CH697183A5

CH697183A5 - Use of the content of platelets or platelet rich plasma (obtained by disruption of their membranes) for the preparation of an agent, which is useful for the treatment of bone, cartilage or skin diseases or defects

Info

Publication number: CH697183A5
Application number: CH01752/06A
Authority: CH
Inventors: Thomas Meury; Thierry Stoll; Mauro Alini
Original assignee: Synthes Gmbh
Priority date: 2004-05-05
Filing date: 2004-05-05
Publication date: 2008-06-25

Abstract

Use of the content of platelets or platelet rich plasma (I) (obtained by disruption of their membranes) for the preparation of an agent (A) for the treatment of bone, cartilage or skin. An independent claim is also included for a method for preparing (A) comprising subjecting (I) to sonification at 0-37 [deg]C leading to a disruption of the platelet membranes and a release of their content. ACTIVITY : Osteopathic; Dermatological. MECHANISM OF ACTION : None given.

Description

       

  [0001] Die Erfindung betriff ein Verfahren für die Herstellung eines Mittels aus Blutplättchen oder blutplättchenreichem Plasma (PRP) für die Knochen oder Knorpel und die Verwendung von diesem Mittel zur Herstellung eines weiteren Mittels.

[0002] Die Freisetzung mehrerer Vermittler und Zytozine durch aktivierte Blutplättchen ist zwar bekannt, nicht aber für eine Knochen-, Knorpel- oder Hautbehandlung.

[0003] Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Verwendungsmöglichkeiten und ein viel leichteres und schnelleres Verfahren für die Aktivierung von PRP mit den von früheren Verfahren der Technik gegebenen vergleichbaren Ergebnissen zu schaffen.

[0004] Die Erfindung löst das gestellte Problem durch die kennzeichnenden Merkmale der unabhängigen Ansprüche 1 und 7.

   Die durch dieses Verfahren erreichten Vorteile nach der Erfindung sind grundsätzlich darin zu finden, dass es bedeutend weniger Zeit beansprucht, indem es gegenüber den ungefähr 15-30 Minuten nach den Verfahren früherer Technik nur etwa eine Minute benötigt. Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass keine nicht-autologen Elemente im Verfahren vorkommen.

[0005] Die Behandlung kann auf die Therapie von Knochen-, Knorpel- oder Hautkrankheiten und -fehlern oder auch auf die Behebung von Schäden in bzw. bei einer Knochen-, Knorpel- oder Hautersetzung gezielt sein.

   Die Behandlung kann auch ein Knochen-, Knorpeln oder Hautwachstum aktivieren, beschleunigen oder fördern.

[0006] In einer Sonderausführung umfasst das genannte Mittel einen oder mehrere der folgenden Stoffe: der von Blutplättchen abgeleitete AB-Wachstumsfaktor (PDGF-BB), der endotheliale Gefässbildungsfaktor (VEGF), der Wachstumswandlungsfaktor beta  (TGF-beta ), der epidermische Wachstumsfaktor (EGF), der Insulin-artige Wachstumsfaktor (IGF), der Epithelialzellen-Wachstumsfaktor (ECGF) und der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF).

   Diese Stoffe verbessern die Genesung von Wunden.

[0007] Das genannte Mittel umfasst vorzugsweise keine zusätzlichen organischen Verbindungen und insbesonders keine lonophoren, um die Toxizität auf einem niedrigen Niveau zu halten.

[0008] Das genannte Mittel sollte weder Verbindungen anderer Spezies noch anderer Individuen als der erwähnten Blutplättchen bzw. dem blutplättchenreichen Plasma (PRP) enthalten. Die Aufnahme seitens des Patienten ist durch diese Massnahme begünstigt.

[0009] In einer Sonderausführung des Verfahrens für die Herstellung eines Mittels für die Behandlung von Knochen-, Knorpel- oder Hautkrankheiten oder -fehlern wird eine Ultrabeschallung bei einer Temperatur zwischen 0 deg. C und +10 deg. C, vorzugsweise zwischen 0 deg. C und +2 deg. C vorgenommen.

   Die Ultrabeschallung geschieht am besten auf Eis.

[0010] Die Ultrabeschallung kann bei einer Frequenz zwischen 10 und 30 KHz, vorzugsweise zwischen 15 und 25 KHz vorgenommen werden.

