiée ici.
[0071] D'autres essais, dont les résultats sont reportés à la fig. 4, ont également montré que la vitesse d'agitation n'avait pour ainsi dire pas d'impact sur la vitesse de migration des différents composants, notamment du chlorure de guanidinium, vers l'extérieur des billes. Tous les résultats ci-dessus désignent clairement le transport à l'intérieur des billes comme l'étape limitante du processus.
[0072] Ces résultats démontrent aussi sans équivoque que des billes de faible diamètre ne sont pas exigées pour mener à bien l'application décrite ici. En conséquence, la présente invention ne requiert pas l'emploi d'une technologie sophistiquée pour la génération de gouttelettes monodisperses de faible diamètre telles que décrites dans la littérature sur la microencapsulation.
[0073] Les observations reportées ici démontrent donc amplement la validité du concept proposé, à savoir la migration rapide de l'agent dénaturant hors des billes d'alginate ainsi que la rétention de la majeure partie de la protéine à l'intérieur de celles-ci pendant ce laps de temps.
Exemple 2: Renaturation de l'[alpha]-amylase de B. amyloliquefaciens à haute concentration - comparaison de la méthode par dialyse et par diffusion de l'agent dénaturant hors d'une matrice d'alginate.
Produits chimiques et réactifs
[0074] Alginate de sodium, Lot # KLTV 45184A, Inotech AG, Basel (Suisse) [alpha]-amylase de Bacillus amyloliquefaciens, 839 unités/mgsolide, Sigma-AIdrich, Buchs (Suisse).
Chlorure de Guanidinium, Sigma Aldrich, Buchs (Suisse)
Chlorure de calcium dihydrate, Fluka Chemicals, Buchs (Suisse)
Tri-sodium Citrate dihydrate, Panreac chemicals, Barcelona (Espagne)
Phadebas<(R)>kit for amylase assay, Magie AB, Lund (Suède)
Mesure de la concentration de chlorure de guanidinium (GdnCI)
[0075] La concentration de l'agent dénaturant a été mesurée par conductimétrie, comme décrit dans l'essai 1.
Mesure d'activité de l'[alpha]-amylase.
[0076] L'activité de l'a-amylase (et donc la concentration d'enzyme native) a été déterminée lors des différents essais à l'aide d'un kit commercial Phadebas<(R)> commercialisé par la maison Magie AB, Lund (Suède). Celui-ci consiste en un amidon modifié, sur lequel a été greffé un colorant qui se solubilise au fur et à mesure de la dégradation du substrat par l'amylase.
[0077] Les mesures ont été réalisées selon le protocole général suivant:
Trois tablettes de substrat (insoluble) étaient dispersées dans 32 ml de tampon phosphate 0.1 M pH 7.0 contenant également 0.5 mM de chlorure de calcium. La suspension était maintenue sous agitation afin d'en garantir l'homogénéité.
2 ml de suspension étaient ensuite prélevés et placés dans un tube à essais.
On y ajoutait ensuite 0.5 ml de solution d'enzyme (à la dilution appropriée) avant de mettre en route le chronomètre et de placer le mélange sous agitation, à température ambiante.
Après 10 minutes d'incubation on ajoutait 0.5 ml de NaOH 0.5 M sous bonne agitation, afin de stopper la réaction.
La suspension résultante était ensuite filtrée sur membrane de 0.45 [micro]m à l'aide d'une seringue et l'absorbance du surnageant mesurée à 620 nm (couleur bleue due au colorant solubilisé) contre un échantillon de contrôle négatif où la solution d'enzyme était remplacée par du tampon phosphate.
La différence d'absorbance ainsi mesurée était, en tenant compte des dilutions éventuelles, directement proportionnelle à la concentration d'enzyme active dans l'échantillon.
Description de l'essai
[0078] Cet essai a pour but de comparer les rendements de renaturation à haute concentration d'[alpha]-amylase obtenus soit par dialyse, soit par la méthode proposée dans la présente invention.
[0079] Dans la première l'enzyme concentrée (10 mg/ml) se trouve en solution et est donc libre de former des agrégats. Dans la seconde l'enzyme se trouve immobilisée dans un gel permettant sa renaturation mais limitant sa mobilité, de telle sorte que l'agrégation est fortement inhibée.
[0080] Dans la seconde approche l'enzyme dénaturée (10 mg/ml) et l'agent dénaturant (3.0 M) ont été encapsulés dans une matrice d'alginate. Les capsules ainsi formées ont été immergées dans une solution tampon, ce qui a permis une élimination rapide de l'agent dénaturant, comme démontré dans l'essai 1. Les billes ont ensuite été récupérées et dissoutes par complexation du calcium à l'aide de citrate. L'activité de l'amylase a été mesurée avant dénaturation et après le traitement de renaturation.
Dénaturation de l'a-amylase et renaturation par dialyse
[0081] Environ 5 ml d'une solution à 10 mg/ml d'a-amylase de B. amyloliquefaciens ont été dénaturés à température ambiante pendant 12 h en présence de 3.0 M de chlorure de guanidinium (GdnCI). L'activité résiduelle de l'enzyme a été mesurée avant et après dénaturation. Les résultats sont consignés dans le Tableau 1.
[0082] Une quantité équivalant à 2 ml de la solution d'enzyme dénaturée a ensuite été transférée dans une cassette de dialyse dont le seuil de coupure nominal est de 10 kDa. La cassette a ensuite été mise en suspension dans 3.0 litres de tampon phosphate agités à l'aide d'un barreau magnétique, et laissée pendant 12 heures.
[0083] L'équilibre des concentrations une fois atteint, l'agent dénaturant se trouvait dilué 1500 fois, ce qui correspond à une concentration résiduelle de 2 mM.
[0084] On a noté qu'après une longue dénaturation de 12 h, il ne restait plus que 8% d'activité relative. Lors de la renaturation par dialyse, un précipité est apparu dans la cassette. Après les 12 heures de dialyse, l'échantillon a été récupéré, mélangé et son activité mesurée. Celle-ci s'est révélée être très faible, atteignant 4% de l'activité initiale. Il semble donc que l'agrégation des protéines a engendré une perte notable de l'activité. Le problème de la dialyse est que la concentration en enzyme reste élevée dans la cassette (10 mg/ml). Ainsi, la tendance à l'agrégation est forte et la renaturation par dialyse apparaît comme une méthode inappropriée dans ce cas de figure.
