CH689672A9 - Catalytic subunit of human telomerase. - Google Patents

Catalytic subunit of human telomerase. Download PDF

Info

Publication number
CH689672A9
CH689672A9 CH02312/97A CH231297A CH689672A9 CH 689672 A9 CH689672 A9 CH 689672A9 CH 02312/97 A CH02312/97 A CH 02312/97A CH 231297 A CH231297 A CH 231297A CH 689672 A9 CH689672 A9 CH 689672A9
Authority
CH
Switzerland
Prior art keywords
htrt
telomerase
cell
sequence
polypeptide
Prior art date
Application number
CH02312/97A
Other languages
German (de)
Other versions
CH689672A5 (en
Inventor
Thomas R Cech
Calvin Bruce Harley
William H Andrews
Joachim Ligner
Toru Nakamura
Karen B Chapman
Gregg B Morin
Original Assignee
Geron Corp
Univ Technology Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/851,843 external-priority patent/US6093809A/en
Priority claimed from US08/854,050 external-priority patent/US6261836B1/en
Priority claimed from US08/912,951 external-priority patent/US6475789B1/en
Application filed by Geron Corp, Univ Technology Corp filed Critical Geron Corp
Publication of CH689672A5 publication Critical patent/CH689672A5/en
Publication of CH689672A9 publication Critical patent/CH689672A9/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10Transferases (2.)
    • C12N9/12Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10Transferases (2.)
    • C12N9/12Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1276RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y207/00Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07049RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01KANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00Genetically modified animals
    • A01K2217/05Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10Type of nucleic acid
    • C12N2310/15Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/31Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315Phosphorothioates

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Beschreibung description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Nucleinsäuren und Polypeptide, die die katalytische Untereinheit von Telomerase codieren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die katalytische Untereinheit von menschlicher Telomerase. Die Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen bereit, die die Medizin, Molekularbiologie, Chemie, Pharmakologie und medizinische, diagnostische und prognostische Verfahren betreffen. The present invention relates to novel nucleic acids and polypeptides that encode the catalytic subunit of telomerase. In particular, the present invention relates to the catalytic subunit of human telomerase. The invention provides methods and compositions related to medicine, molecular biology, chemistry, pharmacology, and medical, diagnostic, and prognostic methods.

Die folgende Diskussion soll den Leser in das Gebiet, auf das sich die vorliegende Erfindung bezieht, einführen. Das Zitieren verschiedener Literaturstellen in diesem Abschnitt soll nicht als ein Eingeständnis einer Vonwegnahme der Erfindung verstanden werden. The following discussion is intended to introduce the reader to the field to which the present invention relates. The citation of various references in this section should not be construed as an admission of discarding the invention.

Es ist schon lange bekannt, dass die vollständige Replikation der Enden von eukaryotischen Chromosomen spezialisierte Zellbestandteile erfordert (Watson, Nature New. Biol. 239 (1972), 197 und Olovni-kov, J. Theor. Biol. 41 (1973), 181). Die Replikation eines linearen DNA-Strangs durch übliche DNA-Po-lymerasen erfordert einen RNA-Primer und sie kann nur in 5'-3'-Richtung fortschreiten. Bei Entfernung der an das äussere 5'-Ende chromosomaler eukaryotischer DNA-Stränge gebundene RNA wird eine Lücke eingeführt, was zu einer fortschreitenden Verkürzung der Tochterstränge bei jeder Replikations-runde führt. Diese Verkürzung von Telomeren, die die an den Enden von Chromosomen physisch lokalisierten Protein/DNA-Strukturen darstellen, scheint der Grund für das Phänomen der zellulären Senes-zenz oder Alterung (siehe z.B. Goldstein, Science 249 (1990), 1129; Martin et al., Lab. Invest. 23 (1979), 86; Goldstein et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 64 (1969), 155 und Schneider und Mitsui, Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 73 (1976), 3584) normaler menschlicher somatischer Zellen in vitro und in vivo zu sein. It has long been known that the complete replication of the ends of eukaryotic chromosomes requires specialized cell components (Watson, Nature New. Biol. 239 (1972), 197 and Olovni-kov, J. Theor. Biol. 41 (1973), 181) . Replication of a linear strand of DNA by common DNA polymerases requires an RNA primer and can only proceed in the 5'-3 'direction. When the RNA bound to the outer 5'-end of chromosomal eukaryotic DNA strands is removed, a gap is introduced, which leads to a progressive shortening of the daughter strands with each round of replication. This shortening of telomeres, which represent the protein / DNA structures physically located at the ends of chromosomes, seems to be the reason for the phenomenon of cellular senescence or aging (see, for example, Goldstein, Science 249 (1990), 1129; Martin et al ., Lab. Invest. 23 (1979), 86; Goldstein et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 64 (1969), 155 and Schneider and Mitsui, Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 73 ( 1976), 3584) of normal human somatic cells in vitro and in vivo.

Die Länge und Integrität von Telomeren steht somit mit dem Eintritt einer Zelle in einen seneszenten Status (d.h. den Verlust der Proliferationsfähigkeit) in Zusammenhang. Da rüber hinaus dürfte die Fähigkeit einer Zelle die Telomerlänge zu bewahren (oder zu steigern) es der Zelle erlauben, der Seneszenz zu entgehen, d.h. unsterblich zu werden. The length and integrity of telomeres is thus related to the entry of a cell into a senescent status (i.e. the loss of its ability to proliferate). Furthermore, the ability of a cell to maintain (or increase) the telomere length may allow the cell to escape senescence, i.e. to become immortal.

Die Struktur von Telomeren und Telomer-DNA wurde in zahlreichen Systemen untersucht (siehe z.B. Harley und Villeponteau, Curr. Opin. Genet. Dev. 5 (1995), 249). In den meisten Organismen besteht Telomer-DNA aus einem Tandemarray von sehr einfachen Sequenzen; in Menschen und anderen Ver-tebraten besteht Telomer-DNA aus hunderten bis tausenden von Tandemwiederholungseinheiten der Sequenz TTAGGG. Verfahren zur Bestimmung und Modulierung der Telomerlänge in Zellen sind in den PCT-Veröffentlichungen WO 93/23 572 und WO 96/41 016 beschrieben. The structure of telomeres and telomeric DNA has been studied in numerous systems (see e.g. Harley and Villeponteau, Curr. Opin. Genet. Dev. 5 (1995), 249). In most organisms, telomeric DNA consists of a tandem array of very simple sequences; in humans and other verbrates, telomeric DNA consists of hundreds to thousands of tandem repeat units of the TTAGGG sequence. Methods for determining and modulating the telomer length in cells are described in PCT publications WO 93/23 572 and WO 96/41 016.

Die Wahrung von Telomeren ist eine Funktion einer Telomerspezifischen DNA-Polymerase, die als Telomerase bekannt ist. Telomerase ist ein Ribonucleoprotein (RNP), das einen Anteil seiner RNA-Ein-heit als eine Matrize für die Synthese der DNA-Telomer-Wiederholungseinheiten verwendet (Morin, Eur. J. Cancer 33 (1997), 750; Yu et al., Nature 344 (1990) 126; Singer und Gottschling, Science 266 Telomer preservation is a function of a telomer-specific DNA polymerase known as telomerase. Telomerase is a ribonucleoprotein (RNP) that uses a portion of its RNA unit as a template for the synthesis of the DNA telomer repeat units (Morin, Eur. J. Cancer 33 (1997), 750; Yu et al., Nature 344 (1990) 126; Singer and Gottschling, Science 266

(1994), 404; Autexier und Greider, Genes Develop. 8 (1994), 563; Gilley et al., Genes Develop. 9 (1994) 404; Autexier and Greider, Genes Develop. 8: 563, 1994; Gilley et al., Genes Develop. 9

(1995), 2214; Mc Eachem und Blackbum, Nature 367 (1995), 403; Blackbum, Ann. Rev. Biochem. 61 (1992), 113; Greider, Ann. Rev. Biochem. 65 (1996), 337). Die RNA-Bestandteile von menschlichen und anderen Telomerasen wurden cloniert und charakterisiert (siehe die PCT-Veröffentlichung WO 96/01835 und Feng et al., Science 269 (1995), 1236). Die Charakterisierung der Proteinbestandteile von Telomerase war jedoch schwierig. Dies rührt teilweise daher, dass es sich als schwierig herausgestellt hat, Te-lomerase-RNP zu reinigen, das in Zellen, in denen es exprimiert wird, nur in äusserst geringen Konzentrationen vorhanden ist. Beispielsweise nahm man an, dass menschliche Zellen, von denen man weiss, dass sie hohe Spiegel an Telomerase-Aktivität exprimieren, lediglich etwa 100 Enzymmoleküle pro Zelle besitzen. (1995), 2214; Mc Eachem and Blackbum, Nature 367 (1995), 403; Blackbum, Ann. Rev. Biochem. 61: 113 (1992); Greider, Ann. Rev. Biochem. 65 (1996), 337). The RNA components of human and other telomerases have been cloned and characterized (see PCT publication WO 96/01835 and Feng et al., Science 269 (1995), 1236). However, the characterization of the protein components of telomerase was difficult. This is partly due to the fact that it has proven difficult to purify Te-isomerase RNP, which is only present in extremely low concentrations in cells in which it is expressed. For example, it has been thought that human cells, which are known to express high levels of telomerase activity, have only about 100 enzyme molecules per cell.

Übereinstimmend mit der Beziehung von Telomeren und Telomerase mit der Proliferationsfähigkeit einer Zelle (d.h. der Fähigkeit einer Zelle, sich unbegrenzt zu teilen), wurde Telomerase-Aktivität in unsterblichen Zellinien und in ausgesprochen unterschiedlichen Arten von Tumorgeweben nachgewiesen, sie wurde jedoch nicht in normalen somatischen Zellkulturen oder normalen Geweben in Nachbarschaft eines Tumors (siehe US-Patente mit den Nummern 5 629 154; 5 489, 508; 5 648 215 und 5 639 613; siehe auch Morin, Cell 59 (1989) 521; Shay und Bacchetti, Eur. J. Cancer 33 (1997), 78 7; Kim et al., Science 266 (1994), 2011; Counter et al., EMBO J. 11 (1992), 1921; Counter et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 91 (1994), 2900 und Counter et al., J. Virol. 68 (1994), 3410) nachgewiesen (d.h. war nicht vorhanden oder unter der Nachweisgrenze des Assays). Darüber hinaus wurde über einen Zusammenhang zwischen dem Spiegel an Telomeraseaktivität in einem Tumor und des wahrscheinlichen klinischen Verlaufs der Krankheit des Patienten berichtet (z.B. US-Patent Nr. 5,639,613, a.a.O., und Langford et al., Hum. Pathol. 28 (1997), 416). Telomerase-Aktivität wurde auch in menschlichen Keimzellen, proliferierenden Stammzellen oder Nachkommen davon und aktivierten Lymphocyten nachgewiesen. In somatischen Stammzellen oder den Nachkommen davon und in aktivierten Lymphocyten ist die Telomerase-Aktivität typischerweise entweder sehr gering oder nur transient exprimiert (siehe Chiù et al., Stem Cells 14 (1996), 239, Bodnar et., Exp. Cell Res. 228 (1996), 58 und Taylor et al., J. Invest. Dermatolo-gy 106 (1996), 759). Consistent with the relationship of telomeres and telomerase to a cell's ability to proliferate (i.e., the ability of a cell to divide indefinitely), telomerase activity has been demonstrated in immortal cell lines and in distinctly different types of tumor tissues, but it has not been found in normal somatic cell cultures or normal tissues in the vicinity of a tumor (see U.S. Pat. Nos. 5,629,154; 5,489, 508; 5,648,215 and 5,639,613; see also Morin, Cell 59 (1989) 521; Shay and Bacchetti, Eur. J. Cancer 33 (1997), 78 7; Kim et al., Science 266 (1994), 2011; Counter et al., EMBO J. 11 (1992), 1921; Counter et al., Proc. Nati. Acad USA 91 (1994), 2900 and Counter et al., J. Virol. 68 (1994), 3410) (ie was not present or was below the detection limit of the assay). A relationship between the level of telomerase activity in a tumor and the likely clinical course of the patient's disease has also been reported (e.g., U.S. Patent No. 5,639,613, supra, and Langford et al., Hum. Pathol. 28 (1997), 416). Telomerase activity has also been demonstrated in human gametes, proliferating stem cells or progeny thereof and activated lymphocytes. In somatic stem cells or their progeny and in activated lymphocytes, telomerase activity is typically either very low or only transiently expressed (see Chiù et al., Stem Cells 14 (1996), 239, Bodnar et., Exp. Cell Res. 228 (1996), 58 and Taylor et al., J. Invest. Dermatolo-gy 106 (1996), 759).

Menschliche Telomerase ist ein ideales Ziel für die Diagnose und Behandlung menschlicher Krankheiten, die sich auf zelluläre Proliferation und Seneszenz, wie beispielsweise Krebs, beziehen. Verfah- Human telomerase is an ideal target for the diagnosis and treatment of human diseases related to cellular proliferation and senescence, such as cancer. Procedure

2 2nd

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

ren zur Diagnose und Behandlung von Krebs und anderen mit Telomerase in Zusammenhang stehenden Krankheiten in Menschen sind in den US-Patenten Nr. 5 489 508, 5 639 613 und 5 645 986 beschrieben. Verfahren zur Vorhersage des Fortschreitens eines Tumors durch Beobachtung von Telomerase sind in dem US-Patent Nr. 5 639 613 beschrieben. Das Auffinden und die Charakterisierung der katalytischen Protein-Untereinheit menschlicher Telomerase würde zusätzliche nützliche As-says für Telomerase und für die Diagnose und Therapie von Krankheiten bereitstellen. Darüber hinaus würde es die Clonierung und die Bestimmung der Primärsequenz der katalytischen Protein-Untereinheit erlauben, wirksamere Therapien für menschlichen Krebs und andere Krankheiten, die mit der Proliferationsfähigkeit und Seneszenz von Zellen zusammenhängen, bereitzustellen. Other methods for diagnosing and treating cancer and other telomerase-related diseases in humans are described in U.S. Patent Nos. 5,489,508, 5,639,613 and 5,645,986. Methods of predicting tumor progression by observation of telomerase are described in U.S. Patent No. 5,639,613. Finding and characterizing the catalytic protein subunit of human telomerase would provide additional useful assertions for telomerase and for the diagnosis and therapy of diseases. In addition, cloning and determination of the primary sequence of the catalytic protein subunit would allow more effective therapies for human cancer and other diseases related to cell proliferation and senescence to be provided.

Die vorliegende Erfindung stellt eine isolierte, im wesentlichen reine oder rekombinante Proteinpräparation eines Telomerase-reverse Transkriptase-Proteins oder einer Variante oder eines Fragments davon bereit. In einer Ausführungsform weist das Protein folgende Aminosäuresequenz auf: The present invention provides an isolated, substantially pure or recombinant protein preparation of a telomerase reverse transcriptase protein or a variant or a fragment thereof. In one embodiment, the protein has the following amino acid sequence:

Trp-RrX7-R1-RrRrX-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8.9-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp wobei X eine beliebige Aminosäure ist und eine tiefgestellte Zahl sich auf die Anzahl von aufeinanderfolgenden Resten bezieht, Ri Leucin ist oder Isoleucin, R2 Glutamin oder Arginin, R3 Phenylalanin oder Tyrosin und R4 Lysin oder Histidin. In einer Ausführungsform hat das Protein eine Sequenz von menschlicher TRT. In anderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung Peptide und Polypeptide, die mit einer Untersequenz solcher Proteine im wesentlich Sequenzidentität gemeinsam haben. Trp-RrX7-R1-RrRrX-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8.9-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp where X is any amino acid and a subscript is based on the number of successive residues, Ri is leucine or isoleucine, R2 glutamine or arginine, R3 phenylalanine or tyrosine and R4 lysine or histidine. In one embodiment, the protein has a sequence from human TRT. In other embodiments, the invention relates to peptides and polypeptides which essentially have sequence identity in common with a sub-sequence of such proteins.

In einer verwandten Ausführungsform stellt die Erfindung eine isolierte, im wesentlichen reine oder rekombinante Nucleinsäure bereit, die ein Telomerase-reverse Transkriptase-Protein codiert. In einer Ausführungsform hat das Protein die folgende Aminosäuresequenz: In a related embodiment, the invention provides an isolated, substantially pure or recombinant nucleic acid encoding a telomerase reverse transcriptase protein. In one embodiment, the protein has the following amino acid sequence:

Trp-R, -X7-R, -R i -RrX-Phe-Phe-T yr-X-Thr-Glu-Xg.9-R3 -R3-Arg-R4-X2-Trp. Trp-R, -X7-R, -R i -RrX-Phe-Phe-T yr-X-Thr-Glu-Xg.9-R3 -R3-Arg-R4-X2-Trp.

In einer Ausführungsform hat die Nucleinsäure eine Sequenz menschlicher TRT. In weiteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung Oligonucleotide und Polynucleotide, die mit einer Untereinheit solcher Nucleinsäuren wesentliche Sequenzidentität gemeinsam haben. In one embodiment, the nucleic acid has a sequence of human TRT. In further embodiments, the invention relates to oligonucleotides and polynucleotides which have essential sequence identity in common with a subunit of such nucleic acids.

Ein erfindungsgemässer Aspekt betrifft menschliche Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT). Somit stellt die Erfindung in einer Ausführungsform eine isolierte, im wesentlichen reine oder rekombinante Proteinpräration eines menschlichen Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-Proteins oder einer Variante oder eines Fragments davon bereit. One aspect of the invention relates to human telomerase reverse transcriptase (hTRT). Thus, in one embodiment, the invention provides an isolated, substantially pure or recombinant protein preparation of a human telomerase reverse transcriptase (hTRT) protein or a variant or fragment thereof.

In einer Ausführungsform ist das Protein durch eine Aminosäure gekennzeichnet mit mindestens etwa 75% oder mindestens etwa 80% Sequenzidentität zu dem hTRT-Protein von SEQ. ID. Nr. 2 (Fig. 17) oder eine Variante oder eines Fragments davon. In einer verwandten Ausführungsform hat das hTRT-Protein die Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2. In einigen Ausführungsformen weist das Protein eine oder mehrere Telomerase-Aktivitäten auf, beispielsweise katalytische Aktivität. In einer Ausführungsform weist das hTRT-Proteinfragment mindestens 6 Aminosäurereste auf. In one embodiment, the protein is characterized by an amino acid with at least about 75% or at least about 80% sequence identity to the hTRT protein from SEQ. ID. No. 2 (Fig. 17) or a variant or a fragment thereof. In a related embodiment, the hTRT protein has the sequence of SEQ. ID. # 2. In some embodiments, the protein has one or more telomerase activities, such as catalytic activity. In one embodiment, the hTRT protein fragment has at least 6 amino acid residues.

Die Erfindung stellt auch eine, ein hTRT-Protein und eine RNA umfassende Zusammensetzung bereit. Die RNA kann eine Telomerase-RNA sein, beispielsweise eine RNA menschlicher Telomerase. In einer Ausführungsform bilden das hTRT-Protein und die RNA menschlicher Telomerase einen Ribonu-cleoproteinkomplex mit einer Telomerase-Aktivität. The invention also provides a composition comprising an hTRT protein and an RNA. The RNA can be a telomerase RNA, for example an RNA of human telomerase. In one embodiment, the hTRT protein and the human telomerase RNA form a ribonu-cleoprotein complex with telomerase activity.

Ein erfindungsgemässer Aspekt betrifft die Bereitstellung isolierter menschlicher Telomerase, beispielsweise einer im wesentlichen reinen menschlichen Telomerase, die menschliche Telomerase-re-verse Transkriptase (hTRT) und menschliche Telomerase RNA (hTR) umfasst. In einer Ausführungsform hat die Telomerase eine Reinheit von mindestens etwa 95%. Die Telomerase kann aus einer Zelle isoliert sein. One aspect of the invention relates to the provision of isolated human telomerase, for example an essentially pure human telomerase, which comprises human telomerase reverse transcriptase (hTRT) and human telomerase RNA (hTR). In one embodiment, the telomerase is at least about 95% pure. The telomerase can be isolated from a cell.

Ein weiterer erfindungsgemässer Gesichtspunkt betrifft die Bereitstellung eines isolierten, synthetischen, im wesentlichen reinen oder rekombinanten Polynucleotids, das eine ein hTRT-Protein codierende Nucleinsäuresequenz umfasst. In einer Ausführungsform hat das Polynucleotid eine Nucleotidse-quenz, die ein hTRT-Protein codiert, das eine in SEQ. ID. Nr. 2 angegegebene Aminosäuresequenz hat, oder eine Sequenz, die eine oder mehrere konservative Substitutionen in dieser Aminosäuresequenz umfasst. Ein verwandter Aspekt betrifft die Bereitstellung eines Polynucleotids, das unter strin-genten Bedingungen mit einem Polynucleotid mit der Sequenz von SEQ. ID. Nr. 1 hybridisiert. In einer weiteren verwandten Ausführungsform hat die Nucleotidsequenz des Polynucleotids eine kleinste Summenwahrscheinlichkeit von weniger als etwa 0,5 im Vergleich zu einer in SEQ. ID. Nr. 1 angegebenen Nucleotidsequenz mittels des BLAST-Algorithmus unter Verwendung von Voreinstellungsparametern. Another aspect of the invention relates to the provision of an isolated, synthetic, essentially pure or recombinant polynucleotide, which comprises a nucleic acid sequence encoding an hTRT protein. In one embodiment, the polynucleotide has a nucleotide sequence encoding an hTRT protein that contains one in SEQ. ID. No. 2 amino acid sequence indicated, or a sequence that includes one or more conservative substitutions in that amino acid sequence. A related aspect relates to the provision of a polynucleotide which, under strict conditions, contains a polynucleotide having the sequence of SEQ. ID. No. 1 hybridizes. In a further related embodiment, the nucleotide sequence of the polynucleotide has a smallest sum probability of less than about 0.5 compared to that in SEQ. ID. No. 1 specified nucleotide sequence using the BLAST algorithm using preset parameters.

Ein weiterer erfindungsgemässer Aspekt betrifft die Bereitstellung eines Polynucleotids mit einer Promotorsequenz, die mit der das hTRT-Protein codierenden Sequenz funktionell verknüpft ist. Der Promotor kann ein Promotor sein, der nicht dem natürlich vorkommenden hTRT-Promotor entspricht. Ein verwandter erfindungsgemässer Gesichtspunkt betrifft die Bereitstellung eines Expressionsvektors, der das hTRT-Polynucleotid umfasst. Another aspect of the invention relates to the provision of a polynucleotide with a promoter sequence which is functionally linked to the sequence encoding the hTRT protein. The promoter can be a promoter that does not correspond to the naturally occurring hTRT promoter. A related aspect of the invention relates to the provision of an expression vector comprising the hTRT polynucleotide.

Die Erfindung stellt auch ein isoliertes, synthetisches, im wesentlichen reines oder rekombinantes Polynucleotid bereit, das eine Länge von mindestens 10 Nucleotiden aufweist und eine aufeinanderfolgende Sequenz von mindestens 10 Nucleotiden umfasst, die zu einer aufeinanderfolgenden Sequenz in ei3 The invention also provides an isolated, synthetic, substantially pure or recombinant polynucleotide that is at least 10 nucleotides in length and comprises a sequential sequence of at least 10 nucleotides that results in a sequential sequence in ei3

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

nem natürlich vorkommenden hTRT-Gen oder hTRT-mRNA identisch oder genau komplementär ist. In einigen Ausführungsformen ist das Polynucleotid eine RNA, eine DNA, oder es enthält ein oder mehrere nicht natürlich vorkommende, synthetische Nucleotide. In einer Ausführungsform ist das Polynucleotid identisch oder genau komplementär zu der aufeinanderfolgenden Sequenz von mindestens 10 aufeinanderfolgenden Nucleotiden in einem natürlich-vorkommenden hTRT-Gen oder einer hTRT-mRNA. Beispielsweise kann das Polynucleotid ein «antisense»-Polynucleotid sein. In einer anderen Ausführungsform umfasst das antisense-Polynucleotid mindestens etwa 20 Nucleotide. nes naturally occurring hTRT gene or hTRT mRNA is identical or exactly complementary. In some embodiments, the polynucleotide is an RNA, a DNA, or it contains one or more non-naturally occurring synthetic nucleotides. In one embodiment, the polynucleotide is identical or exactly complementary to the sequential sequence of at least 10 consecutive nucleotides in a naturally occurring hTRT gene or hTRT mRNA. For example, the polynucleotide can be an "antisense" polynucleotide. In another embodiment, the antisense polynucleotide comprises at least about 20 nucleotides.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung rekombinanter Telomerase durch Inkontakt-bringen eines rekombinanten hTRT-Proteins mit einem Telomerase-RNA-Bestandteil unter solchen Bedingungen bereit, dass das rekombinante Protein und der Telomerase-RNA-Bestandteil zur Bildung eines Telomerase-Enzyms assoziieren, das die Hinzufügung von Nucleotiden zu einem Telomerase-Sub-strat katalysieren kann. In einer Ausführungsform hat das hTRT-Protein die Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2. Das hTRT-Protein kann in einem in vitro-Expressionssystem hergestellt und mit einer Telomera-se-RNA vermischt werden; in einer anderen Ausführungsform wird die Telomerase-RNA in dem in vitro-Expressionssystem coexprimiert. In einer Ausführungsform ist die Telomerase-RNA menschliche Telomerase-RNA. In einer alternativen Ausführungsform geschieht das Inkontaktbringen in einer Zelle, beispielsweise einer menschlichen Zelle. In einer Ausführungsform weist die Zelle keine Telomeraseaktivi-tät vor dem Inkontaktbringen von hTRT und der RNA eines hTRT-Polynucleotids (oder der Einführung z.B. durch Transfektion) auf. In einer Ausführungsform wird die Telomerase-RNA natürlicherweise von der Zelle exprimiert. The invention also provides a method for producing recombinant telomerase by contacting a recombinant hTRT protein with a telomerase RNA component under conditions such that the recombinant protein and the telomerase RNA component associate to form a telomerase enzyme. that can catalyze the addition of nucleotides to a telomerase substrate. In one embodiment, the hTRT protein has the sequence of SEQ. ID. No. 2. The hTRT protein can be produced in an in vitro expression system and mixed with a telomerase RNA; in another embodiment, the telomerase RNA is co-expressed in the in vitro expression system. In one embodiment, the telomerase RNA is human telomerase RNA. In an alternative embodiment, the contacting takes place in a cell, for example a human cell. In one embodiment, the cell has no telomerase activity prior to contacting hTRT and the RNA of an hTRT polynucleotide (or introduction, e.g., by transfection). In one embodiment, the telomerase RNA is naturally expressed by the cell.

Die Erfindung stellt auch eine Zelle bereit, beispielsweise eine menschliche Zelle, Mauszelle oder Hefezelle, die die erfindungsgemässen rekombinanten Polynucleotide enthält, beispielsweise ein Polynucleotid mit einer mit einem Promotor funktionell verknüpften, ein hTRT-Protein codierenden Sequenz. Hinsichtlich bestimmter Aspekte ist die Zelle eine Vertebratenzelle, beispielsweise eine Zelle eines Säugers, z.B. eines Menschen, und weist eine erhöhte Proliferationsfähigkeit relativ zur Zelle auf, die ansonsten identisch ist, jedoch nicht das rekombinante Polynucleotid umfasst, oder sie weist einen erhöhten Telomerase-Aktivitätsspiegel auf, relativ zu einer Zelle, die ansonsten identisch ist, jedoch nicht rekombinante Polynucleotide umfasst. In einigen Ausführungsformen ist die Zelle unsterblich. The invention also provides a cell, for example a human cell, mouse cell or yeast cell, which contains the recombinant polynucleotides according to the invention, for example a polynucleotide with a sequence which is functionally linked to a promoter and encodes an hTRT protein. In certain aspects, the cell is a vertebrate cell, e.g. a mammalian cell, e.g. of a human, and has an increased proliferation ability relative to the cell that is otherwise identical but does not include the recombinant polynucleotide, or has an increased level of telomerase activity relative to a cell that is otherwise identical but does not include recombinant polynucleotides . In some embodiments, the cell is immortal.

Verwandte erfindungsgemässe Ausführungsformen betreffen die Bereitstellung von Organismen und Zellen, die ein Polynucleotid umfassen, das ein menschliches Telomerase-reverse Transkriptase-Polypeptid ist. Dazu zählen ein transgener nicht-menschlicher Organismus, wie beispielsweise Hefe, eine Pflanze oder Bakterium oder ein Tier, beispielsweise eine Maus. Die Erfindung stellt auch transgene Tiere und Zellen bereit, bei denen ein hTRT-Gen deletiert wurde («knockedout») oder so mutiert wurde, dass das Gen ein natürlich vorkommendes hTRT-Genprodukt nicht exprimiert. Somit hat in alternativen Ausführungsformen das transgene Tier ein mutiertes Telomerasegen, ist ein hinsichtlich einer Telomerase-Aktivität defizientes Tier, ist ein Tier, dessen TRT-Defizienz das Ergebnis eines mutierten Gens ist, das eine TRT mit einem herabgesetzten Spiegel an Telomerase-Aktivität im Vergleich zu einem Wild-typ-TRT besitzt oder ein Tier mit einem mutierten TRT-Gen mit einer oder mehreren Mutationen, wozu «missense» Mutationen, «nonsense»-Mutationen, Insertionen und Deletionen zählen. Related embodiments of the invention relate to the provision of organisms and cells comprising a polynucleotide that is a human telomerase reverse transcriptase polypeptide. These include a transgenic non-human organism, such as yeast, a plant or bacterium, or an animal, such as a mouse. The invention also provides transgenic animals and cells in which an hTRT gene has been knocked out or mutated so that the gene does not express a naturally occurring hTRT gene product. Thus, in alternative embodiments, the transgenic animal has a mutated telomerase gene, is an animal deficient in telomerase activity, is an animal whose TRT deficiency is the result of a mutated gene that compares a TRT with a reduced level of telomerase activity owns a wild-type TRT or an animal with a mutated TRT gene with one or more mutations, including "missense" mutations, "nonsense" mutations, insertions and deletions.

Die Erfindung stellt auch einen isolierten oder rekombinanten Antikörper oder ein Fragment davon bereit, die an hTRT-Protein spezifisch binden. In einer Ausführungsform bindet der Antikörper mit einer Affinität von mindestens etwa 10®M"1. Der Antikörper kann eine monoclonale oder polyclonale Zusammensetzung, beispielsweise ein polyclonales Antiserum, sein. Ein verwandter erfindungsgemässer Aspekt betrifft die Bereitstellung einer Zelle, die den Antikörper sezernieren kann, beispielsweise ein Hybridom. The invention also provides an isolated or recombinant antibody or fragment thereof that specifically binds to hTRT protein. In one embodiment, the antibody binds with an affinity of at least about 10®M "1. The antibody can be a monoclonal or polyclonal composition, for example a polyclonal antiserum. A related aspect of the invention relates to the provision of a cell which can secrete the antibody, for example a hybridoma.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Nachweis zur Verfügung, ob eine Verbindung oder eine Behandlung ein Modulator einer reversen Transkriptase-Aktivität von Telomerase oder der hTRT-Ex-pression ist durch den Nachweis oder die Überwachung einer Veränderung in der Aktivität oder Expression in einer Zelle, einem Tier oder einer Zusammensetzung, die ein hTRT-Protein oder entsprechendes Polynucleotid umfasst, nach Verabreichung der Verbindung oder der Behandlung. In einer Ausführungsform beinhaltet das Verfahren die folgenden Schritte: Bereitstellung einer TRT-Zusammensetzung, Inkontaktbringen der TRT mit der Testverbindung und Messung der Aktivität der TRT, wobei eine Veränderung in der TRT-Aktivität in Gegenwart der Testverbindung ein Indikator dafür ist, ob die Testverbindung TRT-Aktivität moduliert. In bestimmten Ausführungsformen ist die Zusammensetzung eine Zelle, ein Organismus, ein transgener Organismus oder ein in vitro-System, beispielsweise ein Expressionssystem, das ein ein hTRT-Polypeptid codierendes rekombinantes Polynucleotid enthält. Somit kann die menschliche Telomerase-reverse Transkriptase dieses Verfahrens ein Produkt einer in vitro-Expression sein. In verschiedenen Ausführungsformen kann der Nachweis einer Telomerase-Aktivität oder -Expression dadurch erfolgen, dass eine Veränderung in der Häufigkeit eines hTRT-Genprodukts dadurch nachgewiesen wird, dass der Einbau einer Nucleotidmarkierung in ein Substrat für Telomerase überwacht wird, die Hybridisierung einer Sonde mit einem verlängerten Telomerase-Substrat, die Amplifikation eines verlängerten Telomerase-Substrats, die Telomerlänge einer der Testverbindung ausgesetzten Zelle und der Verlust der Fähigkeit der Telomerase an ein Chromosom zu binden oder durch die Messung der Anreicherung oder des Verlusts einer Telomerstruktur. The invention also provides a method of detecting whether a compound or treatment is a modulator of telomerase reverse transcriptase activity or hTRT expression by detecting or monitoring a change in activity or expression in a cell , an animal or a composition comprising an hTRT protein or corresponding polynucleotide after administration of the compound or treatment. In one embodiment, the method includes the following steps: providing a TRT composition, contacting the TRT with the test compound and measuring the activity of the TRT, a change in the TRT activity in the presence of the test compound being an indicator of whether the test compound is TRT Activity modulated. In certain embodiments, the composition is a cell, an organism, a transgenic organism or an in vitro system, for example an expression system, which contains a recombinant polynucleotide encoding an hTRT polypeptide. Thus, the human telomerase reverse transcriptase of this method can be a product of in vitro expression. In various embodiments, detection of telomerase activity or expression can be accomplished by detecting a change in the frequency of an hTRT gene product by monitoring the incorporation of a nucleotide label into a substrate for telomerase, the hybridization of a probe with an extended one Telomerase substrate, the amplification of an elongated telomerase substrate, the telomer length of a cell exposed to the test compound and the loss of the ability of the telomerase to bind to a chromosome or by measuring the accumulation or loss of a telomer structure.

Ein erfindungsgemässer Aspekt betrifft die Bereitstellung eines Verfahrens zum Nachweis eines menschlichen Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-Genprodukts in einer biologischen Probe durch One aspect of the invention relates to the provision of a method for the detection of a human telomerase reverse transcriptase (hTRT) gene product in a biological sample

4 4th

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Inkontaktbringen der biologischen Probe mit einer Sonde, die das Genprodukt spezifisch bindet, wobei die Sonde und das Genprodukt einen Komplex bilden, und durch den Nachweis des Komplexes, wobei das Vorhandensein des Komplexes mit dem Vorhandensein des hTRT-Genprodukts in der biologischen Probe korreliert. Das Genprodukt kann RNA, DNA oder ein Polypeptid sein. Zu den Beispielen für Sonden, die zum Nachweis verwendet werden können, zählen, jedoch ohne Beschränkung darauf, Nuclein-säuren und Antikörper. Contacting the biological sample with a probe that specifically binds the gene product, the probe and the gene product forming a complex, and by detecting the complex, the presence of the complex correlating with the presence of the hTRT gene product in the biological sample. The gene product can be RNA, DNA or a polypeptide. Examples of probes that can be used for detection include, but are not limited to, nucleic acids and antibodies.

In einer Ausführungsform ist das Genprodukt eine Nucleinsäure, die durch Amplifikation des Gens und Nachweis des Amplifikationsprodukts nachgewiesen wird, wobei das Vorhandensein des Komplexes oder des Amplifikationsprodukts mit dem Vorhandensein des hTRT-Genprodukts in der biologischen Probe korreliert. In one embodiment, the gene product is a nucleic acid that is detected by amplifying the gene and detecting the amplification product, the presence of the complex or the amplification product correlating with the presence of the hTRT gene product in the biological sample.

In einer Ausführungsform ist die biologische Probe von einem Patienten beispielsweise einem menschlichen Patienten. In einer weiteren Ausführungsform enthält die biologische Probe mindestens eine Zelle aus einer in vitro-Zellkultur, beispielsweise einer Kultur menschlicher Zellen. In one embodiment, the biological sample from a patient is, for example, a human patient. In a further embodiment, the biological sample contains at least one cell from an in vitro cell culture, for example a culture of human cells.

Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins mindestens einer unsterblichen oder Telomerase-positiven menschlichen Zelle in einer menschlichen Zellen umfassenden biologischen Probe bereit, wobei die menschliche Zellen umfassende biologische Probe erhalten wird und das Vorhandensein einer Zelle mit einem hohen Spiegel eines hTRT-Genprodukts in der Probe nachgewiesen wird, wobei das Vorhandensein einer Zelle mit einem hohen Spiegel an dem hTRT-Gen-produkt mit dem Vorhandensein von unsterblichen oder Telomerase-positiven Zellen in der biologischen Probe korreliert. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Diagnose eines mit Telomerase in Zusammenhang stehenden Zustands in einem Patienten durch Gewinnung einer Zelle oder einer Gewebeprobe von dem Patienten, Bestimmung der Menge eines menschlichen Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-Genprodukts in der Zelle oder dem Gewebe und dem Vergleich der Menge des hTRT-Genprodukts in der Zelle oder dem Gewebe mit der Menge in einer gesunden Zelle oder einem gesunden Gewebe des gleichen Typs, wobei eine unterschiedliche Menge des hTRT-Genprodukts in der Probe von dem Patienten im Vergleich zu der gesunden Zelle oder im gesunden Gewebe ein diagnostisches Anzeichen für einen mit Telomerase in Zusammenhang stehenden Zustand ist. In einer Ausführungsform ist der mit Telomerase in Zusammenhang stehende Zustand Krebs. The invention further provides a method for detecting the presence of at least one immortal or telomerase-positive human cell in a biological sample comprising human cells, wherein the biological sample comprising human cells is obtained and the presence of a cell with a high level of an hTRT gene product is detected in the sample, the presence of a cell with a high level of the hTRT gene product correlating with the presence of immortal or telomerase positive cells in the biological sample. The invention also provides a method for diagnosing a telomerase-related condition in a patient by obtaining a cell or tissue sample from the patient, determining the amount of a human telomerase reverse transcriptase (hTRT) gene product in the cell or tissue and comparing the amount of the hTRT gene product in the cell or tissue with the amount in a healthy cell or tissue of the same type, with a different amount of the hTRT gene product in the sample from the patient compared to the healthy cell or is a diagnostic sign of a condition related to telomerase in healthy tissue. In one embodiment, the telomerase-related condition is cancer.

Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit zur Diagnose von Krebs in einem Patienten durch Gewinnung einer Probe von dem Patienten und den Nachweis eines menschlichen Telomerase-reverse-Transkriptase-(hTRT)-Genprodukts in der Probe von dem Patienten, wobei der Nachweis des hTRT-Genprodukts in der Probe mit einer Diagnose von Krebs korreliert. The invention further provides a method for diagnosing cancer in a patient by obtaining a sample from the patient and detecting a human telomerase reverse transcriptase (hTRT) gene product in the sample from the patient, wherein the detection of the hTRT- Gene product in the sample correlated with a diagnosis of cancer.

Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit zur Diagnose von Krebs in einem Patienten durch Gewinnung einer Patientenprobe, Bestimmung der Menge des menschlichen Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-Genprodukts in der Patientenprobe und den Vergleich der Menge des hTRT-Genprodukts mit einem normalen Wert oder Kontrollwert, wobei eine Menge des hTRT-Genprodukts in dem Patienten, die in dem Vergleich zu dem Normalwert oder Kontrollwert grösser ist, ein diagnostisches Anzeichen für Krebs ist. The invention also provides a method of diagnosing cancer in a patient by obtaining a patient sample, determining the amount of human telomerase reverse transcriptase (hTRT) gene product in the patient sample, and comparing the amount of the hTRT gene product to a normal value or Control value, where an amount of the hTRT gene product in the patient that is larger compared to the normal or control value is a diagnostic sign of cancer.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Diagnose von Krebs in einem Patienten durch Gewinnung einer Patientenprobe, die mindestens eine Zelle enthält, Bestimmung der Menge des hTRT-Genprodukts, in einer Zelle in der Probe und den vergleich der Menge des hTRT-Genprodukts in der Zelle mit einem für die Zellen normalen Wert, wobei eine Menge des hTRT-Genprodukts die über dem Normalwert liegt, ein diagnostisches Anzeichen für Krebs ist. In einer Ausführungsform wird davon ausgegangen, dass die Probe mindestens eine maligne Zelle enthält. The invention also provides a method for diagnosing cancer in a patient by obtaining a patient sample containing at least one cell, determining the amount of the hTRT gene product in a cell in the sample and comparing the amount of the hTRT gene product in the Cell with a normal value for the cells, with an amount of the hTRT gene product which is above the normal value being a diagnostic sign of cancer. In one embodiment, it is assumed that the sample contains at least one malignant cell.

Die Erfindung stellt ausserdem ein Verfahren zur Bereitstellung einer Prognose für einen Krebspatienten bereit, wobei die Menge des hTRT-Genprodukts in einer von dem Patienten erhaltenen Krebszelle bestimmt wird und die Menge von hTRT in der Krebszelle mit einem prognostischen Wert für hTRT pro Krebszelle, konsistent mit einer Prognose hinsichtlich Krebs ist, wobei eine hTRT-Menge pro Zelle in der Probe, die bei dem prognostischen Wert liegt, die spezielle Prognose bereitstellt. The invention also provides a method of providing a prognosis for a cancer patient wherein the amount of the hTRT gene product in a cancer cell obtained from the patient is determined and the amount of hTRT in the cancer cell with a prognostic value for hTRT per cancer cell consistent with is a cancer prognosis, with an amount of hTRT per cell in the sample that is at the prognostic value providing the particular prognosis.

Die Erfindung stellt ausserdem ein Verfahren bereit zur Überwachung der Wirksamkeit einer An-tikrebsbehandlung, die Proliferationskapazität von Krebszellen in einem Patienten herabzusetzen, dadurch, dass zuerst eine Messung der Menge eines hTRT-Genprodukts in mindestens einer Krebszelle von dem Patienten durchgeführt wird, eine zweite Messung hinsichtlich des Spiegels an hTRT-Genprodukts in mindestens einer Krebszeile des Patienten durchgeführt wird, wobei die Antikrebsbehandlung dem Patienten vor der zweiten Messung oder zur gleichen Zeit verabreicht wird und durch den Vergleich der ersten mit der zweiten Messung, wobei ein niedriger Spiegel an hTRT-Genprodukt in der zweiten Messung mit der Wirksamkeit einer Antikrebsbehandlung korreliert, die Proliferationskapazität von Krebszellen in dem Patienten herabzusetzen. The invention also provides a method for monitoring the effectiveness of an anti-cancer treatment to decrease the proliferation capacity of cancer cells in a patient by first measuring the amount of an hTRT gene product in at least one cancer cell by the patient, a second measurement in terms of the level of hTRT gene product is performed in at least one patient's cancer row, the anti-cancer treatment being administered to the patient before or at the same time and by comparing the first to the second measurement, with a low level of hTRT gene product correlated in the second measurement with the effectiveness of anti-cancer treatment to reduce the proliferation capacity of cancer cells in the patient.

Die Erfindung stellt auch Kits für den Nachweis eines hTRT-Gens oder Genprodukts zur Verfügung. In einer Ausführungsform enthält der Kit einen Behälter, der ein Molekül umfasst, ausgewählt aus einer hTRT-Nucleinsäure oder einer Untersequenz davon, ein hTRT-Polypeptid oder eine Untersequenz davon und einen anti-hTRT-Antikörper. Die Erfindung stellt auch Behandlungsverfahren für menschliche Krankheiten zur Verfügung. Ein erfindungsgemässer Aspekt betrifft die Bereitstellung eines Verfahrens zur Steigerung der Proliferationskapazität einer Vertebratenzelle, beispielsweise einer Säugerzelle, durch Einführung eines rekombinanten Polynucleotids in die Zelle, wobei das Polynucleotid eine Sequenz The invention also provides kits for the detection of an hTRT gene or gene product. In one embodiment, the kit contains a container comprising a molecule selected from an hTRT nucleic acid or a sub-sequence thereof, an hTRT polypeptide or a sub-sequence thereof and an anti-hTRT antibody. The invention also provides methods of treating human diseases. One aspect of the invention relates to the provision of a method for increasing the proliferation capacity of a vertebrate cell, for example a mammalian cell, by introducing a recombinant polynucleotide into the cell, the polynucleotide being a sequence

5 5

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

umfasst, die ein menschliches Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-Polypeptid umfasst. In einer Ausführungsform hat das hTRT-Polypeptid eine Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2 (Fig. 17). In einer Ausführungsform ist die Sequenz mit einem Promotor funktionell verknüpft. In einer Ausführungsform weist die hTRT katalytische Aktivität von Telomerase auf. In einer Ausführungsform ist die Zelle menschlich, bei-5 spielsweise eine Zelle in einem menschlichen Patienten. comprising a human telomerase reverse transcriptase (hTRT) polypeptide. In one embodiment, the hTRT polypeptide has a sequence of SEQ. ID. No. 2 (Fig. 17). In one embodiment, the sequence is functionally linked to a promoter. In one embodiment, the hTRT has catalytic activity of telomerase. In one embodiment, the cell is human, for example a cell in a human patient.

In einer alternativen Ausführungsform wird die Zelle in vitro kultiviert. In einer verwandten Ausführungsform wird die Zelle in einen menschlichen Patienten eingeführt. In an alternative embodiment, the cell is cultivated in vitro. In a related embodiment, the cell is introduced into a human patient.

Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit zur Behandlung einer menschlichen Krankheit durch Einführung eines rekombinanten hTRT-Polynucleotids in mindestens eine Zelle in einem Patienten. In 10 einer Ausführungsform wird ein Vektor für Gentherapie verwendet. In einer verwandten Ausführungsform besteht das Verfahren femer in der Einführung eines Polynucleotids in die Zelle, das eine menschliche Telomerase-RNA codierende Sequenz umfasst, beispielsweise ein hTRT-Polynucleotid, das mit einem Promotor funktionell verknüpft ist. The invention further provides a method of treating a human disease by introducing a recombinant hTRT polynucleotide into at least one cell in a patient. In one embodiment, a vector is used for gene therapy. In a related embodiment, the method further consists in introducing into the cell a polynucleotide comprising a sequence encoding a human telomerase RNA, for example an hTRT polynucleotide operably linked to a promoter.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Steigerung der Proliferationsfähigkeit einer Verte-15 bratenzelle, wobei das Verfahren die Einführung einer wirksamen Menge eines menschlichen Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-Polypeptids in die Zelle umfasst. In einer Ausführungsform hat das hTRT-Polypeptid katalytische Aktivität von Telomerase. Die Erfindung stellt ferner Zellen und Nachkommen der Zellen mit erhöhter Proliferationskapazität bereit. The invention also provides a method for increasing the proliferation ability of a verte-15-cell, the method comprising introducing an effective amount of a human telomerase reverse transcriptase (hTRT) polypeptide into the cell. In one embodiment, the hTRT polypeptide has catalytic activity from telomerase. The invention further provides cells and progeny of the cells with increased proliferation capacity.

Die Erfindung stellt auch Arzneimittel bereit, die einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten 20 und ein Molekül ausgewählt aus: einem hTRT-Polypeptid, einem ein hTRT-Polypeptid codierenden Polynucleotid und einer hTRT-Nucleinsäure oder einer Untersequenz davon. The invention also provides pharmaceutical compositions containing a pharmaceutically acceptable carrier and a molecule selected from: an hTRT polypeptide, a polynucleotide encoding an hTRT polypeptide and an hTRT nucleic acid or a sub-sequence thereof.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Behandlung eines Zustands, der mit einem erhöhten Spiegel an Telomerase-Aktivität innerhalb einer Zelle assoziiert ist, wobei das Verfahren die Einführung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Inhibitors von Telomerase-Aktivität in die Zelle um-25 fasst, wobei der Inhibitor ein hTRT-Polypeptid oder ein hTRT-Polynucleotid ist. In einer Ausführungsform ist der Inhibitor ein Polypeptid, das die Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2 oder 4 oder eine Untersequenz davon umfasst. In weiteren Ausführungsformen hemmt das Polypeptid eine TRT-Aktivität, beispielsweise die Bindung endogener TRT an Telomerase-RNA. The invention also provides a method of treating a condition associated with an increased level of telomerase activity within a cell, the method comprising introducing into the cell a therapeutically effective amount of an inhibitor of telomerase activity. wherein the inhibitor is an hTRT polypeptide or an hTRT polynucleotide. In one embodiment, the inhibitor is a polypeptide that comprises the sequence of SEQ. ID. No. 2 or 4 or a sub-sequence thereof. In further embodiments, the polypeptide inhibits TRT activity, for example the binding of endogenous TRT to telomerase RNA.

Die Erfindung stellt auch ein Vakzin bereit, das ein hTRT-Polypeptid und ein Adjuvans umfasst. The invention also provides a vaccine comprising an hTRT polypeptide and an adjuvant.

30 30th

Beschreibung der Figuren Fig. 1 DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1

zeigt hochkonservierte Reste in TRT-Motiven von Menschen, S. pombe (tez1), S. cerevisiae (EST2) und 35 Euplotes aediculatus (p123). Identische Aminosäuren sind mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet, während ähnliche Aminosäurereste durch einen Punkt (•) gekennzeichnet sind. Motiv «0» in der Figur wird auch Motif T genannt; Motiv «3» wird auch Motiv A genannt. shows highly preserved residues in TRT motifs of humans, S. pombe (tez1), S. cerevisiae (EST2) and 35 Euplotes aediculatus (p123). Identical amino acids are marked with an asterisk (*), while similar amino acid residues are marked with a dot (•). Motif "0" in the figure is also called Motif T; Motif «3» is also called motif A.

Fig. 2 Fig. 2

zeigt die Lage Telomerase-spezifischer Motive und RT-spezifischer Sequenzmotive von Telomerase-40 Proteinen und anderen reversen Transkriptasen. Die Lage des Telomerase-spezifischen Motivs T und der konservierten RT-Motive 1, 2 und A-E sind durch gefüllte Kästchen gekennzeichnet. Das mit einem offenen Rechteck gekennzeichnete HIV-1 RT kennzeichnet den in Fig. 3 gezeigten Anteil dieses Proteins. shows the location of telomerase-specific motifs and RT-specific sequence motifs of telomerase-40 proteins and other reverse transcriptases. The location of the telomerase-specific motif T and the conserved RT motifs 1, 2 and A-E are indicated by filled boxes. The HIV-1 RT marked with an open rectangle marks the portion of this protein shown in FIG. 3.

Fig. 3 Fig. 3

45 zeigt die Kristallstruktur der p66-Untereinheit von HIV-1-reverse Transkriptase («Brookhaven code» 1HNV). Die Ansicht ist, vom rechten Handrücken aus gesehen, dargestellt, damit alle Motive erkennbar sind. 45 shows the crystal structure of the p66 subunit of HIV-1 reverse transcriptase (“Brookhaven code” 1HNV). The view is shown from the back of the right hand, so that all motifs are recognizable.

Fig. 4 Fig. 4

zeigt mehrere Sequenzausrichtungen von Telomerase-RTs (Sp_Trt1p, S. pombe TRT (hier auch mit 50 «tezlp» bezeichnet); bTRT, menschliche TRT; Ea_p123, Euplotes p123; Sc_Est2p, S. cerevisiae Est2P) und Mitglieder anderer RT-Familien (S_a1, Cytochrom-oxidase Gruppe II Intron l-codiertes Protein von S. cerevisiae-Mitochondrien, Dm_TART, reverse Transkriptase von Drosophila melanogaster TART-nicht-LTR-Retrotransposon-Element); HIV-1, reverse Transkriptase von menschlichem HIV). TRT con und RT con repräsentieren «Consensus»-Sequenzen für Telomerase-RTs und nicht-Telomerase-RTs. 55 Aminosäuren sind gekennzeichnet mit einem h, hydrophob; p, polar; c, geladen. Dreiecke bezeichnen Reste, die innerhalb der Telomerase-Proteine konserviert sind, in anderen RTs jedoch unterschiedlich sind. Die dicke Linie unter Motiv E bezeichnet den «Primergriff» («primer grip»)-Bereich. shows several sequence orientations of telomerase RTs (Sp_Trt1p, S. pombe TRT (here also denoted by 50 «tezlp»); bTRT, human TRT; Ea_p123, Euplotes p123; Sc_Est2p, S. cerevisiae Est2P) and members of other RT families (S_a1 , Cytochrome oxidase group II intron I-encoded protein from S. cerevisiae mitochondria, Dm_TART, reverse transcriptase from Drosophila melanogaster TART non-LTR retrotransposon element); HIV-1, reverse transcriptase from human HIV). TRT con and RT con represent “consensus” sequences for telomerase RTs and non-telomerase RTs. 55 amino acids are marked with an h, hydrophobic; p, polar; c, loaded. Triangles indicate residues that are conserved within the telomerase proteins, but are different in other RTs. The thick line under motif E denotes the "primer grip" area.

Fig. 5 Fig. 5

zeigt die Expression von hTRT-RNA in Telomerase-negativen sterblichen Zellstämmen und Telomerase-60 positiven unsterblichen Zellinien, wie in Beispiel 2 beschrieben. shows the expression of hTRT-RNA in telomerase-negative mortal cell strains and telomerase-60 positive immortal cell lines, as described in Example 2.

Fig. 6 Fig. 6

zeigt einen möglichen phylogenetischen Stammbaum von Telomerasen und Retroelementen mit RNA-abhängigen RNA-Polymerasen als Wurzel. shows a possible phylogenetic family tree of telomerases and retro elements with RNA-dependent RNA polymerases as the root.

Fig. 7 Fig. 7

65 zeigt eine Restriktionskarte des lambda-Clons G.o5. 65 shows a restriction map of the lambda clone G.o5.

6 6

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Fig. 8 Fig. 8

zeigt eine Karte von Chromosom Sp mit der Lage des STS-Markers D5S678 (der in der Nähe des hTRT-Gens lokalisiert ist). shows a map of chromosome Sp with the location of the STS marker D5S678 (located near the hTRT gene).

Fig. 9 Fig. 9

zeigt die Konstruktion eines hTRT-Promotor-Reporterplasmids. shows the construction of an hTRT promoter reporter plasmid.

Fig. 10 Fig. 10

(zwei Seiten) zeigt die in vitro-Coexpression von hTRT und hTR zur Herstellung katalytisch aktiver menschlicher Telomerase. (two pages) shows the in vitro coexpression of hTRT and hTR for the production of catalytically active human telomerase.

Fig. 11 Fig. 11

(zwei Seiten) zeigt die Ausrichtung von Sequenzen von vier TRT-Proteinen und interessierende Motive sind gekennzeichnet. TRT con bezeichnet eine TRT-«Consensus»-Sequenz. RT con bezeichnet «Con-sensus»-Reste bei anderen reversen Transkriptasen. «Consensus»-Reste mit Grossbuchstaben kennzeichnen absolute Konservierung in TRT-Proteinen. (two pages) shows the alignment of sequences of four TRT proteins and interesting motifs are marked. TRT con denotes a TRT “consensus” sequence. RT con denotes “con sensus” residues in other reverse transcriptases. “Consensus” remains with capital letters indicate absolute preservation in TRT proteins.

Fig. 12 Fig. 12

zeigt eine Topoisomerase Il-Spaltstelle und NFicB-Bindungsstellen-Motive in einem hTRT-Intron, wobei die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 7 (Fig. 12) entspricht. shows a topoisomerase II cleavage site and NFicB binding site motifs in an hTRT intron, the sequence shown being SEQ. ID. No. 7 (Fig. 12) corresponds.

Fig. 13 Fig. 13

(zwei Seiten) zeigt die Sequenz der DNA, die die Euplotes 123 kD-Telomerase-Proteinuntereinheit codiert (Euplotes TRT-Protein). (two pages) shows the sequence of the DNA encoding the Euplotes 123 kD telomerase protein subunit (Euplotes TRT protein).

Fig. 14 Fig. 14

zeigt die Aminosäuresequenz der Euplotes 123 kD-Telomerase-Proteinunterheit (Euplotes TRT-Protein). shows the amino acid sequence of the Euplotes 123 kD telomerase protein subunit (Euplotes TRT protein).

Fig. 15 Fig. 15

(vierzehn Seiten) zeigt die DNA- und Aminosäuresequenzen der katalytischen Untereinheit der S. pom-be-Telomerase (S. pombe-TRT). (fourteen pages) shows the DNA and amino acid sequences of the catalytic subunit of S. pom-be-telomerase (S. pombe-TRT).

Fig. 16 Fig. 16

(zwei Seiten) zeigt die hTRT-cDNA-Sequenz, wobei die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 1 entspricht. Fig. 17 (two pages) shows the hTRT cDNA sequence, the sequence shown SEQ. ID. No. 1 corresponds. Fig. 17

zeigt das hTRT-Protein, codiert durch die cDNA von Fig. 16. Die gezeigte Proteinsequenz entspricht SEQ. ID. Nr. 2. shows the hTRT protein encoded by the cDNA of Fig. 16. The protein sequence shown corresponds to SEQ. ID. No. 2.

Fig. 18 Fig. 18

zeigt die Sequenz des Clons 712562, wobei die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 3 entspricht. shows the sequence of clone 712562, the sequence shown SEQ. ID. No. 3 corresponds.

Fig. 19 Fig. 19

zeigt ein Protein mit 259 Resten, das von dem Clon 712562 codiert wird, wobei die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 10 entspricht. Figure 25 shows a 259 residue protein encoded by clone 712562, the sequence shown being SEQ. ID. No. 10 corresponds.

Fig. 20 Fig. 20

(sieben Seiten) zeigt die Sequenz einer Nucleinsäure mit einem offenen Leserahmen, die eine a182-Po-lypeptidvariante codiert, wobei die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 4 entspricht. Diese Figur zeigt auch die Aminosäuresequenz dieser Al82-Polypeptidvariante, wobei die gezeigte Aminosäuresequenz SEQ. ID. Nr. 5 entspricht. (seven pages) shows the sequence of an open reading frame nucleic acid encoding an a182-polypeptide variant, the sequence shown being SEQ. ID. No. 4 corresponds. This figure also shows the amino acid sequence of this Al82 polypeptide variant, the amino acid sequence shown SEQ. ID. No. 5 corresponds.

Fig. 21 Fig. 21

(sechs Seiten) zeigt die Sequenz eines genomischen hTRT-Clons, wobei die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 6 entspricht. «Consensus»-Motive und Elemente sind angegeben, dazu gehören auch Sequenzen, die charakteristisch sind für eine Topoisomerase Il-Spaltstelle, NFxB-Bindungsstellen, eine Alu-Sequenz und andere Sequenzelemente. (six pages) shows the sequence of a genomic hTRT clone, the sequence shown SEQ. ID. No. 6 corresponds. “Consensus” motifs and elements are given, including sequences that are characteristic of a topoisomerase II cleavage site, NFxB binding sites, an Alu sequence and other sequence elements.

Fig. 22 Fig. 22

zeigt die Auswirkung einer Mutation des TRT-Gens in Hefe, wie in Beispiel 1 beschrieben. Figure 4 shows the effect of mutating the TRT gene in yeast as described in Example 1.

Fig. 23 Fig. 23

zeigt die Sequenz von EST AA281296, die SEQ. ID. Nr. 8 entspricht. shows the sequence of EST AA281296 SEQ. ID. No. 8 corresponds.

Fig. 24 Fig. 24

zeigt die Sequenz der 182 Basenpaare, die in Clon 712562 deletiert sind, wobei die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 9 entspricht. shows the sequence of the 182 base pairs deleted in clone 712562, the sequence shown SEQ. ID. No. 9 corresponds.

Fig. 25 Fig. 25

zeigt die Ergebnisse eines Assays auf Telomerase-Aktivität von BJ-Zellen, die mit einem ein hTRT-Pro-tein codierenden Expressionsvektor (pGRN133) oder einem Kontrollplasmid (pBBS212) transfiziert wurden, wie in Beispiel 13 beschrieben. shows the results of an assay for telomerase activity from BJ cells transfected with an expression vector encoding an hTRT protein (pGRN133) or a control plasmid (pBBS212) as described in Example 13.

Fig. 26 Fig. 26

ist ein schematisches Diagramm hinsichtlich der Affinitätsreinigung von Telomerase, das die Bindungsschritte und Elutionsschritte durch Verdrängung zeigt. Figure 12 is a schematic diagram of affinity purification of telomerase showing the binding steps and elution steps by displacement.

Fig. 27 Fig. 27

ist ein Photo eines Northern-Blots von Telomerase-Präparationen, die während des in Beispiel 1 beschriebenen Reinigungsprotokolls erhalten wurden. Spur 1 enthielt 1,5 fMol Telomerase-RNA, Spur 2 4,6 fMol, Spur 3 14 fMol, Spur 4 41 fMol, Spur 5 nucleären Extrakt (42 fMol Telomerase), Spur 6 Affi-Gel-Heparin-gereinigte Telomerase (47 fMol Telomerase), Spur 7 affinitätsgereinigte Telomerase (68 fMol) und Spur 8 über Glyceringradienten gereinigte Telomerase (35 fMol). is a photo of a Northern blot of telomerase preparations obtained during the purification protocol described in Example 1. Lane 1 contained 1.5 fMol telomerase RNA, lane 2 4.6 fMol, lane 3 14 fMol, lane 4 41 fMol, lane 5 nuclear extract (42 fMol telomerase), lane 6 Affi-gel heparin-purified telomerase (47 fmol telomerase), lane 7 affinity-purified telomerase (68 fMol) and lane 8 via glycerol gradient purified telomerase (35 fMol).

7 7

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Fig. 28 Fig. 28

zeigt Telomerase-Aktivitäten während eines Reinigungsprotokolls. shows telomerase activity during a cleaning protocol.

Fig. 29 Fig. 29

ist ein Photo eines SDS-PAGE-Gels, das die Anwesenheit eines Polypeptids mit etwa 123 kD und einer 5 Dublette mit etwa 43 kD von Euplotes aediculatus zeigt. is a photo of an SDS-PAGE gel showing the presence of an approximately 123 kD polypeptide and a 5 approximately 43 kD doublet from Euplotes aediculatus.

Fig. 30 Fig. 30

ist eine Graphik, die den Sedimentationskoeffizienten von Euplotes aediculatus-Telomerase zeigt. is a graph showing the sedimentation coefficient of Euplotes aediculatus telomerase.

Fig. 31 Fig. 31

ist ein Photo eines Polyacrylamid/Harnstoff-Gels mit 36% Formamid, das die Substratverwertung von 10 Euplotes-Telomerase zeigt. is a photo of a polyacrylamide / urea gel with 36% formamide, which shows the substrate utilization of 10 Euplotes-Telomerase.

Fig. 32 Fig. 32

zeigt die vermuteten Ausrichtungen von Telomerase-RNA-Matrize und Haamadelstruktur-Primern mit Telomerase-RNA. shows the suspected alignments of telomerase RNA template and hairpin structure primers with telomerase RNA.

Fig. 33 Fig. 33

15 ist ein Photo der Spuren 25 bis 30 des in Fig. 31 gezeigten Gels mit geringerer Belichtung. 15 is a photograph of lanes 25-30 of the gel shown in FIG. 31 with lower exposure.

Fig. 34 Fig. 34

zeigt die DNA-Sequenz des Gens, das die 43 kD-Telomerase-Proteinuntereinheit von Euplotes codiert. Fig. 35 shows the DNA sequence of the gene encoding the 43 kD telomerase protein subunit of Euplotes. Fig. 35

(vier Seiten) zeigt die DNA-Sequenz sowie die Aminosäuresequenzen aller drei offenen Leserahmen 20 der 43 kD Telomerase-Proteinuntereinheit von Euplotes. (four pages) shows the DNA sequence and the amino acid sequences of all three open reading frames 20 of the 43 kD telomerase protein subunit from Euplotes.

Fig. 36 Fig. 36

zeigt einen Sequenzvergleich zwischen der 123 kD-Telomerase-Proteinuntereinheit von Euplotes (obere Sequenz) und der 80 kD-Polypeptid-Untereinheit von T. thermophila (untere Sequenz). shows a sequence comparison between the 123 kD telomerase protein subunit from Euplotes (upper sequence) and the 80 kD polypeptide subunit from T. thermophila (lower sequence).

Fig. 37 Fig. 37

25 zeigt einen Sequenzvergleich zwischen der 123 kD-Telomerase-Proteinunterheit von E. aediculatus (obere Sequenz) und dem 95 kD-Telomerase-Polypeptid von T. thermophila (untere Sequenz). 25 shows a sequence comparison between the 123 kD telomerase protein subunit from E. aediculatus (upper sequence) and the 95 kD telomerase polypeptide from T. thermophila (lower sequence).

Fig. 38 Fig. 38

zeigt die «best-fit»-Ausrichtung zwischen einem Teil der «La-Domäne» der 43 kD-Telomerase-Protein-untereinheit von E. aediculatus (obere Sequenz) und einem Teil der 95 kD-Polypeptiduntereinheit von 30 T. thermophila (untere Sequenz). shows the “best fit” alignment between a part of the “La domain” of the 43 kD telomerase protein subunit of E. aediculatus (upper sequence) and a part of the 95 kD polypeptide subunit of 30 T. thermophila (lower Sequence).

Fig. 39 Fig. 39

zeigt die «best-fit»-Ausrichtung zwischen einem Teil, der «La-Domäne» der 43 kD-Telomerase-Protein-untereinheit von E. aediculatus (obere Sequenz) und einem Teil der 80 kD-Polypeptid-Untereinheit von T. thermophila (untere Sequenz). shows the “best fit” alignment between a part, the “La domain” of the 43 kD telomerase protein subunit from E. aediculatus (upper sequence) and a part of the 80 kD polypeptide subunit from T. thermophila (lower sequence).

35 Fig. 40 35 Fig. 40

zeigt die Ausrichtung und die Motive der Polymerase-Domäne der 123 kD-Telomerase-Proteinunterein-heit von E. aediculatus und der Polymerase-Domänen von verschiedenen reversen Transkriptasen, wozu auch ein Cytochrom-Oxidase-Gruppe II Intron 1-codiertes Protein von S. cerevisiae-Mitochondrien (al S.c. (Gruppe II)) zählen, Dong (LINE) und Hefe ESTp (L8543.12). shows the alignment and motifs of the polymerase domain of the 123 kD telomerase protein subunit of E. aediculatus and the polymerase domains of various reverse transcriptases, including a cytochrome oxidase group II intron 1-encoded protein from S. cerevisiae mitochondria (al Sc (group II)) count, dong (LINE) and yeast ESTp (L8543.12).

40 Fig. 41 40 Fig. 41

zeigt die Ausrichtung einer Domäne der 43 kD Telamerase-Proteinuntereinheit mit verschiedenen La-Proteinen. shows the alignment of a domain of the 43 kD telamerase protein subunit with different La proteins.

Fig. 42 Fig. 42

zeigt die Nucleotidsequenz, die T. thermophila 80 kD-Protein-Untereinheit codiert. shows the nucleotide sequence encoding T. thermophila 80 kD protein subunit.

45 Fig. 43 45 Fig. 43

zeigt die Aminosäuresequenz der T. thermophila 80 kD-Protein-Untereinheit. shows the amino acid sequence of the T. thermophila 80 kD protein subunit.

Fig. 44 Fig. 44

zeigt die Nucleotidsequenz, die die T. thermophila 95 kD-Protein-Untereinheit codiert. shows the nucleotide sequence encoding the T. thermophila 95 kD protein subunit.

Fig. 45 Fig. 45

50 zeigt die Aminosäuresequenz der T. thermophila 95 kD Protein-Untereinheit. 50 shows the amino acid sequence of the T. thermophila 95 kD protein subunit.

Fig. 46 Fig. 46

zeigt die Aminosäuresequenz von L8543.12 («Est2p»), shows the amino acid sequence of L8543.12 («Est2p»),

Fig. 47 Fig. 47

zeigt die Ausrichtung der durch das Oxytricha PCR-Produkt codierten Aminosäuresequenz mit der Eu-55 plotes p123-Sequenz. shows the alignment of the amino acid sequence encoded by the Oxytricha PCR product with the Eu-55 plotes p123 sequence.

Fig. 48 Fig. 48

zeigt die DNA-Sequenz von Est2. shows the DNA sequence of Est2.

Fig. 49 Fig. 49

zeigt die partielle Aminogäuresequenz eines cDNA-Clons, der Peptidmotive menschlicher Telomerase 60 codiert. shows the partial amino acid sequence of a cDNA clone encoding human telomerase 60 peptide motifs.

Fig. 50 Fig. 50

zeigt die partielle DNA-Sequenz eines cDNA-Clons, der Peptidmotive menschlicher Telomerase codiert. shows the partial DNA sequence of a cDNA clone encoding human telomerase peptide motifs.

65 65

8 8th

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Fig. 51 Fig. 51

zeigt die Aminosäuresequenz von tez1, das auch als S. pombe trt bezeichnet wird. shows the amino acid sequence of tez1, also known as S. pombe trt.

Fig. 52 Fig. 52

(zwei Seiten) zeigt die DNA-Sequenz von tez1. Intron-Bereiche und andere nicht codierende Bereiche sind in Kleinbuchstaben gezeigt und Exons (d.h. codierende Bereich) sind mit Grossbuchstaben angegeben. (two pages) shows the DNA sequence of tez1. Intron areas and other non-coding areas are shown in lower case and exons (i.e. coding area) are shown in upper case.

Fig. 53 Fig. 53

zeigt die Ausrichtung- von EST2p, Euplotes und Tetrahymena-Sequenzen, sowie «Consensus»-Sequen-zen. shows the alignment of EST2p, Euplotes and Tetrahymena sequences, as well as «consensus» sequences.

Fig. 54 Fig. 54

zeigt die Sequenzen von Peptiden, die für die Herstellung von anti-hTRT-Antikörpern nützlich sind. Fig. 55 shows the sequences of peptides useful for the production of anti-hTRT antibodies. Fig. 55

ist eine schematische Zusammenfassung der tez1+-Sequenzierungsexperimente. is a schematic summary of the tez1 + sequencing experiments.

Fig. 56 Fig. 56

zeigt zwei degenerierte Primer, die in der PCR zur Identifizierung des S. pombe-Homologen zu den E. aediculatus p123-Sequenzen verwendet wurden. shows two degenerate primers that were used in the PCR to identify the S. pombe homologue to the E. aediculatus p123 sequences.

Fig. 57 Fig. 57

zeigt die vier Hauptbanden, die in der PCR mit den degenerierten Primern zur Identifizierung des S. pombe-Homologen, zu den E. aediculatus p123-Sequenzen verwendet wurden. shows the four major bands used in the PCR with the degenerate primers to identify the S. pombe homologue to the E. aediculatus p123 sequences.

Fig. 58 Fig. 58

zeigt die Ausrichtung des M2-PCR-Produkts mit E. aediculatus p123, S. cerevisiae und Oxytricha-Telo-merase-Proteinsequenzen. shows the alignment of the M2-PCR product with E. aediculatus p123, S. cerevisiae and Oxytricha telomerase protein sequences.

Fig. 59 Fig. 59

ist ein Schema, das die 3'-RT-PCR-Strategie für die Identifizierung des S. pombe-Homologen zu dem E. aediculatus p123 zeigt. Figure 3 is a diagram showing the 3 'RT-PCR strategy for the identification of the S. pombe homologue to the E. aediculatus p123.

Fig. 60 Fig. 60

zeigt Merkmale der Banken, die verwendet wurden, um nach S. pombe Telomerase-Proteinsequenz zu screenen und die Ergebnisse des Screenings. shows features of the libraries used to screen for S. pombe telomerase protein sequence and the results of the screening.

Fig. 61 Fig. 61

zeigt die positiven Ergebnisse, die mit den Hindlll-gespaltenen positiven genomischen Clonen erhalten wurden, die die S. pombe-Telomerase-Sequenz enthalten. shows the positive results obtained with the HindIII-cleaved positive genomic clones containing the S. pombe telomerase sequence.

Fig. 62 Fig. 62

ist ein Schema, das die 5'-RT-PCR-Strategie zeigt, die zum Erhalt des S. pombe TRT-Clons mit vollständiger Länge verwendet wurde. Fig. 5 is a schematic showing the 5'-RT-PCR strategy used to obtain the full length S. pombe TRT clone.

Fig. 63 Fig. 63

zeigt die Ausrichtung von RT-Domänen von katalytischen Untereinheiten von Telomerase für S. pombe (S.p.), S. cerevisiae (S.c.) und E. aediculatus (E.a.). shows the alignment of RT domains of catalytic subunits of telomerase for S. pombe (S.p.), S. cerevisiae (S.c.) and E. aediculatus (E.a.).

Fig. 64 Fig. 64

zeigt die Ausrichtung von Sequenzen von Euplotes («Ea_P123»), S. cerevisiae («Sc_Est2P») und S. pombe («Sp_Tez1p»), In Teil A kennzeichnen die schattierten Bereiche Reste, die beide Sequenzen gemeinsam haben. In Teil B bezeichnen die schattierten Bereiche Reste, die alle drei Sequenzen gemeinsam haben. shows the alignment of sequences from Euplotes («Ea_P123»), S. cerevisiae («Sc_Est2P») and S. pombe («Sp_Tez1p»). In part A, the shaded areas indicate residues that both sequences have in common. In Part B, the shaded areas indicate residues that all three sequences have in common.

Fig. 65 Fig. 65

zeigt die für die Telomerase-Gene in S. pombe verwendete Disruptionsstrategie. shows the disruption strategy used for the telomerase genes in S. pombe.

Fig. 66 Fig. 66

zeigt die experimentellen Ergebnisse, die die Disruption von tez1 bestätigen. shows the experimental results that confirm tez1's disruption.

Fig. 67 Fig. 67

zeigt die progressive Verkürzung von Telomeren in S. pombe aufgrund der Disruption von tez1. shows the progressive shortening of telomeres in S. pombe due to the disruption of tez1.

Fig. 68 Fig. 68

(vier Seiten) zeigt die DNA-Sequenz und Aminosäuresequenz des ORF, der ein Teiomerase-Protein von etwa 63 kD codiert oder ein Fragment davon, codiert von der EcoRI-Notl-lnsertion des Genbank-Clons #AA281296. (four pages) shows the DNA sequence and amino acid sequence of the ORF encoding a 63 kD teiomerase protein or a fragment thereof encoded by the EcoRI-Notl insertion of the Genbank clone # AA281296.

Fig. 69 Fig. 69

zeigt eine Ausrichtung von reverser Transkriptase-Motiven aus verschiedenen Quellen. shows an alignment of reverse transcriptase motifs from different sources.

Fig. 70 Fig. 70

ist eine Restriktionskarte und funktionelle Karte von Plasmid pGRN121. is a restriction map and a functional map of plasmid pGRN121.

Fig. 71 Fig. 71

(zwei Seiten) zeigt die Ergebnisse von vorläufigen Analysen der Nucleinsäure-Sequenzierung einer hTRTcDNA-Sequenz. (two pages) shows the results of preliminary analyzes of nucleic acid sequencing of an hTRTcDNA sequence.

Fig. 72 Fig. 72

(10 Seiten) zeigt die vorläufige Nucleinsäure von hTRT und die abgeleiteten ORF-Sequenzen in den drei Leserahmen. (10 pages) shows the preliminary nucleic acid from hTRT and the derived ORF sequences in the three reading frames.

Fig. 73 Fig. 73

ist eine Restriktionskarte und funktionelle Karte von Plasmid pGRN121. is a restriction map and a functional map of plasmid pGRN121.

9 9

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Fig. 74 Fig. 74

(8 Seiten) zeigt die verbesserte Nucleinsäuresequenz und abgeleitete ORF-Sequenzen von hTRT. (8 pages) shows the improved nucleic acid sequence and derived ORF sequences from hTRT.

Fig. 75 Fig. 75

zeigt eine Restriktionskarte des lambda-Clons 25-1.1. shows a restriction map of the lambda clone 25-1.1.

Fig. 76 Fig. 76

zeigt eine Karte der Restriktions-Stellen und Bereiche von DNA pGRN 144.4. shows a map of the restriction sites and regions of DNA pGRN 144.4.

I. Einleitung I. Introduction

Telomerase ist ein Ribonucleoproteinkomplex (RNP), der einen RNA-Bestandteil und einen katalytischen Protein-Bestandteil umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft die Clonierung und Charakterisierung des katalytischen Proteinbestandteils der Telomerase, der nachstehend «TRT» (Telomerase-re-verse-Transkriptase) bezeichnet wird. Dieses Protein wird deshalb als TRT bezeichnet, weil es als eine RNA-abhängige DNA-Polymerase arbeitet, wobei der RNA-Bestandteil der Telomerase (nachstehend mit «TR» bezeichnet) zur Steuerung der Synthese der Telomer-DNA-Wiederholungssequenzen verwendet wird. Darüber hinaus ist TRT mit anderen reversen Transkriptasen evolutionär verwandt (siehe Beispiel 12). Telomerase is a ribonucleoprotein complex (RNP) that comprises an RNA component and a catalytic protein component. The present invention relates to the cloning and characterization of the catalytic protein component of telomerase, hereinafter referred to as “TRT” (telomerase reverse transcriptase). This protein is referred to as TRT because it works as an RNA-dependent DNA polymerase, the RNA component of the telomerase (hereinafter referred to as "TR") being used to control the synthesis of the telomer DNA repeat sequences. In addition, TRT is evolutionarily related to other reverse transcriptases (see Example 12).

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Clonierung und Charakterisierung des katalytischen Proteinbestandteils der menschlichen Telomerase, die nachstehend als «hTRT» bezeichnet wird. Menschliche TRT ist deshalb von ausserordentlichem Interesse und Wert, da, wie nachstehend angemerkt, Telomerase-Aktivität in Menschen (und weiteren Säuger-Zellen) mit der Eigenschaft der Zellproliferation, Zellimmortalität und der Entwicklung eines neoplastischen Phänotyps korreliert. Beispielsweise ist in unsterblichen menschlichen Zellen (z.B. maligne Tumorzellen und unsterbliche Zellinien) die Telo-merase-Aktivität und, wie in Beispiel 2 nachstehend gezeigt, die Menge an Genprodukten menschlicher TRT gegenüber sterblichen Zellen (z.B. den meisten menschlichen somatischen Zellen) erhöht. One aspect of the present invention relates to the cloning and characterization of the catalytic protein component of human telomerase, hereinafter referred to as "hTRT". Human TRT is of exceptional interest and value because, as noted below, telomerase activity in humans (and other mammalian cells) correlates with the property of cell proliferation, cell immortality and the development of a neoplastic phenotype. For example, in immortal human cells (e.g., malignant tumor cells and immortal cell lines), telomerase activity and, as shown in Example 2 below, the amount of gene products of human TRT are increased over mortal cells (e.g., most human somatic cells).

Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren und Zusammensetzungen bereit, die zur Diagnose, Prognose und zur Behandlung von menschlichen Erkrankungen und Krankheitszuständen von Wert ist, wie dies nachstehend ausführlich beschrieben wird. Ausserdem werden Verfahren und Reagenzien zur Verfügung gestellt, die zur Immortalisierung von Zellen (in vivo und ex vivo) von Nutzen sind, wobei transgene Tiere mit erwünschten Merkmalen hergestellt werden, sowie zahlreiche weitere Verwendungsmöglichkeiten, die zum grossen Teil nachstehend beschrieben werden. Die Erfindung stellt auch Verfahren und Agenzien bereit, die für die Herstellung, die Clonierung und Re-Clonierung von TRT-Genen und -Proteinen aus Ciliaten, Pilzen, Vertebraten, beispielsweise Säugern, und anderen Organismen von Nutzen sind. The present invention further provides methods and compositions of value for the diagnosis, prognosis, and treatment of human diseases and conditions, as will be described in detail below. In addition, methods and reagents are provided that are useful for immortalizing cells (in vivo and ex vivo), producing transgenic animals with desired features, as well as numerous other uses, which are largely described below. The invention also provides methods and agents useful for the production, cloning and re-cloning of TRT genes and proteins from ciliates, fungi, vertebrates, for example mammals, and other organisms.

Wie nachstehend ausführlich beschrieben wird, wurde TRT zuerst nach Reinigung von Telomerase aus dem Ciliaten Euplotes aediculatus charakterisiert. Die umfassende Reinigung von E. aediculatus Telomerase unter Verwendung von RNA-Affinitätschromatographie und weiterer Verfahren lieferte das Protein «p123». Überraschendenweise stellte sich heraus, dass p123 mit Proteinen, von denen bisher angenommen wurde, dass sie Proteinuntereinheiten des Telomerase-Holoenzyms darstellen (d.h. die p80- und p95-Proteine von Tetrahymena thermophila) nicht verwandt ist. Die Analyse der Sequenzen der p123-DNA und des Proteins (Genbank-Zugangsnummer U95964; Fig. 13 und 14) ergab das Vorhandensein von Motiven von reverser Transkriptase (RT) , was mit der Rolle von p123 als katalytische Untereinheit der Telomerase konsistent ist (siehe z.B. Fig. 11). Darüber hinaus ist p123 mit dem Estlp-Protein aus S. cerevisiae (Hefe) verwandt, von dem bekannt war, dass es eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Telomere in S. cerevisiae spielt (Genbank-Zugangsnummer S5396). Es wurde jedoch vor der vorliegenden Erfindung nicht erkannt, dass dieses ein Protein einer katalytischen Untereinheit von Telomerase codiert (siehe beispielsbeise Lendvay et al., Genetics 144 (1996), 1399). As described in detail below, TRT was first characterized after purification of telomerase from the ciliate Euplotes aediculatus. The comprehensive purification of E. aediculatus telomerase using RNA affinity chromatography and other methods yielded the protein "p123". Surprisingly, it was found that p123 is not related to proteins previously thought to be protein subunits of the telomerase holoenzyme (i.e., the p80 and p95 proteins from Tetrahymena thermophila). Analysis of the sequences of p123 DNA and protein (Genbank accession number U95964; Figures 13 and 14) revealed the presence of reverse transcriptase (RT) motifs, consistent with the role of p123 as a catalytic subunit of telomerase (see e.g. Fig. 11). In addition, p123 is related to the S. cerevisiae (yeast) Estlp protein, which was known to play a role in the maintenance of telomeres in S. cerevisiae (Genbank accession number S5396). However, it was not recognized prior to the present invention that it encodes a protein of a telomerase catalytic subunit (see, for example, Lendvay et al., Genetics 144 (1996), 1399).

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Reagenzien und Verfahren zur Identifizierung und Clonierung neuer TRTs unter Verwendung von: Nucleinsäuresonden und Primern, die von den offenbarten TRT-Polynucleotiden erzeugt oder abgeleitet sind (z.B. zur Clonierung von TRT-Genen und cDNAs); Antikörpern, die Motive, Motivsequenzen oder andere TRT-Epitope spezifisch erkennen (z.B. zur Ex-pressionsclonierung von TRT-Genen oder zur Reinigung von TRT-Proteinen); das Screening von Com-puter-Datenbanken oder weiterer Hilfsmittel. Beispielsweise wurde die in Beispiel 1 beschriebene PCR-Amplifikation (Polymerase-Kettenreaktion) von DNA von S. pombe mit Primern mit degenerierten Sequenzen, die anhand der Euplotes p123 RT Motive B' und C entworfen wurden, ausgewählt. Von den vier erzeugten Hauptprodukten codierte eines eine Peptidsequenz, die homolog ist zur Euplotes p123 und S. cerevisiae Est2p. Die vollständige Sequenz des zur S. pombe TRT homologen Proteins wurde unter Verwendung dieses PCR-Produkts als Sonde durch Screenen von cDNA- und genomischen Banken von S. pombe und Amplifikation von S. pombe RNA durch reverse Transkription und PCR (RT-PCR) erhalten. Die vollständige Sequenz des S. pombe Gens (trt1"; Genbank-Zugangsnummer AF015783; Fig. 15) ergab, dass die Homologie zwischen p123 und Est2p in den Motiven für reverse Transkriptase besonders hoch war. One aspect of the present invention relates to reagents and methods for identifying and cloning new TRTs using: nucleic acid probes and primers that are generated or derived from the disclosed TRT polynucleotides (e.g., for cloning TRT genes and cDNAs); Antibodies that specifically recognize motifs, motif sequences or other TRT epitopes (e.g. for the expression cloning of TRT genes or for the purification of TRT proteins); the screening of computer databases or other aids. For example, the PCR amplification (polymerase chain reaction) of DNA from S. pombe described in Example 1 with primers with degenerate sequences, which were designed on the basis of the Euplotes p123 RT motifs B 'and C, was selected. Of the four main products generated, one encoded a peptide sequence that is homologous to Euplotes p123 and S. cerevisiae Est2p. The complete sequence of the protein homologous to S. pombe TRT was obtained using this PCR product as a probe by screening cDNA and genomic banks of S. pombe and amplifying S. pombe RNA by reverse transcription and PCR (RT-PCR) . The complete sequence of the S. pombe gene (trt1 "; Genbank accession number AF015783; Fig. 15) showed that the homology between p123 and Est2p was particularly high in the reverse transcriptase motifs.

Die Amplifikation unter Verwendung von degenerierten Primern, die von den Telomerase RT-Motiven abgeleitet waren, wurde auch zum Erhalt von TRT-Gensequenzen aus Oxytricha trifallax und Tretrahy-mena thermophila, wie in Beispiel 1 beschrieben, verwendet. Amplification using degenerate primers derived from the Telomerase RT motifs was also used to obtain TRT gene sequences from Oxytricha trifallax and Tretrahy-mena thermophila as described in Example 1.

10 10th

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Die erfindungsgemässen Sequenzen Euplotes p123, S. pombe trt1 und S. cerevisiae Est2p wurden bei der Suche in computerisierten Datenbanken von menschlichen exprimierten Sequenzen «tags» (ESTs) unter Verwendung des Programms «BLAST» (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403) verwendet. Die Suche in dieser Datenbank mit der Est2p-Sequenz ergab keine Übereinstimmung, ein menschliches EST (Genbank-Zugangsnummer AA281296; siehe SEQ. ID. Nr. 8) konnte jedoch wie in Beispiel 1 beschrieben durch Suche mit p123- und trtl-Sequenzen identifiziert werden. Dieses menschliche EST codiert vermutlich ein homologes Protein. Die vollständige Sequenzierung des cDNA-Clons, der das EST enthält (nachstehend als «Clon 712562» bezeichnet; siehe SEQ. ID. Nr. 3) zeigte das Vorhandensein von sieben RT-Motiven. Dieser Clon konnte jedoch ein zusammenhängendes menschliches TRT nicht codieren, da die Motive B', C, D und E im Vergleich zu den mehr NH2-terminal gelegenen Motiven in einem unterschiedlichen offenen Leserahmen (ORF) enthalten waren. Darüber hinaus war der Abstand zwischen den Motiven A und B' wesentlich geringer als bei den bereits charakterisierten TRTs. (Clon 712562 wurde von dem I.M.A.G.E.-Consortium erhalten; Lennon et al., Genomics 33 (1996), 151). The sequences Euplotes p123, S. pombe trt1 and S. cerevisiae Est2p according to the invention were searched for in computerized databases of human-expressed sequences “tags” (ESTs) using the program “BLAST” (Altschul et al., J. Mol. Biol 215 (1990), 403). The search in this database with the Est2p sequence did not result in a match, but a human EST (Genbank accession number AA281296; see SEQ. ID. No. 8) could be identified by searching with p123 and trtl sequences as described in Example 1 . This human EST is believed to encode a homologous protein. Complete sequencing of the cDNA clone containing the EST (hereinafter referred to as "clone 712562"; see SEQ. ID. No. 3) showed the presence of seven RT motifs. However, this clone could not encode a coherent human TRT, since motifs B ', C, D and E were contained in a different open reading frame (ORF) compared to the more NH2-terminal motifs. In addition, the distance between motifs A and B 'was significantly smaller than with the TRTs already characterized. (Clone 712562 was obtained from the I.M.A.G.E. Consortium; Lennon et al., Genomics 33 (1996), 151).

