[0001] Die Erfindung betrifft ein System zur Durchführung von Kristallisationsexperimenten nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.
[0002] Die morphologische Form von chemischen Substanzen, insbesondere pharmazeutischen Wirksubstanzen, hat einen grossen Einfluss auf deren biologische Aktivität. Demzufolge ist die Charakterisierung des festen Zustandes neuer Wirkstoffe eine wichtige Tätigkeit innerhalb der pharmazeutischen Entwicklung.
Da zudem unterschiedliche morphologische Formen einer Substanz eigenständige Produkte sind, ist es auch aus wirtschaftlicher Sicht wichtig, möglichst in einer frühen Phase der pharmazeutischen Entwicklung einen Überblick darüber zu erhalten, ob allenfalls verschiedene morphologische Formen existieren.
[0003] Verschiedene morphologische Formen einer Substanz unterscheiden sich in ihren physikalischen Eigenschaften wie zum Beispiel Schmelzpunkt oder Löslichkeit. Ebenso unterscheiden sie sich in ihren Vibrationsspektren (IR, MIR, Raman) und Röngtendiffraktionsspektren.
Sofern nur geringe Substanzmengen zur Verfügung stehen, sind die Röntgendiffraktions- und Ramanspektroskopie die experimentell am besten geeigneten Techniken zur Untersuchung, ob verschiedene morphologische Formen vorliegen.
[0004] Eine ebenso wichtige Bedeutung wie die Morphologie auf die physiologische Wirksamkeit einer Substanz hat die Wahl der Gegenionen bei Aktivsubstanzen mit mindestens einer basischen oder sauren funktionellen Gruppe. Oft kann mit einer geeigneten Salzbildung die Löslichkeit der Wirksubstanz stark gesteigert und damit deren physiologische Verfügbarkeit verbessert werden.
Dementsprechend werden grosse Anstrengungen unternommen, um innerhalb der Forschungs- und Entwicklungsaktivitäten möglichst frühzeitig physikalisch-chemische Kenntnisse über die Polymorphie, die Löslichkeit und die chemische Stabilität verschiedener Salze der Wirksubstanz zu erlangen. Auch auf diesem Gebiet sind die Röntgendiffraktions- und Raman-spektroskopischen Methoden gut zur Charakterisierung des festen Zustandes der Salze geeignet.
[0005] Analog zur Salzbildung werden neuerdings auch Anstrengungen unternommen, das Verhalten von Wirksubstanzen durch die Bildung von Co-Kristallen mit geeigneten Kristallisationspartnern zu verbessern.
[0006] Die genannten Untersuchungen werden mittels Kristallisationsexperimenten mit minimalen Substanzmengen durchgeführt. Bekannt sind dafür zum Beispiel Systeme, die Mikrotiterplatten ähnlich sind.
Die Kristalle werden entweder durch Abdampfen des Lösungsmittels auf einer Mikrotiterplatte oder durch Filtration der auskristallisierten Lösung auf einer Filterplatte gesammelt und für weitere Analysen zugänglich gemacht.
[0007] Weiter ist eine Vorrichtung mit einer Mikrotiterplatte bekannt, die einen variablen Boden aufweist.
Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels kann der Boden mit einem geeigneten Werkzeug hochgeschoben werden, so dass die Kristalle auf dem Boden bzw. dessen Rand gesammelt werden, um für weitere Analysen zur Verfügung zu stehen.
[0008] Bekannt ist auch ein Kristallisationssystem mit individuellen Kristallisationszellen, welche aus Glasröhrchen bestehen, die auf einer Mikrotiterplatte angeordnet sind.
[0009] Der Nachteil dieser Systeme ist, dass die Kristalle nach der Auskristallisation aus der Lösung oder dem Abdampfen des Lösungsmittels durch mechanisch aufwändige Vorgänge wie zum Beispiel durch Filtration oder Abkratzen isoliert werden müssen, bevor die Kristalle mit spektroskopischen Methoden analysiert werden können.
In der Praxis werden deshalb Kristallisationsexperimente oft direkt in flachen 96er-Mikrotiterplatten durchgeführt, damit die Kristalle anschliessend direkt analysiert werden können. Die Mikrotiterplatten wiederum haben den Nachteil, dass der Verdampfungsprozess des Lösungsmittels nur schlecht kontrolliert werden kann, wodurch die Substanzen meist in amorpher Form anfallen. Aus diesem Grund wurden Verschlusssysteme mit Überströmkanälen für Mikrotiterplatten entwickelt, welche eine bessere Kontrolle des Verdampfungsvorgangs erlauben.
[0010] Eine weitere Möglichkeit, den Kristallisationsprozess besser kontrollieren zu können, besteht in der Verwendung von zylinderförmigen Gefässen mit einer im Vergleich zum Volumen kleinen Öffnung. Verwendet man dabei nicht transparente Materialien wie z.B.