[0085] L'activité de l'enzyme a été mesurée à chaque étape de l'expérience et est reportée dans le Tableau 1 ci-après. On y trouve la concentration d'enzyme Camyiase en mg de protéine par ml, l'activité enzymatique par unité de volume AVOi, l'activité spécifique Aspec (en unités par mg de protéine) et finalement l'activité relative Arei exprimée en % de l'activité de l'enzyme native. Toute l'expérience s'est déroulée à température ambiante.
[0086] Tableau 1: Activité de l'a-amylase à chaque étape de la renaturation par dialyse
<tb>Etape<sep>Camylase
[mg/ml]<sep>Avol
[U/ml]<sep>Aspec
[U/mg]<sep>Arel
[%]
<tb>Enzyme native<sep>10.0<sep>4670<sep>467<sep>100
<tb>Dénaturation 12h<sep>10.0<sep>367<sep>36.7<sep>8
<tb>Après dialyse<sep>10.0<sep>174<sep>17.4<sep>4
Dénaturation de l'[alpha]-amylase et renaturation dans une matrice d'alginate
[0087] Le but est d'encapsuler l'enzyme dénaturée à haute concentration dans une matrice d'alginate en présence du chlorure de guanidinium, de permettre à ce dernier de diffuser rapidement hors des billes avant de les récupérer et de les plonger dans une solution de citrate de sodium pour dissoudre le gel et récupérer une enzyme concentrée et active.
[0088] On a pesé 200 mg d'[alpha]-amylase, avant de les transférer dans un flacon jaugé de 20 ml. Environ 10 ml de tampon phosphate 0.1 M pH 7.0 contenant 0.5 mM de CaCI2 ont été transférés dans le jaugé pour dissoudre l'enzyme. Après dissolution de l'enzyme, on a ajouté 5.732 g de chlorure de guanidinium (correspondant à 3.0 M une fois dissouts dans 20 ml) à la solution d'enzyme et complété le volume jusqu'à un total de 19.5 ml environ. On a ensuite laiisé le mélange 16h à température ambiante afin de dénaturer l'enzyme le plus complètement possible.
[0089] A la fin de l'étape de dénaturation on a transféré la solution d'enzyme dans un bêcher de 50 ml et ajouté 0.8 g d'alginate afin d'obtenir une solution à 4% de ce dernier. On a agité doucement avec une spatule afin de dissoudre l'alginate sans générer trop de bulles d'air. Le cas échéant, ces dernières peuvent être efficacement éliminées par centrifugation ou en plaçant la solution sous vide.
[0090] L'alginate une fois dissout on a rempli une seringue de 10 ml avec le mélange, que l'on a laissé tomber goutte à goutte dans 490 ml d'une solution de CaC2 5%. Les billes ainsi formées ont été laissées pendant 1h sous agitation modérée. Ce laps de temps est assez long pour permettre l'élimination complète de l'agent dénaturant et permettre la renaturation de l'enzyme, tout en étant assez court pour garantir une bonne rétention de cette dernière.
[0091] Les 10 ml de billes ont ensuite été récupérées à l'aide d'une passoire et transférées dans 90 ml de citrate de sodium 500 mM à pH 5.0 afin de dissoudre l'alginate et de récupérer l'enzyme soluble et renaturée.
[0092] L'activité de l'enzyme ainsi renaturée a finalement été mesurée et comparée à l'activité récupérée après dialyse à la même concentration de 10 mg/ml. Les résultats sont consignés dans le Tableau 2.
[0093] Tableau 2: Renaturation de l'enzyme par encapsulation dans une matrice d'alginate
<tb>Etape<sep>Camylase
[mg/ml]<sep>Avol
[U/ml]<sep>Aspec
[U/mg]<sep>Arel
[%]
<tb>Enzyme native<sep>10.0<sep>4820<sep>482<sep>100
<tb>Dénaturation 16h<sep>10.0<sep>329<sep>32.9<sep>7
<tb>Ex-capsules<sep>1.0<sep>314<sep>314<sep>65
[0094] On constate pour cet essai un rendement de renaturation de 65%. A conditions expérimentales identiques cette valeur est très similaire aux rendements habituellement obtenus en diluant 50 fois une solution contenant 1 mg/ml d'enzyme et 3.0 M de chlorure de Guanidinium. Ce résultat a par contre été atteint à une concentration d'enzyme 50 fois supérieure représentant ainsi des économies substantielles pour les étapes de purification suivantes où l'enzyme devra être à nouveau concentrée.
REFERENCES
[0095] Brekke O.H. and Loset G.Â. (2003): New technologies in therapeutic antibody development. Current opinion in Pharmacology 3 (5), 544-550
[0096] De Bernardez Clark E. (1998): Refolding of recombinant proteins. Current Opinion in Biotechnology 9, 157-163
[0097] De Bernardez Clark E. (2001): Protein refolding for industrial processes. Current Opinion in Biotechnology, 12, 202-207
[0098] Schlegl R., Tscheliessnig A., Necina R., Wandl R., Jungbauer A. (2005): Refolding of proteins in a CSTR.Chemical Engineering Science 60, 5770-5780
[0099] Ferré H., Ruffet E., Nielsen L.-L. B., Nissen M.H., HobleyT.J., Thomas O.R.T., Buus S. (2005): A novel System for continuous protein refolding and on-line capture by expanded bed adsorption. Protein Science 14, 2141-2153.
[0100] Middelberg A.P.J. (2002): Preparative protein refolding. Trends in Biotechnology 20 (10), 437-443
[0101] Lanckriet H. & Middelberg A.P.J. (2004): Continuous chromatographic protein refolding. Journal of Chromatography A 1022, 103-113
[0102] Hutchinson M.W. & Chase H.A. (2006): Adsorptive refolding of histidine-tagged glutathione S-transferase using métal affinity chromatography. Journal of Chromatography A 1128 (1-2), 125-132
[0103] Randolph T.W. et al. (1999): High pressure fosters protein refolding from aggregates at high concentrations, PNAS 96 (23), 13029-13033
[0104] Randolph T.W. et al. (2002): High hydrostatic pressure as a tool to study protein aggregation and amyloidosis. Biochimica et Biophysica Acta 1595, 224-234
[0105] Mondai K., Bohidar H.B., Roy R.P., Gupta M.N. (2006): Alginate-chaperoned facile refolding of Chromobacterium viscosum lipase. Biochimica et Biophysica Acta 1764, 877-886
[0106] Mondai K., Raghava S., Barua B., Varadarajan R., Gupta M.N. (2007): Rôle of Stimuli-Sensitive Polymers in Protein Refolding: r-Amylase and CcdB (Controller of Cell Division or Death B) as Model Proteins. Langmuir 23, 70-75.