Der cDNA-Clon pGRN121, der ein funktionales hTRT codiert (SEQ. ID. Nr. 1) wurde aus einer cDNA-Bank isoliert, die von der humanen Zellinie 293 stammte (siehe Beispiel 1). Der Vergleich des Clons 712562 mit pGRN121 ergab, dass Clon 712562 zwischen den Motiven A und B' eine Deletion von 182 Basenpaaren (SEQ. ID. Nr. 9) aufweist. Die in pGRN121 zusätzlich vorhandenen 182 Basenpaare führen dazu, dass alle TRT-Motive in einem einzigen offenen Leserahmen vorhanden sind, und dass sich der Abstand zwischen den Bereichen des Motivs A und des Motivs B' so vergrössert, dass dies konsistent ist mit dem Abstand bei anderen bekannten TRTs. Wie nachstehend in den Beispielen beschrieben (z.B. Beispiel 7) codiert SEQ. ID. Nr. 1 ein katalytisch aktives Teiomerase-Protein mit der Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2. Das Polypeptid von SEQ. ID. Nr. 2 weist 1132 Aminosäuren und ein geschätztes Molekulargewicht von etwa 127 Kilodaltons (kD) auf. The cDNA clone pGRN121, which encodes a functional hTRT (SEQ. ID. No. 1), was isolated from a cDNA library which originated from the human cell line 293 (see Example 1). Comparison of clone 712562 with pGRN121 showed that clone 712562 has a deletion of 182 base pairs between motifs A and B '(SEQ. ID. No. 9). The additional 182 base pairs in pGRN121 mean that all TRT motifs are present in a single open reading frame and that the distance between the areas of motif A and motif B 'increases so that this is consistent with the distance at other known TRTs. SEQ encodes as described below in the examples (e.g. example 7). ID. No. 1 a catalytically active Teiomerase protein with the sequence of SEQ. ID. No. 2. The polypeptide from SEQ. ID. No. 2 has 1132 amino acids and an estimated molecular weight of about 127 kilodaltons (kD).

Wie nachstehend diskutiert und in Beispiel 9 beschrieben, werden die für den Clon 712562 charakteristische Deletion von 182 Basenpaaren aufweisende TRT-cDNAs im Anschluss an die reverse Transkription von mRNA aus Telomerase-positiven Zellen (z.B. Testes- und 293-Zellen) nachgewiesen. hTRT-RNAs, denen diese Sequenz von 182 Basenpaaren fehlt, werden allgemein als «al82-Varianten» bezeichnet und diese können eine, zwei oder mehrere Spezies repräsentieren. Die hTRT-Varianten, denen die in der pGRN121-cDNA (SEQ. ID. Nr. 1) gefundene Sequenz von 182 Basenpaaren fehlt, codieren zwar höchstwahrscheinlich kein Telomerase-Enzym mit vollständiger katalytischer Aktivität, sie können jedoch eine Rolle bei der Telomerase-Regulation, wie nachstehend beschrieben, spielen und/oder partielle Telomerase-Aktivität aufweisen, beispielsweise eine Aktivität für die Telomer-Bindung oder hTR-Bindung, wie nachstehend diskutiert. As discussed below and described in Example 9, the 182 base pair deletion of TRT cDNAs characteristic of clone 712562 is detected following reverse transcription of mRNA from telomerase positive cells (e.g. Testes and 293 cells). hTRT-RNAs that lack this sequence of 182 base pairs are commonly referred to as "al82 variants" and can represent one, two or more species. The hTRT variants, which lack the 182 base pair sequence found in the pGRN121 cDNA (SEQ. ID. No. 1), most likely do not encode a telomerase enzyme with complete catalytic activity, but they can play a role in telomerase regulation , as described below, and / or have partial telomerase activity, for example telomer binding or hTR binding activity, as discussed below.

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht somit in der Bereitstellung eines isolierten Polynucleotids mit einer Sequenz eines natürlich vorkommenden menschlichen TRT-Gens oder einer mRNA, wobei ein Polynucleotid mit der Sequenz von SEQ. ID. Nr. 1 eingeschlossen ist, allerdings ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Ein verwandter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung eines Polynucleotids, das ein hTRT-Protein codiert, ein Fragment, eine Variante oder ein Derivat. Ein weiterer verwandter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung von «sense»- und «an-tisense»-Nucleinsäuren, die an ein hTRT-Gen oder mRNA binden. Die vorliegende Erfindung stellt ferner hTRT-Proteine bereit, die entweder synthetisiert oder von natürlichen Quellen gereinigt wurden, sowie Antikörper und weitere Agenzien, die spezifisch ein hTRT-Protein oder ein Fragment davon binden. Die vorliegende Erfindung stellt auch viele neue Verfahren bereit, zu denen Verfahren gehören, die die vorstehend erwähnten Zusammensetzungen verwenden, beispielsweise durch Bereitstellung von diagnostischen und prognostischen Assays bezüglich menschlicher Erkrankungen, Verfahren zur Entwicklung von Arzneimitteln und therapeutischen Verfahren, zur Identifizierung von Telomerase-assoziierten Proteinen und Verfahren zum Screenen nach Agenzien, die Telomerase-Aktivität aktivieren oder hemmen können. Zahlreiche weitere Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nachstehend bereitgestellt. One aspect of the present invention is thus to provide an isolated polynucleotide with a sequence of a naturally occurring human TRT gene or an mRNA, a polynucleotide with the sequence of SEQ. ID. No. 1 is included, but is not limited to this. A related aspect of the present invention relates to the provision of a polynucleotide encoding an hTRT protein, a fragment, a variant or a derivative. Another related aspect of the present invention relates to the provision of “sense” and “anisense” nucleic acids that bind to an hTRT gene or mRNA. The present invention further provides hTRT proteins that are either synthesized or purified from natural sources, as well as antibodies and other agents that specifically bind an hTRT protein or a fragment thereof. The present invention also provides many new methods, including methods using the above-mentioned compositions, for example by providing diagnostic and prognostic assays for human diseases, methods of drug development and therapeutic methods, of identification of telomerase-associated proteins and methods of screening for agents that can activate or inhibit telomerase activity. Numerous other aspects and embodiments of the present invention are provided below.

Ein Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Polynucleotids, das eine Länge von etwa 10 kb oder mehr aufweist, und eine aufeinanderfolgende Sequenz von mindestens 10 Nucleotiden umfasst, die zu einer aufeinanderfolgenden Sequenz in einem natürlich vorkommenden hTRT-Gen oder einer hTRT-mRNA identisch oder genau komplementär ist zum Untersuchen oder dem Screenen (nach) einer hTRT-Gensequenz oder einer hTRT-mRNA oder zur Herstellung einer rekombinanten Wirtszelle. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Agens, das die Expression von hTRT erhöht, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Zustands, der durch die Erhöhung der Proliferationskapazität einer Vertebratenzelle behandelt wird, wobei gegebenenfalls das Arzneimittel zur Hemmung der Auswirkungen des Alterns verwendet wird. One aspect of the invention is the use of a polynucleotide that is approximately 10 kb or more in length and comprises a sequential sequence of at least 10 nucleotides that is identical or identical to a sequential sequence in a naturally occurring hTRT gene or hTRT mRNA is exactly complementary to examining or screening (for) an hTRT gene sequence or an hTRT mRNA or for producing a recombinant host cell. Another aspect of the invention is the use of an agent that increases the expression of hTRT in the manufacture of a medicament for the treatment of a condition treated by increasing the proliferation capacity of a vertebrate cell, optionally using the medicament to inhibit the effects of aging .

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines Inhibitors von Telomerase-Aktivität bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Zustands, der mit einem erhöhten Spiegel an Telomerase-Aktivität innerhalb einer menschlichen Zelle assoziiert ist. Die erfindungsgemässen Proteine, Varianten und Fragmente und die codierenden Polynucleotide oder Fragmente, werden auch in einem weiteren Aspekt dieser Erfindung zur Verwendung als Arzneimittel bereitgestellt. Another aspect of the invention relates to the use of an inhibitor of telomerase activity in the manufacture of a medicament for the treatment of a condition associated with an increased level of telomerase activity within a human cell. The proteins, variants and fragments according to the invention and the coding polynucleotides or fragments are also provided in a further aspect of this invention for use as a medicament.

Die Erfindung betrifft ferner die Venwendung eines Proteins, einer Variante oder eines Fragments davon oder eines Polynucleotids oder Fragments, wie hier definiert, bei der Herstellung eines Medika- The invention further relates to the use of a protein, a variant or a fragment thereof or a polynucleotide or fragment, as defined here, in the manufacture of a medicament.

11 11

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

ments, beispielsweise bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung eines Effekts des Alterns oder von Krebs. ment, for example in the manufacture of a medicament for inhibiting an effect of aging or cancer.

In bestimmten erfindungsemässen Ausführungsformen sind die hTRT-Polynucleotide nicht das Polynucleotid mit 389 Nucleotiden von SEQ. ID. Nr. 8 und/oder nicht Clon 712562, das Plasmid, das eine Insertion enthält mit der Sequenz von SEQ. ID. Nr. 3 in Fig. 18. In certain embodiments of the invention, the hTRT polynucleotides are not the 389 nucleotide polynucleotide of SEQ. ID. No. 8 and / or not clone 712562, the plasmid containing an insert with the sequence of SEQ. ID. No. 3 in Fig. 18.

Die nachstehende Beschreibung ist nach Themen aufgebaut. Teil II beschreibt weitere für TRT-Pro-teine charakteristische Aminosäuremotive. Die Teile III bis VI beschreiben unter anderem Nucleinsäuren, Proteine, Antikörper und gereinigte Zusammensetzungen der Erfindung, wobei der Schwerpunkt auf mit menschlicher TRT verwandten Zusammensetzungen liegt. Teil VII beschreibt unter anderem Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung, die zur Behandlung von menschlichen Erkrankungen von Nutzen sind. Teil VIII beschreibt die Herstellung und Identifizierung von immortalisierten menschlichen Zelli-nien. Teil IX beschreibt unter anderem die Verwendung der erfindungsgemässen Nucleinsäuren, Polynucleotide und weiterer Zusammensetzungen zur Diagnose von menschlichen Erkrankungen. Teil X ist ein Glossar der in den Teilen I bis IX verwendeten Bezeichnungen. Teil XI beschreibt Beispiele, die sich auf spezifische erfindungsgemässe Ausführungsformen beziehen. Die Beschreibung der Erfindung ist nach Themen und Unterthemen gegliedert, um den Stoff verständlicher zu machen, stellt jedoch in keiner Weise eine Einschränkung dar. The description below is organized by topic. Part II describes further amino acid motifs that are characteristic of TRT proteins. Parts III to VI describe, among other things, nucleic acids, proteins, antibodies and purified compositions of the invention, with a focus on compositions related to human TRT. Part VII describes, among other things, methods and compositions of the invention that are useful for the treatment of human diseases. Part VIII describes the production and identification of immortalized human cells. Part IX describes, among other things, the use of the nucleic acids, polynucleotides and other compositions according to the invention for the diagnosis of human diseases. Part X is a glossary of terms used in Parts I to IX. Part XI describes examples which relate to specific embodiments according to the invention. The description of the invention is structured according to topics and subtopics in order to make the subject more understandable, but is in no way a limitation.

II. TRT-Gene und Proteine II. TRT genes and proteins

Die vorliegende Erfindung stellt isolierte und/oder rekombinante Gene und Proteine bereit, die eine Sequenz einer katalytischen Untereinheit des Telomerase-Proteins (d.h. Telomerase-reverse-Tran-skriptase) aufweisen, wozu, allerdings ohne Beschränkung darauf, die natürlich vorkommenden Formen solcher Gene und Proteine in isolierter oder rekombinanter Form gehören. Typischenweise sind TRTs grosse, basische Proteine mit für reverse Transkriptase (RT) und Telomerase-spezifischen Aminosäuremotiven, so wie dies hier offenbart ist. Da diese Motive innerhalb unterschiedlicher Organismen konserviert sind, könnnen TRT-Gene zahlreiche Organismen unter Verwendung der erfindungsgemässen Verfahren oder unter Verwendung erfindungsgemässer Primer, Nucleinsäuresonden und Antikörpern, beispielsweise solcher, die für ein oder mehrere der Motivsequenzen spezifisch sind, erhalten werden. The present invention provides isolated and / or recombinant genes and proteins having a sequence of a catalytic subunit of the telomerase protein (ie, telomerase reverse trans-scriptase), including, but not limited to, the naturally occurring forms of such genes and Proteins include in isolated or recombinant form. Typically, TRTs are large, basic proteins with amino acid motifs specific for reverse transcriptase (RT) and telomerase, as disclosed here. Since these motifs are conserved within different organisms, TRT genes can be obtained from numerous organisms using the methods according to the invention or using primers, nucleic acid probes and antibodies according to the invention, for example those which are specific for one or more of the motif sequences.

Die sieben in TRTs gefundenen RT-Motive ähneln zwar den in anderen reversen Transkriptasen gefundenen, weisen jedoch besondere Kennzeichen auf. Beispielsweise gibt es innerhalb der TRT-RT-Mo-tive wie in Fig. 4 gezeigt, eine Reihe von Aminosäuresubstitutionen (mit Pfeil markiert) in Aminosäureresten, die innerhalb der anderen RTs hoch konserviert sind. Beispielsweise kommen die zwei Asparagin-säurereste (DD) im Motiv C, die die Metallionen im aktiven Zentrum koordinieren (siehe Kohlstaedt et al., Science 256 (1992), 1783; Jacobo-Molina et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 90 (1993), 6320; Patel et al., Biochemistry 34 (1995), 5351) in dem Kontext hxDD(F/Y) in den RTs von Telomerase vor, während diese in den anderen RTs im Kontext (F/Y)xDDh vorkommen, wobei h eine hydrophobe Aminosäure ist und «x» eine beliebige Aminosäure ist; siehe Xiong et al., EMBO J. 9 (1990) 3353; Eickbush, in The Evolutionary Biology of Viruses (S. Morse Herausg. Raven-Press, NY, S. 121 (1994». Weitere für die TelomeraseUntergruppen charakteristische systematische Austausche kommen in dem Motiv E vor, in dem WxGxSx eine «Consensus»Sequenz darstellt oder innerhalb der Telomerase-Proteine konserviert ist, während hLGxxh für andere RTs charakteristisch ist (Xiong et al., a.a.0; Eickbush, a.a.O.) Dieses Motiv E wird als der «Primer-Griff» (primer-grip) bezeichnet und es wurde beschrieben, dass Mutationen in diesem Bereich das «RNA-Priming» beeinflussen, jedoch nicht das «DNA-Priming» (Powell et al., J. Biol. Chem. 272 (1997), 13262). Da Telomerasen einen DNA-Primer, (z.B. das 3'-Ende des Chromosoms) benötigen, ist es nicht überraschend, dass sich Telomerase von anderen RTs im Bereich des «Primer-Griffs» unterscheidet. Darüber hinaus ist die Entfernung zwischen den Motiven A und B7 in den TRTs grösser wie dies typischerweise in den anderen RTs der Fall ist, wobei dies eine Insertion innerhalb des «Finger»-Bereichs der Struktur, die einer rechten Hand ähnelt, darstellen kann (Fig. 3; siehe Kohlstaedt et al., a.a.O.; Jacobo-Molina et al., a.a.O.; und Patel et al., a.a.O.). The seven RT motifs found in TRTs are similar to those found in other reverse transcriptases, but have special characteristics. For example, within the TRT-RT motifs, as shown in Figure 4, there are a number of amino acid substitutions (marked with an arrow) in amino acid residues that are highly conserved within the other RTs. For example, there are the two aspartic acid residues (DD) in motif C that coordinate the metal ions in the active center (see Kohlstaedt et al., Science 256 (1992), 1783; Jacobo-Molina et al., Proc. Nati. Acad. Sei USA 90 (1993), 6320; Patel et al., Biochemistry 34 (1995), 5351) in the context hxDD (F / Y) in the RTs of telomerase, while this in the other RTs in context (F / Y ) xDDh occur, where h is a hydrophobic amino acid and «x» is any amino acid; see Xiong et al., EMBO J. 9 (1990) 3353; Eickbush, in The Evolutionary Biology of Viruses (S. Morse ed. Raven-Press, NY, p. 121 (1994 ». Further systematic exchanges characteristic of the telomerase subgroups occur in the motif E, in which WxGxSx represents a« consensus »sequence or is conserved within the telomerase proteins while hLGxxh is characteristic of other RTs (Xiong et al., supra; Eickbush, supra). This motif E is referred to as the "primer grip" and has been described that mutations in this area influence "RNA priming", but not "DNA priming" (Powell et al., J. Biol. Chem. 272 (1997), 13262). Since telomerases are a DNA primer, ( it is not surprising that telomerase differs from other RTs in the area of the "primer handle". In addition, the distance between motifs A and B7 in the TRTs is larger as is typically the case is the case in the other RTs, where d This can represent an insertion within the "finger" area of the structure, which resembles a right hand (Fig. 3; see Kohlstaedt et al., op. cit .; Jacobo-Molina et al., Op. Cit .; and Patel et al., op. cit.).

Weiterhin ist das T-Motiv, wie vorstehend erwähnt, ein zusätzliches Kennzeichen von TRT-Proteinen. Das beispielsweise in der Fig. 4 gezeigte T-Motiv (W-L-X-Y-X-X-h-h-X-h-h-X-p-F-F-Y-X-T-E-X-p-X-X-X-p-X-X-X-Y-X-R-K-X-X-W, wobei X eine beliebige Aminosäure ist, h hydrophob und p polar ist) umfasst eine Sequenz, die unter Verwendung der folgenden Formel beschrieben werden kann: Furthermore, the T motif, as mentioned above, is an additional characteristic of TRT proteins. For example, the T motif shown in Fig. 4 (W-L-X-Y-X-X-h-h-X-h-h-X-p-F-F-Y-X-T-E-X-p-X-X-X-p-X-X-X-Y-X-R-K-X-X-W, where X is any amino acid, includes the following, can be described using the following: h being hydrophobic and p polar, polar

T rp-R,-X7-R, -R, -R2-X-Phe-Phe-T yr-X-Thr-GIu -X j.9-Rj-R3-Arg-Rj-Xj-T rp wobei X eine beliebige Aminosäure ist und die tiefgestellte Zahl sich auf eine Zahl von aufeinanderfolgenden Resten bezieht, Ri Leucin oder Isoleucin ist, R2 Glutamin oder Arginin, R3 Phenylalanin oder Tyrosin und R4 Lysin oder Histidin ist. T rp-R, -X7-R, -R, -R2-X-Phe-Phe-T yr-X-Thr-GIu -X j.9-Rj-R3-Arg-Rj-Xj-T rp where X is any amino acid and the subscript refers to a number of consecutive residues, Ri is leucine or isoleucine, R2 is glutamine or arginine, R3 is phenylalanine or tyrosine and R4 is lysine or histidine.

Das T-Motiv kann auch unter Verwendung der folgenden Formel beschrieben werden: The T-motif can also be described using the following formula:

12 12th

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Trp-R,-X4-h-h-X-h-h-Rrp-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu- Trp-R, -X4-h-h-X-h-h-Rrp-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-

X-p-X3-p-X3.3- Rj-Rj-Arg-Rj-Xj-Trp wobei X eine beliebige Aminosäure ist und sich eine tiefgestellte Zahl auf eine Anzahl von aufeinanderfolgenden Resten bezieht, Ri Leucin oder Isoleucin ist, R2 Glutamin oder Arginin, R3 Phenylalanin oder Tyrosin, R4 Lysin oder Histidin, h eine hydrophobe Aminosäure ausgewählt als Ala, Leu, Ile, Val, Pro, Phe, Trp, und Met und p eine polare Aminosäure ausgewählt als Gly, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn und Gin ist. Xp-X3-p-X3.3-Rj-Rj-Arg-Rj-Xj-Trp where X is any amino acid and a subscript refers to a number of consecutive residues, Ri is leucine or isoleucine, R2 is glutamine or arginine , R3 phenylalanine or tyrosine, R4 lysine or histidine, h a hydrophobic amino acid selected as Ala, Leu, Ile, Val, Pro, Phe, Trp, and Met and p a polar amino acid selected as Gly, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn and Gin is.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung isolierte, natürlich vorkommende und rekombinante TRT-Proteine bereit, die eines oder mehrere der in Fig. 11 dargestellten Motive umfassen, beispielsweise, In a further embodiment, the present invention provides isolated, naturally occurring and recombinant TRT proteins that comprise one or more of the motifs shown in FIG. 11, for example,

Motif T Motif T

w-x12-ffy-x-te-x1(vi rr-x,-w-x7-i w-x12-ffy-x-te-x1 (vi rr-x, -w-x7-i

Motif r e-x2-v-x Motif r e-x2-v-x

Motif 1 Motif 1

x3-r-x2-pk-x3 x3-r-x2-pk-x3

Motif 2 Motif 2

x-r-x-r-x x-r-x-r-x

Motif A Motif A

x,-f-x3-d-x4-yd-x2 x, -f-x3-d-x4-yd-x2

Motif B' Motif B '

y-x,-g-x2-qg-x3-s-x, y-x, -g-x2-qg-x3-s-x,

Motif C Motif C

x6-dd-x-l-x3 x6-dd-x-l-x3

Wenn das gezeigte TRT-Protein mehr als ein TRT-Motiv enthält, ist die Reihenfolge (NH2-+COOH) wie in Fig. 4 gezeigt. If the TRT protein shown contains more than one TRT motif, the order (NH2- + COOH) is as shown in FIG. 4.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung isolierte, natürlich vorkommende TRT-Proteine bereit, die folgendes Supermotiv umfassen: In another embodiment, the present invention provides isolated, naturally occurring TRT proteins that include the following super motif:

(nh2)-x300«o-w-x,2-ffy-x-te-xi0.irr-x3-w-x7-i-x,.20-e-x2-v-x-x5.20-x,-r-x2-pk-x4.,0-r-x-i-x-x60.i0-x«-f-xj-d-x4-yd-x;-xi0.130-y-x4-g-x2-qg-x,-s-xi-xj.3j- (nh2) -x300 «owx, 2-ffy-x-te-xi0.irr-x3-w-x7-ix, .20-e-x2-vx-x5.20-x, -r-x2-pk- x4., 0-rxix-x60.i0-x «-f-xj-d-x4-yd-x; -xi0.130-y-x4-g-x2-qg-x, -s-xi-xj. 3y

x6-dd-x-l-x3-x10.20-x12-k x6-dd-x-l-x3-x10.20-x12-k

Es ist für den Fachmann, der über die hier offenbarten Reagenzien, einschliesslich der TRT-Sequen-zen verfügt, offensichtlich, dass mit diesen Reagenzien und den hier bereitgestellten Verfahren und Lehren (einschliesslich spezifischer nachstehend beschriebenen Verfahrensweisen) TRT-Gene und -Proteine vom Fachmann erhalten, isoliert und in rekombinanter Form hergestellt werden können. Beispielsweise werden Primer (z.B. degenerierte Amplifikationsprimer) bereitgestellt, die mit Gensequenzen hybridisieren, die für TRT charakteristische RT- und T-Motive codieren. Beispielsweise können einer oder mehrere Primer oder degenerierte Primer hergestellt werden, die mit Sequenzen hybridisieren, die den FFYXTE-Bereich des T-Motivs, weitere TRT-Motive (wie nachstehend diskutiert) oder Kombinationen von Motiven oder «Consensus»-Sequenzen codieren, basierend auf der Codon-Verwendung des Zielorganismus, und zur Amplifikation der TRT-Gensequenz aus genomischer DNA oder cDNA, die von dem Zielorganismus hergestellt wurde, verwendet werden. Die Verwendung von degenerierten Primern ist auf dem Fachgebiet gut bekannt. Dazu gehören auch Primersätze, die mit dem Satz von Nucleinsäure-sequenzen hybridisieren, die möglicherweise die Aminosäuren des Zielmotivs codieren. Dabei muss die Bevorzugung und Verwendung bestimmter Codons innerhalb des Zielorganismus in Erwägung gezogen werden. Dabei werden auch Amplifikations- (z.B. PCR)-Bedingungen angewandt, die geeignet sind, Fehlpaarungen von Basen bei den Anlagerungsschritten der PCR zu erlauben. Typischerweise werden zwei Primer verwendet, Amplifikationssysteme mit einem einzigen Primer (oder in diesem Fall ein Satz mit einem einzelnen degenerierten Primer) sind allgemein bekannt, und diese können auch zum Erhalt von TRT-Genen verwendet werden. It will be apparent to those skilled in the art having the reagents disclosed herein, including the TRT sequences, that with these reagents and the methods and teachings provided herein (including specific procedures described below), those skilled in the art will have TRT genes and proteins obtained, isolated and can be prepared in recombinant form. For example, primers (e.g., degenerate amplification primers) are provided that hybridize to gene sequences that encode RT and T motifs characteristic of TRT. For example, one or more primers or degenerate primers that hybridize to sequences encoding the FFYXTE region of the T motif, other TRT motifs (as discussed below), or combinations of motifs or "consensus" sequences can be made based on the codon usage of the target organism, and to amplify the TRT gene sequence from genomic DNA or cDNA produced by the target organism. The use of degenerate primers is well known in the art. This also includes primer sets that hybridize to the set of nucleic acid sequences that may encode the amino acids of the target. The preference and use of certain codons within the target organism must be considered. Amplification (e.g. PCR) conditions are also used, which are suitable to allow base mismatches during the PCR attachment steps. Typically two primers are used, amplification systems with a single primer (or in this case a set with a single degenerate primer) are well known and can also be used to obtain TRT genes.

Tabelle 1 zeigt Beispiele von erfindungsgemässen Primern, die zur Amplifikation neuer TRT-Nuclein-säuren, insbesondere solchen aus Vertebraten (z.B. Säuger), verwendet werden können. «N» ist ein äquimolares Gemisch aller vier Nucleotide und Sequenzen in Klammern stellen äquimolare Gemische der angegebenen Nucleotide dar. Table 1 shows examples of primers according to the invention which can be used for the amplification of new TRT nucleic acids, in particular those from vertebrates (e.g. mammals). “N” is an equimolar mixture of all four nucleotides and sequences in brackets represent equimolar mixtures of the specified nucleotides.

13 13

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Tabelle 1 Table 1

BEISPIELE DEGENERIERTER PRIMER ZUR AMPLIFIKATION VON TRT- EXAMPLES OF DEGENERATED PRIMERS FOR AMPLIFICATING TRT

NUCLEINSÄUREN NUCLEIC ACIDS

Motiv Richtung g'-Sequenz-3' Motif direction g'-sequence-3 '

a FFYVTE Vorwärts TT (CT)TT(CT)T A(CT)GTNACNGA b FFYVTE Rückwärts TCNGTNAC(GA)TA(GA)AA(GA)AA a FFYVTE forward TT (CT) TT (CT) T A (CT) GTNACNGA b FFYVTE reverse TCNGTNAC (GA) TA (GA) AA (GA) AA

c RFIEKP Vorwärts (CA)GNTT(CT)AT(ACT)CCNAA(AG)CC d RFIEKP Rückwärts GG(TC)TTNGG(T G A) AT(G A) AANC c RFIEKP Forward (CA) GNTT (CT) AT (ACT) CCNAA (AG) CC d RFIEKP Backward GG (TC) TTNGG (T G A) AT (G A) AANC

e AYPTI Vorwärts GCNTA(CT)GA(CT)ACNAT f A YD TT Rückwärts TANGT(GA)TC(GA)TANGC e AYPTI Forward GCNTA (CT) GA (CT) ACNAT f A YD TT Backward TANGT (GA) TC (GA) TANGC

g GIPQG Vorwärts GGNAT(ACT)CCNCA(AG)GG h Ql?QQS Rückwärts (GC)(AT)NCC(TC)TGNGG(TGA)ATNCC g GIPQG Forward GGNAT (ACT) CCNCA (AG) GG h Ql? QQS Backward (GC) (AT) NCC (TC) TGNGG (TGA) ATNCC

i LVDDFL Vorwärts (CT)TNGTNGA(CT)GA(CT)TT(CT)(CT)T j ÜDFLLVT Rückwärts GTNACNA(GA)NA(GA)(GA)AA(GA)TC(GA)TC i LVDDFL Forward (CT) TNGTNGA (CT) GA (CT) TT (CT) (CT) T j ÜDFLLVT Reverse GTNACNA (GA) NA (GA) (GA) AA (GA) TC (GA) TC

Erlaubte Primer-Kombinationen (y = ja, n = nein) Allowed primer combinations (y = yes, n = no)

Rückwärts Backward

Vorwärts h Forward h

d f d f

h i Hi

a - a -

n y n y

y y y y

y c - y c -

n n n n

y y y y

y e - y e -

n n n n

n y n y

y g- y g-

n n n n

n n n n

y i - y i -

n n n n

n n n n

n n

In einer Ausführungsform wird eine amplifizierte TRT-Nucleinsäure als Hybridisierungssonde zur Kolo-nie-Hybridisierung mit einer Genbank (z.B. einer cDNA-Bank), die aus dem Zielorganismus hergestellt wurde, verwendet, wobei eine Nucleinsäure mit der das gesamte TRT-Protein oder einen wesentlichen Anteil davon codierende Sequenz identifiziert und isoliert oder cloniert wird. Reagenzien und Verfahren, wie beispielsweise die gerade beschriebenen, werden in Übereinstimmung mit den hier beschriebenen Verfahren zum Erhalt von TRT-Gensequenzen aus Oxytricha trifallax und Tetrahymena thermophila, wie In one embodiment, an amplified TRT nucleic acid is used as a hybridization probe for colonic hybridization with a gene bank (eg a cDNA bank) that has been produced from the target organism, a nucleic acid with which all or a substantial part of the TRT protein Part of the coding sequence is identified and isolated or cloned. Reagents and methods, such as those just described, are used in accordance with the methods described herein for obtaining TRT gene sequences from Oxytricha trifallax and Tetrahymena thermophila, such as

14 14

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

nachstehend ausführlich beschrieben, verwendet. Natürlich kann im Anschluss an die Clonierung eines bisher nicht charakterisierten TRT-Gens die Sequenz durch Routineverfahren bestimmt und das codierte Polypeptid synthetisiert und auf eine TRT-Aktivität, beispielsweise der katalytischen Aktivität von Telomerase, untersucht werden (wie hier beschrieben und/oder mittels auf dem Fachgebiet bekannter Telo-merase-Assays). described in detail below. Of course, following the cloning of a previously uncharacterized TRT gene, the sequence can be determined by routine methods and the encoded polypeptide synthesized and examined for TRT activity, for example the catalytic activity of telomerase (as described here and / or by means of the Specialty of known telomerase assays).

Es ist für den Fachmann auch offensichtlich, dass TRT-Gene unter Verwendung einer Vielzahl von erfindungsgemässen Clonierungsverfahren cloniert werden können, da die TRT-Motivsequenzen und die solche Sequenzen umfassenden erfindungsgemässen Nucleinsäuren in einer grossen Anzahl solcher Verfahren verwendet werden können. Beispielsweise kann Hybridisierung unter Verwendung einer Sonde, die auf der Sequenz einer bekannten TRT basiert mit DNA- oder weiteren Nucleinsäure-Banken aus dem Zielorganismus, wie in Beispiel 1 beschrieben, verwendet werden. Degenerierte PCR-Primer oder ihre Amplifikationsprodukte, beispielsweise die vorstehend beschriebenen, können selbst markiert sein und als Hybridisierungssonden verwendet werden. In einer weiteren Ausführungsform werden Expressi-onsclonierungs-Verfahren angewandt. Beispielsweise können einer oder mehrere Antikörper, die Peptide spezifisch binden, die ein TRT-Motiv oder ein anderes TRT-Epitop umspannen, beispielsweise das FFYXTE-Motiv (wobei X eine beliebige der 20 Standard-Aminosäuren darstellt) spezifisch binden, zur Isolation eines ribosomalen Komplexes verwendet werden, der ein TRT-Protein und die dieses codierende mRNA umfasst. Zur Herstellung der erfindungsgemässen Antikörper weisen die Peptid-Immuno-gene typischerweise eine Länge von 6 bis 30 Aminosäuren auf, bevorzugt 10 bis 20 Aminosäuren. Die Antikörper können auch zum Absuchen einer cDNA-Expressionsbank, die von dem gewünschten Organismus stammt, zur Identifikation eines eine TRT-Sequenz codierenden Clons verwendet werden. In einer weiteren Ausführungsform können zur Identifikation eines eine TRT-Sequenz codierten Clons DNA-Datenbanken per Computer nach DNAs durchsucht werden, die innerhalb bekannter TRTs konservierte Sequenzen enthalten. It is also obvious to the person skilled in the art that TRT genes can be cloned using a large number of cloning methods according to the invention, since the TRT motif sequences and the nucleic acids according to the invention comprising such sequences can be used in a large number of such methods. For example, hybridization using a probe based on the sequence of a known TRT with DNA or other nucleic acid libraries from the target organism as described in Example 1 can be used. Degenerate PCR primers or their amplification products, for example those described above, can themselves be labeled and used as hybridization probes. In a further embodiment, expression cloning methods are used. For example, one or more antibodies that specifically bind peptides that span a TRT motif or other TRT epitope, such as specifically bind the FFYXTE motif (where X represents any of the 20 standard amino acids), can be used to isolate a ribosomal complex can be used which comprises a TRT protein and the mRNA encoding it. To produce the antibodies according to the invention, the peptide immunogens typically have a length of 6 to 30 amino acids, preferably 10 to 20 amino acids. The antibodies can also be used to screen a cDNA expression bank derived from the desired organism to identify a clone encoding a TRT sequence. In a further embodiment, in order to identify a clone encoding a TRT sequence, DNA databases can be searched by computer for DNAs which contain conserved sequences within known TRTs.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung von Zusammensetzungen, die ein isoliertes oder rekombinantes Polypeptid mit der Sequenz eines natürlich vorkommenden TRT-Proteins umfassen. Üblicherweise hat die natürlich vorkommende TRT ein Molekulargewicht zwischen etwa 80 000 Daltons (d) und etwa 150 000 d, bevorzugt zwischen etwa 95 000 d und etwa 130 000 d. Typischerweise hat die natürlich vorkommende TRT bei einem pH-Wert von 7 eine positive Gesamtladung (wobei der geschätzte pl typischerweise über 9 liegt). In einer Ausführungsform weist das Polypeptid eine wie hier definierte Telomerase-Aktivität auf. In einer verwandten Ausführungsform weist das Polypeptid eine Sequenz für einen TRT-spezifischen Bereich (T-Motiv) auf und eine Telomerase-Aktivi-tät. Die Erfindung stellt ferner Fragmente solcher Polypeptide bereit. Die vorliegende Erfindung stellt ausserdem isolierte oder rekombinante Polynucleotide mit der Sequenz eines natürlich vorkommenden, ein TRT-Protein codierenden Gens bereit. Die Erfindung stellt auch isolierte TRT-Polynucleotide mit einer Sequenz einer TRT eines Nicht-Vertebraten (z.B. von Hefe) und Vertebraten, beispielsweise Säugern (z.B. Mäusen oder Menschen) bereit. Die isolierten Polynucleotide können mit anderen natürlich vorkommenden oder Vektor-Nucleinsäuresequenzen assoziiert sein. Typischerweise liegt die Länge der isolierten Nucleinsäure unter etwa 300 kb, bevorzugt unter etwa 50 kb, mehr bevorzugt unter etwa 20 kb und am meisten bevorzugt unter etwa 10 kb. Gelegentlich liegt die Länge unter etwa 5 kb oder 2 kb. In einigen Ausführungsformen ist das isolierte TRT-Polynucleotid sogar noch kleiner, beispielsweise handelt es sich dabei um ein Genfragment, einen Primer oder eine Sonde mit einer Länge unter etwa 1 kb oder 0,1 kb. Another aspect of the present invention relates to the provision of compositions comprising an isolated or recombinant polypeptide having the sequence of a naturally occurring TRT protein. Typically, the naturally occurring TRT has a molecular weight between about 80,000 daltons (d) and about 150,000 d, preferably between about 95,000 d and about 130,000 d. Typically, the naturally occurring TRT has a positive total charge at pH 7 (the estimated p1 typically being over 9). In one embodiment, the polypeptide has a telomerase activity as defined here. In a related embodiment, the polypeptide has a sequence for a TRT-specific region (T motif) and a telomerase activity. The invention also provides fragments of such polypeptides. The present invention also provides isolated or recombinant polynucleotides with the sequence of a naturally occurring gene encoding a TRT protein. The invention also provides isolated TRT polynucleotides having a sequence of TRT from a non-vertebrate (e.g. yeast) and vertebrate, e.g. mammals (e.g. mice or humans). The isolated polynucleotides can be associated with other naturally occurring or vector nucleic acid sequences. Typically, the length of the nucleic acid isolated is less than about 300 kb, preferably less than about 50 kb, more preferably less than about 20 kb, and most preferably less than about 10 kb. Occasionally the length is less than about 5 kb or 2 kb. In some embodiments, the isolated TRT polynucleotide is even smaller, for example, a gene fragment, primer, or probe less than about 1 kb or 0.1 kb in length.

III. Nucleinsäuren III. Nucleic acids

A) Allgemeines A) General

Die vorliegende Erfindung stellt isolierte und rekombinante Nucleinsäuren bereit mit einer Sequenz eines Polynucleotids, das eine katalytische Untereinheit des Telomerase-Proteins (TRT) codiert, beispielsweise ein rekombinantes TRT-Gen aus Euplotes, Tetrahymena, S. pombe oder Menschen. Beispiele für Polynucleotide sind dargestellt in Fig. 13 (Euplotes), Fig. 15 (S. pombe) und Fig. 16 (Mensch, Genbank-Zugangsnummer AF15950). Die vorliegende Erfindung stellt «sense» und «anti-sense»-Polynucleotide mit einer TRT-Gensequenz bereit, dazu zählen auch Sonden, Primer, TRT-Protein-codierende Polynucleotide und ähnliches. The present invention provides isolated and recombinant nucleic acids with a sequence of a polynucleotide encoding a telomerase protein (TRT) catalytic subunit, for example a recombinant TRT gene from Euplotes, Tetrahymena, S. pombe or humans. Examples of polynucleotides are shown in Fig. 13 (Euplotes), Fig. 15 (S. pombe) and Fig. 16 (human, Genbank accession number AF15950). The present invention provides “sense” and “anti-sense” polynucleotides with a TRT gene sequence, including probes, primers, TRT protein-encoding polynucleotides and the like.

B) Menschliche TRT B) Human TRT

Die vorliegende Erfindung stellt Nucleinsäuren bereit mit einer Sequenz einer katalytischen Untereinheit einer Telomerase aus Menschen (d.h. hTRT). The present invention provides nucleic acids with a sequence of a human telomerase catalytic subunit (i.e., hTRT).

Ein Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung eines Polynucleotids mit einer Sequenz oder Untersequenz eines menschlichen TRT-Gens oder einer RNA. In einer Ausführungsform besitzt das erfin-dungsgemässe Polynucleotid eine Sequenz der SEQ. ID. Nr. 1 (Fig. 16) oder eine Untersequenz davon. In einer weiteren Ausführungsform weist das Polynucleotid eine Sequenz der SEQ. ID. Nr. 3 (Fig. 18), SEQ. ID. Nr. 4 (Fig. 20) oder Untersequenzen davon auf. Die Erfindung stellt auch Polynucleotide mit One aspect of the invention relates to the provision of a polynucleotide with a sequence or sub-sequence of a human TRT gene or an RNA. In one embodiment, the polynucleotide according to the invention has a sequence of the SEQ. ID. No. 1 (Fig. 16) or a sub-sequence thereof. In a further embodiment, the polynucleotide has a sequence of the SEQ. ID. No. 3 (Fig. 18), SEQ. ID. No. 4 (Fig. 20) or sub-sequences thereof. The invention also provides polynucleotides

15 15

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

im wesentlichen zu den hier offenbarten hTRT-Nucleinsäuresequenzen identischen Sequenzen bereit, beispielsweise SEQ. ID. Nr. 1 und die weiteren offenbarten Sequenzen (z.B. SEQ. ID. Nr. 4, 6 (Fig. 21) und 7 (Fig. 12)). Somit stellt die Erfindung natürlich vorkommende Allele der menschlichen TRT-Gene und Varianten der Polynucleotidsequenzen bereit mit einer oder mehreren Nucleotiddeletionen, Insertionen oder Substitutionen, bezogen auf eine hier offenbarte hTRT-Nucleinsäuresequenz. Wie nachstehend beschrieben, können Varianten der Nucleinsäuren unter Verwendung der nachstehend beschriebenen Rekombinationsverfahren oder synthetischer Verfahren oder durch andere Mittel hergestellt werden. sequences essentially identical to the hTRT nucleic acid sequences disclosed here, for example SEQ. ID. No. 1 and the other sequences disclosed (e.g. SEQ. ID. Nos. 4, 6 (Fig. 21) and 7 (Fig. 12)). Thus, the invention provides naturally occurring alleles of the human TRT genes and variants of the polynucleotide sequences with one or more nucleotide deletions, insertions or substitutions based on an hTRT nucleic acid sequence disclosed herein. As described below, variants of the nucleic acids can be made using the recombination or synthetic methods described below, or by other means.

Die Erfindung stellt auch isolierte und rekombinante Polynucleotide mit einer Sequenz eines flankierenden Bereichs eines menschlichen TRT-Gens bereit. Zu diesen Polynucleotiden zählen solche, die von genomischen Sequenzen von untranslatierten Bereichen der hTRT-mRNA abstammen. Ein Beispiel für eine genomische Sequenz ist SEQ. ID. Nr. 6 (Fig. 21). Wie in Beispiel 4 beschrieben, wurde SEQ. ID. Nr. 6 durch Sequenzierung des Clons >.G<i>5, der aus einer menschlichen Genombank isoliert wurde, erhalten. M3<&5 enthält eine Insertion mit einer Länge von 15 Kilobasenpaaren (kbp) , die ungefähr 13 000 Basen 5' zu den hTRT codierenden Sequenzen einschliessen. Dieser Clon enthält hTRT-Promotorsequenzen und weitere regulatorische Sequenzen des hTRT-Gens (z.B. Enhancer). The invention also provides isolated and recombinant polynucleotides with a sequence of a flanking region of a human TRT gene. These polynucleotides include those derived from genomic sequences from untranslated regions of the hTRT mRNA. An example of a genomic sequence is SEQ. ID. No. 6 (Fig. 21). As described in Example 4, SEQ. ID. No. 6 was obtained by sequencing the clone> .G <i> 5, which was isolated from a human genome library. M3 <& 5 contains an insert with a length of 15 kilobase pairs (kbp), which include approximately 13,000 bases 5 'to the hTRT coding sequences. This clone contains hTRT promoter sequences and further regulatory sequences of the hTRT gene (e.g. enhancer).

Die Erfindung stellt auch isolierte und rekombinante Polynucleotide mit einer Sequenz aus einem In-tronbereich eines menschlichen TRT-Gens bereit. Ein Beispiel für eine Intronsequenz ist SEQ. ID. Nr. 7 (siehe Beispiel 3 und Fig. 12) . In einigen Ausführungsformen sind hTRT-Introns in «Minigenen» zur verbesserten Expression von hTRT-Proteinen in eukaryotischen Zellen eingeschlossen. The invention also provides isolated and recombinant polynucleotides with a sequence from an intron region of a human TRT gene. An example of an intron sequence is SEQ. ID. No. 7 (see Example 3 and Fig. 12). In some embodiments, hTRT introns are enclosed in "minigenes" for improved expression of hTRT proteins in eukaryotic cells.

Ein verwandter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung von Polynucleotiden, die hTRT-Proteine oder Proteinfragmente codieren, dazu zählen modifizierte und geänderte hTRT-Polypepti-de und Varianten der hTRT-Polypeptide. In einer Ausführungsform weist das codierte hTRT-Protein oder Fragment eine wie in SEQ. ID. Nr. 2 (Fig. 17) gezeigte Aminosäuresequenz auf oder eine Aminosäuresequenz mit konservativen Austauschen der SEQ. ID. Nr. 2. In einer Ausführungsform weisen das codierte hTRT-Protein oder -Fragment Austausche auf, die eine Aktivität des Proteins (z.B. katalytische Aktivität von Telomerase) aufweisen. Natürlich müssen aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes die das hTRT-Protein codierenden Nucleinsäuren nicht die Sequenz eines natürlich vorkommenden hTRT-Gens aufweisen, d.h. eine Vielzahl von Polynucleotiden kann ein hTRT-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ. ID. Nr. 2 codieren. Die vorliegende Erfindung stellt jede mögliche Variation von Nucleotidsequenzen bereit, die durch die Auswahl von Kombinationen hergestellt werden, die auf der Auswahl möglicher Codons in Übereinstimmung mit dem bekannten genetischen Triplett-Code basieren. All diese Variationen sind hiermit ausdrücklich offenbart. Zwar sind somit in einigen Fällen hTRT-Polypeptid codierende Nucleotidsequenzen, die mit den Nucleotidsequenzen der natürlich vorkommenden Sequenz (unter entsprechend ausgewählten Bedingungen der Stringenz) hybridisieren können, bevorzugt, es kann jedoch in anderen Fällen vorteilhaft sein, hTRT-codierende Nucleotidsequenzen herzustellen, die eine im wesentlichen unterschiedliche Condonverwendung aufweisen. A related aspect of the present invention relates to the provision of polynucleotides which encode hTRT proteins or protein fragments, including modified and modified hTRT polypeptides and variants of the hTRT polypeptides. In one embodiment, the encoded hTRT protein or fragment has one as in SEQ. ID. No. 2 (FIG. 17) shown amino acid sequence on or an amino acid sequence with conservative exchanges of the SEQ. ID. No. 2. In one embodiment, the encoded hTRT protein or fragment has exchanges that have activity of the protein (e.g., catalytic activity of telomerase). Of course, due to the degeneracy of the genetic code, the nucleic acids encoding the hTRT protein need not have the sequence of a naturally occurring hTRT gene, i.e. a variety of polynucleotides can be an hTRT polypeptide having an amino acid sequence of SEQ. ID. Code number 2. The present invention provides any possible variation of nucleotide sequences produced by the selection of combinations based on the selection of possible codons in accordance with the known triplet genetic code. All of these variations are hereby expressly disclosed. Thus, in some cases, nucleotide sequences encoding hTRT polypeptide which can hybridize with the nucleotide sequences of the naturally occurring sequence (under suitably selected conditions of stringency) are preferred, but in other cases it may be advantageous to produce nucleotide sequences encoding hTRT which one have essentially different condon usage.

In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung hTRT-Oligo- und -Polynucleotide bereit, die eine Untersequenz einer hier offenbarten hTRT-Nucleinsäure umfassen (z.B. SEQ. ID. Nr. 1, 4, 6 und 7). Die erfindungsgemässen Nucleinsäuren umfassen typischerweise mindestens etwa 10, bevorzugt mindestens etwa 12 oder etwa 15 aufeinanderfolgende Basen des erläuterten hTRT-Polynucleotids auf. Oft umfassen die erfindungsgemässen Nucleinsäuren auch eine längere Sequenz, beispielsweise eine Sequenz mit einer Länge von mindestens etwa 25, etwa 50, etwa 100, etwa 200 oder mindestens etwa 500 Basen, beispielsweise wenn die Expression eines Polypeptids angestrebt wird. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich das hTRT-Polynucleotid von einem Polynucleotid mit der Sequenz von EST AA281296 (SEQ. ID. Nr. 8). In certain embodiments, the invention provides hTRT oligo- and polynucleotides that comprise a sub-sequence of an hTRT nucleic acid disclosed herein (e.g., SEQ. ID. Nos. 1, 4, 6, and 7). The nucleic acids according to the invention typically comprise at least about 10, preferably at least about 12 or about 15 consecutive bases of the illustrated hTRT polynucleotide. The nucleic acids according to the invention often also comprise a longer sequence, for example a sequence with a length of at least about 25, about 50, about 100, about 200 or at least about 500 bases, for example if expression of a polypeptide is desired. In some embodiments of the present invention, the hTRT polynucleotide differs from a polynucleotide having the sequence of EST AA281296 (SEQ. ID. No. 8).

Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellen «Al82hTRT»-Polynucleotide bereit mit einer Sequenz, die natürlich vorkommende oder nicht natürlich vorkommende hTRTPolynucleotide codieren, beispielsweise SEQ. ID. Nr. 3 oder SEQ. ID. Nr. 4, die nicht die in pGRN121 aufgefundene 182 Basenpaarsequenz (SEQ. ID. Nr. 9 (Fig. 24)), die in Clon 712562 ebenfalls fehlt) enthalten. Diese Polynucleotide sind teilweise von Interesse, da sie Polypeptide codieren, die Kombinationen von TRT-Moti-ven enthalten, die sich von dem in hTRT-Polypeptid mit vollständiger Länge gefundenen (SEQ. ID. Nr. 2), beispielsweise dem von pGRN121 codierten Polypeptid, unterscheiden. Wie nachstehend diskutiert, wird davon ausgegangen, dass diese Polypeptide in der Natur eine biologische Rolle spielen können (z.B. bei der Regulation der Expression von Telomerase in Zellen) und/oder als Arzneimittel Verwendung finden können (z.B. als dominant-negative Produkte, die die Funktion des Wildtyp-Proteins hemmen) oder dass diese Polypeptide weitere Rollen und Verwendungen, beispielsweise die hier beschriebenen, aufweisen. Further embodiments of the present invention provide "Al82hTRT" polynucleotides with a sequence encoding naturally occurring or non-naturally occurring hTRT polynucleotides, for example SEQ. ID. No. 3 or SEQ. ID. No. 4, which does not contain the 182 base pair sequence found in pGRN121 (SEQ. ID. No. 9 (FIG. 24)), which is also missing in clone 712562). These polynucleotides are of interest in part because they encode polypeptides that contain combinations of TRT motifs that are different from those found in full-length hTRT polypeptide (SEQ. ID # 2), such as the polypeptide encoded by pGRN121 , differentiate. As discussed below, it is believed that these polypeptides can play a biological role in nature (e.g., in regulating the expression of telomerase in cells) and / or can be used as drugs (e.g., as dominant-negative products that function inhibit the wild-type protein) or that these polypeptides have further roles and uses, for example those described here.

Beispielsweise codiert Clon 712562 im Gegensatz zu dem Clon pGRN121 ein Protein mit 259 Aminosäureresten und einem geschätzten Molekulargewicht von ungefähr 30 kD (nachstehend als «712562 hTRT» bezeichnet. Das 712562 hTRT-Polypeptid (SEQ. ID. Nr. 10 (Fig. 19) ) enthält die Motive T, 1, 2 und A, jedoch nicht die Motive B', C, D und E. In ähnlicher Weise kann eine Variante des hTRT-Poly-peptids mit therapeutischen und weiteren Aktivitäten von einer Nucleinsäure exprimiert werden, die der pGRN121-cDNA gleicht, der jedoch die 182 Basenpaare fehlen, die der Clon 712562 nicht aufweist, beispielsweise mit der Sequenz SEQ. ID. Nr. 4. Diese Nucleinsäure (nachstehend mit «pro90hTRT» bezeichnet), die unter Verwendung von Routine-Syntheseverfahren oder rekombinanten Verfahren, wie sie For example, in contrast to clone pGRN121, clone 712562 encodes a protein with 259 amino acid residues and an estimated molecular weight of approximately 30 kD (hereinafter referred to as "712562 hTRT". The 712562 hTRT polypeptide (SEQ. ID. No. 10 (Fig. 19) ) contains the motifs T, 1, 2 and A, but not the motifs B ', C, D and E. Similarly, a variant of the hTRT polypeptide with therapeutic and other activities can be expressed by a nucleic acid which is the The pGRN121 cDNA is similar, but lacks the 182 base pairs that the clone 712562 does not have, for example with the sequence SEQ ID NO: 4. This nucleic acid (hereinafter referred to as "pro90hTRT"), which is produced using routine synthetic methods or recombinant methods as they

16 16

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

hier beschrieben sind, synthetisiert werden kann, codiert ein Protein mit 807 Aminosäureresten (geschätztes Molekulargewicht etwa 90 kD), das dieselben Amino-terminalen Sequenzen wie das von SEQ. ID. Nr. 1 codierte hTRT-Protein aufweist, jedoch am Carboxy-terminalen Bereich abweicht (die ersten 763 Aminosäurereste haben beide Proteine gemeinsam, die letzten 44 Aminosäurereste von pro90hTRT unterscheiden sich von dem hTRT mit vollständiger Länge). Das pro90hTRT-Polypeptid enthält die Motive T, 1,2 und A, nicht jedoch die Motive B, C, D und E und kann daher einige, jedoch nicht alle Telo-merase-Aktivitäten aufweisen. can be synthesized encodes a protein with 807 amino acid residues (estimated molecular weight about 90 kD) that has the same amino-terminal sequences as that of SEQ. ID. No. 1 encoded hTRT protein, but deviates at the carboxy-terminal region (the first 763 amino acid residues have in common both proteins, the last 44 amino acid residues of pro90hTRT differ from the full-length hTRT). The pro90hTRT polypeptide contains the motifs T, 1,2 and A, but not the motifs B, C, D and E and can therefore have some, but not all, telomerase activities.

C) Herstellung von menschlichen TRT-Nucleinsäuren C) Production of human TRT nucleic acids

Für die erfindungsgemässen Polynucleotide ergeben sich zahlreiche Anwendungen. Dazu zählen, allerdings ohne Beschränkung darauf, die Expression von Polypeptiden, die hTRT oder Fragmente davon codieren, die Verwendung als «sense»- oder «antisense»-Sonden oder Primer zur Hybridisierung und/ oder Amplifikation von natürlich vorkommenden hTRT-Genen oder RNAs (z.B. für diagnostische oder prognostische Anwendungen) und als Arzneimittel (z.B. in «antisense»-, Triplex- oder Ribozym-Zusam-mensetzungen). Nach Lektüre dieser Offenbarung ist offensichtlich, dass diese Anwendungsmöglichkeiten eine gewaltige Auswirkung auf die Diagnose und die Behandlung von menschlichen Erkrankungen, die sich auf Alterung, Krebs und Fruchtbarkeit beziehen, und darüber hinaus auf das Wachstum, die Reproduktion und die Herstellung von Produkten, die auf Zellen basieren, haben. Wie in den nachstehenden Abschnitten beschrieben, können die erfindungsgemässen hTRT-Nucleinsäuren unter Verwendung bekannter Techniken (z.B. durch Clonierung, Synthese oder Amplifikation) hergestellt werden. There are numerous applications for the polynucleotides according to the invention. These include, but are not limited to, the expression of polypeptides encoding hTRT or fragments thereof, the use as “sense” or “antisense” probes or primers for the hybridization and / or amplification of naturally occurring hTRT genes or RNAs ( eg for diagnostic or prognostic applications) and as medicinal products (eg in «antisense», triplex or ribozyme compositions). After reading this disclosure, it is apparent that these uses have a tremendous impact on the diagnosis and treatment of human diseases related to aging, cancer and fertility, and also on the growth, reproduction and manufacture of products based on them Cells. As described in the sections below, the hTRT nucleic acids of the invention can be prepared using known techniques (e.g., by cloning, synthesis or amplification).

1) Clonierung, Amplifikation und Rekombinante Herstellung 1) Cloning, amplification and recombinant production

In einer Ausführungsform werden hTRT-Gene oder cDNAs unter Verwendung einer Nucleinsäureson-de cloniert, die an hTRT-mRNA, cDNA oder genomische DNA spezifisch hybridisiert. Eine für diesen Zweck geeignete Probe ist ein Polynucleotid mit der Sequenz, die in SEQ. ID. Nr. 1 bereitgestellt wird oder eine Untersequenz davon. Typischerweise wird die genomische DNA oder cDNA mit dem Ziel-hTRT in einen Vektor ligiert (z.B. ein Plasmid, Phage, Virus, künstliches Hefechromosom etc.) und sie kann in einer genomischen Bank oder cDNA-Bank (z.B. einer cDNA-Bank von menschlicher Plazenta) gefunden werden. Nachdem eine hTRT-Nucleinsäure identifiziert ist, kann sie gemäss dem Fachmann bekannten Standardverfahren isoliert werden. Ein das Screenen einer menschlichen cDNA-Bank nach dem hTRT-Gen veranschaulichendes Beispiel ist Beispiel 1; ein ähnliches Beispiel, das sich auf das Screenen einer menschlichen genomischen Bank bezieht, ist Beispiel 4. Clonierungsverfahren sind allgemein bekannt und beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); Berger und Kimmel, Methods In Enzymology, Vol. 152: Guide To Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc. (1987); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York (1997); Cashion et al., US-Patent Nr. 5 017 478; und Carr. EP-B1 0 246 864, beschrieben. In one embodiment, hTRT genes or cDNAs are cloned using a nucleic acid that specifically hybridizes to hTRT mRNA, cDNA or genomic DNA. A sample suitable for this purpose is a polynucleotide with the sequence set out in SEQ. ID. No. 1 is provided or a sub-sequence thereof. Typically, the genomic DNA or cDNA with the target hTRT is ligated into a vector (e.g. a plasmid, phage, virus, artificial yeast chromosome etc.) and it can be in a genomic or cDNA library (e.g. a human placenta cDNA library ) being found. After an hTRT nucleic acid is identified, it can be isolated according to standard procedures known to those skilled in the art. An example illustrating the screening of a human cDNA library for the hTRT gene is Example 1; a similar example relating to the screening of a human genomic library is Example 4. Cloning methods are well known and are described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); Berger and Kimmel, Methods In Enzymology, vol. 152: Guide To Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc. (1987); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York (1997); Cashion et al., U.S. Patent No. 5,017,478; and Carr. EP-B1 0 246 864.

Die Erfindung stellt ferner genomische hTRT-Nucleinsäuren oder cDNA-hTRT-Nucleinsäuren zur Verfügung, die durch Amplifikationsverfahren wie z.B. die Polymerasekettenreaktion (PCR), isoliert wurde, zur Verfügung. In einer Ausführungsform wird die das hTRT-Protein codierende Sequenz aus einer RNA-Probe oder cDNA-Probe amplifiziert (z.B. doppelsträngige Plazenta-cDNA (Clontech, Palo Alto CA» unter Verwendung der Primer The invention also provides genomic hTRT nucleic acids or cDNA-hTRT nucleic acids which can be obtained by amplification methods such as e.g. the polymerase chain reaction (PCR) was isolated. In one embodiment, the sequence encoding the hTRT protein is amplified from an RNA sample or cDNA sample (e.g., double-stranded placenta cDNA (Clontech, Palo Alto, CA) using the primers

Primer Primer

5'-GTGAAGGCACTGTTCAGCG-3' ("TCPl.l") und 5'-GTGAAGGCACTGTTCAGCG-3 '("TCPl.l") and

51-CGCGTGGGTGAGGTGAGGTG-3 ("TCPl.15"). 51-CGCGTGGGTGAGGTGAGGTG-3 ("TCPl.15").

In einigen Ausführungsformen kann ein dritter Primer oder ein zweites Primerpaar verwendet werden, beispielsweise für «nested PCR» zur Erhöhung der Spezifität. Ein Beispiel eines zweiten Primerpaares ist In some embodiments, a third primer or a second pair of primers can be used, for example for nested PCR to increase specificity. An example of a second pair of primers is

51-CTGTGCTGGGCCTGGACGATA-31 ("billTCPö") und 51-AGCTTGTTCTCCATGTCGCCGTAG-3' ("TCPl.14"). 51-CTGTGCTGGGCCTGGACGATA-31 ("billTCPö") and 51-AGCTTGTTCTCCATGTCGCCGTAG-3 '("TCPl.14").

Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass zahlreiche andere Primer und Primerkombinationen, die für die Amplifikation von hTRT-Nucleinsäuren von Nutzen sind, durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden. It will be apparent to those skilled in the art that numerous other primers and combinations of primers useful for the amplification of hTRT nucleic acids are provided by the present invention.

Darüber hinaus stellt die Erfindung Primer zur Verfügung, die einen beliebigen spezifischen Bereich amplifizieren (beispielsweise codierende Bereiche, Promotorbereiche und/oder Introns) oder eine Unter17 In addition, the invention provides primers which amplify any specific region (for example coding regions, promoter regions and / or introns) or a sub17

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

sequenz genomischer hTRTDNA, cDNA oder RNA. Beispielsweise kann das hTRT-Intron an der Position 274/275 von SEQ. ID. Nr. 1 (siehe Beispiel 3) amplifiziert werden (z.B. zum Nachweis genomischer Clone) unter Verwendung der Primer TCP1.57 und TCP1.52 (Primerpaar 1) oder der Primer TCP1.49 und TCP1.50 (Primerpaar 2). (Die Bezeichnungen für die Primer beziehen sich auf die in der nachstehenden Tabelle 2 aufgelisteten Primer). Die Primerpaare können individuell oder in einer «nested PCR» verwendet werden, in der der Primersatz 1 zuerst verwendet wird. Ein weiteres veranschaulichendes Beispiel bezieht sich auf Primer, die spezifisch das 5'-Ende der hTRT-mRNA oder das Exon, das das 5'-Ende des hTRT-Gens codiert, amplifizieren und somit nachweisen (z.B. um die Grösse oder die Vollständigkeit eines cDNA-Clons zu beurteilen). Die folgenden Primerpaare sind zur Amplifikation des 5'-Endes von hTRT von Nutzen: Primer K320 und K321 (Primerpaar 3); Primer K320 und TCP1.61 (Primerpaar 4); Primer K320 und K322 (Primerpaar 5). Die Primersätze können in einer «nested PCR» in der Reihenfolge Satz 5, dann Satz 4 oder Satz 3, oder Satz 4 und dann Satz 3 verwendet werden. Ein weiteres veranschaulichendes Beispiel betrifft Primer, die zur spezifischen Amplifikation oder zum spezifischen Nachweis des konservierten hTRT-TRT-Motivbereichs ausgewählt wurden, der etwa das mittlere Drittel der mRNA umfasst (z.B. zur Verwendung als Hybridisierungssonde zur Identifizierung von TRT-Clonen aus nicht-menschlichen Organismen). Die folgenden Primerpaare sind zur Amplifikation des TRT-Motivbereichs von hTRT-Nucleinsäuren von Nutzen: Primer K304 und TCP1.8 (Primerpaar 6), oder Primer LT1 und TCP1.15 (Primerpaar 7). Die Primersätze können in einem Experiment mit «nested PCR» in der Reihenfolge Satz 6, dann Satz 7 verwendet werden. sequence of genomic hTRTDNA, cDNA or RNA. For example, the hTRT intron at position 274/275 of SEQ. ID. No. 1 (see example 3) can be amplified (e.g. for the detection of genomic clones) using the primers TCP1.57 and TCP1.52 (primer pair 1) or the primers TCP1.49 and TCP1.50 (primer pair 2). (The designations for the primers refer to the primers listed in Table 2 below). The primer pairs can be used individually or in a «nested PCR» in which primer set 1 is used first. Another illustrative example relates to primers which specifically amplify and thus detect (for example, the size or completeness of a cDNA) the 5 'end of the hTRT mRNA or the exon which codes the 5' end of the hTRT gene -Clons to judge). The following primer pairs are useful for amplifying the 5 'end of hTRT: primers K320 and K321 (primer pair 3); Primers K320 and TCP1.61 (primer pair 4); Primers K320 and K322 (primer pair 5). The primer sets can be used in a “nested PCR” in the order of set 5, then set 4 or set 3, or set 4 and then set 3. Another illustrative example relates to primers selected for specific amplification or detection of the conserved hTRT-TRT motif region, which comprises approximately the middle third of the mRNA (eg for use as a hybridization probe to identify TRT clones from non-human organisms ). The following primer pairs are useful for amplifying the TRT motif range of hTRT nucleic acids: primers K304 and TCP1.8 (primer pair 6), or primers LT1 and TCP1.15 (primer pair 7). The primer sets can be used in an experiment with «nested PCR» in the order set 6, then set 7.

Geeignete Bedingungen für die PCR-Amplifikation sind dem Fachmann bekannt. Dazu gehören (ohne Beschränkung darauf) 1 Einheit Taq-Polymerase (Perkin Elmer, Norwalk CT), jeweils 100 pM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 x PCR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris, pH-Wert 8,3 bei Raumtemperatur, 1,5 mM MgCI2, 0,01% Gelatine) und 0,5 nM Primer, wobei die Amplifikation etwa 30 Cyclen bei 94°C für 45 Sekunden, 55°C für 45 Sekunden und 72°C für 90 Sekunden umfasst. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass andere thermostabile DNA-Polymerasen, Reaktionsbedingungen und Parameter bezüglich der Cyclen ebenfalls eine geeignete Amplifikation liefern. Weitere geeignete Verfahren für die Amplifikation in vitro, die zum Erhalt von hTRT-Nucleinsäuren verwendet werden können, umfassen, jedoch ohne Beschränkung darauf, die nachstehend beschriebenen Verfahren. Nach Amplifikation können die hTRT-Nucleinsäuren, falls erwünscht, unter Verwendung von Routineverfahren der Molekularbiologie in einer Vielzahl von Vektoren cloniert werden, nachgewiesen oder auf andere Art und Weise in Übereinstimmung mit den erfindungsgemässen Verfahren angewandt werden. Suitable conditions for PCR amplification are known to the person skilled in the art. These include (without limitation) 1 unit of Taq polymerase (Perkin Elmer, Norwalk CT), each 100 pM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 x PCR buffer (50 mM KCl, 10 mM Tris, pH- 8.3 at room temperature, 1.5 mM MgCl 2, 0.01% gelatin) and 0.5 nM primer, the amplification being about 30 cycles at 94 ° C for 45 seconds, 55 ° C for 45 seconds and 72 ° C for 90 seconds. It will be apparent to those skilled in the art that other thermostable DNA polymerases, reaction conditions and parameters related to the cycles also provide suitable amplification. Other suitable methods for in vitro amplification that can be used to obtain hTRT nucleic acids include, but are not limited to, the methods described below. After amplification, the hTRT nucleic acids, if desired, can be cloned into a variety of vectors using routine molecular biology techniques, detected, or otherwise used in accordance with the methods of the invention.

Es ist dem Fachmann bewusst, dass die wie vorstehend beschrieben erhaltenen clonierten oder am-plifizierten hTRT-Nucleinsäuren unter Verwendung weiterer Verfahren hergestellt oder vermehrt werden können, beispielsweise durch chemische Synthese oder Replikation durch Transformation in bakterielle Systeme wie beispielsweise E. coli (siehe beispielsweise Ausubel et al., a.a.O.) oder eukaryotische Expressionssysteme, beispielsweise Säuger-Expressionssysteme. In ähnlicher Weise kann hTRT-RNA in Übereinstimmung mit den erfindungsgemässen in vitro-Verfahren oder in bakteriellen Systemen wie E. coli exprimiert werden, beispielsweise ohne Verwendung von im Handel erhältlichen Vektoren, die Promotoren enthalten, die von einer RNA-Polymerase erkannt werden, wie beispielsweise T7, T3 oder SP6 oder durch Transkription von DNA, die durch PCR-Amplifikation erzeugt wurde, unter Verwendung von Primern, die einen RNA-Polymerase-Promotor enthalten. It is known to the person skilled in the art that the cloned or amplified hTRT nucleic acids obtained as described above can be prepared or propagated using further methods, for example by chemical synthesis or replication by transformation into bacterial systems such as E. coli (see for example Ausubel et al., loc. cit.) or eukaryotic expression systems, for example mammalian expression systems. Similarly, hTRT-RNA can be expressed in accordance with the in vitro methods of the invention or in bacterial systems such as E. coli, for example without using commercially available vectors containing promoters recognized by an RNA polymerase, such as for example, T7, T3 or SP6 or by transcription of DNA generated by PCR amplification using primers containing an RNA polymerase promoter.

Die vorliegende Erfindung stellt femer veränderte oder modifizierte hTRT-Nucleinsäuren bereit. Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass die erhaltenen clonierten oder amplifizierten hTRT-Nucleinsäuren durch allgemein bekannte Verfahren (z.B. ortsgerichtete Mutagenese, «Linker-Scanning»-Mutagene-se) modifiziert werden können, beispielsweise verkürzt, derivatisiert, verändert), oder einfach de novo, wie nachstehend beschrieben, synthetisiert werden können. Die veränderten oder modifizierten hTRT-Nucleinsäuren sind für eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten von Nutzen, zu denen ohne Beschränkung darauf die Erleichterung der Clonierung, die Manipulation eines hTRT-Gens oder Genprodukts oder die Expression einer Variante eines hTRT-Genprodukts gehören. In einer Ausführungsform wird beispielsweise die hTRT-Gensequenz so verändert, dass sie ein hTRT-Polypeptid mit veränderten Eigenschaften oder Aktivitäten codiert, wie dies ausführlich nachstehend diskutiert wird, beispielsweise durch Mutation in einem konservierten Motiv von hTRT. In einem weiteren veranschaulichenden Beispiel können die Mutationen in dem das Protein codierenden Bereich einer hTRT-Nucleinsäure zur Veränderung des Glykosylierungsmusters, zur Veränderung von Codon-Präferenzen, zur Herstellung von Spleiss-Varianten, zur Entfernung von Protease-empfindlichen Stellen, zur Erzeugung von antigenen Domänen, zur Modifikation der spezifischen Aktivität etc. eingeführt werden. In weiteren Ausführungsformen wird die hTRT und seine Derivate codierende Sequenz ohne Änderung der codierten Aminosäuresequenzen verändert, beispielsweise zur Herstellung von RNA-Transkripten mit mehr erwünschten Eigenschaften, wie beispielsweise erhöhte Translationeffizienz oder eine grössere oder kürzere Halbwertszeit im Vergleich zu Transkripten, die von der natürlich vorkommenden Sequenz hergestellt wurden. In einer weiteren Ausführungsform werden zur Erhöhung der Expressionsrate des Peptids in einem speziellen prokaryotischen oder eukaryotischen Expressionswirt gemäss der Frequenz, mit der bestimmte Codons von dem Wirt verwendet werden, veränderte Codons ausgewählt. Nützliche in vitro und in vivo-Rekombinationsverfahren, die zur Herstellung der erfindungsgemässen hTRT-Polynucleotidvarianten verwendet werden können, können in Sambrook et al. und Ausubel et al., a.a.O., gefunden werden. The present invention further provides altered or modified hTRT nucleic acids. It is obvious to the person skilled in the art that the cloned or amplified hTRT nucleic acids obtained can be modified by generally known methods (for example site-directed mutagenesis, “linker scanning” mutagenesis), for example shortened, derivatized, changed), or simply de novo can be synthesized as described below. The altered or modified hTRT nucleic acids are useful for a variety of uses, including, but not limited to, facilitating cloning, manipulating an hTRT gene or gene product, or expressing a variant of an hTRT gene product. For example, in one embodiment, the hTRT gene sequence is altered to encode an hTRT polypeptide with altered properties or activities, as discussed in detail below, for example, by mutation in a conserved motif from hTRT. In another illustrative example, the mutations in the protein coding region of an hTRT nucleic acid can be used to change the glycosylation pattern, to change codon preferences, to produce splice variants, to remove protease-sensitive sites, to generate antigenic domains , to modify specific activity etc. In further embodiments, the sequence encoding hTRT and its derivatives is changed without changing the encoded amino acid sequences, for example to produce RNA transcripts with more desirable properties, such as, for example, increased translation efficiency or a longer or shorter half-life in comparison to transcripts that occur from the naturally occurring one Sequence were made. In a further embodiment, to increase the expression rate of the peptide in a special prokaryotic or eukaryotic expression host, modified codons are selected according to the frequency with which certain codons are used by the host. Useful in vitro and in vivo recombination methods which can be used to produce the hTRT polynucleotide variants according to the invention can be found in Sambrook et al. and Ausubel et al., supra.

18 18th

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Wie bereits vorstehend erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung Nucleinsäuren mit flankierenden (5' oder 3') und Intron-Sequenzen des hTRT-Gens bereit. Die Nucleinsäuren sind u.a. deshalb von Interesse, da sie Promotoren und weitere regulatorische Elemente enthalten, die an der hTRT-Regulation beteiligt und zur Expression von hTRT und anderer rekombinanter Proteine oder RNA-Genprodukte von Nutzen sind. Es ist offensichtlich, dass zusätzlich zu den in SEQ. ID. Nr. 6 (Fig. 17) und 7 bereitgestellten Nucleinsäuresequenzen zusätzliche hTRT-Intronsequenzen und flankierende Sequenzen unter Verwendung von Routineverfahren der Molekularbiologie einfach erhalten werden können. Beispielsweise kann eine zusätzliche genomische hTRT-Sequenz durch weitere Sequenzierung des Lambda-Clons Go5, der vorstehend und in Beispiel 4 beschrieben ist, erhalten werden. Darüber hinaus können weitere genomische hTRT-Clone und Sequenzen durch Screenen einer menschlichen genomischen Bank unter Verwendung einer hTRT-Nucleinsäuresonde mit einer Sequenz oder Untersequenz von SEQ. ID. Nr. 1 erhalten werden. Weitere Clone und Sequenzen (z.B. noch weiter stromaufwärts) können unter Verwendung von markierten Sequenzen oder Subclonen, die von XGo5 stammen, zum Absuchen geeigneter Genbanken erhalten werden. Andere nützliche Verfahren zur weiteren Charakterisierung von flankierenden hTRT-Sequenzen sind die allgemeinen Verfahren, die von Gobinda et al., PCR Meth. Applic. 2 (1993), 318; Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16 (1988), 8186; Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1 (1991), 111; und Parker et al., Nucleic Acids Res. 19 (1991), 3055, beschrieben werden. As mentioned above, the present invention provides nucleic acids with flanking (5 'or 3') and intron sequences of the hTRT gene. The nucleic acids include of interest because they contain promoters and other regulatory elements that are involved in hTRT regulation and are useful for the expression of hTRT and other recombinant proteins or RNA gene products. It is obvious that in addition to those in SEQ. ID. Nos. 6 (Fig. 17) and 7 provided nucleic acid sequences additional hTRT intron sequences and flanking sequences can be easily obtained using routine molecular biology methods. For example, an additional genomic hTRT sequence can be obtained by further sequencing of the lambda clone Go5, which is described above and in Example 4. In addition, other hTRT genomic clones and sequences can be screened by screening a human genomic library using an hTRT nucleic acid probe with a sequence or sub-sequence of SEQ. ID. # 1 can be obtained. Additional clones and sequences (e.g., still further upstream) can be obtained using labeled sequences or subclones derived from XGo5 to search for suitable gene banks. Other useful methods for further characterizing flanking hTRT sequences are the general methods described by Gobinda et al., PCR Meth. Applic. 2 (1993), 318; Triglia et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 8186; Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1: 111 (1991); and Parker et al., Nucleic Acids Res. 19 (1991), 3055.

Intron-Sequenzen können durch Routinemittel identifiziert werden, beispielsweise durch Vergleich der genomischen hTRT-Sequenz mit hTRT-cDNA-Sequenzen (siehe beispielsweise Beispiel 3), durch S1-Analyse (siehe Ausubel et al., a.a.O.; Kapitel 4), oder zahlreiche weitere auf dem Fachgebiet bekannte Mittel. Intron-Sequenzen können auch in prä-mRNA (d.h. ungespleissten oder unvollständig gespleissten mRNA-Vorläufern) gefunden werden. Diese können amplifiziert oder nach reverser Transkription von zellulärer RNA cloniert werden. Intron sequences can be identified by routine means, for example by comparing the genomic hTRT sequence with hTRT cDNA sequences (see for example Example 3), by S1 analysis (see Ausubel et al., Loc. Cit., Chapter 4), or numerous others means known in the art. Intron sequences can also be found in pre-mRNA (i.e. unspliced or incompletely spliced mRNA precursors). These can be amplified or cloned after reverse transcription of cellular RNA.

Falls erwünscht, kann die clonierte, amplifizierte oder anderweitig synthetisierte hTRT-Nucleinsäure oder andere TRT-Nucleinsäure bestimmt oder unter Verwendung von allgemein bekannten Verfahren für die DNA-Sequenzierung verifiziert werden (siehe beispielsweise Ausubel et al., a.a.O.) Bei den nützlichen Sequenzierungsverfahren werden Enzyme wie beispielsweise das Klenow-Fragment der DNA-Po-lymerase I, Sequenase (US Biochemical Corp., Cleveland OH), Taq DNA-Polymerase (Perkin Eimer, Norwalk CT), thermostabile T7-Polymerase (Amersham, Chicago IL), oder Kombinationen von rekombinanten Polymerasen und Exonucleasen mit «proofreading»-Aktivität angewandt, beispielsweise das ELONGASE-Amplifikations-System, das von Gibco BRL (Gaithersburg MD) erhältlich ist. Zur Sequenzierung oder Verifizierung der Sequenz von Oligonucleotiden, (wie z.B. Oligonucleotiden, die durch die de novo-chemische Synthese hergestellt wurden) wird das Verfahren von Maxam und Gilbert bevorzugt (Maxam und Gilbert, Meth. Enz. 65 (1980), 499; Ausubel et al., a.a.O., Kapitel 7). If desired, the cloned, amplified, or otherwise synthesized hTRT nucleic acid or other TRT nucleic acid can be determined or verified using well known methods for DNA sequencing (see, e.g., Ausubel et al., Supra). The useful sequencing methods use enzymes such as the Klenow fragment of DNA polymerase I, Sequenase (US Biochemical Corp., Cleveland OH), Taq DNA polymerase (Perkin Elmer, Norwalk CT), thermostable T7 polymerase (Amersham, Chicago IL), or combinations of recombinant polymerases and exonucleases with "proofreading" activity, for example the ELONGASE amplification system available from Gibco BRL (Gaithersburg MD). For sequencing or verifying the sequence of oligonucleotides (such as oligonucleotides produced by de novo chemical synthesis), the method of Maxam and Gilbert is preferred (Maxam and Gilbert, Meth. Enz. 65 (1980), 499; Ausubel et al., loc. cit., chapter 7).

Die 5'-untranslatierten Sequenzen von hTRT oder anderen TRT-mRNAs können durch Clonierung einer hTRT mit «vollständiger Länge» oder einer anderen cDNA unter Verwendung von Standardverfahren wie der reversen Transkription von mRNA und im Anschluss daran durch Clonierung und Sequenzierung der erhaltenen cDNA direkt bestimmt werden. Bevorzugte durch oligo(dT)-«priming» erhaltene Genbanken zum Screenen oder Amplifizieren von cDNAs mit vollständiger Länge, die zum Einschluss grösserer cDNAs nach Grösse selektiert wurden, werden bevorzugt. Durch «Zufalls-Priming» erhaltene Genbanken sind ebenfalls geeignet. Diese enthalten oft einen grösseren Anteil von Clonen, die 5'-Berei-che von Genen enthalten. Es können weitere allgemein bekannte Verfahren zum Erhalt von 58-RNA-Sequenzen verwendet werden, beispielsweise das von Frohman et al., Proc. Nat. Acad. Sei., USA 85 (1988), 8998, beschriebene RACE-Protokoll. Falls erwünscht, kann die Transkriptions-Startstelle einer hTRT oder einer anderen TRTmRNA durch Routineverfahren unter Verwendung der hier bereitgestellten Nucleinsäuren (z.B. solcher mit der Sequenz von SEQ. ID. Nr. 1) bestimmt werden. Ein Verfahren ist die S1-Nuclease-Analyse (Ausubel et al., a.a.O.), bei der eine markierte DNA mit einer Sequenz des 5'-Bereichs von SEQ. IDNr. 1 verwendet wird. The 5'-untranslated sequences of hTRT or other TRT mRNAs can be determined directly by cloning a "full length" hTRT or another cDNA using standard methods such as reverse transcription of mRNA and then by cloning and sequencing the cDNA obtained become. Preferred libraries obtained by oligo (dT) priming for screening or amplifying full-length cDNAs which have been selected for inclusion of larger cDNAs are preferred. Genebanks obtained by "random priming" are also suitable. These often contain a larger proportion of clones that contain 5 'regions of genes. Other generally known methods for obtaining 58 RNA sequences can be used, for example that of Frohman et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 85 (1988), 8998, RACE protocol. If desired, the transcription start site of an hTRT or other TRTmRNA can be determined by routine methods using the nucleic acids provided herein (e.g., those with the sequence of SEQ. ID No. 1). One method is S1 nuclease analysis (Ausubel et al., Op. Cit.), In which a labeled DNA with a sequence of the 5 'region of SEQ. ID no. 1 is used.

2) Chemische Synthese von Nucleinsäuren 2) Chemical synthesis of nucleic acids

Die vorliegende Erfindung stellt auch hTRT-Polynucleotide (RNA, DNA oder modifiziert) bereit, die durch direkte chemische Synthese hergestellt werden. Chemische Synthese wird im allgemeinen für die Herstellung von Oligonucleotiden oder von Oligonucleotiden und Polynucleotiden, die Nicht-Standardnu-cleotide enthalten (z.B. Sonden, Primer und «antisense»-Oligonucleotide) bevorzugt. Die direkte chemische Synthese von Nucleinsäuren kann durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren erfolgen, beispielsweise durch das Phosphotriester-Verfahren von Narang et al., Meth. Enzymol. 68 (1979), 90; das Phosphodiester-Verfahren von Brown et al., Meth. Enzymol. 68 (1979), 109; das Diethylphosphoramidit-Verfahren von Beaucage et al., Tetra. Lett. 22 (1981), 1859; und das Verfahren des US-Patents Nr. 4 458 066, bei dem ein fester Träger verwendet wird. Durch die chemische Synthese wird typischerweise ein einzelsträngiges Oligonucleotid hergestellt, das durch Hybridisierung mit einer komplementären Sequenz oder durch Polymerisation mit einer DNA-Polymerase und eines Oligonucleotidprimers unter Verwendung des Einzelstrangs als Matrize in eine doppelsträngige DNA umgewandelt werden kann. Der Fachmann ist sich dessen bewusst, dass zwar die chemische Synthese von DNA oft auf Sequen- The present invention also provides hTRT polynucleotides (RNA, DNA or modified) made by direct chemical synthesis. Chemical synthesis is generally preferred for the preparation of oligonucleotides or of oligonucleotides and polynucleotides containing non-standard nucleotides (e.g. probes, primers and "antisense" oligonucleotides). The direct chemical synthesis of nucleic acids can be accomplished by methods known in the art, for example by the phosphotriester method of Narang et al., Meth. Enzymol. 68: 90 (1979); the Brown et al. phosphodiester method, Meth. Enzymol. 68: 109 (1979); the diethyl phosphoramidite method of Beaucage et al., Tetra. Lett. 22: 1859 (1981); and the method of U.S. Patent No. 4,458,066 using a solid support. Chemical synthesis typically produces a single-stranded oligonucleotide that can be converted to double-stranded DNA by hybridization with a complementary sequence or by polymerization with a DNA polymerase and an oligonucleotide primer using the single strand as a template. The person skilled in the art is aware that the chemical synthesis of DNA is often based on sequences

19 19th

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

zen von etwa 100 oder 150 Basen beschränkt ist, längere Sequenzen jedoch durch Ligierung der kürzeren Sequenzen oder durch ausgefeiltere Syntheseverfahren erhalten werden können. zen is limited to about 100 or 150 bases, but longer sequences can be obtained by ligation of the shorter sequences or by more sophisticated synthetic methods.