Metallhülsen oder Metallblöcke mit Bohrungen, so kann der eigentliche Kristallisationsvorgang optisch bzw. spektroskopisch nicht verfolgt werden. Bei transparenten Materialien wie Glaszylinder kann der Kristallisationsvorgang zwar verfolgt werden. Aufgrund der Materialeigenschaften von Glas verdampft das Lösungsmittel jedoch meist vom oberen Rand der Zylinderöffnung, da die Lösung die überstehende Glaswand benetzt.
Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels sind die Kristalle deshalb nicht wie gewünscht gut geschützt im Innern des Glaszylinders, sondern am oberen Gefässrand, wo sie oft schon durch geringe Erschütterungen abbrechen und in oder gar neben den Glaszylinder fallen.
[0011] Der vorliegenden Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein System zur Durchführung von Mikrokristallisationsexperimenten bereitzustellen, das die obengenannten Nachteile bekannter Systeme zur Durchführung von Mikrokristallisationsexperimenten überwindet.
[0012] Diese Aufgabe wird durch ein System mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst.
[0013] Weitere Vorteile der Erfindung folgen aus den abhängigen Patentansprüchen und aus der nachfolgenden Beschreibung,
in welcher die Erfindung anhand eines in einer schematischen Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispieles näher erläutert wird.
[0014] Die Figur zeigt den schematischen Aufbau eines Mikrogefässes zur Durchführung von Kristallisationsexperimenten.
[0015] Das Prinzip des erfindungsgemässen Systems zur Durchführung von Kristallisationsexperimenten mit minimalen Substanzmengen basiert auf modifizierten Mikrotiterplatten und besteht im Wesentlichen aus einer Grundplatte, die mit Mikrogefässen 1 bestückt ist, welche mit einem Verschluss 4 verschliessbar sind. Diese Mikrogefässe 1 sind zur Aufnahme der Testsubstanzen bestimmt und sind aus transparentem Material gefertigt.
Die Innenwände der Mikrogefässe 1 weisen eine transparente, hydrophobe Auskleidung 3 auf.
[0016] Die Figur zeigt schematisch eine beispielsweise Ausführung eines erfindungsgemässen Mikrogefässes 1, dessen Gefässwände aus einem Glasröhrchen 2 bzw. einem unten geschlossenen Glaszylinder, ähnlich einem Reagenzglas, bestehen. Die Mikrogefässe 1 sind mit einem Verschluss 4 wiederverschliessbar. Das Glasröhrchen 2 ist innen mit einer Auskleidung 3 versehen. Die Auskleidung bildet dabei den eigentlichen Behälter 5 zur Aufnahme der Testsubstanz, in dem die Kristallisation durchgeführt wird. Die Auskleidung 3 besteht aus einem nicht benetzbaren, transparenten Material, d.h. durch den Glaszylinder 2 und die Auskleidung 3 kann der Kristallisationsvorgang von aussen optisch beobachtet werden.
In einer möglichen Ausführung besteht die Auskleidung 3 aus einem herausnehmbaren Einsatz, der aus einem sehr dünnen transparenten, an seinem unteren Ende geschlossenen Teflonzylinder gebildet ist. Der die Auskleidung 3 bzw. den Einsatz umhüllende Glaszylinder 2 gibt der dünnen Hülle der Auskleidung 3 die nötige mechanische Festigkeit. Bei der Verwendung einer genügend stabilen Auskleidung 3 kann der Glaszylinder 2 auch aus einem unten offenen Glasrohr bestehen. Es muss nur sichergestellt sein, dass der Einsatz nicht aus dem Mikrogefäss 1 gleiten kann. Der wiederverschliessbare Verschluss erlaubt die Kontrolle der Verdampfung des Lösungsmittels. Das Mikrogefäss 1 kann auch aus einem anderen Material als Glas sein. Es muss jedoch über einen grossen Wellenlängenbereich - ähnlich wie Glas - transparent sein. Im beschriebenen Beispiel besteht die Auskleidung 3 aus Teflon.
Als Auskleidung eignen sich aber auch andere fluorierte Kunststoffe, oder Polyethylen oder Polypropylen.
[0017] In einer anderen Ausführung wird auf eine in das Mikrogefäss 1 einsetzbare Auskleidung 3 verzichtet. Die Auskleidung 3 der Innenwand des Glasröhrchens 2 wird durch eine geeignete chemische oder physikalische Modifizierung der Innenseite der Glaswand erreicht. Das kann zum Beispiel durch eine Beschichtung oder durch Bedampfen der Glasinnenfläche des Behälters "Liners" erfolgen oder durch eine chemische Behandlung der Glasoberfläche mit bestimmten Silanen (Organohalogensilane).