[0107] AU 2007202306: Improved protein disaggregation and refolding using high-pressure. Barofold, Inc., 22.05.2007.
[0108] WO 2007062174: Devices and methods for high-pressure refolding of proteins. Barofold, Inc., 21.11.2005
[0109] WO9202540: Procédé de purification d'une protein présente dans des corps d'inclusion. BioEurope, 01.08.1990
[0110] WO9402625: Process for isolating recombinant polypeptides. Immunex Corp., 21.07.1992
The invention relates to a method for purifying and renaturing a protein. It relates more particularly to a process for purifying a recombinant protein accumulated in the form of insoluble inclusion bodies by prokaryotic or eukaryotic cells. This process comprises in particular a renaturation step, and makes it possible to drive the latter at a high protein concentration.
While the structural biology that predicts the three-dimensional structure of proteins derived from raw sequences has become one of the approaches to make sense of this flow of information, protein production methods, by contrast, have remained relatively artisanal. although progress has been made in the development and improvement of recombinant protein production and purification systems.
[0003] There are a very large number of expression systems (host cell / gene vector combination) specific for each protein or family of recombinant proteins. The choice of the expression system is essentially guided by the modifications that the protein must undergo to be biologically active.
[0004] Until the mid-1990s, the bacterium, and more particularly Escherichia coli (E. coli), was the host of choice for producing a recombinant protein. E. coli has been extensively studied since the 1960s, so it is one of the best known organisms today. All of this knowledge in biochemistry, genetics and molecular biology has been exploited to express proteins in large quantities. This bacterium has several interesting properties with regard to the expression of proteins: it is easy to handle, it grows quickly in relatively inexpensive media and the laboratory strains are harmless. In addition all molecular biology laboratories use E. coli for other experiments (cloning, sequence ...). This facility has made it the most popular expression system.
On the other hand, the production of recombinant proteins in the bacteria frequently leads to inactive proteins, aggregated in a solid form called the inclusion body. These are dense and can be found either in the cytoplasm or in the periplasmic space of the cell.
[0005] Currently, with the development of cell culture technologies, about 70 to 80% of the proteins of interest are produced in animal cells. Most human or humanized recombinant antibodies are produced in such host cells (Brekke & Loset, 2003). Indeed, despite a much slower growth rate and a great fragility especially with respect to agitation, animal cells have the property of glycosylating the proteins they synthesize. As a post-translational modification, this glycosylation is necessary for the biological activity of molecules such as therapeutic antibodies.
To fulfill their function, the proteins must adopt a precise three-dimensional conformation, the native state, acquired during cellular refolding. However, many recombinant proteins are not produced in their native state, but aggregate in a state most often biologically inactive, called inclusion body. The aggregation phenomenon described above leads to a significant reduction in productivity and efficiency for these expression systems because it makes additional process steps necessary in the process. Moreover, contrary to what is commonly admitted, the formation of inclusion bodies is not restricted to bacterial systems but is also observed in certain eukaryotic cells.
However, these inclusion bodies have the advantage of representing a concentrated and relatively pure form of the target molecule. In addition, the denatured and insoluble form of the proteins that compose them makes them less susceptible to degradation by the proteases released during the cell lysing step.
[0008] These inclusion bodies, granules of aggregated proteins sometimes visible in light microscopy, greatly facilitate the purification of the protein. By cons they must then be solubilized, usually in the presence of a chaotropic agent, which causes their almost complete denaturation. This is why the solubilization must imperatively be followed by a folding step (or renaturation) in vitro. This last step is empirical, requires a tedious focus specific for each protein, and its yield is often low. Thus the main difficulty of this kind of process is to convert an inactive and insoluble protein into an active and soluble protein with the highest possible yield and in the most economical way possible.
Another important point is that no variation of the process should occur during industrial scale-up; this process must be easy to automate and be generic for a wide range of similar proteins so that the technology does not have to be reinvented each time. Fig. 1 shows a sequence of commonly used steps for isolation of inclusion bodies, their solubilization and renaturation of the target protein.
The international patent application WO9202540, filed in the name of BioEurope, precisely describes one of these purification processes, with however a different approach to that described in FIG. This application discloses a method for purifying secreted protein in the form of inclusion bodies which are insoluble by a bacterium, characterized in that:
a) a pellet or solid fraction combining the aforementioned cell fragments and inclusion bodies is harvested after grinding of the microbial cells and centrifugation, and the pellet is suspended in a solution of water-soluble substance which can to be gelled, c) the mixture of the solid particles of the pellet and of the solution of water-soluble substance is injected dropwise in a gelling solution, for example a solution containing multivalent cations, thus making the encapsulation of the solid particles of the pellet in the gelled substance, d) the encapsulated pellets are suspended in a dissolution solution containing at least one chaotropic agent and optionally a reducing agent, e) the denatured protein is obtained and purified in solution,
cell debris and other insoluble compounds remaining trapped in the gelled matrix. This approach therefore makes it possible to separate the inclusion bodies (ie the product of interest) from the cell fragments in a simple and efficient manner, a step that is important and difficult to master but often obscured in the descriptions of the literature. A major drawback of this approach lies in the fact that other compounds will be solubilized at the same time as the inclusion bodies, thus reducing the purity of the recovered product compared to the direct isolation of solid inclusion bodies. . Renaturation should therefore be done in the presence of more or less significant amounts of contaminants, which can have a negative impact on renaturation yields.
Moreover, this international application does not go beyond the solubilization of the inclusion bodies, and does not in any way deal with the means of obtaining a native protein from the denatured material, except by the conventional methods of dilution.
The protein is then renatured by removing denaturants in its environment; this is done by diluting the medium used for the dissolution of the inclusion bodies. This renaturation technique, on the other hand, does not allow renaturation according to the requirements of current biology. Moreover, many proteins can not be renatured in this way and the result obtained does not always allow an effective subsequent use of these recombinant proteins.
Indeed it is known that the proteins obtained by this kind of process are with a very good degree of purification, sufficient for some experiments (especially for immunizations). However, other uses require the production of a purified soluble protein that has recovered its original three-dimensional conformation.
The international patent application WO9402 625, filed in the name of Immunex Corporation, also does not propose an efficient and reliable renaturation process. Indeed, this application discloses a method of isolating a recombinant polypeptide produced as a component of an insoluble fraction in a transformed host cell, which comprises entrapping the host cells (before or after the lysis of these cells). ci) in a porous matrix; to break, if it had not already been done, the membrane of the host cells to allow the diffusion of the soluble proteins contained in said cells; washing the trapped host cells to extract soluble proteins, while leaving the insoluble fraction in the porous matrix;
and contacting the insoluble fraction in the porous matrix with a chaotropic agent to isolate the recombinant polypeptide from the insoluble fraction. Again, aspects related to the renaturation and the yield of this last step are not described in the invention.