Die erfindungsgemässen hTRT-Polynucleotide und Oligonucleotide (oder hTRT- oder weitere Polynucleotide oder Oligonucleotide) können unter Verwendung von Nicht-Standardbasen (z.B. solche, die sich von Adenin, Cytidin, Guanin, Thymin und Uridin unterscheiden) oder Nicht-Standard-Rückgratstrukturen zur Erzielung gewünschter Eigenschaften (z.B. erhöhte Nuclease-Resistenz, engere Bindung, Stabilität oder ein gewünschter TM) hergestellt werden. Zu den für die Herstellung von Nuclease-resistenten Oligonucleotiden zählen die in der PCT-Veröffentlichung WO 94/12 633 beschriebenen Verfahren. Eine grosse Anzahl von nützlichen modifizierten Oligonucleotiden kann hergestellt werden, dazu zählen Oligonucleotide mit einem Peptid-Nucleinsäure (PNA)-Rückgrat (Nielsen et al., Science 254 (1991), 1497) oder der Einbau von 2'-0-Methylribonucleotiden, Phosphorthioat-Nucleotiden, Methylphosphonat-Nucleo-tiden, Phosphotriester-Nucleotiden, Phosphorthioat-Nucleotiden und Phosphoramidaten. Weitere nützliche Oligonucleotide können Alkyl- und Halogen-substituierte Zuckeranteile enthalten, die an der 2"-Posi-tion eine der folgenden Gruppen enthalten: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3OCH3, 0CH30(CH2)nCH3, 0(CH2)nNH2 oder 0(CH2)nCH3, wobei n von 1 bis etwa 10 ist; C1 bis C10-Niederalkyl, substituiertes Niederalkyl, Alkaryl oder Aralkyl; CI; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S-, oder N-Alkyl; O-, S-, oder N-Alkenyl; SOCH3, SO2CH3; ONO2; NO2; N3, NH2; Heterocycloalkyl; Heterocycloalkaryl; Aminoalkylamino; Polyal-kylamino, substituiertes Silyl; eine RNA-spaltende Gruppe, eine Cholesteringruppe, eine Folatgruppe, eine Reportergruppe, ein Intercalator, eine Gruppe zur Verbesserung der pharmacokinetischen Eigenschaften eines Oligonucleotids; oder eine Gruppe zur Verbesserung der pharmacodynamischen Eigenschaften eines Oligonucleotids und weiterer Substituenten mit ähnlichen Eigenschaften. Folat, Cholesterin und weitere Gruppen, die die Aufnahme des Oligonucleotids erleichtern, wie beispielsweise Lipid-Analoga, können direkt oder über einen Linker an der 2-Position jedes Nucleosids oder an der 3'- oder 5'-Position des 3'-terminalen bzw. 5'-terminalen Nucleosids konjugiert werden. Es können eines oder mehrere solcher Konjugate verwendet werden. Oligonucleotide können auch Zucker «mimetics» aufweisen, beispielsweise Cyclobutyle anstelle der Pentofuranosylgruppe. Weitere Ausführungsformen können mindestens eine modifizierte Basenform oder eine «universelle Base» wie Inosin beinhalten oder den Einschluss von anderen Nicht-Standardbasen wie Queosin und Wybutosin sowie Acetyl-, Methyl-, Thio-und ähnlich modifizierte Formen von Adenin, Cytidin, Guanin, Thymin und Uridin, die von Endonuclea-sen nicht so leicht erkannt werden. Die Erfindung stellt ferner Oligonucleotide mit Rückgratanalogen bereit, dazu gehören Phosphodiester, Phosphorthioat, Phosphordithioat, Methylphosphonat, Phosphorami-dat, Alkylphosphotriester, Sulfamat, 3'-Thioacetyl, Methylen(methylimino), 3'-N-Carbamat, Morpholincar-bamat, Chiral-Methylphosphonate, Nucleotide mit kurzkettigen Alkyl- oder Cycloalkylverknüpfungen zwischen den Zuckern, kurzkettige Verknüpfungen («Rückgratverknüpfungen») zwischen den Zuckern mit unterschiedlichen Atomen oder solche die heterocyclisch sind oder CH2-NH-OCH2, CH2-N(CH3)-OCH2, CH2(-N(CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2 und 0-N(CH3)-CH2-CH2-Rückgrate (wobei Phosphodiester O-P-O-CH2 ist), oder Mischungen dieser Verbindungen. Von Nutzen sind ausserdem Oligonucleotide mit Morpholino-Rückgrat-Struktur (US-Patent Nr. 5 034 506). The hTRT polynucleotides and oligonucleotides (or hTRT or other polynucleotides or oligonucleotides) according to the invention can be achieved using non-standard bases (for example those which differ from adenine, cytidine, guanine, thymine and uridine) or non-standard backbone structures desired properties (eg increased nuclease resistance, closer binding, stability or a desired TM) can be produced. The processes described in the PCT publication WO 94/12 633 are among those for the production of nuclease-resistant oligonucleotides. A large number of useful modified oligonucleotides can be made, including oligonucleotides with a peptide nucleic acid (PNA) backbone (Nielsen et al., Science 254 (1991), 1497) or incorporation of 2'-0-methylribonucleotides, phosphorothioate -Nucleotides, methylphosphonate nucleotides, phosphotriester nucleotides, phosphorothioate nucleotides and phosphoramidates. Other useful oligonucleotides may contain alkyl and halogen substituted sugar moieties that contain one of the following groups at the 2 "position: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3OCH3, 0CH30 (CH2) nCH3, 0 (CH2) nNH2 or 0 (CH2) nCH3, where n is from 1 to about 10; C1 to C10 lower alkyl, substituted lower alkyl, alkaryl or aralkyl; CI; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S-, or N-alkyl ; O-, S-, or N-alkenyl; SOCH3, SO2CH3; ONO2; NO2; N3, NH2; heterocycloalkyl; heterocycloalkaryl; aminoalkylamino; polyalkylamino, substituted silyl; an RNA-cleaving group, a cholesterol group, a folate group, a Reporter group, an intercalator, a group for improving the pharmacokinetic properties of an oligonucleotide, or a group for improving the pharmacodynamic properties of an oligonucleotide and other substituents with similar properties, folate, cholesterol and other groups which facilitate the uptake of the oligonucleotide, for example Lipid analogs can be conjugated directly or via a linker at the 2-position of each nucleoside or at the 3'- or 5'-position of the 3'-terminal or 5'-terminal nucleoside. One or more such conjugates can be used. Oligonucleotides can also have sugar mimetics, for example cyclobutyls instead of the pentofuranosyl group. Further embodiments may include at least one modified base form or a "universal base" such as inosine or the inclusion of other non-standard bases such as queosine and wybutosine as well as acetyl, methyl, thio and similarly modified forms of adenine, cytidine, guanine, thymine and Uridine, which is not easily recognized by endonucleases. The invention further provides oligonucleotides with backbone analogs, including phosphodiester, phosphorothioate, phosphorodithioate, methylphosphonate, phosphoramate, alkylphosphotiester, sulfamate, 3'-thioacetyl, methylene (methylimino), 3'-N-carbamate, morpholine caramate, chiral Methylphosphonates, nucleotides with short-chain alkyl or cycloalkyl linkages between the sugars, short-chain links ("backbone links") between the sugars with different atoms or those that are heterocyclic or CH2-NH-OCH2, CH2-N (CH3) -OCH2, CH2 (- N (CH3) -CH2, CH2-N (CH3) -N (CH3) -CH2 and 0-N (CH3) -CH2-CH2 backbones (where phosphodiester is OPO-CH2), or mixtures of these compounds, are useful also oligonucleotides with a morpholino backbone structure (U.S. Patent No. 5,034,506).

Zur weiteren nützlichen Literatur zählt: Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, F. Eckstein (Herausg.) IRL Press bei Oxford University Press (1991); Antisense Strategies, Annais of the New York Academy of Sciences, Bd. 600, Baserga und Denhardt (Herausg.) (NYAS 1992), Milligan et al., J. Med. Chem. 36 (14) (9. Juli 1993), 1923-1937; Antisense Research and Applications (1993, CRC Press) die gesamte Veröffentlichung und speziell Kapitel 15 von Sanghvi, mit dem Titel «Heterocyclic base modifications in nucleic acids and their applications in antisense oligonucleotides.» Antisense The-rapeutics, Sudhir Agrawal (Herausgeber (Humana Press, Totowa, New Jersey, 1996). Other useful literature includes: Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, F. Eckstein (ed.) IRL Press at Oxford University Press (1991); Antisense Strategies, Annais of the New York Academy of Sciences, Vol. 600, Baserga and Denhardt (ed.) (NYAS 1992), Milligan et al., J. Med. Chem. 36 (14) (July 9, 1993), 1923-1937; Antisense Research and Applications (1993, CRC Press) published the entire publication, specifically Chapter 15 of Sanghvi, entitled "Heterocyclic base modifications in nucleic acids and their applications in antisense oligonucleotides." Antisense The-rapeutics, Sudhir Agrawal (Editor (Humana Press, Totowa, New Jersey, 1996).

D) Die Markierung von Nucleinsäuren D) The labeling of nucleic acids

Es ist oft von Nutzen, die erfindungsgemässen Nucleinsäuren zu markieren, beispielsweise wenn die hTRT oder andere Oligonucleotide oder Polynucleotide als Nucleinsäuresonden verwendet werden sollen. Die Markierungen (siehe nachstehend) können durch beliebige, dem Fachmann allgemein bekannte Mittel eingebaut werden. In einer Ausführungsform wird eine nicht-amplifizierte Nucleinsäure (z.B. mRNA, poly-A-mRNA, cDNA) markiert. Mittel zur Herstellung markierter Nucleinsäuren sind dem Fachmann allgemein bekannt. Dazu gehören beispielsweise Nick-Translation, Markierung mittels «Zufalls-Priming», Endmarkierung (z.B. unter Verwendung einer Kinase) und chemische Konjugation (z.B. Photobiotinylie-rung). In einer weiteren Ausführungsform wird die Markierung gleichzeitig während eines Amplifikations-schritts bei der Herstellung der Proben-Nucleinsäuren eingebaut. Somit liefern beispielsweise die Poly-merasekettenreaktion (PCR) oder andere Nucleinsäureamplifikationsverfahren mit markierten Primern oder markierten Nucleotiden ein markiertes Amplifikationsprodukt. In einer weiteren Ausführungsform wird durch Transkriptionsamplifikation unter Verwendung eines markierten Nucleotids (z.B. Fluorescein-markiertes UTP und/oder CTP) eine Markierung in die transkribierten Nucleinsäuren eingebaut. Ein Amplifikationsprodukt kann auch oder alternativ nach Beendigung der Amplifikation markiert werden. It is often useful to label the nucleic acids according to the invention, for example if the hTRT or other oligonucleotides or polynucleotides are to be used as nucleic acid probes. The markings (see below) can be incorporated by any means well known to those skilled in the art. In one embodiment, an unamplified nucleic acid (e.g. mRNA, poly-A mRNA, cDNA) is labeled. Agents for the production of labeled nucleic acids are generally known to the person skilled in the art. These include, for example, nick translation, labeling using «random priming», end labeling (e.g. using a kinase) and chemical conjugation (e.g. photobiotinylation). In a further embodiment, the label is incorporated simultaneously during an amplification step in the preparation of the sample nucleic acids. Thus, for example, the polymerase chain reaction (PCR) or other nucleic acid amplification methods with labeled primers or labeled nucleotides provide a labeled amplification product. In a further embodiment, a label is incorporated into the transcribed nucleic acids by transcription amplification using a labeled nucleotide (e.g. fluorescein-labeled UTP and / or CTP). An amplification product can also or alternatively be marked after completion of the amplification.

20 20th

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

E) Beispiele für Oligonucleotide E) Examples of oligonucleotides

Wie bereits vorstehend angemerkt und nachstehend ausführlich diskutiert werden Oligonucleotide für eine Vielzahl von Verwendungsmöglichkeiten verwendet, beispielsweise als Primer, Sonden, therapeutische oder andere «antisense»-Oligonucleotide und Triplex-Oligonucleotide. Zahlreiche weitere Verwendungsmöglichkeiten ergeben sich aus der vorliegenden Beschreibung. Tabelle 2 veranschaulicht bestimmte spezifische Oligonucleotide, die bei der Ausführung der Erfindung verwendet werden können. Natürlich können zahlreiche weitere nützliche erfindungsgemässe Oligonucleotide durch den Fachmann anhand der hier zur Verfügung gestellten Lehre synthetisiert werden. As noted above and discussed in detail below, oligonucleotides are used for a variety of uses, such as primers, probes, therapeutic or other "antisense" oligonucleotides, and triplex oligonucleotides. Numerous other possible uses result from the present description. Table 2 illustrates certain specific oligonucleotides that can be used in the practice of the invention. Of course, numerous other useful oligonucleotides according to the invention can be synthesized by the person skilled in the art using the teaching provided here.

In Tabelle 2 bedeutet «seq», dass der Primer zur Sequenzierung verwendet wurde oder dafür von Nutzen ist; «PCR» bedeutet, dass der Primer zur PCR verwendet wurde oder dafür von Nutzen ist; «AS» bedeutet, dass der Primer zur «antisense»-Hemmung von Telomerase-Aktivität verwendet wurde oder dafür von Nutzen ist; «CL» bedeutet, dass der Primer zur Clonierung von Bereichen von hTRT-Genen oder RNA verwendet wurde oder dafür von Nutzen ist; «mut» bedeutet, dass der Primer zur Konstruktion von Mutanten von hTRT-Genen oder Genprodukten verwendet wurde oder für von Nutzen ist. «UC» bedeutet «Upper case» [Grossschreibung], und «Ic» bedeutet «lower case» [Kleinschreibung], Fehlpaarungen und Insertionen (relativ zu SEQ. ID Nr. 1) sind unterstrichen; Deletionen werden durch ein «-» angegeben. Selbstverständlich soll keine der Angaben in Tabelle 2 eine Einschränkung der Verwendung eines bestimmten Oligonucleotids auf irgendeine Einzelverwendung oder einen Satz von Anwendungsmöglichkeiten beschränken. In Table 2, “seq” means that the primer has been used or is useful for sequencing; “PCR” means that the primer has been used for PCR or is useful for it; “AS” means that the primer has been used or is useful in the antisense inhibition of telomerase activity; “CL” means that the primer has been used or useful for cloning regions of hTRT genes or RNA; “Mut” means that the primer was used to construct mutants for hTRT genes or gene products or is of use. "UC" means "Upper case" and "Ic" means "lower case", mismatches and insertions (relative to SEQ. ID No. 1) are underlined; Deletions are indicated by a «-». Of course, none of the information in Table 2 is intended to limit the use of a particular oligonucleotide to any single use or set of uses.

21 21

U1 U1

A A

o ro ro primer 5'-Seauen7-.V • o ro ro primer 5'-Seauen7-.V •

TCP 1.1 GTGAAGGC ACTGTTC AGCG TCP 1.1 GTGAAGGC ACTGTTC AGCG

TCPl.2 GTGGATGATTICTTGTTGG TCPl.2 GTGGATGATTICTTGTTGG

TCP 1.4 CTGGACACTCAGCCCTTGG TCP 1.4 CTGGACACTCAGCCCTTGG

TCP 1.5 GGC AGGTGTGCTGG ACACT TCP 1.5 GGC AGGTGTGCTGG ACACT

TCP 1.6 TTTG ATG ATGCTGGCGATG TCP 1.6 TTTG ATG ATGCTGGCGATG

TCP 1.7 GGGQCTC GT CTT CTAC AGG TCP 1.7 GGGQCTC GT CTT CTAC AGG

TCP 1.8 C AGCAGG AGG ATCTTGT AG TCP 1.8 C AGCAGG AGG ATCTTGT AG

TCPl.9 TGACCCCAGGAGTGGCACG TCPl.9 TGACCCCAGGAGTGGCACG

TCPl. 10 TCA AGCTG ACT CG ACACCG TCPl. 10 TCA AGCTG ACT CG ACACCG

TCP1.I ! CGGCGTGACAGGGCTGC TCP1.I! CGGCGTGACAGGGCTGC

TCP 1.12 GCTGAAGGCTGAGTGTCC TCP 1.12 GCTGAAGGCTGAGTGTCC

TCP 1.13 TAGTCCATGTTCACAATCG TCP 1.13 TAGTCCATGTTCACAATCG

TCPl. 14 CTGTGCTGGGCCTGGACGATA TCPl. 14 CTGTGCTGGGCCTGGACGATA

TCPl. 15 CGCGTGGGTGAGGTGAGGTG TCPl. 15 CGCGTGGGTGAGGTGAGGTG

TCP 1.16 1TTCCGTGTTGAGTGTTTC TCP 1.16 1TTCCGTGTTGAGTGTTTC

TCP I I 7 GTCACCGTGTTGGGCAGG TCP I I 7 GTCACCGTGTTGGGCAGG

TCP 1.19 GCTACCTGCCCAACACGG TCP 1.19 GCTACCTGCCCAACACGG

TCPl. 20 GCGCGAAGAACGTGCTGG TCPl. 20 GCGCGAAGAACGTGCTGG

TCPl.21 CA-CTGCTCCTTGTCGCCTG TCPl.21 CA-CTGCTCCTTGTCGCCTG

TCPl.22 TTCCCAAGGACTTTGTTGC TCPl.22 TTCCCAAGGACTTTGTTGC

TCPl.24 TGITCCTCAAGACGCACTG TCPl.24 TGITCCTCAAGACGCACTG

TCP 1.25 TACT GCGT GCGTCGGT ATG TCP 1.25 TACT GCGT GCGTCGGT ATG

TCP 1.26 GG TCITGCGGCTG AAGTGT TCP 1.26 GG TCITGCGGCTG AAGTGT

TCPl .27 TGG rrCACCTGCTGGCACü TCPl .27 TGG rrCACCTGCTGGCACü

TCP 1.28 GTGGTTTCTGTGTGGTGTC TCP 1.28 GTGGTTTCTGTGTGGTGTC

TCP1.29 GACACCACACAGAAACCAC TCP1.29 GACACCACACAGAAACCAC

TCP 1.30 GTGCCAGCAGGTGAACCAG TCP 1.30 GTGCCAGCAGGTGAACCAG

TCP I 32n GCAGTGCGTCTTGAGGAGC TCP I 32n GCAGTGCGTCTTGAGGAGC

TCPl .33 TOGA ACCAT AGCGTCAGGG AG TCPl .33 TOGA ACCAT AGCGTCAGGG AG

TCPl.34 GGCCTCCCTGACGCTATGGTT TCPl.34 GGCCTCCCTGACGCTATGGTT

TCPl.35 GC(GT)CGGCGCTGCCACTCAGG TCPl.35 GC (GT) CGGCGCTGCCACTCAGG

TCP 1.3 51 GCTCGGCGCTGCCACl CAGG TCP 1.3 51 GCTCGGCGCTGCCACl CAGG

TCP 1.36 ACGCCGAG ACCA AGCAC TTC TCP 1.36 ACGCCGAG ACCA AGCAC TTC

co en co en

CJ O CJ O

ro o ro o

Tabelle 2 nützliche Oligonucleotide Table 2 useful oligonucleotides

Verwendung use

Anmerkungen Fehloaamnç ? • seu PCR AS CL MUT Comments Fehoaamnç? • see PCR AS CL MUT

Y Y

Y Y

seq seq

PCR PCR

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

O T O T

en oo «o o> -j io > en oo «o o> -j io>

(O (O

Ol o Ol o

U1 m U1 m

CTI CTI

o en o en

■fc. o ■ fc. O

CJ CJ

o O

TCPl.38 CCAAAG AGGTGGCTTCTT CG TCPl.38 CCAAAG AGGTGGCTTCTT CG

TCP 1.39 AAGGCCAGCACGTTCTTCGC TCP 1.39 AAGGCCAGCACGTTCTTCGC

TCPl.40 CACGTTCGTGCGGCGCCTG TCPl.40 CACGTTCGTGCGGCGCCTG

TCP 1.41 CCTTCACCACCAGCGTGCG TCP 1.41 CCTTCACCACCAGCGTGCG

TCPI.42 GGCG ACGACGT GCTGGTT C TCPI.42 GGCG ACGACGT GCTGGTT C

TCP1.43 GGCTCAGGGGCAGCGCCAC TCP1.43 GGCTCAGGGGCAGCGCCAC

TCP 1.44 CTGGCAGGTGTACGGCTTC TCP 1.44 CTGGCAGGTGTACGGCTTC

TCPl.45 (iCGTGGACCGAGTGACCGTGCirri'C TCPl.45 (iCGTGGACCGAGTGACCGTGCirri'C

TCP 1.46 GACGTGGTGGCCGCGATGTGG TCP 1.46 GACGTGGTGGCCGCGATGTGG

TCP 1.47 GAAGTCTGCCGTTGCCCAAGAG TCP 1.47 GAAGTCTGCCGTTGCCCAAGAG

TCP 1.48 GACACCACACAGAAACCACGGTCAC TCP 1.48 GACACCACACAGAAACCACGGTCAC

TCP 1.49 CGCCCCCTCCTTCCGCCAGGT TCP 1.49 CGCCCCCTCCTTCCGCCAGGT

TCPl.50 CGAAGCCGAAGGCCAGCACGTTCTT TCPl.50 CGAAGCCGAAGGCCAGCACGTTCTT

TCP 1.51 GGTGC.CCCG AGTGCTGCAG AGG TCP 1.51 GGTGC.CCCG AGTGCTGCAG AGG

TCPl.52 GTAGCIXJCGCACGCTGGTGGTGAAG TCPl.52 GTAGCIXJCGCACGCTGGTGGTGAAG

TCPl.53 TGGGCGACGACGTGCTGGTTCA TCPl.53 TGGGCGACGACGTGCTGGTTCA

TCPl .54 TATGGTTCCAGGCCCGTrCGCATCC TCPl .54 TATGGTTCCAGGCCCGTrCGCATCC

TCPl.55 CCAGCTGCGCCTACCAGGTGTGC TCPl.55 CCAGCTGCGCCTACCAGGTGTGC

TCPl.56 GGCCTCCCTGACGCTATGGTTCCAG TCPl.56 GGCCTCCCTGACGCTATGGTTCCAG

TCPl.57 GGTGCTGCCGCTGGCCACGTTCG TCPl.57 GGTGCTGCCGCTGGCCACGTTCG

TCPl .58 TCCCAGGGCACGCACACCAGGCACT TCPl .58 TCCCAGGGCACGCACACCAGGCACT

TCP 1.59 GTACAGGGCACACCTTTGGTCACTC TCP 1.59 GTACAGGGCACACCTTTGGTCACTC

TCPl.60 TCGACGACGTACACACTCATCAGCC TCPl.60 TCGACGACGTACACACTCATCAGCC

TCP 1.61 AGCGGCAGCACCTCGCGGT AGTGGC TCP 1.61 AGCGGCAGCACCTCGCGGT AGTGGC

TCPl.62 CCACCAGCrcCITCAGGCAGGACAC TCPl.62 CCACCAGCrcCITCAGGCAGGACAC

TCP 1.63 CCAGGGCTTCCCACGTGCGCAGCAG TCP 1.63 CCAGGGCTTCCCACGTGCGCAGCAG

TCP 1.64 CGCACG AACGIGGCCAGCGGC AGCA TCP 1.64 CGCACG AACGIGGCCAGCGGC AGCA

TCPl.65 TGACCGTGGTTTCTGTGTGGTGT TCPl.65 TGACCGTGGTTTCTGTGTGGTGT

TCP1.66 CCCTCTTCAAGTGCTGTCTGATTCC TCP1.66 CCCTCTTCAAGTGCTGTCTGATTCC

TCPl.67 ATCGCGGCCACCACGTCCCT TCPl.67 ATCGCGGCCACCACGTCCCT

TCP 1.68 TGCTCC AG ACACTCGGCCGGTAG A A TCP 1.68 TGCTCC AG ACACTCGGCCGGTAG A A

TCP 1.69 ACGAAGCCGTACACCTGCC TCP 1.69 ACGAAGCCGTACACCTGCC

TCP 1.72 CGACATCCCTGCGTTCTTGGCTTrC TCP 1.72 CGACATCCCTGCGTTCTTGGCTTrC

TCP 1.73 CACTGCTGGCCTCATTCAGGG TCP 1.73 CACTGCTGGCCTCATTCAGGG

TCPl.74 GCGACATGGAGAACAAGC TCPl.74 GCGACATGGAGAACAAGC

TCPl.75 GCAGCCATACTCAGGGACAC TCPl.75 GCAGCCATACTCAGGGACAC

TCP 1.76 CC ATCCTCTCC ACGCTGCTC TCP 1.76 CC ATCCTCTCC ACGCTGCTC

M ro en o M ro en o

Tabelle 2 Table 2

(Fortsetzung) (Continuation)

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

y * ^ y * ^

X x 2 X x 2

x x en x x en

X X g X X g

X X _ X X _

O) O)

XX XX

TO TO

x x > x x>

XX <0 XX <0

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

X X X X

ro en ro o ro en ro o

Tabelle 2 Table 2

(Fortsetzung) (Continuation)

TCP 1.77 GCGATGACCTCCGTGAGCCTG TCP 1.77 GCGATGACCTCCGTGAGCCTG

TCP 1.78 CCCAGGACAüCiCTCACGG A TCP 1.78 CCCAGGACAüCiCTCACGG A

billTCPJ CCTCTTCAAGTGCTGTCTGATTCC billTCPJ CCTCTTCAAGTGCTGTCTGATTCC

billTCP2 C AGCTCGACGACGT ACACACTCATC billTCP2 C AGCTCGACGACGT ACACACTCATC

bilITCP4 CTGACGTCCAGACTCCGCTTCAT bilITCP4 CTGACGTCCAGACTCCGCTTCAT

billTCP6 AGCTTGTTCTCCATGTCGCCGT AG billTCP6 AGCTTGTTCTCCATGTCGCCGT AG

rpprimOl GACCTGAGCAGCTCGACGACGTACACACTCATC rpprimOl GACCTGAGCAGCTCGACGACGTACACACTCATC

1.11 GI CG 1CGAGCIGCICAGGTC 1.11 GI CG 1CGAGCIGCICAGGTC

LÜ AGCACGCTGAACAGTGCCTr LÜ AGCACGCTGAACAGTGCCTr

Lt3 GACCTGAGCAGCTCGACGAC Lt3 GACCTGAGCAGCTCGACGAC

Ll4 AAGGCACrGITCAGCGTGCT Ll4 AAGGCACrGITCAGCGTGCT

Li 5 CGG££GAGTGTCTGGAGCAA Li 5 CGG ££ GAGTGTCTGGAGCAA

1.16 GGATGAAGCGGAGTCTGGA 1.16 GGATGAAGCGGAGTCTGGA

HamH I L(7 ATGGATCCGTCGTCGAGCTGCTCAGGTCT HamH I L (7 ATGGATCCGTCGTCGAGCTGCTCAGGTCT

Sai I Ll8 ATCAGC TGAGCACGCTG AACAGTGCCTTC Sai I Ll8 ATCAGC TGAGCACGCTG AACAGTGCCTTC

K.303 GTCTCCGTGACATAAAAGAAAGAC K.303 GTCTCCGTGACATAAAAGAAAGAC

K304 GCCAAGTTCCTGCACTGGCT K304 GCCAAGTTCCTGCACTGGCT

K305 GCCTGTTCTTTTGAAACGTGGTCT K305 GCCTGTTCTTTTGAAACGTGGTCT

K.306 XXGCCTGTT CTTTTGAAACGTGGTCT K.306 XXGCCTGTT CTTTTGAAACGTGGTCT

K311 GTCAAGATGCCTGAGATAGAAC K311 GTCAAGATGCCTGAGATAGAAC

K3I2 TGCTT AGCTTGTGGGGGTGTCA K3I2 TGCTT AGCTTGTGGGGGTGTCA

K3I3 TGCTT AGCTTGTGGGGGTGTCA K3I3 TGCTT AGCTTGTGGGGGTGTCA

K.320 GCTGCGTCCTGCTGCGCACGT K.320 GCTGCGTCCTGCTGCGCACGT

K32I CAGCGGGGAGCGCGCGGCATC K32I CAGCGGGGAGCGCGCGGCATC

K322 TGGGCCACCAGCGCGCGGAAA K322 TGGGCCACCAGCGCGCGGAAA

stanti. 1 CGGCCGCAGCCCGTCAGGCrTGGGG stanti. 1 CGGCCGCAGCCCGTCAGGCrTGGGG

slanti.2 CCGACAQCTCCCGCAGCTGCACCC slanti.2 CCGACAQCTCCCGCAGCTGCACCC

slanti.3 CGT AC AC ACTCATC AGCCAGT GCAGG AACTT GGC slanti. 3 CGT AC AC ACTCATC AGCCAGT GCAGG AACTT GGC

slanli.4 CGCüCCCGCTCGTAGTTGAGCACGCTGAACAGTGCCTTC slanli.4 CGCüCCCGCTCGTAGTTGAGCACGCTGAACAGTGCCTTC

slami 5 ÜCGGAGTCTGGACGTCAGCAGGGCGGGCCTGGCITCCCCi slami 5 ÜCGGAGTCTGGACGTCAGCAGGGCGGGCCTGGCITCCCCi

UTR2 ATTTGACCCACAGGGACCCCCATCCAG UTR2 ATTTGACCCACAGGGACCCCCATCCAG

FW5 ATGACCGCCCTCCTCGTGAG FW5 ATGACCGCCCTCCTCGTGAG

Naml GCCACCCCCGCGATGCC Naml GCCACCCCCGCGATGCC

Nam2 AGCCCTGGCCCCGGCCA Nam2 AGCCCTGGCCCCGGCCA

Nam3 TCCCACGTGCGCAGCAG Nam3 TCCCACGTGCGCAGCAG

Nam4 AGCAGÜACGCAGCGCTG Nam4 AGCAGÜACGCAGCGCTG

PEU I CGCGGTAGTGGCTGCGCAGCAGGGAGCGCACGGC PEU I CGCGGTAGTGGCTGCGCAGCAGGGAGCGCACGGC

BamHI -Stalle BamHI stables

Pvu II Stelle (nicht Sai I Pvu II position (not Sai I

X = Biotin, = K305 X = biotin, = K305

<J\ <J \

O O

CJ CJ

Tabelle 2 Table 2

(Fortsetzung) (Continuation)

PE02 LMIOl PE02 LMIOl

LMI03 LMI03

LM104 LMIOÎ LM104 LMIOÎ

LMI06 LMI06

LM107 LM107

LMI08 LMI08

LMI09 LM_FFYT LMI09 LM_FFYT

TCF061 : 1IUMOI: TCF061: 1IUMOI:

HUM02: HUM02:

HUM03: HUM03:

HUM04: HUM04:

SLW FIN SLW FIN

SLW FIC SLW FIC

SLW F2N SLW F2C SLW F2N SLW F2C

SLW F3N SLW F3N

CCAGGGCTTCCCACGTGCGCAGCAGGACÜCAGCGC CTAGTCTAGATCA / GCT AGCGTAATCTGGAACATCGT A TGGGTA / GTCCAGGATGGTCTTGAAGTC T ACCATGGGCT ACCCAT ACGACGTTCCAGATTACGCTCA CCAGGGCTTCCCACGTGCGCAGCAGGACÜCAGCGC CTAGTCTAGATCA / GCT AGCGTAATCTGGAACATCGT A TGGGTA / GTCCAGGATGGTCTTGAAGTC T ACCATGGGCT ACCCAT ACGACGTTCCAGATTACGCTCA

TATGAGCGTAATCTGGAACGTCGTATGGGTAGCCCATGG TATGAGCGTAATCTGGAACGTCGTATGGGTAGCCCATGG

GTGTACGTCGTCGAGCTCCTCAGGTCTGCCTTTT GTGTACGTCGTCGAGCTCCTCAGGTCTGCCTTTT

ATGTCACGGAG ATGTCACGGAG

GTGT ACGTCGTCG AGCTCCTCAGGTCTTTCGCTT ATGTC ACGGAGACC GTGT ACGTCGTCG AGCTCCTCAGGTCTTTCGCTT ATGTC ACGGAGACC

CCTCAGGTCTTTCnTGCTGTCACGG AG ACAACGTTT1 CAAAAGAACAG CCTCAGGTCTTTCnTGCTGTCACGG AG ACAACGTTT1 CAAAAGAACAG

GGTC'I I ICI I I IATGTCGCGGAGACAACGTTT CAAAAGAACAG GGTC'I I ICI I I IATGTCGCGGAGACAACGTTT CAAAAGAACAG

CTTTCTTTTATGTCACGGCGACAACGTTTCAAAAGAACA CTTTCTTTTATGTCACGGCGACAACGTTTCAAAAGAACA

ATGAGTGTGTACGTCGTCGAGCTCCTCAGGTCTACCACG ATGAGTGTGTACGTCGTCGAGCTCCTCAGGTCTACCACG

CAAAAGAACAGGCTCTTTTTC CAAAAGAACAGGCTCTTTTTC

GGCTGATGAGTGTGTACGTCGTCGA GGCTGATGAGTGTGTACGTCGTCGA

ACGTGGTCTCCGTGACATAAAAGAA ACGTGGTCTCCGTGACATAAAAGAA

AGGT CTTTCrTTT ATGTCACGGA AGGT CTTTCrTTT ATGTCACGGA

CACAGACCCCCGTCGCCTGGTC CACAGACCCCCGTCGCCTGGTC

CGGAGTCTGGACGTCAGCAGGGC CGGAGTCTGGACGTCAGCAGGGC

ceceealccelaaclaaaATGCCGCGCGCTCCCCGCTGC ceceealccelaaclaaaATGCCGCGCGCTCCCCGCTGC

Xba I si.fr/HA tag / hTRT in pGRNI21 inaariwt HA lag in «m» Nde I SWh am 5* Endo von hTRT Anlagerung an LM103 Veränderung = F559A Xba I si.fr/HA day / hTRT in pGRNI21 inaariwt HA was in «m» Nde I SWh at the 5 * endo of hTRT attachment to LM103 change = F559A

(phe > ala) (phe> ala)

Veränderung = F560A Change = F560A

(phe > ala) (phe> ala)

Veränderung = Y561A Change = Y561A

(tyr > ala) (tyr> ala)

Veränderung = T563A Change = T563A

(thr > ala) (thr> ala)

Veränderung = E564A Deletion von FFYVTE (aa 559-554) Change = E564A deletion from FFYVTE (aa 559-554)

komplementär zu TCP1 61 zum DD-Motif, entworfen um sich gegebenenfalb am mTRT anzulagern zum DD-Motif, entworfen um sich gegebenenfalls am mTRT anzulagern entworfen um sich gegebenenfalls am mTRT anzulagern entworfen um sich gegebenenfalls am mTRT anzulagern für ein GST-Fusionskonstrukt (782-1636) Complementary to TCP1 61 to DD-Motif, designed to attach to the mTRT to DD-Motif, designed to attach to the mTRT if necessary designed to attach to the mTRT if necessary designed to attach to the mTRT for a GST fusion construct (782- 1636)

ccEEaaltcellaeltacttaCAAAGAGGTGGcTICI TCGGC ccEEaaltcellaeltacttaCAAAGAGGTGGcTICI TCGGC

UC ■ hTRT seq, Ic =BamH1 Stelle + 2 stop Codons für ein GST-Fusionskonstrukt (782-1636) LIC = hTRT seq, le = EcoR I Stelle + 3 stop Codons SLW FIN / SLW FIC ampHfizieren ein B93 nt Stück von pGRN121 (782 -1636) UC ■ hTRT seq, Ic = BamH1 digit + 2 stop codons for a GST fusion construct (782-1636) LIC = hTRT seq, le = EcoR I digit + 3 stop codons SLW FIN / SLW FIC ampHfify a B93 nt piece of pGRN121 ( 782 -1636)

cgcgeatccetaaclaaaGCCACCTC I I I GGAGGGTGCG für ein GST-Fusionskonstrukt (1625-2458) cgcgeatccetaaclaaaGCCACCTC I I I GGAGGGTGCG for a GST fusion construct (1625-2458)

UC = hTRT seq, Ic = BamH1 Stelle + 2 stop Codons ccpeaaUcgttayttacttaAGACCTGAGCAGCTCGACGAC für ein GST-Fusionskonstrukt (1625-2458) UC = hTRT seq, Ic = BamH1 digit + 2 stop codons ccpeaaUcgttayttacttaAGACCTGAGCAGCTCGACGAC for a GST fusion construct (1625-2458)

UC = hTRT seq, Ic = EcoR I Stelle + 3 stop Codons SLW F2N / SLW F2C amplifizieren ein 872 nt Stück von PGRN121 (1625 - 2458) UC = hTRT seq, Ic = EcoR I site + 3 stop codons SLW F2N / SLW F2C amplify an 872 nt piece of PGRN121 (1625 - 2458)

ceceeatccetaactaaaATGAGTGTGTACGTCGTCGAG für ein GST-Fusionskonstrukt (2426-3274) ceceeatccetaactaaaATGAGTGTGTACGTCGTCGAG for a GST fusion construct (2426-3274)

en en co o en en co o

Tabelle 2 Table 2

(Forsetzung) (Continued)

UC = hTRT seq, le = Ba/nHI Stelle +2 stop Codons für ein GST-Fusionskonstrukt (2426-3274) UC = hTRT seq, le = Ba / nHI position +2 stop codons for a GST fusion construct (2426-3274)

UC=hTRT seq, lc=EcoR I Stelle +3 stop Codons SLW F3N / SLW F3C amplinzieren ein 887 nt Stück von pGRN1121 (2426-3274) UC = hTRT seq, lc = EcoR I position +3 stop codons SLW F3N / SLW F3C amplify an 887 nt piece of pGRN1121 (2426-3274)

ceceeatccgtaactaaaATCCCGCAGGGCTCCATCCTC für ein GST Fuslonskonstrukt (3272-4177) ceceeatccgtaactaaaATCCCGCAGGGCTCCATCCTC for a GST fuslon construct (3272-4177)

UC=hTRT seq, lc=BamHI Stelle + 2 stop Codons ccggaaltcgttaBttacttaGTCCAGGATGGTCTTGAAGTC für ein GST Fuskxiskonstrukt (3272-4177) UC = hTRT seq, lc = BamHI digit + 2 stop codons ccggaaltcgttaBttacttaGTCCAGGATGGTCTTGAAGTC for a GST Fuskxis construct (3272-4177)

UC=hTRT seq, lc=EcoR I Stelle + 3 stop Codons SLW F4N / SLW F4C amplifizieren ein 994 nt Stück von pGRN121 (3272-4177) UC = hTRT seq, lc = EcoR I site + 3 stop codons SLW F4N / SLW F4C amplify a 994 nt piece of pGRN121 (3272-4177)

SLW F3C ccgeaattcettagttacttaGATCCCCTGGCACTGGACO SLW F3C ccgeaattcettagttacttaGATCCCCTGGCACTGGACO

SLW F4N SLW F4C SLW F4N SLW F4C

40-60 GGCATCGCGGGGGTGGCCGGG 40-60 GGCATCGCGGGGGTGGCCGGG

260-280 GGACACCTGGCGGAAGGAGGG 260-280 GGACACCTGGCGGAAGGAGGG

500-520 GCGTGCCAGCAGGTGAACCAG 500-520 GCGTGCCAGCAGGTGAACCAG

770-790 CTCAGGGGCAGCGCCACGCCT 770-790 CTCAGGGGCAGCGCCACGCCT

885-905 AGGTGGC1TC1TCGGCGGGTC 885-905 AGGTGGC1TC1TCGGCGGGTC

1000-1020 GGACAAGGCGTGTCCCAGGGA 1000-1020 GGACAAGGCGTGTCCCAGGGA

1300-1320 GCTGGGGTG ACCGCAGCTCGC 1300-1320 GCTGGGGTG ACCGCAGCTCGC

1520-1540 GATGAACTTCTTGGTGTTCCT 1520-1540 GATGAACTTCTTGGTGTTCCT

2110-2130 GTGCGCC AGGCCCTGTGG ATA 2110-2130 GTGCGCC AGGCCCTGTGG ATA

2295-2315 GCCCATGGGCGGCCTTCTGGA 2295-2315 GCCCATGGGCGGCCTTCTGGA

2450-2470 GAGGCCACTGCTGGCCTCATT 2450-2470 GAGGCCACTGCTGGCCTCATT

2670-2690 GGGTGAGGTGAGGTGTCACCA 2670-2690 GGGTGAGGTGAGGTGTCACCA

3080-3110 GCTGCAGCACACATGCGTGAAACCTGTACGC 3080-3110 GCTGCAGCACACATGCGTGAAACCTGTACGC

3140-3160 GACGCGCAGGAAAAATGTGGG 3140-3160 GACGCGCAGGAAAAATGTGGG

3690-3710 CCGAGCGCCAGCCTGTGGGGA 3690-3710 CCGAGCGCCAGCCTGTGGGGA

55-75 CAGCGGGGAGCGCGCGGCATC 55-75 CAGCGGGGAGCGCGCGGCATC

151-171 CAGCACCTCGCGGTAGTGGCT 151-171 CAGCACCTCGCGGTAGTGGCT

TP 1.1 TCAAGCCAAACCTGAATCTGAG TP 1.1 TCAAGCCAAACCTGAATCTGAG

TP 1.2 CCCGAGTGAATCTTTCTACGC TP 1.2 CCCGAGTGAATCTTTCTACGC

TP 1.3 GTCTCTGGCAGTTTCCTCATCCC TP 1.3 GTCTCTGGCAGTTTCCTCATCCC

TP 1.4 TTTAGGCATCCTCCCAAGCACA TP 1.4 TTTAGGCATCCTCCCAAGCACA

Phosphorothioat Phosphorothloat Phosphorothioat Phosphorothioat Phosphorothioat Phosphorothioat Phosphorothioat Phosphorothioat Phosphorothioat Phosphorothioat Phosphorothioat Phosphorothioat Phosphorothioat Phosphorothioat Phosphorothioat Phosphorothioat Phosphorothioat Phosphorothioate Phosphorothloat Phosphorothioate Phosphorothioate Phosphorothioate Phosphorothioate Phosphorothioate Phosphorothioate Phosphorothioate Phosphorothioate Phosphorothioate Phosphorothioate Phosphorothioate Phosphorothioate Phosphorothioate Phosphorothioate Phosphorothioate

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

IV. TRT-Proteine und Peptide IV. TRT proteins and peptides

A) Allgemeines A) General

Die Erfindung stellt eine grosse Vielzahl von hTRT-Proteinen bereit, die unter anderem zur Hemmung von Telomerase-Aktivität in einer Zelle von Nutzen sind, zur Induktion einer anti-hTRT-lmmunantwort, als ein therapeutisches Reagenz, als Standard oder Kontrolle in einem diagnostischen Assay, als ein Ziel beim Screenen nach Aktivierung oder Hemmung einer Aktivität von hTRT oder Telomerase und zahlreiche weitere Anwendungsmöglichkeiten sind entweder hier beschrieben oder für den Fachmann offensichtlich. Zu den erfindungsgemässen hTRT-Proteinen gehören funktionell aktive Proteine (die z.B. zur Übertragung von Telomerase-Aktivität in eine Telomerase-negative Zelle von Nutzen sind) und Varianten, inaktive Varianten (die z.B. zur Hemmung von Telomerase-Aktivität in einer Zelle von Nutzen sind), hTRT-Polypeptide, Proteine und Telomerase-RNPs (z.B. die Proteine umfassenden Ribonucleo-proteinkomplexe), die eine, verschiedene oder alle funktionelle Aktivitäten von natürlich vorkommender hTRT und Telomerase aufweisen, wie dies zur Veranschaulichung noch ausführlicher nachstehend diskutiert wird. The invention provides a wide variety of hTRT proteins which are useful, inter alia, for inhibiting telomerase activity in a cell, for inducing an anti-hTRT immune response, as a therapeutic reagent, as a standard or as a control in a diagnostic assay , as a target in screening for activation or inhibition of an activity of hTRT or telomerase and numerous other possible uses are either described here or obvious to the person skilled in the art. The hTRT proteins according to the invention include functionally active proteins (which are useful, for example, for transferring telomerase activity into a telomerase-negative cell) and variants, inactive variants (which are useful, for example, for inhibiting telomerase activity in a cell). , hTRT polypeptides, proteins, and telomerase RNPs (eg, the protein-containing ribonucleo-protein complexes) that have one, different, or all functional activities of naturally occurring hTRT and telomerase, as discussed further below for illustration purposes.

In einer Ausführungsform ist das erfindungsgemässe hTRT-Protein ein Polypeptid mit der Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2 (Fig. 17) oder ein Fragment davon. In einer weiteren Ausführungsform unterscheidet sich das hTRT-Polypeptid von SEQ. ID. Nr. 2 durch interne Deletion, Insertionen oder konservative Austausche von Aminosäureresten. In einer verwandten Ausführungsform stellt die Erfindung hTRT-Po-lypeptide bereit, die der SEQ. ID. Nr. 2 im wesentlichen gleichen. Die Erfindung stellt ferner hTRT-Polypeptide bereit, die bezogen auf die Aminosäuresequenz von SEQ. ID. Nr. 2 modifiziert sind, d.h. beispielsweise verkürzt, mutiert, derivatisiert oder an andere Sequenzen fusioniert sind (beispielsweise zur Bildung eines Fusionsproteins). Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung Telomerase-RNPs bereit, die ein erf indungsgemässes hTRT-Protein umfassen, das mit einer Matrizen-RNA einen Komplex bildet (z.B. hTR). In weiteren Ausführungsformen sind eines oder mehrere Telomerase-assoziierte Proteine mit einem hTRT-Protein und/oder hTR assoziiert. In one embodiment, the hTRT protein according to the invention is a polypeptide with the sequence of SEQ. ID. No. 2 (Fig. 17) or a fragment thereof. In another embodiment, the hTRT polypeptide differs from SEQ. ID. No. 2 through internal deletion, insertion or conservative replacement of amino acid residues. In a related embodiment, the invention provides hTRT polypeptides that SEQ. ID. No. 2 essentially the same. The invention also provides hTRT polypeptides that are related to the amino acid sequence of SEQ. ID. No. 2 are modified, i.e. for example truncated, mutated, derivatized or fused to other sequences (for example to form a fusion protein). In addition, the present invention provides telomerase RNPs comprising an hTRT protein according to the invention which complexes with a template RNA (e.g. hTR). In further embodiments, one or more telomerase-associated proteins are associated with an hTRT protein and / or hTR.

Die Erfindung stellt auch weitere natürlich vorkommende hTRT-Spezies oder nicht natürlich vorkommende Varianten zur Verfügung, beispielsweise Proteine mit der Sequenz von SEQ. ID. Nr. 5 (Fig. 20), SEQ. ID. Nr. 10 (Fig. 19) oder einer im wesentlichen gleichen Sequenz und Fragmente, Varianten oder Derivate davon. The invention also provides other naturally occurring hTRT species or non-naturally occurring variants, for example proteins with the sequence of SEQ. ID. No. 5 (Fig. 20), SEQ. ID. No. 10 (Fig. 19) or a substantially identical sequence and fragments, variants or derivatives thereof.

Die Erfindung stellt aber noch weitere hTRT-Spezies und Varianten bereit. Ein Beispiel einer hTRT-Variante kann durch ribosomale Leserahmenverschiebung von mRNA, die durch den Clon 712562 (SEQ. ID. Nr. 3 (Fig. 18)) codiert wird resultieren oder durch die pro90 hTRT-Variante, die in SEQ. ID. Nr. 4 (Fig. 20) gezeigt ist und diese resultieren in der Synthese von hTRT-Polypeptiden, die alle TRT-Motive enthalten (siehe als allgemeines Beispiel beispielsweise Tsuchihashi et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 87 (1990), 2516; Craigengen et al., Cell 50 (1987), 1; Weiss, Cell 62 (1990), 117). Ribosomale Leserahmenverschiebung kann auftreten, wenn spezifische mRNA-Sequenzen oder Sekundärstrukturen bewirken, dass das Ribosom «verharrt» und innerhalb der Sequenz ein Nucleotid vorwärts oder rückwärts springt. Somit könnte eine ribosomale Leserahmenverschiebung auf der mRNA von 712562 die Synthese eines Polypeptids mit etwa 523 Aminosäureresten bewirken. Eine derartige ribosomale Leserahmenverschiebung auf der Sequenz von pro90 könnte ein Protein mit etwa 1071 Resten ergeben. Es ist offensichtlich, dass die sich aus einer ribosomalen Leserahmenverschiebung ergebenden Proteine auch durch die durch die Erfindung bereitgestellten synthetischen Verfahren oder Rekombinationsverfahren exprimiert werden können. However, the invention provides still further hTRT species and variants. An example of an hTRT variant may result from ribosomal reading frame shift of mRNA encoded by clone 712562 (SEQ. ID. No. 3 (FIG. 18)) or by the pro90 hTRT variant described in SEQ. ID. No. 4 (FIG. 20) and these result in the synthesis of hTRT polypeptides that contain all TRT motifs (see, for example, Tsuchihashi et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87 (1990 ), 2516; Craigengen et al., Cell 50 (1987), 1; Weiss, Cell 62 (1990), 117). Ribosomal reading frame shift can occur when specific mRNA sequences or secondary structures cause the ribosome to "freeze" and a nucleotide to jump forwards or backwards within the sequence. Thus, a ribosomal reading frame shift on the 712562 mRNA could result in the synthesis of a polypeptide with approximately 523 amino acid residues. Such a ribosomal reading frame shift on the pro90 sequence could result in a protein with about 1071 residues. It is apparent that the proteins resulting from a ribosomal reading frame shift can also be expressed by the synthetic methods or recombination methods provided by the invention.

Menschliche TRT-Proteine, Peptide und funktionell äquivalente Proteine können durch Reinigung, chemische Synthese oder rekombinante Produktion, wie dies ausführlicher nachstehend diskutiert wird, erhalten werden. Human TRT proteins, peptides, and functionally equivalent proteins can be obtained by purification, chemical synthesis, or recombinant production, as discussed in more detail below.

B) TRT-Proteinaktivität B) TRT protein activity

Die erfindungsgemässen TRT-Polypeptide (einschliesslich Fragmente, Varianten, Produkte von alternativen Allelen und Fusionsproteine) können eine, mehrere oder alle der mit nativer hTRT assoziierten funktionellen Aktivitäten aufweisen. Falls nicht anders angegeben, wird hier davon ausgegangen, dass eine hTRT oder ein anderes TRT-Polypeptid eine angegebene Aktivität aufweist, falls sich die Aktivität entweder von dem hTRT-Protein ohne eine assoziierte RNA (z.B. HTR) oder in einem Komplex aus hTRT mit assoziierter RNA (z.B. hTR) zeigt. Die hTR-bindende Aktivität von hTRT ist ein Beispiel für eine mit dem hTRT-Protein assoziierte Aktivität. Verfahren zur Herstellung von Komplexen aus Nucleinsäuren (z.B. hTR) und den erfindungsgemässen hTRT-Polypeptiden werden nachstehend beschrieben. The TRT polypeptides according to the invention (including fragments, variants, products of alternative alleles and fusion proteins) can have one, more or all of the functional activities associated with native hTRT. Unless otherwise stated, it is assumed here that an hTRT or another TRT polypeptide has a stated activity if the activity is either from the hTRT protein without an associated RNA (eg HTR) or in a complex of hTRT with associated RNA (eg hTR) shows. The hTR-binding activity of hTRT is an example of an activity associated with the hTRT protein. Methods for producing complexes from nucleic acids (e.g. hTR) and the hTRT polypeptides according to the invention are described below.

Die Modifizierung der hTRT-Proteine (z.B. durch chemische oder rekombinante Mittel einschliesslich der Mutation oder Modifikation eines Polynucleotids, das das hTRT-Polynucleotid codiert, oder die chemische Synthese eines Polynucleotids mit einer Sequenz, die sich von der nativen Polynucleotidse-quenz unterscheidet) zur Erzielung eines unterschiedlichen Satzes von Aktivitäten im Vergleich zu nativer hTRT kann bei therapeutischen Anwendungen oder ein Screenen nach spezifischen Modulatoren von hTRT oder Telomerase-Aktivität von Nutzen sein. Darüber hinaus können Assays für eine Reihe Modification of the hTRT proteins (e.g., by chemical or recombinant means, including mutation or modification of a polynucleotide encoding the hTRT polynucleotide, or chemical synthesis of a polynucleotide with a sequence different from the native polynucleotide sequence) to achieve this a different set of activities compared to native hTRT may be useful in therapeutic applications or screening for specific modulators of hTRT or telomerase activity. It can also perform assays for a number

27 27

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

von hTRT-Aktivitäten zur Identifizierung von Agenzien (z.B. die Aktivität modulierende Agenzien) von besonderem Nutzen sein, die mit hTRT oder Telomerase zur Veränderung der Telomeraseaktivität in-teragieren. of hTRT activities to identify agents (e.g., activity modulating agents) that interact with hTRT or telomerase to alter telomerase activity.

Die Aktivitäten von nativer hTRT beinhalten, wie nachstehend diskutiert, katalytische Aktivität von Telomerase (wobei es sich entweder um eine prozessive oder nicht-prozessive Aktivität handeln kann); Telomerase-Prozessivität; Aktivität von konventioneller reversen Transkriptase; nucleolytische Aktivität; Primer- oder Substrat- (Telomer-, synthetisches Telomerase-Substrat- oder Primer-) bindende Aktivität, dNTP-bindende Aktivität; RNA- (d.h. hTR-) bindende Aktivität; und Protein-bindende Aktivität (z.B. Bindung an Telomerase-assoziierte Proteine, Telomer-bindende Proteine oder an einen Komplex aus Protein und telomerer DNA). Natürlich stellt die vorliegende Erfindung auch hTRT-Zusammensetzungen bereit, ohne eine besondere hTRT-Aktivität, jedoch mit nützlichen Aktivitäten, die mit hTRT oder anderen TRT-Proteinen in Bezug stehen (z.B. bestimmte kurze immunogene Peptide, hemmende Peptide). The activities of native hTRT, as discussed below, include catalytic activity of telomerase (which can be either processive or non-processive); Telomerase processivity; Activity of conventional reverse transcriptase; nucleolytic activity; Primer or substrate (telomer, synthetic telomerase substrate or primer) binding activity, dNTP binding activity; RNA (i.e. hTR) binding activity; and protein binding activity (e.g. binding to telomerase-associated proteins, telomer-binding proteins or to a complex of protein and telomeric DNA). Of course, the present invention also provides hTRT compositions without special hTRT activity, but with useful activities related to hTRT or other TRT proteins (e.g. certain short immunogenic peptides, inhibitory peptides).

1) Katalytische Aktivität von Telomerase 1) Catalytic activity of telomerase

Wie hier verwendet, hat ein erfindungsgemässes Polypeptid «katalytische Aktivität von Telomerase», wenn das Polypeptid in der Lage ist, einen DNA-Primer oder Substrat durch Hinzufügung von einem partiellen, einem oder mehr als einem Repeat mit einer Sequenz (z.B. TTAGGG), die von einer Matri-zen-Nucleinsäure (z.B. hTR) codiert wird, zu verlängern. Diese Aktivität kann prozessiv oder nicht-pro-zessiv sein. Prozessive Aktivität liegt dann vor, wenn eine Telomerase-RNP mehrfach Wiederholungseinheiten an einem Primer oder Telomerase anfügt, bevor die DNA von dem Enzymkomplex freigesetzt wird. Nicht prozessive Aktivität liegt dann vor, wenn Telomerase eine partielle oder eine Wiederholungseinheit an einen Primer anfügt und danach freigesetzt wird. In vivo könnte jedoch eine nicht-prozessive Reaktion mehrfach Wiederholungseinheiten durch aufeinanderfolgende Runden der Assoziation, Verlängerung und Dissoziation anfügen. Dies kann aber auch in vitro vorkommen, wird jedoch typischerweise in Standardassays nicht beobachtet aufgrund des sehr grossen molaren Überschusses an Primern gegenüber Telomerase unter Standard-Assaybedingungen. As used herein, a polypeptide according to the invention has "catalytic activity of telomerase" if the polypeptide is capable of a DNA primer or substrate by adding a partial, one or more than one repeat with a sequence (eg TTAGGG) that is encoded by a matrix nucleic acid (eg hTR). This activity can be processive or non-processive. Processive activity occurs when a telomerase RNP adds multiple repeat units to a primer or telomerase before the DNA is released from the enzyme complex. Non-processive activity occurs when telomerase attaches a partial or a repeat unit to a primer and is then released. In vivo, however, a non-process response could add multiple repeat units through successive rounds of association, extension, and dissociation. However, this can also occur in vitro, but is typically not observed in standard assays due to the very large molar excess of primers compared to telomerase under standard assay conditions.

Zur Charakterisierung eines hTRT-Polypeptids bezüglich einer nicht-prozessiven Aktivität wird eine übliche TelomeraseReaktion durchgeführt unter Bedingungen, die eine nicht-prozessive Reaktion begünstigen beispielsweise bei hohen Temperaturen, d.h. 35-40°C, typischerweise 37°C, niedrigen dGTP-Konzentrationen (1 nM oder weniger), hohen Primer-Konzentrationen (5 pM oder mehr), und hohen dATP/TTP-Konzentrationen (2 mM oder mehr), wobei die Temperatur und die dGTP typischerweise die grösste Auswirkung haben. Zur Charakterisierung eines hTRT-Polypeptids bezüglich prozessiver Aktivität wird eine übliche Telomerase-Reaktion durchgeführt unter Verwendung von Bedingungen, die eine prozessive Reaktion begünstigen, beispielsweise 27 bis 34°C, typischerweise 30°C, hohe dGTP-Kon-zentration (10 mM oder mehr), niedrige Primer-Konzentration (1 nM oder weniger) und/oder niedrige dATP und TTP-Konzentrationen (0,3-1 mM), wobei die Temperatur und die für dGTP typische Konzentration am kritischsten sind. Alternativ können ein TRAP-Assay (für prozessive oder moderat-prozessive Aktivität) oder der Dot-Blot- und Gel-Blot-Assay (für prozessive Aktivität) verwendet werden. Das erfin-dungsgemässe hTRT-Polypeptid kann eine nicht-prozessive Aktivität, jedoch keine prozessive Aktivität aufweisen (z.B. wenn eine Änderung des hTRT-Polypeptids die Fähigkeit zur Translokation verringert reduziert oder eliminiert), es kann aber auch nur prozessiv sein oder es kann beide Aktivitäten besitzen. To characterize an hTRT polypeptide for non-process activity, a common telomerase reaction is carried out under conditions that favor a non-process reaction, e.g. at high temperatures, e.g. 35-40 ° C, typically 37 ° C, low dGTP concentrations (1 nM or less), high primer concentrations (5 pM or more), and high dATP / TTP concentrations (2 mM or more), the temperature and the dGTP typically have the greatest impact. To characterize an hTRT polypeptide in terms of process activity, a conventional telomerase reaction is carried out using conditions which favor a process reaction, for example 27 to 34 ° C., typically 30 ° C., high dGTP concentration (10 mM or more ), low primer concentration (1 nM or less) and / or low dATP and TTP concentrations (0.3-1 mM), whereby the temperature and the concentration typical for dGTP are most critical. Alternatively, a TRAP assay (for processive or moderate processive activity) or the dot blot and gel blot assay (for processive activity) can be used. The hTRT polypeptide according to the invention can have a non-processive activity but no processive activity (for example if a change in the hTRT polypeptide reduces or eliminates the ability to translocate), but it can also be only processive or both activities have.

a) Nicht-prozessive Aktivität a) Non-process activity

Eine nicht-prozessive katalytische Aktivität von Telomerase kann den DNA-Primer von der Position, an der das 3'-Ende sich an die RNA-Matrize anlagert, zu dem 5'-Ende der Matrize hin verlängern; diese Verlängerung endet typischerweise mit der Anfügung des ersten G-Rests (z.B. wenn die Matrize hTR ist). Wie in Tabelle 3 gezeigt, hängt die genaue Anzahl der hinzugefügten Nucleotide von der Position des 3'-terminalen Nucleotids des Primers innerhalb der TTAGG-Wiederholungssequenz ab. Non-processive catalytic activity of telomerase can extend the DNA primer from the position where the 3 'end attaches to the RNA template to the 5' end of the template; this extension typically ends with the addition of the first G residue (e.g. if the matrix is hTR). As shown in Table 3, the exact number of nucleotides added depends on the position of the 3'-terminal nucleotide of the primer within the TTAGG repeat sequence.

28 28

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

TABELLE 3 TABLE 3

NICHT-PROZESSIVE AKTIVITÄT NON-PROCESSIVE ACTIVITY

i) i)

TTAGGGttag (DNA) TTAGGGttag (DNA)

3 ' AUCCCAAUC 3 'AUCCCAAUC

5' (RNA) 5 '(RNA)

ü) ü)

TTAGggttag (DNA) TTAGggttag (DNA)

3 ' AUCCCAAUC 3 'AUCCCAAUC

5' (RNA) 5 '(RNA)

in DNA, UC = Primer, le = angefügte Nucleotide in DNA, UC = primer, le = attached nucleotides

Somit werden an den -TTAGGG-Primer (i) 4 Nucleotide angefügt, während an den --TTAG-Primer (ii) 6 Nucleotide angefügt werden. Die in einer prozessiven Reaktion durch Telomerase angefügte erste Wiederholungseinheit entspricht diesem Schritt; in einer prozessiven Reaktion führt Telomerase jedoch einen Translokationsschritt durch, wobei das 3'-Ende freigesetzt wird und an einer Position, am 3'-Be-reich der Matrize, die ausreicht, die Anfügung einer weiteren Wiederholungseinheit zu primen, erneut gebunden wird (siehe Morin, Eur. J. Cancer 33 (1997), 750). Thus, 4 nucleotides are added to the -TTAGGG primer (i), while 6 nucleotides are added to the --TTAG primer (ii). The first repeat unit added in a process reaction by telomerase corresponds to this step; in a processive reaction, however, telomerase carries out a translocation step, whereby the 3 'end is released and is bound again at a position, at the 3' region of the template, which is sufficient to prime the addition of a further repeating unit (see Morin, Eur. J. Cancer 33: 750 (1997).

Eine vollständig nicht-prozessive Reaktion führt lediglich zur Produktion einer Bande in einem üblichen Assay unter Venwendung eines einzigen synthetischen Primers. Da dieses Ergebnis auch durch andere Enzyme hervorgerufen werden kann, beispielsweise die Aktivität einer terminalen Transferase, kann es bei einigen Anwendungen wünschenswert sein, zu verifizieren, dass das Produkt das Ergebnis einer katalytischen Aktivität von Telomerase ist. Eine durch Telomerase (hTRT) erzeugte Bande kann durch verschiedene zusätzliche Merkmale unterschieden werden. Die Anzahl an Nucleotiden, die an das Ende des Primers angefügt wird, sollte mit der Position des Primerterminus übereinstimmen. Somit sollte ein -TTAGGG-Primer 4 angefügte Nucleotide aufweisen und ein -TTAG-Primer 6 Nucleotide (siehe vorstehend). In der Praxis können zwei oder mehr in der Sequenz permutierte Primer, die die gleiche Gesamtlänge, jedoch unterschiedliche 5'- und 3'-Endpunkte aufweisen, verwendet werden. Zur Veranschaulichung soll folgendes Beispiel dienen. Die nicht-prozessive Verlängerung des Primers TTAGGGTTAGGGTTAGGG und GTTAGGGTTAGGGTTAGG wird Produkte erzeugen, deren absolute Länge sich in einem Nucleotid unterscheidet (zu TTAGGGTTAGGGTTAGGG werden 4 angefügt zu einer Gesamtlänge von 22 nt und zu GTTAGGGTTAGGGTTAGG werden 5 angefügt zu einer Gesamtlänge von 23 nt). Die Nucleotidabhängigkeit der Reaktion sollte mit der Position des Primerterminus übereinstimmen. Somit sollte ein Produkt des -TTAGGG-Primers dGTP, TTP und dATP, jedoch nicht dCTP benötigen und ein Produkt des -AGGGTT-Primers sollte die dGTP und dATP, jedoch nicht TTP oder dCTP benötigen. Die Aktivität sollte gegenüber der Vorbehandlung mit RNAse oder Micrococcus-Nu-clease unter Bedingungen, die zum Abbau von hTR und so zur Eliminierung der Matrize führen, empfindlich sein (siehe Morin, Cell 59 (1989) 521). A completely non-processive reaction only results in the production of a band in a conventional assay using a single synthetic primer. Since this result can also be caused by other enzymes, for example the activity of a terminal transferase, it may be desirable in some applications to verify that the product is the result of a catalytic activity of telomerase. A band generated by telomerase (hTRT) can be distinguished by various additional features. The number of nucleotides added to the end of the primer should match the position of the primer terminus. Thus, a -TTAGGG primer should have 4 attached nucleotides and a -TTAG primer should have 6 nucleotides (see above). In practice, two or more primers permuted in the sequence, which have the same overall length but different 5 'and 3' end points, can be used. The following example is intended to illustrate this. The non-procedural extension of the primers TTAGGGTTAGGGTTAGGG and GTTAGGGTTAGGGTTAGG will produce products whose absolute length differs in one nucleotide (4 are added to TTAGGGTTAGGGTTAGGG to a total length of 22 nt and GTTAGGGTTAGGGTT are added to a total length of 5 nGTT. The nucleotide dependence of the reaction should match the position of the primer terminus. Thus, a product of the -TTAGGG primer should need dGTP, TTP and dATP but not dCTP and a product of the -AGGGTT primer should need dGTP and dATP but not TTP or dCTP. The activity should be sensitive to the pretreatment with RNAse or Micrococcus nuclease under conditions which lead to the degradation of hTR and thus to the elimination of the template (see Morin, Cell 59 (1989) 521).

b) Prozessive Aktivität b) Processive activity

In der Praxis kann eine prozessive Aktivität leicht durch das Auftreten einer Leiter von 6 Nucleotiden in einem üblichen Assay, einem TRAP-Assay, Gel-Blot-Assay oder dem Dot-Blot-Assay leicht beobachtet werden. Der übliche Assay wird in Morin, Cell 59 (1989), 521, auf das hier vollinhaltlich Bezug genommen wird, der TRAP-Assay wird in dem US-Patent Nr. 5 629 154 beschrieben; siehe auch die PCT-Veröffentlichung WO 97/15 687, die PCT-Veröffentlichung WO 95/13 381; Krupp et al., Nucleic Acids Res. 25 (1997), 919 und Wright et al.. Nuc. Acids Res. 23 (1995), 3794, auf die hier vollinhaltlich Bezug genommen wird. Der Dot-Blot-Assay ist ausführlich in der parallelen US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/833 377, eingereicht am 4. April 1997, beschrieben, auf die hier vollinhaltlich Bezug genommen wird. Die vorstehend angegebenen Literaturstellen sind hiermit durch die Bezugnahme vollständig und für alle Zwecke mit aufgenommen. Andere Assays bezüglich einer prozessiven katalytischen Aktivität von Telomerase können auch verwendet werden, beispielsweise der «Stretch-PCR»-As-say von Tatematsu et al., Oncogene 13 (1996), 2265. Der Gel-Blot-Assay, eine Kombination von üblichen und Dot-Blot-Assays kann ebenfalls verwendet werden. Bei dieser Variante wird ein üblicher Assay mit einem radioaktiv markierten Nucleotid und mit hohen dGTP-Konzentrationen (z.B. 0,1-2 mM) durchgeführt. Nach Durchführung des üblichen Assays wird die synthetisierte DNA durch denaturierende PAGE aufgetrennt und auf eine Membran (z.B. Nitrocellulose) überführt. Telomer-DNA (das Produkt von Telomerase - ein verlängerter Telomerase-Primer oder Substrat) kann im Anschluss daran durch Ver29 In practice, process activity can easily be observed by the appearance of a 6 nucleotide ladder in a conventional assay, a TRAP assay, gel blot assay, or the dot blot assay. The common assay is described in Morin, Cell 59 (1989), 521, the entire contents of which are incorporated herein by reference; the TRAP assay is described in U.S. Patent No. 5,629,154; see also PCT publication WO 97/15 687, PCT publication WO 95/13 381; Krupp et al., Nucleic Acids Res. 25 (1997), 919 and Wright et al. Nuc. Acids Res. 23 (1995), 3794, to which reference is made here in full. The dot blot assay is described in detail in parallel U.S. patent application serial no. 08/833 377, filed on April 4, 1997, to which reference is hereby made in full. The references cited above are hereby incorporated by reference in their entirety and for all purposes. Other assays for processive catalytic activity of telomerase can also be used, for example the "Stretch-PCR" -As-say by Tatematsu et al., Oncogene 13 (1996), 2265. The gel blot assay, a combination of conventional ones and dot blot assays can also be used. In this variant, a conventional assay is carried out with a radioactively labeled nucleotide and with high dGTP concentrations (e.g. 0.1-2 mM). After performing the usual assay, the synthesized DNA is separated by denaturing PAGE and transferred to a membrane (e.g. nitrocellulose). Telomer DNA (the product of telomerase - an extended telomerase primer or substrate) can then be obtained by Ver29

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

fahren wie Hybridisierung unter Verwendung markierter Telomer-DNA-Sonden (z.B. die CCCTAA-Se-quenz enthaltende Sonden, wie sie in dem Dot-Blot-Assay wie vorstehend verwendet werden) nachgewiesen werden. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist, dass diese empfindlicher als der übliche Assay sind und Informationen über die Grösse der synthetisierten Fragmente und die Prozessivität der Reaktion liefern. drive like hybridization using labeled telomeric DNA probes (e.g. probes containing the CCCTAA sequence as used in the dot blot assay as above). An advantage of this method is that they are more sensitive than the usual assay and provide information about the size of the synthesized fragments and the processivity of the reaction.

c) Aktivitätsbestimmungen c) Activity regulations

Die Telomerase-Aktivität eines hTRT-Polypeptids kann unter Verwendung eines ungereinigten, partiell gereinigten oder im wesentlichen gereinigten hTRT-Polypeptids (z.B. in Assoziation mit hTR) in vitro oder nach Expression in vivo bestimmt werden. Beispielsweise kann Telomerase-Aktivität in einer Zelle (z.B. einer Zelle, die ein rekombinantes erfindungsgemässes hTRT-Polypeptid exprimiert) durch Bestimmung der Längenzunahme oder -abnahme der Telomere nachgewiesen werden. Typische Assays bezüglich einer katalytischen Aktivität von Telomerase können unter Verwendung eines Komplexes von hTRT und hTR durchgeführt werden. Es können jedoch alternative Telomerase-Matrizen- RNAs substituiert sein oder man kann Assays zur Bestimmung einer anderen Aktivität wie Telomerase-Primerbin-dung durchführen. Assays zur Bestimmung der Länge der Telomere sind auf dem Fachgebiet bekannt. Dazu zählen die Hybridisierung von Sonden an Telomer-DNA (ein Amplifikationsschritt kann aufgenommen werden) und eine TRF-Analyse, d.h. die Analyse von Telomer-DNA-Restriktionsfragmenten (TRFs) nach einem Restriktionsendonuclease-Verdau (siehe die PCT-Veröffentlichungen WO 93/235 572 und WO 96/41 016; Counter et al., EMBO J. 11 (1992), 1921; Allsopp et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 89 (1992), 10114; Sanno, Am. J. Clin. Pathol. 106 (1996), 16 und Sanno, Neuroendocrinology 65 (1997), 229. The telomerase activity of an hTRT polypeptide can be determined using an unpurified, partially purified or substantially purified hTRT polypeptide (e.g. in association with hTR) in vitro or after expression in vivo. For example, telomerase activity in a cell (e.g. a cell that expresses a recombinant hTRT polypeptide according to the invention) can be detected by determining the increase or decrease in the length of the telomeres. Typical assays for catalytic activity of telomerase can be performed using a complex of hTRT and hTR. However, alternative telomerase template RNAs can be substituted or one can carry out assays to determine another activity such as telomerase primer binding. Assays to determine the length of the telomeres are known in the art. This includes the hybridization of probes to telomer DNA (an amplification step can be included) and a TRF analysis, i.e. analysis of telomeric DNA restriction fragments (TRFs) after restriction endonuclease digestion (see PCT publications WO 93/235 572 and WO 96/41 016; Counter et al., EMBO J. 11 (1992), 1921; Allsopp et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89 (1992), 10114; Sanno, Am. J. Clin. Pathol. 106 (1996), 16 and Sanno, Neuroendocrinology 65 (1997), 229.

Die katalytische Aktivität von Telomerase eines hTRT-Polypeptids kann durch eine Reihe von Verfahren nachgewiesen werden, wobei die vorstehend beschriebenen Assays und weitere Assays bezüglich einer katalytischen Aktivität von Telomerase verwendet werden können. Bei einem Verfahren wird das hTRT-Protein in einer Telomerase-negativen menschlichen Zelle, in der hTR exprimiert wird (d.h. entweder normalerweise in der Zelle oder durch rekombinante Expression), exprimiert (z.B. wie nachstehend beschrieben) und die Gegenwart oder Abwesenheit von Telomerase-Aktivität wird in der Zelle oder im Zellysat bestimmt. Beispiele für geeignete Telomerase-negative Zellen sind IMR 90 (ATCC, #CCL-186) oder BJ-Zellen (eine menschliche Vorhautfibroblastenlinie; siehe beispielsweise Feng et al., Science 269 (1995), 1236). Zu weiteren Beispielen zählen pigmentierte Retinal-Epithelzellen (RPE), menschliche Na-belschnurarterienepithelzellen (HUVEG; ATCC #CRL-1730), menschliche Aortaendothelzellen (HAEC; Clonetics Corp., #CC-2535) und menschliche Brustepithelzellen (HME; Hammond et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 81 (1984), 5435; Stampfer, T., Tissue Culture Methods 9 (1985), 107). In einer alternativen Ausführungsform wird das hTRT-Polypeptid in einer Telomerase-positiven Zelle (z.B. durch Trans-fektion mit einem hTRT-Expressionsvektor) exprimiert und eine Steigerung der Telomerase-Aktivität in der Zelle im Vergleich zu einer nicht-transfizierten Kontrollzelle wird dann nachgewiesen, wenn das Polypeptid eine katalytische Aktivität von Telomerase aufweist. Üblicherweise ist die katalytische Aktivität von Telomerase in einer mit einem geeigneten Expressionsvektor transfizierten Zelle, die hTRT exprimiert, signifikant erhöht, das heisst sie ist um mindestens etwa das 2fache, mindestens etwa das 5fache oder sogar mindestens etwa das 10fache bis 100fache oder sogar 1000fache höher im Vergleich zu untransfizierten (Kontroll)-Zellen. The catalytic activity of telomerase of an hTRT polypeptide can be detected by a number of methods, the assays described above and other assays relating to catalytic activity of telomerase can be used. In one method, the hTRT protein is expressed (e.g., as described below) in a telomerase negative human cell in which hTR is expressed (ie, either normally in the cell or by recombinant expression) and the presence or absence of telomerase activity is determined in the cell or in cell lysate. Examples of suitable telomerase negative cells are IMR 90 (ATCC, # CCL-186) or BJ cells (a human foreskin fibroblast line; see, for example, Feng et al., Science 269 (1995), 1236). Other examples include pigmented retinal epithelial cells (RPE), human umbilical cord artery epithelial cells (HUVEG; ATCC # CRL-1730), human aortic endothelial cells (HAEC; Clonetics Corp., # CC-2535) and human breast epithelial cells (HME; Hammond et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 (1984), 5435; Stampfer, T., Tissue Culture Methods 9 (1985), 107). In an alternative embodiment, the hTRT polypeptide is expressed in a telomerase-positive cell (eg by transfection with an hTRT expression vector) and an increase in the telomerase activity in the cell compared to a non-transfected control cell is then detected, if the polypeptide has a catalytic activity of telomerase. Usually, the catalytic activity of telomerase is significantly increased in a cell transfected with a suitable expression vector which expresses hTRT, that is to say it is at least about 2 times, at least about 5 times or even at least about 10 times to 100 times or even 1000 times higher in Comparison to untransfected (control) cells.

In einer weiteren alternativen Ausführungsform wird das hTRT-Protein in einer Zelle (z.B. einer Telo-merase-negativen Zelle, in der hTR exprimiert wird, als ein Fusionsprotein (siehe nachstehend) mit einer Markierung oder einem «Epitoptag» zur Erleichterung der Reinigung exprimiert. In einer Ausführungsform wird das RNP aus der Zelle unter Verwendung eines Antikörpers gewonnen, der das «tag» spezifisch erkennt. Bevorzugte «tags» sind typischerweise kurz oder klein und sie können eine Spaltstelle oder andere Eigenschaften aufweisen, die es gestatten, das «tag» von dem hTRT-Polypeptid zu entfernen. Zu den Beispielen von geeigneten «tags» gehören das «Xpres»-Epitop (Invitrogen, Inc. San Diego CA) und weitere Anteile, die von einem Antikörper oder Nucleinsäure spezifisch gebunden werden können. Weitere äquivalente Verfahren sind beispielsweise in Beispiel 6 beschrieben. In einer alternativen Ausführungsform zählen zu den «tags» solche, die von inserierten Sequenzen codiert werden. Beispielsweise von Sequenzen, die in SEQ. ID. Nr. 1 stromaufwärts des ATG-Codons inseriert sind, das die Translation des Proteins von SEQ. ID. Nr. 2 initiiert, wobei die Insertion eines (neuen) Methio-nin-lnitiationscodons in die stromaufwärts gelegene Sequenz mit eingeschlossen sein kann. In a further alternative embodiment, the hTRT protein is expressed in a cell (eg a telomerase negative cell in which hTR is expressed) as a fusion protein (see below) with a label or an "epitope tag" for ease of purification. In one embodiment, the RNP is obtained from the cell using an antibody that specifically recognizes the "tag." Preferred "tags" are typically short or small and may have a cleavage site or other properties that allow the "tag" from the hTRT polypeptide. Examples of suitable tags include the Xpres epitope (Invitrogen, Inc. San Diego CA) and other portions that can be specifically bound by an antibody or nucleic acid. Other equivalent methods are described, for example, in Example 6. In an alternative embodiment, the tags include those from inserted sequences For example, of sequences that are in SEQ. ID. No. 1 upstream of the ATG codon, which translates the protein of SEQ. ID. No. 2 initiated, whereby the insertion of a (new) methionine initiation codon can be included in the upstream sequence.

Natürlich können bei der Expression einer hTRT-Variante in einer Zelle (beispielsweise als ein Fusionsprotein) und der darauffolgenden Isolation (z.B. als ein Ribonucleoproteinkomplex) andere Zellproteine (d.h. Telomerase-assoziierte Proteine) mit dem isolierten Komplex assoziiert sein (direkt oder indirekt daran gebunden). In solchen Fällen wird es manchmal wünschenswert sein, Telomerase-Aktivität in dem Komplex zu bestimmen, der hTRT, hTR und die assoziierten Proteine enthält. Of course, when an hTRT variant is expressed in a cell (e.g., as a fusion protein) and the subsequent isolation (e.g., as a ribonucleoprotein complex), other cell proteins (ie, telomerase-associated proteins) can be associated with (directly or indirectly bound to) the isolated complex. . In such cases it will sometimes be desirable to determine telomerase activity in the complex containing hTRT, hTR and the associated proteins.

30 30th

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

2. Weitere Aktivitäten von Telomerase oder TRT-Protein 2. Other activities of telomerase or TRT protein

Zu den erfindungsgemässen hTRT-Polypeptiden zählen Varianten, denen eine katalytische Aktivität von Telomerase fehlt, die jedoch eine oder mehrere andere Aktivitäten von Telomerase beibehalten haben. Zu diesen anderen Aktivitäten und erfindungsgemässen Verfahren zur Messung solcher Aktivitäten gehören (jedoch ohne Einschränkung darauf) die in den folgenden Abschnitten diskutierten: The hTRT polypeptides according to the invention include variants which lack a catalytic activity of telomerase, but which have retained one or more other activities of telomerase. These other activities and methods according to the invention for measuring such activities include (but are not limited to) those discussed in the following sections:

a) Übliche Aktivität bezüglich reverser Transkriptase a) Usual reverse transcriptase activity

Die übliche Telomerase-Aktivität bezüglich reverser Transkriptase wird beispielsweise in Morin (1997), a.a.O., und Spence et al., Science 267 (1995) 988, beschrieben. Da hTRT konservierte Aminosäuremotive enthält, die für die katalytische Aktivität von reverser Transkriptase erforderlich sind, weist hTRT die Fähigkeit auf, exogene (d.h. nicht-hTR) RNAs zu transkribieren. In einem üblichen RT-Assay wird die Fähigkeit des Enzyms zur Transkription einer RNA-Matrize durch die Verlängerung eines angelagerten DNA-Primers gemessen. The usual telomerase activity with regard to reverse transcriptase is described, for example, in Morin (1997), cited above, and Spence et al., Science 267 (1995) 988. Because hTRT contains conserved amino acid motifs necessary for the catalytic activity of reverse transcriptase, hTRT has the ability to transcribe exogenous (i.e., non-hTR) RNAs. In a conventional RT assay, the ability of the enzyme to transcribe an RNA template is measured by extending an attached DNA primer.

Die Aktivität von reverser Transkriptase kann durch zahlreiche auf dem Fachgebiet bekannte Möglichkeiten bestimmt werden, beispielsweise durch Beobachtung der Zunahme der Grösse eines markierten Nucleinsäureprimers (z.B. RNA oder DNA) oder des Einbaus eines markierten dNTPs. Siehe beispielsweise Ausubel et al., a.a.O. Reverse transcriptase activity can be determined by numerous means known in the art, for example by observing the increase in the size of a labeled nucleic acid primer (e.g. RNA or DNA) or the incorporation of a labeled dNTP. See, for example, Ausubel et al., Op. Cit.

Da hTRT spezifisch mit hTR assoziiert, kann natürlich der DNA-Primer/RNA-Matrize für ein übliches RT-Assay zur Erzielung von Merkmalen, die mit hTR und einem Telomer-DNA-Primer in Bezug stehen, modifiziert werden. Beispielsweise kann die RNA die Sequenz (CCCTAA)n aufweisen, wobei n mindestens 1, mindestens 3, mindestens 10 oder grösser ist. In einer Ausführungsform liegt der (CCCTAA)n-Bereich bei oder in der Nähe des 5'-Endes der RNA (ähnlich zu der 5'-Lokalisierung von Matrizenbereichen in Telomerase-RNAs). In ähnlicher Weise kann der DNA-Primer ein 3'-Ende aufweisen, das Anteile der TTAGGG-Telomersequenz aufweist, beispielsweise XnTTAG, XnAGGG, Xn(TTAGGG)qTTAG, etc., wobei X eine nicht-Telomer-Sequenz ist und n 8-20 oder 60-30 ist und q 1 bis 4 ist. In einer weiteren Ausführungsform weist der DNA-Primer ein 5'-Ende auf, das zu der RNA-Matrize nicht komplementär ist, so dass bei Anlagerung das 5'-Ende ungebunden bleibt. Zusätzliche Modifikationen von Standard-Assays bezüglich reverser Transkription, die bei den erfindungsgemässen Verfahren angewandt werden können, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Since hTRT is specifically associated with hTR, the DNA primer / RNA template can of course be modified for a common RT assay to achieve features related to hTR and a telomeric DNA primer. For example, the RNA can have the sequence (CCCTAA) n, where n is at least 1, at least 3, at least 10 or larger. In one embodiment, the (CCCTAA) n region is at or near the 5 'end of the RNA (similar to the 5' localization of template regions in telomerase RNAs). Similarly, the DNA primer may have a 3 'end that has portions of the TTAGGG telomeric sequence, e.g. XnTTAG, XnAGGG, Xn (TTAGGG) qTTAG, etc., where X is a non-telomeric sequence and n is 8- Is 20 or 60-30 and q is 1 to 4. In a further embodiment, the DNA primer has a 5 'end which is not complementary to the RNA template, so that the 5' end remains unbound when attached. Additional modifications of standard reverse transcription assays that can be used in the methods of the invention are known in the art.

b) Nucleolytische Aktivität b) Nucleolytic activity

Nucleolytische Aktivität von Telomerase wird beispielsweise beschrieben in Morin, 1997, a.a.O. Collins und Grieder, Genes and development 7 (1993) 1364. Telomerase besitzt eine nucleolytische Aktivität (Joyce und Steitz, Trends Biochem. Sei. 12 (1987), 288), jedoch weist die Telomerase-Aktivität besondere Merkmale auf. Telomerase entfernt Nucleotide, üblicherweise nur eines, vom 3^-Ende, wenn das 3'-Ende der DNA an der 5'-Grenze der DNA-Matrize positioniert ist. In Menschen und bei Tetrahymena ist dieses Nucleotid das erste G der Telomer-Wiederholungseinheit (TTAGG im Menschen). Telomerase entfernt bevorzugt G-Reste, weist jedoch keine nucleolytische Aktivität gegenüber anderen Nucleotiden auf. Diese Aktivität kann überwacht werden. Hier werden zur Veranschaulichung zwei unterschiedliche Verfahren beschrieben. Ein Verfahren beinhaltet eine übliche Telomerase-Reaktion mit einem Primer, der die gesamte Matrizensequenz bindet (d.h. an der Matrizengrenze endet; -TAGGGATTAG im Menschen). Nucleolytische Aktivität wird durch Überwachung des Austauschs des letzten dG-Restes gegen ein in dem Assay zur Verfügung gestelltes radioaktiv markiertes dGTP nachgewiesen. Der Austausch wird durch Auftreten einer Bande mit der Grösse des Ausgangsprimers in der Gelelektrophorese und Autoradiographie überwacht. Nucleolytic activity of telomerase is described, for example, in Morin, 1997, op. Cit. Collins and Grieder, Genes and development 7 (1993) 1364. Telomerase has nucleolytic activity (Joyce and Steitz, Trends Biochem. Sci. 12 (1987), 288), but the telomerase activity has special features. Telomerase removes nucleotides, usually only one, from the 3 ^ end when the 3 'end of the DNA is positioned at the 5' border of the DNA template. In humans and in Tetrahymena, this nucleotide is the first G of the telomer repeat unit (TTAGG in humans). Telomerase preferentially removes G residues, but has no nucleolytic activity towards other nucleotides. This activity can be monitored. Two different methods are described here for illustration. One method involves a common telomerase reaction with a primer that binds the entire template sequence (i.e., ends at the template boundary; -TAGGGATTAG in humans). Nucleolytic activity is detected by monitoring the exchange of the last dG residue for a radiolabelled dGTP provided in the assay. The exchange is monitored by the appearance of a band with the size of the initial primer in gel electrophoresis and autoradiography.

In einem bevorzugten Verfahren wird ein DNA-Primer verwendet, der ein «blockiertes» 3'-Ende aufweist, das durch Telomerase nicht verlängert werden kann. Der 3'-blockierte Primer kann in Standard-Telomerase-Assays verwendet werden, er wird jedoch solange nicht verlängert, bis das 3"-Nucleotid durch die nucleolytische Aktivität von Telomerase entfernt wird. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass Telomerase-Aktivität durch verschiedene Standardmassnahmen überwacht werden kann, und das Signal stark und leichter zu quantifizieren ist. Die Blockierung des 3"-Endes des Primers kann auf verschiedene Weise erreicht werden. In einem Verfahren wird ein 3'-Desoxy-dNTP-Rest an das 3'-Ende des Primers unter Verwendung von Standard-Oligonucleotidsyntheseverfahren angefügt. Dieses Ende weist ein 2'OH auf, jedoch nicht das für Telomerase erforderliche 3'OH. Es gibt noch weitere Möglichkeiten zur Blockierung des 3'-Endes, beispielsweise die Verwendung eines 3'-Didesoxy-Endes eines 3'-Amin-Endes etc. Ein Beispiel für einen Primer für einen Assay bezüglich einer nucleolytischen Aktivität von hTRT ist 5'-TTAGGGTTAGGGTTA (G3'), wobei der letzte Rest einem 3'-Desoxy-guanosin-rest entspricht (Glen Research, Sterling, VA). Dem Fachmann sind zahlreiche weitere Varianten bezüglich eines kleinen Primers, die auf der hier zur Verfügung gestellten Lehre basieren, bekannt. A preferred method uses a DNA primer that has a "blocked" 3 'end that cannot be extended by telomerase. The 3'-blocked primer can be used in standard telomerase assays, but is not extended until the 3 "nucleotide is removed by the nucleolytic activity of telomerase. The advantage of this method is that telomerase activity is reduced by various standard measures can be monitored, and the signal is strong and easier to quantify. The blocking of the 3 "end of the primer can be achieved in different ways. In one procedure, a 3'-deoxy-dNTP residue is added to the 3 'end of the primer using standard oligonucleotide synthesis procedures. This end has a 2'OH, but not the 3'OH required for telomerase. There are other ways to block the 3'-end, for example using a 3'-dideoxy end of a 3'-amine end, etc. An example of a primer for an assay for a nucleolytic activity of hTRT is 5'- TTAGGGTTAGGGTTA (G3 ') with the last residue corresponding to a 3'-deoxy-guanosine residue (Glen Research, Sterling, VA). Numerous other variants relating to a small primer, which are based on the teaching provided here, are known to the person skilled in the art.