[0011] Die Dauer der Ultrabeschallung kann 1-50 Sekunden, vorzugsweise 5-20 Sekunden betragen. Vorzugsweise wird vor und nach der Ultrabeschallung keine andere blutplättchenstörende Behandlung unternommen.

[0012] Die Ex-vivo-Aktivierung von Blutplättchen bzw. blutplättchenreichem Plasma (PRP) kann auf chemischem oder physischem Wege durch den Zusatz von Rinderthrombin, wiederholten Einfrier- und Auftauzyklen oder den Zusatz eines lonophors geschehen. Der Verwendung von Chemikalien wie Rinderthrombin oder lonophoren ist bedenklich und die wiederholten Einfrier- und Auftauzyklen sind zeitraubend.

   Das für die Erzeugung eines Mittels für die Behandlung von Knochen-, Knorpel- und Hautkrankheiten nach der Erfindung bevorzugte Verfahren ist Ultrabeschallung. Ultrabeschallung hat sich als ein einfaches, aber schnelles und wirkkräftiges Verfahren für die PRP-Aktivierung erwiesen. Die Aktivierungsleistung ist mit den schon bekannten Verfahren vergleichbar, die Ultrabeschallung ist aber weniger zeitraubend als Einfrier- und Auftauzyklen und erübrigt den Gebrauch potentiell gefährlicher chemischer Mittel wie Rinderthrombin.

[0013] Die Erfindung und zusätzliche Änderungen der Erfindung werden nun in eingehendem Detail unter Bezugnahme auf eine Anzahl spezifischer Beispiele erörtert.

Beispiel 1 (Herstellung)

[0014] Ein Zitrat-Antikoagulans wurde bei 200 g zehn Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert.

   Die oberste Schicht wurde in ein neues Glas übertragen und bei 200 g nochmals 20 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die obersten auf der Oberfläche schwimmenden 30-50% blutplättchenarmes Plasma, (PP) wurden abgeschieden und das Bällchen wurde in der restlichen Schwimmflüssigkeit wieder suspendiert, um ein plättchenreiches Plasma (PRP) zu gewinnen. Das PRP wurde mit einem gleichen Volumen CaCl2 (eine 10%ige Endkonzentration) versetzt. Die PRP-Ultrabeschallung wurde bei Verwendung einer Frequenz von 25 KHz 15 Sekunden lang auf Eis ausgeführt. Dies veranlasste die Blutplättchen, die Vermittler und Zytozine freizugeben. Das Gel brauchte zur Verfestigung eine Stunde.

   Sämtliche Schritte wurden unter sterilen Bedingungen vorgenommen.

Beispiel 2 (Herstellung)

[0015] Ein mit einem Antikoagulans behandeltes Blut wurde bei 150-400 g, vorzugsweise 200 g, 10-60 Minuten lang bei Raumtemperatur (langsame Bremseinstellung) zentrifugiert. Die Oberschicht (das Plasma) wurde in ein neues Glas übertragen und nochmals bei 500-2000 g 7-10 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die obersten 50-70% Volumenprozent der PRP-, plättchenarmes Plasma enthaltenden Schwimmschicht wurden abgeschieden und das plättchenreiche Plasma (PRP) wurde durch nochmaliges Suspendieren des Bällchens in der restlichen Schwimmflüssigkeit durch Verwirbelung hergestellt. Dieses Verfahren erzeugte aus 80-130 ml unbehandeltem Blut 7-15 ml nichtaktiviertes PRP. Dieses PRP wurde bei 2 deg. C-8 deg. C bis zu 24 Stunden lang, vorzugsweise weniger als 8 Stunden lang gelagert.

   Dem PRP wurden 10% (Endvolumen) CaCI2 zugesetzt, um die antikoagulierende Wirkung des Zitrats zu hemmen und die Polymerisierung des Fibrinogen zu Fibrin zu erlauben. Die PRP-Ultrabeschallung wurde bei Verwendung einer Frequenz von 20 KHz und 2X5 Sekunden lang auf Eis ausgeführt. Dies veranlasste die Plättchen dazu, sich zu entkörnen und die Vermittler und Zytozine freizusetzen. Die Verfestigung des Gels benötigte 1-2 Stunden. Alle diese Schritte wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.