The two patent applications cited above, although using a similar material and approach, mainly deal with the facilitated solubilization of a recombinant protein from inclusion bodies, while maintaining solid residues trapped in a hydrogel-type matrix. The renaturation phase of the recombinant protein thus solubilized, however critical and most often limiting in terms of costs and time, is hardly addressed.
The most frequently used method for renaturing is dilution, which consists in diluting the soluble but denatured protein using a renaturation buffer. This is a simple method, but one that can lead to difficulties in commercial applications. Indeed, it requires the manipulation of large volumes of buffer for dilution, which necessitates a subsequent concentration step and increases the cost of the process [De Bernardez Clark, 1998]. However, dilution is necessary for solution renaturation because high protein concentrations promote agglomeration, characterized by second-order kinetics (Schlegl et al., 2005), to the detriment of the parallel and competing renaturation process, which follows to him first order kinetics.
Different approaches have been proposed to allow the renaturation of high concentration proteins. Among them are techniques where it is sought to reduce the mobility of the protein during the process; this must make it possible to limit the phenomenon of aggregation, which implies that the protein molecules meet. This category includes the approaches described by Ferré et al. (2005), Middelberg (2002), or Lanckriet & Middelberg (2004). The protein is generally adsorbed on a chromatographic column, which limits its mobility, while the denaturing agent is removed. A major drawback of this approach is that the denatured protein, even if it carries the same overall charge, is often not adsorbed in the same way on the stationary phase as the native protein.
One possible solution to this problem is to use proteins bearing a marker (commonly called "tag" in English) of type (His) 6 for example, and to adsorb them on an affinity column of "IMAC" type (Immobilized Metal Affinity Chromatography) carrying transition metal ions such as Cu2, Co2, Ni2 or Zn2 + and for which histidine has a high affinity (Hutchinson & Chase, 2006).
In another approach, high hydrostatic pressures are used to promote the folding of recombinant proteins to their native structure even at high concentrations. The principle and examples of applications of this technology developed and operated by BaroFold, Inc. are described in publications (Randolph et al., 1999 and 2002) as well as in a series of patent applications (AU 2007 202 306 , WO 2007 062174). Although this method has proved its effectiveness in many applications, the equipment to reach pressures of several kbar are however extremely expensive and the residence time in the machine can reach 24 hours.
Therefore, in view of the state of the art described above, there is still a need for a large-scale efficient method of renaturation of a recombinant protein, if possible in high concentration.
The invention described below allows to work on a large scale, with a high concentration of proteins, with inexpensive materials, in easily reproducible conditions and with a high yield. The use of high protein concentrations thus makes it possible to reduce the volumes and thus to facilitate their handling.
The present invention mainly relates to a process for the purification and renaturation of a recombinant protein accumulated in the form of an insoluble inclusion body by prokaryotic or eukaryotic cells, characterized in that:
a) the inclusion bodies are collected in the form of a pellet after lysis of the prokaryotic or eukaryotic cells and centrifugation,
b) the pellet is put in the presence of a denaturing solution containing at least one denaturing agent and / or a reducing agent and / or a detergent agent, in order to dissolve the proteins contained in the pellet at high concentration,
c) dissolving a gelling polymer in the denaturing solution,
d) contacting the denaturing solution comprising the gelling polymer with a bath causing gelling of the dissolved gelling polymer,
thus leading to the encapsulation of the denatured proteins and the denaturing agent and / or the reducing agent and / or the detergent in the solution thus gelled,
e) allowing the denaturing agent and / or reducing agent and / or detergent (which are molecules of relatively low molecular weight) to diffuse through the thus gelled solution comprising the encapsulated denatured proteins much faster than the latter, thus leading to a progressive renaturation of these denatured proteins while limiting their aggregation (due to a greatly reduced mobility),
f) the capsules containing the renatured protein are introduced in the presence of a solution allowing the dissolution of the gel,
g) the renatured and purified protein is obtained in solution at a high concentration
The invention also relates to a kit and an apparatus for carrying out the method of purification and renaturation of a recombinant protein accumulated in the form of an insoluble inclusion body by prokaryotic or eukaryotic cells.
<tb> Fig. 1 <sep> represents a classical scheme of isolation, solubilization and renaturation of recombinant proteins accumulated in a host cell in the form of inclusion bodies.
<tb> Fig. 2 <sep> represents the kinetics of release of guanidiniun chloride (GdnCl) and ovalbumin out of 3 mm diameter beads prepared with different concentrations of alginate. Temperature = 22 [deg.] C.
<tb> Fig. 3 <sep> represents the kinetics of release of guanidiniun chloride (GdnCl) and ovalbumin from 5 mm diameter beads prepared with different concentrations of alginate. Temperature = 22 [deg.] C.
<tb> Fig. 4 <sep> shows the influence of the stirring rate on the kinetics of release of quanidinium chloride from 5 mm diameter beads prepared with 2% alginate. Temperature = 22 [deg.] C.
By recombinant protein is meant a protein produced by cells (eukaryotic or prokaryotic) whose DNA has been modified by genetic recombination. The use of an expression vector (generally a plasmid or a virus for eukaryotic vectors), acting as the genetic carrier of the gene of interest encoding the desired protein is the most often used means for modify the DNA of the cells used for the production of the recombinant protein.
By protein is meant a macromolecule composed of one or more chain (s) (or sequence (s)) amino acids linked together by peptide bonds. In general, we speak of protein when the chain contains more than 50 amino acids. In the opposite case, we speak of peptides and polypeptides. Therefore, the present invention also contemplates a method of purifying and renaturing a recombinant protein of less than 50 amino acids or peptides (as defined above) accumulated as an inclusion body insoluble by cells. prokaryotes or eukaryotes.
In general, the recombinant protein is produced by prokaryotic or eukaryotic host cells. Prokaryotic cells lack a cell nucleus and are generally unicellular. They include bacteria, cyanobacteria, archaebacteria. Their genetic material is diffuse circular deoxyribonucleic acid (A.D.N or DNA) in the cytoplasm of the cell. Prokaryotic cells are considered more evolutionarily primitive and generally have fewer genes than eukaryotic cells.
Eukaryotic cells, in turn, are characterized primarily by the fact that they have a nucleus composed of a double membrane surrounding the DNA. These cells include all the organisms included in four great kingdoms of the living world: animals, fungi, plants and protists.