31 31

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

c) Primer (Telomer)-Bindungsaktivitât c) Primer (Telomer) binding activity

Primer (Telomer)-Bindungsaktivität von Telomerase wird beispielsweise von Morin, 1997, a.a.O.; Collins et al., Celi 81 (1995), 667 und Ham'ngton et al., J. Biol. Chem. 270 (1995), 8893 beschrieben. Man nimmt an, dass Telomerase zwei Stellen aufweist, die einen Telomer-DNA-Primer binden. Die mit der Primerbindung assoziierten RT-Motive zeigen, dass hTRT und/oder hTRT/hTR DNA-Primer-Bindungsak-tivität aufweist. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, Primer-Bindungsaktivität zu bestimmen. Allerdings haben die meisten Verfahren einen Schritt gemeinsam, nämlich die Inkubation eines markierten DNA-Primers mit hTRT oder hTRT/hTR oder anderen TRT/TR-Kombinationen unter geeigneten Bindungsbedingungen. Die meisten Verfahren verwenden auch ein Mittel zur Abtrennung ungebundener DNA von Protein-gebundener DNA. Diese Verfahren beinhalten folgende Schritte: Primer (telomer) binding activity of telomerase is described, for example, by Morin, 1997, op. Cit .; Collins et al., Celi 81 (1995), 667 and Ham'ngton et al., J. Biol. Chem. 270 (1995), 8893. Telomerase is believed to have two sites that bind a telomeric DNA primer. The RT motifs associated with primer binding show that hTRT and / or hTRT / hTR has DNA primer binding activity. There are several ways to determine primer binding activity. However, most methods have one step in common, namely the incubation of a labeled DNA primer with hTRT or hTRT / hTR or other TRT / TR combinations under suitable binding conditions. Most methods also use a means to separate unbound DNA from protein-bound DNA. These procedures include the following steps:

i) Gel-«shift»-Assays (die auch als «electrophoretic/mobility shift»-Assays bezeichnet werden) sind Assays, bei denen ungebundener DNA-Primer von Protein-gebundenem DNA-Primer durch Elektrophorese in einem nicht-denaturierenden Gel abgetrennt wird (Ausubel et al., a.a.O). i) Gel shift assays (which are also referred to as electrophoretic / mobility shift assays) are assays in which unbound DNA primer is separated from protein-bound DNA primer by electrophoresis in a non-denaturing gel (Ausubel et al., Loc. Cit.).

ii) Matrixbindungs-Assays beinhalten verschiedene Variationen hinsichtlich des Grundverfahrens. Dazu gehören die Bindung der hTRT oder des hTRT/hTR-Komplexes an eine Matrix (z.B. Nitrocellulose) entweder vor oder nach Inkubation mit dem markierten Primer. Durch die Bindung der hTRT an eine Matrix kann der ungebundene Primer von dem gebundenen Primer mechanisch abgetrennt werden. Restliche ungebundene DNA kann durch Waschen der Membran vor der Quantifizierung entfernt werden. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass es verschiedene Möglichkeiten zur Kopplung von Proteinen an solche Matrices, feste Träger und Membranen gibt, dazu gehören beispielsweise chemische, photochemische und UV-Quervernetzung, Antikörper/Epitop und nicht-kovalente, hydrophobe, (elektrostatische etc.) Interaktionen. ii) Matrix binding assays involve various variations in the basic procedure. This includes binding the hTRT or the hTRT / hTR complex to a matrix (e.g. nitrocellulose) either before or after incubation with the labeled primer. By binding the hTRT to a matrix, the unbound primer can be mechanically separated from the bound primer. Residual unbound DNA can be removed by washing the membrane before quantification. It is obvious to the person skilled in the art that there are various possibilities for coupling proteins to such matrices, solid supports and membranes, these include, for example, chemical, photochemical and UV crosslinking, antibodies / epitope and non-covalent, hydrophobic, (electrostatic, etc. ) Interactions.

Als DNA-Primer kann jede DNA mit einer Affinität für Telomerase verwendet werden, beispielsweise ein Telomer-DNA-Primer, wie (TTAGGG)n, wobei n 1 bis 10 sein kann und typischerweise 3 bis 5 ist. Die 3'- und 5'-Enden können an jeder Position der Wiederholungssequenz enden. Die Primer können auch 5'- oder 3'-Verlängerungen von Nicht-Telomer-DNA aufweisen, die eine Markierung oder einen Nachweis erleichtern können. Die Primer können auch derivatisiert sein, um beispielsweise den Nachweis oder die Isolierung zu erleichtern. Any DNA with an affinity for telomerase can be used as the DNA primer, for example a telomer DNA primer such as (TTAGGG) n, where n can be 1 to 10 and is typically 3 to 5. The 3 'and 5' ends can end at any position in the repeat sequence. The primers can also have 5 'or 3' extensions of non-telomeric DNA that can facilitate labeling or detection. The primers can also be derivatized, for example to facilitate detection or isolation.

d) dNTP-Bindungsaktivität dNTP-Bindungsaktivität von Telomerase wird beispielsweise in Morin, 1997, a.a.O., und Spence et al., a.a.O. beschrieben. Telomerase benötigt für die Synthese von DNA dNTPs. Das hTRT-Protein weist eine Nucleotid-Bindungsaktivität auf und es kann hinsichtlich einer dNTP-Bindung ähnlich wie andere Nucleotid-bindende Proteine untersucht werden (Kantrowitz et al., Trends Biochem. Sei. 5 (1980), 124). Typischerweise wird die Bindung eines markierten dNTPs oder eines dNTP-Analogs überwacht, so wie dies auf dem Fachgebiet für Nicht-Telomerase-RT-Proteine bekannt ist. d) dNTP binding activity Telomerase's dNTP binding activity is described, for example, in Morin, 1997, cited above, and Spence et al., cited above. described. Telomerase requires dNTPs for the synthesis of DNA. The hTRT protein has nucleotide binding activity and can be assayed for dNTP binding similarly to other nucleotide binding proteins (Kantrowitz et al., Trends Biochem. Sci. 5 (1980), 124). Typically, the binding of a labeled dNTP or a dNTP analog is monitored, as is known in the art for non-telomerase RT proteins.

e) RNA (d.h. hTR)-Bindungsaktivität e) RNA (i.e. hTR) binding activity

RNA (d.h. hTR)-Bindungsaktivität von Telomerase wird beispielsweise in Morin, 1997, a.a.O., beschrieben, Harrington et al., Science 275 (1997), 973 und Collins et al., Cell 81 (1995), 677. Die RNA-Bindungsaktivität eines erfindungsgemässen TRT-Proteins kann auf ähnliche Weise wie dies vorstehend bezüglich des DNA-Primer-Bindungsassays beschrieben wurde, unter Verwendung einer markierten RNA-Sonde nachgewiesen werden. Verfahren zur Abtrennung gebundener und nicht-gebundener RNA und zum Nachweis von RNA sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Diese können für die erfindungsgemässen Aktivitätsassays auf ähnliche Weise wie dies für den DNA-Primer-Bindungsassay beschrieben wurde, angewandt werden. Bei der RNA kann es sich um hTR mit vollständiger Länge handeln, Fragmente von hTR oder andere RNAs, für die gezeigt werden kann, dass sie eine Affinität für Telomerase oder hTRT aufweisen. Siehe US-Patent Nr. 5 583 016 und PCT-Veröffentlichung Nr. 96/40 868 (siehe auch USSN 08/478 352, eingereicht am 7. Juni 1995). RNA (ie, hTR) binding activity of telomerase is described, for example, in Morin, 1997, loc. Cit., Harrington et al., Science 275 (1997), 973 and Collins et al., Cell 81 (1995), 677. The RNA binding activity of a TRT protein according to the invention can be detected in a manner similar to that described above with regard to the DNA primer binding assay, using a labeled RNA probe. Methods for separating bound and unbound RNA and for detecting RNA are well known in the art. These can be used for the activity assays according to the invention in a manner similar to that described for the DNA primer binding assay. The RNA can be full-length hTR, fragments of hTR, or other RNAs that can be shown to have an affinity for telomerase or hTRT. See U.S. Patent No. 5,583,016 and PCT Publication No. 96/40 868 (see also USSN 08/478,352, filed June 7, 1995).

3) Telomerase-Motive als Ziele 3) Telomerase motifs as targets

Wie bereits vorstehend angemerkt, stellt die vorliegende Erfindung hTRT-Polypeptide bereit, die nicht den vollen Satz (wie vorstehend beschrieben) an Telomerase-Aktivitäten von natürlich vorkommender Telomerase, hTRT oder anderen TRTProteinen aufweisen. Es ist angesichts der hier vorliegenden Beschreibung von RT und von Telomerase-spezifischen Motiven von TRT offensichtlich, dass Änderungen oder Mutationen von konservierten Aminosäureresten, die in den oben diskutierten Motivsequenzen gefunden werden können, zur Entstehung von Mutanten mit Aktivitätsverlusten führen, die für therapeutische Zwecke, zum Screenen und zur Charakterisierung von Arzneimitteln und für weitere Anwendungsmöglichkeiten von Nutzen sind. Beispielsweise führt die Deletion der Motive B in den RT-Domänen des endogenen TRT-Gens in s. pombe, wie in Beispiel 1 beschrieben, zu haploiden Zellen, in denen eine progressive Telomerverkürzung bis zu dem Punkt, an dem eine Hybridisierung mit Telomer-Wiederho- As noted above, the present invention provides hTRT polypeptides that do not have the full set (as described above) of telomerase activities from naturally occurring telomerase, hTRT, or other TRTProteins. In view of the present description of RT and of telomerase-specific motifs of TRT, it is obvious that changes or mutations of conserved amino acid residues which can be found in the motif sequences discussed above lead to the formation of mutants with loss of activity which, for therapeutic purposes, are useful for screening and characterizing drugs and for other applications. For example, deletion of motifs B results in the RT domains of the endogenous TRT gene in s. pombe, as described in Example 1, to haploid cells in which a progressive telomer shortening to the point where hybridization with telomer repeat

32 32

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

lungseinheiten fast nicht mehr nachweisbar war, beobachtet werden konnte, was einen Verlust einer katalytischen Aktivität von Telomerase anzeigt. Auf ähnliche Weise können Änderungen in der WxGxS-Stelle von Motiv E die DNA-Primerbindung oder Funktion von Telomerase beeinflussen. Darüber hinaus können Änderungen der Aminosäuren in den Motiven A, B' und C die katalytische Aktivität von Telomerase beeinflussen. Die Mutation des DDMotivs von hTRT kann Telomerase-Aktivität erheblich verringern oder aufheben (siehe Beispiel 16). units were almost no longer detectable, could be observed, which indicates a loss of catalytic activity of telomerase. Similarly, changes in the WxGxS site of motif E can affect DNA primer binding or telomerase function. In addition, changes in the amino acids in motifs A, B 'and C can influence the catalytic activity of telomerase. The mutation of the DDM motif of hTRT can significantly reduce or cancel telomerase activity (see Example 16).

C) Die Synthese von hTRT und anderen TRT-Polypeptiden C) The synthesis of hTRT and other TRT polypeptides

Die Erfindung stellt eine Reihe von Verfahren zur Herstellung der hier offenbarten hTRT und anderer TRT-Polypeptide bereit. In den folgenden Abschnitten wird die chemische Synthese und die rekombinante Expression von hTRT-Proteinen, einschliesslich Fusionsproteinen ausführlich beschrieben. The invention provides a number of methods for making the hTRT and other TRT polypeptides disclosed herein. The chemical synthesis and recombinant expression of hTRT proteins, including fusion proteins, is described in detail in the following sections.

1) Chemische Synthese 1) Chemical synthesis

Die Erfindung stellt hTRT-Polypeptide bereit, die ganz oder teilweise unter Verwendung von allgemeinen, auf dem Fachgebiet gut bekannten chemischen Verfahren synthetisiert wurden (siehe beispielsweise Caruthers et al., Nucleic Acids Res. Symp. Ser. (1980) 215-223 und Horn et al., Nucleic Acids Res. Symp. Ser. (1980), 225-232). Beispielsweise kann eine Peptidsynthese unter Verwendung verschiedener Festphasenverfahren durchgeführt werden (Roberge et al., Science 269 (1995) 202), darunter fällt auch die automatische Synthese (z.B. unter Verwendung des Peptid Synthesizers ABI 431A von Perkin Elmer gemäss den Anweisungen des Herstellers). Wenn ein Protein mit vollständiger Länge erwünscht ist, können kürzere Polypeptide durch Kondensation des Aminoterminus eines Moleküls mit dem Car-boxylterminus des anderen Moleküls zur Bildung einer Peptidbindung fusioniert werden. The invention provides hTRT polypeptides that have been synthesized in whole or in part using general chemical methods well known in the art (see, for example, Caruthers et al., Nucleic Acids Res. Symp. Ser. (1980) 215-223 and Horn et al., Nucleic Acids Res. Symp. Ser. (1980), 225-232). For example, peptide synthesis can be performed using various solid phase methods (Roberge et al., Science 269 (1995) 202), including automatic synthesis (e.g. using the Perkin Elmer ABI 431A peptide synthesizer according to the manufacturer's instructions). If a full-length protein is desired, shorter polypeptides can be fused by condensing the amino terminus of one molecule with the car-boxyl terminus of the other molecule to form a peptide bond.

Die neu synthetisierten Peptide können wesentlich gereinigt werden, beispielsweise durch präparative HPLC (siehe beispielsweise Creighton Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York NY (1983). Die Zusammensetzung der synthetischen Peptide (oder beliebiger anderer erfindungsgemässer Peptide oder Polypeptide) kann durch Aminosäureanalyse oder Sequenzierung (z.B. das Verfahren des Edman-Abbaus; Creighton, a.a.O.) bestätigt werden. Es ist wichtig anzumerken, dass die Aminosäuresequenz von hTRT oder einem beliebigen Teil davon während der Synthese verändert werden kann und/oder unter Verwendung chemischer Verfahren mit Sequenzen von anderen Proteinen kombiniert werden kann. Dies kann auch anderweitig durchgeführt werden und einen beliebigen Teil der Aminosäuresequenzen für jeden beliebigen Zweck zur Herstellung einer Variante der erfindungsgemässen Polypeptide umfassen. The newly synthesized peptides can be substantially purified, for example by preparative HPLC (see, for example, Creighton Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York NY (1983). The composition of the synthetic peptides (or any other peptides or polypeptides according to the invention ) can be confirmed by amino acid analysis or sequencing (eg the Edman degradation method; Creighton, op. cit.) It is important to note that the amino acid sequence of hTRT or any part thereof can be altered during synthesis and / or using chemical methods can be combined with sequences from other proteins, this can also be carried out otherwise and comprise any part of the amino acid sequences for any purpose for the production of a variant of the polypeptides according to the invention.

2) Rekombinante Expression von hTRT und anderen Trtproteinen 2) Recombinant expression of hTRT and other Trt proteins

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren, Reagenzien, Vektoren und Zellen bereit, die zur Expression von hTRT-Polypeptiden und Nucleinsäuren von Nutzen sind, wobei in vitro (zellfrei), ex vivo oder in vivo (auf Zellen oder Organismen basierende) rekombinante Expressionssysteme verwendet werden. In einer Ausführungsform umfasst die Expression des hTRT-Proteins oder eines Fragments davon die Insertion der codierenden Sequenz in einen geeigneten Expressionsvektor (d.h. ein Vektor, der die erforderlichen Elemente für die Transkription und Translation der inserierten codierenden Sequenz enthält). Somit betrifft ein Aspekt der Erfindung die Bereitstellung eines Polynucleotids, das in der Sequenz im wesentlichen identisch ist zu einer ein hTRT-Gen codierenden Sequenz von mindestens 25 Nucleotiden und vorzugsweise für viele Anwendungsmöglichkeiten 50 bis 100 Nucleotiden oder mehr der erfindungsgemässen hTRT-cDNAs oder Gene, das zur Bildung einer Transkriptionseinheit, die ein hTRT-Polypeptid exprimieren kann, mit einem Promotor funktionell verknüpft ist. Zur Konstruktion der Expressionsvek-toren, die eine durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte hTRTSequenz und geeignete Transkriptionskontrollen oder Translationskontrollen enthalten, können dem Fachmann gut bekannte Verfahren angewandt werden (siehe beispielsweise Sambrook et al., a.a.O., Ausubel et al., a.a.o. und die vorliegende Beschreibung). The present invention provides methods, reagents, vectors and cells useful for expressing hTRT polypeptides and nucleic acids using in vitro (cell free), ex vivo or in vivo (cell or organism based) recombinant expression systems. In one embodiment, expression of the hTRT protein or a fragment thereof comprises inserting the coding sequence into an appropriate expression vector (i.e., a vector containing the elements necessary for the transcription and translation of the inserted coding sequence). Thus, one aspect of the invention relates to the provision of a polynucleotide which is essentially identical in sequence to a sequence of at least 25 nucleotides encoding an hTRT gene and preferably 50 to 100 nucleotides or more of the hTRT cDNAs or genes according to the invention for many possible uses, that is operably linked to a promoter to form a transcription unit that can express an hTRT polypeptide. Methods well known to those skilled in the art can be used to construct expression vectors containing an hTRT sequence provided by the present invention and suitable transcriptional or translational controls (see, for example, Sambrook et al., Supra, Ausubel et al., Supra, and the present specification ).

Zu den erfindungsgemässen hTRT-Polypeptiden zählen Fusionsproteine, die hTRT-Polypeptide oder Fragmente des hTRTProteins enthalten. Die Fusionsproteine werden typischerweise rekombinant hergestellt, sie können jedoch auch chemisch synthetisiert werden. Fusionsproteine können zur Erzielung einer erhöhten Expression der hTRT-Polypeptidkonstrukte von Nutzen sein oder zur Herstellung von hTRT-Polypeptiden mit anderen gewünschten Eigenschaften beispielsweise eine Markierung umfassen (z.B. eine enzymatische Reportergruppe), eine bindende Gruppe oder ein Antikörper-Epitop umfassen. Ein Beispiel für ein Fusionsprotein, das hTRT und «enhanced green fluorescent protein» (EGFP)-Se-quenzen umfasst, ist nachstehend in Beispiel 15 beschrieben. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass die in Beispiel 15 und an anderen Stellen hier diskutierten Verwendungen und Anwendungsmöglichkeiten nicht auf die spezifischen Fusionsproteine beschränkt sind, sondern die Verwendungsmöglichkeiten für die verschiedenen Fusionskonstrukte veranschaulichen sollen. The hTRT polypeptides according to the invention include fusion proteins which contain hTRT polypeptides or fragments of the hTRT protein. The fusion proteins are typically produced recombinantly, but they can also be synthesized chemically. Fusion proteins may be useful for increasing expression of the hTRT polypeptide constructs or for producing hTRT polypeptides with other desired properties, for example comprise a label (e.g. an enzymatic reporter group), a binding group or an antibody epitope. An example of a fusion protein comprising hTRT and enhanced green fluorescent protein (EGFP) sequences is described in Example 15 below. It is obvious to the person skilled in the art that the uses and possible uses discussed in Example 15 and elsewhere here are not restricted to the specific fusion proteins, but rather are intended to illustrate the possible uses for the different fusion constructs.

Die erfindungsgemässen Fusionsproteinsysteme können auch zur Erleichterung der effizienten Herstellung und Isolierung von hTRT-Proteinen oder Peptiden verwendet werden. Beispielsweise umfasst in The fusion protein systems according to the invention can also be used to facilitate the efficient production and isolation of hTRT proteins or peptides. For example, in

33 33

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

einigen Ausführungsformen der Nicht-hTRT-Sequenzanteil des Fusionsproteins ein kurzes Peptid, das an ein immobilisiertes Molekül spezifisch gebunden werden kann, so dass das Fusionsprotein von nicht-gebundenen Bestandteilen (wie nicht verwandte Proteine in einem Zellysat) abgetrennt werden kann. Ein Beispiel dafür ist eine Peptidsequenz, die von einem spezifischen Antikörper gebunden wurde. Ein weiteres Beispiel ist ein Peptid, das Polyhistidin-Spuren umfasst, beispielsweise (His)6 oder Histidin-Tryptophan-Sequenzen, die durch ein Harz gebunden werden können, das Nickeloder Kupferionen enthält (d.h. Metallchelat-Affinitätschromatographie). Zu weiteren Beispielen zählen Protein A-Domänen oder Fragmente, die die Reinigung auf immobilisierten Immunglobulin erlauben, und die in dem «FLAGS»-Verlängerungs/-Affinitäts-Reinigungssystem verwendete Domäne (Immunex Corp., Seattle WA). In einigen Ausführungsformen enthält das Fusionsprotein eine Spaltstelle, so dass die hTRT-Sequenz oder eine andere TRT-Polypeptidsequenz von der Nicht-hTRT-Peptidsequenz oder Nicht-hTRT-Proteinsequenz leicht abgetrennt werden kann. In diesem Fall kann die Spaltung chemisch erfolgen (z.B. mit Bromcyan, 2-(2-Nitrophenylsulfonyl)-3-methyl-3'-bromindolen, Hydroxylamin oder niedriger pH-Wert) oder enzymatisch (z.B. mit Faktor Xa, Enterokinase). Die Auswahl des Fusions- und Spaltsystems kann teilweise von dem Anteil (d.h. der Sequenz) des zu exprimierenden hTRT-Polypeptids abhängen. Fusionsproteine sind allgemein beschrieben in Ausubel et al., a.a.O., Kapitel 16, Kroll et al., DNA Cell. Biol. 12 (1993), 441 und in dem Invitrogen-Katalog von 1997 (Invitrogen Inc., San Diego CA). Weitere Beispiele für erfindungsgemässe Fusionsproteine mit Epitop-»tags» oder «tags» und Spaltstellen werden nachstehend in Beispiel 6 bereitgestellt. In some embodiments, the non-hTRT sequence portion of the fusion protein is a short peptide that can be specifically bound to an immobilized molecule so that the fusion protein can be separated from unbound components (such as unrelated proteins in a cell lysate). An example of this is a peptide sequence that was bound by a specific antibody. Another example is a peptide comprising traces of polyhistidine, for example (His) 6 or histidine tryptophan sequences, which can be bound by a resin containing nickel or copper ions (i.e. metal chelate affinity chromatography). Other examples include protein A domains or fragments that allow purification on immobilized immunoglobulin and the domain used in the "FLAGS" extension / affinity purification system (Immunex Corp., Seattle WA). In some embodiments, the fusion protein contains a cleavage site so that the hTRT sequence or other TRT polypeptide sequence can be easily separated from the non-hTRT peptide sequence or non-hTRT protein sequence. In this case, the cleavage can be carried out chemically (e.g. with cyanogen bromide, 2- (2-nitrophenylsulfonyl) -3-methyl-3'-bromoindolen, hydroxylamine or low pH) or enzymatically (e.g. with factor Xa, enterokinase). The selection of the fusion and cleavage system may depend in part on the proportion (i.e. the sequence) of the hTRT polypeptide to be expressed. Fusion proteins are generally described in Ausubel et al., Op. Cit., Chapter 16, Kroll et al., DNA Cell. Biol. 12 (1993), 441 and in the 1997 Invitrogen Catalog (Invitrogen Inc., San Diego CA). Further examples of fusion proteins according to the invention with epitope tags or tags and cleavage sites are provided in Example 6 below.

Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass sich die in diesem Abschnitt diskutierten Expressionssy-steme zwar auf die Expression von hTRT-Polypeptiden konzentrieren, jedoch die gleichen oder ähnliche Zellen, Vektoren und Verfahren zur Expression von erfindungsgemässen hTRT-Polypeptiden verwendet werden können, dazu gehören auch «sense»- und «antisense»-Polynucleotide, wobei die Herstellung von hTRT-Polypeptiden nicht notwendigerweise erwünscht ist. Typischerweise erfordert die Expression eines Polypeptids ein geeignetes Initiationscodon (z.B. Methionin), einen offenen Leserahmen und Translationsregulationssignale (z.B. eine Ribosomenbindungsstelle, ein Terminationscodon), die fehlen können, wenn die Translation einer Nucleinsäuresequenz zur Herstellung eines Proteins nicht erwünscht ist. It is obvious to the person skilled in the art that the expression systems discussed in this section concentrate on the expression of hTRT polypeptides, but the same or similar cells, vectors and methods for expressing hTRT polypeptides according to the invention can be used also “sense” and “antisense” polynucleotides, the production of hTRT polypeptides not necessarily being desired. Typically, expression of a polypeptide requires a suitable initiation codon (e.g. methionine), an open reading frame, and translation regulatory signals (e.g. a ribosome binding site, a termination codon), which may be absent if translation of a nucleic acid sequence to produce a protein is not desired.

Die Expression von hTRT-Polypeptiden und Polynucleotiden kann durchgeführt werden, um die Vorteile zu nutzen, die mit den der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Vorteilen einhergehen. Ein Beispiel eines solchen Vorteils ist die Expression von hTRT-Polypeptiden, die im Anschluss daran von der Zelle, in der sie exprimiert wurden, isoliert werden (z.B. zur Herstellung grosser Mengen von hTRT zur Verwendung als ein Vakzin). Ein zweites Beispiel für einen solchen Vorteil ist die Expression von hTRT in einer Zelle zur Veränderung des Phänotyps der Zelle (wie bei Anwendungen in der Gentherapie). Nicht-Säugerzellen können für die Expression von hTRT zur Reinigung verwendet werden, während eu-karyotische Zellen, insbesondere Säugerzellen (z.B. menschliche Zellen) nicht nur für die Isolation und Reinigung von hTRT verwendet werden können, sondern auch zur Expression von hTRT, wenn eine Veränderung im Phänotyp in einer Zelle erwünscht ist (z.B. um eine Änderung in der Fähigkeit zur Proliferation z.B. bei Anwendungen in der Gentherapie zu erreichen). hTRT-Polypeptide mit einer oder mehreren Telomerase-Aktivitäten (z.B. der katalytischen Aktivität von Telomerase) können beispielsweise, allerdings ohne Beschränkung darauf, in einer Wirtszelle exprimiert werden, um so die Fähigkeit einer Zelle zur Proliferation zu erhöhen (z.B. um eine Zelle zu immortalisieren). Im Gegensatz dazu können hTRT-«antisense»-Polynucleotide oder hemmende Polypeptide typischerweise zur Herabsetzung der Fähigkeit einer Zelle zur Proliferation exprimiert werden (z.B. bei einer Telomerase-positiven malignen Tumorzelle). Zahlreiche spezifische Anwendungsmöglichkeiten werden hier beschrieben, beispielsweise bei der nachstehenden Diskussion der Verwendungen der erfindungsgemässen Reagenzien und Verfahren für therapeutische Anwendungen. Expression of hTRT polypeptides and polynucleotides can be performed to take advantage of the benefits associated with the benefits provided by the present invention. An example of such an advantage is the expression of hTRT polypeptides, which are subsequently isolated from the cell in which they were expressed (e.g., for the production of large amounts of hTRT for use as a vaccine). A second example of such an advantage is the expression of hTRT in a cell to change the phenotype of the cell (as in applications in gene therapy). Non-mammalian cells can be used for expression of hTRT for purification, while eu-karyotic cells, particularly mammalian cells (e.g. human cells) can be used not only for isolation and purification of hTRT, but also for expression of hTRT when there is a change is desired in the phenotype in a cell (eg to achieve a change in the ability to proliferate, for example in applications in gene therapy). For example, but not limited to, hTRT polypeptides with one or more telomerase activities (e.g., the catalytic activity of telomerase) can be expressed in a host cell so as to increase a cell's ability to proliferate (e.g., to immortalize a cell) . In contrast, hTRT "antisense" polynucleotides or inhibitory polypeptides can typically be expressed to decrease a cell's ability to proliferate (e.g., in a telomerase positive malignant tumor cell). Numerous specific applications are described here, for example in the discussion below of the uses of the reagents and methods according to the invention for therapeutic applications.

Zu den Beispielen von nützlichen erfindungsgemässen Expressionssystemen (Zellen, regulatorische Elemente, Vektoren und Expression) gehören eine Reihe von zell-freien Systemen, wie beispielsweise ein Retikulocytenlysat und Weizenkeim-Systeme, die hTRT-Polynucleotide gemäss allgemeiner, auf dem Fachgebiet gut bekannter Verfahren verwenden (siehe beispielsweise Ausubel et al., a.a.O., Kapitel 10). In alternativen Ausführungsformen stellt die Erfindung Reagenzien und Verfahren zur Expression von hTRT in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen bereit. Die vorliegende Erfindung stellt somit Nucleinsäuren bereit, die hTRT-Polynucleotide codieren, Proteine, Protein-Untersequenzen oder Fusionsproteine, die in Bakterien, Pilzen, Pflanzen, Insekten und Tieren, einschliesslich Menschen, auf dem Fachgebiet bekannten Zellexpressionssystemen einschliesslich isolierter Zellen, Zellinien, Zellkulturen, Geweben und ganzen Organismen exprimiert werden können. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass die in eine Wirtszelle oder ein zellfreies Expressionssystem eingeführten hTRT-Polynucleotide üblicherweise mit einer geeigneten Expressionskontrollsequenz für jeden Wirt oder jedes zellfreie System funktionell verknüpft sind. Examples of useful expression systems according to the invention (cells, regulatory elements, vectors and expression) include a number of cell-free systems, such as, for example, a reticulocyte lysate and wheat germ systems, which use hTRT polynucleotides according to general methods well known in the art ( see for example Ausubel et al., loc. cit., chapter 10). In alternative embodiments, the invention provides reagents and methods for expressing hTRT in prokaryotic or eukaryotic cells. The present invention thus provides nucleic acids encoding hTRT polynucleotides, proteins, protein sub-sequences or fusion proteins, which are found in bacteria, fungi, plants, insects and animals, including humans, cell expression systems known in the art including isolated cells, cell lines, cell cultures, Tissues and whole organisms can be expressed. It will be apparent to those skilled in the art that the hTRT polynucleotides introduced into a host cell or cell-free expression system are usually functionally linked to a suitable expression control sequence for each host or cell-free system.

Zu den nützlichen bakteriellen Expressionssystemen gehören E. coli, Bacilli (wie beispielsweise Bacillus subtilis), andere Enterobacteriaceae (wie Salmonella, Serratia und zahlreiche Pseudomonasarten) oder andere bakterielle Wirte (z.B. Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis, Streptococcus thermo-philus, Leuconostoc citrovorum, Leuconostoc mesenteroides», Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus lactis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve und Bifidobacterium longum). Zu den in Prokaryo- Useful bacterial expression systems include E. coli, Bacilli (such as Bacillus subtilis), other Enterobacteriaceae (such as Salmonella, Serratia and numerous Pseudomonas species) or other bacterial hosts (e.g. Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis, Streptococcus thermo-philus, Leuconostocroost, Leuconostocroost mesenteroides », Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus lactis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve and Bifidobacterium longum). To those in prokaryo-

34 34

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

ten nützlichen hTRT-Expressionskonstrukten gehören rekombinante Bakteriophagen, Plasmid- oder Cos-mid-DNA-Expressionsvektoren oder ähnliche und diese beinhalten typischerweise Promotorsequenzen. Zu den Beispielen für Promotoren zählen induzierbare Promotoren, wie der lac-Promotor, der Hybrid-lacZ-Promotor des «Bluescript7»-Phagemids (Stratagene, La Jolla CA) oder pSportl (Gibco BRL); Promotorsysteme vom Phagen lambda; ein Tryptophan (trp)-Promotorsystem; ptrp-lac-Hybride etc. Die bakteriellen Expressionskonstrukte enthalten gegebenenfalls eine Ribosomenbindungsstelle und regulatorische Signalsequenzen für die Termination der Transkription. Zu den veranschaulichenden Beispielen von spezifischen Vektoren, die für die Expression von Nutzen sind, zählen pTrcHis2 (Invitrogen, San Diego CA) , pThioHis A, B & C und zahlreiche andere auf dem Fachgebiet bekannte Vektoren oder solche, die entwickelt werden können (siehe beispielsweise Ausubel, a.a.O.). Zu den für Bakterien nützlichen Vektoren gehören solche, die die Herstellung von hTRT-Fusionsproteinen erleichtern. Zu den für die Expression von Fusionsproteinen in bakteriellen Zellen mit hohem Niveau nützlichen Vektoren zählen, allerdings ohne Beschränkung darauf, die multifunktionalen Clonierungs- und Expressionsvektoren für E. coli, beispielsweise der vorstehend erwähnte Bluescript7 (Stratagene), bei dem die ein hTRT-Protein, ein hTRT-Fusionsprotein oder ein hTRT-Fragment codierende Sequenz im Leserahmen mit Sequenzen für das aminoterminale Met und die sich daran anschliessenden 7 Reste der ß-Galactosidase in den Vektor ligiert werden kann, so dass ein Hybridprotein hergestellt wird (z.B. pIN-Vektoren; van Heeke und Schuster, J. Biol. Chem. 264 (1989), 5503). Vektoren, wie beispielsweise pGEX-Vektoren (z.B. pGEX-2TK; Pharmacia Biotech) können auch zur Expression von Fremdpolypeptiden wie einem hTRT-Protein als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase (GST) verwendet werden. Solche Fusionsproteine können von lysierten Zellen durch Adsorption an Glutathion-Agarose-Kügelchen und anschliessender Elution in Gegenwart von freiem Glutathion gereinigt werden. In solchen Systemen hergestellte Proteine enthalten oft Protease-Spaltstellen für Enterokinase, Thrombin oder Faktor Xa, so dass das erwünschte clonierte Polypeptid von der GST-Einheit, falls erwünscht, freigesetzt werden kann, was bei der Reinigung oder anderen Anwendungsmöglichkeiten von Nutzen ist. Weitere Beispiele sind Fusionsproteine, die hTRT und das Maltose-bindende Protein von E. coli (MBP) oder Thioredoxin von E. coli umfassen. Veranschaulichende Beispiele von in bakteriellen Zellen nützlichen hTRT-Expressions-konstrukten werden in dem nachstehenden Beispiel 6 bereitgestellt. Useful hTRT expression constructs include recombinant bacteriophages, plasmid or cosmid DNA expression vectors, or the like, and typically include promoter sequences. Examples of promoters include inducible promoters, such as the lac promoter, the hybrid lacZ promoter of the “Bluescript7” phagemid (Stratagene, La Jolla CA) or pSportl (Gibco BRL); Phage lambda promoter systems; a tryptophan (trp) promoter system; ptrp-lac hybrids etc. The bacterial expression constructs optionally contain a ribosome binding site and regulatory signal sequences for the termination of the transcription. Illustrative examples of specific vectors useful for expression include pTrcHis2 (Invitrogen, San Diego CA), pThioHis A, B & C, and numerous other vectors known in the art or those that can be developed (see, for example Ausubel, loc. Cit.). Vectors useful for bacteria include those that facilitate the production of hTRT fusion proteins. Vectors useful for the expression of fusion proteins in high level bacterial cells include, but are not limited to, the multifunctional cloning and expression vectors for E. coli, for example the above-mentioned Bluescript7 (Stratagene), in which the hTRT protein, an hTRT fusion protein or an hTRT fragment coding sequence in the reading frame with sequences for the amino terminal Met and the subsequent 7 residues of the β-galactosidase can be ligated into the vector, so that a hybrid protein is produced (for example pIN vectors; van Heeke and Schuster, J. Biol. Chem. 264 (1989), 5503). Vectors such as pGEX vectors (e.g. pGEX-2TK; Pharmacia Biotech) can also be used to express foreign polypeptides such as an hTRT protein as fusion proteins with glutathione-S-transferase (GST). Such fusion proteins can be purified from lysed cells by adsorption on glutathione-agarose beads and subsequent elution in the presence of free glutathione. Proteins made in such systems often contain protease cleavage sites for enterokinase, thrombin or factor Xa so that the desired cloned polypeptide can be released from the GST unit, if desired, which is useful for purification or other uses. Other examples are fusion proteins which include hTRT and the E. coli maltose binding protein (MBP) or E. coli thioredoxin. Illustrative examples of hTRT expression constructs useful in bacterial cells are provided in Example 6 below.

Die vorliegende Erfindung stellt ferner hTRT-Polypeptide zur Verfügung, die in Pilzsystemen wie beispielsweise Dictyostelium und vorzugsweise Hefe wie beispielsweise Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Torulopsi holmil, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces lactis, Hansenula polymorpha und Candida pseudotropicalis exprimiert wurden. Für die Expression von hTRT in Hefe stehen eine Reihe von geeigneten Vektoren zur Verfügung, zu denen Plasmid- und YACs-Vektoren gehören (YACs = künstliche Hefechromosomen). Die Vektoren enthalten typischerweise Expressionskontrollsequenzen, wie z.B. konstitutive oder induzierbare Promotoren (z.B. den a-Faktor, Alkoholoxidase, PGH und 3-Phosphoglyceratkinase oder andere glykolytische Enzyme), einen Replikationsursprung, Terminations-sequenzen etc., je nachdem, was erwünscht ist. Zu den zur Verwendung in Pichia geeigneten Vektoren gehören pPICZ, His6/pPICZB, pPICZalpha, pPIC3.5K, pPIC9K, pA0815, pGAP2A, B & C, pGAP2alpha A, B und C (Invitrogen, San Diego, CA) und zahlreiche weitere auf dem Fachgebiet bekannte oder noch zu entwickelnde Vektoren. In einer Ausführungsform wird der Vektor His6/pPICZB (Invitrogen, San Diego, CA) zur Expression eines His6-hTRT-Fusionsproteins in der Hefe Pichia pastoris verwendet. pYES2 (Invitrogen, San Diego, CA) ist ein Beispiel für einen in Saccharomyces nützlichen Vektor. Veranschaulichende Beispiele von in Hefe nützlichen hTRT-Expressionskonstrukten werden in dem nachstehenden Beispiel 6 bereitgestellt. The present invention further provides hTRT polypeptides which have been expressed in fungal systems such as Dictyostelium and preferably yeast such as Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Torulopsi holmil, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces lactis, Hansenula polymorpha and Candida pseudotropicalis. A number of suitable vectors are available for the expression of hTRT in yeast, including plasmid and YACs vectors (YACs = artificial yeast chromosomes). The vectors typically contain expression control sequences such as e.g. constitutive or inducible promoters (e.g. the a-factor, alcohol oxidase, PGH and 3-phosphoglycerate kinase or other glycolytic enzymes), an origin of replication, termination sequences etc., whichever is desired. Vectors suitable for use in Pichia include pPICZ, His6 / pPICZB, pPICZalpha, pPIC3.5K, pPIC9K, pA0815, pGAP2A, B & C, pGAP2alpha A, B and C (Invitrogen, San Diego, CA) and many others on the Vectors known in the art or to be developed. In one embodiment, the vector His6 / pPICZB (Invitrogen, San Diego, CA) is used to express a His6-hTRT fusion protein in the yeast Pichia pastoris. pYES2 (Invitrogen, San Diego, CA) is an example of a vector useful in Saccharomyces. Illustrative examples of hTRT expression constructs useful in yeast are provided in Example 6 below.

Die erfindungsgemässen hTRT-Polypeptide können auch in Pflanzenzellensystemen exprimiert werden, die mit Pflanzen- oder Pflanzenvirus-Expressionsvektoren (z.B. mit Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) transfiziert oder mit bakteriellen Expressionsvektoren (Ti oder dem Plasmid pBR322) transformiert wurden. In Fällen, bei den Pflanzenvirus-Expressionsvektoren verwendet werden, kann die Expression einer hTRT-codierenden Sequenz durch eine Reihe von Promotoren gesteuert werden. Beispielsweise können virale Promotoren wie die 35S und 19S-Promotoren von CaMV (Brisson et al. Nature 310 (1984) 511-514) allein oder in Kombination mit der Omega Leader-Sequenz von TMV verwendet werden (Takamatsu et al., EMBO J. 6 (1987) 307-311). In einer alternativen Ausführungsform können Pflanzenpromotoren wie der Promotor von dem Gen für die kleine Untereinheit von RU-BISCO (Coruzzi et al., EMBO J. 3 (1984) 1671 bis 1680 und Broglie et al., Science 224 (1984), 838-843) oder Hitzeschockpromotoren (Winter und Sinibaldi, Results Probi. Cell Differ. 17 (1991), 85) oder Promotoren von Genen für Speicherproteine verwendet werden. Diese Konstrukte können durch direkte DNATransformation oder pathogen-vermittelte Transfektion in Pflanzenzellen eingeführt werden (zum weiteren Studium dieser Verfahren sei verwiesen auf Hobbs oder Murry (1992) in McGraw Hill Year-book of Science and Technology, McGraw Hill New York NY, S. 191-196 (1992), oder Weissbach und Weissbach (1988), Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, New York NY, S. 421-463). The hTRT polypeptides according to the invention can also be expressed in plant cell systems which have been transfected with plant or plant virus expression vectors (e.g. with cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV) or transformed with bacterial expression vectors (Ti or the plasmid pBR322). In cases where plant virus expression vectors are used, the expression of an hTRT coding sequence can be controlled by a number of promoters. For example, viral promoters such as the 35S and 19S promoters from CaMV (Brisson et al. Nature 310 (1984) 511-514) can be used alone or in combination with the omega leader sequence from TMV (Takamatsu et al., EMBO J. 6 (1987) 307-311). In an alternative embodiment, plant promoters such as the promoter of the RU-BISCO small subunit gene (Coruzzi et al., EMBO J. 3 (1984) 1671 to 1680 and Broglie et al., Science 224 (1984), 838- 843) or heat shock promoters (Winter and Sinibaldi, Results Probi. Cell Differ. 17 (1991), 85) or promoters of genes for storage proteins. These constructs can be introduced into plant cells by direct DNA transformation or pathogen-mediated transfection (for further study of these methods, reference is made to Hobbs or Murry (1992) in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill New York NY, p. 191 -196 (1992), or Weissbach and Weissbach (1988), Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, New York NY, pp. 421-463).

Ein weiteres, durch die vorliegende Erfindung bereitgestelltes Expressionssystem zur Expression eines hTRT-Proteins ist ein Insektensystem. Bei einem bevorzugten System wird ein Baculovirus-Poly-hedrin-Promotor verwendet. In einem dieser Systeme wird der nucleäre Polyhedrosis-Virus von Autogra-pha californica (AcNPV) als Vektor zur Expression von Fremdgenen in Spodoptera frugiperda-Zellen oder in Trichoplusia-Larven verwendet. Die das gewünschte Gen codierende Sequenz kann in einen Another expression system provided by the present invention for expressing an hTRT protein is an insect system. A preferred system uses a baculovirus polyhedrin promoter. In one of these systems, the nuclear polyhedrosis virus from Autogra-pha californica (AcNPV) is used as a vector for the expression of foreign genes in Spodoptera frugiperda cells or in Trichoplusia larvae. The sequence coding for the desired gene can be converted into a

35 35

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

nicht-essentiellen Bereich des Virus, beispielsweise das Polyhedringen, cloniert werden und unter die Kontrolle des Polyhedrinpromotors gestellt werden. Die erfolgreiche Insertion der Sequenz, die beispielsweise das hTRT-Protein codiert, führt zur Inaktivierung des Polyhedringens und es wird ein rekombinantes Virus hergestellt, dem das Hüllprotein fehlt. Die rekombinanten Viren werden dann zur Infektion von S. frugiperda-Zellen oder Trichoplusia-Larven verwendet, in denen dann die hTRT-Sequenz exprimiert wird (siehe bezüglich allgemeiner Verfahren Smith et al., J. Virol. 46 (1983), 584 und Engelhard et al., Proc. Nati. Acad. Sei. 91 (1994) 3224-7). Zu den für die BaculovirusExpression nützlichen Vektoren zählen pBlueBacHis2 A, B & C; pBlueBac4.5; pMelBacB und zahlreiche andere auf dem Fachgebiet bekannte Vektoren oder noch zu entwickelnde Vektoren. Veranschaulichende Beispiele von hTRT-Expres-sions-Konstrukten, die in Insektenzellen von Nutzen sind, werden in dem nachstehenden Beispiel 6 bereitgestellt. non-essential region of the virus, for example the polyhedrin gene, are cloned and placed under the control of the polyhedrin promoter. The successful insertion of the sequence encoding, for example, the hTRT protein leads to the inactivation of the polyhedrogen wrestling and a recombinant virus is produced which lacks the coat protein. The recombinant viruses are then used to infect S. frugiperda cells or Trichoplusia larvae, in which the hTRT sequence is then expressed (see, for general procedures, Smith et al., J. Virol. 46 (1983), 584 and Engelhard et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 91 (1994) 3224-7). Vectors useful for baculovirus expression include pBlueBacHis2 A, B &C;pBlueBac4.5; pMelBacB and numerous other vectors known in the art or vectors to be developed. Illustrative examples of hTRT expression constructs useful in insect cells are provided in Example 6 below.

Die vorliegende Erfindung stellt auch Expressionssysteme in Säugern und Säugerzellen bereit. Wie bereits vorstehend angemerkt, können hTRT-Polynucleotide in Säugerzellen (z.B. menschlichen Zellen) für die Herstellung von signifikanten Mengen von hTRT-Polypeptiden (z.B. zur Reinigung) oder zur Veränderung des Phänotyps einer Zielzelle (z.B. für Zwecke der Gentherapie, Zellimmortilisation etc.) exprimiert werden. Im letzteren Fall kann das exprimierte hTRT-Polynucleotid ein Polypeptid mit einer katalytischen Aktivität von Telomerase codieren oder auch nicht. Das heisst, es kann ein «sense»- oder «anti-sense»-Polynucleotid, ein hemmendes oder stimulierendes Polypeptid, ein Polypeptid mit null, einer oder mehreren Telomerase-Aktivitäten exprimiert werden, weitere Kombinationen und Varianten sind für den Fachmann nach Lesen dieser Beschreibung offensichtlich. The present invention also provides expression systems in mammals and mammalian cells. As noted above, hTRT polynucleotides can be expressed in mammalian cells (e.g. human cells) for the production of significant amounts of hTRT polypeptides (e.g. for purification) or to change the phenotype of a target cell (e.g. for gene therapy, cell immortilization, etc.) become. In the latter case, the expressed hTRT polynucleotide may or may not encode a polypeptide with a catalytic activity of telomerase. This means that a "sense" or "anti-sense" polynucleotide, an inhibitory or stimulating polypeptide, a polypeptide with zero, one or more telomerase activities can be expressed, other combinations and variants are known to the person skilled in the art after reading these Description obvious.

Zu den für die Expression der erfindungsgemässen Nucleinsäuren geeigneten Gewebekultur-Säuger-zellen gehören jede normale sterbliche, normale oder abnorme unsterbliche tierische oder menschliche Zelle. Dazu gehören: die mit SV40 transformierte Affennierenlinie CV1 (COS-7, ATCC CRL 1651), die menschliche embrionale Nierenlinie (293) (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977), 59), die Babyham-sternierenzellen (BHK, ATCC CCL 10), CHO (ATCC CCL 61 und CRL 9618), Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23 (1980) 243-251), Affennierenzellen (CV1, ATCC CCL 70), Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL 1587), menschliche Cervix-Karzinomzellen (He-La, ATCC CCL 2), Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34), Büffelrattenleberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442), menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75), menschliche Leberzellen (HEP G2, HB 8065), Maus-Brusttumor (MMT 060562, ATCC CCL 51) und TRI-Zellen (Mather et al., Annais N.Y. Acad. Sei. 383 (1982), 44-46, MDCK (ATCC CCL 34 und CRL 6253), HEK 293 (ATCC CRL 1573), WI-38 (ATCC CCL 75) (ATCC: American Type Culture Collection Rockville, MD)). Die Verwendung von Säuger-Gewebezellkulturen zur Expression von Polypeptiden wird allgemein in Winnacker, FROM GENES TO CLONES (VCH-Verlag, N.Y., N.Y., 1987) erläutert. Tissue culture mammalian cells suitable for the expression of the nucleic acids according to the invention include any normal mortal, normal or abnormal immortal animal or human cell. These include: the CV1 monkey kidney line transformed with SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), the human embryonic kidney line (293) (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977), 59), the Babyham star kidney cells (BHK, ATCC CCL 10), CHO (ATCC CCL 61 and CRL 9618), mouse Sertoli cells (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23 (1980) 243-251), monkey kidney cells (CV1, ATCC CCL 70), kidney cells of the African Vervet Monkey (VERO-76, ATCC CRL 1587), human cervical carcinoma cells (He-La, ATCC CCL 2), dog kidney cells (MDCK, ATCC CCL 34), buffalo rat liver cells (BRL 3A, ATCC CRL 1442), human lung cells (W138 , ATCC CCL 75), human liver cells (HEP G2, HB 8065), mouse breast tumor (MMT 060562, ATCC CCL 51) and TRI cells (Mather et al., Annais NY Acad. Sci. 383 (1982), 44- 46, MDCK (ATCC CCL 34 and CRL 6253), HEK 293 (ATCC CRL 1573), WI-38 (ATCC CCL 75) (ATCC: American Type Culture Collection Rockville, MD)). The use of mammalian tissue cell cultures to express polypeptides is generally discussed in Winnacker, FROM GENES TO CLONES (VCH Verlag, N.Y., N.Y., 1987).

Für Säugerwirtszellen werden auf Viren basierende und nichtvirale Expressionssysteme bereitgestellt. Zu den nicht-viralen Vektoren und Systemen gehören Plasmide, episomale Vektoren, typischerweise mit einer Expressionskassette für Expression eines Proteins oder einer RNA, und menschliche künstliche Chromosomen (siehe z.B. Harrington et al., Nat Genet 15 (1997), 345). Zu den für die Expression von hTRT-Polynucleotiden und Polypeptiden in Säugerzellen (z.B. menschlichen Zellen) nützlichen nicht-viralen Vektoren gehören pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C (Invitrogen, San Diego CA), MPSV-Vektoren, andere in dem Invitrogen-Katalog von 1997 beschriebene Vektoren (Invitrogen Inc., San Diego CA), der aufgrund der Bezugnahme vollständig zum Offenbarungsgehalt der vorliegenden Beschreibung zählt, sowie bezüglich weiterer Proteine zahlreiche andere auf dem Fachgebiet bekannte Vektoren und Systeme. Veranschaulichende Beispiele von in Säugerzellen nützlichen hTRT-Expressionskonstrukten werden nachstehend in Beispiel 6 bereitgestellt. Virus-based and non-viral expression systems are provided for mammalian host cells. Non-viral vectors and systems include plasmids, episomal vectors, typically with an expression cassette for expression of a protein or an RNA, and human artificial chromosomes (see e.g. Harrington et al., Nat Genet 15 (1997), 345). Non-viral vectors useful for the expression of hTRT polynucleotides and polypeptides in mammalian cells (e.g. human cells) include pcDNA3.1 / His, pEBVHis A, B & C (Invitrogen, San Diego CA), MPSV vectors, others in the 1997 Invitrogen catalog (Invitrogen Inc., San Diego, CA), which is incorporated by reference in its entirety into the disclosure of the present specification, and numerous other vectors and systems known in the art for other proteins. Illustrative examples of hTRT expression constructs useful in mammalian cells are provided in Example 6 below.

Zu den nützlichen viralen Vektoren zählen Vektoren, die auf Retroviren basieren, Adenoviren, adeno-assoziierte Viren, Herpesviren, auf SV40 basierende Vektoren, Papilloma Viren, HBP-Epstein Barr Virus, Vaccinia Virus-Vektoren und «Semliki Forest»-Virus (SFV). SFV und Vacciniavektoren werden allgemein in Ausubel et al., a.a.O., Kapitel 16 diskutiert. Diese Vektoren sind oft aus zwei Komponenten aufgebaut, einem modifizierten viralen Genom und einer dieses umgebenden Hüll-Struktur (siehe allgemein Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49 (1995), 807). Allerdings werden gelegentlich virale Vektoren in nackter Form oder umhüllt mit Proteinen, die nicht zu viralen Proteinen zählen, eingeführt. Die virale Nucleinsäure in einem Vektor kann jedoch auf vielfältige Weise verändert werden, beispielsweise wenn dies für die Gentherapie erwünscht ist. Ziele dieser Veränderungen sind das Wachstum des Virus in Zielzellen zu verhindern und Beibehaltung seiner Fähigkeit in Vektorform in verfügbaren Pack- oder Helferzellen zu wachsen, um Raum innerhalb des viralen Genoms zur Insertion von exogenen DNA-Sequenzen bereitzustellen und um neue Sequenzen einzufügen, die das gewünschte Gen codieren und eine geeignete Expression ermöglichen. Somit umfassen Vektor-Nucleinsäuren im allgemeinen zwei Bestandteile: essentielle in eis wirkende Viralsequenzen zur Replikation und Verpackung in einer Helferlinie und die Transkriptionseinheit für das exogene Gen. Andere virale Funktionen werden in einer spezifischen Ver-packungs- oder Helfer-Zellinie in trans exprimiert. Adenovirus-Vektoren (z.B. zur Verwendung in der Gentherapie bei Menschen) sind beispielsweise in Rosenfeld et al., Cell 68 (1992), 143 und in den PCT-Veröffentlichungen Wo 94/12 650; 94/12 649 und 94/12 629 beschrieben. In Fällen, in denen als Expressionsvektor ein Adenovirus verwendet wird, kann eine hTRT codierende Sequenz in einen Ade-novirus-Transkriptions/Translations-Komplex ligiert werden, der aus dem späten Promotor und der drei36 Useful viral vectors include vectors based on retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses, SV40-based vectors, papilloma viruses, HBP-Epstein Barr virus, vaccinia virus vectors and “Semliki Forest” virus (SFV) . SFV and vaccinia vectors are discussed generally in Ausubel et al., Op. Cit., Chapter 16. These vectors are often made up of two components, a modified viral genome and an envelope structure surrounding it (see generally Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49 (1995), 807). However, viral vectors are sometimes introduced in the naked form or coated with proteins that are not viral proteins. However, the viral nucleic acid in a vector can be modified in a variety of ways, for example if this is desired for gene therapy. The goal of these changes is to prevent the virus from growing in target cells and to maintain its ability to grow in vector form in available pack or helper cells to provide space within the viral genome for insertion of exogenous DNA sequences and to insert new sequences that are desired Encode gene and allow suitable expression. Thus vector nucleic acids generally comprise two components: essential viral sequences acting in ice for replication and packaging in a helper line and the transcription unit for the exogenous gene. Other viral functions are expressed in trans in a specific packaging or helper cell line. Adenovirus vectors (e.g. for use in gene therapy in humans) are described, for example, in Rosenfeld et al., Cell 68 (1992), 143 and in PCT publications Wo 94/12 650; 94/12 649 and 94/12 629. In cases where an adenovirus is used as the expression vector, an hTRT coding sequence can be ligated into an ade novirus transcription / translation complex which consists of the late promoter and the three36

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

teiligen Leadersequenz besteht. Die Insertion in einen nicht-essentiellen E1- oder E3-Bereich des viralen Genoms ergibt ein lebensfähiges Virus, das in infizierten Wirtszellen exprimieren kann (Logan und Shenk, Proc. Nati. Acad. Sei. 81 (1984), 3655). Replikations-defiziente retrovirale Vektoren, die eine therapeutische Polynucleotidsequenz als Teil des retroviralen Genoms enthalten, werden beispielsweise beschrieben in Miller et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990) 4239; Kolberg, J. NIH Res. 4 (1992), 43 und Cornette et al., Hum. Gene Ther. 2 (1991), 215. partial leader sequence. Insertion into a non-essential E1 or E3 region of the viral genome results in a viable virus that can express in infected host cells (Logan and Shenk, Proc. Nati. Acad. Sci. 81 (1984), 3655). Replication-deficient retroviral vectors that contain a therapeutic polynucleotide sequence as part of the retroviral genome are described, for example, in Miller et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990) 4239; Kolberg, J. NIH Res. 4 (1992), 43 and Cornette et al., Hum. Gene Ther. 2: 215 (1991).

In Säuger-Zellsystemen sind oft Promotoren von Säugergenen oder Säugerviren geeignet. Geeignete Promotoren können konstitutiv sein, Zelltyp-spezifisch, Stadium-spezifisch und/oder modulierbar oder regulierbar (z.B. durch Hormone, wie beispielsweise Glucocorticoide). Zu nützlichen Promotoren zählen, jedoch ohne Beschränkung darauf, der Metallothionein-Promotor, der konstitutive «Major late»-Promotor von Adenovirus, der Dexamethason-induzierbare MMTV, der SV40-Promotor, der MRP pollll-Promotor, der konstitutive MPSV-Promotor, der Tetracyclin-induzierbare CMV-Promotor (wie beispielsweise der menschliche «immediate-early» CMV-Promotor), der konstitutive CMV-Promotor und auf dem Fachgebiet bekannte Promotor-Enhancer-Kombinationen. Promoters of mammalian genes or mammalian viruses are often suitable in mammalian cell systems. Suitable promoters can be constitutive, cell type-specific, stage-specific and / or modulatable or regulatable (e.g. by hormones such as glucocorticoids). Useful promoters include, but are not limited to, the metallothionein promoter, the constitutive major late promoter of adenovirus, the dexamethasone inducible MMTV, the SV40 promoter, the MRP pollll promoter, the constitutive MPSV promoter, the Tetracycline inducible CMV promoter (such as the human immediate early CMV promoter), the constitutive CMV promoter and promoter-enhancer combinations known in the art.

Für eine effiziente Expression eines hTRT-Polynucleotids und/oder die Translation einer hTRT-Protei-ne codierenden Sequenz können auch weitere regulatorische Elemente erforderlich oder erwünscht sein. Für die Translation beinhalten diese Elemente typischerweise ein ATG-Initiationscodon und eine benachbarte Ribosomen-Bindungsstelle oder andere Sequenzen. Für das hTRT-Protein codierende Sequenzen sind, falls dessen Initiationscodon und stromaufwärts gelegene Promotorsequenzen in einen Expressionsvektor inseriert sind, keine zusätzlichen Translationssignale oder andere Kontrollsignale erforderlich. In Fällen jedoch, in denen nur eine codierende Sequenz oder ein Teil davon inseriert ist, müssen oft exogene Transkriptions- und/oder Translations-Kontrollsignale (z.B. der Promotor, die Ribo-somenbindungsstelle und das ATG-Initiationscodon) bereitgestellt werden. Darüber hinaus muss das Initiationscodon typischerweise im korrekten Leserahmen vorliegen, um die Translation des gewünschten Proteins zu gewährleisten. Exogene Transkriptionselemente und Initiationscodons können von zahlreichen Quellen, sowohl natürlichen als auch synthetischen, stammen. Zusätzlich kann die Effizienz der Expression durch die Einfügung von für das verwendete Zellsystem geeigneten Enhancern verstärkt werden (Scharf et al., Results Probi. Cell Differ. 20 (1994), 125 und Bittner et al., Meth. Enzymol. 153 (1987), 516). Beispielsweise kann zur Steigerung der Expression in Säuger-Wirtszellen der SV40-En-hancer oder der CMV-Enhancer verwendet werden. Further regulatory elements may also be required or desired for an efficient expression of an hTRT polynucleotide and / or the translation of an hTRT protein-coding sequence. For translation, these elements typically include an ATG initiation codon and an adjacent ribosome binding site or other sequences. If the initiation codon and upstream promoter sequences are inserted into an expression vector, no additional translation signals or other control signals are required for the hTRT protein coding sequences. However, in cases where only a coding sequence or a part thereof is inserted, exogenous transcription and / or translation control signals (e.g. the promoter, the ribosome binding site and the ATG initiation codon) often have to be provided. In addition, the initiation codon must typically be in the correct reading frame to ensure translation of the desired protein. Exogenous transcription elements and initiation codons can come from numerous sources, both natural and synthetic. In addition, the efficiency of expression can be increased by the insertion of enhancers suitable for the cell system used (Scharf et al., Results Probi. Cell Differ. 20 (1994), 125 and Bittner et al., Meth. Enzymol. 153 (1987) , 516). For example, the SV40 enhancer or the CMV enhancer can be used to increase expression in mammalian host cells.

Die Expression von hTRT-Genprodukten kann auch durch Aktivierung eines hTRT-Promotors oder Enhancers in einer Zelle, wie beispielsweise einer menschlichen Zelle, z.B. einer Telomerase-negativen Zellinie, bewirkt (erhöht) werden. Die Aktivierung kann durch eine Reihe von unterschiedlichen Massnahmen erreicht werden. Dazu zählen die Verabreichung eines einen exogenen Promotor aktivierenden Agens oder die Hemmung eines zellulären Bestandteils, der die Expression des hTRT-Gens unterdrückt. Natürlich wird umgekehrt die Hemmung der Promotorfunktion, so wie dies nachstehend beschrieben ist, die hTRT-Genexpression herabsetzen. Expression of hTRT gene products can also be accomplished by activating an hTRT promoter or enhancer in a cell, such as a human cell, e.g. a telomerase-negative cell line. Activation can be achieved through a number of different measures. These include the administration of an exogenous promoter activating agent or the inhibition of a cellular component that suppresses the expression of the hTRT gene. Conversely, of course, inhibition of promoter function, as described below, will decrease hTRT gene expression.

Die Erfindung stellt die induzierbare und reprimierbare Expression von hTRT-Polypeptiden unter Verwendung solcher Systeme wie des Ecdyson-induzierbaren Expressionssystems (Invitrogen) und die «Tet-On and Tet-off» Tetracyclin-regulierten Systeme von Clontech bereit. Bei dem durch Ecdyson induzierbaren Expressionssystem wird ein Analogon des Steroidhormons Ecdyson, Muristeron A zur Aktivierung der Expression eines rekombinanten Proteins über einen heterodimären nucleären Rezeptor verwendet (No et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 93 (1996), 3346). In einer Ausführungsform wird hTRT in den pIND-Vektor (Clontech) cloniert, der fünf modifizierte Ecdyson-Reaktionselemente (E/GREs) stromaufwärts eines minimalen Hitzeschockpromotors und der Mehrfachclonierungsstelle enthält. Dieses Kon-strukt wird dann in den Ecdyson-Rezeptor stabil exprimierenden Zellinien transfiziert. Nach der Trans-fektion werden die Zellen zur Induktion der intrazellulären Expression von pIND mit Muristeron A behandelt. In einer anderen Ausführungsform wird das hTRT-Polypeptid unter Verwendung der «Tet-on and Tet-off »-Expressionssysteme (Clontech) neben den beschriebenen regulierten Hochniveau-Genexpressionssystemen exprimiert (Gossen et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 89 (1992), 5547 und Gossen et al., Science 268 (1995), 1766). The invention provides the inducible and repressible expression of hTRT polypeptides using such systems as the Ecdyson-inducible expression system (Invitrogen) and the "Tet-On and Tet-off" tetracycline-regulated systems from Clontech. In the expression system inducible by ecdyson, an analogue of the steroid hormone ecdysone, muristerone A, is used to activate the expression of a recombinant protein via a heterodimeric nuclear receptor (No et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 93 (1996), 3346) . In one embodiment, hTRT is cloned into the pIND vector (Clontech), which contains five modified Ecdyson reaction elements (E / GREs) upstream of a minimal heat shock promoter and the multiple cloning site. This construct is then transfected into cell lines stably expressing the ecdysone receptor. After the transfection, the cells are treated with Muristeron A to induce the intracellular expression of pIND. In another embodiment, the hTRT polypeptide is expressed using the "tet-on and tet-off" expression systems (Clontech) in addition to the regulated high-level gene expression systems described (Gossen et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 89 (1992), 5547 and Gossen et al., Science 268 (1995), 1766).

Die erfindungsgemässen hTRT-Vektoren können in eine Zelle, ein Gewebe, Organ, einen Patienten oder ein Tier durch eine Reihe von Verfahren eingeführt werden. Die erfindungsgemässen Nucleinsäu-reexpressionsvektoren (typischerweise dsDNA) können in die gewählte Wirtszelle durch allgemein bekannte Verfahren wie die Calciumchlorid-Transformation (für bakterielle Systeme), Elektroporation, Calci-umphosphat-Behandlung, Liposomen-vermittelte Transformation, Injektion und Mikroinjektion, ballistische Verfahren, Virosomen, Immunoliposomen, Polykation:Nucleinsäure-Konjugate, nackte DNA, künstliche Virione, Fusion an das Herpesvirus-Strukturprotein VP22 (Elliot und O'Hare, Cell 88, 223) durch Agens-verstärkte Aufnahme von DNA und ex-vivo-Transduktion transferiert werden. Nützliche Liposomen-vermittelte DNA-Transferverfahren sind in den US-Patenten Nr. 5 049 386, 4 946 787 und 4 897 355, in den PCT-Veröffentlichungen WO 91/17 424 und WO 91/16 024 beschrieben sowie in Wang und Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 147 (1987), 980; Wang und Huang, Biochemistry 28 (1989), 9508; Litzinger und Huang, Biochem. Biophys. Acta 1113 (1992), 201; Gao und Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 179 (1991), 280. Immunliposomen als Träger für exogene Polynucleotide wurden ebenfalls beschrieben (Wang und Huang, Proc. Nati. Acad. Sei. USA 84 (1987), 7851 und Trubetskoy et al., The hTRT vectors according to the invention can be introduced into a cell, a tissue, organ, a patient or an animal by a number of methods. The nucleic acid re-expression vectors according to the invention (typically dsDNA) can be introduced into the selected host cell by generally known methods such as calcium chloride transformation (for bacterial systems), electroporation, calcium phosphate treatment, liposome-mediated transformation, injection and microinjection, ballistic methods, virosomes , Immunoliposomes, polycation: nucleic acid conjugates, naked DNA, artificial virions, fusion to the herpes virus structural protein VP22 (Elliot and O'Hare, Cell 88, 223) can be transferred by agent-enhanced uptake of DNA and ex vivo transduction. Useful liposome-mediated DNA transfer methods are described in U.S. Patents 5,049,386, 4,946,787 and 4,897,355, PCT publications WO 91/17 424 and WO 91/16 024, and Wang and Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 147: 980 (1987); Wang and Huang, 1989 Biochemistry 28: 9508; Litzinger and Huang, Biochem. Biophys. Acta 1113 (1992), 201; Gao and Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 179 (1991), 280. Immunoliposomes as carriers for exogenous polynucleotides have also been described (Wang and Huang, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7851 and Trubetskoy et al.,

37 37

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Biochem. Biophys. Acta 1131 (1992), 311). Diese dürften im Vergleich zu Liposomen eine verbesserte Zelltyp-Spezifität aufgrund des Einschlusses von spezifischen Antikörpern, die vermutlich an Oberflä-chenantigene auf spezifischen Zelltypen binden, verbesserte Zelltypenspezifität aufweisen. Behr et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 86 (1989), 6982, berichten über die Verwendung von Lipopolyamin als ein Reagenz zur Vermittlung der Transfektion selbst» wobei es nicht nötig ist, zur Bildung von Liposomen irgendein zusätzliches Phospholipid zuzugeben. Geeignete Einführungsverfahren können vom Fachmann im Hinblick auf geeignete Praktiken und Erfordernisse bezüglich der Regulation (z.B. zur Gentherapie oder zur Herstellung von Zellinien zur Expression von rekombinanten Proteinen) ausgewählt werden. Natürlich können die oben aufgezählten Einführungsverfahren auch zum Transfer von Nucleinsäuren in Zellen für die Gentherapie, den Transfer in Gewebekulturzellen etc. verwendet werden. Biochem. Biophys. Acta 1131 (1992), 311). These should have improved cell type specificity compared to liposomes due to the inclusion of specific antibodies, which presumably bind to surface antigens on specific cell types, have improved cell type specificity. Behr et al., Proc. Nati. Acad. Be. USA 86: 6982 (1989) report the use of lipopolyamine as a reagent to mediate transfection itself, with no need to add any additional phospholipid to form liposomes. Suitable introductory methods can be selected by the person skilled in the art with regard to suitable practices and requirements with regard to regulation (e.g. for gene therapy or for the production of cell lines for the expression of recombinant proteins). Of course, the introductory methods listed above can also be used to transfer nucleic acids into cells for gene therapy, transfer into tissue culture cells, etc.

Für die langfristige Herstellung von rekombinanten Proteinen mit hoher Ausbeute ist oft eine stabile Expression erwünscht. Beispielsweise können hTRT stabil exprimierende Zellinien unter Verwendung der erfindungsgemässen Expressionsvektoren hergestellt werden, die virale Replikationsursprünge oder endogene Expressionselemente und ein selektierbares Markergen enthalten. Nach der Einschleusung des Vektors kann man die Zellen 1 bis 2 Tage in angereicherten Medien wachsen lassen, bevor man zu Selektivmedien wechselt. Der selektierbare Marker dient dazu, zur Selektion eine Resistenz zu verleihen. Seine Gegenwart erlaubt das Wachstum von Zellen, die die eingeschleusten Sequenzen in Selektivmedien erfolgreich exprimieren. Resistente und stabil transfizierte Zellen können unter Verwendung von für den entsprechenden Zelltyp geeigneten Gewebekulturverfahren vermehrt werden. Ein Amplifika-tionsschritt kann eingefügt werden, beispielsweise durch Verabreichung von Methyltrexat an mit einem DHFR-Gen transfizierten Zellen gemäss auf dem Fachgebiet allgemein bekannter Verfahren. Stable expression is often desirable for the long-term production of recombinant proteins with high yield. For example, cell lines stably expressing hTRT can be produced using the expression vectors according to the invention which contain viral origins of replication or endogenous expression elements and a selectable marker gene. After the vector has been introduced, the cells can be allowed to grow in enriched media for 1 to 2 days before switching to selective media. The selectable marker is used to confer resistance to the selection. Its presence allows the growth of cells that successfully express the inserted sequences in selective media. Resistant and stably transfected cells can be grown using tissue culture techniques appropriate for the cell type. An amplification step can be included, for example, by administering methyl trexate to cells transfected with a DHFR gene according to methods well known in the art.

Zusätzlich kann ein Wirtszellstamm gewählt werden hinsichtlich seiner Fähigkeit, die Expression der inserierten Sequenzen zu modulieren oder das exprimierte Protein auf die gewünschte Weise zu prozessieren. Zu solchen Modifikationen des Polypeptids zählen, allerdings ohne Beschränkung darauf, Acetylierung, Carboxylierung, Phosphorylierung, Lipidierung und Acylierung. Die post-translationale Prozessierung kann auch für die korrekte Insertion, Faltung und/oder Funktion wichtig sein. Die verschiedenen Wirtszellen verfügen über eine zelluläre Maschinerie und charakteristische Mechanismen für solche post-translationale Aktivitäten, die für jede Zelle spezifisch sind. Somit kann eine bestimmte Zelle zur Gewährleistung der korrekten Modifikation und Prozessierung des eingeschleusten Fremdproteins gewählt werden. In addition, a host cell strain can be selected for its ability to modulate expression of the inserted sequences or to process the expressed protein in the desired manner. Such modifications of the polypeptide include, but are not limited to, acetylation, carboxylation, phosphorylation, lipidation, and acylation. Post-translational processing can also be important for correct insertion, folding and / or function. The different host cells have a cellular machinery and characteristic mechanisms for such post-translational activities that are specific to each cell. A specific cell can thus be selected to ensure the correct modification and processing of the introduced foreign protein.

Die vorliegende Erfindung stellt auch transgene Tiere (d.h. Säuger, die bezüglich einer menschlichen oder anderen TRT-Gensequenz transgen sind), bereit, die ein hTRT- oder ein anderes TRT-Polynucleo-tid oder Polypeptid exprimieren. In einer Ausführungsform wird hTRT in der Milch eines transgenen Säugers, wie beispielsweise eines transgenen Rinds, einer Ziege oder eines Kaninchens, sezerniert. Verfahren zur Herstellung solcher Tiere können beispielsweise in Heyneker et al., PCT WO 91/08 216 gefunden werden. The present invention also provides transgenic animals (i.e. mammals that are transgenic to a human or other TRT gene sequence) that express an hTRT or other TRT polynucleotide or polypeptide. In one embodiment, hTRT is secreted in the milk of a transgenic mammal such as a transgenic bovine, a goat or a rabbit. Methods for producing such animals can be found, for example, in Heyneker et al., PCT WO 91/08 216.

Die erfindungsgemässen hTRT-Proteine und Komplexe, zu denen die durch die vorstehend beschriebenen Expressionssysteme hergestellten zählen, könnnen unter Verwendung einer Reihe von allgemeinen, auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren in Übereinstimmung mit den durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten spezifischen Verfahren (wie beispielsweise nachstehend beschrieben) gereinigt werden. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass nach chemischer Synthese, biologischer Expression oder Reinigung das hTRT-Protein eine Konformation besitzen kann, die sich von der nativen Konformation von natürlich vorkommender Telomerase unterscheidet. In einigen Fällen mag es hilfreich oder sogar nötig sein, das Polypeptid zu denaturieren (was beispielsweise die Reduktion von Disulfid- oder anderen Bindungen beinhalten kann) und danach das Polypeptid zu einer Rückfaltung in die bevorzugte Konformation zu bringen. Eine korrekte Rückfaltung kann auch die Gegenwart von hTR (oder hTR-Frag-menten) erforderlich machen. Verfahren zur Reduktion und Denaturierung von Proteinen und zur Induktion der Rückfaltung sind dem Fachmann bekannt (siehe beispielsweise Debinski et al. J. Biol. Chem. 268 (1993), 14065; Kreitman und Pastan, Bioconjug. Chem. 4 (1993), 581; und Buchner et al. Anal Biochem. 205 (1992), 263 und McCaman et al., J. Biotech. 2 (1985), 177). (Siehe auch USSN 08/478 352, eingereicht am 7. Juni 1995, a.a.O.). The hTRT proteins and complexes of the invention, including those produced by the expression systems described above, can be purified using a number of general methods known in the art in accordance with the specific methods provided by the present invention (such as described below) become. It is obvious to a person skilled in the art that after chemical synthesis, biological expression or purification, the hTRT protein can have a conformation that differs from the native conformation of naturally occurring telomerase. In some cases it may be helpful or even necessary to denature the polypeptide (which may include, for example, reducing disulfide or other bonds) and then refolding the polypeptide into the preferred conformation. Correct refolding may also require the presence of hTR (or hTR fragments). Methods for reducing and denaturing proteins and for inducing refolding are known to the person skilled in the art (see, for example, Debinski et al. J. Biol. Chem. 268 (1993), 14065; Kreitman and Pastan, Bioconjug. Chem. 4 (1993), 581 and Buchner et al. Anal Biochem. 205 (1992), 263 and McCaman et al., J. Biotech. 2 (1985), 177). (See also USSN 08/478 352, filed June 7, 1995, supra).

D. Komplexe aus menschlicher TRT und menschlicher Telomeplase-RNA, Telomerase-assoziierten Proteinen und anderen Biomolekülen, die durch Coexpression und andere Mittel hergestellt werden D. Complexes of human TRT and human telomeplase RNA, telomerase-associated proteins and other biomolecules, which are produced by coexpression and other means

Erfindungsgemässe hTRT-Polypeptide können in vivo und in vitro mit anderen Biomolekülen assoziieren, wozu RNAs (z.B. hTR), Proteine (z.B. Telomerase-assoziierte Proteine), DNA (z.B. Telomer-DNA, [T2AGs]n) und Nucleotide wie (Desoxy)ribonucleotid-triphosphate gehören. Diese Assoziationen können dazu verwendet werden, um die Anwesenheit oder Funktion von hTRT nachzuweisen, um hTRT oder Telomerase-assoziierte Moleküle zu identifizieren oder zu reinigen und um die Struktur oder Funktion von hTRT oder Telomerase gemäss den erfindungsgemässen Verfahren zu analysieren. HTRT polypeptides according to the invention can associate with other biomolecules in vivo and in vitro, including RNAs (eg hTR), proteins (eg telomerase-associated proteins), DNA (eg telomer DNA, [T2AGs] n) and nucleotides such as (deoxy) ribonucleotide -Triphosphate belong. These associations can be used to detect the presence or function of hTRT, to identify or purify hTRT or telomerase-associated molecules and to analyze the structure or function of hTRT or telomerase according to the methods according to the invention.

In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung hTRT bereit, das mit einer Nucleinsäure, üblicherweise einer RNA einen Komplex bildet (z.B. damit assoziiert oder daran gebunden ist). In einer Ausführungsform kann die gebundene RNA als eine Matrize für eine Telomerase-vermittelte DNA-Syn-these fungieren. Zu den Beispielen für RNAs, die mit dem hTRT-Polypeptid einen Komplex bilden kön- In one embodiment, the present invention provides hTRT that complexes (e.g., is associated with or bound to) a nucleic acid, usually an RNA. In one embodiment, the bound RNA can act as a template for telomerase-mediated DNA synthesis. Examples of RNAs that can form a complex with the hTRT polypeptide

38 38

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

nen, zählen eine natürlich vorkommende Wirtszell-Telomerase-RNA, eine menschliche Telomerase-RNA (z.B. hTR; US-Patent Nr. 5 583 016), eine hTR-Untersequenz oder -Domäne, eine synthetische RNA oder andere RNAs. Der RNA-hTRT-Proteinkomplex (ein RNP) weist typischerweise eine oder mehrere Telomerase-Aktivitäten auf, beispielsweise katalytische Aktivitäten von Telomerase. Diese hTRT-hTR-RNPs (oder andere hTRT-RNA-Komplexe) können mittels einer Reihe von Verfahren, wie sie nachstehend zur Veranschaulichung beschrieben sind, hergestellt werden, dazu gehören in vitro-Rekonstitution und Coexpression von hTRT und hTR (und einer anderen RNA) in vitro (d.h. in einem zellfreien System) in vivo oder ex vivo. include a naturally occurring host cell telomerase RNA, a human telomerase RNA (e.g. hTR; U.S. Patent No. 5,583,016), an hTR subsequence or domain, a synthetic RNA or other RNAs. The RNA-hTRT protein complex (an RNP) typically has one or more telomerase activities, for example, catalytic activities of telomerase. These hTRT-hTR-RNPs (or other hTRT-RNA complexes) can be prepared by a number of methods as described below by way of illustration, including in vitro reconstitution and co-expression of hTRT and hTR (and another RNA ) in vitro (ie in a cell-free system) in vivo or ex vivo.

Somit stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform einen hTRT-hTR-Komplex (oder einen anderen hTRT-RNAKomplex) bereit, der in vitro durch Mischen getrennt gereinigter Bestandteile gebildet wurde («in vitro-Rekonstitution»; siehe beispielsweise US-Patent Nr 5 583 016 bezüglich einer Beschreibung der Rekonstitution und USSN 08/478 352, eingereicht am 7. Juni 1995; siehe auch Autexier et al., EMBO J. 15; 5928). Thus, in one embodiment, the present invention provides an hTRT-hTR complex (or other hTRT-RNA complex) that was formed in vitro by mixing separately purified components ("in vitro reconstitution"; see, for example, US Pat. No. 5,583 016 for a description of the reconstitution and USSN 08/478 352, filed June 7, 1995; see also Autexier et al., EMBO J. 15; 5928).

In einer alternativen Ausführungsform stellt die Erfindung Telomerase-RNPs bereit, die duch Coexpression des hTRT-Polypeptids und einer RNA (z.B. hTR) in vitro in einem zellfreien Transkriptions/ Translations-System (z.B. Weizenkeimlysat oder Kaninchen-Reticulocytenlysat) hergestellt wurden. Wie in Beispiel 7 gezeigt, führt die Coexpression eines rekombinanten hTRT-Polypeptids und von hTR in vitro zur Herstellung von katalytischer Aktivität von Telomerase (gemessen durch einen TRAP-Assay). In an alternative embodiment, the invention provides telomerase RNPs made by coexpressing the hTRT polypeptide and an RNA (e.g. hTR) in vitro in a cell-free transcription / translation system (e.g. wheat germ lysate or rabbit reticulocyte lysate). As shown in Example 7, coexpression of a recombinant hTRT polypeptide and hTR in vitro results in the production of catalytic activity of telomerase (as measured by a TRAP assay).

Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus Telomerase-RNPs bereit, die durch Expression des hTRT-Polypeptids in einer Zelle, beispielsweise einer Säugerzelle, hergestellt werden, in der hTR natürlicherweise exprimiert wird, oder in die hTR (oder eine andere RNA, die mit dem hTRT-Protein einen Komplex bilden kann) eingeführt wird, oder durch Rekombination exprimiert wird. Somit wird in einer Ausführungsform hTRT in einer Telomerase-negativen menschlichen Zelle, in der hTR vorhanden ist (z.B. BJ- oder IMP90-Zellen) exprimiert, was die Assemblierung beider Moleküle zu einem RNP erlaubt. In einer weiteren Ausführungsform wird hTRT in einer menschlichen oder nicht-menschlichen Zelle, in der hTR rekombinant exprimiert wird, exprimiert. Verfahren zur Expression von hTR in einer Zelle können in dem US-Patent 5,583,016 gefunden werden. Der Clon pGRN33, der eine die RNA-Komponente von Telomerase codierende cDNA enthält, wurde ferner hinterlegt (ATCC 75926). Die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase codierenden genomischen Sequenzen wurden als 15 kb SaulllA1 bis Hindlll-Insertion des Clons 28-1 hinterlegt (ATCC 75925). Zur Expression in eukaryotischen Zellen wird die hTRT-Sequenz typischerweise mit einer Transkriptions-Initiationssequenz (RNA-Polymerase-Bin-dungsstelle) und Transkriptions-Terminationssequenzen funktionell verknüpft (siehe beispielsweise PCT-Veröffentlichung WO 96/01 835; Feng et al., Science 269 (1995), 1236). The present invention also provides telomerase RNPs made by expressing the hTRT polypeptide in a cell, such as a mammalian cell, in which hTR is naturally expressed, or in the hTR (or other RNA associated with the hTRT -Protein can form a complex) is introduced, or is expressed by recombination. Thus, in one embodiment, hTRT is expressed in a telomerase negative human cell in which hTR is present (e.g., BJ or IMP90 cells), allowing both molecules to assemble into an RNP. In a further embodiment, hTRT is expressed in a human or non-human cell in which hTR is recombinantly expressed. Methods for expressing hTR in a cell can be found in US Patent 5,583,016. The clone pGRN33, which contains a cDNA encoding the RNA component of telomerase, was also deposited (ATCC 75926). The RNA component of genomic sequences coding for human telomerase were deposited as 15 kb SaulllA1 to Hindlll insertion of the clone 28-1 (ATCC 75925). For expression in eukaryotic cells, the hTRT sequence is typically functionally linked to a transcription initiation sequence (RNA polymerase binding site) and transcription termination sequences (see, for example, PCT publication WO 96/01 835; Feng et al., Science 269 (1995), 1236).

Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus rekombinant hergestellte oder im wesentlichen gereinigte hTRT-Polypeptide bereit, die mit sogenannten «Telomerase-assoziierten Proteinen» coexprimiert und/oder assoziiert sind. Somit stellt die vorliegende Erfindung hTRT bereit, das mit anderen Proteinen (z.B. Telomerase-assoziierten Proteinen) coexprimiert wird oder mit diesen einen Komplex bildet. Unter Telomerase-assoziierten Proteinen versteht man solche Proteine, die mit menschlicher Telomerase mit aufgereinigt werden und/oder eine Rolle bei der Modulation der Telomerasefunktion oder -Aktivität spielen können, beispielsweise dadurch, dass sie an der Assoziation von Telomerase mit Telomer-DNA beteiligt sind. Zu den Beispielen für Telomerase-assoziierte Proteine gehören (jedoch ohne Beschränkung darauf) die folgenden Proteine und/oder ihre menschlichen Homologe: Nucleolin (siehe die parallele US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/833 377 und Srivastava et al., FEBS Letts. 250 (1989), 99); EF2H (das Homolog zum Elongationsfaktor 2; siehe die parallele US-Patentanmeldung Nr. 08/833 377 und Nomura et al., DNA Res. (Japan) 1 (1994), 27, GENBANK Zugangsnummer #D21163), TP1/TLP1 (Harrington et al., Science 275 (1997), 973); Nakayama et al., Cell 88 (1997), 875; das menschliche Homolog zu Tetrahymena p95 (Collins et al., Cell 81 (1995) 677); TPC2 (ein die Telomerlänge regulierendes Protein; ATCC-Zugangsnummer 97708 (siehe USSN 08/710 249 und 08/713 922, beide am 13. September 1996 eingereicht)), TPC3 (ebenfalls ein die Telomerlänge regulierendes Protein; ATCC-Zugangsnummer 97707 (siehe USSN 08/710 249 und 08/713 922, beide eingereicht am 13. September 1996)), DNA-bindendes Protein B (dbpB; Horwitz et al., J. Biol. Chem. 269 (1994), 14130) und der die Telomer-Wiederholungseinheit bindende Faktor (TRF 1 & 2; Chang et al., Science 270 (1995), 1663; Chong et al., Hum. Mol. Genet. 6 (1997), 69; EST1, 3 und 4 (Lendvay et al., Genetics 144 (1996), 1399; Nugent et al., Science 274 (1996), 249 und Lundblad et al., Cell 57 (1989), 633) und der «End-capping»-Faktor (Cardenas et al., Genes Dev. 7 (1993), 883). The present invention also provides recombinantly produced or substantially purified hTRT polypeptides which are co-expressed and / or associated with so-called “telomerase-associated proteins”. Thus, the present invention provides hTRT that is co-expressed or complexed with other proteins (e.g. telomerase-associated proteins). Telomerase-associated proteins are understood to mean those proteins which are purified with human telomerase and / or which can play a role in modulating the telomerase function or activity, for example in that they are involved in the association of telomerase with telomer DNA. Examples of, but not limited to, telomerase-associated proteins include the following proteins and / or their human homologs: nucleolin (see U.S. Patent Application Serial No. 08/833,377 and Srivastava et al., FEBS Letts. 250 (1989), 99); EF2H (the homolog to elongation factor 2; see U.S. Patent Application No. 08/833,377 and Nomura et al., DNA Res. (Japan) 1 (1994), 27, GENBANK accession number # D21163), TP1 / TLP1 (Harrington et al., Science 275 (1997), 973); Nakayama et al. (1997) Cell 88: 875; the human homologue to Tetrahymena p95 (Collins et al., Cell 81 (1995) 677); TPC2 (a telomere length regulating protein; ATCC accession number 97708 (see USSN 08/710 249 and 08/713 922, both filed on September 13, 1996)), TPC3 (also a telomer length regulating protein; ATCC accession number 97707 (see USSN 08/710 249 and 08/713 922, both filed on September 13, 1996)), DNA-binding protein B (dbpB; Horwitz et al., J. Biol. Chem. 269 (1994), 14130) and that Telomer repeat unit binding factor (TRF 1 &2; Chang et al., Science 270 (1995), 1663; Chong et al., Hum. Mol. Genet. 6 (1997), 69; EST1, 3 and 4 (Lendvay et al., Genetics 144 (1996), 1399; Nugent et al., Science 274 (1996), 249 and Lundblad et al., Cell 57 (1989), 633) and the end-capping factor (Cardenas et al ., Genes Dev. 7 (1993), 883).