Beispiel 3

[0016] Das PRP wurde in der in den Beispielen 1 und 2 obenerwähnten Weise aus im unmittelbar voroperativen Zeitraum gesammeltem Blut hergestellt. Ein Zitrat-Antikoagulans wurde bei 200 g zehn Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Es wurde bei 2 deg. C-8 deg. C gelagert und aus technischen Gründen (vor der PRP-Gelierung) binnen einer Stunde ab Herstellung verwendet.

   Das in den obigen Beispielen 1 bzw. 2 hergestellte RP wurde mit einer Injektionsspritze direkt auf einen Knochen- bzw. Knorpelfehler aufgetragen. Die aufgetragene PRP-Menge war von der Grösse des Knochens bzw. Knorpelfehlers abhängig, grundsätzlich wurde aber so viel PRP als möglich eingesetzt (100 ml Blut ergaben etwa 10 ml PRP).

   Um die Ergebnisse zu verbessern, wurde das PRP vor der Ultraschall-Aktivierung durch Entfernung einer weiteren Menge Schwimmschicht nach der zweiten Zentrifugierungsphase (bei 200-2000 g, wie im Beispiel 2 beschrieben) noch weiter konzentriert und das Plättchenbällchen wurde in einem geringeren Volumen suspendiert.

Beispiel 4

[0017] Das alleinstehende, nach Beispiel 2 hergestellte PRP oder eine Kombination desselben mit abgesaugtem Knochenmark wurde dem Knochenimplantat als anfänglicher Wachstumsfaktor-Vorrat zugesetzt, um die rasche Vermehrung, Differenzierung, Chemotaxis und Morphogenese der Zellen und Gewebe zu regulieren. Dies ergab eine geringere Blutung und eine wesentlich erhöhte Knochenzellenzufuhr und deshalb eine raschere und bessere Heilung des derart behandelten Knochenfehlers.

   In den PRP-behandelten Implantaten konnte, im Vergleich zu unbehandelten Implantaten, 6 Monate nach der Implantierung bis zu 100% mehr Knochengewebe erzielt werden.

Beispiel 5 (Proteinwerte)

[0018] Die PRP-Herstellung durch Ultrabeschallung hat VEGF, PDGF-AB, PDGF-BB und TGF-beta  Werte ergeben, die (+- 30%) mit den entsprechenden, durch die anderen Verfahren (Thrombin, Einfrieren/Auftauen) erzeugten Werten vergleichbar sind.

Beispiel 6 (in vitro)

[0019] In vitro unter Verwendung von in IMDM, 10% FBS, 10 mM beta -Glyzerophosphat, 0,1 mM Askorbinsäure-2-Phosphat und 10% PRP gezüchteten Knochenmark-Grundgewebezellen (hBMSC) getätigte Experimente erwiesen nach 10 Tagen Kultur eine entschieden höhere (durch Einverleibung von <45>Ca<2+> gemessene) Matrixmineralisierung als das ohne PRP gewachsene hBMSC.

   Der Zusatz von durch Ultrabeschallung erzeugtem PRP ergab eine bis zu 20X höhere Einverleibung von Ca, das Einfrier/Auftauverfahren erwies ähnliche Ergebnisse, während ein Thrombin-aktiviertes PRP im Vergleich zu dem ohne PRP gewachsenen hBMSC eine nur 10-fache Erhöhung ergab.

[0020] In-vitro-Versuche erwiesen (bei denselben obenwähnten Einrichtungen) gleichfalls, dass der Zusatz von PRP zu hBMSC, unabhängig vom angewendeten PRP-Verfahren, eine 75-100%ige Erhöhung der (durch DNA-Gehaltsmessung geschätzte) hBMSC-Vermehrung herbeiführt.



  The invention relates to a method for the preparation of an agent from platelets or platelet-rich plasma (PRP) for the bones or cartilage and the use of this agent for the preparation of another agent.

Although the release of several mediators and cytocins by activated platelets is known, but not for a bone, cartilage or skin treatment.

The invention has for its object to provide new uses and a much easier and faster method for the activation of PRP with the comparable results given by previous methods of technology.