There is, for the moment, no absolute rule to predict the stability, solubility, activity and conformation of a recombinant protein (heterologous) expressed by a eukaryotic or prokaryotic type E cell. coli. The main problem encountered is the formation of inclusion bodies insoluble in the cytoplasm of these host cells. Indeed, in E. coli, the important expression of heterologous proteins often leads to the appearance of granules called insoluble inclusion bodies which are visible by phase contrast microscopy. They generally contain the overexpressed recombinant protein as well as nucleic acids and some bacterial proteins.
These insoluble inclusion bodies can be quite easily isolated thus making it possible to obtain the recombinant protein with a good degree of purification, which is sufficient for certain experiments (in particular for conventional immunizations). However, other approaches, for example therapeutic treatments using peptides or antibodies, require the production of a purified and native soluble protein.
Indeed, the recombinant protein is produced as insoluble inclusion bodies. Conventionally, the eukaryotic or prokaryotic cells will first be concentrated from the culture medium of these cells, by centrifugation or ultrafiltration. The present invention makes it possible to work with a high concentration of proteins, which makes it easier to handle them.
Lysis of eukaryotic or prokaryotic cells is then obtained by disrupting the plasma membrane of these cells by the action of a physical, chemical or biological agent, thus leading to the death of the cell.
Preferably, the mechanical grinding (eg in a ball mill, a high pressure homogenizer or a "french press") or sonication (ultrasonic treatment) but chemical agents such as detergents (anionic, cationic, neutral), organic solvents, strong bases or acids or enzymatic preparations are also conceivable.
Step A:
The inclusion bodies are then harvested by centrifugation. During this centrifugation, the supernatant contains the soluble constituents of the bacterium. But the particulate fraction thus collected, also called pellet, contains in addition to insoluble inclusion bodies containing recombinant proteins, non-lysed cells, cellular debris and protein contaminants, soluble or not.
Optionally, the pellet is washed, beforehand in the dissolution step, with an aqueous buffer solution to remove soluble contaminants. Buffer solutions commonly used are, depending on the desired pH, acetate, citrate, phosphate, Tris, or Glycine and any other buffer that the skilled person deems useful to use.
Step B:
This pellet is then placed in the presence of a denaturing solution containing at least one denaturing agent and / or a reducing agent and / or a detergent agent, in order to dissolve the proteins contained in the pellet. The denaturing solution comprises at least one denaturing agent selected from chaotropic agents known to those skilled in the art such as urea or guanidinium chloride, these examples not being limiting. The role of this denaturing agent is to cause the dissociation of proteins by altering their spatial configuration or their conformation. The solution may also contain at least one reducing agent selected from the non-limiting group comprising (3-mercaptoethanol, glycine, dithiothreitol, glutathione, etc. A preferred agent is glutathione.
The solution may also contain a detergent agent known to those skilled in the art and may be selected from the non-limiting group comprising anionic, neutral, cationic or zwitterionic detergents. Preferably the detergent agent will be selected from the non-exhaustive group including Triton X100, CHAPS, dodecyl maltoside, DTAB, CTAB.
These three agents (denaturant, reducing agent and detergent) can be together in the same solution or alone or in groups of two.
Once the solubilized recombinant protein, it can, if necessary, easily separate by filtration or centrifugation of cell debris and other insoluble particles resulting from the lysis step.
Alternatively one can proceed to the lysis of the cells and recover (after centrifugation and / or filtration and washing) the insoluble solid material. This solid fraction contains cell debris and inclusion bodies. These can be dissolved by contacting the centrifugation pellet with a denaturing solution containing at least one denaturing agent and / or a reducing agent and / or a detergent agent, in order to dissolve the proteins contained in the pellet at high concentration, and isolate by centrifugation and / or filtration the supernatant containing the denatured target molecule,
Step C:
In the next step, a gelling polymer is dissolved in the denaturing solution. Among the most commonly encountered gelling polymers, mention may be made, among other examples, of alginate, carrageenan, chitosan, pectin, starch (modified or otherwise), gelatin, cellulose sulphate, carboxymethylcellulose, xanthan gum, locust bean gum, gellan gum or agar agar.
Apart from these polysaccharides, gelatin and other proteins also have interesting properties vis-à-vis the formation of more or less permeable gels.
Synthetic polymers giving rise to the formation of a hydrogel can also be used, provided that the gel can be broken down at the end of the renaturation process, whether by dissolution or degradation of the polymer.
So-called smart polymers, which have the property of changing phase according to the temperature are another possibility of confinement of the denatured protein.
Carrageenan (or carrageenan) is a polysaccharide extracted from red algae as a thickening and stabilizing agent in the food industry. It bears the code E407 of the classification of food additives. Carrageenans make it possible to form hot gels (up to 60 [deg.] C) and are therefore of interest compared to traditional animal gelatins.
A more preferred polysaccharide according to the present invention is alginate. Alginate is a polymer formed from two monomers bonded together: mannuronate or mannuronic acid and guluronate or guluronic acid. The proportion and distribution of these two monomers is critical for a broad expansion of the physical and chemical properties of alginate.
Alginates can form hard and heat-stable gels used as food additives (E400 to E405) for the reconstruction of food (ham, blue cords, breaded fish ...). Alginate beads can also be used in medicine to encapsulate drugs or fragile biological substances (enzymes, microorganisms, animal or human cells). In general, the concentration of alginate used according to the invention is between 2 and 10%, preferably between 4 and 5%. It should be noted that the alginate concentration required to achieve a given gel firmness will depend on the molecular weight of the alginate, its purity, as well as the respective proportions of manuromate and guluronate.
The choice and the concentration of the encapsulation matrix will be made by the skilled person depending on the size and charge of the protein and its activity. For example, better retention can be achieved by encapsulating a positively charged protein (at a pH below its isoelectric point) within a negative charge matrix.
In addition, it is envisaged the possibility of adding within the encapsulation matrix or in the surrounding solutions any compounds capable of facilitating or accelerating the renaturation of the target molecule. Many examples are cited in the scientific literature and are known to those skilled in the art. Mention may be made briefly and non-exhaustively of redox systems such as reduced / oxidized glutathione (GSH / GSSG), certain amino acids such as arginine, proline, polyols such as glycerol or polyethylene glycol, sugars such as sucrose or polymers such as heparin, a glycosaminoglycan.
Step D:
The denaturing solution comprising the gelling polymer is then brought into contact with a bath causing gelling of the dissolved gelling polymer, thus leading to the encapsulation of the denatured proteins and of the denaturing agent and / or of the reducing agent and or detergent in the solution thus gelled.