Telomerase-assoziierte Proteine können auf der Basis der Mitaufreinigung mit oder der Bindung an hTRT-Protein oder das hTRT-hTR-RNP identifziert werden. In einer alternativen Ausführungsform können sie auf der Basis der Bindung an ein hTRT-Fusionsprotein, beispielsweise ein GST-hTRT-Fusions-protein etc. identifiziert werden, wie dies durch Affinitätsreinigung erfolgen kann (siehe Ausubel et al., Kapitel 20). Ein besonders nützliches Verfahren zur Bestimmung von Protein/Protein-Interaktionen und zur Identifizierung von hTR-T-assoziierten Proteinen ist das «two hybrid screen»-Verfahren von Chien et al. (Proc. Nati. Acad. Sei. USA 88 (1991), 9578; siehe auch Ausubel et al., a.a.O., Kapitel 20). Durch dieses Screenen können Protein/Protein-Interaktionen in vivo durch Rekonstitution eines Transkriptionsaktivators, dem Hefe-Ga14-Transkriptionsprotein identifiziert werden (siehe Fields und Song, Nature 340 (1989), 245). Dieses Verfahren basiert auf den Eigenschaften des Hefe-Ga14-Proteins, das aus trenn39 Telomerase-associated proteins can be identified based on the co-purification with or binding to hTRT protein or the hTRT-hTR-RNP. In an alternative embodiment, they can be identified on the basis of binding to an hTRT fusion protein, for example a GST-hTRT fusion protein, etc., as can be done by affinity purification (see Ausubel et al., Chapter 20). A particularly useful method for determining protein / protein interactions and for identifying hTR-T-associated proteins is the “two hybrid screen” method by Chien et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88 (1991), 9578; see also Ausubel et al., Op. Cit., Chapter 20). This screening allows protein / protein interactions to be identified in vivo by reconstitution of a transcription activator, the yeast Ga14 transcription protein (see Fields and Song, Nature 340 (1989), 245). This method is based on the properties of the yeast Ga14 protein that is separated from 39

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

baren Domänen besteht, die für die DNA-Bindung und transkriptioneile Aktivierung verantwortlich sind. «Two hybrid»-Proteine codierende Polynucleotide, üblicherweise Expressionsvektoren, werden konstruiert. Ein Polynucleotid umfasst die Hefe-Ga14-DNA-bindende Domäne, die an eine Polypeptidsequenz eines auf eine hTRT-Interaktion zu testenden Proteins fusioniert ist (z.B. Nucleolin oder EF2H). In einer alternativen Ausführungsform ist die Hefe-Ga14-DNA-bindende Domäne an cDNAs aus einer menschlichen Zelle fusioniert, wodurch eine Bank von menschlichen Proteinen, die an die Ga14DNA-bindende Domäne fusioniert sind, zum Screenen nach Telomerase-assoziierten Proteinen hergestellt wird. Die anderen Polynucleotide umfassen die Ga14-Aktivierungsdomäne, die an eine hTRT-Polypeptidsequenz fusioniert ist. Die Konstrukte werden in eine Hefewirtszelle eingeführt. Nach Expression kann die intermolekulare Bindung zwischen hTRT und dem Testprotein die Ga14-DNA-bindende Domäne mit der Ga14-aktivierenden Domäne rekonstituieren. Dies führt zu der transkriptioneilen Aktivierung eines Reportergens (z.B. lacZ, His3), das mit einer Ga14-Bindungsstelle funktionell verknüpft ist. Durch Auswählen oder Untersuchung können Reportergen-Zellkolonien identifiziert werden, die ein mit hTRT interagieren-des Protein oder ein Telomerase-assoziiertes Protein enthalten. Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass es zahlreiche Variationen des «2-hybrid-screen»-Systems gibt, beispielsweise das LexA-System (Bartel et al., in Cellular Interactions in Development: A Praticai Approach, Hartley (Herausg.), D.A. (Oxford Univ. Press (1993), S. 153-179)). domains that are responsible for DNA binding and transcriptional activation. Polynucleotides encoding “two hybrid” proteins, usually expression vectors, are constructed. A polynucleotide comprises the yeast Ga14 DNA binding domain fused to a polypeptide sequence of a protein to be tested for hTRT interaction (e.g. Nucleolin or EF2H). In an alternative embodiment, the yeast Ga14 DNA binding domain is fused to cDNAs from a human cell, thereby producing a library of human proteins fused to the Ga14DNA binding domain for screening for telomerase-associated proteins. The other polynucleotides include the Ga14 activation domain fused to an hTRT polypeptide sequence. The constructs are introduced into a yeast host cell. After expression, the intermolecular bond between hTRT and the test protein can reconstitute the Ga14 DNA-binding domain with the Ga14-activating domain. This leads to the transcriptional activation of a reporter gene (e.g. lacZ, His3) which is functionally linked to a Ga14 binding site. Reporter gene cell colonies containing an protein interacting with hTRT or a telomerase-associated protein can be identified by selection or examination. It is obvious to the person skilled in the art that there are numerous variations of the “2 hybrid screen” system, for example the LexA system (Bartel et al., In Cellular Interactions in Development: A Praticai Approach, Hartley (ed.), DA (Oxford Univ. Press (1993), pp. 153-179)).

Ein weiteres nützliches Verfahren zum Identifizieren von Telomerase-assoziierten Proteinen ist ein «three-hybrid»-System (siehe beispielsweise Zhang et al., Anal. Biochem. 242 (1996), 68 und Licitra et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 93 (1996), 12817). Die Telomerase-RNA-Komponente kann in diesem System mit der TRT oder dem hTRT-Protein und einem Testprotein verwendet werden. Ein weiteres nützliches Verfahren zur Identifizierung von interagierenden Proteinen (d.h. von Proteinen, die heterodi-merisieren oder Heteromultimere höherer Ordnung bilden) ist insbesondere das E.coli/BCCP «interaktive Screening»-System (siehe Germino et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 90 (1993), 933 und Guarente, Proc. Nati. Acad. Sei. (USA), 90 (1993), 1639). Another useful method for identifying telomerase-associated proteins is a "three-hybrid" system (see, for example, Zhang et al., Anal. Biochem. 242 (1996), 68 and Licitra et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93 (1996), 12817). The telomerase RNA component can be used in this system with the TRT or the hTRT protein and a test protein. Another useful method for identifying interacting proteins (ie proteins that heterodimerize or form higher order heteromultimers) is in particular the E. coli / BCCP “interactive screening” system (see Germino et al., Proc. Nati. Acad Sei. USA 90 (1993), 933 and Guarente, Proc. Nati. Acad. Sei. (USA), 90 (1993), 1639).

Die vorliegende Erfindung stellt auch Komplexe aus Telomerbindenden Proteinen bereit (bei denen es sich um Telomeraseassoziierte Proteine handeln kann oder nicht) und hTRT (die mit hTR, anderen RNAs oder einem oder mehreren Telomeraseassoziierten Proteinen komplexiert sein kann oder nicht). Zu den Beispielen von Telomer-bindenden Proteinen gehören TRF1 und TRF2 (a.a.O.) rnpA1, mpA2, RAP1 (Buchman et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988), 210, Buchman et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988), 5086), SIR3 und SIR4 (Aparicio et al., Cell 66 (1991), 1279), TELI (Greenwell et al., Cell 82 (1995), 823; Mor-row et al., Cell 82 (1995), 831); ATM (Savitsky et al., Science 268 (1995), 1749), «end-capping»-Faktor (Cardenas et al., Genes Dev. 7 (1993), 883) und die entsprechenden menschlichen Homologe. Die vorstehend erwähnten Komplexe können allgemein, so wie es vorstehend für Komplexe aus hTRT und hTR oder Telomerase-assoziierten Proteinen beschrieben wurde, hergestellt werden, beispielsweise durch Vermischen oder Coexpression in vitro oder in vivo. The present invention also provides complexes of telomere binding proteins (which may or may not be telomerase-associated proteins) and hTRT (which may or may not be complexed with hTR, other RNAs, or one or more telomerase-associated proteins). Examples of telomer binding proteins include TRF1 and TRF2 (loc.) RnpA1, mpA2, RAP1 (Buchman et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988), 210, Buchman et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988), 5086), SIR3 and SIR4 (Aparicio et al., Cell 66 (1991), 1279), TELI (Greenwell et al., Cell 82 (1995), 823; Mor-row et al., Cell 82 (1995), 831); ATM (Savitsky et al., Science 268 (1995), 1749), “end-capping” factor (Cardenas et al., Genes Dev. 7 (1993), 883) and the corresponding human homologues. The above-mentioned complexes can generally be prepared as described above for complexes of hTRT and hTR or telomerase-associated proteins, for example by mixing or coexpression in vitro or in vivo.

V. Antikörper und andere bindende Agenzien V. Antibodies and other binding agents

Ein verwandter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Antikörper, die mit hTRT spezifisch immunreaktiv sind. Dazu gehören polyclonale und monoclonale Antikörper, Antikörperfragmente, Antikörper mit einer einzelnen Kette, menschliche und chimäre Antikörper, einschliesslich Antikörper oder Antikörper-Fragmente, die an Phagenhüll- oder Zelloberflächenproteine fusioniert sind und weitere auf dem Fachgebiet bekannte und hier beschriebene. Die erfindungsgemässen Antikörper können Polypeptide spezifisch erkennen und binden, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mit der Aminosäuresequenz von SEQ. ID. Nr. 2 im wesentlichen identisch ist, oder ein immunogenes Fragment davon, oder ein Epi-top auf dem dadurch definierten Protein. Die erfindungsgemässen Antikörper können eine spezifische Bindungsaffinität für hTRT von mindestens etwa 107, 108, 109 oder 1010 M_1 aufweisen. Sie können po-lyclonal oder monoclonal sein, rekombinant oder auf andere Weise hergestellt. Die Erfindung stellt auch anti-hTRT-Antikörper bereit, die ein Konformationsepitop vonh TRT erkennen (beispielsweise ein Epitop auf der Oberfläche des hTRT-Proteins oder eines Telomerase-RNPs). Wahrscheinliche Konformations-epitope können, falls erwünscht, durch computergestützte Analyse der hTRT-Proteinsequenz identifiziert werden, durch Vergleich mit der Konformation von verwandten reversen Transkriptasen, wie beispielsweise der p66-Untereinheit von HIF-1 (siehe beispielsweise Fig. 3) oder empirisch. Anti-hTRT-Antikörper, die Konformationsepitope erkennen, sind unter anderem bei dem Nachweis und der Reinigung von menschlicher Telomerase und bei der Diagnose und der Behandlung von menschlichen Erkrankungen von Nutzen. A related aspect of the present invention relates to antibodies that are specifically immunoreactive with hTRT. These include polyclonal and monoclonal antibodies, antibody fragments, single chain antibodies, human and chimeric antibodies, including antibodies or antibody fragments fused to phage coat or cell surface proteins, and others known in the art and described herein. The antibodies according to the invention can specifically recognize and bind polypeptides that have an amino acid sequence that matches the amino acid sequence of SEQ. ID. No. 2 is essentially identical, or an immunogenic fragment thereof, or an epitope on the protein defined thereby. The antibodies according to the invention can have a specific binding affinity for hTRT of at least about 107, 108, 109 or 1010 M_1. They can be polycyclonic or monoclonal, recombinant or otherwise produced. The invention also provides anti-hTRT antibodies that recognize a conformational epitope of h TRT (e.g., an epitope on the surface of the hTRT protein or a telomerase RNP). Probable conformational epitopes, if desired, can be identified by computer-aided analysis of the hTRT protein sequence, by comparison to the conformation of related reverse transcriptases such as the p66 subunit of HIF-1 (see, e.g., Figure 3) or empirically. Anti-hTRT antibodies that recognize conformation epitopes are useful, among other things, in the detection and purification of human telomerase and in the diagnosis and treatment of human diseases.

Für die Herstellung von anti-hTRT-Antikörpern können Wirte wie beispielsweise Ziegen, Schafe, Kühe, Meerschweinchen, Kaninchen, Ratten oder Mäuse durch Injektion mit einem hTRT-Protein oder einem beliebigen Anteil, einem Fragment oder Oligopeptid davon, der immunogene Eigenschaften beibehalten hat, immunisiert werden. Für die Auswahl von hTRT-Polypeptiden zur Antikörperinduktion ist es nicht nötig, dass diese biologische Aktivität beibehalten wird, das Proteinfragment oder Oligopeptid muss jedoch immunogen und vorzugsweise antigen sein. Die Immunogenität kann durch Injektion eines Polypeptids und eines Adjuvans in ein Tier (z.B. ein Kaninchen) und durch Untersuchung des Auftretens von Antikörpern, die gegen das injizierte Polypeptid gerichtet sind, nachgewiesen werden (siehe For the production of anti-hTRT antibodies, hosts such as goats, sheep, cows, guinea pigs, rabbits, rats or mice can be injected with an hTRT protein or any portion, fragment or oligopeptide thereof that has retained immunogenic properties, be immunized. It is not necessary to maintain this biological activity for the selection of hTRT polypeptides for antibody induction, but the protein fragment or oligopeptide must be immunogenic and preferably antigenic. Immunogenicity can be demonstrated by injecting a polypeptide and an adjuvant into an animal (e.g. a rabbit) and by examining the appearance of antibodies directed against the injected polypeptide (see

40 40

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

beispielsweise Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988), beispielsweise Kapitel 5, und dieses Dokument ist durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit und für alle Zwecke Bestandteil dieser Beschreibung). Zur Induktion spezifischer Antikörper verwendete Peptide weisen typischerweise eine Aminosäuresequenz auf, die aus mindestens fünf Aminosäuren besteht, vorzugsweise mindestens 8 Aminosäuren und mehr bevorzugt mindestens 10 Aminosäuren. Üblicherweise nehmen sie die gesamte Aminosäuresequenz des Proteins mit SEQ. ID. Nr. 2 oder einen Teil davon auf, oder besitzen eine dazu im wesentlichen identische Sequenz. Kurze Strecken der Aminosäure des hTRT-Proteins können mit denen anderer Proteine fusioniert werden, wie beispielsweise das «Keyhole limpet»-Hemocyanin und einen anti-hTRT-Antikörper, der gegen das chimäre Molekül hergestellt wurde. In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtsart können verschiedene Adjuvanten zur Steigerung der Immunantwort verwendet werden. for example, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988), e.g., Chapter 5, and this document is incorporated by reference in its entirety and for all purposes with this description). Peptides used to induce specific antibodies typically have an amino acid sequence consisting of at least five amino acids, preferably at least 8 amino acids, and more preferably at least 10 amino acids. They usually take the entire amino acid sequence of the protein with SEQ. ID. No. 2 or a part thereof, or have an essentially identical sequence. Short stretches of the amino acid of the hTRT protein can be fused with those of other proteins, such as the keyhole limpet hemocyanin and an anti-hTRT antibody made against the chimeric molecule. Depending on the type of host used, various adjuvants can be used to increase the immune response.

Das Antigen wird dem Immunsystem auf eine Weise präsentiert, die durch für das Tier geeignete Verfahren ermittelt wurde. Diese sowie andere Parameter sind dem Immunologen im allgemeinen gut bekannt. Typischerweise werden die Injektionen in die Fussballen, intramuskulär, intradermal, in die Pe-rilymphknoten oder intraperitoneal verabreicht. Die durch den Wirt hergestellten Immunglobuline können präzipitiert, isoliert und gemäss Routineverfahren, zu denen Affinitätsreinigung zählt, gereinigt werden. The antigen is presented to the immune system in a manner determined by animal procedures. These and other parameters are generally well known to the immunologist. Typically, the injections are administered into the balls of the foot, intramuscularly, intradermally, into the perilymph nodes or intraperitoneally. The immunoglobulins produced by the host can be precipitated, isolated and purified according to routine procedures, which include affinity purification.

Veranschaulichende Beispiele von immunogenen hTRT-Peptiden werden in Beispiel 8 bereitgestellt.-Zusätzlich beschreibt Beispiel 8 die Herstellung und die Verwendung von polyclonalen anti-hTRT-Anti-körpern. Illustrative examples of immunogenic hTRT peptides are provided in Example 8. In addition, Example 8 describes the preparation and use of polyclonal anti-hTRT antibodies.

A) Monoclonale Antikörper A) Monoclonal antibodies

Monoclonale Antikörper gegen hTRT-Proteine und Peptide können in Übereinstimmung mit den erfindungsgemässen Verfahren unter Verwendung jedes Verfahrens, das für die Herstellung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zellinien in Kultur geeignet ist, hergestellt werden. Zu diesen Verfahren zählen, jedoch ohne Beschränkung darauf, das ursprünglich beschriebene Hybridom-Verfahren von Koehler und Milstein (Nature 256 (1975), 495), das Hybridom-Verfahren mit menschlichen B-Zellen (Kosbor et al., Immunol. Today 4 (1983), 72 und Cote et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 80 (1983), 2026), und das EBV-Hybridom-Verfahren (Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc. New York NY, S. 77-96 (1985)). Monoclonal antibodies to hTRT proteins and peptides can be prepared in accordance with the methods of the invention using any method suitable for the production of antibody molecules by continuous cell lines in culture. These methods include, but are not limited to, the originally described hybridoma method by Koehler and Milstein (Nature 256 (1975), 495), the hybridoma method using human B cells (Kosbor et al., Immunol. Today 4 ( 1983), 72 and Cote et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80 (1983), 2026), and the EBV hybridoma method (Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc New York NY, pp. 77-96 (1985)).

In einer Ausführungsform werden geeignete Tiere ausgewählt und das geeignete anzuwendende Immunisierungsprotokoll. Die Herstellung von nicht-menschlichen monoclonalen Antikörpern, beispielsweise von der Maus, von Lagomorpha und vom Pferd ist allgemein bekannt und kann beispielsweise durch Immunisierung eines Tiers mit einer hTRT oder Fragmente davon enthaltenden Präparation erfolgen. In einem Verfahren wird nach einem geeigneten Zeitraum die Milz der Tiere herausgeschnitten und einzelne Milzzellen werden typischerweise mit immortalisierten Myelomzellen unter geeigneten Selektionsbedingungen fusioniert. Danach werden die Zellen clonai getrennt und die Überstände von jedem Clon (z.B. Hybridom) bezüglich der Herstellung eines geeigneten Antikörpers, der für den gewünschten Bereich des Antigens spezifisch ist, getestet. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Siehe beispielsweise Goding et al., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2. Ausgabe), Acad. Press, N.Y., und Harlow und Lane, a.a.O., wobei beide Veröffentlichungen durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen sind. Zu anderen geeigneten Verfahren zählen die in vitro-Exposition von Lymphocyten gegenüber den antigenen Polypetiden oder, alternativ, eine Auswahl von Antikörperbanken in Phagen-vektoren oder ähnlichen Vektoren (siehe die nachstehende Beschreibung). In one embodiment, suitable animals are selected and the appropriate immunization protocol to be used. The production of non-human monoclonal antibodies, for example from the mouse, from Lagomorpha and from the horse, is generally known and can be carried out, for example, by immunizing an animal with a preparation containing hTRT or fragments thereof. In one method, the spleen of the animals is cut out after a suitable period of time and individual spleen cells are typically fused with immortalized myeloma cells under suitable selection conditions. The clonai cells are then separated and the supernatants from each clone (e.g. hybridoma) tested for the production of an appropriate antibody specific for the desired region of the antigen. Methods for producing antibodies are well known in the art. See, for example, Goding et al., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2nd Edition), Acad. Press, N.Y., and Harlow and Lane, op. Cit., Both publications are incorporated by reference in their entirety and for all purposes, as a part of this description. Other suitable methods include in vitro exposure of lymphocytes to the antigenic polypeptides or, alternatively, a selection of antibody banks in phage vectors or similar vectors (see the description below).

B) Menschliche Antikörper B) Human antibodies

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung von menschlichen Antikörpern gegen ein hTRT-Polypeptid. Menschliche monoclonale Antikörper gegen ein bekanntes Antigen können auch unter Verwendung von transgenen Tieren hergestellt werden, die Elemente eines menschlichen Immunsystems besitzen (siehe beispielsweise USPatent Nr. 5 569 825 und 5 545 806, wobei beide Dokumente durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen sind) oder unter Verwendung von menschlichen peripheren Blutzellen (Casali et al., Science 234 (1986), 476). Einige menschliche Antikörper werden durch kompetitive Bindungsexperimente ausgewählt oder so, dass sie dieselbe Epitop-Spezifität aufweisen wie ein spezieller Mausantikörper. Another aspect of the invention relates to the provision of human antibodies against an hTRT polypeptide. Human monoclonal antibodies to a known antigen can also be made using transgenic animals that have elements of a human immune system (see, for example, US Patent Nos. 5,569,825 and 5,545,806, both documents being incorporated by reference in their entirety and for all purposes as Are part of this description) or using human peripheral blood cells (Casali et al., Science 234 (1986), 476). Some human antibodies are selected by competitive binding experiments or so that they have the same epitope specificity as a specific mouse antibody.

In einer weiteren Ausführungsform können menschliche Antikörper gegen ein hTRT-Polypeptid durch Screenen einer DNA-Bank aus menschlichen B-Zellen gemäss dem von Huse et al., Science 246 (1989), 1275 beschriebenen allgemeinen Protokoll hergestellt werden. Dieses Dokument ist aufgrund der Bezugnahme ebenfalls als Teil der vorliegenden Beschreibung anzusehen. An das hTRT-Polypeptid bindende Antikörper werden ausgewählt. Diese Antikörper (oder ein bindendes Fragment) codierenden Sequenzen werden dann cloniert und amplifiziert. Das von Huse beschriebene Protokoll wird oft mit der «phage-display»-Technologie verwendet. In a further embodiment, human antibodies against an hTRT polypeptide can be produced by screening a DNA bank from human B cells according to the general protocol described by Huse et al., Science 246 (1989), 1275. This document is also to be considered part of the present description by reference. Antibodies binding to the hTRT polypeptide are selected. Sequences encoding these antibodies (or a binding fragment) are then cloned and amplified. The protocol described by Huse is often used with the «phage-display» technology.

41 41

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

C. Humanisierte oder chimäre Antikörper C. Humanized or Chimeric Antibodies

Die Erfindung stellt auch anti-hTRT-Antikörper bereit, die als chimäre, menschlichen Antikörper ähnelnden oder humanisierte Antikörper hergestellt wurden, um so ihre potentielle Antigenität jedoch nicht ihre Affinität gegenüber dem Ziel herabzusetzen. Die Herstellung von Chimären und humanisierten Antikörpern bzw. von den menschlichen Antikörpern ähnelnden Antikörpern wurde auf dem Fachgebiet beschrieben (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5 585 089 und 5 530 101; Queen et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 86 (1989), 10029 und Verhoeyan et al., Science 239 (1988), 1534, wobei diese Dokumente aufgrund der Bezugnahme in ihrer Gesamtheit und für alle Zwecke als Gegenstand dieser Beschreibung anzusehen sind). Humanisierte Immunglobuline weisen variable Grundgerüstbereiche auf, die im wesentlichen von einem humanen Immunglobulin stammen (mit der Bezeichnung Akzeptor-Im-munglobulin) und die Komplementarität der determinierenden Bereiche, die im wesentlichen von einem nicht-menschlichen Immunglobulin (z.B. von der Maus) stammen (mit der Bezeichnung Donor-Im-munglobulin). Die (Der) konstante(n) Bereich(e) stammt/stammen, falls vorhanden, auch im wesentlichen von einem menschlichen Immunglobulin. The invention also provides anti-hTRT antibodies made as chimeric, human antibody-like or humanized antibodies so as not to lower their potential antigenicity to the target. The preparation of chimeras and humanized antibodies, or antibodies similar to human antibodies, has been described in the art (see, for example, U.S. Patent Nos. 5,585,089 and 5,530,101; Queen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86 (1989), 10029 and Verhoeyan et al., Science 239 (1988), 1534, which documents are to be considered in their entirety and for all purposes as the subject of this description by reference. Humanized immunoglobulins have variable scaffold regions, which essentially come from a human immunoglobulin (with the name acceptor-immunoglobulin) and the complementarity of the determining regions, which essentially come from a non-human immunoglobulin (e.g. from the mouse) (with the designation donor immunoglobulin). The constant region (s), if present, originate essentially from a human immunoglobulin.

Bei einigen Anwendungen, beispielsweise bei der Verabreichung an menschliche Patienten, bieten die erfindungsgemässen humanisierten (sowie die menschlichen) anti-hTRT-Antikörper eine Reihe von Vorteilen gegenüber Antikörpern von Mäusen oder anderen Spezies: (1) das menschliche Immunsystem sollte das Grundgerüst oder den konstanten Bereich des humanisierten Antikörpers nicht als fremd erkennen und daher sollte die Antikörper-Antwort gegen einen solchen injizierten Antikörper geringer ausfallen als gegen einen vollständig fremden Maus-Antikörper oder einen partiell fremden Chimären Antikörper; (2) da der Effektorbereich des humanisierten Antikörpers menschlich ist, dürfte er mit anderen Teilen des menschlichen Immunsystems besser interagieren, und (3) injizierte humanisierte Antikörper weisen eine Halbwertszeit auf, die im wesentlichen zu der von natürlich vorkommenden menschlichen Antikörpern äquivalent ist, was es erlaubt, kleinere und weniger häufige Dosen im Vergleich zu Antikörpern anderer Spezies zu verabreichen. In some applications, for example when administered to human patients, the humanized (as well as the human) anti-hTRT antibodies according to the invention offer a number of advantages over antibodies of mice or other species: (1) the human immune system should be the basic structure or the constant Do not recognize the area of the humanized antibody as foreign and therefore the antibody response against such an injected antibody should be lower than against a completely foreign mouse antibody or a partially foreign chimeric antibody; (2) since the effector area of the humanized antibody is human, it is likely to interact better with other parts of the human immune system, and (3) injected humanized antibodies have a half-life that is essentially equivalent to that of naturally occurring human antibodies, which it is allows smaller and less frequent doses to be administered compared to antibodies from other species.

D) «Phage Display» D) "Phage Display"

Die vorliegende Erfindung stellt auch anti-hTRT-Antikörper (oder bindende Zusammensetzung) bereit, die durch «phage display»-Verfahren hergestellt wurden (siehe beispielsweise Dower et al. 1 WO 91/17 271 und McCafferty et al., WO 92/01 047 sowie Vaughan et al., Nature Biotechnology 14 (1996), 309, wobei diese Dokumente aufgrund der Bezugnahme in ihrer Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen sind). Bei diesen Verfahren werden Phagenbanken hergestellt, in denen Mitglieder auf ihren äusseren Oberflächen unterschiedliche Antikörper präsentieren. Antikörper werden gewöhnlich als Fv- oder Fab-Fragmente präsentiert. Phagen, die Antikörper mit einer gewünschten Spezifität präsentieren, werden durch Affinitätsanreicherung mit einem hTRT-Polypeptid ausgewählt. The present invention also provides anti-hTRT antibodies (or binding composition) made by phage display methods (see, for example, Dower et al. 1 WO 91/17 271 and McCafferty et al., WO 92/01 047 and Vaughan et al., Nature Biotechnology 14 (1996), 309, which documents are to be regarded in their entirety and for all purposes as a component of this description by reference. These processes produce phage banks in which members present different antibodies on their outer surfaces. Antibodies are usually presented as Fv or Fab fragments. Phages that present antibodies with a desired specificity are selected by affinity enrichment with an hTRT polypeptide.

Bei einer Variation des «phage-display»-Verfahrens können humanisierte Antikörper mit der Bin-dungsspezifität eines ausgewählten Maus-Antikörpers hergestellt werden. Bei diesem Verfahren wird der variable Bereich entweder der schweren oder der leichten Kette des ausgewählten Maus-Antikörpers als Ausgangsmaterial verwendet. Wenn beispielsweise der variable Bereich einer leichten Kette als Ausgangsmaterial ausgewählt wird, wird eine Phagenbank hergestellt, in der Mitglieder den variablen Bereich derselben leichten Kette (d.h. des Ausgangsmaterials von der Maus) und einen variablen Bereich einer unterschiedlichen schweren Kette präsentieren. Die variablen Bereiche der schweren Kette werden von einer Bank mit menschlichen rearrangierten variablen Bereichen der schweren Kette erhalten. Ein Phage, der eine starke spezifische Bindung an das hTRT-Polypeptid zeigt (z.B. mindestens 10® und vorzugsweise mindestens 109 M~1) wird ausgewählt. Der variable Bereich der menschlichen schweren Kette von diesem Phagen dient dann als Ausgangsmaterial für die Herstellung einer weiteren Phagenbank. In dieser Bank präsentiert jeder Phage denselben variablen Bereich der schweren Kette, d.h. den von der ersten Präsentationsbank identifizierte Bereich, und einen unterschiedlichen Bereich der leichten Kette. Die variablen Bereiche der leichten Kette werden von einer Bank aus menschlichen rearrangierten variablen Regionen der leichten Kette erhalten. Wieder wird ein Phage, der eine starke spezifische Bindung zeigt, ausgewählt. Diese Phagen präsentieren die variablen Bereiche von vollständig menschlichen anti-hTRT-Antikörpern. Diese Antikörper weisen üblicherweise die gleiche oder eine ähnliche Epitopspezifität auf, wie das von der Maus stammende Ausgangsmaterial. In a variation of the "phage-display" process, humanized antibodies with the binding specificity of a selected mouse antibody can be produced. In this method, the variable region of either the heavy or the light chain of the selected mouse antibody is used as the starting material. For example, if the variable region of a light chain is selected as the starting material, a phage bank is created in which members present the variable region of the same light chain (i.e. the starting material from the mouse) and a variable region of a different heavy chain. The heavy chain variable regions are obtained from a bank with human rearranged heavy chain variable regions. A phage that shows strong specific binding to the hTRT polypeptide (e.g. at least 10® and preferably at least 109 M ~ 1) is selected. The variable region of the human heavy chain from this phage then serves as the starting material for the production of a further phage bank. In this bank, each phage presents the same variable region of the heavy chain, i.e. the area identified by the first presentation bench, and a different area of the light chain. The light chain variable regions are obtained from a bank of human rearranged light chain variable regions. Again, a phage that shows strong specific binding is selected. These phages present the variable regions of fully human anti-hTRT antibodies. These antibodies usually have the same or a similar epitope specificity as the mouse-derived starting material.

E) Hybrid-Antikörper E) Hybrid antibodies

Die Erfindung stellt auch Hybrid-Antikörper bereit, die die Spezifität mit Antikörpern gegen ein hTRT-Polypeptid gemeinsam haben, jedoch auch eine zweite Einheit spezifisch binden können. In diesen Hy-brid-Antikörpern stammt normalerweise ein Paar aus einer schweren und leichten Kette von einem anti-hTRT-Antikörper und das andere Paar von einem Antikörper, der gegen ein anderes Epitop oder Protein gerichtet ist. Dies führt zu der Eigenschaft einer multifunktionellen Valenz, d.h. der Fähigkeit, mindestens zwei verschiedene Epitope gleichzeitig binden zu können, wobei mindestens ein Epitop das Epitop ist, an das der anti-Komplex-Antikörper bindet. Solche Hybride können durch Fusion der entspre- The invention also provides hybrid antibodies that share specificity with antibodies to an hTRT polypeptide, but can also specifically bind a second entity. In these hybrid antibodies, one pair normally comes from a heavy and light chain from an anti-hTRT antibody and the other pair from an antibody directed against another epitope or protein. This leads to the property of multifunctional valence, i.e. the ability to bind at least two different epitopes simultaneously, at least one epitope being the epitope to which the anti-complex antibody binds. Such hybrids can be created by merging the corresponding

42 42

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

chenden Bestandteilsantikörpern herstellenden Hybridome gebildet werden oder durch Kombinationsverfahren. Hybridomas producing constituent antibodies are formed or by combination methods.

Erfindungsgemässe Immunglobuline können auch mit funktionellen Bereichen von anderen Genen (z.B. Enzymen) zur Herstellung von Fusionsproteinen (z.B. Immuntoxinen) mit nützlichen Eigenschaften fusioniert werden. Immunoglobulins according to the invention can also be fused with functional areas of other genes (e.g. enzymes) for the production of fusion proteins (e.g. immunotoxins) with useful properties.

F) Anti-idiotypische Antikörper F) Anti-idiotypic antibodies

Auch anti-idiotypische Antikörper, die mittels der vorstehend beschriebenen Verfahren isoliert werden können, sind von Nutzen. Anti-idiotypische Antikörper können beispielsweise durch Immunisierung eines Tiers mit dem primären Antikörper (d.h. anti-hTRT-Antikörpem oder hTRT-bindenden Fragmenten davon) präpariert werden. Für anti-hTRT-Antikörper werden anti-idiotypische Antikörper ausgewählt, deren Bindung an den primären Antikörper durch ein hTRT-Polypeptid oder Fragmente davon gehemmt wird. Da sowohl der anti-idiotypische Antikörper als auch das hTRT-Polypeptid oder Fragmente davon, das primäre Immunglobulin binden, kann das anti-idiotypische Immunglobulin das «interne Bild» eines Epitops repräsentieren und somit in Assays das hTRT-Polypeptid ersetzen, oder es kann dazu verwendet werden, anti-hTRT-Antikörper, beispielsweise in einem Patienten, zu binden (d.h. zu inaktivieren). Anti-idiotypische Antikörper können auch mit Telomeraseassoziierten Proteinen interagieren. Die Verabreichung solcher Antikörper könnte eine Telomerase-Funktion durch Austitrieren hTRT-assoziierter Proteine beeinflussen. Anti-idiotypic antibodies that can be isolated using the methods described above are also useful. Anti-idiotypic antibodies can be prepared, for example, by immunizing an animal with the primary antibody (i.e. anti-hTRT antibody or hTRT-binding fragments thereof). For anti-hTRT antibodies, anti-idiotypic antibodies are selected whose binding to the primary antibody is inhibited by an hTRT polypeptide or fragments thereof. Since both the anti-idiotypic antibody and the hTRT polypeptide or fragments thereof bind the primary immunoglobulin, the anti-idiotypic immunoglobulin can represent the "internal picture" of an epitope and thus replace the hTRT polypeptide in assays, or it can do so be used to bind (ie inactivate) anti-hTRT antibodies, for example in a patient. Anti-idiotypic antibodies can also interact with telomerase-associated proteins. The administration of such antibodies could affect telomerase function by titrating out hTRT-associated proteins.

G) Allgemeines G) General

Die erfindungsgemässen Antikörper können zu einem beliebigen Isotyp gehören, beispielsweise IgM, IgD, IgG, IgA und IgE, wobei IgG, IgA und IgM oft bevorzugt sind. Humanisierte Antikörper können auch Sequenzen von mehr als einer Klasse oder eines Isotyps umfassen. The antibodies according to the invention can belong to any isotype, for example IgM, IgD, IgG, IgA and IgE, with IgG, IgA and IgM being often preferred. Humanized antibodies can also include sequences from more than one class or isotype.

In einer weiteren erfindungsgemässen Ausführungsform werden Fragmente der intakten vorstehend beschriebenen Antikörper bereitgestellt. Typischerweise können diese Fragmente mit dem intakten Antikörper, von dem sie abstammen, um die spezifische Bindung an das hTRT-Polypeptid konkurrieren und sie binden mit einer Affinität von 107, 108, 109 M~1, oder 1010 M~1. Zu den Antikörperfragmenten zählen getrennte schwere Ketten, leichte Ketten, Fab, Fab'F(ab')2, Fabc und Fv. Fragmente können durch en-zymatische oder chemische Trennung von intakten Immunglobulinen hergestellt werden. Beispielsweise kann ein F(ab')2-Fragment aus einem IgG-Molekül durch proteolytische Spaltung mit Pepsin bei einem pH-Wert von 3,0-3,5 mit Standardverfahren, wie sie beispielsweise in Harlow und Lane, a.a.O., beschrieben sind, erhalten werden. Fab-Fragmente können aus F(ab')2-Fragmenten durch limitierte Reduktion aus einem ganzen Antikörper durch Spaltung mit Papain in Gegenwart von Reduktionsmitteln erhalten werden (siehe allgemein Paul, W. (Herausg.) Fundamental Immunology 2nd Raven Press, N.Y., 1989, Kapitel 7, wobei dieses Dokument durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden kann). Fragmente können auch durch DNA-Re-kombinationsverfahren hergestellt werden. Nucleinsäuresegmente, die ausgewählte Fragmente codieren, werden durch Spaltung codierender Sequenzen vollständiger Länge mit Restriktionsenzymen hergestellt oder durch de novo-Synthese. Oft werden Fragmente in Form eines Phagen-Fusionshüllproteins exprimiert. In a further embodiment according to the invention, fragments of the intact antibodies described above are provided. Typically, these fragments can compete with the intact antibody from which they are derived for specific binding to the hTRT polypeptide and bind with an affinity of 107, 108, 109 M ~ 1, or 1010 M ~ 1. Antibody fragments include separate heavy chains, light chains, Fab, Fab'F (ab ') 2, Fabc and Fv. Fragments can be made by enzymatic or chemical separation of intact immunoglobulins. For example, an F (ab ') 2 fragment from an IgG molecule by proteolytic cleavage with pepsin at a pH of 3.0-3.5 using standard methods, as described, for example, in Harlow and Lane, loc. Cit. be preserved. Fab fragments can be obtained from F (ab ') 2 fragments by limited reduction from a whole antibody by digestion with papain in the presence of reducing agents (see generally Paul, W. (ed.) Fundamental Immunology 2nd Raven Press, NY, 1989 , Chapter 7, this document being incorporated by reference in its entirety and for all purposes as part of this description). Fragments can also be made by recombinant DNA techniques. Nucleic acid segments encoding selected fragments are made by digesting full length coding sequences with restriction enzymes or by de novo synthesis. Fragments are often expressed in the form of a phage fusion coat protein.

Viele der vorstehend beschriebenen Immunglobuline können unkritische Aminosäuresubstitutionen, Additionen oder Deletionen sowohl in den variablen als auch in den konstanten Bereichen ohne Verlust von Bindungsspezifität oder Effektorfunktionen oder nicht tolerierbare Herabsetzung der Bindungsaktivität (d.h. unter etwa 107 M~1) durchlaufen. Üblicherweise zeigen Immunglobuline mit solchen Änderungen eine im wesentlichen identische Sequenz, verglichen mit einem Referenzimmunglobulin von dem sie abstammen. Ein mutiertes Immunglobulin kann ausgewählt werden, das die gleiche Spezifität und eine erhöhte Affinität aufweist im Vergleich zu einem Referenzimmunglobulin, von dem es abstammt. Die «phage-display»-Technologie bietet nützliche Verfahren zur Selektion solcher Immunglobuline. Siehe beispielsweise Dower et al., WO 91/17 271, McCafferty et al., WO 92/01 047 und Huse, WO 92/06 204. Many of the immunoglobulins described above can undergo uncritical amino acid substitutions, additions or deletions in both the variable and constant regions without loss of binding specificity or effector functions or intolerable reduction in binding activity (i.e. below about 107 M ~ 1). Typically, immunoglobulins with such changes show a substantially identical sequence compared to a reference immunoglobulin from which they are derived. A mutant immunoglobulin can be selected that has the same specificity and increased affinity compared to a reference immunoglobulin from which it is derived. The «phage-display» technology offers useful methods for the selection of such immunoglobulins. See, for example, Dower et al., WO 91/17 271, McCafferty et al., WO 92/01 047 and Huse, WO 92/06 204.

Die erfindungsgemässen Antikörper können mit oder ohne Modifikation verwendet werden. Häufig werden die Antikörper durch entweder kovalente oder nicht-kovalente Anfügung einer nachweisbaren Markierung markiert. Als markierte Bindungseinheiten sind die erfindungsgemässen Antikörper bei diagnostischen Anwendungen von besonderem Nutzen. The antibodies according to the invention can be used with or without modification. The antibodies are often labeled by either covalent or non-covalent addition of a detectable label. The antibodies according to the invention are particularly useful as labeled binding units in diagnostic applications.

Die erfindungsgemässen anti-hTRT-Antikörper können unter Verwendung allgemein bekannter Verfahren gereinigt werden. Die vollständigen Antikörper, ihre Dimere, individuellen leichten und schweren Ketten oder andere erfindungsgemässen Immunglobulinformen können unter Verwendung der erfindungsgemässen Verfahren und Reagenzien in Übereinstimmung mit auf dem Fachgebiet üblichen Standardverfahren, zu denen Ammoniumsulfatpräzipitation, Affinitätssäulen, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese etc. gehören, gereinigt werden (siehe allgemein Scopes, Protein Purification: Principiesand Practice, 3. Ausgabe (Springer-Verlag, N.Y.; 1993). Bevorzugt sind im wesentlichen reine Immunglobuline mit mindestens etwa 90 bis 95% oder sogar 98 bis 99% oder darüber liegender Homogenität. The anti-hTRT antibodies according to the invention can be purified using generally known methods. The complete antibodies, their dimers, individual light and heavy chains, or other forms of immunoglobulin according to the present invention can be purified using the methods and reagents of the present invention in accordance with standard procedures common in the art, including ammonium sulfate precipitation, affinity columns, column chromatography, gel electrophoresis, etc. (see General Scopes, Protein Purification: Principiesand Practice, 3rd Edition (Springer-Verlag, NY; 1993), Preferred are essentially pure immunoglobulins with at least about 90 to 95% or even 98 to 99% or higher homogeneity.

43 43

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

VI. Reinigung von menschlicher Telomerase VI. Purification of human telomerase

Die vorliegende Erfindung stellt isolierte menschliche Telomerase mit bisher nicht erreichter Reinheit bereit. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung bereit: gereinigte hTRT rekombinanten oder nicht-rekombinanten Ursprungs; gereinigte hTRT-hTR-Komplexe (d.h. RNPs), rekombinanten, nicht-rekombi-nanten oder gemischten Ursprungs, die gegebenenfalls ein oder mehrere Telomeraseassoziierte Proteine umfassen; gereinigte natürlich vorkommende menschliche Telomerase; etc. Darüber hinaus stellt die Erfindung Verfahren und Reagenzien bereit, um die vorstehend beschriebenen Moleküle und Komplexe einschliesslich von Varianten, Fusionsproteinen, natürlich vorkommenden Proteinen etc. (die kollektiv als «hTRT und/oder hTRT-Komplexe» bezeichnet werden) in partiell gereinigter, im wesentlich gereinigter oder hochgereinigter Form gewinnen zu können. Bevor diese Erfindung gemacht wurde, wurden Versuche unternommen, den Telomerase-Enzym-Komplex bis zur Homogenität zu reinigen, jedoch mit begrenztem Erfolg (siehe beispielsweise die parallele US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/833 377, eingereicht am 4. April 1997 und 08/510 736, eingereicht am 4. August 1995 sowie die PCT-Anmeldung Nr. 97/06 012, eingereicht am 4. April 1997. Diese Dokumente sind aufgrund der Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung hinsichtlich nützlicher Reinigungsverfahren anzusehen). Die in den vorstehend aufgeführten Anmeldungen bereitgestellten Verfahren erlauben es, Telomerase bis etwa 60 OOOfach oder höher im Vergleich zu Zellrohextrakten zu reinigen. Die vorliegende Erfindung stellt hTRT und hTRT-Komplexe mit sogar noch höherer Reinheit bereit, teilweise dank der neuen erfindungsgemässen Immunoaffinitätsreagenzien, (z.B. anti-hTRT-Antikörper) und/oder der hier für die rekombinante Expression von hTRT zur Verfügung gestellten Reagenzien, Zellen und Verfahren. Die rekombinante Expression von hTRT und hTRT-Komplexen erleichtert die Reinigung, da die gewünschten Moleküle in wesentlich höherer Konzentration im Vergleich zu den meisten in der Natur vorkommenden exprimierenden Zellen hergestellt werden und/oder weil die rekombinanten hTRT-Moleküle so modifiziert werden können (z.B. durch Fusion mit einem Epitop-«tag»), dass sie leicht gereinigt werden können. The present invention provides isolated human telomerase with unprecedented purity. In particular, the present invention provides: purified hTRT recombinant or non-recombinant in origin; purified hTRT-hTR complexes (i.e., RNPs), recombinant, non-recombinant, or mixed origin, optionally including one or more telomerase-associated proteins; purified naturally occurring human telomerase; etc. Furthermore, the invention provides methods and reagents for the above-described molecules and complexes including variants, fusion proteins, naturally occurring proteins etc. (collectively referred to as “hTRT and / or hTRT complexes”) in partially purified, to be able to win in a substantially purified or highly purified form. Before making this invention, attempts have been made to purify the telomerase-enzyme complex to homogeneity, but with limited success (see, for example, U.S. Patent Application Serial No. 08 / 833,377, filed April 4, filed 1997 and 08/510 736, filed August 4, 1995, and PCT Application No. 97/06 012, filed April 4, 1997. These documents are to be considered part of this description for useful cleaning procedures by reference). The methods provided in the applications listed above make it possible to purify telomerase up to about 60,000 times or higher compared to crude cell extracts. The present invention provides hTRT and hTRT complexes with even higher purity, in part thanks to the new immunoaffinity reagents according to the invention (eg anti-hTRT antibodies) and / or the reagents, cells and methods provided here for the recombinant expression of hTRT . The recombinant expression of hTRT and hTRT complexes facilitates purification because the desired molecules are produced in a significantly higher concentration compared to most naturally occurring expressing cells and / or because the recombinant hTRT molecules can be modified in this way (e.g. by Fusion with an epitope “tag” that they can be easily cleaned.

Es ist offensichtlich, dass natürlich vorkommende Telomerase aus einer Telomerase-positiven Zelle gereinigt werden kann. Rekombinante hTRT und hTRT-Komplexe können u.a. unter Verwendung beliebiger in vitro, in vivo, ex vivo, pflanzlichen oder tierischen Expressionssystemen, die vorstehend beschrieben wurden, oder andere auf dem Fachgebiet bekannte Systeme exprimiert und gereinigt werden. It is obvious that naturally occurring telomerase can be purified from a telomerase positive cell. Recombinant hTRT and hTRT complexes can include expressed and purified using any of the in vitro, in vivo, ex vivo, plant or animal expression systems described above, or other systems known in the art.

In einer Ausführungsform werden die hTRT, Telomerase und andere erfindungsgemässen Zusammensetzungen mittels eines Immunoaffinitätsschritts gereinigt, wobei entweder nur dieser Schritt oder eine Kombination mit weiteren Reinigungsschritten durchgeführt wird. Typischerweise wird ein immobilisierter oder immobilisierbarer anti-hTRT-Antikörper, sowie er von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, mit einer Probe, beispielsweise einem Zellysat, das die gewünschte hTRT oder den hTRT-enthaltenden Komplex enthält, unter Bedingungen in Kontakt gebracht, bei denen ein anti-hTRT-Antikörper das hTRT-Antigen bindet. Nach Entfernung von nichtgebundenen Bestandteilen der Probe durch auf dem Fachgebiet allgemein bekannte Verfahren kann die hTRT-Zusammensetzung, falls erwünscht, von dem Antikörper in im wesentlichen reiner Form eluiert werden. In einer Ausführungsform werden auf dem Fachgebiet gut bekannte Immunoaffinitätschromatographieverfahren verwendet (siehe beispielsweise Harlow und Lane, a.a.O., Ausubel, a.a.O., und Hermansanetal., 1992, Immobilized Affinity Ligand Techniques(Acade-micPress,SanDiego»in Übereinstimmung mit den erfindungsgemässen Verfahren. In einer weiteren veranschaulichenden Ausführungsform wird eine Immunpräzipitation von anti-hTRT-lmmunglobulin-hTRT-Komplexen unter Verwendung von immobilisiertem Protein A durchgeführt. Dem Fachmann sind zahlreiche Variationen und alternative Immunoaffinitätsreinigungsprotokolle, die zur Verwendung in Übereinstimmung mit den erfindungsgemässen Verfahren und Reagenzien geeignet sind, gut bekannt. In one embodiment, the hTRT, telomerase and other compositions according to the invention are purified by means of an immunoaffinity step, either only this step or a combination with further purification steps being carried out. Typically, an immobilized or immobilizable anti-hTRT antibody, as provided by the present invention, is contacted with a sample, for example a cell lysate, which contains the desired hTRT or the hTRT-containing complex, under conditions in which a anti-hTRT antibody that binds hTRT antigen. After removal of unbound components of the sample by methods well known in the art, the hTRT composition can, if desired, be eluted from the antibody in substantially pure form. In one embodiment, immunoaffinity chromatography methods well known in the art are used (see, for example, Harlow and Lane, loc. Cit., Ausubel, loc. Cit., And Hermansanetal., 1992, Immobilized Affinity Ligand Techniques (Acade-micPress, SanDiego »in accordance with the methods of the invention. In one In another illustrative embodiment, immunoprecipitation of anti-hTRT-immunoglobulin-hTRT complexes is performed using immobilized protein A. Numerous variations and alternative immunoaffinity purification protocols suitable for use in accordance with the methods and reagents of the invention are well known to those skilled in the art.

In einer weiteren Ausführungsform können rekombinante hTRT-Proteine als Folge ihrer Expression mit hohem Niveau mittels Routine-Proteinreinigungsverfahren gereinigt werden, beispielsweise durch Ammoniumsulfatpräzipitation, Affinitätssäulen (z.B. Immunoaffinität), Ausschluss nach Grösse («size-ex-clusion»), Anionen- und Kationen Austauschchromatographie, Gelelektrophorese etc. (siehe allgemein R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982) und Deutscher, Methods in Enzymology 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990)) anstelle von Immunoaffinitätsver-fahren oder zusätzlich dazu. Kationenaustauschverfahren können aufgrund des basischen pl-Werts des hTRT-Proteins besonders nützlich sein. Beispielsweise kann immobilisiertes Phosphat als eine funktionelle Kationenaustauschgruppe (z.B. P-11 Phosphocellulose, Whatman-Katalog #4071 oder Cellulose-phosphat, Sigma-Katalog #C 3145) verwendet werden. Immobilisiertes Phosphat hat bezüglich der hTRT-Reinigung zwei vorteilhafte Merkmale - es ist ein Kationenaustauschharz und es zeigt physikalisch eine Ähnlichkeit mit dem Phosphatrückgrat von Nucleinsäuren. Daher kann auch die «Pseudo»-Af-finitätschromatophie verwendet werden, da hTRT hTR und Telomer-DNA bindet. Andere nicht-spezifi-sche Nucleinsäure-Affinitätschromatographieverfahren sind zur Reinigung ebenfalls von Nutzen (siehe beispielsweise die parellele US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/833 377; Albers et al., Methods Enzymol. 21 (1971), 198; Arnt-Jovin et al., Eur. J. Biochem. 54(1975), 411 und den Pharmacia-Katalog #27-5575-02). Die weitere Nutzung dieser wahrscheinlichen Bindungsfunktion von hTRT würde die Verwendung von spezifischen Nucleinsäuren (z.B. Primer oder hTR) bei Affinitätschromatographie zur Reinigung beinhalten (Chodosh et al., Mol. Cell. Biol. 6 (1986), 4723; Wu et al., Science 238 (1987), 1247 und Kadonaga, Methods Enzymol. 208 (1991), 10); immobilisierter «Cibricon Blue»-Farbstoff, der physi- In a further embodiment, recombinant hTRT proteins can be purified as a result of their high-level expression using routine protein purification processes, for example by ammonium sulfate precipitation, affinity columns (eg immunoaffinity), size-exclusion, anion and cations Exchange chromatography, gel electrophoresis, etc. (see generally R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982) and Deutscher, Methods in Enzymology 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. NY (1990)) instead of immunoaffinity testing. drive or in addition to it. Cation exchange methods can be particularly useful due to the basic pI value of the hTRT protein. For example, immobilized phosphate can be used as a functional cation exchange group (e.g. P-11 phosphocellulose, Whatman catalog # 4071 or cellulose phosphate, Sigma catalog #C 3145). Immobilized phosphate has two advantageous features in terms of hTRT purification - it is a cation exchange resin and it shows physically a similarity to the phosphate backbone of nucleic acids. Therefore, the "pseudo" AF-finite chromatography can be used because hTRT binds hTR and telomer DNA. Other nonspecific nucleic acid affinity chromatography methods are also useful for purification (see, for example, U.S. Pat. No. 08/833,377; Albers et al., Methods Enzymol. 21 (1971), 198; Arnt -Jovin et al., Eur. J. Biochem. 54 (1975), 411 and Pharmacia catalog # 27-5575-02). Further use of this probable binding function of hTRT would involve the use of specific nucleic acids (e.g. primer or hTR) in affinity chromatography for purification (Chodosh et al., Mol. Cell. Biol. 6 (1986), 4723; Wu et al., Science 238 (1987), 1247 and Kadonaga, Methods Enzymol. 208 (1991), 10); immobilized «Cibricon Blue» dye, the physical

44 44

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

kalisch Nucleotiden ähnelt, stellt aufgrund der hTRT-Bindung von Nucleotiden (z.B. als Substrate für die DNA-Synthese) ein weiteres nützliches Harz für die Reinigung von hTRT dar (Pharmacia-Katalog #17-0948-01 oder Sigma-Katalog #C 1285). Kalisch resembles nucleotides, represents another useful resin for the purification of hTRT due to the hTRT binding of nucleotides (e.g. as substrates for DNA synthesis) (Pharmacia catalog # 17-0948-01 or Sigma catalog #C 1285) .

In einer Ausführungsform werden hTRT-Proteine direkt von einem in vitro oder in vivo-Expressionssy-stem isoliert, in dem andere Telomerase-Bestandteile nicht coexprimiert werden. Isoliertes hTRT-Protein kann natürlich auch leicht von gereinigter menschlicher Telomerase oder hTRT-Komplexen beispielsweise durch Aufbrechen des Telomerase-RNPs (z.B. durch Exposition gegenüber einem milden oder einem anderen Denaturierungsmittel) und Abtrennung der RNP-Bestandteile (z.B. durch Routinemassnahmen wie Chromatographie oder Immunoaffinitätschromatographie) gereinigt werden. In one embodiment, hTRT proteins are isolated directly from an in vitro or in vivo expression system in which other telomerase components are not co-expressed. Isolated hTRT protein can of course also be easily removed from purified human telomerase or hTRT complexes, for example by breaking up the telomerase RNP (for example by exposure to a mild or other denaturing agent) and separating the RNP components (for example by routine measures such as chromatography or immunoaffinity chromatography). getting cleaned.

Die Telomerase-Reinigung kann unter Verwendung eines Assays bezüglich einer Telomerase-Aktivität (z.B. den TRAP-Assay, einen üblichen Assay oder einen Primer-Bindungs-Assay) überwacht werden, durch Bestimmung der hTRT-Anreicherung (z.B. durch ELISA), durch Bestimmung der hTR-Anreiche-rung oder durch weitere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren. Telomerase purification can be monitored using an assay for telomerase activity (e.g., the TRAP assay, a conventional assay, or a primer binding assay) by determining the hTRT enrichment (e.g. by ELISA) by determining the hTR enrichment or by other methods known in the art.

Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte gereinigte menschliche Telomerase, die hTRT-Proteine und hTRT-Komplexe, sind in einer Ausführungsform hoch gereinigt (d.h. mindestens zu etwa 90% homogen, vorzugsweise mindestens zu etwa 95% homogen). Die Homogenität kann durch Stan-dardmassnahmen bestimmt werden, beispielsweise durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und andere auf dem Fachgebiet bekannte Mittel (siehe beispielsweise Ausubel etal., a.a.O.). Zwar sind gelegentlich hochgereinigte menschliche Telomerase, hTRT-Protein oder hTRT-Komplexe erwünscht, aber natürlich sind auch im wesentlich gereinigte (z.B. mit wenigstens etwa 75% Homogenität) oder partiell gereinigte (z.B. mindestens zu etwa 20% homogen) menschliche Telomerase, hTRT-Protein oder hTRT-Komplexe für viele Anwendungen auch von Nutzen und diese werden durch die vorliegende Erfindung ebenfalls bereitgestellt. Beispielsweise ist partiell gereinigte Telomerase nützlich für das Screenen von Testverbindungen bezüglich einer Telomerase-modulierenden Aktivität und für weitere Verwendungen (siehe beispielsweise die parallele US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/911312 (Anwalts-Register Nr. 015 389-002 500, eingereicht am 14. August 1997, vorstehend zitiert, und US-Patent-Nr. 5 645 986, USSN 08/151 477, eingereicht am 12. November 1993 und USSN 08/288 501, eingereicht am 10. August 1994). The purified human telomerase provided by the present invention, the hTRT proteins and hTRT complexes, are highly purified in one embodiment (i.e. at least about 90% homogeneous, preferably at least about 95% homogeneous). Homogeneity can be determined by standard measures such as SDS polyacrylamide gel electrophoresis and other means known in the art (see, e.g., Ausubel et al., Supra). Although highly purified human telomerase, hTRT protein or hTRT complexes are occasionally desired, naturally purified (e.g. at least about 75% homogeneity) or partially purified (e.g. at least about 20% homogeneous) human telomerase, hTRT protein is also desirable or hTRT complexes also useful for many applications and these are also provided by the present invention. For example, partially purified telomerase is useful for screening test compounds for telomerase-modulating activity and for other uses (see, for example, U.S. Patent Application Serial No. 08/911312 (Attorney Register No. 015 389-002 500, filed August 14, 1997, cited above, and U.S. Patent No. 5,645,986, USSN 08/151,477, filed November 12, 1993, and USSN 08/288 501, filed August 10, 1994).

VII. Die Behandlung von Erkrankungen, die mit Telomerase in Verbindung stehen VII. The treatment of diseases related to telomerase

A) Einleitung A) Introduction

Die vorliegende Erfindung stellt hTRT-Polynucleotide, -Polypeptide und -Antikörper bereit, die für die Behandlung von menschlichen Erkrankungen und Krankheitszuständen von Nutzen sind. Die rekombinanten und synthetischen erfindungsgemässen hTRT-Genprodukte (Protein und mRNA) können dazu verwendet werden, um Telomerase-Aktivität in einer Zelle zu erzeugen oder zu erhöhen, aber auch um Telomerase-Aktivität in einer Zelle zu hemmen, in der dies nicht erwünscht ist. Somit kann die Hemmung, Inaktivierung oder anderweitige Veränderung einer Telomerase-Aktivität (z.B. einer katalytischen Aktivität von Telomerase, Genauigkeit, Prozessivität, Telomer-Bindung etc.) in einer Zelle zur Veränderung der Proliferationsfähigkeit der Zelle verwendet werden. Beispielsweise kann die Herabsetzung von Telomeraseaktivität in einer immortalisierten Zelle, wie beispielsweise einer malignen Tumorzelle, die Zelle mortalisieren. Umgekehrt kann die Steigerung der TelomeraseAktivität in einer sterblichen Zelle (wozu beispielsweise die meisten menschlichen somatischen Zellen gehören) zur Steigerung der Proliferationsfähigkeit der Zelle führen. Beispielsweise führt die Expression eines hTRT-Proteins in Hautfibro-blasten, wodurch die Telomerlänge ansteigt, zu einer erhöhten Proliferationskapazität der Fibroblasten; eine solche Expression kann die altersabhängige Verlangsamung des Wundverschlusses verlangsamen oder umkehren (siehe beispielsweise West, Arch. Derm. 130 (1994), 87). The present invention provides hTRT polynucleotides, polypeptides and antibodies that are useful for the treatment of human diseases and conditions. The recombinant and synthetic hTRT gene products (protein and mRNA) according to the invention can be used to generate or increase telomerase activity in a cell, but also to inhibit telomerase activity in a cell in which this is not desired. Thus, inhibiting, inactivating, or otherwise altering a telomerase activity (e.g., a telomerase catalytic activity, accuracy, processivity, telomer binding, etc.) in a cell can be used to alter the cell's proliferation ability. For example, the reduction in telomerase activity in an immortalized cell, such as a malignant tumor cell, can mortalize the cell. Conversely, increasing telomerase activity in a mortal cell (which includes, for example, most human somatic cells) can increase the cell's ability to proliferate. For example, expression of an hTRT protein in skin fibroblasts, which increases the length of the telomer, leads to an increased proliferation capacity of the fibroblasts; such an expression can slow down or reverse the age-dependent slowdown in wound closure (see, for example, West, Arch. Derm. 130 (1994), 87).

Somit betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung von Reagenzien und Verfahren, die bei der Behandlung von Erkrankungen und Zuständen von Nutzen sind, die durch die Anwesenheit, das Fehlen oder die Menge von menschlicher Telomerase-Aktivität in einer Zelle gekennzeichnet sind und die auf eine Behandlung unter Verwendung der hier beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren ansprechen. Zu diesen Erkrankungen zählen, so wie dies ausführlich und nachstehend beschrieben wird, Krebserkrankungen, andere Erkrankungen bezüglich der Zellproliferation (insbesondere Erkrankungen bezüglich der Alterung, immunologische Funktionsstörungen, Unfruchtbarkeit (oder Fruchtbarkeit) etc. Thus, one aspect of the present invention relates to the provision of reagents and methods that are useful in the treatment of diseases and conditions characterized by the presence, absence or amount of human telomerase activity in a cell and which are responsive to a Respond to treatment using the compositions and methods described herein. These diseases include, as described in detail and below, cancer, other diseases related to cell proliferation (especially diseases related to aging, immunological dysfunction, infertility (or fertility) etc.

B) Die Behandlung von Krebs B) Treatment of cancer

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zur Herabsetzung von Telomerase-Aktivität in Tumorzellen und zur Behandlung von Krebs bereit. Krebszellen (z.B. maligne Tumorzellen), die Telomerase-Aktivität exprimieren (Telomerase-positive Zellen) können durch Herabsetzung oder Hemmung der endogenen Telomerase-Aktivität mortalisiert werden. Darüber hinaus könnte jede Herabsetzung der Telomerase-Aktivität die aggressive Natur einer Krebserkrankung hin zu einem leichter zur therapierenden Krankheitsstatus (durch Steigerung der Wirksamkeit von konventionellen Behandlungs- The present invention provides methods and compositions for reducing telomerase activity in tumor cells and for treating cancer. Cancer cells (e.g. malignant tumor cells) that express telomerase activity (telomerase positive cells) can be mortalized by reducing or inhibiting endogenous telomerase activity. In addition, any decrease in telomerase activity could change the aggressive nature of cancer to a more easily treatable disease status (by increasing the effectiveness of conventional treatment

45 45

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

methoden) herabsetzen, da Telomerasespiegel mit Krankheitskennzeichen, wie beispielsweise dem Potential zur Metastasenbildung korrelieren (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5 639 613; 5 648 215; 5 489 508 und Pandita et al., Proc. Am. Ass. Cancer Res 37 (1996, 559). methods) because telomerase levels correlate with disease characteristics such as the potential for metastasis (see, for example, U.S. Patent Nos. 5,639,613; 5,648,215; 5,489,508 and Pandita et al., Proc. Am. Ass. Cancer Res 37 (1996, 559).

Die Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren bereit, die bei der Behandlung einer grossen Anzahl von unterschiedlichen Krebstypen von Nutzen sind, einschliesslich von soliden Tumoren und Leukämien. Zu den Krebsarten, die behandelt werden können gehören (jedoch ohne Beschränkung darauf): das Adenokarzinom der Brust, der Prostata und des Dickdarms; alle Formen von Lungenkrebs, der von den Bronchien ausgeht; Knochenmarkskrebs, das Melanom, das Hepatom, das Neuroblastom; das Papillom; das Apudom, das Choristom, das Branchiom; das maligne Karzinoid-Syndrom; die Karzi-noid-Herzerkrankung; das Karzinom (z.B. Walke-Karzinom, Basalzellen-Karzinom, basosquamöses Karzinom, Brown-Pearce-Karzinom, duktales Karzinom, Ehrlich-Tumor, insitu-Karzinom, Krebs-2-Karzinom, Merkel-Zellen-Karzinom, Schleimkrebs, nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom, Haferzellen-Karzinom, papilläres Karzinom, szirrhöses Karzinom, bronchiolo-alveoläres Karzinom, Bronchial-Karzinom, Plattenepithelkarzinom und Transitionalzell-Karzinom); histiocytische Funktionsstörung; Leukämie (z.B. in Zusammenhang mit B-Zellen-Leukämie, Gemischt-Zellen-Leukämie, Nullzellen-Leukämie, T-Zellen-Leukämie, chronische T-Zellen-Leukämie, HTLV-ll-assoziierte Leukämie, akut lymphozytische Leukämie, chronisch-lymphozytische Leukämie, Mastzell-Leukämie und myeloische Leukämie), maligne Histiocytose, Hodg-kin-Krankheit, klein Immunproliferativ; non-Hodgkin-Lymphom, solitärer Plasmazelltumor; Reticuloendo-theliose, Melanom, Chondroblastom; Chondrom, Chondrosarkom; Fibrom; Fibrosarkom; Riesenzell-Tu-more; Histiocytom, Lipom; Liposarkom; Mesotheliom, Myxom; Myxosarkom; Osteom; Osteosarkom; Ewing-Sarkom; Synoviom; Adenofibrom; Adenolymphom; Karcinosarkom, Chordom, Craniopharyngiom, Dysgerminom, Hamartom; Mesenchymom; Mesonephrom, Myosarkom, Ameloblastom, Cementom; Odontom; Teratom; Thymom, Chorioblastom; Adenokarzinom, Adenom; Cholangiom; Cholesteatom; Cy-lindrom; Cystadenocarcinom,Cystadenom; Granulosazelltumor; Gynandroblastom, Hepatom; Hidrade-nom; Inselzelltumor; Leydig-Zelltumor; Papillom; Sertoli-Zell-Tumor, Thekazelltumor, Leiomyom; Leio-myosarkom; Myoblastom; Myom; Myosarkom; Rhabdomyom; Rhabdomyosarkom; Ependymon; Ganglio-neurom, Gliom; Medulloblastom, Meningiom; Neurilemmom; Neuroblastom; Neuroepitheliom, Neurofibrom, Neurom, Paragangliom, nicht-chromaffines Paragangliom, Angiokeratom, angiolymphoide Hyperplasie mit Eosinophilie; sclerosierendes Angiom; Angiomatose; Glomangiom; Hemangioendotheli-om; Hemangiom; Hemangiopericytom, Hemangiosarkom; Lymphangiom, Lymphangiomyom, Lymphan-giosarkom; Pinealom; Carcinosarkom; Chondrosarkom; Cystosarkom phyllodes; Fibrosarkom; Hemangiosarkom; Leiomyosarkom; -Leukosarkom; Liposarkom; Lymphangiosarkom; Myosarkom; Myxosarkom, ovarialkarzinom, Rhabdomyosarkom; Sarkom (z.B. Ewing-Sarkom, experimentell, Kaposi-Sarkom und Mastzell-Sarkom); Neoplasmen (z.B.Knochen-Neoplasmen, Brust-Neoplasmen, Neoplasmen des Verdauungssystems, colorektale Neoplasmen, Leber-Neoplasmen, Pankreas Neoplasmen, Hirnanhang-Neo-plasmen, Hoden-Neoplasmen, Orbita-Neoplasmen, Neoplasmen des Kopfes und Halses, des Zentralnervensystems, Neoplasmen des Hörorgans, des Beckens, des Atmungstrakts und des Urogenitaltrakts); Neurofibromatose und cervicale Plattenepuitheldysplasie). Die Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren bereit, die zur Behandlung anderer Zustände von Nutzen sind, bei denen Zellen immortalisiert oder hyperproliferativ wurden, beispielsweise durch Disregulation (z.B. abnormhohe Expression) von hTRT, dem Telomeraseenzym oder Aktivität. The invention provides compositions and methods that are useful in treating a wide variety of different types of cancer, including solid tumors and leukemias. The types of cancer that can be treated include (but are not limited to): breast, prostate, and colon adenocarcinoma; all forms of lung cancer that originate from the bronchi; Bone marrow cancer, melanoma, hepatoma, neuroblastoma; the papilloma; the apudome, the choristome, the branchchioma; the malignant carcinoid syndrome; Karzi-noid heart disease; the carcinoma (e.g. Walke carcinoma, basal cell carcinoma, basosquamous carcinoma, Brown Pearce carcinoma, ductal carcinoma, Ehrlich tumor, insitu carcinoma, cancer 2 carcinoma, Merkel cell carcinoma, mucous carcinoma, non-small cell carcinoma , Oat cell carcinoma, papillary carcinoma, scirrhous carcinoma, bronchiolo-alveolar carcinoma, bronchial carcinoma, squamous cell carcinoma and transitional cell carcinoma); histiocytic dysfunction; Leukemia (e.g. in connection with B-cell leukemia, mixed-cell leukemia, zero-cell leukemia, T-cell leukemia, chronic T-cell leukemia, HTLV-II-associated leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic-lymphocytic leukemia , Mast cell leukemia and myeloid leukemia), malignant histiocytosis, Hodg-kin disease, small immunoproliferative; non-Hodgkin's lymphoma, solitary plasma cell tumor; Reticuloendo theliosis, melanoma, chondroblastoma; Chondroma, chondrosarcoma; Fibroma; Fibrosarcoma; Giant cell Tu-more; Histiocytoma, lipoma; Liposarcoma; Mesothelioma, myxoma; Myxosarcoma; Osteoma; Osteosarcoma; Ewing's sarcoma; Synoviom; Adenofibroma; Adenolymphoma; Carcinosarcoma, chordoma, craniopharyngioma, dysgerminoma, hamartoma; Mesenchymoma; Mesonephroma, myosarcoma, ameloblastoma, cementoma; Odontoma; Teratoma; Thymoma, chorioblastoma; Adenocarcinoma, adenoma; Cholangioma; Cholesteatoma; Cy-lindrome; Cystadenocarcinoma, cystadenoma; Granulosa cell tumor; Gynandroblastoma, hepatoma; Hidrade-nom; Islet cell tumor; Leydig cell tumor; Papilloma; Sertoli cell tumor, theca cell tumor, leiomyoma; Leio myosarcoma; Myoblastoma; Fibroid; Myosarcoma; Rhabdomyoma; Rhabdomyosarcoma; Ependymon; Ganglio-neuroma, glioma; Medulloblastoma, meningioma; Neurilemmoma; Neuroblastoma; Neuroepithelioma, neurofibroma, neuroma, paraganglioma, non-chromaffin paraganglioma, angiokeratome, angiolymphoid hyperplasia with eosinophilia; sclerosing angioma; Angiomatosis; Glomangioma; Hemangioendotheli-om; Hemangioma; Hemangiopericytoma, hemangiosarcoma; Lymphangioma, lymphangiomyoma, lymphangiosarcoma; Pinealom; Carcinosarcoma; Chondrosarcoma; Cystosarcoma phyllodes; Fibrosarcoma; Hemangiosarcoma; Leiomyosarcoma; -Leukosarcoma; Liposarcoma; Lymphangiosarcoma; Myosarcoma; Myxosarcoma, ovarian cancer, rhabdomyosarcoma; Sarcoma (e.g. Ewing's sarcoma, experimental, Kaposi's sarcoma and mast cell sarcoma); Neoplasms (e.g. bone neoplasms, breast neoplasms, neoplasms of the digestive system, colorectal neoplasms, liver neoplasms, pancreatic neoplasms, neoplasms of the appendages, testicular neoplasms, orbital neoplasms, neoplasms of the head and neck system, the neoplasms of the central, central, and neoplasms Hearing organ, pelvis, respiratory tract and urogenital tract); Neurofibromatosis and cervical squamous dysplasia). The invention provides compositions and methods useful for treating other conditions in which cells have become immortalized or hyperproliferative, for example by disregulating (e.g., abnormally high expression) hTRT, the telomerase enzyme or activity.

Die vorliegende Erfindung stellt femer Zusammensetzungen und Verfahren zur Prävention von Krebserkrankungen zur Verfügung, dazu zählen anti-hTRT, Vakzine, GentherapieVektoren, die die Aktivierung von Telomerase verhindern und Gentherapie-Vektoren, die den spezifischen Tod von Telomerase-positi-ven Zellen zur Folge haben. In einem verwandten Aspekt können die nachstehend beschriebenen Genaustausch-Therapieverfahren zur «Behandlung» einer genetischen Prädisposition für Krebserkrankungen verwendet werden. The present invention further provides compositions and methods for cancer prevention, including anti-hTRT, vaccines, gene therapy vectors that prevent telomerase activation, and gene therapy vectors that result in the specific death of telomerase positive cells . In a related aspect, the gene exchange therapy methods described below can be used to "treat" a genetic predisposition to cancer.

C) Behandlung anderer Zustände C) Treatment of other conditions

Die vorliegende Erfindung stellt auch Zusammensetzungen und Verfahren bereit, die zur Behandlung von Erkrankung und Krankheitszuständen (zusätzlich zu Krebserkrankungen) von Nutzen sind, die durch eine unter- oder Überexpression von Telomerase oder hTRT-Genprodukten gekennzeichnet sind. Zu den Beispielen gehören: Erkrankungen bezüglich der Zellproliferation, Erkrankungen, die von Zellsenes-zenz herrühren (insbesondere Erkrankungen bezüglich des Alterns), immunologische Funktionsstörung und Unfruchtbarkeit, Erkrankungen bezüglich einer Immun-Fehlfunktion etc. The present invention also provides compositions and methods useful for treating disease and disease conditions (in addition to cancer) characterized by under or over expression of telomerase or hTRT gene products. Examples include: diseases related to cell proliferation, diseases resulting from cell senescence (particularly diseases related to aging), immunological dysfunction and infertility, diseases related to an immune malfunction etc.

Bestimmte Erkrankungen bezüglich des Alterns sind durch mit der Zellseneszenz-assoziierte Veränderungen aufgrund einer verringerten Telomerlänge (verglichen mit jüngeren Zellen) gekennzeichnet. Diese sind die Folge des Fehlens (oder eines viel geringeren Niveaus) von Telomerase-Aktivität in der Zelle. Eine verringerte Telomerlänge und eine verringerte Replikationsfähigkeit tragen zu den nachstehend beschriebenen Erkrankungen bei. Telomerase-Aktivität und Telomerlänge kann beispielsweise dadurch erhöht werden, dass das Niveau an hTRT-Genprodukten (Protein und mRNA) in der Zelle erhöht wird. Nachstehend wird ein Teil der Krankheitszustände aufgezählt, die mit zellulärer Seneszenz assoziiert sind, bei denen hTRT-Expression eine therapeutische Wirkung zeigen kann: Alzheimer-Erkrankung, Parkinson-Erkrankung, Huntington-Erkrankung und Schlaganfall, mit dem Alter in Zusammenhang ste- Certain diseases related to aging are characterized by changes associated with cell senescence due to reduced telomere length (compared to younger cells). These are the result of the absence (or a much lower level) of telomerase activity in the cell. Reduced telomere length and replication ability contribute to the diseases described below. Telomerase activity and telomer length can be increased, for example, by increasing the level of hTRT gene products (protein and mRNA) in the cell. Listed below are some of the disease states associated with cellular senescence where hTRT expression can have a therapeutic effect: Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease and stroke related to age.

46 46

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

hende Erkrankungen des Integuments, beispielsweise Hautatrophie, Elastolyse und Faltenbildung der Haut, Talgdrüsenhyperplasie, Bildung von Altersflecken, das Ergrauen der Haare und der Haarausfall, chronische Hautgeschwüre, und mit der Alterung in Zusammenhang stehende Verschlechterung der Wundheilung; degenerative Gelenkerkrankungen, Osteoporose; mit der Alterung in Zusammenhang stehende Schwächung des Immunsystems (wobei beispielsweise Zellen beteiligt sind, wie B- und T-Lym-phocyten, Monocyten, Neutrophile, Eosinophile, Basophile, NK-Zellen und ihre entsprechenden Vorläufer); mit der Alterung in Zusammenhang stehende Erkrankungen des vaskulären Systems, dazu zählen Atherosclerose, Verkalkung, Thrombose und Aneurysmen; Diabetes, Muskelatrophie; Atemwegserkrankungen, Erkrankungen der Leber und des Darm-Verdauungstrakts, Stoffwechselkrankheiten, endokrine Krankheiten (z.B. Funktionsstörungen der Hirnanhangdrüse und Nebennieren), reproduktive Erkrankungen und mit der Alterung in Zusammenhang stehende Makuladegeneration. Diese Krankheiten und Zustände können dadurch behandelt werden, dass das Niveau an hTRT-Genprodukten in der Zelle erhöht wird, um dadurch die Telomerlänge zu erhöhen, wobei die Replikationsfähigkeit der Zelle wiederhergestellt oder erhöht wird. Solche Verfahren können ex vivo an kultivierten Zellen oder in vivo an Zellen ausgeführt werden. In einer Ausführungsform werden die Zellen zuerst zur Aktivierung von Telomerase und Verlängerung der Telomere behandelt und danach erfolgt eine Behandlung zur Inaktivierung des hTRT-Gens und von Telomerase-Aktivität. existing diseases of the integument, for example skin atrophy, elastolysis and wrinkling of the skin, sebaceous gland hyperplasia, formation of age spots, graying of the hair and hair loss, chronic skin ulcers, and deterioration in wound healing associated with aging; degenerative joint diseases, osteoporosis; aging-related weakening of the immune system (involving, for example, cells such as B and T lymphocytes, monocytes, neutrophils, eosinophils, basophils, NK cells and their corresponding precursors); diseases of the vascular system related to aging, including atherosclerosis, calcification, thrombosis and aneurysms; Diabetes, muscle atrophy; Respiratory diseases, diseases of the liver and intestinal tract, metabolic diseases, endocrine diseases (e.g. dysfunction of the pituitary gland and adrenal glands), reproductive diseases and macular degeneration associated with aging. These diseases and conditions can be treated by increasing the level of hTRT gene products in the cell, thereby increasing the length of the telomeres, restoring or increasing the cell's ability to replicate. Such methods can be carried out ex vivo on cultivated cells or in vivo on cells. In one embodiment, the cells are first treated to activate telomerase and extend the telomeres, and then treated to inactivate the hTRT gene and telomerase activity.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird Telomerase-Aktivität durch einen erfindungsgemässen Vektor in einer embryonalen Keimzelle oder Stammzelle erzeugt (siehe USSN 08/591 246, eingereicht am 1B. Januar 1996; USSN 08/376 327, eingereicht am 20. Januar 1995; Pederson et al.; USSN 08/665217, eingereicht am 14. Juni 1996 und USSN 08/829 372, eingereicht am 31. März 1997) vor oder während der Differenzierung. In a preferred embodiment, telomerase activity is generated by a vector according to the invention in an embryonic germ cell or stem cell (see USSN 08/591 246, filed on January 1, 1996; USSN 08/376 327, filed on January 20, 1995; Pederson et al .; USSN 08/665217, filed on June 14, 1996 and USSN 08/829 372, filed on March 31, 1997) before or during the differentiation.

Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren und Zusammensetzungen bereit, die zur Behandlung von Unfruchtbarkeit von Nutzen sind. Menschliche Keimbahnzellen (z.B. Stammsamenzellen, ihre Vorläufer oder Abkömmlinge) können unbegrenzt proliferieren und sind durch eine hohe Telomerase-Aktivität gekennzeichnet. Abnormale oder verringerte Konzentrationen von hTRT-Genprodukten können beispielsweise dazu führen, dass es zu einer unzulänglichen oder abnormalen Produktion von Spermatozo-en kommt, was zu Unfruchtbarkeit oder Funktionsstörungen bei der Reproduktion führt. Somit kann eine auf «Telomerase basierende» Unfruchtbarkeit unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren und Zusammensetzung zur Erhöhung der Telomerase-Konzentrationen behandelt werden. Da die Hemmung von Telomerase die Spermatogenese, Oogenese sowie die Lebensfähigkeit von Sperma und Eiern negativ beeinflussen kann, können die erfindungsgemässen Telomerase-hemmenden Zusammensetzungen empfängnisverhütende Wirkungen haben, wenn sie in Keimbahnzellen zur Herabsetzung der Konzentrationen von hTRT-Genprodukten verwendet werden. The present invention also provides methods and compositions useful for treating infertility. Human germline cells (e.g. stem cells, their precursors or descendants) can proliferate indefinitely and are characterized by high telomerase activity. Abnormal or decreased concentrations of hTRT gene products, for example, can lead to inadequate or abnormal sperm production, leading to infertility or reproductive dysfunction. Thus, infertility based on "telomerase" can be treated using the methods and composition described here to increase telomerase concentrations. Since the inhibition of telomerase can have a negative effect on spermatogenesis, oogenesis and the viability of sperm and eggs, the telomerase-inhibiting compositions according to the invention can have contraceptive effects when used in germline cells to reduce the concentrations of hTRT gene products.

Die Erfindung stellt ferner Verfahren und Zusammensetzungen zur Verfügung, die zur Verringerung des proliferativen Potentials von Telomerase-positiven Zellen durch Herabsetzung der Telomerase-Akti-vität verwendet werden kann, beispielsweise bei aktivierten Lymphocyten und hematopoietischen Stammzellen. Somit stellt die Erfindung Mittel für die Bewirkung einer Immunsuppression bereit. Umgekehrt sind die erfindungsgemässen Verfahren und Reagenzien von Nutzen zur Steigerung der Telomerase-Aktivität und des proliferativen Potentials in Zellen, wie beispielsweise Stammzellen, die vor dem therapeutischen Eingriff einen niedrigen Telomerase-Spiegel oder keine Telomerase exprimieren. The invention also provides methods and compositions that can be used to reduce the proliferative potential of telomerase positive cells by reducing telomerase activity, for example in activated lymphocytes and hematopoietic stem cells. Thus the invention provides means for effecting immunosuppression. Conversely, the methods and reagents according to the invention are useful for increasing the telomerase activity and the proliferative potential in cells, such as stem cells, which express a low telomerase level or no telomerase before the therapeutic intervention.

D) Arten der Intervention D) Types of intervention

Aufgrund der vorstehenden Diskussion ist es klar, dass die Modulation des Telomerase-Spiegels oder der Telomerase-Aktivität einer Zelle eine ausgeprägte Auswirkung auf das proliferative Potential der Zelle haben kann und somit bei der Behandlung einer Erkrankung von grossem Nutzen ist. Es ist ebenfalls klar, dass diese Modulation entweder durch eine Verringerung von Telomerase-Aktivität oder eine Aktivitätssteigerung erfolgen kann. Die Telomerase modulierenden erfindungsgemässen Moleküle können durch eine Reihe von Mechanismen wirken; einige dieser Mechanismen werden in dieser und den nachstehenden Unterabschnitten beschrieben, um so dem Anwender bei der Auswahl therapeutischer Mittel zu helfen. Die Anwender beabsichtigen jedoch bezüglich der hier beschriebenen neuen Arzneimittel, Zusammensetzungen und Verfahren keiner Beschränkung auf einen bestimmten Wirkungsmechanismus. Based on the discussion above, it is clear that modulating a cell's telomerase level or activity can have a marked impact on the cell's proliferative potential and is therefore of great benefit in treating a disease. It is also clear that this modulation can be done by either reducing telomerase activity or increasing activity. The telomerase-modulating molecules according to the invention can act through a number of mechanisms; some of these mechanisms are described in this and the following subsections to help the user choose therapeutic agents. However, the users do not intend to limit the particular drugs, compositions, and methods described herein to any particular mechanism of action.

Telomerase-Aktivität kann durch verschiedene Mechanismen oder Kombinationen von Mechanismen verringert werden. Ein Mechanismus ist die Herabsetzung der hTRT-Genexpression zur Herabsetzung von Telomerase-Aktivität. Diese Herabsetzung kann auf dem Stadium der Transkription des hTRT-Gens in mRNA stattfinden, bei der Prozessierung (z.B. dem Spleissen), beim nucleären Transport oder hinsichtlich der Stabilität von mRNA, bei der Translation von mRNA zur Herstellung von hTRTProtein oder hinsichtlich der Stabilität und Funktion von hTRT-Protein. Ein weiterer Mechanismus bezieht sich auf Störung einer oder mehrerer Telomerase-Aktivitäten, (z.B. die katalytische Aktivität von reverser Transkriptase oder der hTR-Bindungs-Aktivität) durch Verwendung hemmender Nucleinsäuren, Polypeptiden, oder anderer Agenzien (z.B. imitierende Agenzien («mimetics»), kleine Moleküle, Medikamente und Medikamentenvorstufen («pro-drugs»)), die unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren identifiziert werden können oder durch die hier beschriebenen Zusammensetzungen bereitgestellt werden. Zu weite- Telomerase activity can be reduced by various mechanisms or combinations of mechanisms. One mechanism is to decrease hTRT gene expression to decrease telomerase activity. This reduction can take place at the stage of transcription of the hTRT gene in mRNA, during processing (eg splicing), during nuclear transport or with regard to the stability of mRNA, with the translation of mRNA for the production of hTRTProtein or with regard to stability and function of hTRT protein. Another mechanism relates to disruption of one or more telomerase activities (eg the catalytic activity of reverse transcriptase or the hTR binding activity) by using inhibitory nucleic acids, polypeptides, or other agents (eg mimetics). small molecules, drugs and prodrugs that can be identified using the methods described herein or provided by the compositions described herein. Too far

47 47

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

ren Mechanismen zählen die Sequestrierung von hTR und/oder Telomerase-assoziierten Proteinen und die Störung der Assemblierungen des Telomerase-RNPs aus den Bestandteilen der Untereinheiten. Bei einem verwandten Mechanismus wird eine hTRT-Promotorsequenz mit einem Gen funktionell verknüpft, das ein Toxin codiert, und dieses Konstrukt in eine Zelle eingeführt. Falls oder dann, wenn transkriptio-nelle Aktivatoren für hTRT in der Zelle exprimiert oder aktiviert werden, wird das Toxin exprimiert, was zu einer spezifischen Abtötung der Zelle führt. Other mechanisms include the sequestration of hTR and / or telomerase-associated proteins and the disruption of the assemblies of the telomerase-RNP from the constituents of the subunits. In a related mechanism, an hTRT promoter sequence is operably linked to a gene encoding a toxin and this construct is introduced into a cell. If or when transcriptional activators for hTRT are expressed or activated in the cell, the toxin is expressed, which leads to a specific killing of the cell.

Ein verwandtes Verfahren zur Herabsetzung der Proliferationsfähigkeit einer Zelle beinhaltet die Einführung einer hTRT-Variante mit geringer Genauigkeit, d.h. einer Variante mit einer hohen Fehlerrate, beispielsweise über 1%, so dass abweichende Telomer-Wiederholungseinheiten synthetisiert werden. Diese abweichenden Wiederholungseinheiten wirken sich auf die Telomer-Proteinbindung aus und führen zu chromosomalen Rearrangements und Anomalien und/oder führen zum Tod der Zelle. A related method for reducing the proliferation capacity of a cell involves the introduction of an hTRT variant with low accuracy, i.e. a variant with a high error rate, for example over 1%, so that different telomer repeat units are synthesized. These different repeat units affect telomer-protein binding and lead to chromosomal rearrangements and anomalies and / or lead to cell death.

Auf ähnliche Weise kann die Telomerase-Aktivität durch verschiedene Mechanismen oder eine Kombination von Mechanismen gesteigert werden. Zu diesen gehören die Steigerung der Menge von hTRT in einer Zelle. Üblicherweise wird dies durch Einführung eines ein hTRT-Polypeptid codierenden Polynucleotids in die Zelle erreicht (z.B. mittels eines rekombinant hergestellten Polypeptids, das eine mit einem Promotor funktionell verknüpfte hTRT-DNA-Sequenz umfasst oder eine stabile hTRT-mRNA). In einer alternativen Ausführungsform kann ein katalytisch aktives hTRT-Polypeptid selbst in eine Zelle oder ein Gewebe, beispielsweise durch Mikroinjektion oder andere auf dem Fachgebiet bekannte Massnahmen eingeschleust werden. Bei anderen Mechanismen kann die Expression des endogenen hTRT-Gens oder die Stabilität von hTRT-Genprodukten in der Zelle gesteigert werden. Telomerase-Aktivität in einer Zelle kann auch durch Störung der Interaktion von endogenen Telomeraselnhibitoren und dem Telome-rase-RNP oder von endogenen Repressoren der hTRT-Transkription und dem hTRT-Gen gesteigert werden, darüber hinaus durch Steigerung der Expression oder Aktivität von Aktivatoren der hTRT-Tran-skription sowie weitere Massnahmen, die für den Fachmann nach Lesen dieser Beschreibung offensichtlich sind. Similarly, telomerase activity can be increased by various mechanisms or a combination of mechanisms. These include increasing the amount of hTRT in a cell. Typically, this is accomplished by introducing a polynucleotide encoding an hTRT polypeptide into the cell (e.g., using a recombinantly produced polypeptide comprising an hTRT DNA sequence functionally linked to a promoter or a stable hTRT mRNA). In an alternative embodiment, a catalytically active hTRT polypeptide can itself be introduced into a cell or a tissue, for example by microinjection or other measures known in the art. In other mechanisms, the expression of the endogenous hTRT gene or the stability of hTRT gene products in the cell can be increased. Telomerase activity in a cell can also be increased by disrupting the interaction of endogenous telomerase inhibitors and the telomerase RNP or endogenous repressors of the hTRT transcription and the hTRT gene, and furthermore by increasing the expression or activity of activators of the hTRT -Transcription and other measures that are obvious to a person skilled in the art after reading this description.