Bei der dabei ablaufenden Reaktion werden die Si-OH-Gruppen an der Glasoberfläche durch das Silan alkyliert, wodurch die ursprünglich polare Oberfläche in hydrophobe, eine wenig benetzbare hydrophile Oberfläche, umwandelt.
[0018] Zur Durchführung eines Mikrokristallisationsexperimentes mit dem erfindungsgemässen System wird folgendermassen vorgegangen:
Zuerst wird die Testsubstanz, beispielsweise etwa 1 mg, in das Mikrogefäss 1 mit der Auskleidung 3 eingewogen und das Lösungsmittel eingefüllt. Anschliessend wird das Gefäss 1 mit dem Deckel 4 verschlossen. Die Testsubstanz wird durch Erwärmen der Probe gelöst. Die Vollständigkeit der Auflösung der Testsubstanz wird mittels Ramanspektroskopie und Videoaufnahme überprüft und dokumentiert. Durch Abkühlen und Abdampfen des Lösungsmittels wird die Testsubstanz auskristallisiert.
Zum Abdampfen des Lösungsmittels wird der Deckel 4 des Behälters entfernt. Am Ende dieses Vorgangs liegt die Substanz in fester Form im Behälter 5, also innerhalb der Auskleidung 3 des Gefässes 1 vor. Die Polymorphie der Testsubstanz wird mittels Ramanspektroskopie und Videoaufnahme überprüft, ausgewertet und dokumentiert. Anschliessend kann die Testsubstanz aus dem Gefäss 1 bzw. der Auskleidung 3 mechanisch entfernt werden, um für weitergehende Analysen wie z.B. X-Ray, Löslichkeitsuntersuchungen, zur Verfügung zustehen.
[0019] Salzbildungs- und Co-Kristallisationsexperimente laufen analog zum beschriebenen Kristallisationsexperimenten ab. Nach der Kontrolle der vollständigen Auflösung der Testsubstanz wird jedoch in einem zusätzlichen Schritt die zur Salzbildung notwendige Säure bzw.
Base oder das für die Co-Kristallisation gewählte Substrat in reiner oder gelöster Form zugegeben. Unter Umständen wird nach dem Auflösen der Säure bzw. der Base oder der zur Co-Kristallisation beabsichtigten Substanz nochmals eine Kontrolle der vollständigen Auflösung der Substanzen durchgeführt.
The invention relates to a system for carrying out crystallization experiments according to the preamble of patent claim 1.
The morphological form of chemical substances, in particular pharmaceutical active substances, has a great influence on their biological activity. As a result, the characterization of the solid state of new drugs is an important activity within pharmaceutical development.
In addition, since different morphological forms of a substance are independent products, it is also important from an economic point of view, if possible at an early stage of the pharmaceutical development to get an overview of whether possibly different morphological forms exist.
Various morphological forms of a substance differ in their physical properties such as melting point or solubility. They also differ in their vibration spectra (IR, MIR, Raman) and X-ray diffraction spectra.
If only small amounts of substance are available, X-ray diffraction and Raman spectroscopy are the best experimental techniques available to study whether different morphological forms exist.
Just as important as the morphology on the physiological activity of a substance has the choice of counterions in active substances having at least one basic or acidic functional group. Often, with a suitable salt formation, the solubility of the active substance can be greatly increased and thus their physiological availability can be improved.
Accordingly, great efforts are being made in order to obtain physicochemical knowledge of the polymorphism, the solubility and the chemical stability of various salts of the active substance as early as possible within the research and development activities. Also in this field the X-ray diffraction and Raman spectroscopic methods are well suited to characterize the solid state of the salts.
Similar to the salt formation efforts are also recently made to improve the behavior of active substances by the formation of co-crystals with suitable crystallization partners.
The studies mentioned are carried out by means of crystallization experiments with minimal amounts of substance. For example, systems that are similar to microtiter plates are known.
The crystals are collected either by evaporating the solvent on a microtiter plate or by filtration of the crystallized solution on a filter plate and made available for further analysis.
Further, a device with a microtiter plate is known which has a variable bottom.
After evaporation of the solvent, the soil can be pushed up with a suitable tool so that the crystals are collected on the bottom or its edge to be available for further analysis.
Also known is a crystallization system with individual crystallization cells, which consist of glass tubes, which are arranged on a microtiter plate.
The disadvantage of these systems is that the crystals after crystallization from the solution or evaporation of the solvent by mechanically complex processes such as filtration or scraping must be isolated before the crystals can be analyzed by spectroscopic methods.