In general, the contacting between the denaturing solution and the bath causing the gelation of the polymer is carried out by dropping the denaturing solution into the bath, thereby causing the polymer to gel. However, any other technique for obtaining capsules or polymer beads is suitable for carrying out the present invention. The diameter of the beads thus obtained may typically be between 1 and 10 mm, but an extrusion in the form of spaghetti or a bulk or other form of gelation is also possible.
The tests carried out by the applicant of the present invention have shown that large logs (4-5 mm in diameter) do not constitute a handicap insofar as the denaturing agent can still escape rather quickly and where the The target protein was better retained by 4-5 mm beads than by smaller beads.
Preferably, if the gelling polymer is alginate then the bath causing gelling of the polymer consists of a calcium chloride solution between 3 and 10%, more preferably around 5%.
In general, it is the nature of the gelling polymer that will determine that of the bath causing gelling of the polymer. Also each polymer pair / gelling bath will be precisely determined by the skilled person according to his knowledge.
It is the same with the concentration of the component present in the gelling bath; this concentration is directly dependent on the concentration of the gelling polymer and will also be determined precisely by the skilled person according to his knowledge.
Step E:
In the next step, the denaturing agent and / or the reducing agent and / or the detergent agent are allowed to diffuse through the solution thus gelled comprising the encapsulated denatured proteins, thus causing a renaturation. of these denatured proteins while limiting their aggregation. Indeed and surprisingly, the inventors of the present invention have noticed that the use of a gelling polymer to encapsulate the denatured proteins and in solution in the denaturing solution made it possible to obtain a high degree of renaturation of the denatured recombinant protein. while limiting the aggregation of these same proteins.
This progressive renaturation is obtained by a favorable combination of two effects:
<Tb> 1) on the one hand, the denaturing agent and / or the reducing agent and / or the detergent agent, which are molecules of relatively small size, are allowed to diffuse through the gelled matrix, thus reducing the concentration of these substances at values allowing the renaturation of the protein.
<Tb> 2) <sep> On the other hand, by strongly limiting the mobility of the protein within the matrix during the renaturation step, it is prevented from forming aggregates, which leads to higher renaturation yields despite the high concentration of protein.
The diffusion of the denaturing agent and / or the reducing agent and / or the detergent agent through the solution thus gelled comprising the encapsulated denatured proteins is carried out by bringing into contact said encapsulated denatured proteins, in general in the form of capsules or beads, in the presence of water, preferably distilled or a buffer providing the protein pH conditions favorable to its stability. The volume of distilled water is in general 10 to 30 times, preferably 20 times, larger than the volume of beads. A slight agitation can be applied to allow a faster and more homogeneous diffusion. As the denaturing agent is removed, the target molecule will thus be placed in conditions favorable to its renaturation and limiting its tendency to agglomeration.
This renaturation process makes it possible to obtain excellent results. The temperature can be maintained at a value known to those skilled in the art and guaranteeing the stability of the protein for the duration of this step.
Step F:
After this in silico renaturation step, the capsules containing the denatured proteins are put in the presence of a solution allowing the dissolution of the gel. The latter is selected from solutions of sodium citrate, EDTA or sodium fluoride, are compounds known to those skilled in the art and for complexing calcium, thus leading to the disintegration of the alginate network.
Preferably, a buffered sodium citrate solution is used at one of the following concentrations: 100 mM, 200 mM, 300 mM or 500 mM, with a preference for a concentration of 200 mM.
These concentrations can also be advantageously applied to other compounds at the base of the solution for the dissolution of the gel. This will be conducted over a period of 30 to 180 minutes (preferably 60 minutes) and at a temperature between 5 and 40 [deg.] C (preferably 10-25 [deg.] C).
In general, it is preferable to carry out this step of dissolving the gel in small volumes of solution, in order to finally obtain a medium to high concentration of recombinant protein which is renatured and purified in the solution.
Step G:
The protein is then obtained in renatured and purified form in concentrated solution.
The present invention also comprises an apparatus for carrying out the method of purification and renaturation of a recombinant protein accumulated in the form of an insoluble inclusion body by prokaryotic or eukaryotic cells as described above.
The present invention also comprises a kit for carrying out the method of purification and renaturation of a recombinant protein accumulated in the form of an insoluble inclusion body by prokaryotic or eukaryotic cells as described above. This kit may comprise, inter alia, i) the denaturing agent and / or the reducing agent and / or the detergent agent in general in the form of solutions, ii) the gelling polymer, iii) a bath solution causing gelling said gelling polymer and iv) prokaryotic or eukaryotic cells necessary for the expression of the recombinant protein. Optionally, the kit may also comprise an expression vector (plasmid or other) necessary for the expression of the recombinant protein of interest.
The following examples are intended to demonstrate the feasibility of the present invention and can not limit the invention to these descriptions alone.
The first example below is a proof of concept which demonstrates that a protein trapped in an alginate matrix diffuses much more slowly than the denaturing agent which is also encapsulated therein. The model chosen for the protein is ovalbumin, with a molecular weight of approximately 45 kDa, and isoelectric point 4.6.
The second example shows a renaturation test of α-amylase of B. amyloliquefaciens (molecular weight 55 kDa, isoelectric point around 5.2) at high concentration (10 mg / ml) produced in two different ways:
In the former, the denaturing agent (guanidinium chloride) was removed by dialysis, the enzyme remaining in solution inside the dialysis chamber. Amylase activity was measured before denaturation and after dialysis.
In the second approach the denatured enzyme (10 mg / ml) and the denaturing agent (3.0 M) were encapsulated in an alginate matrix. The capsules thus formed were immersed in a buffer solution, which allowed rapid removal of the denaturing agent. The beads were then recovered and dissolved by complexation of calcium with citrate.
Amylase activity was measured before denaturation and after renaturation treatment.
All the tests described below were carried out at room temperature (22 [deg.] C).
Example 1: Proof of concept - measurements of diffusion rates of BSA and guanidinium chloride out of an alginate matrix.
Chemicals and reagents
Sodium alginate, Lot # KLTV45184A, Inotech AG, Basel (Switzerland) Calcium chloride dihydrate (CaCl2-2H2O), Fluka Chemicals, Buchs (Switzerland). Guanidinium Chloride, Sigma Aldrich, Buchs (Switzerland) Crystalline Ovalbumin 5x, Fluka Chemicals, Buchs (Switzerland) Tri-sodium Citrate Dihydrate, Panreac Chemicals, Barcelona (Spain)
Description of the test
In a 10 mM Tris buffer at pH 7.0, 10 mg / ml of ovalbumin was dissolved, guanidinium chloride (GdnCl) at a rate of 3.0 mol / l and sodium alginate at concentrations ranging between 2 and 5%. The solution was then degassed and the air bubbles removed by centrifugation and / or under vacuum.