The invention solves the problem posed by the characterizing features of independent claims 1 and 7.

   The advantages achieved by this method according to the invention are, in principle, to be found in that it takes considerably less time, requiring only about one minute compared to about 15-30 minutes according to the prior art methods. Another advantage is that there are no non-autologous elements in the process.

The treatment may be targeted to the therapy of bone, cartilage or skin diseases and disorders or also to the repair of damage in or in a bone, cartilage or skin replacement.

   The treatment may also activate, accelerate or promote bone, cartilage or skin growth.

In a special embodiment, said agent comprises one or more of the following: platelet-derived AB growth factor (PDGF-BB), endothelial vascularization factor (VEGF), growth factor beta (TGF-beta), epidermal growth factor ( EGF), insulin-like growth factor (IGF), epithelial cell growth factor (ECGF) and fibroblast growth factor (FGF).

   These substances improve the recovery of wounds.

The said agent preferably comprises no additional organic compounds, and in particular no ionophores, in order to keep the toxicity at a low level.

The said agent should contain no compounds of other species or other individuals than the mentioned platelets or the platelet-rich plasma (PRP). Admission on the part of the patient is favored by this measure.

In a special embodiment of the process for the preparation of an agent for the treatment of bone, cartilage or skin diseases or defects is an ultrasonication at a temperature between 0 deg. C and +10 deg. C, preferably between 0 deg. C and + 2 deg. C made.

   The ultrasound is best done on ice.

The ultrasound can be made at a frequency between 10 and 30 KHz, preferably between 15 and 25 KHz.

The duration of the ultrasonication can be 1-50 seconds, preferably 5-20 seconds. Preferably, no other antiplatelet treatment is undertaken before and after the sonication.

The ex-vivo activation of platelets or platelet-rich plasma (PRP) can be done chemically or physically by the addition of bovine thrombin, repeated freezing and thawing cycles or the addition of an ionophore. The use of chemicals such as bovine thrombin or ionophore is questionable and the repeated freezing and thawing cycles are time consuming.

   The method preferred for the production of an agent for the treatment of bone, cartilage and skin diseases according to the invention is ultrasonication. Ultrasonic sonication has proven to be a simple but fast and effective method for PRP activation. Activation performance is comparable to previously known methods, but ultrasonication is less time consuming than freeze-thaw cycles and eliminates the need for potentially hazardous chemical agents such as bovine thrombin.

The invention and additional modifications of the invention will now be discussed in detail with reference to a number of specific examples.

Example 1 (preparation)

A citrate anticoagulant was centrifuged at 200 g for ten minutes at room temperature.

   The uppermost layer was transferred to a new glass and centrifuged again at 200 g for 20 minutes at room temperature. The topmost 30-50% platelet poor plasma (PP) floating on the surface was precipitated and the ball resuspended in the remaining buoyant fluid to recover platelet-rich plasma (PRP). The PRP was spiked with an equal volume of CaCl2 (a 10% final concentration). The PRP ultrasonication was performed on ice for 15 seconds using a frequency of 25 KHz. This caused the platelets to release the mediators and cytosines. The gel took an hour to solidify.

   All steps were performed under sterile conditions.

Example 2 (Production)

A blood treated with an anticoagulant was centrifuged at 150-400 g, preferably 200 g, for 10-60 minutes at room temperature (slow brake adjustment). The top layer (the plasma) was transferred to a new glass and again centrifuged at 500-2000 g for 7-10 minutes at room temperature. The top 50-70% by volume of the PRP, platelet poor plasma-containing floating layer was deposited and the platelet-rich plasma (PRP) was prepared by re-suspending the ball in the remaining float fluid by vortexing. This procedure produced 7-15 ml of unactivated PRP from 80-130 ml untreated blood. This PRP was incubated at 2 deg. C-8 deg. C stored for up to 24 hours, preferably less than 8 hours.

   10% (final volume) of CaCl 2 was added to the PRP to inhibit the anticoagulant activity of the citrate and allow the polymerisation of the fibrinogen to fibrin. The PRP ultrasonication was performed using a frequency of 20 KHz and 2X5 seconds on ice. This caused the platelets to ungentrate and release the mediators and cytocins. Solidification of the gel took 1-2 hours. All of these steps were performed under sterile conditions.