In practice, therefore, crystallization experiments are often carried out directly in flat 96-well microtiter plates, so that the crystals can then be analyzed directly. The microtiter plates in turn have the disadvantage that the evaporation process of the solvent can only be controlled poorly, whereby the substances usually accumulate in amorphous form. For this reason, closure systems have been developed with overflow channels for microtiter plates, which allow better control of the evaporation process.
Another way to control the crystallization process better, is the use of cylindrical vessels with a small opening compared to the volume. In doing so, non-transparent materials such as e.g.
Metal sleeves or metal blocks with holes, so the actual crystallization process can not be followed optically or spectroscopically. For transparent materials such as glass cylinders, the crystallization process can be tracked. However, due to the material properties of glass, the solvent usually evaporates from the upper edge of the cylinder opening, since the solution wets the projecting glass wall.
After evaporation of the solvent, the crystals are therefore not well protected as desired inside the glass cylinder, but at the upper edge of the vessel, where they often break off even by slight shocks and fall into or even next to the glass cylinder.
The present invention is now based on the object to provide a system for carrying out microcrystallization experiments, which overcomes the above-mentioned disadvantages of known systems for carrying out microcrystallization experiments.
This object is achieved by a system having the features of patent claim 1.
Further advantages of the invention follow from the dependent claims and from the following description,
in which the invention is explained in more detail with reference to an embodiment shown in a schematic drawing.
The figure shows the schematic structure of a microvessel for carrying out crystallization experiments.
The principle of the inventive system for carrying out crystallization experiments with minimal amounts of substances based on modified microtiter plates and consists essentially of a base plate, which is equipped with micro-vessels 1, which are closable with a closure 4. These microvessels 1 are intended for holding the test substances and are made of transparent material.
The inner walls of the microvessels 1 have a transparent, hydrophobic lining 3.
The figure shows schematically an example embodiment of an inventive microvessel 1, the vessel walls of a glass tube 2 and a closed bottom glass cylinder, similar to a test tube exist. The microvessels 1 can be reclosed with a closure 4. The glass tube 2 is internally provided with a lining 3. The lining forms the actual container 5 for receiving the test substance, in which the crystallization is carried out. The liner 3 is made of a non-wettable, transparent material, i. through the glass cylinder 2 and the lining 3, the crystallization process can be visually observed from the outside.
In one possible embodiment, the lining 3 consists of a removable insert which is formed from a very thin transparent Teflon cylinder closed at its lower end. The lining 3 and the use enveloping glass cylinder 2 are the thin shell of the lining 3, the necessary mechanical strength. When using a sufficiently stable lining 3, the glass cylinder 2 can also consist of a glass tube open at the bottom. It only has to be ensured that the insert can not slide out of the microvessel 1. The resealable closure allows control of the evaporation of the solvent. The microvessel 1 can also be made of a material other than glass. However, it has to be transparent over a large wavelength range, much like glass. In the example described, the lining 3 is made of Teflon.
However, other fluorinated plastics or polyethylene or polypropylene are also suitable as lining.
In another embodiment, an insertable into the microvessel 1 liner 3 is omitted. The lining 3 of the inner wall of the glass tube 2 is achieved by a suitable chemical or physical modification of the inside of the glass wall. This can be done, for example, by coating or by steaming the glass inner surface of the container "liner" or by a chemical treatment of the glass surface with certain silanes (organohalosilanes).
In the course of this reaction, the Si-OH groups on the glass surface are alkylated by the silane, which converts the originally polar surface into a hydrophobic, slightly wettable, hydrophilic surface.
To carry out a microcrystallization experiment with the system according to the invention, the procedure is as follows:
First, the test substance, for example about 1 mg, is weighed into the microvessel 1 with the lining 3 and the solvent is introduced. Subsequently, the vessel 1 is closed with the lid 4. The test substance is dissolved by heating the sample. The completeness of the dissolution of the test substance is checked and documented by means of Raman spectroscopy and video recording. By cooling and evaporation of the solvent, the test substance is crystallized out.
To evaporate the solvent, the lid 4 of the container is removed. At the end of this process, the substance is present in solid form in the container 5, ie within the lining 3 of the vessel 1. The polymorphism of the test substance is checked, evaluated and documented by means of Raman spectroscopy and video recording. Subsequently, the test substance can be mechanically removed from the vessel 1 or the lining 3, respectively, in order to be used for further analyzes such as e.g. X-Ray, solubility studies, are available.
Salt formation and co-crystallization experiments proceed analogously to the described crystallization experiments. After checking the complete dissolution of the test substance, however, in an additional step, the acid required for salt formation or
Base or the chosen substrate for the co-crystallization in pure or dissolved form. Under certain circumstances, once the acid or the base or the substance intended for co-crystallization has been dissolved, another check of the complete dissolution of the substances is carried out again.