This mixture was then dropped into a 10 mM Tris buffer solution at pH 7.0 containing 5% CaCl 2 as well as ovalbumin and GdnCl at the same concentrations as before (10 mg / ml and 3.0 mol / l, respectively) to avoid losses during storage of the beads. Alginate beads with a diameter of about 5 mm were thus formed.
For the beginning of the test, the balls, with a total volume of 10 ml, were recovered and drained using a strainer before being immersed in a container containing 190 ml of a solution. 10 mM Tris buffer pH 7.0. The suspension was stirred with a magnetic bar.
The migration of guanidinium chloride and ovalbumin from the alginate matrix to the external solution was measured from this moment onwards. The assay of GdnCL was done continuously by conductimetry. The concentration of ovalbumin in the liquid was determined by regular sampling and by measuring the absorbance of the solution at 280 nm.
Two sizes of beads as well as different alginate concentrations and variable stirring speeds were tested during these tests.
Results
The results of the tests described above are shown in FIG. 2. It can be seen that 20 minutes are sufficient to eliminate almost all the denaturing agent contained in beads 3-4 mm in diameter, irrespective of the alginate concentration used for the manufacture of the beads ( between 2 and 5%), FIG. 3 shows exactly the same trends for larger logs, 5 mm in diameter. It is also noted for the two sizes of beads that ovalbumin, because of its size, diffuse for its part that much slower out of the matrix of alginate.
Fig. 2 also demonstrates the influence of the alginate concentration on the release rate of the components: first observation, a 5% gel of alginate does not seem to retain the denaturant more strongly than a gel at 2%; this is not too surprising given the small size of the GdnCl molecule. Ovalbumin, on the other hand, with a molecular weight of 45 kDa, is released much less rapidly from a 5% alginate gel than from a 2% gel. The "tighter" network of the 5% gel therefore retains better the protein studied here.
Other tests, the results of which are reported in FIG. 4, have also shown that the stirring speed had virtually no impact on the migration rate of the various components, including guanidinium chloride, to the outside of the beads. All the above results clearly indicate the transport inside the beads as the limiting step of the process.
These results also demonstrate unequivocally that small diameter beads are not required to carry out the application described here. Accordingly, the present invention does not require the use of sophisticated technology for the generation of small diameter monodisperse droplets as described in the microencapsulation literature.
The observations reported here thus amply demonstrate the validity of the proposed concept, namely the rapid migration of the denaturing agent out of the alginate beads as well as the retention of the major part of the protein within these alginate beads. during this period of time.
Example 2 Renaturation of [alpha] -amylase of B. amyloliquefaciens at high concentration - comparison of the method by dialysis and diffusion of the denaturing agent out of an alginate matrix.
Chemicals and reagents
Sodium alginate, Lot # KLTV 45184A, Inotech AG, Basel (Switzerland) [alpha] -amylase of Bacillus amyloliquefaciens, 839 units / mgsolid, Sigma-Aldrich, Buchs (Switzerland).
Guanidinium Chloride, Sigma Aldrich, Buchs (Switzerland)
Calcium Chloride Dihydrate, Fluka Chemicals, Buchs (Switzerland)
Tri-sodium Citrate dihydrate, Panreac chemicals, Barcelona (Spain)
Phadebas <(R)> kit for amylase assay, Magic AB, Lund (Sweden)
Measurement of Guanidinium Chloride Concentration (GdnCl)
The concentration of the denaturing agent was measured by conductimetry, as described in Test 1.
Measurement of activity of [alpha] -amylase.
The activity of the α-amylase (and therefore the concentration of native enzyme) was determined during the various tests using a Phadebas commercial kit. <(R)> marketed by Magie AB, Lund (Sweden). This consists of a modified starch, onto which has been grafted a dye which solubilizes as the substrate is degraded by the amylase.
The measurements were carried out according to the following general protocol:
Three (insoluble) substrate tablets were dispersed in 32 ml of 0.1 M phosphate buffer pH 7.0 also containing 0.5 mM calcium chloride. The suspension was kept stirring to ensure homogeneity.
2 ml of suspension were then taken and placed in a test tube.
Then 0.5 ml of enzyme solution (at the appropriate dilution) was added before starting the stopwatch and stirring the mixture at room temperature.
After 10 minutes of incubation, 0.5 ml of 0.5 M NaOH was added with good stirring in order to stop the reaction.
The resulting suspension was then filtered through a 0.45 [micro] m membrane using a syringe and the absorbance of the supernatant measured at 620 nm (blue color due to solubilized dye) against a negative control sample where the solution of enzyme was replaced by phosphate buffer.
The difference in absorbance thus measured was, taking into account possible dilutions, directly proportional to the concentration of active enzyme in the sample.
Description of the test
This test aims to compare the renaturation yields at high concentration of [alpha] -amylase obtained either by dialysis or by the method proposed in the present invention.
In the first concentrated enzyme (10 mg / ml) is in solution and is free to form aggregates. In the second, the enzyme is immobilized in a gel allowing its renaturation but limiting its mobility, so that the aggregation is strongly inhibited.
In the second approach, the denatured enzyme (10 mg / ml) and the denaturing agent (3.0 M) were encapsulated in an alginate matrix. The capsules thus formed were immersed in a buffer solution, which allowed a rapid removal of the denaturing agent, as demonstrated in Test 1. The beads were then recovered and dissolved by calcium complexation using citrate. Amylase activity was measured before denaturation and after renaturation treatment.
Denaturation of α-amylase and renaturation by dialysis
About 5 ml of a 10 mg / ml solution of B. amyloliquefaciens α-amylase was denatured at room temperature for 12 h in the presence of 3.0 M guanidinium chloride (GdnCl). The residual activity of the enzyme was measured before and after denaturation. The results are shown in Table 1.
An amount equivalent to 2 ml of the denatured enzyme solution was then transferred to a dialysis cassette whose nominal cutoff is 10 kDa. The cassette was then suspended in 3.0 liters of phosphate buffer stirred with a magnetic bar and left for 12 hours.
The equilibrium of the concentrations once reached, the denaturing agent was diluted 1500 times, which corresponds to a residual concentration of 2 mM.