E) Mittel für die Intervention 1) TRT-Proteine und Peptide E) Intervention means 1) TRT proteins and peptides

In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Telomerasemodulierende Polypeptide (d.h. Proteine, Polypeptide und Peptide) bereit, die Telomerase-Aktivität steigern oder herabsetzen. Diese können in eine Zielzelle direkt (z.B. durch Injektion, Liposomen-vermittelte Fusion, Applikation eines Hydrogels auf die Tumoroberfläche (z.B. bei einem Melanom, Fusion oder Anheftung des Strukturproteins VP22 des Herpes-Virus und weitere hier beschriebene und auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren) eingeführt werden. In einer zweiten Ausführungsform werden erfindungsgemässe Telomerasemodulierenden Proteine und Peptide in einer Zelle durch Einführung einer Nucleinsäure (z.B. eines DNA-Expressionsvektors oder mRNA), die das gewünschte Protein oder Peptid in der Zelle codiert, in einer Zelle exprimiert. Die Expression kann entweder konstitutiv oder induzierbar sein, was von dem Vektor und der Wahl des Promotors (siehe die nachstehende Diskussion) abhängt. Präparationen von Messenger-RNA, die hTRT codieren, sind besonders dann von Nutzen, wenn lediglich eine transiente Expression (z.B. die transien-te Aktivierung von Telomerase) erwünscht ist. Verfahren zur Einführung und Expression von Nucleinsäuren in eine Zelle sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt (siehe darüber hinaus andere Stellen in dieser Beschreibung, beispielsweise die Abschnitte über Oligonucleotide und Gentherapieverfahren). In one embodiment, the invention provides telomerase modulating polypeptides (i.e., proteins, polypeptides and peptides) that increase or decrease telomerase activity. These can be introduced directly into a target cell (e.g. by injection, liposome-mediated fusion, application of a hydrogel to the tumor surface (e.g. in the case of melanoma, fusion or attachment of the structural protein VP22 of the herpes virus and other methods described here and known in the art) In a second embodiment, telomerase-modulating proteins and peptides according to the invention are expressed in a cell by introducing a nucleic acid (for example a DNA expression vector or mRNA) which encodes the desired protein or peptide in the cell. The expression can either be constitutive or inducible, depending on the vector and choice of promoter (see discussion below) Messenger RNA preparations encoding hTRT are particularly useful when only transient expression (e.g. transient activation of Telomerase) is desirable Expression of nucleic acids into a cell is well known in the art (see also other places in this description, for example the sections on oligonucleotides and gene therapy methods).

Ein Aspekt dieser Erfindung betrifft ein Telomerasemodulierendes Polypeptid, das Telomerase-Aktivität in einer Zelle erhöht. In einer Ausführungsform ist das Polypeptid ein katalytisch aktives hTRT-Poly-peptid, das die Synthese von menschlicher Telomer-DNA (in Verbindung mit einer RNA-Matrize, wie beispielsweise hTR) steuern kann. Diese Aktivität kann wie vorstehend diskutiert gemessen werden, beispielsweise unter Verwendung eines Telomerase-Aktivitätsassays, wie beispielsweise einem TRAP-Assay. In einer Ausführungsform ist das Polypeptid ein hTRT-Protein mit vollständiger Länge und einer Sequenz, die der Sequenz von 1132 Resten von SEQ. ID. Nr. 2 entspricht oder im wesentlichen identisch dazu ist. In einer weiteren Ausführungsform ist das Polypeptid eine Variante des hTRT-Proteins von SEQ. ID. Nr. 2, beispielsweise ein Fusionspolypeptid, derivatisiertes Polypeptid, verkürztes Polypeptid, Polypeptid mit konservativen Substitutionen etc. Ein Fusions- oder derivatisiertes Protein kann eine «targeting»-Einheit enthalten, die die Fähigkeit des Polypeptids die Zellmembran zu durchdringen steigert, oder bewirkt, dass das Polypeptid einem spezifischen Zelltyp (z.B. Leberzellen oder Tumorzellen) oder Zellkompartimenten (z.B. dem nucleären Kompartiment) bevorzugt zugeführt wird. Zu den Beispielen für solche «Zielsetzungs»-Einheiten gehören Lipidschwänze, Aminosäuresequenzen, wie beispielsweise das «antennapediall-Peptid (siehe USSN 08/838,545, eingereicht am 9. April 1997) oder ein nu-cleäres Lokalisationssignal (NLS; z.B. Xenopus-Nucloplasmin; Robbins et al., Cell 64 (1991), 615). Natürlich vorkommendes hTRT-Protein (z.B. mit einer Sequenz, die SEQ. ID. Nr. 2 entspricht oder dazu im wesentlichen identisch ist) wirkt im Zellnucleus. Daher ist es wahrscheinlich, dass eine oder mehrere Untersequenzen von SEQ. ID. Nr. 2, beispielsweise die Reste 193 bis 196 (PRRR) und die Reste 235-240 (PKRPRR) als nucleäres Lokalisationssignal wirken. Die kleinen Bereiche sind wahrscheinlich NLSs. Dies beruht auf der Beobachtung, dass viele NLSs ein Muster mit vier Resten umfassen, das One aspect of this invention relates to a telomerase-modulating polypeptide that increases telomerase activity in a cell. In one embodiment, the polypeptide is a catalytically active hTRT polypeptide that can direct the synthesis of human telomeric DNA (in conjunction with an RNA template, such as hTR). This activity can be measured as discussed above, for example using a telomerase activity assay such as a TRAP assay. In one embodiment, the polypeptide is a full-length hTRT protein with a sequence that corresponds to the sequence of 1132 residues of SEQ. ID. No. 2 corresponds or is essentially identical to it. In a further embodiment, the polypeptide is a variant of the hTRT protein from SEQ. ID. No. 2, for example a fusion polypeptide, derivatized polypeptide, truncated polypeptide, polypeptide with conservative substitutions etc. A fusion or derivatized protein may contain a "targeting" unit which increases or causes the polypeptide to penetrate the cell membrane the polypeptide is preferably supplied to a specific cell type (for example liver cells or tumor cells) or cell compartments (for example the nuclear compartment). Examples of such "targeting" units include lipid tails, amino acid sequences such as, for example, the "antennapedial peptide (see USSN 08 / 838,545, filed on April 9, 1997) or a nuclear localization signal (NLS; for example Xenopus nucloplasmin; Robbins et al. (1991) Cell 64: 615). Naturally occurring hTRT protein (e.g. with a sequence that corresponds to SEQ. ID. No. 2 or is essentially identical to it) acts in the cell nucleus. Therefore, it is likely that one or more sub-sequences of SEQ. ID. No. 2, for example residues 193 to 196 (PRRR) and residues 235-240 (PKRPRR) act as a nuclear localization signal. The small areas are probably NLSs. This is based on the observation that many NLSs include a four residue pattern, the

48 48

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

aus basischen Aminosäuren (K oder R) oder drei basischen Aminosäuren (K oder R) und H oder P zusammengesetzt ist; einem Muster, das mit P beginnt, woran sich innerhalb dreier Reste ein basisches Segment anschliesst, das 3 K- oder R-Reste von vier Resten enthält (siehe beispielsweise Nakai et al., Genomics 14 (1992) 897). Es wird davon ausgegangen, dass die Deletion einer dieser Sequenzen oder beider und/oder zusätzlicher Lokalisationssequenzen den hTRT-Transport in den Nucleus stört und/oder den hTRT-Umsatz steigert und somit zur Verhinderung des Zugangs von Telomerase zu seinen nucle-ären Substraten der Herabsetzung des proliferativen Potentials von Nutzen ist. Darüber hinaus könnte eine hTRT-Variante, der das NLS fehlt, sich zu einem RNP assemblieren, das nicht mehr die Telomer-Länge aufrechterhalten kann, da das daraus hervorgehende Enzym nicht in den Nucleus hineingelangen kann. is composed of basic amino acids (K or R) or three basic amino acids (K or R) and H or P; a pattern starting with P followed by a basic segment within three residues containing 3 K or R residues from four residues (see for example Nakai et al., Genomics 14 (1992) 897). It is believed that the deletion of one of these sequences or both and / or additional localization sequences interferes with hTRT transport into the nucleus and / or increases hTRT conversion and thus to prevent telomerase from accessing its nuclear substrates of degradation of the proliferative potential is useful. In addition, an hTRT variant that lacks the NLS could assemble into an RNP that can no longer maintain the telomeric length because the resulting enzyme cannot get into the nucleus.

Die erfindungsgemässen hTRT-Polypeptide sind typischerweise in der Zielzelle mit einer Telomerase-RNA, wie beispielsweise hTR, assoziiert, wenn sie zur Steigerung von Telomerase-Aktivität in einer Zelle verwendet werden. In einer Ausführungsform assoziiert ein eingeführtes hTRT-Polypeptid mit einer endogenen hTR zur Bildung eines katalytisch aktiven RNP (z.B. eines RNPs, das die hTR und ein Polypeptid mit vollständiger Länge und einer Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2 umfasst). Das so gebildete RNP kann auch mit weiteren, beispielsweise Telomerase-assoziierten, Proteinen assoziieren. In weiteren Ausführungsformen wird das Telomerase-RNP (das hTRT-Protein, hTR und gegebenenfalls weitere Bestandteile enthält) als Komplex in die Zielzelle eingeführt. The hTRT polypeptides according to the invention are typically associated in the target cell with a telomerase RNA, such as hTR, if they are used to increase telomerase activity in a cell. In one embodiment, an introduced hTRT polypeptide associates with an endogenous hTR to form a catalytically active RNP (e.g., an RNP that includes the hTR and a full length polypeptide and a sequence of SEQ. ID No. 2). The RNP formed in this way can also associate with other, for example telomerase-associated, proteins. In further embodiments, the telomerase RNP (which contains the hTRT protein, hTR and optionally further constituents) is introduced as a complex into the target cell.

In einer ähnlichen Ausführungsform wird ein hTRT- Expressionsvektor in eine Zelle (oder die Nachkommenschaft einer Zelle) eingeführt, in die ein Telomerase-RNA (z.B. hTR)-Expressionsvektor gleichzeitig, danach oder vorher eingeführt wird. In dieser Ausführungsform werden hTRT-Protein und Telomerase-RNA in der Zelle coexprimiert und sie assemblieren zur Bildung eines Telomerase-RNPs. Eine bevorzugte Telomerase-RNA ist hTR zusammen. Ein für die Expression von hTR in einer Zelle nützlicher Expressionsvektor wurde vorstehend beschrieben (siehe US-Patent 5 583 016). In einer weiteren Ausführungsform sind das hTRT-Polypeptid und die hTR-RNA (oder ein Äquivalent) zur Bildung eines Komplexes, der dann in die Zielzellen eingeführt wird, in vitro assoziiert. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung von hTRT-Polypeptiden, die zur Herabsetzung der Telomerase-Aktivität in einer Zelle nützlich sind. In a similar embodiment, an hTRT expression vector is introduced into a cell (or the progeny of a cell) into which a telomerase RNA (e.g. hTR) expression vector is introduced simultaneously, after, or before. In this embodiment, hTRT protein and telomerase RNA are co-expressed in the cell and they assemble to form a telomerase RNP. A preferred telomerase RNA is hTR together. An expression vector useful for the expression of hTR in a cell has been described above (see U.S. Patent 5,583,016). In a further embodiment, the hTRT polypeptide and the hTR-RNA (or an equivalent) are associated in vitro to form a complex which is then introduced into the target cells. Another aspect of the invention relates to the provision of hTRT polypeptides which are useful for reducing telomerase activity in a cell.

Wie vorstehend beschrieben, können diese «hemmenden» Polypeptide entweder direkt in die Zelle eingeführt werden oder durch Expression von rekombinanten Nucleinsäuren in der Zelle erzeugt werden. Peptid-«Imitatoren» oder Polypeptide, die Nicht-Standard-Aminosäuren umfassen (d.h. Aminosäuren, die nicht den durch den genetischen Code codierten 20 Aminosäuren oder deren normalen Derivaten entsprechen) werden normalerweise direkt eingeführt. As described above, these "inhibitory" polypeptides can either be introduced directly into the cell or generated by expression of recombinant nucleic acids in the cell. Peptide "imitators" or polypeptides comprising non-standard amino acids (i.e. amino acids that do not correspond to the 20 amino acids encoded by the genetic code or their normal derivatives) are usually introduced directly.

In einer Ausführungsform führt die Hemmung der Telomerase-Aktivität zu der Sequestrierung eines Bestandteils, der für die genaue Telomerverlängerung erforderlich ist. Beispiele für solche Bestandteile sind hTRT und hTR. Somit kann die Verabreichung eines Polypeptids, das hTR bindet, jedoch keine katalytische Aktivität von Telomerase aufweist, die endogene Telomerase-Aktivität in der Zelle herabsetzen. In einer verwandten Ausführungsform kann das hTRT-Polypeptid einen Zellbestandteil binden, bei dem es sich nicht um hTR handelt, beispielsweise ein Telomerase-assoziiertes Protein (oder mehrere), wodurch die Telomerase-Aktivität in der Zelle gestört wird. In one embodiment, inhibition of telomerase activity results in the sequestration of an ingredient required for accurate telomere extension. Examples of such components are hTRT and hTR. Thus, administration of a polypeptide that binds hTR but has no catalytic activity of telomerase can decrease endogenous telomerase activity in the cell. In a related embodiment, the hTRT polypeptide can bind a cell component that is not hTR, for example a (or more) telomerase-associated protein, thereby disrupting telomerase activity in the cell.

In einer anderen Ausführungsform stören die erfindungsgemässen hTRT-Polypeptide die Interaktion von endogen exprimiertem hTRT-Protein und einer anderen für die Telomerase-Funktion erforderlichen zellulären Komponente, beispielsweise hTR, Telomer-DNA, Telomerase-assoziierte Proteine, Telomer-assoziierte Proteine, Telomere, den Zellcyclus kontrollierende Proteine, DNA-Reparaturenzyme, Histone oder nicht-Histon-chromosomale Proteine etc. (beispielsweise durch Kompetition). In another embodiment, the hTRT polypeptides according to the invention disrupt the interaction of endogenously expressed hTRT protein and another cellular component required for the telomerase function, for example hTR, telomer DNA, telomerase-associated proteins, telomer-associated proteins, telomeres Cell cycle controlling proteins, DNA repair enzymes, histones or non-histone chromosomal proteins etc. (for example by competition).

Durch Auswahl von erfindungsgemässen Molekülen (Z.B. Polypeptiden), die sich auf die Interaktion von endogen exprimiertem hTRT-Protein und weiteren zellulären Bestandteilen auswirken, kann man Moleküle bevorzugen, die, wie hier beschrieben, eines oder mehrere der konservierten Motive des hTRT-Proteins enthalten. Die evolutionäre Konservierung dieser Bereiche zeigt, dass diese Motive eine wichtige Funktion in dem korrekten Arbeiten der menschlichen Telomerase beisteuern. Diese Motive sind somit allgemein nützliche Bereiche, um die Funktion des hTRT-Proteins zur Erzeugung von erfindungsgemässen hTRT-Proteinvarianten zu verwenden, somit sind hTRT-Polypeptidvarianten mit Mutationen in konservierten Motiven von besonderem Nutzen. By selecting molecules according to the invention (e.g. polypeptides) which affect the interaction of endogenously expressed hTRT protein and other cellular components, one can prefer molecules which, as described here, contain one or more of the conserved motifs of the hTRT protein. The evolutionary conservation of these areas shows that these motifs play an important role in the correct functioning of human telomerase. These motifs are thus generally useful areas for using the function of the hTRT protein to generate hTRT protein variants according to the invention. Thus, hTRT polypeptide variants with mutations in conserved motifs are particularly useful.

In einer weiteren Ausführungsform wird die Expression des endogenen hTRT-Gens durch Einführung einer grossen Menge an hTRT-Polypeptid in die Zelle (z.B. typischerweise mindestens etwa mehr als 2fach im Vergleich zu dem endogenen Spiegel, vorzugsweise etwa mindestens 10- bis etwa 100fach) reprimiert. Dieses wirkt über eine Prüfkopplungsschleife und hemmt so die Transkription des hTRT-Gens, die Prozessierung der hTRT-prä-m-PNA, die Translation der hTRT-mRNA oder die Assemblierung und den Transport des Telomerase-RNPs. In a further embodiment, expression of the endogenous hTRT gene is repressed by introducing a large amount of hTRT polypeptide into the cell (e.g. typically at least about more than 2-fold compared to the endogenous level, preferably about at least 10 to about 100-fold). This acts via a test coupling loop and thus inhibits the transcription of the hTRT gene, the processing of the hTRT pre-m PNA, the translation of the hTRT mRNA or the assembly and transport of the telomerase RNP.

49 49

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

2) Oligonucleotide a) «Antisense»-Konstrukte 2) Oligonucleotides a) «Antisense» constructs

Die Erfindung stellt Verfahren und «antisense»-Oligonucleotide oder Polynucleotidreagenzien zur Verfügung, die zur Herabsetzung der Expression von hTRT-Genprodukten in vitro oder in vivo verwendet werden können. Die Verabreichung der erfindungsgemässen «antisense»-Reagenzien an eine Zielzelle führt zu einer herabgesetzten TelomeraseAktivität und ist für die Behandlung von Erkrankungen besonders nützlich, die durch eine hohe Telomerase-Aktivität gekennzeichnet sind (z.B. bei Krebserkrankungen). Es wird davon ausgegangen, wobei hier keine Einschränkung auf einen bestimmten Mechanismus beabsichtigt ist, dass «antisense»-Oligonucleotide an die «sense»-hTRT-mRNA binden und deren Translation stören. Alternativ können die «antisense»-Moleküle die hTRT-mRNA für eine Spaltung mit Nuclease empfindlich machen, die Transkription, Prozessierung oder Lokalisierung stören oder auf andere Weise RNA-Vorläufer («prä-mRNA») stören, die Transkription von mRNA des hTRT-Gens reprimie-ren oder über einige andere Mechanismen wirken. Der bestimmte Mechanismus, durch den die «anti-sense»-Moleküle die hTRT-Expression herabsetzen, ist jedoch nicht kritisch. The invention provides methods and "antisense" oligonucleotides or polynucleotide reagents that can be used to decrease expression of hTRT gene products in vitro or in vivo. The administration of the “antisense” reagents according to the invention to a target cell leads to a reduced telomerase activity and is particularly useful for the treatment of diseases which are characterized by high telomerase activity (e.g. cancer). It is assumed that no limitation to a particular mechanism is intended here that “antisense” oligonucleotides bind to the “sense” hTRT mRNA and interfere with its translation. Alternatively, the “antisense” molecules can make the hTRT mRNA sensitive to cleavage with nuclease, interfere with transcription, processing or localization or otherwise interfere with RNA precursors (“pre-mRNA”), the transcription of mRNA of the hTRT Repress gene or act through some other mechanism. However, the specific mechanism by which the anti-sense molecules reduce hTRT expression is not critical.

Die erfindungsgemässen «antisense»-Polynucleotide umfassen eine «antisense»-Sequenz mit mindestens 7 bis 10 oder mehr Nucleotiden, die mit eine Sequenz von mRNA, die humane TRT codiert, oder mRNA, die von dem hTRT-Gen transkribiert wird, spezifisch hybridisieren. Vorzugsweise weist das erfin-dungsgemässe «antisense»-Polynucleotid eine Länge von etwa 10 bis etwa 50 Nucleotiden oder von etwa 14 bis etwa 35 Nucleotiden auf. In weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei den «antisen-se»-Polynucleotiden um Polynucleotide, die kürzer als etwa 100 Nucleotide oder kürzer als etwa 200 Nucleotide sind. Im allgemeinen sollten die «antisense»-Polynucleotide lang genug sein, um eine stabile Doppelhelix zu bilden, jedoch kurz genug (in Abhängigkeit von der Art der Zuführung) um, falls erwünscht, in vivo verabreicht werden zu können. Die minimale Länge eines Polynucleotids, die für eine spezifische Hybridisierung mit einer Zielsequenz erforderlich ist, hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise vom G/C-Gehalt, der Lage von fehlgepaarten Basen (falls vorhanden), dem Ausmass der Einzigartigkeit der Sequenz im Vergleich zu der Population von Ziel-Polynucleotiden, der chemischen Natur des Polynucleotids (z.B. kann es sich um ein Methylphosphonat-Rückgrat handeln, eine Peptid-Nucleinsäure, ein Phosphorothioat) etc. Im allgemeinen ist die «antisense»-Sequenz zur Gewährleistung einer spezifischen Hybridisierung zu der Ziel-hTRT-mRNA-Sequenz im wesentlichen komplementär. In bestimmten Ausführungsformen ist die «antisense»-Sequenz genau komplementär zu der Zielsequenz. Die «antisense»-Polynucleotide können jedoch auch Nucleotid-Substitutionen, Additionen, Deletionen, Transitionen, Transpositionen oder Modifikationen enthalten, solange die spezifische Bindung an die relevante Zielsequenz, die hTRT-RNA oder deren Gen entspricht, als eine funktionelle Eigenschaft des Polynucleotids beibehalten wird. The “antisense” polynucleotides according to the invention comprise an “antisense” sequence with at least 7 to 10 or more nucleotides which hybridize specifically with a sequence of mRNA which encodes human TRT or mRNA which is transcribed by the hTRT gene. The “antisense” polynucleotide according to the invention preferably has a length of about 10 to about 50 nucleotides or of about 14 to about 35 nucleotides. In other embodiments, the "antisen-se" polynucleotides are polynucleotides that are shorter than about 100 nucleotides or shorter than about 200 nucleotides. In general, the "antisense" polynucleotides should be long enough to form a stable double helix, but short enough (depending on the type of delivery) to be administered in vivo if desired. The minimum length of a polynucleotide required for a specific hybridization with a target sequence depends on various factors, for example the G / C content, the location of mismatched bases (if any), the extent of the uniqueness of the sequence compared to the population of target polynucleotides, the chemical nature of the polynucleotide (eg it can be a methylphosphonate backbone, a peptide nucleic acid, a phosphorothioate) etc. In general the "antisense" sequence is to ensure a specific hybridization to that Target hTRT mRNA sequence essentially complementary. In certain embodiments, the "antisense" sequence is exactly complementary to the target sequence. However, the “antisense” polynucleotides can also contain nucleotide substitutions, additions, deletions, transitions, transpositions or modifications, as long as the specific binding to the relevant target sequence, which corresponds to hTRT-RNA or its gene, is retained as a functional property of the polynucleotide .

In einer Ausführungsform ist die «antisense»-Sequenz zu relativ zugänglichen Sequenzen der hTRT-mRNA (z.B. Sequenzen, die relativ wenig Sekundärstrukturen aufweisen) komplementär. Dies kann durch Analyse der vorhergesagten RNA-Sekundärstrukturen bestimmt werden, beispielsweise mittels des MFOLD-Programms (Genetics Computer Group, Madison Wl) und durch auf dem Fachgebiet bekannte in vitro- oder in vivo-Tests. Beispiele für Oligonucleotide, die hinsichtlich einer «antisense»-Sup-pression der hTRT-Funktion getestet werden können, sind Oligonucleotide, die mit den folgenden Positionen von SEQ. ID. Nr. 1 hybridisieren können (d.h. im wesentlichen komplementär sind): SEQ. ID. Nr. 1: 40-60; 260-280; 500-520; 770-790, 885-905; 1000-1020; 1300-1320; 1520-1540; 2110-2130; 2295-2315; 2450-2470, 2670-2690; 3080-3110; 3140-3160; und 3690-3710. Bei einem weiteren nützlichen Verfahren zur Identifizierung von effektiven «antisense»-Zusammensetzungen werden kombinatorische Arrays von Oligonucleotiden verwendet (siehe beispielsweise Milner et al., Nature Biotechnology 15 (1997), 537). In one embodiment, the "antisense" sequence is complementary to relatively accessible sequences of the hTRT mRNA (e.g. sequences that have relatively few secondary structures). This can be determined by analyzing the predicted RNA secondary structures, for example by means of the MFOLD program (Genetics Computer Group, Madison Wl) and by in vitro or in vivo tests known in the art. Examples of oligonucleotides that can be tested for an “antisense” suppression of the hTRT function are oligonucleotides that match the following positions of SEQ. ID. # 1 can hybridize (i.e. are essentially complementary): SEQ. ID. No. 1: 40-60; 260-280; 500-520; 770-790, 885-905; 1000-1020; 1300-1320; 1520-1540; 2110-2130; 2295-2315; 2450-2470, 2670-2690; 3080-3110; 3140-3160; and 3690-3710. Another useful method for identifying effective "antisense" compositions uses combinatorial arrays of oligonucleotides (see, for example, Milner et al., Nature Biotechnology 15 (1997), 537).

Die Erfindung stellt auch ein «antisense»-Polynucleotid bereit, das Sequenzen zusätzlich zu der «an-tisense»-Sequenz aufweist (z.B. zusätzlich zu der anti-hTRT-«sense»-Sequenz). In diesem Fall ist die «antisense»-Sequenz in einem Polynucleotid mit einer längeren Sequenz enthalten. In einer weiteren Ausführungsform besteht die Sequenz des Polynucleotids im wesentlichen aus der «antisense»-Se-quenz oder sie stellt diese dar. The invention also provides an "antisense" polynucleotide that has sequences in addition to the "an-tisense" sequence (e.g., in addition to the anti-hTRT "sense" sequence). In this case, the «antisense» sequence is contained in a polynucleotide with a longer sequence. In a further embodiment, the sequence of the polynucleotide essentially consists of the “antisense” sequence or it represents this.

Die «antisense»-Nucleinsäuren (DNA, RNA, modifizierte DNA oder RNA-Analoge etc.) können unter Venwendung jedes zur Herstellung von Nucleinsäuren geeigneten Verfahrens, beispielsweise den hier beschriebenen Verfahren, hergestellt werden. In einer Ausführungsform können erfindungsgemässe «antisense»-RNA-Moleküle beispielsweise durch chemische Synthese de novo oder durch Clonierung hergestellt werden. Beispielsweise kann eine «antisense»-RNA, die mit hTRT-mRNA hybridisiert, dadurch hergestellt werden, dass eine hTRT-DNA-Sequenz (z.B. SEQ. ID. Nr. 1 oder ein Fragment davon) in umgekehrter Orientierung funktionell mit einem Promotor verknüpft in einen Vektor (z.B. ein Plasmid) inseriert (ligiert) wird. Unter der Voraussetzung, dass der Promotor und vorzugsweise Termina-tions- und Polyadenylierungssignale korrekt positioniert sind, wird der Strang der inserierten Sequenz, der dem nicht-codierenden Strang entspricht, transkribiert, und dieser wirkt als ein erfindungsgemässes «antisense»-Oligonucleotid. The “antisense” nucleic acids (DNA, RNA, modified DNA or RNA analogs etc.) can be produced using any method suitable for producing nucleic acids, for example the methods described here. In one embodiment, “antisense” RNA molecules according to the invention can be produced, for example, by chemical synthesis de novo or by cloning. For example, an “antisense” RNA that hybridizes with hTRT mRNA can be produced by functionally linking an hTRT DNA sequence (for example SEQ. ID. No. 1 or a fragment thereof) to a promoter in reverse orientation a vector (eg a plasmid) is inserted (ligated). Provided that the promoter and preferably termination and polyadenylation signals are correctly positioned, the strand of the inserted sequence that corresponds to the non-coding strand is transcribed and this acts as an “antisense” oligonucleotide according to the invention.

Die erfindungsgemässen «antisense»-Oligonucleotide können zur Hemmung der Telomerase-Aktivität The “antisense” oligonucleotides according to the invention can be used to inhibit telomerase activity

50 50

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

in zellfreien Extrakten, Zellen und Tieren, einschliesslich Säugern und Menschen, verwendet werden. Die Phosphorothioat-«antisense»-Oligonucleotide: in cell-free extracts, cells and animals, including mammals and humans. The phosphorothioate «antisense» oligonucleotides:

A) GGCATCGCGGGGGTGGCCGGG A) GGCATCGCGGGGGTGGCCGGG

B) CAGCGGGGAGCGCGCGGCATC B) CAGCGGGGAGCGCGCGGCATC

C) CAGCACCTCGCGGTAGTGGCT C) CAGCACCTCGCGGTAGTGGCT

D) GGACACCTGGCGGAAGGAGGG D) GGACACCTGGCGGAAGGAGGG

können beispielsweise zur Hemmung von Telomerase-Aktivität verwendet werden. Bei einer Konzentration von 10 nM hemmte(n) jedes Oligonucleotid; Gemische der Oligonucleotide A und B; A, B, C und D; und A, C und D die Telomerase Aktivität in 293-Zellen, wenn diese 7 Tage einmal pro Tag behandelt wurden. Eine Hemmung wurde auch mit einem «antisense»-hTR-Molekül (5'-GCTCTAGAATGAAGGGTG-3') beobachtet, wenn dies mit den Oligonucleotiden A,B und C; A, B und D; und A und C kombiniert war. Zu den für solche Experimente nützlichen Kontroll- und Oligonucleotiden zählen: can be used, for example, to inhibit telomerase activity. At a concentration of 10 nM, each oligonucleotide inhibited; Mixtures of oligonucleotides A and B; A, B, C and D; and A, C and D the telomerase activity in 293 cells when treated once a day for 7 days. Inhibition was also observed with an “antisense” hTR molecule (5'-GCTCTAGAATGAAGGGTG-3 ') when this was done with oligonucleotides A, B and C; A, B and D; and A and C was combined. Control and oligonucleotides useful for such experiments include:

51) GCGACGACTGACATTGGCCGG 51) GCGACGACTGACATTGGCCGG

52) GGCTCGAAGTAGCACCGGTGC 52) GGCTCGAAGTAGCACCGGTGC

53) GTGGGAACAGGCCGATGTCCC 53) GTGGGAACAGGCCGATGTCCC

Um für die für eine bestimmte gewünschte Anwendung optimalen erfindungsgemässen «antisense»-Oligonucleotide bestimmen zu können, kann man ein Scanning unter Verwendung eines Satzes von erfindungsgemässen «antisense»-Oligonucleotiden durchführen. Ein Beispiel für einen solchen Satz ist der Satz von 30-mer Oligonucleotiden, die die hTRT-mRNA umspannen und wobei eines von dem nächsten um 15 Nucleotide versetzt ist, (d.h. ON1 entspricht den Positionen 1-30 und ist TCCCACGTGCGCAGCAGGACGCAGCGCTGC, ON2 entspricht Positionen 16-45 und ist GCCGGGGCCAGGGCTTCCCACGTGCGCAGC, und ON3 entspricht den Positionen 31-60 und ist GGCATCGCGGGGGTGGCCGGGGCCAGGGCT usw. bis zum Ende der mRNA). Jedes Mitglied dieses Satzes kann hinsichtlich seiner hemmenden Aktivität, wie hier beschrieben, getestet werden. Jene Oligonucleotide, die unter den gewünschten Bedingungen eine hemmende Aktivität zeigen, kennzeichnen dann einen gewünschten Bereich. Weitere erfindungsgemässe Oligonucleotide, die dem gewünschten Bereich entsprechen (d.h. 8-mere, 10-mere, 15-mere etc.) können zur Identifikation des Oligonucleotids mit der für die Anwendung bevorzugten Aktivität getestet werden. In order to be able to determine the “antisense” oligonucleotides according to the invention that are optimal for a particular desired application, a scanning can be carried out using a set of “antisense” oligonucleotides according to the invention. An example of such a set is the set of 30-mer oligonucleotides that span the hTRT mRNA and one of the next is offset by 15 nucleotides (ie ON1 corresponds to positions 1-30 and is TCCCACGTGCGCAGCAGGACGCAGCGCTGC, ON2 corresponds to positions 16 -45 and is GCCGGGGCCAGGGCTTCCCACGTGCGCAGC, and ON3 corresponds to positions 31-60 and is GGCATCGCGGGGGTGGCCGGGGCCAGGGCT etc. until the end of the mRNA). Each member of this set can be tested for inhibitory activity as described here. Those oligonucleotides that show inhibitory activity under the desired conditions then identify a desired region. Further oligonucleotides according to the invention which correspond to the desired region (i.e. 8-mers, 10-mers, 15-mers etc.) can be tested to identify the oligonucleotide with the activity preferred for the application.

Bezüglich allgemeiner Verfahren, die sich auf antisense-Polynucleotide beziehen, siehe Antisense RNA and DNA (1988), D.A. Melton, (Herausg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) und Dagle et al., Nucleic Acids Research 19 (1991), 1805. Bezüglich eines Übersichtsartikels der die «antisense»-Therapie betrifft, siehe beispielsweise Uhlmann et al., Chem. Reviews 90 (1990) 543-584. For general procedures related to antisense polynucleotides, see Antisense RNA and DNA (1988), D.A. Melton, (ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) and Dagle et al., Nucleic Acids Research 19 (1991), 1805. For a review article on antisense therapy, see, for example, Uhlmann et al ., Chem. Reviews 90 (1990) 543-584.

b) Triplex-Oligo- und Polynucleotide b) triplex oligo- and polynucleotides

Die vorliegende Erfindung stellt Oligo- und Polynucleotide (z.B. DNA, RNA oder PNA) bereit, die an doppelsträngige oder Duplex-hTRT-Nucleinsäuren binden, (z.B. in einem gefalteten Bereich der hTRT-RNA oder im hTRT-Gen), wobei eine Nucleinsäure gebildet wird, die eine Dreifach-Helix enthält oder eine «triplex»-Nucleinsäure. Die Bildung einer Dreifach-Helix führt zur Hemmung der hTRT-Expression, beispielsweise durch die Verhinderung der Transkription des hTRT-Gens, wodurch Telomerase-Aktivität in einer Zelle herabgesetzt oder eliminiert wird. Es wird davon ausgegangen (wobei jedoch nicht beabsichtigt ist, an einen bestimmten Mechanismus gebunden zu sein), dass die Dreifach-Helixpaarung die Fähigkeit der Doppelhelix sich für die Bindung von Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder regulatorischen Molekülen ausreichend zu öffnen, stört. The present invention provides oligonucleotides and polynucleotides (e.g., DNA, RNA, or PNA) that bind to double-stranded or duplex hTRT nucleic acids (e.g., in a folded region of the hTRT RNA or in the hTRT gene), thereby forming a nucleic acid that contains a triple helix or a “triplex” nucleic acid. The formation of a triple helix leads to the inhibition of hTRT expression, for example by preventing the transcription of the hTRT gene, as a result of which telomerase activity in a cell is reduced or eliminated. It is believed (but is not intended to be bound by any particular mechanism) that the triple helix pair will interfere with the ability of the double helix to open sufficiently for the binding of polymerases, transcription factors, or regulatory molecules.

Erfindungsgemässe Triplex-Oligo- und Polynucleotide werden unter Anwendung der Basenpaarungsregeln für die Bildung von Dreifach-Helices konstruiert (siehe beispielsweise Cheng et al., i. Biol. Chem. Triplex oligo- and polynucleotides according to the invention are constructed using the base pairing rules for the formation of triple helices (see for example Cheng et al., I. Biol. Chem.

263 (1988), 15110; Ferrin und Camerini Otero, Science 354 (1991), 1494; Ramdas et al., J.Biol. Chem. 1988, 263: 15110; Ferrin and Camerini Otero, Science 354 (1991), 1494; Ramdas et al., J.Biol. Chem.

264 (1989), 17395; Strobel et al., Science 254 (1991), 1639 und Rigas et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 83 (1986), 9591, wobei durch Bezugnahme jedes dieser Dokumente als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen ist) und den hTRT-mRNA- und/oder Gensequenzen. Typischerweise umfassen die erfindungsgemässen Triplex-formenden Oligonucleotide eine spezifische Sequenz von etwa 10 bis mindestens etwa 25 Nucleotiden oder eine längere Sequenz, die zu einer spezifischen Sequenz in der hTRT-RNA oder dem Gen «komplementär» ist (d.h. lang genug, um eine stabile Dreifach-Helix bilden zu können, jedoch kurz genug, in Abhängigkeit von der Art der Zulieferung, um, falls gewünscht, in vivo verabreicht werden zu können). In diesem Zusammenhang bedeutet «komplementär» die Fähigkeit zur 1989, 264: 17395; Strobel et al., Science 254 (1991), 1639 and Rigas et al., Proc. Nati. Acad. Be. USA 83 (1986), 9591, each of which is to be considered part of this description by reference) and the hTRT mRNA and / or gene sequences. Typically, the triplex-forming oligonucleotides of the invention comprise a specific sequence from about 10 to at least about 25 nucleotides or a longer sequence that is "complementary" to a specific sequence in the hTRT-RNA or the gene (ie long enough to be a stable triple -Helix formation, but short enough, depending on the type of delivery, to be administered in vivo if desired). In this context, "complementary" means the ability to

51 51

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Bildung einer stabilen Dreifach-Helix. In einer Ausführungsform werden Oligonucleotide so entworfen, dass sie spezifisch an die regulatorischen Bereiche des hTRT-Gens (z.B. die hTRT-5'-flankierende Sequenz, Promotoren und Enhancer) oder die Transkriptions-Initiationsstelle (z.B. zwischen -10 und +10 von der Transkriptionsinitiationsstelle) spezifisch binden. Bezüglich eines Übersichtsartikels neuerer therapeutischer Fortschritte, bei denen Triplex-DNA verwendet wird, siehe Gee et al., in Huber und Carr, 1994, Molecular and Immunologie Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco NY und Rininsland et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 94 (1997), 5854, wobei beide Dokumente durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen sind. Formation of a stable triple helix. In one embodiment, oligonucleotides are designed to specifically target the regulatory regions of the hTRT gene (e.g., the hTRT-5 'flanking sequence, promoters and enhancers) or the transcription initiation site (e.g., between -10 and +10 from the transcription initiation site ) bind specifically. For a review of recent therapeutic advances using triplex DNA, see Gee et al., In Huber and Carr, 1994, Molecular and Immunologie Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco NY and Rininsland et al., Proc. Nati. Acad. Be. USA 94 (1997), 5854, both documents being incorporated by reference into this description.

c) Ribozyme c) Ribozymes

Die vorliegende Erfindung stellt auch Ribozyme bereit, die zur Hemmung von Telomerase-Aktivität von Nutzen sind. Die erfindungsgemässen Ribozyme binden, spalten spezifisch und inaktivieren hTRT-mRNA. Nützliche Ribozyme können 5'- und 3'-terminale Sequenzen umfassen, die zu der hTRT-mRNA komplementär sind, und diese können vom Fachmann auf der Basis der hier beschriebenen hTRT-mRNA-Sequenz konstruiert werden (siehe PCT-Veröffentlichung WO 93/23 572, a.a.O.). Zu den erfindungsgemässen Ribozymen gehören Ribozyme mit den Merkmalen der Gruppe I-Intron-Ribozyme (Cech, Biotechnology 13 (1995), 323) und «hammerhead»-Ribozyme (Edgington, Biotechnology 10 (1992), 256). The present invention also provides ribozymes that are useful for inhibiting telomerase activity. The ribozymes according to the invention bind, cleave specifically and inactivate hTRT mRNA. Useful ribozymes can include 5 'and 3' terminal sequences complementary to the hTRT mRNA, and these can be constructed by those skilled in the art based on the hTRT mRNA sequence described herein (see PCT publication WO 93/23 572, loc. Cit.). The ribozymes according to the invention include ribozymes with the characteristics of the group I intron ribozymes (Cech, Biotechnology 13 (1995), 323) and “hammerhead” ribozymes (Edgington, Biotechnology 10 (1992), 256).

Zu den erfindungsgemässen Ribozymen zählen Ribozyme mit Spaltstellen wie GUA, GUU und GUC. Zu weiteren optimalen Spaltstellen für die Ribozym-vermittelte Hemmung von Telomerase-Aktivität gemäss der vorliegenden Erfindung gehören jene, die in den PCT-Veröffentlichungen WO 94/02 595 und WO 93/23 569 beschrieben sind, wobei beide Dokumente durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen sind. Kurze RNA-Oligonucleotide mit einer Länge von 15 und 20 Ribonucleoti-den, die einem Bereich des Ziel-hTRT-Gens entsprechen, der eine Spaltstelle enthält, können bezüglich Sekundärstrukturmerkmalen, die zu wünschenswerteren Oligonucleotiden führen, bewertet werden. Die Eignung der Spaltstellen kann auch durch Testen der Zugänglichkeit zur Hybridisierung mit komplementären Oligonucleotiden bewertet werden, wobei «Ribonuclease-Protection»-Assays angewandt werden, oder indem die Ribozym-Aktivität in vitro gemäss auf dem Fachgebiet bekannter Standardverfahren getestet wird. The ribozymes according to the invention include ribozymes with cleavage sites such as GUA, GUU and GUC. Other optimal cleavage sites for ribozyme-mediated inhibition of telomerase activity in accordance with the present invention include those described in PCT publications WO 94/02 595 and WO 93/23 569, both documents being incorporated by reference into this specification are to be seen. Short RNA oligonucleotides 15 and 20 ribonucleotides in length corresponding to a region of the target hTRT gene that contains a cleavage site can be evaluated for secondary structural features that lead to more desirable oligonucleotides. The suitability of the cleavage sites can also be assessed by testing accessibility to hybridization with complementary oligonucleotides using "ribonuclease protection" assays, or by testing ribozyme activity in vitro according to standard procedures known in the art.

Wie von Hu et al., PCT-Veröffentlichung WO 94/03 596 beschrieben, können «antisense»- und Ribo-zym-Funktionen in einem einzigen Oligonucleotid kombiniert werden. Dieses Dokument ist hier ebenfalls durch Bezugnahme als Gegenstand dieser Beschreibung anzusehen. Darüber hinaus können Ribozyme eine oder mehrere modifizierte Nucleotide oder modifizierte Bindungen zwischen Nucleotiden umfassen, wie dies vorstehend im Zusammenhang mit der Beschreibung von veranschaulichenden erfindungsgemässen Oligonucleotiden beschrieben ist. As described by Hu et al., PCT publication WO 94/03 596, "antisense" and ribozyme functions can be combined in a single oligonucleotide. This document is also to be regarded as the subject of this description by reference. In addition, ribozymes can comprise one or more modified nucleotides or modified bonds between nucleotides, as described above in connection with the description of illustrative oligonucleotides according to the invention.

In einer Ausführungsform werden die erfindungsgemässen Ribozyme in vitro erzeugt und in eine Zelle oder einen Patienten eingeführt. In einer anderen Ausführungsform werden Gentherapieverfahren zur Expression von Ribozymen in einer Zielzelle ex vivo oder in vivo angewandt. In one embodiment, the ribozymes according to the invention are generated in vitro and introduced into a cell or a patient. In another embodiment, gene therapy methods are used to express ribozymes in a target cell ex vivo or in vivo.

d) Verabreichung von Oligonucleotiden d) administration of oligonucleotides

Typischerweise gehört zu den erfindungsgemässen therapeutischen Verfahren die Verabreichung eines Oligonucleotids das so wirkt, dass es unter physiologischen Bedingungen in vivo Telomerase-Aktivi-tät hemmen oder stimulieren kann und das unter diesen Bedingungen für einen Zeitraum, der für eine therapeutische Wirkung ausreicht, relativ stabil ist. Wie bereits vorstehend angegeben, können modifizierte Nucleinsäuren bei der Verleihung einer solchen Stabilität von Nutzen sein, aber auch für die gezielte Zulieferung des Oligonucleotids an das gewünschte Gewebe, Organ oder die gewünschte Zelle. Typically, the therapeutic methods according to the invention include the administration of an oligonucleotide which acts in such a way that it can inhibit or stimulate telomerase activity in vivo under physiological conditions and which is relatively stable under these conditions for a period of time which is sufficient for a therapeutic effect . As already stated above, modified nucleic acids can be useful in imparting such stability, but also for the targeted delivery of the oligonucleotide to the desired tissue, organ or cell.

Oligo- und Polynucleotide können direkt als Arzneimittel in einer geeigneten pharmazeutischen Formulierung zugeliefert werden, oder indirekt durch Mittel zur Einführung einer Nucleinsäure in eine Zelle, wozu Liposome, Immunliposome, ballistische Verfahren, die direkte Aufnahme in Zellen etc., so wie dies hier beschrieben ist, gehören. Zur Behandlung einer Erkrankung werden die erfindungsgemässen Oligonucleotide an den Patienten in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Eine therapeutisch wirksame Menge ist die Menge, die ausreicht, um die Krankheitssymptome zu lindern oder die Telome-rase-Aktivität in der Zielzelle zu modulieren, wie dies beispielsweise unter Verwendung eines TRAP-As-says oder anderer geeigneter Assays bezüglich der biologischen Funktion von Telomerase bestimmt werden kann. Für die Zulieferung von Oligonucleotiden für therapeutische Zwecke geeignete Verfahren sind in dem US-Patent 5 272 065, das hiermit durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen ist, beschrieben. Weitere Details bezüglich der Verabreichung von pharmazeutisch aktiven Verbindungen sind nachstehend beschrieben. In einer weiteren Ausführungsform können Oligo- und Polynucleotide unter Verwendung von Gentherapie und der erfindungsgemässen rekombinanten DNA-Expressionsplasmide zugeliefert werden. Oligo- and polynucleotides can be supplied directly as drugs in a suitable pharmaceutical formulation, or indirectly by means of introducing a nucleic acid into a cell, including liposomes, immunliposomes, ballistic methods, direct uptake in cells, etc., as described here , belong. To treat a disease, the oligonucleotides according to the invention are administered to the patient in a therapeutically effective amount. A therapeutically effective amount is the amount sufficient to alleviate disease symptoms or to modulate telomerase activity in the target cell, such as using a TRAP assay or other suitable assay for the biological function of telomerase can be determined. Methods suitable for the delivery of oligonucleotides for therapeutic purposes are described in US Pat. No. 5,272,065, which is hereby incorporated by reference into this description. Further details regarding the administration of pharmaceutically active compounds are described below. In a further embodiment, oligonucleotides and polynucleotides can be supplied using gene therapy and the recombinant DNA expression plasmids according to the invention.

52 52

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

3) Gentherapie 3) gene therapy

Gentherapie bezieht sich auf die Einführung eines ansonsten exogenen Polynucleotids, das auf die (typischerweise) Säuger-Zelle(n), in das (die) es überführt wird, eine medizinisch nützliche phänotypische Auswirkung hat. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung von Gentherapieverfahren und Zusammensetzungen für die Behandlung von Telomerase assoziierten Zuständen. In veranschaulichenden Ausführungsformen gehört zu der Gentherapie die Einführung eines Vektors in eine Zelle, der ein hTRT-Genprodukt exprimiert (z.B.ein hTRT-Protein, das im wesentlichen dem hTRT-Polypeptid mit einer Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2 gleicht, beispielsweise um Telomerase-Aktivität zu steigern, oder ein inhibitorisches hTRT-Polypeptid zur Herabsetzung der Aktivität), die Expression einer Nucleinsäure mit einer Sequenz eines hTRT-Gens oder einer hTRT-mRNA (z.B. einer «antisense»-RNA, um beispielsweise Telomerase-Aktivität herabzusetzen), die Expression eines Polypeptids oder Polynucleotids, das auf andere Weise die Expression von hTRT-Genprodukten beeinflusst (z.B. ein Ribozym, das zur Herabsetzung von Telomerase-Aktivität gegen hTRT-MRNA gerichtet ist) oder den Austausch, oder das Unterbrechen einer endogenen hTRT-Sequenz (z. B. «gene replacement» und «gene knockout»). Für den Fachmann sind nach Lesen dieser Beschreibung zahlreiche weitere Ausführungsformen offensichtlich. In einer Ausführungsform wird auch ein hTR-codierender Vektor eingeführt. In einer weiteren Ausführungsform werden auch Telomerase-assoziierte Proteine codierende Vektoren mit oder ohne einen Vektor für hTR eingeführt. Gene therapy refers to the introduction of an otherwise exogenous polynucleotide that has a medically useful phenotypic effect on the (typically) mammalian cell (s) into which it is transferred. One aspect of the present invention relates to the provision of gene therapy methods and compositions for the treatment of telomerase associated conditions. In illustrative embodiments, gene therapy involves introducing into a cell a vector that expresses an hTRT gene product (e.g., an hTRT protein that is substantially similar to the hTRT polypeptide having a sequence of SEQ. ID No. 2, for example, by To increase telomerase activity, or an inhibitory hTRT polypeptide to reduce the activity), the expression of a nucleic acid with a sequence of an hTRT gene or an hTRT mRNA (for example an “antisense” RNA, for example to reduce telomerase activity) , the expression of a polypeptide or polynucleotide that otherwise influences the expression of hTRT gene products (eg a ribozyme which is directed against hTRT-MRNA to reduce telomerase activity) or the exchange, or the interruption of an endogenous hTRT sequence (e.g. «gene replacement» and «gene knockout»). Numerous other embodiments will be apparent to those skilled in the art after reading this description. In one embodiment, an vector encoding hTR is also introduced. In a further embodiment, vectors encoding telomerase-associated proteins are also introduced with or without a vector for hTR.

Für die hTRT-Gentherapie nützliche Vektoren können viral oder nicht-viral sein. Dazu zählen die im Zusammenhang mit den erfindungsgemässen hTRT-Expressionssystemen vorstehend beschriebenen Vektoren. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass Gentherapie-Vektoren Promotoren und andere regulatorische oder für die Prozessierung benötigte Sequenzen umfassen können, beispielsweise die hier beschriebenen. Üblicherweise umfassen die Vektoren einen Promotor und gegebenenfalls einen Enhancer (unabhängig von einem Enhancer, der innerhalb der Promotorsequenzen bereits vorhanden ist), die zur Steuerung der Transkription eines Oligoribonucleotids dienen, sowie weitere regulatorische Elemente, die für die Beibehaltung des Vektors als Episom oder für die chromosomale Integration und Transkription auf hohem Niveau sorgen, falls erwünscht. Ein für die Gentherapie nützliches Plasmid kann weitere funktionelle Elemente umfassen, beispielsweise selektierbare Marker, Identifizierungsbereiche und weitere Sequenzen. Zusätzliche Sequenzen können eine Rolle dabei spielen, sowohl ausserhalb als auch innerhalb der Zelle Stabilität zu verleihen, um für die zielgerichtete Zulieferung von hTRT-Nucleotidsequenzen («sense» oder «antisense») zu einem gewünschten Organ, Gewebe oder einer Zellpopulation zu bewirken, oder den Eintritt in eine Zelle, in den Nucleus einer Zelle und/oder die Integration innerhalb nucleärer DNA zu vermitteln. Vectors useful for hTRT gene therapy can be viral or non-viral. These include the vectors described above in connection with the hTRT expression systems according to the invention. It will be apparent to those skilled in the art that gene therapy vectors can include promoters and other regulatory or processing sequences, such as those described herein. The vectors usually comprise a promoter and, if appropriate, an enhancer (independent of an enhancer which is already present within the promoter sequences) which serve to control the transcription of an oligoribonucleotide, and further regulatory elements which are required for the maintenance of the vector as an episome or for that Provide high level chromosomal integration and transcription if desired. A plasmid useful for gene therapy can comprise further functional elements, for example selectable markers, identification regions and further sequences. Additional sequences can play a role in providing stability both outside and inside the cell in order to effect the targeted delivery of hTRT nucleotide sequences ("sense" or "antisense") to a desired organ, tissue or cell population, or to mediate entry into a cell, the nucleus of a cell and / or integration within nuclear DNA.

Beispielsweise können Aptamer-ähnliche DNA-Strukturen oder andere Stellen der Einheiten, die Proteine binden, dazu verwendet werden, um die Bindung eines Vektors an Zelloberflächenrezeptoren oder an Serumproteine zu vermitteln, die an einen Rezeptor binden, wodurch die Effizienz des DNA-Transfers in die Zelle erhöht wird. Andere DNA-Stellen und Strukturen können direkt oder indirekt an Rezeptoren in der nucleären Membran oder an andere Proteine, die in den Nucleus wandern, binden, wodurch die nucleäre Aufnahme eines Vektors erleichtert wird. Andere DNA-Sequenzen können direkt oder indirekt die Effizienz der Integration beeinflussen. For example, aptamer-like DNA structures or other sites of the units that bind proteins can be used to mediate the binding of a vector to cell surface receptors or to serum proteins that bind to a receptor, thereby increasing the efficiency of DNA transfer into the Cell is increased. Other DNA sites and structures can bind directly or indirectly to receptors in the nuclear membrane or to other proteins that migrate to the nucleus, thereby facilitating the nuclear uptake of a vector. Other DNA sequences can directly or indirectly influence the efficiency of the integration.

Geeignete Vektoren für die Gentherapie können einen Replikationsursprung besitzen oder auch nicht. Beispielsweise ist es nützlich für die Vermehrung des Vektors vor der Verabreichung an einen Patienten einen Replikationsursprung in einen Vektor einzubauen. Der Replikationsursprung kann jedoch oft vor der Verabreichung entfernt werden, wenn der Vektor so entworfen ist, dass er sich in die chromosomale DNA des Wirts integrieren soll oder an die mRNA oder DNA des Wirts binden soll. In einigen Situationen (z.B. bei Tumorzellen) mag es nicht notwendig sein, dass sich die exogene DNA in die transduzier-te Zelle stabil integriert, da eine transiente Expression ausreichen kann, um Zellen abzutöten. Suitable vectors for gene therapy may or may not have an origin of replication. For example, it is useful for replication of the vector to incorporate an origin of replication into a vector prior to administration to a patient. However, the origin of replication can often be removed prior to administration if the vector is designed to integrate into the host's chromosomal DNA or to bind to the host's mRNA or DNA. In some situations (e.g. with tumor cells) it may not be necessary for the exogenous DNA to integrate stably into the transduced cell, since transient expression can be sufficient to kill cells.

Wie bereits erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung auch Verfahren und Reagenzien für die «gene replacement»-Therapie zur Verfügung (d.h. der Austausch eines endogenen hTRT-Gens gegen ein rekombinantes Gen durch homologe Rekombinaton). Es können dafür speziell für eine Integration durch homologe Rekombination entworfene Vektoren verwendet werden. Zu den für die Optimierung der homologen Rekombination wichtige Faktoren zählen das Ausmass der Sequenzidentität und die Länge der Homologie zu chromosomalen Sequenzen. Die spezifische, die homologe Rekombination vermittelnde Sequenz ist ebenfalls wichtig, da eine Integration in transkriptionell aktive DNA wesentlich leichter stattfindet. Verfahren und Substanzen zur Konstruktion von Konstrukten für eine zielgerichtete homologe Rekombination sind beispielsweise beschrieben in Mansour et al., Nature 336 (1988), 348; Bradley et al., Bio/Technology 10 (1992), 534 und darüber hinaus in US-Patent Nr. 5 627 059; 5 487 992, 5 631 153 und 5 464 764. In einer Ausführungsform umfasst die «gene replacement»-Therapie die Änderung oder den Austausch aller regulatorischen Sequenzen oder eines Teils davon, die die Expression des zu regulierenden hTRT-Gens kontrollieren. Beispielsweise können die hTRT-Promotorsequenzen (z.B. solche, die in SEQ. ID. Nr. 6 (Fig. 21) vorkommen) unterbrochen werden (um so die hTRT-Expression zu verringern oder eine Kontrollstelle für die Transkription zu eliminieren) oder gegen einen exogenen Promotor ausgetauscht sein, beispielsweise um die hTRT-Expression zu erhöhen. As already mentioned, the present invention also provides methods and reagents for gene replacement therapy (i.e. the replacement of an endogenous hTRT gene with a recombinant gene by homologous recombinaton). Vectors specially designed for integration by homologous recombination can be used for this. The factors important for the optimization of the homologous recombination include the extent of the sequence identity and the length of the homology to chromosomal sequences. The specific sequence mediating homologous recombination is also important, since integration into transcriptionally active DNA takes place much more easily. Methods and substances for constructing constructs for targeted homologous recombination are described, for example, in Mansour et al., Nature 336 (1988), 348; Bradley et al., Bio / Technology 10 (1992), 534 and beyond in U.S. Patent No. 5,627,059; 5,487,992, 5,631,153 and 5,464,764. In one embodiment, gene replacement therapy comprises the modification or replacement of all or part of a regulatory sequence which controls the expression of the hTRT gene to be regulated. For example, the hTRT promoter sequences (for example, those found in SEQ. ID No. 6 (FIG. 21)) can be interrupted (in order to reduce the hTRT expression or to eliminate a control point for the transcription) or against an exogenous one Promoter be replaced, for example to increase hTRT expression.

Die Erfindung stellt auch Verfahren und Reagenzien für den hTRT-«gene knockout» bereit (d.h. die The invention also provides methods and reagents for the hTRT gene knockout (i.e., the

53 53

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Deletion oder Unterbrechung eines endogenen hTRT-Gens durch homologe Rekombination unter Verwendung eines rekombinant hergestellten Vektors). Bei diesem «gene knockout» können die als Ziel in Betracht gezogenen Sequenzen regulatorische Sequenzen sein (z.B. der hTRT-Promotor) oder RNA-oder Protein-codierende Sequenzen. Die Veränderung der Expression von endogenen Genen durch homologe Rekombination ist ausführlich beschrieben in dem US-Patent Nr. 5 272 071 (und den vorstehend zitierten US-Patenten), WO 91/09 955, wo 93/09 222, WO 96/29 411, WO 95/31 560 und WO 91/ 12 650. Siehe auch Moynahan et al., Hum. Mol. Genet. 5 (1996) 875. Deletion or disruption of an endogenous hTRT gene by homologous recombination using a recombinantly produced vector). In this "gene knockout", the sequences considered as targets can be regulatory sequences (e.g. the hTRT promoter) or sequences coding for RNA or protein. The change in expression of endogenous genes by homologous recombination is described in detail in US Pat. No. 5,272,071 (and the US patents cited above), WO 91/09 955, where 93/09 222, WO 96/29 411 , WO 95/31 560 and WO 91/1250. See also Moynahan et al., Hum. Mol. Genet. 5 (1996) 875.

Die vorliegende Erfindung stellt femer Verfahren zur spezifischen Abtötung Telomerase-positiver Zellen oder zur Verhinderung der Transformation von Telomerase-negativen Zellen zu einem Telomerase-positiven Status bereit, wobei der hTRT-Genpromotor zur Regulation der Expression eines für die Zelle toxischen Proteins verwendet wird. Wie in Beispiel 14 gezeigt, kann eine hTRT-Promotorsequenz mit einem Reportergen funktionell verknüpft sein, so dass die Aktivierung des Promotors zur Expression des von dem Reportergen codierten Proteins führt. Falls anstelle eines Reporterproteins das codierte Protein für die Zelle toxisch ist, führt die Aktivierung des Promotors zur Zellmorbidität oder zum Tod der Zelle. Bei einer erfindungsgemässen Ausführungsform wird ein Vektor, der ein ein toxisches Protein codierendes Gen umfasst, das mit einem hTRT-Promotor funktionell verknüpft ist in Zellen, wie menschliche Zellen, beispielsweise Zellen in einem menschlichen Patienten, eingeführt, was zum Zelltod bei denjenigen Zellen führt, in denen hTRT-Promotor aktivierende Faktoren exprimiert werden, wie beispielsweise Krebszellen. Bei einer verwandten Ausführungsform ist das codierte Protein selbst nicht toxisch für eine Zelle, codiert jedoch eine Aktivität, die die Zelle gegenüber einem ansonsten nicht-toxischen Wirkstoff empfindlich macht. Tumore können beispielsweise durch Einführung eines hTRT-Promotor-Herpes-Thy-midinkinase (TK)-Genfusionskonstrukts in Tumorzellen und die Verabreichung von Gangcyclovir oder des Äquivalents behandelt werden (siehe beispielsweise Moolton und Wells, J. Nati. Cane. Inst. 82 (1990), 297). Auf dem Fachgebiet sind auch zahlreiche weitere geeignete toxische oder potentiell toxische Proteine und Systeme bekannt (wobei sich von hTRT unterscheidende Promotorsequenzen verwendet werden), die vom Fachmann nach Lesen dieser Beschreibung gemäss der vorliegenden Erfindung modifiziert und verabreicht werden können. The present invention further provides methods of specifically killing telomerase-positive cells or preventing the transformation of telomerase-negative cells to a telomerase-positive status, using the hTRT gene promoter to regulate the expression of a protein toxic to the cell. As shown in Example 14, an hTRT promoter sequence can be operably linked to a reporter gene so that activation of the promoter leads to expression of the protein encoded by the reporter gene. If, instead of a reporter protein, the encoded protein is toxic to the cell, activation of the promoter leads to cell morbidity or cell death. In one embodiment according to the invention, a vector which comprises a gene encoding a toxic protein which is functionally linked to an hTRT promoter is introduced into cells, such as human cells, for example cells in a human patient, which leads to cell death in those cells, in which hTRT promoter activating factors are expressed, such as cancer cells. In a related embodiment, the encoded protein itself is not toxic to a cell, but encodes an activity that makes the cell sensitive to an otherwise non-toxic agent. Tumors can be treated, for example, by introducing an hTRT promoter herpes thymidine kinase (TK) gene fusion construct into tumor cells and administering gangcyclovir or the equivalent (see, for example, Moolton and Wells, J. Nati. Cane. Inst. 82 (1990 ), 297). Numerous other suitable toxic or potentially toxic proteins and systems are known in the art (using promoter sequences that differ from hTRT), which can be modified and administered by a person skilled in the art after reading this description in accordance with the present invention.

Vektoren für die Gentherapie können in Zellen oder Gewebe in vivo, in vitro oder ex vivo eingeführt werden. Für die ex vivo-Therapie können Vektoren in von dem Patienten entnommene Stammzellen eingeführt werden und für die autologe Rücktransplantation in den selben Patienten clonai propagiert werden (siehe beispielsweise die US-Patente 5 399 493 und 5 437 994, wobei durch Bezugnahme diese Dokumente als Bestandteil der Beschreibung angesehen werden können). Zu den Zellen, die als Ziel für die hTRT-Gentherapie mit dem Ziel der Steigerung der Telomerase-Aktivität in einer Zielzelle in Betracht kommen, zählen, allerdings ohne Beschränkung darauf, Embryonalzellen oder Keimzellen, insbesondere Primatenzellen oder menschliche Zellen, wie vorstehend angemerkt, hematopoetische Stammzellen (AIDS und nach der Chemotherapie), vaskuläre Endothelialzellen, (Erkrankungen der Herzgefäs-se und zerebralen Gefässe), Hautfibroblasten und Unterhautkeratinocyten (Wundheilung und Verbrennungen) Chondrocyten (Arthritis), Hirnastrocyten und Microglialzellen (Alzheimer Krankheit), Osteoblasten (Osteoporose) Retinazellen (Augenerkrankungen) und Pankreas-Inselzellen (Typ I Diabetes) sowie die in der nachstehenden Auflistung 1 aufgezählten Zellen. Vectors for gene therapy can be introduced into cells or tissues in vivo, in vitro or ex vivo. For ex vivo therapy, vectors can be introduced into stem cells taken from the patient and clonai propagated for autologous back transplantation in the same patient (see, for example, U.S. Patents 5,399,493 and 5,437,994, reference being incorporated by reference in these documents the description can be viewed). The cells that may be targeted for hTRT gene therapy with the goal of increasing telomerase activity in a target cell include, but are not limited to, embryonic or germ cells, particularly primate or human cells, as noted above, hematopoietic Stem cells (AIDS and after chemotherapy), vascular endothelial cells (diseases of the cardiovascular and cerebral vessels), skin fibroblasts and subcutaneous keratinocytes (wound healing and burns), chondrocytes (arthritis), brain astrocytes and microglial cells (Alzheimer's disease), osteoblasts (osteopellenosis) Eye diseases) and pancreatic islet cells (type I diabetes) and the cells listed in list 1 below.

In einer erfindungsgemässen Ausführungsform wird ein mit einer TRT-codierenden Sequenz (oder einer Variante davon) funktionell verknüpfter induzierbarer Promotor zur Modulation der Proliferationsfähigkeit von Zellen in vivo oder in vitro verwendet. In einer besonderen Ausführungsform werden beispielsweise Insulin-produzierende Pankreaszellen, die mit einem hTRT-Expressionsvektor unter der Kontolle eines induzierbaren Promotors transfiziert sind, in einen Patienten eingeführt. Die Proliferationsfähigkeit der Zellen kann dann durch Verabreichung des den Promotor aktivierenden Mittels (z.B. Tetracyclin) an den Patienten kontrolliert werden, wobei dadurch sich die Zellen stärker vermehren können, als dies ansonsten möglich gewesen wäre. Die Zellproliferation kann dann, je nach dem, wie es von dem behandelnden Arzt gewünscht wird, beendet, fortgesetzt oder erneut initiiert werden. In an embodiment according to the invention, an inducible promoter functionally linked to a TRT-coding sequence (or a variant thereof) is used to modulate the proliferation capacity of cells in vivo or in vitro. In a particular embodiment, for example, insulin-producing pancreatic cells, which are transfected with an hTRT expression vector under the control of an inducible promoter, are introduced into a patient. The proliferation ability of the cells can then be controlled by administering the promoter activating agent (e.g. tetracycline) to the patient, whereby the cells can multiply more than would otherwise have been possible. Cell proliferation can then be stopped, continued, or initiated again, as desired by the attending physician.

4) Vakzine und Antikörper 4) vaccine and antibodies

Immunogene Peptide oder Polypeptide mit einer hTRT-Sequenz können dazu ve wendet werden, um eine anti-hTRT-lmmunantwort in einem Patienten hervorzurufen (d.h. sie können als Vakzin wirken). Beispiele für immunogene hTRT-Peptide und Polypeptide sind nachstehend in den Beispielen 6 und 8 beschrieben. Eine Immunantwort kann auch durch Zulieferung von Plasmidvektoren, die das gewünschte Polypeptid codieren (d.h. die Verabreichung von «nackter DNA») ausgelöst werden. Die gewünschten Nucleinsäuren können durch Injektion, Liposome oder andere Verabreichungsmassnahmen zugeliefert werden. In einer Ausführungsform werden Immunosierungsarten ausgewählt, die in der Versuchsperson bzw. dem Patienten eine auf die MHC Klasse I restringierte Antwort cytotoxischer Lymphocyten gegen Telomerase exprimierende Zellen auslösen. Nach der Immunisierung wird in der Person oder dem Tier eine erhöhte Immunantwort gegen Zellen hervorgerufen, die hohe Konzentrationen von Telomerase exprimieren (z.B. maligne Zellen). Immunogenic peptides or polypeptides with an hTRT sequence can be used to elicit an anti-hTRT immune response in a patient (i.e., they can act as a vaccine). Examples of immunogenic hTRT peptides and polypeptides are described in Examples 6 and 8 below. An immune response can also be triggered by the delivery of plasmid vectors which encode the desired polypeptide (i.e. the administration of "naked DNA"). The desired nucleic acids can be delivered by injection, liposomes or other administration measures. In one embodiment, types of immunization are selected which trigger a response of cytotoxic lymphocytes to telomerase-expressing cells that is restricted to MHC class I in the test subject or the patient. After immunization, an increased immune response against cells that express high concentrations of telomerase (e.g. malignant cells) is elicited in the person or animal.

Anti-hTRT-Antikörper, beispielsweise von der Maus, vom Menschen, oder humanisierte monoclonale Anti-hTRT antibodies, for example from the mouse, from humans, or humanized monoclonal

54 54

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Antikörper können ebenfalls zur Erzielung einer Immunantwort gegen Telomeraseexprimierende Zellen verabreicht werden (z.B. passive Immunisierung). Antibodies can also be administered to achieve an immune response to cells that express telomerase (e.g., passive immunization).

F) Arzneimittel F) Medicines

Verwandte Aspekte der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf die Bereitstellung von Arzneimitteln, die hTRT-Oligo- und -Polynucleotide, -Polypeptide und -Antikörper, -Agonisten, -Antagonisten oder -Hemmstoffe, allein oder in Kombination mit mindestens einem weiteren Mittel, wie beispielsweise einer stabilisierenden Verbindung, einem Verdünnungsmittel, einem Träger oder einem anderen aktiven Bestandteil oder Agens, umfassen. Related aspects of the present invention relate to the provision of drugs that contain hTRT oligo- and polynucleotides, polypeptides and antibodies, agonists, antagonists or inhibitors, alone or in combination with at least one other agent such as one stabilizing compound, diluent, carrier, or other active ingredient or agent.

Die erfindungsgemässen Arzneimittel können in einem sterilen, biokompatiblen pharmazeutischen Träger, zu dem beispielsweise, jedoch ohne Beschränkung darauf, eine Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose und Wasser gehören, verabreicht werden. Jedes dieser Moleküle kann dem Patienten allein verabreicht werden oder in Kombination mit anderen Mitteln, Arzneimitteln oder Hormonen, in Arzneimitteln, wo es mit einem oder mehreren geeigneten Exzipienten, Hilfsstoffen und/oder pharmazeutisch verträglichen Trägern vermischt ist. In einer erfindungsgemässen Ausführung ist der pharmazeutisch verträgliche Träger pharmazeutisch inert. The pharmaceuticals according to the invention can be administered in a sterile, biocompatible pharmaceutical carrier, which includes, for example, but not limited to, saline, buffered saline, dextrose and water. Each of these molecules can be administered to the patient alone or in combination with other agents, drugs or hormones, in drugs where it is mixed with one or more suitable excipients, excipients and / or pharmaceutically acceptable carriers. In an embodiment according to the invention, the pharmaceutically acceptable carrier is pharmaceutically inert.

Die Verabreichung der Arzneimittel kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle (z.B. direkt zu dem Tumor), intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Zusätzlich zu den aktiven Bestandteilen können diese Arzneimittel geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen, die Exzipienten und andere Verbindungen umfassen, die die Verarbeitung der aktiven Bestandteile zu Zubereitungen erleichtern, die pharmazeutisch verwendet werden können. Weitere Details bezüglich Verfahren zur Formulierung und Verabreichung können in der neuesten Ausgabe von «Remington's Pharmaceutical Sciences» (Maack Publishing Co., Easton PA) gefunden werden. The drugs can be administered orally or parenterally. Methods for parenteral administration include topical, intra-arterial (e.g., directly to the tumor), intramuscular, subcutaneous, intramedullary, intrathecal, intraventricular, intravenous, intraperitoneal, or intranasal administration. In addition to the active ingredients, these drugs can include suitable pharmaceutically acceptable carriers that include excipients and other compounds that facilitate the processing of the active ingredients into formulations that can be used pharmaceutically. Further details regarding formulation and administration procedures can be found in the latest edition of "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Maack Publishing Co., Easton PA).

Arzneimittel für die orale Verabreichung können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet gut bekannten pharmazeutisch verträglichen Trägern in Dosen, die für eine orale Verabreichung geeignet sind, formuliert werden, solche Träger erlauben die Formulierung der Arzneimittel als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirups, Aufschlämmungen, Suspensionen etc., die für die Aufnahme durch den Patienten geeignet sind. Siehe PCT-Veröffentlichung WO 93/23 572. Drugs for oral administration can be formulated using pharmaceutically acceptable carriers well known in the art in doses suitable for oral administration. Such carriers allow the formulation of the drugs as tablets, pills, dragees, capsules, liquids, gels , Syrups, slurries, suspensions, etc., which are suitable for ingestion by the patient. See PCT publication WO 93/23 572.

Arzneimittel für die orale Verwendung können durch die Kombination von aktiven Bestandteilen mit einem festen Exzipienten, gegebenenfalls durch Mahlen eines erhaltenen Gemischs, erhalten werden und Weiterverarbeitung des Granulatgemisches nach Zugabe geeigneter zusätzlichen Verbindung, umso, falls erwünscht, Tabletten oder Drageekerne zu erhalten. Geeignete Exzipienten sind Kohlenhydrat-oder Proteinfüllstoffe, dazu zählen, allerdings ohne Beschränkung darauf, Zucker, einschliesslich Lactose, Saccharose, Mannit oder Sorbit; Stärke aus Mais, Weizen, Reis, Kartoffel oder anderen Pflanzen; Cellulose, wie beispielsweise Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose oder Natriumcarboxymethyl-cellulose und Gummis, zu denen Gummi arabicum und Tragacanthharz zählen, sowie Proteine, wie beispielsweise Gelatine und Collagen. Falls erwünscht, können den Zerfall bewirkende oder solubisierende Agenzien zugegeben werden, beispielsweise quer vernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar, Alginsäure oder ein Salz davon, beispielsweise Natriumalginat. Drugs for oral use can be obtained by combining active ingredients with a solid excipient, optionally by grinding a mixture obtained, and further processing the mixture of granules after adding suitable additional compound to obtain tablets or dragee cores if so desired. Suitable excipients are carbohydrate or protein fillers, including, but not limited to, sugars, including lactose, sucrose, mannitol or sorbitol; Starch from corn, wheat, rice, potatoes or other plants; Cellulose such as methyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose or sodium carboxymethyl cellulose and gums, which include gum arabic and tragacanth resin, and proteins, such as gelatin and collagen. If desired, disintegrating or solubilizing agents can be added, for example cross-linked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid or a salt thereof, for example sodium alginate.

Drageekerne werden mit geeigneten Überzügen versehen, beispielsweise konzentrierten Zuckerlösungen, sie können auch Gummi arabicum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, «Carbopol»-Gel, Polyethylenglykol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsgemische enthalten. Zu den Überzügen für die Tabletten oder Dragees können Farbstoffe oder Pigmente zugefügt werden, um das Produkt zu kennzeichnen oder die Menge an aktivem Wirkstoff (d.h. die Dosierung) zu kennzeichnen. Drage cores are provided with suitable coatings, for example concentrated sugar solutions, they can also contain gum arabic, talc, polyvinylpyrrolidone, “Carbopol” gel, polyethylene glycol and / or titanium dioxide, lacquer solutions and suitable organic solvents or solution mixtures. Dyes or pigments can be added to the coatings for the tablets or coated tablets to identify the product or to indicate the amount of active ingredient (i.e. the dosage).

Zu den oral zu verwendenden Arzneimitteln gehören aus Gelatine hergestellte Steckkapseln sowie weiche verschlossene Kapseln, die aus Gelatine und einem Überzug aus Glycerin oder Sorbit hergestellt sind. Steckkapseln können die aktiven Bestandteile, vermischt mit einem Füllstoff oder Bindemitteln enthalten, dazu gehören Lactose oder Stärken, Gleitmittel, wie Talg oder Magnesiumstearat, und gegebenenfalls Stabilisatoren. In weichen Kapseln können die aktiven Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten gelöst oder suspendiert sein, beispielsweise in Fettsäuren, flüssigem Paraffin oder flüssigem Polyethylenglykol mit oder ohne Stabilisatoren. Zu den Arzneimitteln für die parenterale Verabreichung gehören wässrige Lösungen mit aktiven Verbindungen. Für die Injektion kann das erfindungsgemässe Arzneimittel in wässrige Lösungen formuliert werden, vorzugsweise in physiologisch kompatible Puffer, wie beispielsweise Hank's-Lösung, Ringer-Lösung oder in physiologisch gepufferter Kochsalzlösung. Wässrige Suspensionen für die Injektion können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit oder Dextran. Zusätzlich können Suspensionen der aktiven Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Zu den geeigneten lipophilen Lösungsmitteln oder Vehikeln gehören Fettsäuren, wie beispielsweise Sesamöl oder synthetische Fettsäureester, wie beispielsweise Ethyloleat oder Triglyceride oder Liposome. Gegebenenfalls können die Suspensionen auch geeignete Stabilisatoren enthalten, oder Mittel, die die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um so die Herstellung von hochkonzentrierten Lösungen zu gestatten. Oral drugs include plug-in capsules made from gelatin and soft sealed capsules made from gelatin and a coating of glycerin or sorbitol. Push-fit capsules can contain the active ingredients mixed with a filler or binder, including lactose or starches, lubricants such as tallow or magnesium stearate, and optionally stabilizers. In soft capsules, the active compounds can be dissolved or suspended in suitable liquids, for example in fatty acids, liquid paraffin or liquid polyethylene glycol with or without stabilizers. Medicines for parenteral administration include aqueous solutions with active compounds. For the injection, the medicament according to the invention can be formulated in aqueous solutions, preferably in physiologically compatible buffers, such as, for example, Hank's solution, Ringer's solution or in physiologically buffered saline. Aqueous suspensions for injection may contain substances that increase the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol or dextran. In addition, suspensions of the active compounds can be prepared as suitable oily injection suspensions. Suitable lipophilic solvents or vehicles include fatty acids such as sesame oil or synthetic fatty acid esters such as ethyl oleate or triglycerides or liposomes. If appropriate, the suspensions may also contain suitable stabilizers or agents which increase the solubility of the compounds so as to allow the production of highly concentrated solutions.

55 55

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Für die topische oder nasale Verabreichung werden in der Formulierung Penetrantien verwendet, die für die spezifische zu durchdringenden Barrieren geeignet sind. Solche Penetrantien sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. For topical or nasal administration, penetrants are used in the formulation which are suitable for the specific barriers to be penetrated. Such penetrants are well known in the art.

Die erfindungsgemässen Arzneimittel können durch Verfahren, die den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren gleichen, hergestellt werden (z.B. durch übliche Vermischungs-, Lösungs-, Granulierungs-, Drageeherstellungs-, Pulverisierungs-, Emulgierungs-, Einkapselungs-, Einschluss- oder Lyophilisie-rungsverfahren). The pharmaceuticals according to the invention can be prepared by methods which are similar to those known in the art (for example by customary mixing, solution, granulation, dragee production, pulverization, emulsification, encapsulation, inclusion or lyophilization processes). .

Die Arzneimittel können als ein Salz bereitgestellt werden und können mit vielen Säuren hergestellt werden, dazu zählen, allerdings ohne Beschränkung darauf, Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Milchsäure, Weinsäure, Apfelsäure, Bernsteinsäure etc. Salze neigen dazu, in wässrigen oder anderen protonischen Lösungsmitteln löslicher zu sein als die entsprechende Form der freien Base. In anderen Fällen kann die bevorzugte Zubereitung ein lyophilisiertes Pulver in 1 mM-50 mM Histidin, 0,1% bis 2% Saccharose, und 2% bis 7% Mannit bei einem pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 5,5 sein, das vor der Verwendung mit einem Puffer kombiniert wird. The drugs can be provided as a salt and can be prepared with many acids, including, but not limited to, hydrochloric acid, sulfuric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, malic acid, succinic acid, etc. Salts tend to be more soluble in aqueous or other protonic solvents to be as the corresponding form of the free base. In other cases, the preferred preparation may be a lyophilized powder in 1mM-50mM histidine, 0.1% to 2% sucrose, and 2% to 7% mannitol at a pH in the range 4.5 to 5.5 which is combined with a buffer before use.

Nach der Herstellung der Arzneimittel, die eine in einem verträglichen Träger formulierte erfindungsgemässe Verbindung umfassen, können sie in einen geeigneten Behälter gegeben und entsprechend der Behandlung eines angegebenen Krankheitszustands markiert werden. Bei der Verabreichung von menschlichen Telomerase-Proteinen und -Nucleinsäuren würde zu einer solchen Markierung die Angabe der Menge und Häufigkeit der Verabreichung sowie des Verabreichungsverfahrens zählen. After the preparation of the medicaments, which comprise a compound according to the invention formulated in a compatible carrier, they can be placed in a suitable container and labeled according to the treatment of a specified disease state. When administering human telomerase proteins and nucleic acids, such a label would include an indication of the amount and frequency of administration and the method of administration.

Zu den für die erfindungsgemässe Verwendung geeigneten Arzneimitteln zählen Zusammensetzungen, bei denen die aktiven Bestandteile zur Erzielung des gewünschten Zwecks in einer wirksamen Menge enthalten sind. «Therapeutisch wirksame Menge» oder «pharmakologisch wirksame Menge» sind allgemein gebräuchliche Ausdrücke und beziehen sich auf die Menge eines Agens, der das gewünschte pharmakologische Ergebnis wirksam hervorrufen kann. Somit ist eine therapeutisch wirksame Menge eine Menge, die ausreicht, um die Symptome der zu behandelnden Erkrankung zu verbessern. Medicaments suitable for the use according to the invention include compositions in which the active constituents are contained in an effective amount in order to achieve the desired purpose. “Therapeutically effective amount” or “pharmacologically effective amount” are commonly used terms and refer to the amount of an agent that can effectively produce the desired pharmacological result. Thus, a therapeutically effective amount is an amount sufficient to improve the symptoms of the disease to be treated.

Ein nützliches Assay zur Bestimmung einer wirksamen Menge für eine vorgegebene Anwendung (z.B. einer therapeutisch wirksamen Menge) besteht in der Messung des Effekts auf Telomerase-Aktivi-tät in einer Zielzelle. Die tatsächlich verabreichte Menge hängt von der zu behandelnden Person ab und stellt vorzugsweise eine so optimierte Menge dar, dass der gewünschte Effekt ohne wesentliche Nebenwirkungen erzielt wird. Die Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Dosis liegt im Bereich der Fähigkeiten des Fachmanns. A useful assay to determine an effective amount for a given application (e.g., a therapeutically effective amount) is to measure the effect on telomerase activity in a target cell. The amount actually administered depends on the person to be treated and is preferably an amount optimized so that the desired effect is achieved without significant side effects. The determination of a therapeutically effective dose is within the skill of the person skilled in the art.

Für jede beliebige Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis anfänglich entweder in Zellkul-turassays oder mittels eines geeigneten Tiermodells bestimmt werden. Das Tiermodell wird auch dazu verwendet, um einen geeigneten Konzentrationsbereich und einen geeigneten Verabreichungsweg zu ermitteln. So gewonnene Informationen können dann dazu verwendet werden, nützliche Dosen und Verabreichungswege im Menschen zu bestimmen. For any compound, the therapeutically effective dose can initially be determined either in cell culture assays or using a suitable animal model. The animal model is also used to determine an appropriate concentration range and route of administration. Information thus obtained can then be used to determine useful doses and routes of administration in humans.

Eine therapeutisch wirksame Menge bezieht sich auf die Menge an Protein, Polypeptid, Peptid, Antikörper, Oligo- oder Polynucleotid, Agonist oder Antagonist, die die Symptome oder den Zustand bessert. Die therapeutische Wirksamkeit und Toxizität solcher Verbindungen kann durch pharmazeutische Standardprozeduren in Zellkulturen oder an Versuchstieren bestimmt werden (z.B. ED50, die in 50% der Population therapeutisch wirksame Dosis; und LD50, die in 50% der Population tödliche Dosis). Der therapeutische Index bezeichnet das Dosisverhältnis zwischen therapeutischen und toxischen Wirkungen und es kann als das Verhältnis ED50/LD50 ausgedrückt werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen grossen therapeutischen Index aufweisen, sind bevorzugt. Die von Zellkulturassays und Tierstudien gewonnenen Daten werden zur Bestimmung des Dosierungsbereichs für die Anwendung beim Menschen verwendet. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von Umlaufkonzentrationen, die die ED50 einschliessen, mit einer geringen oder keiner Toxizität. Die Dosierung variiert innerhalb dieses Bereichs in Abhängigkeit von der angewandten Dosierungsform, der Empfindlichkeit des Patienten und des Verabreichungswegs. A therapeutically effective amount refers to the amount of protein, polypeptide, peptide, antibody, oligo- or polynucleotide, agonist or antagonist that ameliorates the symptoms or condition. The therapeutic efficacy and toxicity of such compounds can be determined by standard pharmaceutical procedures in cell cultures or on experimental animals (e.g. ED50, the dose which is therapeutically effective in 50% of the population; and LD50, the dose which is lethal in 50% of the population). The therapeutic index indicates the dose ratio between therapeutic and toxic effects and it can be expressed as the ratio ED50 / LD50. Pharmaceutical compositions that have a large therapeutic index are preferred. The data obtained from cell culture assays and animal studies are used to determine the dose range for human use. The dosage of such compounds is preferably within a range of circulating concentrations that include the ED50 with little or no toxicity. The dosage varies within this range depending on the dosage form used, the sensitivity of the patient and the route of administration.

Die exakte Dosierung wird von dem jeweiligen Arzt indivduell für den zu behandelnden Patienten ausgewählt. Die Dosierung und Verabreichung werden so eingestellt, dass sie einen ausreichenden Spiegel der aktiven Einheit bereitstellen, oder den gewünschten Effekt aufrechterhalten. The exact dosage is selected individually by the respective doctor for the patient to be treated. The dosage and administration are adjusted so that they provide a sufficient level of the active unit or maintain the desired effect.

Zu den zusätzlichen Faktoren, die beachtet werden müssen, zählen die Schwere des Krankheitszustands (beispielsweise die Tumorgrösse und -Lage; das Alter, das Gewicht und Geschlecht des Patienten; die Ernährung sowie der Zeitpunkt und die Häufigkeit der Verabreichung, die Kombination(en) von Arzneimittel, Reaktionsempfindlichkeit und Toleranz gegenüber bzw. Ansprechen auf die Therapie). Langwirkende Arzneimittel können alle 3 bis 4 Tage verabreicht werden, jede Woche, oder einmal alle 2 Wochen in Abhängigkeit von der Halbwertszeit und der «clearance»-Rate der speziellen Formulierung. Eine Anleitung bezüglich spezieller Dosierungen und Darreichungsverfahren ist in der Literatur zu finden (siehe US-Patent Nr. 4 657 760, 5 206 344 und 5 225 212, wobei diese Dokumente durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden können). Der Fachmann wird für Nucleotide andere Formulierungen verwenden als für Proteine oder ihre Inhibitoren. Genauso ist die Verabreichung von Polynucleotiden oder Polypeptiden spezifisch für bestimmte Zellen, Zustände, Lagen etc. Additional factors to consider include the severity of the condition (e.g., the size and location of the tumor; the age, weight, and gender of the patient; diet, timing, and frequency of administration, the combination (s) of Drugs, sensitivity to reactions and tolerance towards or response to therapy). Long-acting drugs can be administered every 3 to 4 days, every week, or once every 2 weeks depending on the half-life and the clearance rate of the particular formulation. Instructions regarding specific dosages and methods of administration can be found in the literature (see US Pat. Nos. 4,657,760, 5,206,344 and 5,225,212, which documents may be incorporated by reference into this specification). Those skilled in the art will use different formulations for nucleotides than for proteins or their inhibitors. In the same way, the administration of polynucleotides or polypeptides is specific for certain cells, conditions, locations, etc.