Example 3

The PRP was prepared in the manner mentioned in Examples 1 and 2 above from blood collected in the immediately before-operative period. A citrate anticoagulant was centrifuged at 200 g for ten minutes at room temperature. It was at 2 deg. C-8 deg. C stored and used for technical reasons (before the PRP gelation) within one hour from production.

   The RP prepared in Examples 1 and 2 above was applied directly to a bone or cartilage defect using a hypodermic syringe. The amount of PRP applied was dependent on the size of the bone or cartilage defect, but in principle as much PRP as possible was used (100 ml of blood yielded about 10 ml of PRP).

   To improve the results, the PRP was further concentrated prior to sonication by removing an additional amount of floating layer after the second centrifugation phase (at 200-2000 g as described in Example 2) and the platelet ball was suspended in a smaller volume.

Example 4

The stand-alone PRP prepared according to Example 2 or a combination thereof with aspirated bone marrow was added to the bone graft as an initial growth factor reserve to regulate the rapid proliferation, differentiation, chemotaxis and morphogenesis of the cells and tissues. This resulted in less bleeding and a significantly increased supply of bone cells and therefore a faster and better healing of the thus treated bone defect.

   In the PRP-treated implants, up to 100% more bone tissue could be achieved 6 months after implantation compared to untreated implants.

Example 5 (protein values)

[0018] PRP production by sonication has given VEGF, PDGF-AB, PDGF-BB and TGF-beta values (+ - 30%) with the corresponding values generated by the other methods (thrombin, freeze / thaw) are comparable.

Example 6 (in vitro)

Experiments done in vitro using bone marrow basal tissue cells (hBMSC) grown in IMDM, 10% FBS, 10mM beta-glycerophosphate, 0.1mM ascorbic acid-2-phosphate and 10% PRP showed a decided after 10 days of culture higher (by incorporation of <45> Ca <2+> measured) matrix mineralization than the hPMSC grown without PRP.

   The addition of ultrasonically generated PRP resulted in up to 20X incorporation of Ca, the freeze / thaw method gave similar results, whereas a thrombin-activated PRP gave only a 10-fold increase compared to the hpMSC grown without PRP.

In vitro experiments also showed (with the same facilities mentioned above) that the addition of PRP to hBMSC, regardless of the PRP method used, resulted in a 75-100% increase in hBMSC proliferation (estimated by DNA content measurement) causes.

Claims

1. A process for the preparation of an agent for the treatment of bone or cartilage diseases or bone or cartilage defects, characterized in that platelets or platelet-rich plasma (PRP) at a temperature between 0 deg. C and +37 deg. C be subjected to an ultrasound, which has a dissolution of the platelet membranes and a release of their contents result.

2. The method according to claim 2, characterized in that the ultrasonication at a temperature between 0 deg. C and +10 deg. C, preferably between 0 deg. C and + 2 deg. C, is performed.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the ultrasound is performed on ice.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the ultrasound at a frequency between 10 and 30 KHz, preferably between 15 and 25 KHz, is made.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the ultrasonication for 1-50 seconds, preferably for 5-20 seconds long, made.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that both before and after the ultrasonication no other platelet dissolution treatment is performed.

7. Use of the obtained by membrane dissolution platelet or platelet rich plasma content for the preparation of an agent for bone or cartilage treatment obtained according to the method of any one of claims 1 to 6.

8. Use according to claim 7, characterized in that the treatment is aimed at curing cooking or cartilage diseases or defects.

9. Use according to claim 7, characterized in that the treatment is aimed at activation, acceleration or promotion of bone or cartilage growth.

10. Use according to claim 7, characterized in that the treatment is aimed at troubleshooting or replacement of bone or cartilage tissue.

Use according to any one of claims 7 to 10, characterized in that said agent comprises one or more of the following: platelet-derived AB growth factor (PDGF-AB), platelet-derived AA growth factor (PDGF-AA), platelet-derived BB growth factor (PDGF-BB), endothelial vascularization factor (VEGF), growth factor beta (TGF-beta), epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF), epithelial cell growth factor (ECGF), and fibroblast growth factor (FGF).

Use according to any one of Claims 7 to 11, characterized in that the said agent contains platelets or platelet-rich plasma from a species or an individual.