It was noted that after a long denaturation of 12 hours, there was only 8% of relative activity. During renaturation by dialysis, a precipitate appeared in the cassette. After 12 hours of dialysis, the sample was recovered, mixed and its activity measured. This proved to be very low, reaching 4% of initial activity. It therefore seems that the aggregation of proteins has caused a significant loss of activity. The problem of dialysis is that the enzyme concentration remains high in the cassette (10 mg / ml). Thus, the tendency to aggregation is strong and renaturation by dialysis appears as an inappropriate method in this case.
The activity of the enzyme was measured at each stage of the experiment and is reported in Table 1 below. It contains the concentration of Camyiase enzyme in mg of protein per ml, the enzymatic activity per unit volume AVOi, the specific activity Aspec (in units per mg of protein) and finally the relative activity Arei expressed in% of the activity of the native enzyme. The whole experiment took place at room temperature.
Table 1: Activity of α-amylase at each stage of renaturation by dialysis
<Tb> Step <September> Camylase
[Mg / ml] <September> Avol
[U / ml] <September> Aspec
[U / mg] <September> Arel
[%]
<tb> Native Enzyme <September> 10.0 <September> 4670 <September> 467 <September> 100
<tb> Denaturation 12h <September> 10.0 <September> 367 <September> 36.7 <September> 8
<tb> After dialysis <September> 10.0 <September> 174 <September> 17.4 <September> 4
Denaturation of [alpha] -amylase and renaturation in an alginate matrix
The aim is to encapsulate the denatured enzyme at high concentration in an alginate matrix in the presence of guanidinium chloride, to allow the latter to rapidly diffuse out of the beads before recovering them and to plunge them into a sodium citrate solution to dissolve the gel and recover a concentrated and active enzyme.
[0088] 200 mg of [alpha] -amylase were weighed before being transferred to a 20 ml graduated flask. About 10 ml of 0.1 M phosphate buffer pH 7.0 containing 0.5 mM CaCl 2 was transferred to the gauge to dissolve the enzyme. After dissolution of the enzyme, 5.732 g of guanidinium chloride (corresponding to 3.0 M when dissolved in 20 ml) was added to the enzyme solution and the volume was supplemented to a total of about 19.5 ml. The mixture was then left at room temperature for 16 hours in order to denature the enzyme as completely as possible.
At the end of the denaturation step, the enzyme solution was transferred to a 50 ml beaker and 0.8 g of alginate was added in order to obtain a 4% solution of the latter. It was stirred gently with a spatula to dissolve the alginate without generating too much air bubbles. If necessary, these can be effectively removed by centrifugation or by placing the solution under vacuum.
The alginate once dissolved was filled with a 10 ml syringe with the mixture, which was dropped into 490 ml of a 5% CaCl 2 solution. The beads thus formed were left for 1 h with gentle stirring. This time is long enough to allow the complete elimination of the denaturing agent and allow the renaturation of the enzyme, while being short enough to ensure good retention of the latter.
The 10 ml of beads were then recovered using a strainer and transferred into 90 ml of 500 mM sodium citrate at pH 5.0 in order to dissolve the alginate and recover the soluble and renatured enzyme.
The activity of the enzyme thus renatured was finally measured and compared with the activity recovered after dialysis at the same concentration of 10 mg / ml. The results are shown in Table 2.
Table 2: Renaturation of the enzyme by encapsulation in an alginate matrix
<Tb> Step <September> Camylase
[Mg / ml] <September> Avol
[U / ml] <September> Aspec
[U / mg] <September> Arel
[%]
<tb> Native Enzyme <September> 10.0 <September> 4820 <September> 482 <September> 100
<tb> Denaturation 16h <September> 10.0 <September> 329 <September> 32.9 <September> 7
<Tb> Ex-capsules <September> 1.0 <September> 314 <September> 314 <September> 65
This test shows a renaturation yield of 65%. Under identical experimental conditions, this value is very similar to the yields usually obtained by diluting 50 times a solution containing 1 mg / ml of enzyme and 3.0 M of guanidinium chloride. This result, on the other hand, has been achieved at a concentration of enzyme 50 times higher, thus representing substantial savings for the subsequent purification steps where the enzyme will have to be concentrated again.
REFERENCES
Brekke O.H. and Loset G.Â. (2003): New technologies in therapeutic antibody development. Current opinion in Pharmacology 3 (5), 544-550
From Bernardez Clark E. (1998): Refolding of recombinant proteins. Current Opinion in Biotechnology 9, 157-163
From Bernardez Clark E. (2001): Protein refolding for industrial processes. Current Opinion in Biotechnology, 12, 202-207
Schlegl R., Tscheliessnig A., Necina R., Wandl R., Jungbauer A. (2005): Refolding of proteins in a CSTR.Chemical Engineering Science 60, 5770-5780
Ferré H., Ruffet E., Nielsen L.-L. B., Nissen M.H., HobleyT.J., Thomas O.R.T., Buus S. (2005): A novel system for continuous protein refolding and on-line capture by expanded adsorption. Protein Science 14, 2141-2153.
Middelberg A.P.J. (2002): Preparative protein refolding. Trends in Biotechnology 20 (10), 437-443
Lanckriet H. & Middelberg A.P.J. (2004): Continuous chromatographic protein refolding. Journal of Chromatography A 1022, 103-113
Hutchinson M.W. & Chase H.A. (2006): Adsorptive refolding of histidine-tagged glutathione S-transferase using metal affinity chromatography. Journal of Chromatography A 1128 (1-2), 125-132
Randolph T.W. et al. (1999): High pressure fosters protein refolding at high concentrations, PNAS 96 (23), 13029-13033
Randolph T.W. et al. (2002): High hydrostatic pressure as a tool to study protein aggregation and amyloidosis. Biochimica and Biophysica Acta 1595, 224-234
Mondai K., Bohidar H.B., Roy R.P., Gupta M.N. (2006): Alginate-chaperoned easy refolding of Chromobacterium viscosum lipase. Biochimica and Biophysica Acta 1764, 877-886
Mondai K., Raghava S., Barua B., Varadarajan R., Gupta MN (2007): Role of Stimuli-Sensitive Polymers in Protein Refolding: r-Amylase and CcdB (Controller of Cell Division or Death B) as Model Proteins. Langmuir 23, 70-75.
[0107] AU 2007202306: Improved protein disaggregation and refolding using high-pressure. Barofold, Inc., 22.05.2007.
[0009] WO 2007062174: Devices and methods for high-pressure refolding of proteins. Barofold, Inc., 21.11.2005
[0109] WO9202540: Process for purifying a protein present in inclusion bodies. BioEurope, 01.08.1990
[0110] WO9402625: Process for isolating recombinant polypeptides. Immunex Corp., 21.07.1992