56 56

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Vili. Die Steigerung der Proliferationsfähigkeit und die Herstellung von immortalisierten Zellen, Vili. The increase in the ability to proliferate and the production of immortalized cells,

Zellinien und Tieren Cell lines and animals

Wie bereits vorstehend diskutiert, zeigen die meisten Vertebratenzellen nach einer begrenzten Anzahl von Teilungen in der Kultur (z.B. 50 bis 100 Teilungen) Seneszenz. Bestimmte Zellvarianten können sich jedoch in Kultur unbegrenzt teilen (z.B. HeLa-Zellen, 293-Zellen) und sind aus diesem Grund von Nutzen für die Forschung und industrielle Anwendung. Gewöhnlich werden solche unsterblichen Zellinien von spontan entstehenden Tumoren oder nach Transformation durch Exposition gegenüber Strahlung oder einem Tumor-induzierenden Virus oder einer Tumor-induzierenden Chemikalie erhalten. Leider steht nur eine begrenzte Auswahl von Zellinien, insbesondere von menschlichen Zellinien, die differenzierte Zellfunktion zeigen, zur Verfügung. Darüber hinaus sind die zur Zeit verfügbaren unsterblichen Zellinien durch chromosomale Anomalien gekennzeichnet (z.B. Aneuploidie, Gen-Rearrangements oder Mutationen). Ferner sind viele der bereits lang etablierten Zellinien relativ undifferenziert (z.B. stellen sie nicht solch hochspezialisierte Produkte her, die für bestimmte Gewebe oder Organe einzigartig sind). Es besteht somit ein Bedarf an neuen Verfahren zur Erzeugung unsterblicher Zellen, insbesondere menschlicher Zellen. Eine Verwendung von immortalisierten Zellen bezieht sich auf die Herstellung von natürlichen Proteinen und rekombinanten Proteinen (z.B. therapeutische Polypeptide) oder Antikörper, für die eine stabile genetisch normale Zellinie bevorzugt wird. Für die Herstellung einiger rekombinanter Proteine können auch spezialisierte Zelltypen bevorzugt werden (z.B. Pankreaszellen für die Herstellung von menschlichem Insulin). Eine weitere Verwendungsmöglichkeit für immortalisierte Zellen ist die Einführung in einen Patienten für eine Gentherapie oder für den Austausch von erkrankten oder beschädigten Zellen oder Gewebe. Beispielsweise können autologe Immunzellen, die beispielsweise ein erfin-dungsgemässes rekombinantes hTRT-Gen oder Polypeptid enthalten oder exprimieren für einen Zellaustausch in einem Patienten nach einer aggressiven Krebstherapie, beispielsweise nach der Bestrahlung des gesamten Körpers, verwendet werden. Eine weitere Verwendungsmöglichkeit für immortalisierte Zellen besteht in der ex vivo-Herstellung von «künstlichen» Geweben oder Organen (z.B. Haut) für eine therapeutische Anwendung. Eine weitere Verwendung solcher Zellen besteht im Screenen nach Wirkstoffen oder der Bestätigung der Wirkung von Wirkstoffen, beispielsweise Telomerase-hemmenden Wirkstoffen, oder bei der Herstellung von Vakzinen. Für den Fachmann sind weitere Verwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemässen Zellen offensichtlich. As discussed above, most vertebrate cells show senescence after a limited number of divisions in the culture (e.g. 50 to 100 divisions). However, certain cell variants can divide indefinitely in culture (e.g. HeLa cells, 293 cells) and are therefore useful for research and industrial use. Such immortal cell lines are usually obtained from spontaneously developing tumors or after transformation by exposure to radiation or a tumor-inducing virus or a tumor-inducing chemical. Unfortunately, there is only a limited selection of cell lines available, especially human cell lines that show differentiated cell function. In addition, the immortal cell lines currently available are characterized by chromosomal abnormalities (e.g. aneuploidy, gene rearrangements or mutations). Furthermore, many of the long-established cell lines are relatively undifferentiated (e.g. they do not produce such highly specialized products that are unique to certain tissues or organs). There is therefore a need for new methods for producing immortal cells, in particular human cells. Use of immortalized cells refers to the production of natural proteins and recombinant proteins (e.g. therapeutic polypeptides) or antibodies for which a stable genetically normal cell line is preferred. Specialized cell types may also be preferred for the production of some recombinant proteins (e.g. pancreatic cells for the production of human insulin). A further possible use for immortalized cells is the introduction into a patient for gene therapy or for the exchange of diseased or damaged cells or tissues. For example, autologous immune cells which, for example, contain or express a recombinant hTRT gene or polypeptide according to the invention can be used for cell exchange in a patient after aggressive cancer therapy, for example after irradiation of the entire body. Another possible use for immortalized cells is the ex vivo production of "artificial" tissues or organs (e.g. skin) for therapeutic use. Another use of such cells is screening for active substances or confirmation of the action of active substances, for example telomerase-inhibiting active substances, or in the production of vaccines. Further possible uses of the cells according to the invention are obvious to the person skilled in the art.

Die erfindungsgemässen immortalisierten Zellen und Zellinien sowie solche mit lediglich erhöhter Re-plikationsfähigkeit werden durch Steigerung von Telomerase-Aktivität in der Zelle erzeugt. Es kann dabei jedes hier beschriebene Verfahren zur Steigerung von Telomerase-Aktivität angewendet werden. Somit werden in einer Ausführungsform Zellen durch Steigerung der Menge an hTRT-Polypeptid in der Zelle immortalisiert. In einer Ausführungsform wird der hTRT-Spiegel durch Einführung eines hTRT-Ex-pressionsvektors in die Zelle (wobei gelegentlich eine stabile Transfektion bevorzugt wird) erhöht. Wie bereits vorstehend diskutiert ist die hTRT-codierende Sequenz normalerweise mit einem Promotor funktionell verknüpft, der in der Zelle induzierbar oder konstitutiv aktiv sein kann. The immortalized cells and cell lines according to the invention, as well as those with only increased replication ability, are generated in the cell by increasing telomerase activity. Any method described here for increasing telomerase activity can be used. Thus, in one embodiment, cells are immortalized by increasing the amount of hTRT polypeptide in the cell. In one embodiment, the hTRT level is increased by introducing an hTRT expression vector into the cell (with stable transfection sometimes preferred). As already discussed above, the hTRT coding sequence is normally functionally linked to a promoter that can be inducible or constitutively active in the cell.

In einer Ausführungsform umfasst ein Polynucleotid eine Sequenz, die ein Polypeptid der SEQ. ID. Nr. 2 umfasst, wobei die Sequenz mit einem Promotor (z.B. einem konstitutiv exprimierten Promotor, z.B. eine Sequenz von SEQ. ID. Nr. 6 (Fig. 6)) funktionell verknüpft ist und wobei das Polynucleotid in die Zelle eingeführt wird. In einer Ausführungsform umfasst das Polynucleotid eine Sequenz von SEQ. ID. Nr. 1. Vorzugsweise enthält das Polynucleotid Polyadenylierungs- und Terminationssignale. In weiteren Ausführungsformen sind zusätzliche Elemente, wie Enhancer oder solche wie sie vorstehend diskutiert wurden, enthalten. In einer alternativen Ausführungsform enthält das Polynucleotid keine Promotorsequenz, wobei dann eine solche Sequenz durch das endogene Genom der Zielzelle nach Integration (z.B. durch Rekombination, z.B. homologe Rekombination) des eingeführten Polynucleotids bereitgestellt wird. Das Polynucleotid kann durch jedes beliebige Verfahren in die Zielzelle eingeführt werden, dazu zählen die hier beschriebenen Verfahren (wie beispielsweise Lipofektion, Elektroporation, Virosome, Liposome, Immunliposome, Polykation/Nucleinsäure-Konjugate, nackte DNA). In one embodiment, a polynucleotide comprises a sequence that is a polypeptide of SEQ. ID. No. 2, wherein the sequence is functionally linked to a promoter (e.g. a constitutively expressed promoter, e.g. a sequence of SEQ. ID No. 6 (Fig. 6)) and the polynucleotide is introduced into the cell. In one embodiment, the polynucleotide comprises a sequence of SEQ. ID. No. 1. Preferably the polynucleotide contains polyadenylation and termination signals. In other embodiments, additional elements such as enhancers or those discussed above are included. In an alternative embodiment, the polynucleotide does not contain a promoter sequence, in which case such a sequence is provided by the endogenous genome of the target cell after integration (e.g. by recombination, e.g. homologous recombination) of the introduced polynucleotide. The polynucleotide can be introduced into the target cell by any method, including the methods described herein (such as lipofection, electroporation, virosomes, liposomes, immunliposomes, polycation / nucleic acid conjugates, naked DNA).

Unter Verwendung der erfindungsgemässen Verfahren kann eine beliebige Vertebraten-Zelle dazu gebracht yverden, eine gesteigerte Proliferationsfähigkeit zu zeigen oder sogar immortalisiert zu sein und in Kultur unbegrenzt erhalten zu bleiben. In einer Ausführungsform sind die Zellen Säugerzellen, wobei für viele Anwendungen menschliche Zellen bevorzugt sind. Zu den menschlichen Zellen, die immortalisiert werden können, gehören die in Auflistung 1 aufgezählten Zellen. Using the method according to the invention, any vertebrate cell can be caused to show an increased ability to proliferate or even to be immortalized and to remain in culture indefinitely. In one embodiment, the cells are mammalian, with human cells being preferred for many applications. Human cells that can be immortalized include the cells listed in Listing 1.

Natürlich können die nachstehend beschriebenen erfindungsgemässen «diagnostischen» Assays dazu verwendet werden, um die erfindungsgemässen immortalisierten Zellen zu identifizieren und zu charakterisieren. Of course, the “diagnostic” assays according to the invention described below can be used to identify and characterize the immortalized cells according to the invention.

57 57

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Auflistung 1 Listing 1

Menschliche Zellen, in denen die hTRT-Expression gesteigert werden kann Hornbildende Epithel-Zellen Human cells in which hTRT expression can be increased Horn-forming epithelial cells

Keratinocyten der Epidermis (sich differenzierende Epidermiszellen) Keratinocytes of the epidermis (differentiating epidermal cells)

Basalzellen der Epidermis (Stammzellen) Basal cells of the epidermis (stem cells)

Keratinocyten der Fingernägel und Zehennägel Keratinocytes of the fingernails and toenails

Basalzellen des Nagelbetts (Stammzellen) Basal cells of the nail bed (stem cells)

Zellen des Haarschafts medulläre, kortikale, kutikuläre Zellen; Zellen der Haanwurzelscheide, kutikuläre Zellen, Zellen der Hux-ley-Schicht, externe Zellen der Henle-Schicht; Haarkeimzellen (Stammzellen) Cells of the hair shaft medullary, cortical, cuticular cells; Cells of the hairline sheath, cuticular cells, cells of the Hux-ley layer, external cells of the Henle layer; Hair germ cells (stem cells)

Zellen der feuchten mehrschichtigen Grenzepithele Cells of the moist multilayered border epithelium

Oberflächen-Epithelzellen des mehrschichtigen Plattenepithels der Zunge, der Mundhöhle, der Speiseröhre, des Analkanals, der distalen Harnröhre, der Vagina Basalzellen dieser Epithele (Stammzellen) Surface epithelial cells of the multilayered squamous epithelium of the tongue, oral cavity, esophagus, anal canal, distal urethra, vagina, basal cells of these epithelium (stem cells)

Zellen des äusseren Hornhautepithels Cells of the outer corneal epithelium

Zellen des Harnepithels (das die Blase und die Harnleiter auskleidet) Cells of the urinary epithelium (which lines the bladder and ureters)

Epithelzellen, die auf die exokrine Sekretion spezialisiert sind Zellen der Speicheldrüsen schleimsezernierende Zellen (Sekret reich an Polysacchariden) Epithelial cells specializing in exocrine secretion Salivary gland cells Mucus-secreting cells (secretion rich in polysaccharides)

seröse Drüsenzellen (Sekret reich an Glycoproteinenzymen) serous gland cells (secretion rich in glycoprotein enzymes)

Zellen der von Ebner-Drüsen in der Zunge (Sekret umspült die Geschmacksknospen) Cells of the von Ebner glands in the tongue (secretions wash around the taste buds)

Zellen der Brustdrüse, sezernieren Milch Breast cells secrete milk

Zellen der Tränendrüse, sezernieren Tränen Lacrimal gland cells secrete tears

Zellen der Zeruminaldrüse des Ohres, sezernieren Zerumen Cells of the ceruminal gland of the ear, secrete cerumen

Zellen der ekkrinen Schweissdrüsen, sezernieren Glycoproteine (dunkle Zellen) Cells of the eccrine sweat glands, secrete glycoproteins (dark cells)

Zellen der ekkrinen Schweissdrüsen, sezernieren kleine Moleküle (helle Zellen) Cells of the eccrine sweat glands, secrete small molecules (bright cells)

Zellen der apokrinenSchweissdrüsen (Duftsekret, Geschlechtshormon-sensitiv) Apocrine sweat gland cells (scent secretion, sex hormone sensitive)

Zellen der Moll-Drüsen im Augenlid (spezialisierte Schweissdrüse) Cells of the minor glands in the eyelid (specialized sweat gland)

Zellen der Talgdrüsen, sezernieren Lipid-reiches Sebum Cells of the sebum glands secrete lipid-rich sebum

Zellen der Bowman-Drüsen in der Nase (Sekret umspült das Riechepithel) Bowman gland cells in the nose (secretions wash around the olfactory epithelium)

Zellen der Brunner-Drüsen im Duodenum, sezernieren alkalische Lösung bestehend aus Schleim und Enzymen Brunner gland cells in the duodenum secrete alkaline solution consisting of mucus and enzymes

Zellen der Samenblase, sezernieren Bestandteile der Samenflüssigkeit einschliesslich Fructose (als Treibstoff für darin schwimmende Spermien) Cells of the seminal vesicle, secrete components of the seminal fluid including fructose (as a fuel for sperm floating in it)

Zellen der Vorsteherdrüse, sezernieren andere Bestandteile der Samenflüssigkeit Zellen der Bulbourethraldrüse, sezernieren Schleim Zellen der Bartholin-Drüse, sezernieren Vaginalsekret Zellen der Littré-Drûse, sezernieren Schleim Prostate cells, secrete other constituents of the seminal fluid Bulbourethral gland cells, secrete mucus Bartholin's gland cells, secrete vaginal secretion, Littré gland cells, secrete mucus

Zellen der Uterusschleimhaut, sezernieren vornehmlich Kohlenhydrate isolierte Becherzellen des Atmungs- und Verdauungstrakts, Cells of the uterine mucosa, secrete primarily carbohydrates isolated goblet cells of the respiratory and digestive tract,

sezernieren Schleim schleimsezernierende Zellen der Magenschleimhaut Hauptzellen der Magendrüsen, sezernieren Pepsinogen Parietalzellen der Magendrüsen, sezernieren HCl secrete mucus secreting cells of the gastric mucosa main cells of the gastric glands, secrete pepsinogen parietal cells of the gastric glands, secrete HCl

Acinuszellen der Bauchspeicheldrüse, sezernieren Verdauungsenzyme und Bicarbonat Paneth-Zellen des Dünndarms, sezernieren Lysozym Acinus cells of the pancreas, secrete digestive enzymes and bicarbonate paneth cells of the small intestine, secrete lysozyme

Typ-Il-Alveolarzellen der Lunge, sezernieren Surfactant Clara-Zellen der Lunge Zellen, die auf die Sekretion von Hormonenspezialisiert sind Type II alveolar cells of the lung secrete surfactant clara cells of the lung cells that specialize in the secretion of hormones

Zellen des Hypophysenvorderlappens, sezernieren Wachstumshormon, Follikel-stimulierendes Hormon, luteinisierendes Hormon, Prolactin, adrenocorticotropes Hormon und thyreotropes Hormon Zellen des Hypophysenmittellappens, sezernieren melanocytenstimulierendes Hormon Zellen des Hypophysenhinterlappens, sezernieren Oxytocin, Vasopressin Anterior lobe cells, secrete growth hormone, follicle-stimulating hormone, luteinizing hormone, prolactin, adrenocorticotropic hormone and thyreotropic hormone cells of the pituitary central lobe, secrete melanocyte-stimulating hormone cells of the pituitary gland, secrete vasophysinophenin

Zellen des Intestinums, sezernieren Serotonin, Endorphin, Somatostatin, Gastrin, Sekretin, Cholecystoki-nin, Insulin und Glucagon Intestinal cells secrete serotonin, endorphin, somatostatin, gastrin, secretin, cholecystokinin, insulin and glucagon

Zellen der Schilddrüse, sezernieren Schilddrüsenhormon, Calcitonin Cells of the thyroid gland, secrete thyroid hormone, calcitonin

Zellen der Nebenschilddrüse, sezernieren Parathormon, oxyphile Zellen Parathyroid cells secrete parathyroid hormone, oxyphile cells

Zellen der Nebenniere, sezernieren Epinephrin, Norepinephrin und Steroidhormone Adrenal gland cells secrete epinephrine, norepinephrine and steroid hormones

58 58

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Mineralocorticoide Glucocorticoide Mineralocorticoide Glucocorticoide

Zellen der Gonaden, sezernieren Testosteron (Leydig-Zellen der Hoden) Östrogen (innere Thekazellen des Eifollikels) Progesteron (Gelbkörperzellen des geborstenen Eifollikels) Cells of the gonads, secrete testosterone (Leydig cells of the testicles) estrogen (inner theca cells of the egg follicle) progesterone (luteal cells of the broken egg follicle)

Zellen des juxtaglomerulären Apparats der Niere juxtaglomeruläre Zellen (sezernieren Renin) Cells of the juxtaglomerular apparatus of the kidney juxtaglomerular cells (secrete renin)

Macula-densa-Zellen peripolare Zellen Macula densa cells peripolar cells

Mesangialzellen Mesangial cells

Absorbierende Epithelzellen im Intestinum, den exokrinen Drüsen und dem Urogenitaltrakt Absorbing epithelial cells in the intestine, exocrine glands and urogenital tract

Bürstensaumzellen des Intestinums (mit Kleinzotten) Brush hem cells of the intestine (with small villi)

mehrschichtige Ductuszellen exokriner Drüsen Gallenblasen-Epithelzellen multilayered duct cells of exocrine glands gallbladder epithelial cells

Bürstensaumzellen des proximalen Tubulus der Niere distale Tubuluszellen der Niere nicht-bewimperte Zellen des Ductulus efferens Nebenhoden-Hauptzellen Nebenhoden-Basalzellen Brush border cells of the proximal tubule of the kidney. Distal tubule cells of the kidney. Non-ciliated cells of the ductulus efferens. Epididymal main cells. Epididymal basal cells

Auf Stoffwechsel und Speicherung spezialisierte Zellen Cells specialized in metabolism and storage

Hepatocyten (Leberzellen) Hepatocytes (liver cells)

Fettzellen weisse Fettzellen braune Fettzellen Lipocyten der Leber Fat cells white fat cells brown fat cells lipocytes of the liver

Epithelzellen,die vornehmlich eine schützende Funktion haben und die die Lunge, das Intestinum, die exokrinen Drüsen und den Urogenitaltrakt auskleiden Epithelial cells, which primarily have a protective function and which line the lungs, the intestine, the exocrine glands and the urogenital tract

Typ-I-Pneumocyten (kleiden den Luftraum der Lunge aus) Type I pneumocytes (lining the air space of the lungs)

Pankreasgangzellen (zentroazinäre Zellen) Pancreatic duct cells (centroazine cells)

nicht-mehrschichtige Ductuszellen der Schweissdrüse, der Speicheldrüse, der Brustdrüse Parietalzellen des Nierenglomerulus Podocyten des Nierenglomerulus non-multilayered duct cells of the sweat gland, the salivary gland, the mammary gland parietal cells of the renal glomerulus podocytes of the renal glomerulus

Zellen des dünnen Segments der Henle-Schleife (in der Niere) Henle Loop Thin Segment Cells (in the Kidney)

Sammelrohrzellen (in der Niere) Manifold cells (in the kidney)

Ductuszellen der Samenblase, Vorsteherdrüse Ductal cells of the seminal vesicle, prostate

Epithelzellen, die geschlossene innere Körperhöhlen auskleiden vasculäre Endothelzellen der Blutgefässe und der Lymphgefässe fenestrierte Zellen kontinuierliche Zellen Milzzellen Epithelial cells that line closed internal body cavities line vascular endothelial cells of the blood vessels and lymphatic vessels fenestrated cells continuous cells spleen cells

Synovialzellen (kleiden die Gelenkhöhlen aus, sezernieren vornehmlich Hyaluronsäure) Synovial cells (line the joint cavities, primarily secrete hyaluronic acid)

Serosazellen (kleiden die Peritoneal-, Pleura- und Perikardhöhle aus) Serosa cells (line the peritoneal, pleural and pericardial cavity)

Plattenepithelzellen, die den perilymphatischen Raum des Ohrs auskleiden Zellen, die den endolymphatischen Raum des Ohrs auskleiden Plattenepithelzellen hochprismatische Epithelzellen des Saccus endolymphaticus mit Kleinzotten ohne Kleinzotten «dunkle» Zellen Squamous cells that line the perilymphatic space of the ear. Cells that line the endolymphatic space of the ear. Squamous cell highly prismatic epithelial cells of the endolymphatic sac with small villi without small villi "dark" cells

Zellen der Reissner-Membran (die den Zellen des Plexus choroideus ähneln) Reissner membrane cells (similar to choroid plexus cells)

vaskuläre Stria-Basalzellen vaskuläre Stria-von-Ebner-Halbmond-Zellen vascular stria-basal cells vascular stria-von-ebner-crescent-cells

Claudius-Zellen Claudius cells

Böttcher-Zellen Böttcher cells

Plexus-choroideus-Zellen (sezernieren Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit) Choroid plexus cells (secrete brain and spinal fluid)

Plattenepithelzellen der weichen Hirn- und Rückenmarkshaut Squamous cells of the soft brain and spinal cord skin

Ziliarepithelzellen des Auges pigmenthaltige Zellen nicht-pigmenthaltige Zellen Ciliary epithelial cells of the eye cells containing pigment non-pigmented cells

Zellen des inneren Korneaepithels Cells of the inner corneal epithelium

59 59

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Zilientragende Zellen mit propulsiver Funktion des Atmungstrakts der Eileiter und der Gebärmutterschleimhaut (bei der Frau) Cilia-bearing cells with propulsive function of the respiratory tract of the fallopian tubes and the endometrium (in women)

des Haller-Netzes und des Ductulus efferens (beim Mann) of the Haller network and the duct efferens (in men)

des zentralen Nervensystems (Ependymzellen, die die Hirnhöhle auskleiden) of the central nervous system (ependymal cells that line the brain cavity)

Zellen, die auf die Sekretion extrazellulärer matrix spezialisiert sind Cells that specialize in the secretion of extracellular matrix

Epithelzellen: Epithelial cells:

Ameloblasten (sezernieren den Zahnschmelz) Ameloblasts (secrete the tooth enamel)

Ebner-Halbmondzellen des Gleichgewichtsorgans des Ohrs (sezernieren Proteoglycan) Ebner crescent cells of the equilibrium organ of the ear (secrete proteoglycan)

Interdentalzellen des Corti-Organs (sezernieren Membrana tectoria, die die Haarzellen des Corti-Organs bedeckt) Interdental cells of the Corti organ (secrete membrane tectoria, which covers the hair cells of the Corti organ)

Nichtepithelzellen (Bindegewebe) Non-epithelial cells (connective tissue)

Fibroblasten (verschiedene Fibroblasten des lockeren Bindegewebes, der Kornea, der Sehnen, des retikulären Bindegewebes des Knochenmarks etc.) Fibroblasts (various fibroblasts of the loose connective tissue, the cornea, the tendons, the reticular connective tissue of the bone marrow, etc.)

Pericyten der Blutkapillaren Nucleus-pulposus-Zellen der Bandscheibe Pericytes of the blood capillaries nucleus pulposus cells of the intervertebral disc

Cementoblasten/Cementocyten (sezernieren knochenartigen Zementum der Zahnwurzel) Cementoblasts / Cementocytes (secrete bone-like cementum of the tooth root)

Odontoblasten/Odontocyten (sezernieren das Zahndentin) Odontoblasts / Odontocytes (secrete the dentine)

Chondrocyten Chondrocytes

Hyalinknorpel, Faserknorpel, elastische Knorpel Osteoblasten/Osteocyten Hyaline cartilage, fibrous cartilage, elastic cartilage osteoblasts / osteocytes

Osteoprogenitorzellen (Stammzellen der Osteoblasten) Osteoprogenitor cells (stem cells of the osteoblasts)

Hyalocyten des Glaskörpers des Auges Sternzellen deg perilymphatischen Raums des Ohres Hyalocytes of the vitreous body of the eye Star cells deg perilymphatic space of the ear

Kontraktionsfähige Zellen Contractive cells

Skelettmuskelzellen rote Zellen (langsam) Skeletal muscle cells red cells (slow)

weisse Zellen (schnell) white cells (fast)

intermediäre Zellen intermediate cells

Kernhaufenzellen der Muskelspindel Muscle spindle core cells

Kernkettenzellen der Muskelspindel Core chain cells of the muscle spindle

Satellitenzellen (Stammzellen) Satellite cells (stem cells)

Herzmuskelzellen normale Zellen Cardiac muscle cells normal cells

Knotenzellen Node cells

Purkinje-Faserzellen Purkinje fiber cells

Zellen der glatten Muskulatur Smooth muscle cells

Myoepithelzellen der Iris der exokrinen Drüsen Myoepithelial cells of the iris of the exocrine glands

Zellen des Blut- und Immunsystems rote Blutkörperchen Megakaryocyten Makrophagen Monocyten Blood and immune system cells Red blood cells Megakaryocytes Macrophages Monocytes

Makrophagen des Bindegewebes (verschiedene Arten) Connective tissue macrophages (various types)

Langerhans-Zellen (in der Epidermis) Langerhans cells (in the epidermis)

Osteoklasten (im Knochen) Osteoclasts (in the bone)

dendritische Zellen (im Lymphgewebe) dendritic cells (in the lymphatic tissue)

Mikrogliazellen (im zentralen Nervensystem) Microglial cells (in the central nervous system)

Neutrophile Neutrophils

Eosinophile Eosinophils

Basophile Basophils

Mastzellen Mast cells

T-Lymphocyten T lymphocytes

T-Helferzellen T helper cells

T-Suppressorzellen zytotoxische T-Zellen T suppressor cells cytotoxic T cells

B-Lymphocyten B lymphocytes

60 60

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Igm IgG IgA Igm IgG IgA

igE igE

Killerzellen Killer cells

Stammzellen für das Blut- und Immunsystem (verschiedene Arten) Stem cells for the blood and immune system (various types)

Sinneszellen Sensory cells

Photorezeptorzellen Stäbchenzellen Zapfenzellen blau-empfindliche Zellen grün-empfindliche Zellen rot-empfindliche Zellen Zellen des Hörorgans innere Haarzelle des Corti-Organs äussere Haarzelle des Corti-Organs Photoreceptor cells rod cells cone cells blue-sensitive cells green-sensitive cells red-sensitive cells cells of the hearing organ inner hair cell of the Corti organ outer hair cell of the Corti organ

Zellen zur Wahrnehmung von Beschleunigung und Schwerkraft Typ-I-Haarzellen des Gleichgewichtsorgans des Ohrs Typ-Il-Haarzellen des Gleichgewichtsorgans des Ohrs Geschmackszellen Typ-Il-Geschmacksknospenzellen Zellen zur Wahrnehmung von Gerüchen Riechneuronen Cells for the perception of acceleration and gravity Type I hair cells of the balance organ of the ear Type II hair cells of the balance organ of the ear Taste cells Type II taste bud cells Cells for the perception of smell olfactory neurons

Basalzellen des Riechepithels (Stammzellen für Riechneuronen) Basal cells of the olfactory epithelium (stem cells for olfactory neurons)

Zellen zur Bestimmung des pH-Wertes des Bluts Karotiskörperzellen Typ-I-Zellen Typ-Il-Zellen Cells for determining the pH of the blood Carotid body cells Type I cells Type II cells

Zellen zur Wahrnehmung von Berührungen Merkelzellen der Epidermis primäre sensible Neuronen, auf Wahrnehmung Zellen zur Wahrnehmung von Temperatur primäre sensible Neuronen, auf Wahrnehmung Kälte-empfindliche Zellen Wärme-empfindliche Zellen Zellen zur Wahrnehmung von Schmerz primäre sensible Neuronen, auf Wahrnehmung Strukturen und Kräfte im Bewegungsapparat proprioceptive primäre sensible Neuronen Cells for the perception of touches Merkel cells of the epidermis primary sensitive neurons, perception Cells for the perception of temperature primary sensitive neurons, perception for cold-sensitive cells Heat-sensitive cells Cells for the perception of pain primary sensitive neurons, perception Structures and forces in the musculoskeletal system proprioceptive primary sensitive neurons

Autonome Neuronen cholinerge Neuronen adrenerge Neuronen peptiderge Neuronen Autonomous neurons, cholinergic neurons, adrenergic neurons, peptide-neurons

Zellen, die die Sinnesorgane und die peripheren Neuronen unterstützen Cells that support the sensory organs and peripheral neurons

Stützzellen des Corti-Organs innere Pfeilerzellen äussere Pfeilerzellen innere Phalangealzellen äussere Phalangealzellen Grenzzellen Hensen-Zellen Supporting cells of the Corti organ inner pillar cells outer pillar cells inner phalangeal cells outer phalangeal cells border cells Hensen cells

Stützzellen des Gleichgewichtsorgans Support cells of the balance organ

Stützzellen der Geschmacksknospen (Typ-I-Geschmacksknospenzellen) Support cells of the taste buds (type I taste bud cells)

Stützzellen des Riechepithels Supporting cells of the olfactory epithelium

Schwann-Zellen Schwann cells

Satellitenzellen (umschliessen die peripheren Nervenzellen) Darm-Gliazellen Satellite cells (enclosing the peripheral nerve cells) intestinal glial cells

Neuronen und Gliazellen des zentralen Nervensystems von Berührungen spezialisiert von Temperatur spezialisiert von Schmerz spezialisiert Neurons and glial cells of the central nervous system specialize in touch, specialize in temperature, specialize in pain

61 61

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Neuronen Gliazellen Astrocyten Oligodendrocyten Neurons glial cells astrocytes oligodendrocytes

Zellen der Linse Cells of the lens

Epithelzellen der Vorderlinse Linsenfaserzellen (Kristallin-enthaltende Zellen) Epithelial cells of the anterior lens Lenticular fiber cells (crystalline-containing cells)

Pigmentzellen Pigment cells

Melanocyten pigmenthaltige Epithelzellen der Netzhaut Melanocytes pigmented retinal epithelial cells

Keimzellen Germ cells

Oogonium, Oocyten Spermatocyten Oogonium, oocyte spermatocyte

Spermatogonium (Stammzellen für Spermatocyten) Spermatogonium (stem cells for spermatocytes)

Ammenzellen Nurse cells

Eifollikelzellen Egg follicle cells

Sertolizellen (in den Hoden) Sertoli cells (in the testicles)

Thymus-Epithelzellen Thymic epithelial cells

Stammzellen embryonale Stammzellen embryonale Keimzellen Stammzellen des Erwachsenen fötale Stammzellen Stem cells embryonic stem cells embryonic germ cells adult stem cells fetal stem cells

IX. Diagnostische Assays IX. Diagnostic assays

A. Einführung A. Introduction

1)TRT-Assays 1) TRT assays

Die vorliegende Erfindung stellt eine grosse Anzahl von Assays für TRT, vorzugsweise hTRT, und Telomerase bereit. Diese Assays liefern unter anderem die Basis für empfindliche, preiswerte, leicht zu handhabende und in einem weiten Bereich anwendbare Assays für die Diagnose und Prognose einer Reihe von menschlichen Erkrankungen, zu denen als veranschaulichendes Beispiel Krebs zählt. Wie bereits vorstehend angemerkt, ist die Menge an hTRT-Genprodukten (Protein und mRNA) in unsterblichen menschlichen Zellen im Vergleich zu den meisten normalen sterblichen Zellen (d.h. Telomerase-negative Zellen und die meisten Telomerasepositiven normalen somatischen Zellen von Erwachsenen) gewöhnlich erhöht. Somit besteht ein Aspekt der Einfügung in der Bereitstellung von Assays, die zum Nachweis unter der Bestimmung der Anwesenheit, des Fehlens oder der Menge eines hTRT-Genprodukts in einer Probe, um so die Zellen als unsterblich (beispielsweise eine maligne Tumorzelle), sterblich (wie beispielsweise die meisten somatischen Zellen in Erwachsenen), als Telomerase-positiv oder Telomerase-negativ charakterisieren zu können, wobei die Probe von menschlichen oder anderen Säugerzellen oder eukaryotischen Zellen stammt oder diese enthält. The present invention provides a large number of assays for TRT, preferably hTRT, and telomerase. These assays provide, among other things, the basis for sensitive, inexpensive, easy-to-use and widely applicable assays for the diagnosis and prognosis of a number of human diseases, including cancer as an illustrative example. As noted above, the amount of hTRT gene products (protein and mRNA) in immortal human cells is usually increased compared to most normal mortal cells (i.e., telomerase negative cells and most adult telomerase positive normal somatic cells). Thus, one aspect of the insertion is to provide assays for detection to determine the presence, absence or amount of an hTRT gene product in a sample so as to make the cells as immortal (e.g. a malignant tumor cell), mortal (as for example, most somatic cells in adults) to be able to characterize as telomerase positive or telomerase negative, the sample being derived from or containing human or other mammalian cells or eukaryotic cells.

Jeder Zustand, der durch die Anwesenheit oder das Fehlen eines hTRT-Genprodukts (d.h. Protein oder RNA) gekennzeichnet ist, kann unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren und Substanzen diagnostiziert werden. Zu diesen gehören, so wie dies ausführlicher nachstehend beschrieben wird, Krebserkrankungen, andere mit beschleunigter Zellproliferation einhergehende Erkrankungen, immunologische Funktionsstörungen, Fruchtbarkeit, Unfruchtbarkeit etc. Da das Ausmass, in dem Telomerase Aktivität in Krebszellen erhöht ist, mit den Merkmalen des Tumors, beispielsweise dem Potential zur Metastasenbildung, korreliert, kann durch Überwachung der hTRT-, mRNA- oder Protein-Spiegel die wahrscheinliche zukünftige Entwicklung eines Tumors abgeschätzt und vorhergesagt werden. Any condition characterized by the presence or absence of an hTRT gene product (i.e., protein or RNA) can be diagnosed using the methods and substances described herein. These include, as described in more detail below, cancer, other diseases associated with accelerated cell proliferation, immunological dysfunction, fertility, infertility, etc. Since the extent to which telomerase activity in cancer cells increases, with the characteristics of the tumor, e.g. Potential for metastasis formation, correlated, can be assessed and predicted by monitoring the hTRT, mRNA or protein levels, the likely future development of a tumor.

In einem Aspekt gehört zu den erfindungsgemässen diagnostischen und prognostischen Verfahren die Bestimmung, ob ein menschliches TRT-Genprodukt in einer biologischen Probe (z.B. von einem Patienten) vorhanden ist. Ein zweiter Aspekt betrifft die Bestimmung der Menge eines hTRT-Genprodukts in einer biologischen Probe (z.B. von einem Patienten) und den Vergleich mit der Menge in einer Kon62 In one aspect, the diagnostic and prognostic methods according to the invention include determining whether a human TRT gene product is present in a biological sample (e.g. from a patient). A second aspect relates to the determination of the amount of an hTRT gene product in a biological sample (e.g. from a patient) and the comparison with the amount in a Kon62

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

trollprobe (z.B. normale Zellen oder Gewebe). Ein dritter Aspekt betrifft die Bestimmung der zellulären oder intrazellulären Lokalisierung eines hTRT-Genprodukts in einer Zell- oder Gewebeprobe. Ein vierter Aspekt betrifft die Untersuchung von Wirtszellen (z.B. eines Patienten) zur Identifizierung von Nucleinsäuren mit Sequenzen, die charakteristisch für eine vererbbare Neigung für eine anormale hTRT-Gen-expression sind (anormale Menge, Regulation oder anormales Produkt), wobei dies von Nutzen ist beim genetischen Screenen oder bei einer genetischen Beratung. Ein fünfter Aspekt betrifft die Verwendung der erfindungsgemässen Assays zum Nachweis des Vorhandenseins von anti-hTRT-Antikörpern (z.B. in Patientenserum). Die ausführlicher nachstehend beschriebenen Verfahren stellen nützliche Assays dar, die unter Verwendung der hier beschriebenen Sequenzen und Zusammenhänge ausgeführt werden können. Für den Fachmann sind natürlich zahlreiche Variationen oder weitere Anwendungsmöglichkeiten dieser Assays offensichtlich. troll test (e.g. normal cells or tissue). A third aspect relates to the determination of the cellular or intracellular localization of an hTRT gene product in a cell or tissue sample. A fourth aspect relates to the study of host cells (e.g. a patient) to identify nucleic acids with sequences that are characteristic of an inheritable tendency for abnormal hTRT gene expression (abnormal amount, regulation or abnormal product), which is useful genetic screening or genetic counseling. A fifth aspect relates to the use of the assays according to the invention for detecting the presence of anti-hTRT antibodies (e.g. in patient serum). The procedures described in more detail below are useful assays that can be performed using the sequences and relationships described herein. Numerous variations or other possible uses of these assays are of course obvious to the person skilled in the art.

Zwar sind die vorstehend beschriebenen Assays im Zusammenhang mit diagnostischen und prognostischen Verfahren beschrieben, sie können jedoch immer dann verwendet werden, wenn ein hTRT-Gen, Genprodukt oder eine Variante nachgewiesen, quantifiziert oder charakterisiert werden soll. Somit sind beispielsweise die nachstehend beschriebenen «diagnostischen» Verfahren zur Untersuchung von hTRT oder Telomerase während der Herstellung und Reinigung von hTRT oder menschlicher Telomerase, für die Charakterisierung von Zellinien, die von menschlichen Zellen stammen (z.B. zur Identifizierung unsterblicher Linien), für die Charakterisierung von Zellen, Tieren, Pflanzen, Pilzen, Bakterien oder anderen Organismen, die ein menschliches TRTGen oder Genprodukt (oder Fragmente davon) enthalten, von Nutzen. Although the assays described above are described in connection with diagnostic and prognostic methods, they can always be used when an hTRT gene, gene product or a variant is to be detected, quantified or characterized. Thus, for example, the «diagnostic» methods described below for examining hTRT or telomerase during the production and purification of hTRT or human telomerase, for the characterization of cell lines derived from human cells (eg for the identification of immortal lines), for the characterization of Cells, animals, plants, fungi, bacteria, or other organisms that contain a human TRT gene or gene product (or fragments thereof) are useful.

Der hier verwendete Ausdruck «diagnostisch» besitzt seine normale Bedeutung, nämlich die Identifizierung der Anwesenheit oder der Natur der Erkrankung (beispielsweise Krebs), eines Zustands (z.B. unfruchtbar, aktiviert), eines Status (z.B. fruchtbar) und der Ausdruck «prognostisch» hat ebenfalls seine übliche Bedeutung, nämlich die Prognose der wahrscheinlichen Entwicklung und/oder des Ausgangs einer Erkrankung oder eines Zustands. Zwar werden diese beiden Bezeichnungen in einem klinischen Umfeld gelegentlich auf unterschiedliche Weise verwendet. Jeder der nachstehend beschriebenen Assays oder Assayformate im Bezug auf «Diagnose» ist gleichermassen geeignet für das Stellen einer Prognose, da es inzwischen klar ist, dass höhere Spiegel an Telomerase-Aktivität mit einer schlechteren Prognose für Krebspatienten in Zusammenhang stehen und da die vorliegende Erfindung Nachweisverfahren bereitstellt, die für hTRT spezifisch sind, das mit Konzentrationen exprimiert wird, die mit Telomerase-Aktivität in einer Zelle eng korrelieren. The term "diagnostic" used here has its normal meaning, namely the identification of the presence or nature of the disease (e.g. cancer), a condition (e.g. sterile, activated), a status (e.g. fertile) and the term "prognostic" also has its usual meaning, namely the prognosis of the likely development and / or the outcome of a disease or condition. These two terms are sometimes used differently in a clinical setting. Any of the "diagnosis" assays or assay formats described below are equally suitable for making a prediction, since it is now clear that higher levels of telomerase activity are associated with a poorer prognosis for cancer patients, and because the present invention has detection methods provides that are specific for hTRT expressed at concentrations that closely correlate with telomerase activity in a cell.

2) Diagnose und Prognose von Krebs 2) Diagnosis and prognosis of cancer

Die Bestimmung eines hTRT-Gens-, -mRNA- oder- Protein-Spiegels der über dem normalen oder Standardbereich liegt, zeigt die Anwesenheit von Telomerase-positiven Zellen oder unsterblichen Zellen an, zu denen beispielsweise bestimmte Tumorzellen zählen. Da bestimmte embryonale und fötale Zellen sowie bestimmte «erwachsene» Stammzellen Telomerase exprimieren, stellt die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Bestimmung anderer Zustände wie z.B. Schwangerschaft, durch den Nachweis oder die Isolierung von Telomerase positiven fötalen Zellen aus dem Blut der Mutter. Diese Werte können dazu verwendet werden, eine Diagnose zu erstellen oder sie können bei der Erstellung einer Diagnose hilfreich sein, selbst wenn die Zellen unter Verwendung traditioneller Methoden nicht als krebsartig hätten klassifiziert werden oder anderweitig nachgewiesen oder klassifiziert werden können. Somit erlauben die erfindungsgemässen Verfahren den Nachweis oder die Verifikation von krebsartigen oder anderen Zuständen, die mit Telomerase assoziiert sind, mit erhöhter Zuverlässigkeit und möglicherweise in einem früheren Stadium. Die erfindungsgemässen Assays erlauben die Unterscheidung zwischen Klassen und Stadien von menschlichen Tumoren oder anderen mit der Zellproliferation in Zusammenhang stehenden Erkrankungen, dadurch, dass sie quantative Assays für das hTRT-Gen und -Genprodukte bereitstellen und damit die Wahl geeigneter Behandlungsvorgehensweisen sowie genaue Diagnosen erleichtern. Da der Spiegel an Telomerase-Aktivität dazu verwendet werden kann, um zwischen gutartigen und malignen Tumoren zu unterscheiden (z.B. US-Patent Nr. 5 489 508 und Hiyama et al., Proc. Am Ass. Cancer Res. 38 (1997), 637), um das Bevorstehen einer Invasion vorherzusagen (z.B. US-Patent Nr. 5 639 613 und Yashima et al., Proc. Am. Ass. Cancer Res. 38 (1997), 326) und um eine Korrelation mit dem Potential zur Metastasenbildung herzustellen (z.B. US-Patent Nr. 5 648 215 und Pandita et al., Proc. Am Ass. Cancer Res. 37 (1996), 559), werden diese Assays darüber hinaus für die Prophylaxe, den Nachweis und die Behandlung einer grossen Anzahl von menschlichen Krebsarten von Nutzen sein. The determination of an hTRT gene, mRNA or protein level which is above the normal or standard range indicates the presence of telomerase-positive cells or immortal cells, which include, for example, certain tumor cells. Since certain embryonic and fetal cells as well as certain "adult" stem cells express telomerase, the present invention also provides methods for determining other conditions such as e.g. Pregnancy, by detecting or isolating telomerase positive fetal cells from the mother's blood. These values can be used to make a diagnosis, or can be helpful in making a diagnosis, even if the cells could not have been classified as cancerous or otherwise detected or classified using traditional methods. Thus, the methods according to the invention allow the detection or verification of cancerous or other states associated with telomerase with increased reliability and possibly at an earlier stage. The assays according to the invention allow a distinction to be made between classes and stages of human tumors or other diseases associated with cell proliferation by providing quantitative assays for the hTRT gene and gene products and thus facilitating the selection of suitable treatment procedures and precise diagnoses. Because the level of telomerase activity can be used to distinguish between benign and malignant tumors (e.g., U.S. Patent No. 5,489,508 and Hiyama et al., Proc. Am Ass. Cancer Res. 38 (1997), 637 ) to predict the impending invasion (e.g., U.S. Patent No. 5,639,613 and Yashima et al., Proc. Am. Ass. Cancer Res. 38 (1997), 326) and to correlate with the potential for metastasis (e.g. US Pat. No. 5,648,215 and Pandita et al., Proc. Am Ass. Cancer Res. 37 (1996), 559), these assays are also used for the prophylaxis, detection and treatment of a large number of human cancers.

Für die Prognose von Krebserkrankungen (oder anderer Erkrankungen oder Zustände, die durch eine erhöhte Telomerase-Konzentration gekennzeichnet sind) wird ein prognostischer Wert für ein hTRT-Genprodukt (mRNA oder Protein) oder die Aktivität für einen bestimmten Tumortyp, Tumorklasse oder ein Tumorstadium, wie nachstehend beschrieben, bestimmt. Der Spiegel an hTRT-Protein oder -mRNA oder Telomerase-Aktivität in einem Patienten, kann beispielsweise unter Verwendung der hier beschriebenen Assays bestimmt und mit dem prognostischen Spiegel verglichen werden. A prognostic value for an hTRT gene product (mRNA or protein) or the activity for a specific tumor type, tumor class or tumor stage, such as, is used for the prognosis of cancer diseases (or other diseases or conditions which are characterized by an increased telomerase concentration) described below. The level of hTRT protein or mRNA or telomerase activity in a patient can be determined, for example, using the assays described here and compared to the prognostic level.

In Abhängigkeit von dem verwendeten Assay wird in einigen Fällen die Häufigkeit eines hTRT-Gen-produkts in einer Probe als erhöht angesehen werden, wann immer es durch den Assay nachweisbar Depending on the assay used, the frequency of an hTRT gene product in a sample will be considered increased in some cases whenever detectable by the assay

63 63

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

ist. Aufgrund der geringen Menge von hTRT-mRNA und Protein selbst in Telomerase-positiven Zellen und der Seltenheit oder des Fehlens dieser Genprodukte in normalen oder Telomerase-negativen Zellen sind empfindliche Assays erforderlich, um nachweisen zu können, ob die hTRT-Genprodukte überhaupt in normalen Zellen vorfianden sind. Wenn weniger empfindliche Assays ausgewählt werden, werden zwar hTRT-Genprodukte in gesundem Gewebe nicht nachweisbar sein, jedoch in Telomerase-positivem Krebs- oder bei anderen Telomerase-positiven Zellen. Typischerweise beträgt die Menge eines hTRT-Genprodukts in einer Probe mit einer erhöhten Konzentration mindestens etwa das 5fache, häufiger mindestens etwa das 10fache, noch häufiger mindestens das 50fache und sehr oft mindestens das etwa 100 bis 1000fache im Vergleich zum Spiegel von Telomerase-negativen Kontrollzellen oder Zellen von gesunden Geweben eines Erwachsenen, wobei der Prozentsatz von Telomerase-positiv normalen Zellen sehr gering ist. is. Due to the small amount of hTRT mRNA and protein even in telomerase-positive cells and the rarity or absence of these gene products in normal or telomerase-negative cells, sensitive assays are required in order to be able to prove whether the hTRT gene products are in normal cells at all are found. If less sensitive assays are selected, hTRT gene products will not be detectable in healthy tissue, but in telomerase-positive cancer or other telomerase-positive cells. Typically, the amount of an hTRT gene product in a sample with an increased concentration is at least about 5 times, more often at least about 10 times, more often at least 50 times and very often at least about 100 to 1000 times compared to the level of telomerase-negative control cells or Cells from healthy adult tissues, with the percentage of telomerase positive normal cells being very low.

Die erfindungsgemässen diagnostischen und prognostischen Verfahren können bei jeder Zelle oder jedem Gewebetyp jeden Ursprungs verwendet werden und sie können zum Nachweis einer unsterblichen oder neoplastischen Zelle, eines Tumorgewebes oder eines Krebses jeden Ursprungs ve wendet werden. Zu den Krebsarten, die nachgewiesen werden können, zählen, jedoch ohne Beschränkung darauf, all jene, die hinsichtlich der Diskussion der therapeutischen Anwendung von hTRT vorstehend aufgezählt wurden. The diagnostic and prognostic methods according to the invention can be used with any cell or tissue type of any origin and they can be used for the detection of an immortal or neoplastic cell, a tumor tissue or a cancer of any origin. The types of cancer that can be detected include, but are not limited to, all of those listed above for discussion of the therapeutic use of hTRT.

Die erfindungsgemässen Assays sind darüber hinaus zur Obewachung der Wirksamkeit einer therapeutischen Intervention in Patienten, die wegen eimer Krebserkrankung behandelt werden, von Nutzen. Zu den Behandlungen von Krebs, die übewacht werden können, gehören alle gegenwärtig empfohlenen Therapieformen (einschliesslich Chemotherapie, Bestrahlungstherapie und chirurgische Massnahmen) und dazu zählen auch zukünftige Behandlungen, beispielsweise die hier beschriebenen Therapien, die sich auf die Hemmung oder Aktivierung von Telomerase beziehen (siehe beispielsweise PCT-Veröffentlichung Nr. 96/01 835 und 96/40 868 und US-Patent Nr. 5 583 016; sowie auch US-Patentanmeldungen mit der Serien Nr. 08/472 802 und 08/482 115, die beide am 7. Juni 1995 eingereicht wurden; 08/521 634, eingereicht am 1. August 1995; 08/714 482, eingereicht am 16. September 1996 und 08/770 564 und 08/770 565, die beide am 20. Dezember 1996 eingereicht wurden, wobei all diese Dokumente aufgrund der Bezugnahme in ihrer Gesamtheit als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden können). The assays according to the invention are also useful for monitoring the effectiveness of a therapeutic intervention in patients who are being treated for cancer. Treatments for cancer that can be monitored include all currently recommended forms of therapy (including chemotherapy, radiation therapy, and surgical measures), as well as future treatments, such as the therapies described here, that relate to the inhibition or activation of telomerase (see for example, PCT Publication Nos. 96/01 835 and 96/40 868 and U.S. Patent No. 5,583,016; and U.S. Patent Applications Serial No. 08/472 802 and 08/482 115, both of which issued on July 7, June 1995; 08/521 634, filed August 1, 1995; 08/714 482, filed September 16, 1996 and 08/770 564 and 08/770 565, both filed on December 20, 1996, wherein all of these documents may be considered part of this description based on the reference in their entirety).

In einem weiteren Aspekt sind die nachstehend beschriebenen Assays für den Nachweis bestimmter Variationen in der hTRT-Gensequenz (Mutationen und vererbbare hTRT-Allele) von Nutzen, die eine Prädisposition für Krebserkrankungen oder andere Zustände anzeigt, die mit einer anormalen Regulation der Telomerase-Aktivität assoziiert sind (Unfruchtbarkeit, vorzeitiges Altern). In another aspect, the assays described below are useful for the detection of certain variations in the hTRT gene sequence (mutations and inheritable hTRT alleles) which indicate a predisposition to cancer or other conditions associated with abnormal regulation of telomerase activity are (infertility, premature aging).

3) Diagnose von Zuständen, bei denen es sich nicht um Krebs handelt 3) Diagnosing conditions that are not cancer

Zusätzlich zu der Diagnose von Krebserkrankungen haben die erfindungsgemässen Assays zahlreiche weitere Anwendungsmöglichkeiten. Die vorliegende Erfindung stellt Reagenzien und Verfahren zur Diagnose von Zuständen oder Erkrankungen bereit, die durch eine Unter- oder Überexpression von Telomerase oder hTRT-Genprodukten in Zellen charakterisiert sind. In Ewachsenen wird ein niedriger Spiegel an Telomerase-Aktivität normale weise bei einer begrenzten Art von normalen menschlichen somatischen Zellen gefunden, beispielsweise Stammzellen, aktivierten Lymphocyten und Keimzellen. Die Telomerase-Aktivität fehlt bei anderen somatischen Zellen. Somit ist der Nachweis von hTRT oder Telomerase* Aktivität in Zellen, in denen diese normaleweise fehlen oder inaktiv sind, oder der Nachweis eines anormalen Spiegels (d.h. eines höheren oder niedrigeren im Vergleich zum normalen) in Zellen, in denen hTRT normaleweise nur mit einem niedrigen Spiegel vorhanden ist (wie beispielsweise Stammzellen, aktivierte Lymphocyten und Keimzellen) ein diagnostisches Anzeichen für eine mit Telomerase in Zusammenhang stehende Erkrankung oder einen Zustand. Dieser Nachweis kann auch zur Identifizierung oder Isolierung spezifischer Zelltypen vewendet werden. Zu den Beispielen für solche Erkrankungen und Zustände gehören: Erkrankungen bezüglich der Zellproliferation, immunologische Funktionsstörungen, Unfruchtbarkeit, Erkrankungen hinsichtlich der Immunzellfunktion, Schwangerschaft, fötale Anor-malität, vorzeitige Alterung etc. Darüber hinaus sind die erfindungsgemässen Assays zur Übewachung der Wirksamkeit einer therapeutischen Intervention (wozu, ohne Beschränkung darauf, Wirkstoffe gehören, die Telomerase-Aktivität modulieren) bei einem Patienten oder in einem Assay, der auf Zellen oder einem Tier basiert. Ein Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung von Assays, die zur Diagnose von Unfruchtbarkeit von Nutzen sind. Menschliche Keimzellen (z.B. Stammsamenzellen, Vorläufer oder Nachkommen) können unbegrenzt proliferieren und sind durch eine hohe Telomerase-Aktivität gekennzeichnet. Anormale oder verringerte Spiegel an hTRT-Genprodukten oder anormale Produkte können zu einer unzulänglichen oder anormalen Produktion von Spermatozoen führen, was zu Unfruchtbarkeit oder Funktionsstörungen hinsichtlich der Reproduktion führt. Somit stellt die Erfindung Assays (Verfahren und Reagenzien) zur Diagnose und Behandlung von auf «Telomerase-basierenden» Funktionsstörungen bezüglich der Produktion bereit. Bei einer ähnlichen Anwendung können die Assays zur Übewachung der Wirksamkeit von Empfängnisverhütungsmitteln (z.B. Empfängnisverhütungsmittel für Männer bzw. männliche Tiere) vewendet werden, die gegen die Spermaproduktion als Ziel gerichtet sind oder diese indirekt beeinflussen (und die den hTRT-Spiegel oder Telomerase-Aktivität reduzieren sollen). In addition to the diagnosis of cancer, the assays according to the invention have numerous other possible uses. The present invention provides reagents and methods for diagnosing conditions or diseases which are characterized by under- or overexpression of telomerase or hTRT gene products in cells. In adults, a low level of telomerase activity is normally found in a limited type of normal human somatic cells, such as stem cells, activated lymphocytes and germ cells. Other somatic cells lack telomerase activity. Thus, the detection of hTRT or telomerase * activity in cells where they are normally absent or inactive, or the detection of an abnormal level (i.e. higher or lower compared to normal) in cells in which hTRT is normally low Level (such as stem cells, activated lymphocytes and germ cells) is a diagnostic sign of a telomerase-related disease or condition. This detection can also be used to identify or isolate specific cell types. Examples of such diseases and conditions include: diseases relating to cell proliferation, immunological functional disorders, infertility, diseases relating to immune cell function, pregnancy, fetal abnormality, premature aging etc. In addition, the assays according to the invention for monitoring the effectiveness of a therapeutic intervention ( including, but not limited to, agents that modulate telomerase activity) in a patient or in a cell or animal based assay. One aspect of the invention relates to the provision of assays useful for diagnosing infertility. Human germ cells (e.g. stem cells, progenitors or progeny) can proliferate indefinitely and are characterized by a high telomerase activity. Abnormal or decreased levels of hTRT gene products or abnormal products can lead to inadequate or abnormal sperm production, leading to infertility or reproductive dysfunction. The invention thus provides assays (methods and reagents) for the diagnosis and treatment of “telomerase-based” functional disorders with regard to production. In a similar application, the assays can be used to monitor the effectiveness of contraceptives (e.g. male or female contraceptives) that target or indirectly affect sperm production (and that reduce hTRT levels or telomerase activity) should).

64 64

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung von Assays zur Analyse der Telomerase-und hTRT-Spiegel und deren Funktion in Stammzellen, fötalen Zellen, embryonalen Zellen, aktivierten Lymphocyten und hämatopoetischen Stammzellen. Beispielsweise können Assays für den Nachweis von hTRT-Genprodukten zur allgemeinen Überwachung der Immunfunktion verwendet werden (z.B. zur Überwachung des Vorherrschens aktivierter Lymphocyten oder des gehäuften Auftretens von Vorläufer-Stammzellen), um aktivierte Lymphocyten oder Stammzellen zu identifizieren, auszuwählen oder zu isolieren, basierend auf erhöhten hTRT-Spiegeln, und um die Wirksamkeit von therapeutischen Interventionen, die gegen diese Gewebe als Ziel gerichtet sind, zu überwachen (z.B. immunsuppressive Agenzien oder therapeutische Bemühungen, eine Stammzellpopulation zu vergrössern). Another aspect of the invention relates to the provision of assays for analyzing the telomerase and hTRT levels and their function in stem cells, fetal cells, embryonic cells, activated lymphocytes and hematopoietic stem cells. For example, assays for the detection of hTRT gene products can be used to generally monitor immune function (e.g., to monitor the prevalence of activated lymphocytes or the accumulation of progenitor stem cells) to identify, select, or isolate activated lymphocytes or stem cells based on increased levels of hTRT, and to monitor the effectiveness of therapeutic interventions targeting these tissues (e.g., immunosuppressive agents or therapeutic efforts to increase a stem cell population).

Die Erfindung stellt auch Assays zur Verfügung, die für die Identifizierung von anti-Telomerase- und anti-TRT-lmmunglobulinen (die im Serum eines Patienten gefunden werden) von Nutzen sind. Die hier beschriebenen Substanzen und Assays können zur Identifizierung von Patienten verwendet werden, in denen solche Autoimmun-Antikörper gefunden werden, was eine Diagnose und die Behandlung des mit den Immunglobulinen assoziierten Zustands erlaubt. The invention also provides assays that are useful for the identification of anti-telomerase and anti-TRT immunoglobulins (found in a patient's serum). The substances and assays described here can be used to identify patients in whom such autoimmune antibodies are found, which allows diagnosis and treatment of the condition associated with the immunoglobulins.

4) Überwachung von Zellen in Kultur 4) Monitoring cells in culture

Die hier beschriebenen Assays sind auch für die Überwachung der Expression von hTRT-Genprodukten und der Charakterisierung von hTRT-Genen in Zellen ex vivo oder in vitro von Nutzen. Da erhöhte hTRT-Spiegel charakteristisch für immortalisierte Zellen sind, können die erfindungsgemässen Assays beispielsweise für das Screenen nach immortalisierten Zellen oder deren Identifizierung verwendet werden oder zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der immortalisierte Zellen durch Hemmung der hTRT-Expression oder -Funktion wieder mortalisieren kann. Beispielsweise ist dieser Assay für die Identifizierung von Zellen von Nutzen, die durch eine erhöhte Expression von hTRT in der Zelle, beispielsweise der Expression einer rekombinanten hTRT, oder durch erhöhte Expression einer endogen codierten hTRT (z.B. durch Promotoraktivierung) immortalisiert wurden. The assays described here are also useful for monitoring the expression of hTRT gene products and the characterization of hTRT genes in cells ex vivo or in vitro. Since elevated hTRT levels are characteristic of immortalized cells, the assays according to the invention can be used, for example, to screen for immortalized cells or to identify them, or to identify an active ingredient that can mortalize immortalized cells again by inhibiting hTRT expression or function. For example, this assay is useful for the identification of cells that have been immortalized by increased expression of hTRT in the cell, e.g. expression of a recombinant hTRT, or increased expression of an endogenously encoded hTRT (e.g. by promoter activation).

Auf ähnliche Weise können diese Assays auch zur Überwachung der hTRT-Expression in transgenen Tieren oder Zellen (z.B. in Hefe oder menschlichen Zellen, die ein hTRT-Gen enthalten) verwendet werden. Insbesondere können die Auswirkungen von bestimmten Behandlungen (z.B. die Verabreichung eines bekannten oder vermuteten Telomerase-Antagonisten) bezüglich des hTRT-Spiegels in Menschen und nicht-menschlichen Zellen, die die erfindungsgemässe hTRT exprimieren zur Identifizierung von nützlichen Wirkstoffen und Wirkstoffkandidaten (z.B.Telomerase-Aktivität modulierende Wirkstoffe) verwendet werden. Similarly, these assays can also be used to monitor hTRT expression in transgenic animals or cells (e.g., in yeast or human cells containing an hTRT gene). In particular, the effects of certain treatments (for example the administration of a known or suspected telomerase antagonist) with regard to the hTRT level in humans and non-human cells which express the hTRT according to the invention can be used to identify useful active substances and drug candidates (for example modulating telomerase activity Active ingredients) can be used.

B) Normale, diagnostische und prognostische Werte B) Normal, diagnostic and prognostic values

Assays hinsichtlich des Vorhandenseins oder der Menge eines hTRT-Genprodukts können auf verschiedene Art und Weise ausgeführt und ebenso die Ergebnisse auf verschiedene Art und Weise interpretiert werden, was von dem Assayformat, der Natur der zu untersuchenden Probe und der erwünschten Information abhängt. Beispielsweise ist die Menge an hTRT-Genprodukten in den meisten menschlichen somatischen Geweben im Fliessgleichgewicht so gering, dass diese durch bestimmte Assays nicht nachweisbar sind. Darüber hinaus ist im allgemeinen in diesen Zellen keine Telomerase-Aktivität vorhanden, so dass die Verifikation der Aktivität ziemlich leicht ist. Umgekehrt findet sich hTRT-Protein und/oder hTRT-mRNA oder Telomerase in anderen Telomerase-positiven Geweben, beispielsweise malignen Tumoren, in ausreichender Menge, so dass diese unter Verwendung der gleichen Assays nachgewiesen werden können. Selbst in jenen somatischen Zelltypen, in denen normalerweise ein geringer Spiegel an Telomerase-Aktivität nachgewiesen werden kann (z.B. Stammzellen und bestimmte aktivierte Zellen des Hämatopoetischen Systems), ist der Spiegel an hTRT-mRNA und Telomerase-Aktivität sehr gering (z.B. schätzungsweise etwa 1% oder weniger) im Vergleich zu dem Spiegel in unsterblichen Zellen; somit können unsterbliche und sterbliche Zellen mittels der erfindungsgemässen Verfahren leicht unterschieden werden. Wenn ein «weniger empfindlicher» Assay verwendet wird, kann der blosse Nachweis des hTRT-Genprodukts in einer biologischen Probe selbst für die Diagnose verwendet werden, ohne dass es erforderlich ist, eine zusätzliche Analyse durchzuführen. Zwar können die nachstehend beschriebenen Assays mit einer ausgezeichneten Empfindlichkeit ausgestattet werden, sie können darüber hinaus auch, falls erwünscht, mit einer geringeren Empfindlichkeit ausgestattet werden (z.B. durch geeignete Wahl von Puffern, Waschbedingungen, Anzahl der Amplifikationsrunden, Reagenzien und/oder Auswahl von Signalverstärkem). Somit kann im Prinzip jeder Assay so gestaltet werden, dass er hTRT-Genprodukte nur in den biologischen Proben nachweist, in denen diese in einer bestimmten Konzentration vorhanden sind, beispielsweise in einer höheren Konzentration als in gesundem oder einem anderen Kontrollgewebe. In diesem Fall wird jeder nachweisbare Spiegel an hTRT-mRNA oder hTRT-Protein als in Zellen von post-natalem menschlichem somatischem Gewebe erhöht erachtet (im Unterschied zu hämatopoetischen Zellen und anderen Stammzellen). Assays for the presence or amount of an hTRT gene product can be performed in a variety of ways and the results interpreted in a number of ways, depending on the assay format, the nature of the sample to be assayed, and the information desired. For example, the amount of hTRT gene products in most human somatic tissues in the steady state is so small that they cannot be detected by certain assays. In addition, there is generally no telomerase activity in these cells, so the verification of the activity is fairly easy. Conversely, there is a sufficient amount of hTRT protein and / or hTRT mRNA or telomerase in other telomerase-positive tissues, for example malignant tumors, so that these can be detected using the same assays. Even in those somatic cell types in which a low level of telomerase activity can normally be detected (e.g. stem cells and certain activated cells of the hematopoietic system), the level of hTRT mRNA and telomerase activity is very low (e.g. estimated at about 1% or less) compared to the level in immortal cells; immortal and mortal cells can thus be easily distinguished using the methods according to the invention. If a "less sensitive" assay is used, the mere detection of the hTRT gene product in a biological sample can be used for diagnosis itself, without the need for additional analysis. Although the assays described below can be endowed with an excellent sensitivity, they can also, if desired, be endowed with a lower sensitivity (for example by suitable selection of buffers, washing conditions, number of rounds of amplification, reagents and / or selection of signal amplifiers). . In principle, each assay can be designed in such a way that it only detects hTRT gene products in the biological samples in which they are present in a certain concentration, for example in a higher concentration than in healthy or another control tissue. In this case, any detectable level of hTRT mRNA or hTRT protein is considered to be elevated in cells from post-natal human somatic tissue (in contrast to hematopoietic cells and other stem cells).

In einigen Fällen kann es jedoch wünschenswert sein, normale Werte oder Basiswerte (oder Bereiche) für die hTRT-Genprodukt-Expressionsspiegel zu etablieren, insbesondere, wenn sehr empfindliche Assays verwendet werden, die einen sehr geringen Spiegel an hTRT-Genprodukten, die in normalen In some cases, however, it may be desirable to establish normal levels or baseline (or ranges) for hTRT gene product expression levels, especially when using very sensitive assays that have a very low level of hTRT gene products found in normal

65 65

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

somatischen Zellen vorhanden sein können, nachweisen können. Normale Spiegel der Expression oder von normalen Expressionsprodukten können für jede bestimmte Population, Unterpopulation oder Gruppen von Organismen gemäss dem Fachmann gut bekannter Standardverfahren bestimmt werden. Im allgemeinen werden Basisspiegel (normale Spiegel) an hTRT-Protein oder hTRT-mRNA durch Quantifizierung der Menge an hTRT-Protein und/oder -mRNA in biologischen Proben (z.B. Flüssigkeiten, Zellen oder Geweben) bestimmt, die von normalen (gesunden) Individuen (z.B. einem Menschen) erhalten wurden. Für bestimmte Proben und Zwecke kann es erwünscht sein, die Menge eines hTRT-Genpro-dukts pro Zelle oder pro Tumorzelle zu quantifizieren. Um die Zellmenge einer Probe zu bestimmen, kann der Spiegel eines konstitutiv exprimierten Genprodukts oder eines anderen Genprodukts bestimmt werden, das in Zellen des Typs, von dem die Probe genommen wurde, mit bekanntem Spiegel exprimiert wird. Alternativ können normale Werte eines hTRT-Proteins oder einer hTRT-mRNA dadurch bestimmt werden, dass die Menge an hTRT-Protein/RNA in Zellen oder Geweben, von denen bekannt ist, dass sie gesund sind, und die von dem gleichen Patienten stammen, von dem die erkrankten (oder möglichenweise erkrankten) Zellen entnommen wurden, oder von einem gesunden Individuum, quantifiziert wird. somatic cells can be present. Normal levels of expression or of normal expression products can be determined for any particular population, subpopulation or groups of organisms according to standard procedures well known to those skilled in the art. In general, basic levels (normal levels) of hTRT protein or hTRT mRNA are determined by quantifying the amount of hTRT protein and / or mRNA in biological samples (e.g. liquids, cells or tissues) that are obtained from normal (healthy) individuals ( e.g. a human). For certain samples and purposes, it may be desirable to quantify the amount of an hTRT gene product per cell or per tumor cell. In order to determine the cell amount of a sample, the level of a constitutively expressed gene product or of another gene product which is expressed in cells of the type from which the sample was taken can be determined with a known level. Alternatively, normal values of an hTRT protein or hTRT mRNA can be determined by determining the amount of hTRT protein / RNA in cells or tissues known to be healthy from the same patient from from which the diseased (or possibly diseased) cells were taken, or from a healthy individual.

Alternativ können in einigen Fällen Basisspiegel als der Spiegel definiert werden, der in nicht-unsterblichen menschlichen somatischen Zellen in Kultur vorhanden ist. Es ist möglich, dass normale Werte (Basiswerte) zwischen verschiedenen Zelltypen etwas differieren (z.B. ist der hTRT-mRNA-Spiegel in Hoden höher als in der Niere) oder auch entsprechend dem Alter, Geschlecht oder dem physischen Zustand eines Patienten. Wenn daher beispielsweise ein Assay zur Bestimmung von Veränderungen im hTRT-Spiegel, die mit Krebs assoziiert sind, verwendet wird, können die für die Bestimmung des normalen Bereichs an hTRT-Genprodukt-Expression verwendeten Zellen von Personen des gleichen oder eines unterschiedlichen Alters stammen, je nach der Art der Untersuchung. Die Anwendung von in der Molekulargenetik verwendeten statistischen Standardverfahren erlaubt die Bestimmung von Basis-Expressionsspiegeln sowie von signifikanten Abweichungen von solchen Basisspiegeln. Alternatively, in some cases, base levels can be defined as the level that is present in non-immortal human somatic cells in culture. It is possible that normal values (base values) differ somewhat between different cell types (e.g. the hTRT mRNA level in the testes is higher than in the kidney) or also according to the age, gender or physical condition of a patient. Thus, for example, if an assay is used to determine changes in hTRT levels associated with cancer, the cells used to determine the normal range of hTRT gene product expression may be from people of the same or different ages, depending according to the type of examination. The use of standard statistical methods used in molecular genetics allows the determination of base expression levels and of significant deviations from such base levels.

Für die Durchführung der erfindungsgemässen Diagnose- und Prognose-Verfahren wie sie vorstehend beschrieben wurden kann es manchmal zweckmässig sein, sich auf «diagnostische» und «prognostische» Werte zu beziehen. Der hier verwendete Ausdruck «diagnostischer Wert»bezieht sich auf einen Wert, der für das in einer Probe nachgewiesene hTRT-Genprodukt bestimmt wurde, und der beim Vergleich mit einem normalen Bereich (oder «Basisbereich») für das hTRT-Genprodukt das Vorhandensein einer Erkrankung anzeigt. Diese Erkrankung kann durch hohe Telomerase-Aktivität gekennzeichnet sein (z.B. Krebs), das Fehlen von Telomerase-Aktivität (z.B. Unfruchtbarkeit) oder durch einen Zwischenwert. When carrying out the diagnostic and prognostic methods according to the invention as described above, it can sometimes be expedient to refer to “diagnostic” and “prognostic” values. The term "diagnostic value" as used herein refers to a value determined for the hTRT gene product detected in a sample and which, when compared to a normal range (or "base range") for the hTRT gene product, indicates the presence of a disease displays. This disease can be characterized by high telomerase activity (e.g. cancer), the lack of telomerase activity (e.g. infertility) or by an intermediate value.

Der Ausdruck «prognostischer Wert» bezieht sich auf eine Menge des hTRT-Genprodukts, die in einem gegebenen Zelltyp nachgewiesen wurde (z.B. einer malignen Tumorzelle) und die konsistent ist mit einer bestimmten Diagnose oder Prognose für die Erkrankung (z.B. Krebs). Die Menge des in einer Probe nachgewiesenen hTRT-Genprodukts (einschliesslich der Menge null) wird mit dem prognostischen Wert für die Zelle verglichen, so dass der relative Vergleich der Werte das Vorhandensein einer Erkrankung oder den Ausgang der Entwicklung der Erkrankung (z.B. Krebs) anzeigt. In einer Ausführungsform werden beispielsweise für die Durchführung einer Tumorprognose Daten gesammelt, um so eine statistisch signifikante Korrelation an hTRT-Spiegel mit verschiedenen Tumorklassen oder -Stadien zu erhalten. Für die gleiche Zellprobe oder Gewebeprobe, die von Individuen mit bekannten klinischen Ergebnissen stammt, wird ein prädeterminierter Bereich an hTRT-Spiegeln etabliert. Eine ausreichende Anzahl von Messungen wird durchgeführt, um so einen statistisch signifikanten Wert (oder einen Bereich von Werten) zu ermitteln, mit dem dann ein Vergleich durchgeführt wird. Der prädeterminierte Bereich von hTRT-Spiegeln oder hTRT-Aktivität für eine gegebene Zellprobe oder Gewebeprobe kann dann zur Bestimmung eines Werts oder Bereichs für den Spiegel an hTRT-Genprodukten verwendet werden, der mit einer günstigen (oder ungünstigen) Prognose (z.B. einem «niedrigen Spiegel» im Fall von Krebs) korrelieren würde. Ein einem «hohen Spiegel» entsprechender Bereich, der mit einer (oder mehreren) ungünstigen Prognose(n) im Fall von Krebs korreliert, kann auf ähnliche Weise bestimmt werden. Der Spiegel eines hTRT-Genprodukts einer biologischen Probe (z.B. einer Patientenprobe) kann dann bestimmt, mit den niedrigen und hohen Bereichen verglichen und zur Prognose eines klinischen Verlaufs verwendet werden. The term "prognostic value" refers to an amount of the hTRT gene product that has been detected in a given cell type (e.g. a malignant tumor cell) and which is consistent with a specific diagnosis or prognosis for the disease (e.g. cancer). The amount of hTRT gene product detected in a sample (including zero amount) is compared to the prognostic value for the cell so that the relative comparison of the values indicates the presence of a disease or the outcome of the disease (e.g. cancer). In one embodiment, data are collected, for example, to carry out a tumor prognosis in order to obtain a statistically significant correlation to hTRT levels with different tumor classes or stages. A predetermined range of hTRT levels is established for the same cell sample or tissue sample derived from individuals with known clinical results. A sufficient number of measurements are carried out in order to determine a statistically significant value (or a range of values) with which a comparison is then carried out. The predetermined range of hTRT levels or hTRT activity for a given cell sample or tissue sample can then be used to determine a value or range for the level of hTRT gene products that has a favorable (or unfavorable) prognosis (eg, a "low level »In the case of cancer) would correlate. A region corresponding to a “high level” that correlates with one (or more) unfavorable prognosis (s) in the case of cancer can be determined in a similar way. The level of an hTRT gene product of a biological sample (e.g., a patient sample) can then be determined, compared to the low and high ranges, and used to predict a clinical course.

Zwar bezieht sich die vorstehende Diskussion zur Veranschaulichung auf Krebs, diagnostische und prognostische Werte können aber auch für andere Erkrankungen (z.B. Erkrankungen bezüglich der Zellproliferation) und Zustände bestimmt werden und bei Erkrankungen oder Zuständen, bei denen es sich nicht um Krebs handelt, kann ein «hoher» Spiegel mit dem gewünschten Verlauf und ein «niedriger» Spiegel mit einem ungünstigen Verlauf korrelieren. Beispielsweise können einige Erkrankungen durch eine Defizienz (z.B. einen niedrigen Spiegel) an Telomerase-Aktivität in Stammzellen, aktivierten Lymphocyten oder Keimbahnzellen gekennzeichnet sein. In solchen Fällen können «hohe» Spiegel an hTRT-Genprodukten bezogen auf Zellen des gleichen Alters und/oder des gleichen Typs (z.B. von anderen Patienten oder anderen Geweben in einem bestimmten Patienten) mit einem günstigen Verlauf korrelieren. Although the discussion above relates to cancer as an illustration, diagnostic and prognostic values can also be determined for other diseases (eg diseases related to cell proliferation) and conditions, and for diseases or conditions that are not cancer, a « correlate a high »mirror with the desired curve and a« low »mirror with an unfavorable curve. For example, some diseases may be characterized by a deficiency (e.g. low level) of telomerase activity in stem cells, activated lymphocytes or germline cells. In such cases, "high" levels of hTRT gene products based on cells of the same age and / or of the same type (e.g. from other patients or other tissues in a particular patient) can correlate with a favorable course.

Natürlich erfordern die Assayverfahren nicht unbedingt die Bestimmung von absoluten Werten an hTnT, es sei denn, es ist erwünscht, da relative Werte für viele Anwendungen der erfindungsgemässen Ve -iren ausreichend sind. In den Fällen, in denen eine Quantifizierung wünschenswert ist, stellt die Of course, the assay methods do not necessarily require the determination of absolute values of hTnT, unless it is desired because relative values are sufficient for many applications of the methods according to the invention. In cases where quantification is desirable, the

66 66

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

vorliegende Erfindung Reagenzien bereit, so dass praktisch jedes bekannte Verfahren zur Quantifizierung von Genprodukten verwendet werden kann. present invention reagents ready so that virtually any known method for quantifying gene products can be used.

Die erfindungsmässigen Assays können auch zur Beurteilung der Wirksamkeit eines bestimmten therapeutischen Behandlungsvorgehens bei Untersuchungen an Tieren, bei klinischen Tests oder bei der Überwachung der Behandlung an einzelnen Patienten verwendet werden. In diesen Fällen kann es wünschenswert sein, den Basisspiegel für den Patienten vor dem Beginn der Therapie zu etablieren und während des Verlaufs der Behandlung die Assays einmal oder öfter zu wiederholen, überlicherweise in regelmässigen Abständen, um zu überprüfen, ob sich die hTRT-Spiegel auf einen gewünschten Endpunkt hin (z.B. verringertet! TRT-Expression, wenn es sich um einen Assay für Krebs handelt) als ein Ergebnis der Behandlung bewegen. The assays according to the invention can also be used to assess the effectiveness of a specific therapeutic treatment procedure in animal studies, in clinical tests or in monitoring the treatment of individual patients. In these cases, it may be desirable to establish the baseline level for the patient prior to initiating therapy and to repeat the assays once or more throughout the course of treatment, usually at regular intervals to check if the hTRT level is up a desired endpoint (e.g., decreased TRT expression if it is an assay for cancer) as a result of the treatment.

Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass zusätzlich zu der Quantität oder Häufigkeit von hTRT-Genprodukten auch verschiedene oder anormale Expressionsmuster (z.B. anormale Mengen von RNA-Spleiss-Varianten) oder anormale Expressionsprodukte oder Expressionsproduktvarianten, beispielsweise mutierte Transkripte, verkürzte oder «non-sense»-Polypeptide) durch Vergleich mit normalen Expressionsspiegeln und normalen Expressionsprodukten identifiziert werden können. In diesen Fällen beinhaltet die Bestimmung von «normal» oder «Basis-» die Identifizierung gesunder Organismen und/oder Gewebe (d.h. Organismen und/oder Gewebe ohne Dysregulation der hTRT-Expression oder neoplastisches Wachstum) und die Bestimmung des Expressionsspiegels von hTRT-Genproduktvarianten (z.B. Spleiss-Varianten) oder die Sequenzierung oder den Nachweis des hTRT-Gens, -mRNA oder reverser transkribierter cDNA, um so typische (normale) Sequenzvariantenzu erhalten oder zu bestimmen. Die Anwendung von Statistiken und Standardverfahren, die in der Molekulargenetik verwendet werden, erlaubt die Bestimmung von signifikanten Abweichungen von solchen Basisspiegeln. It is obvious to the person skilled in the art that, in addition to the quantity or frequency of hTRT gene products, different or abnormal expression patterns (for example abnormal amounts of RNA splice variants) or abnormal expression products or expression product variants, for example mutated transcripts, are shortened or «non-sense »-Polypeptides) can be identified by comparison with normal expression levels and normal expression products. In these cases, the determination of "normal" or "basic" includes the identification of healthy organisms and / or tissues (ie organisms and / or tissues without dysregulation of hTRT expression or neoplastic growth) and the determination of the expression level of hTRT gene product variants ( splice variants) or the sequencing or detection of the hTRT gene, mRNA or reverse transcribed cDNA in order to obtain or determine typical (normal) sequence variants. The use of statistics and standard methods used in molecular genetics allows significant deviations from such base levels to be determined.

C) Nachweis und Quantifizierung von TRT-Genprodukten C) Detection and quantification of TRT gene products

Wie hier betont, werden hTRT-Genprodukte normalerweise in den meisten normalen somatischen Zellen mit einem extrem niedrigen Spiegel gefunden. Beispielsweise ist die hTRT-Protein codierende mRNA in allen bisher untersuchten Telomerase-negativen Zelltypen äusserst selten oder sie fehlt. In unsterblichen Zellen, beispielsweise 293-Zellen, kann hTRT-mRNA lediglich in einer Anzahl von etwa 100 Kopien pro Zelle vorhanden sein, während normale somatische Zellen lediglich eine oder gar keine Kopie pro Zelle aufweisen. Es ist somit offensichtlich, dass es manchmal vorteilhaft sein wird, in das As-sayformat Signal- oder Zielamplifikationsverfahren einzuschliessen, wenn hochempfindliche Assays für hTRT-Genprodukte erwünscht sind. Siehe beispielsweise Plenat et al., Ann. Pathol. 17 (1997), 17 (Fluo-resceinyl-Tyramidsignal-Amplifikation); Zehbe et al., J. Pathol. 150 (1997), 1553 («catalyzed reporter de-position»); weitere hier aufgezählte Literaturhinweise (z.B. für bDNA-Signalamplifikation, für PCR und andere Zielamplifikationsformate), sowie weitere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren. As emphasized here, hTRT gene products are usually found in most normal somatic cells with an extremely low level. For example, the mRNA encoding hTRT protein is extremely rare or is absent in all telomerase-negative cell types examined to date. In immortal cells, for example 293 cells, hTRT mRNA can only be present in a number of approximately 100 copies per cell, whereas normal somatic cells have only one or no copy per cell. It is thus apparent that it will sometimes be advantageous to include signal or target amplification methods in the as-say format when highly sensitive assays for hTRT gene products are desired. See, for example, Plenat et al., Ann. Pathol. 17 (1997), 17 (fluoresceinyl tyramide signal amplification); Zehbe et al., J. Pathol. 150 (1997), 1553 ("catalyzed reporter de-position"); further references listed here (e.g. for bDNA signal amplification, for PCR and other target amplification formats), as well as other methods known in the art.

Wie bereits vorstehend angemerkt, ist es oft nicht nötig, die hTRT-mRNA oder das hTRT-Protein in den hier beschriebenen Assays zu quantifizieren, da der Nachweis eines hTRT-Genprodukts (unter As-saybedingungen, bei denen das Produkt in einer Kontrolle, beispielsweise Telomerasenegativen Zellen) nicht nachweisbar ist, an sich für eine Diagnose ausreichend ist. Bei einem weiteren Beispiel kann eine Quantifizierung überflüssig sein, nämlich dann, wenn die in einer Testprobe (z.B. Tumor) und Kontrollprobe (gesundenen Zellen) gefundenen Produktspiegel direkt verglichen werden. As already noted above, it is often not necessary to quantify the hTRT mRNA or the hTRT protein in the assays described here, since the detection of an hTRT gene product (under assay conditions in which the product is in a control, for example Telomerase negative cells) is undetectable, in itself sufficient for a diagnosis. In another example, quantification may be superfluous, namely if the product levels found in a test sample (e.g. tumor) and control sample (healthy cells) are compared directly.

Falls erwünscht können die in den hier beschriebenen Assays gemessenen Mengen an hTRT-Gen-produkt jedoch auf verschiedene Art und Weise beschrieben werden, was von dem Messverfahren und der Zweckmässigkeit abhängt. Somit können normale, diagnostische, prognostische, hohe oder geringe Mengen an hTRT-Protein/mRNA ausgedrückt werden als Standard-Gewichtseinheiten pro Menge einer biologischen Probe (z.B. Picogramm pro Gramm Gewebe, Picogramm pro 1012 Zellen) als eine Anzahl von Molekülen pro Menge einer biologischen Probe (z.B. Transkripte/Zelle, Mol/Zelle), als Aktivitätseinheiten pro Zelle oder pro Menge einer anderen Einheit oder durch ähnliche Verfahren. Die Menge eines hTRT-Genprodukts kann auch in Relation zu der Menge eines anderen Moleküls ausgedrückt werden. Zu den Beispielen gehören die Anzahl von hTRT-Transkripten in einer Probe/die Anzahl von 28S rRNA-Transkripten einer Probe; Nanogramm hTRT-Protein/Nanogramm Gesamtprotein, etc. If desired, however, the amounts of hTRT gene product measured in the assays described here can be described in various ways, depending on the measurement method and the expediency. Thus, normal, diagnostic, prognostic, high or low amounts of hTRT protein / mRNA can be expressed as standard weight units per amount of a biological sample (e.g. picogram per gram of tissue, picogram per 1012 cells) as a number of molecules per amount of a biological Sample (eg transcripts / cell, mole / cell), as units of activity per cell or per amount of another unit or by similar methods. The amount of an hTRT gene product can also be expressed in relation to the amount of another molecule. Examples include the number of hTRT transcripts in a sample / the number of 28S rRNA transcripts in a sample; Nanogram hTRT protein / nanogram total protein, etc.

Wenn hTRT-Genprodukte in zwei (oder mehr) unterschiedlichen Proben bestimmt werden, ist es gelegentlich zweckmässig, eine gemeinsame Vergleichsbasis für die zwei Proben zu haben. Beispielsweise können bei dem Vergleich einer Probe mit normalem Gewebe und einer Probe mit Krebsgewebe gleiche Mengen an Gewebe (bezüglich Gewicht, Volumen, Anzahl von Zellen etc.), verglichen werden. In einer alternativen Ausführungsform können Äquivalente eines Markermoleküls (z.B. 28S RNA, hTR, Telomerase-Aktivität, Telomer-Länge, Aktin) verwendet werden. Beispielsweise kann die Menge an hTRT-Protein in einer Probe gesunden Gewebes, die 10 Picogramm 28S rRNA enthält, mit einer Probe mit erkranktem Gewebe, das die gleiche Menge an 28S rRNA enthält, verglichen werden. When hTRT gene products are determined in two (or more) different samples, it is sometimes useful to have a common basis of comparison for the two samples. For example, when comparing a sample with normal tissue and a sample with cancer tissue, equal amounts of tissue (in terms of weight, volume, number of cells, etc.) can be compared. In an alternative embodiment, equivalents of a marker molecule (e.g. 28S RNA, hTR, telomerase activity, telomer length, actin) can be used. For example, the amount of hTRT protein in a healthy tissue sample containing 10 picograms of 28S rRNA can be compared to a diseased tissue sample containing the same amount of 28S rRNA.

Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass praktisch jeder der hier beschriebenen Assays als ein quantitativer Assay gestaltet werden kann. Typischerweise kann zur Kalibrierung des Assays eine bekannte Menge oder Quelle eines hTRT-Genprodukts (das z.B. unter Verwendung der erfindungsgemässen Verfahren und Zusammensetzung hergestellt wurde) vewendet werden. It will be apparent to those skilled in the art that virtually any of the assays described herein can be designed as a quantitative assay. Typically, a known amount or source of an hTRT gene product (e.g., made using the methods and compositions of the invention) can be used to calibrate the assay.

In bestimmten Ausführungsformen werden Assayformate ausgewählt, die die Anwesenheit, das Feh- In certain embodiments, assay formats are selected that reflect the presence,

67 67

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

len oder die Häufigkeit eines hTRT-Allels oder -Genprodukts in jeder Zelle in einer Probe (oder in einer repräsentativen Stichprobe) nachweisen können. Zu den Beispielen für solche Assayformate gehören jene, mit denen ein Signal mittels Histologie (z.B. Immunhistochemie mit Signalverstärkern oder zielverstärkenden Amplifikationsschritten) nachgewiesen werden kann, fluoreszenz-aktivierte Zellanalyse oder Zellsortierung (FACS). Diese Assayformate sind besonders dann von Vorteil, wenn man es mit einer hochheterogenen Zellpopulation zu tun hat (z.B. einer Zellpopulation, die viele unterschiedliche Zelltypen enthält, in denen nur ein Zelltyp oder nur wenige erhöhte hTRT-Spiegel auftreten oder eine Population von ähnlichen Zellen, die Telomerase mit verschiedenen Spiegeln exprimieren). or the frequency of an hTRT allele or gene product in each cell in a sample (or in a representative sample). Examples of such assay formats include those with which a signal can be detected using histology (e.g. immunohistochemistry with signal amplifiers or target-amplifying amplification steps), fluorescence-activated cell analysis or cell sorting (FACS). These assay formats are particularly advantageous when dealing with a highly heterogeneous cell population (e.g. a cell population that contains many different cell types in which only one cell type or only a few elevated hTRT levels occur, or a population of similar cells that Express telomerase with different levels).

D) Probengewinnung D) Sampling

Das hTRT-Gen oder -Genprodukt (d.h. mRNA oder Polypeptid) wird vorzugsweise in einer biologischen Probe nachgewiesen und/oder quantifiziert. Zu solchen Proben gehören, allerdings ohne Beschränkung darauf, Zellen (einschliesslich ganzer Zellen, Zellfraktionen, Zellextrakten und kultivierten Zellen oder Zellinien), Gewebe (einschliesslich Blut), Blutzellen (z.B. weisse Blutzellen), Gewebeproben, beispielsweise Feinnadelbiopsieproben (z.B. von der Prostata, Brust, Schilddrüse etc.), Körperflüssigkei-ten (z.B. Urin, Sputum, Amnionflüssigkeit, Blut, Peritonealflüssigkeit, Pleural-Flüssigkeit, Samen) oder daraus gewonnene Zellen (z.B. Blasenzellen aus Urin, Lymphocyten aus Blut), Medien (von kultivierten Zellen oder Zellinien) und Waschflüssigkeiten (z.B. von der Blase und Lunge). Zu den biologischen Proben können auch Gewebeschnitte gehören, beispielsweise Gefrierschnitte, die für histologische Zwecke entnommen wurden. Für die Diagnose und Prognose von Krebs wird eine Probe von einem kanzerö-sen, prokanzerösen oder vermutlich kanzerösem Gewebe oder Tumor entnommen. Es kann gelegentlich wünschenswert sein, eine biologische Probe für die spätere Analyse einzufrieren (z.B. wenn die Wirksamkeit von Behandlungen mit Wirkstoffen überwacht wird). The hTRT gene or gene product (i.e. mRNA or polypeptide) is preferably detected and / or quantified in a biological sample. Such samples include, but are not limited to, cells (including whole cells, cell fractions, cell extracts and cultured cells or cell lines), tissues (including blood), blood cells (e.g. white blood cells), tissue samples, e.g. fine needle biopsy samples (e.g. from the prostate, breast , Thyroid gland, etc.), body fluids (e.g. urine, sputum, amniotic fluid, blood, peritoneal fluid, pleural fluid, semen) or cells derived therefrom (e.g. bladder cells from urine, lymphocytes from blood), media (from cultured cells or cell lines) and washing liquids (e.g. from the bladder and lungs). The biological samples can also include tissue sections, for example frozen sections, which were taken for histological purposes. For the diagnosis and prognosis of cancer, a sample is taken from a cancerous, procancerous or presumably cancerous tissue or tumor. It may occasionally be desirable to freeze a biological sample for later analysis (e.g. when monitoring the effectiveness of drug treatments).

In einigen Fällen können die Zellen oder Gewebe vor der Analyse fraktioniert werden. Beispielsweise kann bei einer Gewebebiopsie von einem Patienten ein Zellsortierer (z.B. ein Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer) verwendet werden, um Zellen nach Merkmalen, wie beispielsweise der Expression eines Oberflächenantigens (z.B. eines tumorspezifischen Antigens) gemäss allgemein bekannter Verfahren zu sortieren. In some cases, the cells or tissues can be fractionated before analysis. For example, in a tissue biopsy from a patient, a cell sorter (e.g., a fluorescence activated cell sorter) can be used to sort cells by features such as expression of a surface antigen (e.g., a tumor specific antigen) according to well known methods.

Zwar wird die Probe üblicherweise von einem menschlichen Patienten oder Zellinie entnommen, die Assays können jedoch auch zum Nachweis von homologen hTRT-Genen oder entsprechenden Genprodukten in Proben von Tieren vewendet werden. Alternativ können hTRT-Gene und -Genprodukte in transgenen Tieren oder Organismen, die ein menschliches TRT-Protein oder entsprechende Nucleinsäu-resequenz exprimieren, untersucht werden. Although the sample is usually taken from a human patient or cell line, the assays can also be used to detect homologous hTRT genes or corresponding gene products in animal samples. Alternatively, hTRT genes and gene products can be examined in transgenic animals or organisms which express a human TRT protein or corresponding nucleic acid sequence.

Die Probe kann, falls nötig, durch Verdünnung in einer geeigneten Pufferlösung vorbehandelt werden oder konzentriert werden, falls dies ewünscht ist. Es kann eine Reihe von wässrigen Standardpufferlösungen bei physiologischem pH-Wert vewendet werden, wobei eine Reihe von Puffern angewandt werden kann, beispielsweise Phosphat, Tris-Puffer etc. If necessary, the sample can be pretreated by dilution in a suitable buffer solution or concentrated if desired. A number of standard aqueous buffer solutions at physiological pH can be used, whereby a number of buffers can be used, for example phosphate, Tris buffer etc.

Der Ausdruck «biologische Probe», die von einem Patienten erhalten wurde, kann entweder als «biologische Probe» oder «Patientenprobe» bezeichnet werden. Bei einer Analyse einer «Patientenprobe» müssen nicht unbedingt Zellen oder Gewebe von dem Patienten entnommen werden. Beispielsweise können geeignet markierte hTRT-bindende Agenzien (z.B. Antikörper oder Nucleinsäuren) in den Patienten injiziert und (nach Bindung an das Ziel) unter Vewendung von Standard-Bildgebungstechniken (z.B. CAT, NMR etc.) sichtbar gemacht werden. The term "biological sample" obtained from a patient can be referred to as either "biological sample" or "patient sample". When analyzing a “patient sample”, cells or tissues do not necessarily have to be removed from the patient. For example, appropriately labeled hTRT-binding agents (e.g. antibodies or nucleic acids) can be injected into the patient and visualized (after binding to the target) using standard imaging techniques (e.g. CAT, NMR etc.).

E) Nucleinsäure-Assays E) Nucleic acid assays

In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren zum Nachweis und/oder der Quantifizierung der Expression von hTRT-mRNAs (einschliesslich Spleiss-Varianten oder Sequenzvarianten und alternative Allele) bereit. In einer alternativen Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren zum Nachweis und der Analyse normaler oder anormaler hTRT-Gene (oder eines Fragmentsdavon) bereit. Zu den Formaten solcher qualitativer oder quantitativer Assays gehören, allerdings ohne Beschränkung darauf, auf Amplifikation basierende Assays mit oder ohne Signalamplifikation, auf Hybridisierung basierende Assays und auf der Kombination Amplifikation/Hybridisierung basierende Assays. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass die Unterscheidung zwischen Hybridisierung und Amplifikation nur aus Zweckmässigkeitsgründen durchgeführt wird: Wie in den nachstehenden Beispielen veranschaulicht, beinhalten viele Assayformate sowohl Elemente der Hybridisierung als auch Amplifikation, so dass in einigen Fällen die Kategorisierung etwas willkürlich ist. In one embodiment, the invention provides methods for detecting and / or quantifying the expression of hTRT mRNAs (including splice variants or sequence variants and alternative alleles). In an alternative embodiment, the invention provides methods for the detection and analysis of normal or abnormal hTRT genes (or a fragment thereof). The formats of such qualitative or quantitative assays include, but are not limited to, amplification-based assays with or without signal amplification, hybridization-based assays, and amplification / hybridization-based assays. It will be apparent to those skilled in the art that the distinction between hybridization and amplification is made for convenience only: As illustrated in the examples below, many assay formats contain elements of hybridization as well as amplification, so in some cases the categorization is somewhat arbitrary.

1) Herstellung von Nucleinsäuren 1) Production of nucleic acids

In einigen Ausführungsformen werden Nucleinsäure-Assays mit einer Nucleinsäureprobe, die aus der zu untersuchenden Zelle, oder Zellinie oder dem zu untersuchenden Gewebe oder Organismus isoliert wurde. Die Nucleinsäure (z.B. genomische DNA, RNA oder cDNA) kann aus einer Probe gemäss einer Reihe von dem Fachmann bekannten Verfahren «isoliert» werden. In diesem Zusammenhang bezieht In some embodiments, nucleic acid assays are performed with a nucleic acid sample isolated from the cell or cell line or tissue or organism to be tested. The nucleic acid (e.g. genomic DNA, RNA or cDNA) can be "isolated" from a sample according to a number of methods known to those skilled in the art. Related in this context

68 68

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

sich der Ausdruck «isoliert» auf jede Abtrennung der Spezies oder des Ziels, das nachgewiesen werden soll, von jeder anderen Substanz in dem Gemisch, dies bezeichnet jedoch nicht unbedingt einen wesentlichen Reinheitsgrad des Ziels. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass bei dem Nachweis von Änderungen in der Kopienanzahl des hTRT-Gens das nachzuweisende Ziel genomische DNA ist. Umgekehrt ist in einem auf einer Nucleinsäure basierenden Assay RNA das nachzuweisende Ziel, wenn Expressionsspiegel eines Gens oder von Genen nachgewiesen werden sollen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nucleinsäureprobe Gesamt-mRNA (d.h. poly(A)+RNA) in einer biologischen Probe. Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren sind dem Fachmann gut bekannt und beispielsweise beschrieben in Tijssen, P. (Herausg.) in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Préparation, Elsevier, N.Y. (1993), Kapitel 3, wobei dieses Dokument durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen ist. In einer Ausführungsform wird Gesamt-Nucleinsäure aus einer Probe unter Verwendung eines sauren Guanidin/Phenol/Chloroform-Extraktionsverfahrens isoliert und poly(A)+mRNA durch oligo-dT-Säulenchromatographie oder durch die Verwendung von magnetischen (dT)n Kügelchen (siehe z.B. Sambrook et al., und Ausubel et al., a.a.O.). the term "isolates" from any separation of the species or target to be detected from any other substance in the mixture, but does not necessarily indicate a substantial degree of purity of the target. It will be apparent to those skilled in the art that when changes in the number of copies of the hTRT gene are detected, the target to be detected is genomic DNA. Conversely, the target to be detected in a nucleic acid-based assay is RNA, if expression levels of a gene or of genes are to be detected. In a preferred embodiment, the nucleic acid sample is total mRNA (i.e. poly (A) + RNA) in a biological sample. Methods for isolating nucleic acids are well known to those skilled in the art and are described, for example, in Tijssen, P. (ed.) In Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Elsevier, N.Y. (1993), Chapter 3, which document is to be considered part of this description by reference. In one embodiment, total nucleic acid is isolated from a sample using an acidic guanidine / phenol / chloroform extraction method and poly (A) + mRNA by oligo-dT column chromatography or by using magnetic (dT) n beads (see e.g. Sambrook et al., and Ausubel et al., loc. cit.).

In alternativen Ausführungsformen ist die Isolation von Nucleinsäuren (z.B. Gesamt-RNA oder poly-A+RNA) aus der biologischen Probe vor der Durchführung von Amplikation, Hybridisierung oder anderen Assays nicht erforderlich. Diese Ausführungsformen haben bestimmte Vorteile im Fall, dass hTRT-RNA gemessen werden soll, da sie die Wahrscheinlichkeit verringern, dass hTRT-mRNA während der Isolation und der Handhabung verlorengeht. Beispielsweise können viele Amplifikationsverfahren, wie beispielsweise PCR und RT-PCR (reverse Transkriptase-PCR) unter Verwendung permeabilisierter Zellen (histologische Proben und FACS-Analysen) lysierter Gesamtzellen oder hoher Zellfraktionen, wie beispielsweise bestimmter Zellextrakte, durchgeführt werden. Vorzugsweise werden Schritte unternommen, um die Integrität der Zielnucleinsäure (z.B. mRNA), falls erforderlich, zu bewahren (z.B. durch Zugabe von RNAase-lnhibitoren). Amplifikations- und Hybridisierungs-Assays können auch in situ durchgeführt werden, beispielsweise in dünnen Gewebeabschnitten einer Biopsieprobe oder einer einlagigen Zellschicht (z.B. Blutzellen oder von einander getrennte Zellen einer Gewebekultur). Die Amplifikation kann auch in intakten ganzen Zellen oder fixierten Zellen durchgeführt werden. Beispielsweise können PCR-, RT-PCR-, oder LCR-Amplifikationsverfahren, so wie dies auf dem Fachgebiet bekannt ist, in situ durchgeführt werden, beispielsweise unter Verwendung einer Polymerase oder Ligase, eines Primers oder von Primem und (Desoxy)-Ribonucleosid-Triphosphaten (wenn eine Polymerase verwendet wird) und reverser Transkriptase und einem Primer (wenn RNA transkribiert und die cDNA nachgewiesen werden soll) an fixierten, permeabilisierten oder mikroinjizierten Zellen, um so die Ziel-hTRT-RNA oder -DNA zu amplifizieren. hTRT-RNA enthaltende Zellen (z.B. Telomerase-positive Zellen) oder eine gewünschte hTRT-DNA-Sequenz können dann nachgewiesen werden. Dieses Verfahren ist oft dann zweckmässig, wenn Fluoreszenz-markierte dNTPs, Primer oder andere Bestandteile in Verbindung mit Mikroskopie, einer FACS-Analyse oder äquivalenten Verfahren verwendet werden. In alternative embodiments, isolation of nucleic acids (e.g. total RNA or poly-A + RNA) from the biological sample is not required prior to performing amplification, hybridization, or other assays. These embodiments have certain advantages in the event that hTRT-RNA is to be measured because they reduce the likelihood that hTRT-mRNA will be lost during isolation and handling. For example, many amplification methods such as PCR and RT-PCR (reverse transcriptase-PCR) can be carried out using permeabilized cells (histological samples and FACS analyzes) lysed whole cells or high cell fractions, such as certain cell extracts. Preferably steps are taken to preserve the integrity of the target nucleic acid (e.g. mRNA) if necessary (e.g. by adding RNAase inhibitors). Amplification and hybridization assays can also be carried out in situ, for example in thin tissue sections of a biopsy sample or a single-layer cell layer (e.g. blood cells or separate cells of a tissue culture). The amplification can also be carried out in intact whole cells or fixed cells. For example, PCR, RT-PCR, or LCR amplification methods, as is known in the art, can be performed in situ, for example using a polymerase or ligase, a primer or primer and (deoxy) ribonucleoside triphosphates (when using a polymerase) and reverse transcriptase and a primer (when transcribing RNA and detecting the cDNA) on fixed, permeabilized or micro-injected cells so as to amplify the target hTRT RNA or DNA. Cells containing hTRT-RNA (e.g. telomerase positive cells) or a desired hTRT-DNA sequence can then be detected. This method is often useful when fluorescence-labeled dNTPs, primers or other components are used in connection with microscopy, FACS analysis or equivalent methods.

2) Auf Amplifikation basierende Assays 2) Assays based on amplification

In einer Ausführungsform sind die erfindungsgemässen Assays zum Nachweis eines hTRT-Gens oder -Genprodukts auf Amplifikation basierende Assays. In einem auf Amplifikation basierenden Assay wird ein gesamtes hTRT-Gen oder -Transkript oder ein Teil davon (z.B. mRNA oder cDNA, nachstehend als «Ziel» bezeichnet) amplifiziert und das amplifizierte Produkt wird anschliessend direkt oder indirekt nachgewiesen. Falls kein Gen oder Genprodukt vorhanden ist, das als Matrize wirken kann, wird kein Amplifikationsprodukt hergestellt (z.B. mit der erwarteten Grösse) oder die Amplifikation ist unspezifisch und es entsteht üblicherweise kein einzelnes Amplifikationsprodukt. Im Gegensatz dazu wird die Zielsequenz amplifiziert, wenn das fragliche Gen oder Genprodukt vorhanden ist, was somit die Anwesenheit und/oder die Menge an entsprechendem Gen oder an entsprechender mRNA anzeigt. Auf Amplifikation basierende Assays sind dem Fachmann gut bekannt. In one embodiment, the assays according to the invention for the detection of an hTRT gene or gene product are assays based on amplification. In an assay based on amplification, an entire hTRT gene or transcript or a part thereof (e.g. mRNA or cDNA, hereinafter referred to as “target”) is amplified and the amplified product is then directly or indirectly detected. If there is no gene or gene product that can act as a template, no amplification product is produced (e.g. with the expected size) or the amplification is unspecific and usually no single amplification product is produced. In contrast, the target sequence is amplified when the gene or gene product in question is present, thus indicating the presence and / or the amount of the corresponding gene or mRNA. Assays based on amplification are well known to those skilled in the art.

Die vorliegende Erfindung stellt eine grosse Vielzahl an Primern und Sonden zum Nachweis von hTRT-Genen und Genprodukten bereit. Solche Primer und Proben sind zu dem hTRT-Gen oder Genprodukt ausreichend komplementär, um an die Zielnucleinsäure hybridisieren zu können. Primer weisen üblicherweise eine Länge von mindestens 6 Basen auf, vorzugsweise von etwa 10 bis etwa 100 Basen, mehr bevorzugt von etwa 12 bis etwa 50 Basen und am meisten bevorzugt zwischen etwa 14 und etwa 25 Basen. Der Fachmann wird nach Lesen dieser Beschreibung in der Lage sein, unter Verwendung von Routineverfahren Primer auszuwählen, mit denen das gesamte hTRT-Gen oder -Genprodukt oder ein Anteil davon amplifiziert werden kann oder mit denen zwischen Genprodukt-Varianten, hTRT-Alielen etc. unterschieden werden kann. In Tabelle 2 sind Beispiele von Primern aufgezählt, die für eine PCR-Amplifikation der hTRT oder spezifischer hTRT-Genprodukte oder -Bereiche von Nutzen sind. Es ist auf dem Fachgebiet bekannt, dass einzelne Oligomere (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5 545 522) «nested sets» von Oligomeren oder sogar ein Pool von degenerierten Oligomeren für die Amplifikation verwendet werden kann, beispielsweise, wie dies für die nachstehend beschriebene Amplifikation der Tetrahymena TRT-cDNA veranschaulicht wird. The present invention provides a wide variety of primers and probes for the detection of hTRT genes and gene products. Such primers and samples are sufficiently complementary to the hTRT gene or gene product to be able to hybridize to the target nucleic acid. Primers are usually at least 6 bases in length, preferably from about 10 to about 100 bases, more preferably from about 12 to about 50 bases, and most preferably between about 14 and about 25 bases. After reading this description, the person skilled in the art will be able, using routine methods, to select primers with which the entire hTRT gene or gene product or a portion thereof can be amplified or with which a distinction can be made between gene product variants, hTRT alleles, etc. can be. Table 2 lists examples of primers that are useful for PCR amplification of the hTRT or specific hTRT gene products or regions. It is known in the art that single oligomers (see, for example, U.S. Patent No. 5,545,522), nested sets of oligomers, or even a pool of degenerate oligomers, can be used for amplification, for example, as described below Amplification of the Tetrahymena TRT cDNA is demonstrated.

Die Erfindung stellt eine Vielzahl von Verfahren zur Amplifikation und zum Nachweis eines hTRT- The invention provides a variety of methods for the amplification and detection of an hTRT

69 69

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Gens oder -Genprodukts bereit. Dazu gehören die Polymerase-Kettenreaktion (einschliesslich aller Varianten, beispielsweise die Reverse-Transkriptase-PCR; das «Sunrise Amplification System» (Oncor, Inc., Gaithersburg MD) und zahlreiche weitere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren. In einer veranschaulichenden Ausführung wird die PCR-Amplifikation in einer Lösung von 50 nl durchgeführt, die die Nu-cleinsäureprobe enthält (z.B. eine durch reverse Transkription von hTRT-RNA erhaltene cDNA), jeweils 100 nM dNTP (dATP, dCTP, dGTP und dTTP; Pharmacia LKB Biotechnology, NJ) der (die) hTRT-spe-zifischen PCR-Primer, 1 Einheit Taq-Polymerase (Perkin Elmer, Norwalk CT), 1 x PCR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris, pH-Wert 8,3 bei Raumtemperatur, 1,5 mM M9Cb und 0,01% Gelatine), wobei die Amplifikation mit etwa 30 Cyclen durchgeführt wird, jeweils 45 Sekunden bei 94°C, 45 Sekunden bei 45°C und 90 Sekunden bei 72°C. Es können jedoch natürlich für bestimmte Reaktionen zur Optimierung der PCR-Amplifikation zahlreiche Variationen eingeführt werden. Gene or gene product. These include the polymerase chain reaction (including all variants, for example reverse transcriptase PCR; the “Sunrise Amplification System” (Oncor, Inc., Gaithersburg MD) and numerous other methods known in the art. In an illustrative embodiment, the PCR -Amplification carried out in a solution of 50 nl, which contains the nucleic acid sample (eg a cDNA obtained by reverse transcription of hTRT-RNA), each 100 nM dNTP (dATP, dCTP, dGTP and dTTP; Pharmacia LKB Biotechnology, NJ) (die) hTRT-specific PCR primer, 1 unit Taq polymerase (Perkin Elmer, Norwalk CT), 1 x PCR buffer (50 mM KCl, 10 mM Tris, pH 8.3 at room temperature, 1, 5mM M9Cb and 0.01% gelatin), amplification being performed with about 30 cycles, 45 seconds each at 94 ° C, 45 seconds at 45 ° C and 90 seconds at 72 ° C. However, it can of course be used for certain reactions numerous variants for optimizing the PCR amplification ations are introduced.

Zu weiteren geeigneten Zielamplifikationsverfahren gehören die Ligase-Kettenreaktion (LCR) (siehe z.B. Wu und Wallace, Genomics 4 (1989), 560; Landegren etal., Science 241 (1988), 1077, Barany, Proc. Nati. Acad. Sci. USA88 (1991), 189 und Barringer et al., Gene 89 (1990), 117), die Strangver-drängungs-Amplifikation (SDA) (siehe z.B. Walter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA89 (1992) 392-396); die Transkriptions-Amplifikation (siehe z.B. Kwoh et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 86 (1989), 1173), «self-sustained-sequence»-Replikation (3SR) (siehe z.B. Fahyet al., PCR Methods Appi. 1 (1992) 2 und Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 87 (1990) 1874); die Nucleinsäuresequenz basierte Amplifikation (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario; siehe z.B. Compton, Nature 350 (1991) 91); das Tran-skriptions-basierte Amplifikationssystem (TAS); und das «self-sustained-sequence»-Replikationssystem (SSR). Jede der vorstehenden Veröffentlichungen ist aufgrund der Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen. Eine zweckmässige PCR-Variante ist der PCR-ELISA (z.B. Boehringer Mannheim Kat. Nr. 1 636 111), wobei Digoxigenin-dUTP in das PCR-Produkt eingebaut wird. Das PCR-Re-aktionsgemisch wird denaturiert und mit einem Biotin-markierten Oligonucleotid hybridisiert, das so entworfen wurde, dass es an eine interne Sequenz des PCR-Produkts binden kann. Die Hybridisierungs-produkte werden an mit Streptavid in überzogenen Trägem immobilisiert und unter Verwendung von anti-Digoxigenin-Antikörpern nachgewiesen. Beispiele für in vitro-Amplifikationsverfahren, die dem Fachmann ausreichend Anleitung geben, können in folgenden Veröffentlichungen gefunden werden: PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich (Herausg.) Freeman Press, New York, NY (1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Herausg. Innis, Gelfland, Snisky, und White, Academic Press, San Diego, CA (1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19 (1991), 4967; Eckert und Kunkel, PCR Methods and Applications 1 (1991), 17; PCR, Herausg. McPherson, Quirkes und Taylor, IRL Press, Oxford; U.S.Patent Nr. 4 683 195, 4 683 202 und 4 965 188; Barringer et al., Gene 89 (1990), 117; Kwoh et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 86 (1989), 1173; Guatelli et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 87 (1990) 1874; Lomell et al., J. Clin. Chem. 35 (1989), 1826. Jedes dieser Dokumente ist durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen. Other suitable target amplification methods include ligase chain reaction (LCR) (see, for example, Wu and Wallace, Genomics 4 (1989), 560; Landegren et al., Science 241 (1988), 1077, Barany, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88 (1991), 189 and Barringer et al., Gene 89 (1990), 117), strand displacement amplification (SDA) (see, for example, Walter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89 (1992) 392 -396); transcription amplification (see, for example, Kwoh et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 86 (1989), 1173), "self-sustained-sequence" replication (3SR) (see, for example, Fahy et al., PCR Methods Appi. 1 (1992) 2 and Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874); nucleic acid sequence based amplification (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario; see e.g. Compton, Nature 350 (1991) 91); the transcription-based amplification system (TAS); and the “self-sustained-sequence” replication system (SSR). Each of the above publications is to be regarded as part of this description by reference. A convenient PCR variant is the PCR-ELISA (e.g. Boehringer Mannheim Cat. No. 1 636 111), whereby digoxigenin-dUTP is incorporated into the PCR product. The PCR reaction mixture is denatured and hybridized with a biotin-labeled oligonucleotide designed to bind to an internal sequence of the PCR product. The hybridization products are immobilized on streptavid in coated supports and detected using anti-digoxigenin antibodies. Examples of in vitro amplification methods that give the person skilled in the art sufficient guidance can be found in the following publications: PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich (ed.) Freeman Press, New York, NY (1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Ed. Innis, Gelfland, Snisky, and White, Academic Press, San Diego, CA (1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19 (1991), 4967; Eckert and Kunkel, PCR Methods and Applications 1 (1991), 17; PCR, ed. McPherson, Quirkes and Taylor, IRL Press, Oxford; U.S. Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202 and 4,965,188; Barringer et al., 1990, Gene 89: 117; Kwoh et al., Proc. Nati. Acad. Be. USA 86: 1173; Guatelli et al., Proc. Nati. Acad. Be. USA 87 (1990) 1874; Lomell et al., J. Clin. Chem. 35 (1989), 1826. Each of these documents is to be considered part of this description by reference.

Amplifizierte Produkte können direkt analysiert werden (z.B. anhand der durch Gelelektrophorese bestimmten Grösse), durch Hybridisierung an einer Zielnucleinsäure, die an einem festen Träger immobilisiert ist, beispielsweise einem Kügelchen, einer Membran, einer Scheibe oder einem Chip; durch Sequenzierung; immunologisch (z.B. durch PCR-ELISA), durch Nachweis eines fluoreszierenden phosphoreszierenden oder radioaktiven Signals oder durch eine Reihe weiterer allgemein bekannter Massnahmen. In einem veranschaulichenden Beispiel für ein Nachweisverfahren werden beispielsweise PCR-Primer verwendet, die mit Hilfe von Haamadelschleifen («hairpin loops») vergrössert wurden, die mit Fluorescein verknüpft sind und einem Benzoesäure-Derivat, das als quenchende Verbindung dient, so dass nur dann eine Fluoreszenz emittiert wird, wenn sich die Primer zur Bindung ihrer Ziele entfalten und Replikation stattfindet. Amplified products can be analyzed directly (e.g. based on the size determined by gel electrophoresis), by hybridization to a target nucleic acid immobilized on a solid support, e.g. a bead, membrane, disc or chip; by sequencing; immunologically (e.g. by PCR-ELISA), by detection of a fluorescent phosphorescent or radioactive signal or by a number of other generally known measures. In an illustrative example of a detection method, PCR primers are used, for example, which were enlarged with the aid of hairpin loops, which are linked to fluorescein and a benzoic acid derivative, which serves as a quenching compound, so that only then Fluorescence is emitted when the primers unfold to bind their targets and replication takes place.

Da hTRT-mRNA normalerweise als ein äusserst seltenes Transkript exprimiert wird, das selbst in Te-lomerasepositiven Zellen nur in sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden ist, ist es oft wünschenswert, das durch einen Amplifikationsschritt erhaltene Signal zu optimieren oder zu verstärken. Eine Möglichkeit dafür besteht in der Erhöhung der Anzahl von Amplifikationszyklen. Beispielsweise sind zwar 20 bis 25 Cyclen für die Amplifikation der meisten mRNAs mittels der Polymerasekettenreaktion unter Standardreaktionsbedingungen ausreichend, der Nachweis von hTRT-mRNA kann jedoch in vielen Proben in Abhängigkeit von dem Nachweisformat 30 bis 35 Amplifikationszyklen benötigen. Durch sorgfältige Auswahl der Amplifikationsbedingung einschliesslich der Anzahl von Amplifikationszyklen kann ein Assay entworfen werden, der nur dann zu einem Amplifikationsprodukt führt, wenn eine Schwellenwertmenge des Ziels in der Testprobe vorhanden ist (d.h. so dass nur Proben mit einem hohen Spiegel an hTRT-mRNA ein «positives» Ergebnis zeigen). Darüber hinaus sind Verfahren bekannt, um das durch Amplifikation der Zielsequenz erzeugte Signal zu verstärken. Zu den Verfahren zur Verbesserung der Fähigkeit ein amplifiziertes Ziel nachzuweisen, gehören Signalamplifikationssysteme, beispielsweise: Si-gnalamplifikation mit verzweigter DNA «branched DNA signal amplification» (s. z.B. US-Patent Nr. 5 124 246 und Urdea, Bio/Tech. 12 (1994), 926); das «tyramide»-Signalamplifikationssystem (TSA, Du-Pont); Amplifikation mit einem katalytischen Signal («catalytic signal amplification» (CSA) (Dako); Q Beta-Replicase-Systeme (Tyagi et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 93 (1996), 5395) etc. Since hTRT mRNA is usually expressed as an extremely rare transcript that is only present in very low concentrations even in telomerase positive cells, it is often desirable to optimize or amplify the signal obtained by an amplification step. One way to do this is to increase the number of amplification cycles. For example, although 20 to 25 cycles are sufficient for the amplification of most mRNAs by means of the polymerase chain reaction under standard reaction conditions, the detection of hTRT-mRNA can require 30 to 35 amplification cycles in many samples, depending on the detection format. By carefully selecting the amplification condition, including the number of amplification cycles, an assay can be designed that only leads to an amplification product if a threshold amount of the target is present in the test sample (ie, so that only samples with a high level of hTRT mRNA are " positive »show result). In addition, methods are known for amplifying the signal generated by amplifying the target sequence. Methods for improving the ability to detect an amplified target include signal amplification systems, for example: signal amplification with branched DNA "branched DNA signal amplification" (see, for example, US Pat. No. 5,124,246 and Urdea, Bio / Tech. 12 (1994) , 926); the «tyramide» signal amplification system (TSA, Du-Pont); Amplification with a catalytic signal ("catalytic signal amplification" (CSA) (Dako); Q beta replicase systems (Tyagi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93 (1996), 5395) etc.

Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass unabhängig von dem verwendeten Amplifikationsverfah-ren eine Vielzahl von auf dem Fachgebiet bekannten quantitativen Verfahren zur Quantifizierung ver70 It will be apparent to those skilled in the art that regardless of the amplification method used, a variety of quantitative methods known in the art for quantification are used

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

wendet werden kann, falls dies erwünscht ist. Beispielsweise können, falls erwünscht, zwei oder mehr Polynucleotide in einer einzigen Probe gemeinsam amplifiziert werden. Dieses Verfahren kann als ein zweckmässiges Verfahren zur Quantifizierung der hTRT-mRNA-Menge in einer Probe verwendet werden, da sowohl die reverse Transkription als auch Amplifikationsreaktionen im gleichen Reaktionsgemisch für ein Ziel- und Kontroll-Polynucleotid durchgeführt werden. Die gemeinsame Amplifikation mit dem Kontrollpolynucleotid (das normalerweise in einer bekannten Konzentration oder einer bekannten Kopienanzahl vorhanden ist) kann zur Normalisierung der Anzahl von Zellen in der Probe im Vergleich zu der Menge an hTRT in der Probe verwendet werden. Zu den geeigneten Kontroll-Polynucleotiden für Coamplifikationsreaktionen gehören DNA von «housekeeping»-Genen exprimierte RNA, konstitutiv expri-mierte Gene und in vitro synthetisierte RNAs oder DNAs, die zu dem Reaktionsgemisch gegeben werden. Zu den endogenen Kontroll-Polynucleotiden zählen solche, die bereits in der Probe vorhanden sind, während exogene Kontroll-Polynucleotide einer Probe zugegeben werden, wodurch eine Reaktion «mit Schuss» («spiked») erzeugt wird. Zu den Beispielen für Kontroll-RNAs zählen ß-Actin-RNA, GAPDH RNA, snRNAs, hTR und endogen exprimierte 28S rRNA (siehe Khan et al., Neuro sei. Lett. 147 (1992), 114. Zu exogenen Kontroll-Polynucleotiden gehören eine synthetische AW106-cRNA, die von pAW 106 als «sense»-Strang mittels T7-Polymerase synthetisiert werden kann. Damit das Coamplifi-kationsverfahren für eine Quantifizierung verwendet werden kann, müssen sowohl die Kontroll-Nucleoti-de als auch die Ziel-Polynucleotide üblicherweise in einem linearen Bereich amplifiziert werden. Ausführliche Protokolle für eine quantitative PCR können gefunden werden in PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. N.Y. (1990) und Ausubelet al., a.a.O. (Einheit 15) und Diaco, R. (1995) Practical Considérations for the Design of Quantitative PCR Assays, in PCR Stratégies, S. 84-108, Innis et al. Herausg. Academic Press, New York. can be used if desired. For example, if desired, two or more polynucleotides can be amplified together in a single sample. This method can be used as a convenient method for quantifying the amount of hTRT mRNA in a sample since both reverse transcription and amplification reactions are carried out in the same reaction mixture for a target and control polynucleotide. Common amplification with the control polynucleotide (which is normally present in a known concentration or number of copies) can be used to normalize the number of cells in the sample compared to the amount of hTRT in the sample. Suitable control polynucleotides for co-amplification reactions include DNA expressed from housekeeping genes, constitutively expressed genes and RNAs or DNAs synthesized in vitro that are added to the reaction mixture. Endogenous control polynucleotides include those that are already present in the sample, while exogenous control polynucleotides are added to a sample, creating a "spiked" reaction. Examples of control RNAs include β-actin RNA, GAPDH RNA, snRNAs, hTR and endogenously expressed 28S rRNA (see Khan et al., Neuro. Lett. 147 (1992), 114). Exogenous control polynucleotides include a synthetic AW106 cRNA that can be synthesized by pAW 106 as a “sense” strand using T7 polymerase In order for the co-amplification method to be used for quantification, both the control nucleotides and the target polynucleotides must be used Usually amplified in a linear region. Detailed protocols for quantitative PCR can be found in PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. NY (1990) and Ausubel et al., loc 15) and Diaco, R. (1995) Practical Considérations for the Design of Quantitative PCR Assays, in PCR Stratégies, pp. 84-108, Innis et al. Ed. Academic Press, New York.

In Abhängigkeit von der Sequenz des endogenen oder exogenen Standards können unterschiedliche Primersätze für die Coamplifikationsreaktion verwendet werden. Bei einem Verfahren, der sogenannten kompetitiven Amplifikation, beinhaltet die quantitative PCR die gleichzeitige Coamplifikation mit einer bekannten Menge einer Kontrollsequenz, wobei die gleichen Primer, die für die Zielnucleinsäure verwendet werden, benutzt werden (ein Paar mit zwei Primern). In einer alternativen Ausführungsform, die als nicht-kompetitive Amplifikation bekannt ist, werden die Kontrollsequenz und die Zielsequenz (z.B. hTRT-cDNA) unter Verwendung unterschiedlicher Primer (d.h. 2 Paare von 2 Primern) amplifiziert. In einer weiteren alternativen Ausführungsform, der sogenannten semi-kompetitiven Amplifikation, werden drei Primer vewendet, wobei einer hTRT-spezifisch, einer kontroll-spezifisch und einer in der Lage ist, sich sowohl an Zielsequenzen als auch Kontrollsequenzen anzulagern. Semi-kompetitive Amplifikation wird in dem US-Patent Nr. 5 629 154 beschrieben, das hiermit durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden kann. Depending on the sequence of the endogenous or exogenous standard, different primer sets can be used for the coamplification reaction. In one method, so-called competitive amplification, quantitative PCR involves co-amplification with a known amount of a control sequence, using the same primers used for the target nucleic acid (a pair with two primers). In an alternative embodiment, known as non-competitive amplification, the control sequence and the target sequence (e.g. hTRT cDNA) are amplified using different primers (i.e. 2 pairs of 2 primers). In a further alternative embodiment, the so-called semi-competitive amplification, three primers are used, one being hTRT-specific, one control-specific and one being able to attach to both target sequences and control sequences. Semi-competitive amplification is described in U.S. Patent No. 5,629,154, which is hereby incorporated by reference into this specification.

3) Auf Hybridisierung basierende Assays a) Allgemeines 3) Assays based on hybridization a) General

Eine Vielzahl von Verfahren für die spezifische Messung von DNA und RNA mit Hilfe von Nuclein-säure-Hybridisierungsverfahren sind dem Fachmann bekannt (siehe Sambrook et al., a.a.O.). Auf Hybridisierung basierende Assays betreffen Assays, bei denen eine Nucleinsäuresonde an eine Zielnucleinsäure hybridisiert wird. Üblicheweise sind die erfindungsgemässen Nucleinsäure-Hybridisierungssonden vollständig oder im wesentlichen identisch zu einer zusammenhängenden Sequenz des hTRT-Gens oder der entsprechenden RNA-Sequenz. Vorzugsweise sind die Nucleinsäuresonden mindestens etwa 10 Basen lang, mehr bevorzugt mindestens etwa 20 Basen und am meisten bevorzugt etwa 200 Basen oder länger. Verfahren zur Auswahl von Nucleinsäuresondensequenzen zur Vewendung bei der Nu-cleinsäurehybridisierung werden in Sambrook et al., a.a.O. diskutiert. In einigen Formaten sind entweder das Ziel oder die Sonde oder beide immobilisiert. Bei der immobilisierten Nucleinsäure kann es sich um eine DNA, RNA oder ein anderes Oligo- oder Polynucleotid handeln. Diese können natürlich oder nicht natürlich vorkommende Nucleotide, Nucleotidanaloga oder Rückgrate umfassen. Solche Assays können in verschiedenen Formaten vewendet werden, beispielsweise: Southern, Northern «dot» und «slot» Blots, Polynucleotid- oder Oligonucleotid-Arrays mit hoher Dichte (z.B. GeneChips\Affymetrix), Messstäbchen, Messnadeln («pins»), Chips oder Kügelchen. All diese Verfahren sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt und sie stellen die Basis vieler im Handel erhältlicher diagnostischer Kits dar. Hybridi-sierungstechniken werden allgemein beschrieben in Harnes et al., Herausg. Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach IRL Press (1985); Gali und Pardue, Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 63 (1969), 378-383 und John et al., Nature, 223 (1969) 582-587. A large number of methods for the specific measurement of DNA and RNA using nucleic acid hybridization methods are known to the person skilled in the art (see Sambrook et al., Cited above). Assays based on hybridization relate to assays in which a nucleic acid probe is hybridized to a target nucleic acid. The nucleic acid hybridization probes according to the invention are usually completely or essentially identical to a coherent sequence of the hTRT gene or the corresponding RNA sequence. Preferably, the nucleic acid probes are at least about 10 bases long, more preferably at least about 20 bases, and most preferably about 200 bases or longer. Methods for selecting nucleic acid probe sequences for use in nucleic acid hybridization are described in Sambrook et al., Supra. discussed. In some formats, either the target or the probe or both are immobilized. The immobilized nucleic acid can be a DNA, RNA or another oligonucleotide or polynucleotide. These can include natural or non-naturally occurring nucleotides, nucleotide analogs or backbones. Such assays can be used in various formats, for example: Southern, Northern "dot" and "slot" blots, high-density polynucleotide or oligonucleotide arrays (e.g. GeneChips \ Affymetrix), measuring sticks, measuring pins ("pins"), chips or Globules. All of these methods are well known in the art and are the basis of many commercially available diagnostic kits. Hybridization techniques are generally described in Harnes et al., Eds. Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach IRL Press (1985); Gali and Pardue, Proc. Nati. Acad. Be. USA, 63 (1969), 378-383 and John et al., Nature, 223 (1969) 582-587.

Dem Fachmann sind eine Vielzahl von Formaten für die Nucleinsäurehybridisierung bekannt. Beispielsweise stellt die direkte Hybridisierung ein übliches Format dar, wobei eine Zielnucleinsäure mit einer markierten komplementären Sonde hybridisiert wird. Gewöhnlich werden markierte Nucleinsäuren für die Hybridisierung vewendet, wobei die Markierung das nachweisbare Signal liefert. Ein Verfahren zur Beurteilung der Anwesenheit, des Fehlens oder der Menge an hTRT-mRNA besteht in der Durchführung eines Northern-Transfers von RNA aus einer Probe und der Hybridisierung mit einer markierten hTRT-spezifischen Nucleinsäuresonde, so wie dies in Beispiel 2 veranschaulicht ist. Wie bereits vorste- A variety of formats for nucleic acid hybridization are known to those skilled in the art. For example, direct hybridization is a common format in which a target nucleic acid is hybridized with a labeled complementary probe. Labeled nucleic acids are usually used for hybridization, the label providing the detectable signal. One method of assessing the presence, absence, or amount of hTRT mRNA is to perform Northern transfer of RNA from a sample and hybridize with a labeled hTRT-specific nucleic acid probe, as illustrated in Example 2. As already mentioned

71 71

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

hend angemerkt, ist hTRT-mRNA, wenn überhaupt, in den meisten Zellen nur in sehr geringen Mengen vorhanden. Somit ist es bei der Verwendung einer Northern-Hybridisierung oft wünschenswert, einen Amplifikationsschritt oder alternativ grosse Mengen an Ausgangs-RNA zu verwenden. Ein zweckmässiges Verfahren zur Beurteilung der Anwesenheit, des Fehlens oder der Menge von hTRT-Proteine codierender DNA in einer Probe umfasst einen Southern-Transfer von DNA aus einer Probe und die Hybridisierung mit einer markierten hTRT-spezifischen Nucleinsäuresonde. Note that, if at all, hTRT mRNA is only present in very small amounts in most cells. Thus, when using Northern hybridization, it is often desirable to use an amplification step or, alternatively, large amounts of starting RNA. A convenient method for assessing the presence, absence, or amount of DNA encoding hTRT proteins in a sample involves Southern transfer of DNA from a sample and hybridization with a labeled hTRT-specific nucleic acid probe.

Zu weiteren üblichen Hybridisierungsformaten gehören «Sandwich»-Assays und Kompetitions- oder Verdrängungs-Assays. Bei den «Sandwich»-Assays handelt es sich um im Handel erhältliche zweckmässige Hybridisierungsassays zum Nachweis und zur Isolierung von Nucleinsäuresequenzen. In solchen Assays werden eine «Einfang»-Nucleinsäure, die kovalent an einen festen Träger immobilisiert ist, und eine markierte «Signal»-Nucleinsäure in Lösung verwendet. Die biologische oder klinische Probe liefert die Zielnucleinsäure. Die «Einfang»-Nucleinsäure- und die «Signal»-Nucleinsäuresonde hybridisieren mit der Zielnucleinsäure, wobei ein «Sandwich»-Hybridisierungskomplex gebildet wird. Für die Wirksamkeit ist es erforderlich, dass die Signalnucleinsäure mit der «Einfang»-Nucleinsäure hybridisieren kann. Other common hybridization formats include "sandwich" assays and competition or displacement assays. The "sandwich" assays are commercially available, convenient hybridization assays for the detection and isolation of nucleic acid sequences. In such assays, a "capture" nucleic acid covalently immobilized on a solid support and a labeled "signal" nucleic acid in solution are used. The biological or clinical sample provides the target nucleic acid. The "capture" nucleic acid and the "signal" nucleic acid probes hybridize to the target nucleic acid, forming a "sandwich" hybridization complex. Efficacy requires that the signal nucleic acid can hybridize with the "capture" nucleic acid.

b) Auf einem Chip und auf einer Scheibe basierende Assays b) Assays based on a chip and on a disk

Die vorliegende Erfindung stellt ferner auf einer Sonde basierende Hybridisierungsassays für hTRT-Genprodukte bereit, wobei Arrays von immobilisierten Oligonucleotiden oder Oligonucleotiden verwendet werden, an die eine hTRT-Nucleinsäure hybridisieren kann (d.h. an einige, jedoch normalerweise nicht an alle, oder nicht einmal an die meisten der immobilisierten Oligo- oder Polynucleotide). Oligonucleotid-Arrays mit hoher Dichte oder Polynucleotid-Arrays stellen ein Mittel für den effizienten Nachweis des Vorhandenseins und der Merkmale (z.B. der Sequenz) einer Zielnucleinsäure (z.B. ein hTRT-Gen, -mRNA oder -cDNA) dar. Es sind Techniken bekannt, mit denen sich Arrays herstellen lassen, die Tausende von zu definierten Sequenzen komplementäre Oligonucleotide an definierten Positionen auf einer Oberfläche enthalten, wobei für die Synthese in situ photolithographische Verfahren verwendet werden (siehe z.B. US-Patent Nr.5 578 832, 5 556 752 und 5 510 270; F odor et al., Science 251 (1991), 767; Pease et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 91 (1994), 5022 und Lockhart et al., Nature Biotech 14 (1996); 1675) oder andere Verfahren zur schnellen Synthese und Anlagerung von definierten Oligonucleotiden (Blanchard etal., Biosensors & Bioelectronics 11 (1996), 687). Bei Anwendung dieser Verfahren werden Oligonucleotide (z.B. 20-mere) mit bekannter Sequenz direkt auf einer Oberfläche, beispielsweise auf einer Scheibe mit derivatisiertem Glas synthetisiert. Normalerweise ist das hergestellte Array redundant mit einigen Oligonucleotidsonden auf dem Chip, die für das nachzuweisendeh TRT-Polynucleotid spezifisch sind. The present invention also provides probe-based hybridization assays for hTRT gene products using arrays of immobilized oligonucleotides or oligonucleotides to which an hTRT nucleic acid can hybridize (ie, to some, but not usually all, or not even all of them) most of the immobilized oligo- or polynucleotides). High-density oligonucleotide arrays or polynucleotide arrays are a means for the efficient detection of the presence and characteristics (eg the sequence) of a target nucleic acid (eg an hTRT gene, mRNA or cDNA). Techniques are known with which can produce arrays which contain thousands of oligonucleotides complementary to defined sequences at defined positions on a surface, using photolithographic methods for the synthesis in situ (see, for example, US Pat. Nos. 5,578,832, 5,556,752 and 5,510 270; F odor et al., Science 251 (1991), 767; Pease et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 (1994), 5022 and Lockhart et al., Nature Biotech 14 (1996); 1675 ) or other methods for the rapid synthesis and attachment of defined oligonucleotides (Blanchard et al., Biosensors & Bioelectronics 11 (1996), 687). Using these methods, oligonucleotides (e.g. 20-mers) with a known sequence are synthesized directly on a surface, for example on a disk with derivatized glass. Typically, the array produced is redundant with some on-chip oligonucleotide probes specific for the TRT polynucleotide to be detected.

Kombinationen von Oligonucleotidsonden können so entworfen werden, dass alternativ gespleisste mRNAs nachgewiesen werden können oder um festzustellen, welches von verschiedenen hTRT-Allelen in einer bestimmten Probe exprimiert wird. Combinations of oligonucleotide probes can be designed so that alternatively spliced mRNAs can be detected or to determine which of different hTRT alleles is expressed in a particular sample.

In einer veranschaulichenden Ausführungsform wird durch reverse Transkription von Gesamt-RNA von einer Testzelle präparierte cDNA amplifiziert (z.B. mittels PCR). Normalerweise ist das amplifizierte Produkt markiert, beispielsweise durch Einbau eines fluoreszenzmarkierten dNTPs. Die markierten cDNAs werden dann mit einem Chip hybridisiert, der Oligonucleotidsonden umfasst, die zu verschiedenen Untersequenzen des hTRT-Gens komplementär sind. Die Hybridisierungspositionen werden bestimmt (z.B. gemäss den allgemeinen Verfahren von Shalon et al., Genome Research 6 (1996), 639 oder Schena et al., Genome Res. 6 (1996) 639) und aus dem Hybridisierungsmuster die Sequenz (oder eine andere Information) durch auf diesem Fachgebiet gut bekannte Verfahren abgeleitet. In an illustrative embodiment, reverse transcription of total RNA from a test cell prepares cDNA (e.g., using PCR). The amplified product is normally labeled, for example by incorporating a fluorescence-labeled dNTP. The labeled cDNAs are then hybridized to a chip that includes oligonucleotide probes that are complementary to various sub-sequences of the hTRT gene. The hybridization positions are determined (for example according to the general methods of Shalon et al., Genome Research 6 (1996), 639 or Schena et al., Genome Res. 6 (1996) 639) and the sequence (or other information) from the hybridization pattern ) derived by methods well known in the art.

In einer Ausführungsform werden zwei cDNA-Proben mit dem gleichen Chip hybridisiert, wobei jede mit einer unterschiedlichen Fluoreszenzgruppe markiert ist. Das Verhältnis der Hybridisierung jeder markierten Probe zu Stellen, die komplementär zu dem hTRT-Gen sind, wird dann untersucht. Falls beide Proben die gleiche Menge an hTRT-mRNA enthalten, beträgt das Verhältnis der beiden Fluoreszenzsignale 1:1. Dabei muss das Signal der Fluoreszenzen nicht so eingestellt werden, dass jedem Unterschied in der molaren Empfindlichkeit der Fluoreszenzsignale Rechnung getragen wird. In one embodiment, two cDNA samples are hybridized to the same chip, each labeled with a different fluorescent group. The ratio of hybridization of each labeled sample to sites complementary to the hTRT gene is then examined. If both samples contain the same amount of hTRT mRNA, the ratio of the two fluorescence signals is 1: 1. The signal of the fluorescence does not have to be set so that any difference in the molar sensitivity of the fluorescence signals is taken into account.

Im Gegensatz dazu wird das in der zweiten Probe verwendete Fluoreszenzsignal vorherrschen, falls die erste Probe von einem gesunden (oder Kontroll)-Gewebe stammt, und die zweite Probe von einem kanzerösen Gewebe. In contrast, if the first sample is from healthy (or control) tissue and the second sample from cancerous tissue, the fluorescence signal used in the second sample will prevail.

c) In situ-Hybridisierung c) In situ hybridization

Ein alternatives Verfahren zum Nachweis der Expression eines ein hTRT-Protein codierenden Gens ist in situ-Hybridisierung. In situ-Hybridisierungsassays sind gut bekannt und allgemein beschrieben in Angerer et al., Methods Enzymol. 152 (1987), 649-660 und Ausubel et al., a.a.O. In einem in situ-Hy-bridisierungsassay sind Zellen oder Gewebeproben an einem festen Träger fixiert, der sich typischerweise in einem permeabilisierten Zustand befindet, typischerweise auf einer Glasscheibe. Die Zellen werden dann mit einer Hybridisierungslösung bei einer moderaten Temperatur hybridisiert, um so die Anlagerung von markierten Nucleinsäuresonden zu gestatten (z.B. 35S-markierte Ribosonden, Fluoreszenz72 An alternative method for detecting the expression of a gene encoding an hTRT protein is in situ hybridization. In situ hybridization assays are well known and generally described in Angerer et al., Methods Enzymol. 152: 649-660 (1987) and Ausubel et al., Op. Cit. In an in situ hybridization assay, cells or tissue samples are fixed to a solid support that is typically in a permeabilized state, typically on a glass sheet. The cells are then hybridized with a hybridization solution at a moderate temperature to allow the attachment of labeled nucleic acid probes (e.g. 35S-labeled riboprobes, fluorescence72

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

markierte Sonden), die komplementär oder im wesentlichen komplementär zu hTRT sind. Freie Sonde wird durch Waschen und/oder Spaltung mit Nuclease entfernt und die gebundene Sonde wird direkt auf der Scheibe durch Autoradiographie oder ein geeignetes bildgebendes Verfahren, sowie dies auf dem Fachgebiet bekannt ist, sichtbar gemacht. labeled probes) that are complementary or substantially complementary to hTRT. Free probe is removed by washing and / or cleaving with nuclease and the bound probe is visualized directly on the disc by autoradiography or an appropriate imaging technique as is known in the art.

4) Spezifischer Nachweis von Varianten 4) Specific detection of variants

Wie bereits vorstehend angemerkt und in den Beispielen (z.B. Beispiel 9) veranschaulicht, können Amplifikations-Primer oder -Sonden ausgewählt werden, um Amplifikationsprodukte zu liefern, die spezifische Deletion, Verkürzungen und Insertionen umspannen, wodurch der Nachweis von spezifischen Varianten oder Anormalitäten in der hTRT-mRNA erleichtert wird. Ein Beispiel eines Genprodukts einer hTRT-Variante, das nachgewiesen werden kann, ist eine hTRT-RNA, wie beispielsweise ein vorstehend und in Beispiel 9 beschriebenes Produkt (SEQ. ID. Nr. 4). Die biologische Funktion der 182-Variante(n) ist nicht bekannt, falls überhaupt eine vorhanden ist. Das von der Variante vermutlich codierte verkürzte hTRT-Protein könnte jedoch an einer Regulation von Telomerase-Aktivität beteiligt sein, beispielsweise durch Assemblierung eines nicht-funktionellen Telomerase-RNPs, der Telomerase-Bestandteile titriert. Alternativ könnte- eine negative Regulation von Telomerase-Aktivität durch Steuerung der hTRT-prä-mRNA (naszierende mRNA) auf eine Weise erzielt werden, die zu einer Eliminierung der mRNA und der Herabsetzung des hTRT-mRNA-Spiegels führt. Aus diesen und weiteren Gründen ist die Möglichkeit 182-Varianten entdecken zu können von Nutzen. Zusätzlich mag es gelegentlich wünschenswert sein, in Proben, in denen zwei Spezies von hTRT-RNA vorhanden sind (z.B. eine 182-hTRT-RNA und eine das hTRT-Protein mit vollständiger Länge codierende hTRT-RNA), deren relative und/oder absolute Häufigkeit zu vergleichen. As noted above and illustrated in the examples (e.g., Example 9), amplification primers or probes can be selected to provide amplification products that span specific deletions, truncations, and insertions, thereby detecting specific variants or abnormalities in the hTRT -mRNA is facilitated. An example of a gene product of an hTRT variant that can be detected is an hTRT-RNA, such as a product described above and in Example 9 (SEQ. ID. No. 4). The biological function of the 182 variant (s) is not known, if one is available at all. The shortened hTRT protein presumably encoded by the variant could, however, be involved in regulating telomerase activity, for example by assembling a nonfunctional telomerase RNP which titrates telomerase components. Alternatively, negative regulation of telomerase activity could be achieved by controlling the hTRT pre-mRNA (nascent mRNA) in a manner that leads to elimination of the mRNA and a reduction in the hTRT mRNA level. For these and other reasons, it is useful to be able to discover 182 variants. In addition, it may occasionally be desirable in samples in which two species of hTRT-RNA are present (eg, a 182-hTRT-RNA and an hTRT-RNA encoding the full-length hTRT protein), their relative and / or absolute frequency to compare.

Die Erfindung stellt eine Vielzahl von Verfahren zum Nachweis von 182-Varianten bereit. Beispielsweise führt eine Amplifikation unter Verwendung von Primerpaaren, die die 182-Basenpaardeletion umspannen, zu Produkten unterschiedlicher Grösse, die den deletierten und undeletierten hTRT-RNAs (falls beide vorhanden sind) entsprechen und diese können auf Grund ihrer Grösse (z.B. durch Gelelektrophorese) unterschieden werden. Zu den Beispielen für Primerpaare, die zur Amplifikation des Bereichs» der die 182 bp-Deletion umspannt, nützlich sind, gehören TCPl.14 und TCP1.15 (Primersatz 1) oder TCP1.25 und bTCP6 (Primersatz 2) (siehe Tabelle 2). Diese Primerpaare können getrennt verwendet werden oder in einem PCR-Experiment mit «nested»-Primern, wobei der Primersatz 1 zuerst benutzt wird. Es ist für den Fachmann auch offensichtlich, dass Hybridisierungsverfahren (z.B. Northern-Hybridisierung) oder RNAse-Schutzassays zum Nachweis von hTRT-RNA-Varianten oder um solche Varianten unterscheiden zu können, unter Verwendung der erfindungsgemässen hTRTNucleinsäuresonde verwendet werden können. The invention provides a variety of methods for the detection of 182 variants. For example, amplification using primer pairs spanning the 182 base pair deletion results in products of different sizes which correspond to the deleted and undeleted hTRT-RNAs (if both are present) and these can be distinguished on the basis of their size (for example by gel electrophoresis) . Examples of primer pairs useful for amplifying the region spanning the 182 bp deletion include TCP.14 and TCP1.15 (primer set 1) or TCP1.25 and bTCP6 (primer set 2) (see Table 2) . These primer pairs can be used separately or in a PCR experiment with «nested» primers, whereby primer set 1 is used first. It is also obvious to the person skilled in the art that hybridization methods (e.g. Northern hybridization) or RNAse protection assays for the detection of hTRT-RNA variants or in order to be able to differentiate between such variants can be used using the hTRT nucleic acid probe according to the invention.

Ein weiteres geeignetes Verfahren umfasst PCR-Amplifikation (oder ein äquivalentes Verfahren)mit drei Primern. Ein Primer ist spezifisch zu jeder hTRT-RNA-Spezies (z.B. wie in Tabelle 4 veranschaulicht) und ein Primer ist komplementär zu beiden Spezies (z.B. TCP1.25 (2270-2288)) - analog zu dem semi-kompetitiven quantitativen PCR-Verfahren, das ausführlicher vorstehend beschrieben ist. Ein Beispiel eines Primers, der spezifisch zu SEQ. ID.Nr. 1 ist, ist ein Primer, der sich innerhalb der Sequenz von 182 Nucleotiden (d.h. Nucleotide 2345 bis 2526 von SEQ. ID. Nr. 1) anlagert, z.B. TCP1.73 (2465-2445). Ein Primer, der zu SEQ. ID. Nr. 4 (eine Al82-Variante) spezifisch ist, ist beispielsweise ein Primer, der an die Nucleotide 2358-2339 von SEQ. ID. Nr. 4 anlagert (d.h. der Stelle, die der Insertion von 182 Nucleotiden in SEQ. ID. Nr. 1 entspricht). Die absolute Häufigkeit der Al82-hTRT-mRNA-Spezi-es oder deren relative Häufigkeit im Vergleich zu der Spezies, die das hTRT-Protein mit vollständiger Länge codiert, kann bezüglich einer Korrelation mit dem Zellstatus (z.B. der Fähigkeit zur unbegrenzten Proliferation) analysiert werden. Zahlreiche weitere Primer können ausgehend von der vorliegenden Beschreibung ausgewählt werden. Another suitable method involves PCR amplification (or an equivalent method) with three primers. A primer is specific to each hTRT-RNA species (e.g. as illustrated in Table 4) and a primer is complementary to both species (e.g. TCP1.25 (2270-2288)) - analogous to the semi-competitive quantitative PCR method, which is described in more detail above. An example of a primer that is specific to SEQ. ID No. 1 is a primer that attaches within the sequence of 182 nucleotides (i.e. nucleotides 2345 to 2526 of SEQ. ID. No. 1), e.g. TCP1.73 (2465-2445). A primer that goes to SEQ. ID. No. 4 (an Al82 variant) is, for example, a primer attached to nucleotides 2358-2339 of SEQ. ID. No. 4 (i.e. the site corresponding to the insertion of 182 nucleotides in SEQ. ID. No. 1). The absolute abundance of the Al82-hTRT mRNA species or its relative abundance compared to the species encoding the full-length hTRT protein can be analyzed for correlation with cell status (eg, ability to proliferate indefinitely) . Numerous other primers can be selected based on the present description.

73 73

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

TABELLE 4 TABLE 4

BEISPIELE FÜR PRIMER PRIMER EXAMPLES

182-Spezies (z.B. SEQ. ID. Nr. 4) spezifischer Primer: 5'-GGCACTGGACGTAGGACGTG-3 hTRT (SEQ. ID. Nr. 1) spezifischer Primer (TCPl.73): 182 species (e.g. SEQ. ID. No. 4) specific primer: 5'-GGCACTGGACGTAGGACGTG-3 hTRT (SEQ. ID. No. 1) specific primer (TCPl.73):

5'-CACTGCTGGCCTCATTCAGGG-3 Gemeinsamer (vorwärts)-Primer (TCPl.25): 5'-CACTGCTGGCCTCATTCAGGG-3 common (forward) primer (TCPl.25):

5'-TACTGCGTGCGTCGGTATG-3 5'-TACTGCGTGCGTCGGTATG-3

Zu der weiteren hTRT-Genen von Varianten oder den entsprechenden Genprodukten, die nachgewiesen werden können, gehören solche, die durch Codons, die zu einem vorzeitigen Stop führen, Deletionen, Substitutionen oder Insertionen charakterisiert sind. Deletionen können anhand der verringerten Grösse des Gens, des mRNA-Transkripts oder der cDNA nachgewiesen werden. Auf ähnliche Weise können Insertionen anhand der gesteigerten Grösse des Gens, des mRNA-Transkripts oder der cDNA nachgewiesen werden. Insertionen und Deletionen können auch eine Verschiebung des Leserahmens hervorrufen, was zur Entstehung von Codons für einen frühzeitigen Stop oder längerer offener Leserahmen führt. Substitutionen können durch Hybridisierung mit einer Sonde nachgewiesen werden. Diese Veränderungen werden dadurch nachgewiesen, dass Veränderungen der Grösse der hTRT-Polypeptid-Variante untersucht werden (z.B. durch Western-Analyse) oder durch Hybridisierung oder spezifische Amplifikation, je nach dem, wie es zweckmässig erscheint. Alternativ können Mutationen durch Sequenzierung des Gens oder des Genprodukts gemäss Standardverfahren bestimmt werden. Darüber hinaus und wie bereits vorstehend angemerkt, können Amplifikationsassays und Hybridisierungssonden ausgewählt werden, um auf bestimmte Anormalitäten spezifisch abzielen zu können. Beispielsweise können Nucleinsäuresonden oder Amplifikationsprimer ausgewählt werden, die spezifisch mit der Region hybridisieren, die die Deletion, Substitution oder Insertion enthält bzw. diese spezifisch amplifiziert. An der Stelle, wo das hTRT-Gen eine solche Mutation enthält (1) hybridisiert die Sonde entweder nicht, oder die Amplifikationsreaktion liefert keine spezifische Amplifikation oder wird zu einer Veränderung der Grösse des Amplifikationsprodukts oder des Hybridisierungssignals führen; oder (2) die Sonde oder Amplifikationsreaktion umfasst die gesamte Deletion oder beide Enden der Deletion (Deletionsverbindungs-punkt) oder (3) ähnlicherweise können Sonden und Amplifikationsprimer ausgewählt werden, die spezifisch auf Punktmutationen oder Insertionen abzielen. The further hTRT genes of variants or the corresponding gene products which can be detected include those which are characterized by codons which lead to an early stop, deletions, substitutions or insertions. Deletions can be detected based on the reduced size of the gene, the mRNA transcript or the cDNA. In a similar manner, insertions can be detected based on the increased size of the gene, the mRNA transcript or the cDNA. Insertions and deletions can also cause a shift in the reading frame, which leads to the creation of codons for an early stop or longer open reading frames. Substitutions can be detected by hybridization with a probe. These changes are demonstrated by examining changes in the size of the hTRT polypeptide variant (e.g. by Western analysis) or by hybridization or specific amplification, depending on what appears appropriate. Alternatively, mutations can be determined by sequencing the gene or gene product according to standard procedures. In addition, and as noted above, amplification assays and hybridization probes can be selected to target specific abnormalities. For example, nucleic acid probes or amplification primers can be selected that hybridize specifically to the region that contains or specifically amplifies the deletion, substitution or insertion. Where the hTRT gene contains such a mutation (1) the probe either does not hybridize, or the amplification reaction does not provide specific amplification or will result in a change in the size of the amplification product or the hybridization signal; or (2) the probe or amplification reaction comprises the entire deletion or both ends of the deletion (deletion connection point) or (3) similarly probes and amplification primers can be selected which specifically target point mutations or insertions.

5) Nachweis von HTRT-Mutantenallelen 5) Detection of HTRT mutant alleles

Mutationen im hTRT-Gen könnten für die Entstehung einer Erkrankung verantwortlich sein oder könnten zu einem Krankheitszustand beitragen. Veränderungen der genomischen DNA von hTRT könnten die Spiegel der Gentranskription beeinflussen, zu Veränderungen von Aminosäureresten im hTRT-Prote-in führen, dazu führen, dass verkürzte hTRT-Polypeptide hergestellt werden, die Prozessierungswege der prä-mRNA ändern (was die hTRT-mRNA-Spiegel verändern kann) und auch weitere Konsequenzen zur Folge haben. Mutations in the hTRT gene could be responsible for the development of a disease or could contribute to a disease state. Changes in the genomic DNA of hTRT could affect the level of gene transcription, lead to changes in amino acid residues in the hTRT protein, lead to the production of truncated hTRT polypeptides, which change the processing routes of the pre-mRNA (which the hTRT-mRNA- Mirror can change) and also have further consequences.

Änderungen der genomischen DNA in Nicht-hTRT-Loci können auch die Expression von hTRT oder Telomerase durch Veränderung der Enzyme oder zellulären Prozesse beeinflussen, die für die Regulation der Expression von hTRT, hTR und Telomerase-assoziierten Proteinen verantwortlich sind, sowie für die Prozessierung und die RNP-Assemblierung und den Transport. Änderungen, die die hTRT-Expression, die Prozessierung oder RNP-Assemblierung betrefffen, könnten auch für den Verlauf einer Krebserkrankung, für Alterserkrankungen, für Krankheiten hinsichtlich eines DNA-Schadens etc. wichtig sein. Changes in genomic DNA in non-hTRT loci can also affect expression of hTRT or telomerase by altering the enzymes or cellular processes responsible for regulating expression of hTRT, hTR and telomerase-associated proteins, as well as processing and RNP assembly and transportation. Changes affecting hTRT expression, processing or RNP assembly could also be important for the course of cancer, for old-age diseases, for diseases related to DNA damage, etc.

Der Nachweis von Mutationen in hTRT-mRNA oder dem entsprechenden Gen und Genkontrollelementen kann auf vielfältige Weise gemäss den hier beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Dazu gehören folgende veranschaulichende Beispiele: Es kann ein Verfahren, das als «Primer-Scree-ning» bezeichnet wird, verwendet werden; es werden PCR-Primer entworfen, deren 3'-Enden sich an Nucleotide in einer Proben-DNA (oder RNA), die möglichenweise mutiert sind, anlagern. Falls die DNA (oder RNA) durch die Primer amplifiziert wird, paaren die 3'-Enden mit den Nucleotiden im Gen, falls die DNA nicht amplifiziert wird, dann paaren entweder eines oder beide Enden nicht mit den Nucleotiden im Gen, was die Anwesenheit einer Mutation anzeigt. Auf ähnliche Weise können Primer so entworfen werden, dass Punktmutationen unter Verwendung der Ligase-Kettenreaktion (LCR, vorstehend The detection of mutations in hTRT mRNA or the corresponding gene and gene control elements can be carried out in a variety of ways in accordance with the methods described here. These include the following illustrative examples: a method called primer screening can be used; PCR primers are designed whose 3 'ends attach to nucleotides in a sample DNA (or RNA) that may be mutated. If the DNA (or RNA) is amplified by the primers, the 3 'ends will pair with the nucleotides in the gene, if the DNA is not amplified then either or both ends will not pair with the nucleotides in the gene, indicating the presence of one Mutation indicates. Similarly, primers can be designed to target point mutations using the ligase chain reaction (LCR, supra

74 74

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

beschrieben) nachgewiesen werden können. Eine weitere Technik, die bei dem vorliegenden Verfahren angewandt werden kann, basiert auf Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus, RFLP (Pourzand, C., Cerutti, P. Mutat. Res. 288 (1993), 113-121). Dabei wird ein Southern-Blot menschlicher genomischer DNA, die mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten wurde, mit einer hTRT-spezifischen Sonde hybridisiert. Unterschiede hinsichtlich der Fragmentanzahl oder Fragmentgrössen zwischen der Probe und einer Kontrolle zeigen eine Veränderung der experimentellen Probe an, normalerweise eine Insertion oder Deletion. Einzelstrang-Konformationspolymorphismus, SSCP, (Orrita, M. et. al., PNAS USA 86 (1989), 2766-70) ist eine weitere Technik, die für das vorliegende Verfahren angewandt werden kann. SSCP basiert auf der unterschiedlichen Wanderung von denaturierten einzelsträngigen DNAs des Wildtyps bzw. einer Mutante (die normalerweise durch PCR erzeugt wurden). Einzelsträngige DNA nimmt eine dreidimensionale Konformation ein, die sequenzspezifisch ist. Auch Sequenzunterschiede, die lediglich eine einzelne Base betreffen, können zu einer Mobilitätsverschiebung in einem nicht-denaturie-renden Gel führen. SSCP ist aufgrund seiner Einfachheit eines der am häufigsten verwendeten Verfahren zum Mutations-Screenen. Eine weitere Technik, die bei dem vorliegenden Verfahren angewandt werden kann, ist die denaturierende Gradientengelelektrophorese, DGGE (Myers et al., Methods in En-zymology 155 (1987), 501-527). Mittels DGGE können Mutationen aufgrund des Schmelzverhaltens doppelsträngiger DNA identifiziert werden. Zur Analyse des Schmelzprofils von experimenteller DNA und Kontroll-DNA wird eine spezielle Ausrüstung für denaturierende Elektrophorese verwendet: Eine eine Mutation enthaltende DNA besitzt eine unterschiedliche Mobilität in diesen Gelsystemen im Vergleich zur Kontrolle. Die diskutierten Beispiele veranschaulichen allgemein angewandte Verfahren, darüber hinaus gibt es zahlreiche andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind. described) can be demonstrated. Another technique that can be used in the present method is based on restriction fragment length polymorphism, RFLP (Pourzand, C., Cerutti, P. Mutat. Res. 288 (1993), 113-121). A Southern blot of human genomic DNA, which was cleaved with various restriction enzymes, is hybridized with an hTRT-specific probe. Differences in the number or size of fragments between the sample and a control indicate a change in the experimental sample, usually an insertion or deletion. Single strand conformation polymorphism, SSCP, (Orrita, M. et. Al., PNAS USA 86 (1989), 2766-70) is another technique that can be used for the present method. SSCP is based on the different migration of denatured single-stranded wild-type or mutant DNAs (which were normally generated by PCR). Single-stranded DNA adopts a three-dimensional conformation that is sequence-specific. Sequence differences that only affect a single base can also lead to a mobility shift in a non-denaturing gel. Because of its simplicity, SSCP is one of the most commonly used methods for mutation screening. Another technique that can be used in the present method is denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE (Myers et al., Methods in Enzymology 155 (1987), 501-527). Using DGGE, mutations can be identified based on the melting behavior of double-stranded DNA. Special equipment for denaturing electrophoresis is used to analyze the melting profile of experimental DNA and control DNA: A DNA containing a mutation has a different mobility in these gel systems compared to the control. The examples discussed illustrate common methods, and there are numerous other methods known to those skilled in the art.

F. Analyse des Karyotyps F. Analysis of the karyotype

Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren und Reagenzien zur Analyse des Karyotyps oder für andere Chromosomen-Analysen bereit, wobei hTRT-Sequenzsonden verwendet werden und/oder der Nachweis oder die Lokalisierung von hTRT-Gensequenzen in Chromosomen eines Patienten, einer menschlichen Zellinie oder einer nichtmenschlichen Zelle. In einer Ausführungsform kann die Amplifikation (d.h. eine Veränderung in der Kopienanzahl), Deletion (d.h. partielle Deletion), Insertion, Substitution oder Veränderungen in der chromosomalen Lokalisierung (z.B. Translokation) eines hTRT-Gens mit dem Vorhandensein eines pathologischen Zustands oder einer Prädisposition für die Entwicklung eines pathologischen Zustands (z.B. Krebs) korreliert sein. The present invention further provides methods and reagents for karyotype analysis or other chromosome analysis using hTRT sequence probes and / or the detection or localization of hTRT gene sequences in chromosomes of a patient, human cell line or non-human cell . In one embodiment, the amplification (ie, a change in the number of copies), deletion (ie, partial deletion), insertion, substitution, or changes in the chromosomal localization (eg translocation) of an hTRT gene with the presence of a pathological condition or a predisposition for it Development of a pathological condition (e.g. cancer) must be correlated.

Es wurde in der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass in normalen menschlichen Zellen das hTRT-Gen nahe dem Telomer von Chromosom 5p kartiert (siehe das nachstehende Beispiel 5). Der am nächsten benachbarte STS-Marker ist D5S678. Dessen Lage kann zur Identifizierung von Markern verwendet werden, die mit dem hTRT-Gen eng gekoppelt sind. Diese Marker können zur Identifizierung von YACs, STSs, Cosmiden, BACs, lambda-Phagen oder P1-Phagen oder anderen Clonen verwendet werden, die genomische hTRT-Sequenzen oder -Kontrollelemente enthalten. Die Marker oder die Lage des Gens können verwendet werden, um menschliche Gewebeproben hinsichtlich Veränderungen in der normalen Lage des hTRT Gens, dessen Organisation oder Sequenz, die mit dem Auftreten eines Krebstyps oder einer Krankheit assoziiert sind, zu untersuchen. Diese Information kann dann für die Diagnose oder Prognose hinsichtlich der beteiligten Krankheit oder des Krebses verwendet werden. Darüber hinaus kann die Art jeder Veränderung des hTRT-Gens eine Information über die Ursachen liefern, durch die Zellen unsterblich werden. Beispielsweise könnte ein Translokationsereignis anzeigen, dass die Aktivierung der hTRT-Expression in manchen Fällen durch Austausch des hTRT-Promotors gegen einen anderen Promotor geschieht, der die hTRT-Transkription auf ungünstige Weise steuert. Erfindungsgemässe Verfahren und Reagenzien dieses Typs können zur Entwicklung von Strategien verwendet werden, mit denen hTRT-Aktivierungsprozesse bekämpft werden können. Die Lage ist auch für die Bestimmung der Natur der hTRT-Genrepression in normalen somatischen Zellen von Nutzen, beispielsweise bei der Untersuchung, ob die Lage innerhalb eines Teils von nicht-exprimierendem Heterochro-matin ist. Assays, die auf einer Nuclease-Überempfindlichkeit basieren, zur Unterscheidung zwischen Heterochromatin und Euchromatin sind beispielsweise beschrieben in Wu et al., Cell 16 (1979), 797; Groudine und Weintraub, Cell 30 (1982), 131 und Gross und Garrard, Ann. Rev. Biochem. 57 (1988), 159. It was found in the present invention that in normal human cells the hTRT gene was mapped near the telomer of chromosome 5p (see Example 5 below). The closest neighboring STS marker is D5S678. Its location can be used to identify markers that are closely linked to the hTRT gene. These markers can be used to identify YACs, STSs, cosmids, BACs, lambda phages or P1 phages, or other clones that contain hTRT genomic sequences or controls. The marker or location of the gene can be used to examine human tissue samples for changes in the normal location of the hTRT gene, its organization, or sequence associated with the occurrence of a cancer type or disease. This information can then be used to diagnose or predict the disease or cancer involved. In addition, the nature of any change in the hTRT gene can provide information about the causes by which cells become immortal. For example, a translocation event could indicate that activation of hTRT expression occurs in some cases by replacing the hTRT promoter with another promoter that controls hTRT transcription in an unfavorable manner. Methods and reagents of this type according to the invention can be used to develop strategies with which hTRT activation processes can be combated. The location is also useful for determining the nature of hTRT gene repression in normal somatic cells, for example when examining whether the location is within a portion of non-expressing heterochromatin. Assays based on nuclease hypersensitivity to distinguish between heterochromatin and dichromatin are described, for example, in Wu et al., Cell 16 (1979), 797; Groudine and Weintraub, Cell 30 (1982), 131 and Gross and Garrard, Ann. Rev. Biochem. 57: 159 (1988).

In einer Ausführungsform werden Veränderungen des hTRT-Gens durch Analyse des Karyotyps identifiziert, wobei zahlreiche auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren verwendet werden können. Ein zweckmässiges Verfahren ist die in situ-Hybridisierung (ISH). Wenn in situ-Hybridisierungsverfahren für die Karyotyp-Analyse verwendet werden, wird normalerweise eine nachweisbare oder nachweisbar markierte Probe mit einer chromosomalen Probe in situ zur Lokalisierung einer hTRT-Gensequenz hybridisiert. Im allgemeinen umfasst ISH einen oder mehrere der folgenden Schritte: (1) Fixierung des Gewebes, der Zelle oder der anderen zu analysierenden biologischen Struktur; (2) Vorhybridisierungsbehand-lung der biologischen Struktur zur Steigerung der Zugänglichkeit der Ziel-DNA (z.B. Denaturierung mit Hitze oder Alkali) und zur Verringerung einer unspezifischen Bindung (z.B. durch Blockierung des Hybridisierungsvermögens repetitiver Sequenzen (z.B. mittels menschlicher genomischer DNA); (3) Hybridisierung von einer oder mehreren Nucleinsäuresonden (z.B. übliche Nucleinsäuren, PNAs oder an- In one embodiment, changes in the hTRT gene are identified by analysis of the karyotype, and numerous methods known in the art can be used. A convenient method is in situ hybridization (ISH). When in situ hybridization methods are used for karyotype analysis, a detectable or detectably labeled sample is usually hybridized with a chromosomal sample in situ to locate an hTRT gene sequence. Generally, ISH comprises one or more of the following steps: (1) fixation of the tissue, cell or other biological structure to be analyzed; (2) Prehybridization treatment of the biological structure to increase the accessibility of the target DNA (e.g. denaturation with heat or alkali) and to reduce non-specific binding (e.g. by blocking the hybridization ability of repetitive sequences (e.g. using human genomic DNA); (3) Hybridization of one or more nucleic acid probes (e.g. common nucleic acids, PNAs or other

75 75

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

dere Nucleinsâure-Analoge) mit der Nucleinsäure in der biologischen Struktur oder dem Gewebe; (4) Waschschritte nach der Hybridisierung zur Entfernung von Nucleinsäurefragmenten, die während der Hybridisierung nicht gebunden waren und (5) Nachweis der hybridisierten Nucleinsäurefragmente. Die in jedem dieser Schritte verwendeten Reagenzien und anzuwendenden Bedingungen hängen von der jeweiligen Anwendung ab. Natürlich können diese Schritte auf vielfältige Weise modifiziert werden, wie dies dem Fachmann bekannt ist. their nucleic acid analogs) with the nucleic acid in the biological structure or the tissue; (4) post-hybridization wash steps to remove nucleic acid fragments that were not bound during hybridization; and (5) detection of the hybridized nucleic acid fragments. The reagents and conditions to be used in each of these steps depend on the application. Of course, these steps can be modified in a variety of ways, as is known to those skilled in the art.

In einer Ausführungsform der ISH wird die hTRT-Sonde mit einem Fluoreszenzmarker markiert (in situ Fluoreszenzhybridisierung; «FISH»). Normalerweise ist es wünschenswert, eine «zwei-Farben»-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung anzuwenden, bei denen zwei mit einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff markierte Sonden verwendet werden. Eine Testsonde, die mit der gewünschten hTRT-Sequenz hybridisiert, wird mit einem Farbstoff markiert, und eine Kontrollsonde, die mit einem anderen Bereich hybridisiert wird, wird mit einem zweiten Farbstoff markiert. Als Kontrollsonde kann eine Nucleinsäure verwendet werden, die mit einem stabilen Bereich des gewünschten Chromosoms, beispielsweise dem Zentromerbereich, hybridisiert. Auf diese Weise kann Unterschieden in der Effizienz der Hybridisierung, die von Probe zu Probe schwanken kann, Rechnung getragen werden. In one embodiment of the ISH, the hTRT probe is labeled with a fluorescence marker (in situ fluorescence hybridization; “FISH”). It is usually desirable to use a “two-color” fluorescence in situ hybridization that uses two probes labeled with a different fluorescent dye. A test probe that hybridizes with the desired hTRT sequence is labeled with one dye, and a control probe that hybridizes with another region is labeled with a second dye. A nucleic acid which hybridizes with a stable region of the desired chromosome, for example the centromer region, can be used as the control probe. In this way, differences in the efficiency of hybridization, which can vary from sample to sample, can be taken into account.

Die ISH-Verfahren zum Nachweis chromosomaler Anomalien (z.B. FISH) können an Nanogrammen-gen der fraglichen Nucleinsäuren durchgeführt werden. Es können in Paraffin eingebettete normale Gewebe oder Tumorsektionen verwendet werden, aber auch frisches oder gefrorenes Material, Gewebe oder Sektionen. Da FISH bei diesem begrenzten Material angewandt werden kann, können auch Präparationen von nichtkultivierten primären Tumoren, die nur in Spuren hergestellt werden können («touch»-Präparationen) verwendet werden (siehe z.B. Kallioniemi et al., Cytogenet. Cell Genet. 60 (1992) 190). Beispielsweise können kleine Biopsie-Gewebeproben von Tumoren für «touch»-Präparationen verwendet werden (siehe z.B. Kallioniemi et al., a.a.O.). Es können auch kleine Anzahlen von Zellen analysiert werden, die durch Saugbiopsie erhalten wurden oder Zellen in Körperflüssigkeiten (z.B. Blut, Urin, Sputum etc.) analysiert werden. Für eine pränatale Diagnose zählen Amnionflüssigkeit, Blut der Mütter etc. zu den geeigneten Proben. Zweckmässige für die hier beschriebenen Verfahren und Reagenzien anwendbare Hybridisierungsprotokolle sind beschrieben in Pinkel et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 85 (1988), 9138; EP-A1 0 430 402; Choo (Herausg. Methods in Molecular Biology Vol. 33: In Situ Hybridi-zation Protocols, Humana Press-Totowa, New Jersey (1994) und Kallioniemi et al., a.a.O. The ISH methods for the detection of chromosomal anomalies (e.g. FISH) can be carried out on nanograms of the nucleic acids in question. Normal tissues or tumor sections embedded in paraffin can be used, but also fresh or frozen material, tissues or sections. Since FISH can be used with this limited material, preparations of uncultivated primary tumors that can only be produced in traces (“touch” preparations) can also be used (see, for example, Kallioniemi et al., Cytogenet. Cell Genet. 60 (1992 ) 190). For example, small biopsy tissue samples from tumors can be used for "touch" preparations (see e.g. Kallioniemi et al., Op. Cit.). Small numbers of cells obtained by suction biopsy or cells in body fluids (e.g. blood, urine, sputum etc.) can also be analyzed. Suitable prenatal diagnoses include amniotic fluid, maternal blood, etc. Appropriate hybridization protocols that can be used for the methods and reagents described here are described in Pinkel et al., Proc. Nati. Acad. Be. USA 85: 9138 (1988); EP-A1 0 430 402; Choo (Ed. Methods in Molecular Biology Vol. 33: In Situ Hybridization Protocols, Humana Press-Totowa, New Jersey (1994) and Kallioniemi et al., Op. Cit.

Zu weiteren für die Karyotyp-Analyse nützlichen Verfahren zählen beispielsweise Verfahren wie quantitatives Southern-Blotting, quantitative PCR oder vergleichende genomische Hybridisierung (Kallioniemi et al., Science 258 (1992), 818), wobei die erfindungsgemässen hTRT-Sonden und -Primer zur Identifikation einer Amplifikation, Deletion, Insertion, Substitution von hTRT-Sequenzen in Chromosomen in einer biologischen Probe oder andere Rearrangements von hTRT-Sequenzen verwendet werden können. Other methods useful for karyotype analysis include, for example, methods such as quantitative Southern blotting, quantitative PCR or comparative genomic hybridization (Kallioniemi et al., Science 258 (1992), 818), the hTRT probes and primers according to the invention for identification amplification, deletion, insertion, substitution of hTRT sequences in chromosomes in a biological sample or other rearrangements of hTRT sequences can be used.

G. TRT-Polypeptid-Assays G. TRT polypeptide assays

1) Allgemeines 1. General

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Reagenzien zum Nachweis und zur Quantifizierung von hTRT-Polypeptidenbereit. Zu diesen Verfahren zählen analytische biochemische Verfahren, beispielsweise Elektrophorese, Massenspektroskopie, «Gelshift», Kapillarelektrophorese, chromatographische Verfahren, beispielsweise Grössenausschluss, Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), (TLC), Hyperdiffusionschromatographie etc., oder verschiedene immunologische Verfahren, beispielsweise Flüssigkeits- oder Gel-Präzipitin-Reaktion, Immundiffusion (Einzel- oder Doppel-), Immunelektrophorese, Radioimmunassay (RIA), enzymverbundene Immunabsorptionsbestimmungen (ELISAs), Immunfluo-reszenz-Assays, Western-Blotting, Massenspektrometrie und weitere Verfahren, die nachstehend beschrieben werden und für den Fachmann nach Lesen dieser Beschreibung offensichtlich sind. The present invention provides methods and reagents for the detection and quantification of hTRT polypeptides. These methods include analytical biochemical methods, for example electrophoresis, mass spectroscopy, "gel shift", capillary electrophoresis, chromatographic methods, for example size exclusion, high pressure liquid chromatography (HPLC), (TLC), hyperdiffusion chromatography, etc., or various immunological methods, for example liquid or gel precipitin -Reaction, immunodiffusion (single or double), immunoelectrophoresis, radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), immunofluorescence assays, Western blotting, mass spectrometry and other methods, which are described below and for the person skilled in the art after reading this description are obvious.

2) Elektrophoretische Assays 2) Electrophoretic assays

In einer Ausführungsform werden die hTRT-Polypeptide durch elektrophoretische Proteinauftrennung nachgewiesen. Ein Aspekt betrifft ein zweidimensionales Elektrophoresesystem. In one embodiment, the hTRT polypeptides are detected by electrophoretic protein separation. One aspect relates to a two-dimensional electrophoresis system.

Mittel zum Nachweis von Proteinen unter Verwendung von Elektrophoreseverfahren sind dem Fachmann gut bekannt (siehe allgemein R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182 (1990): Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y.). Means for the detection of proteins using electrophoresis methods are well known to the person skilled in the art (see generally R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, NY; Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182 (1990): Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., NY).

In einer ähnlichen Ausführungsform wird ein «mobility shift»-Assay verwendet (siehe z.B. Ausubel et al., a.a.O.). Beispielsweise assoziiert markierte hTR mit hTRT und wandert mit veränderter Mobilität bei der Elektrophorese in einem nicht-denaturierten Polyacrylamidgel etc. Somit führt beispielsweise dann, wenn eine markierte hTR-Sonde oder ein markierter Telomerase-Primer mit einer hTRT enthaltenden Probe vermischt wird oder mit hTRT coexprimiert wird, (z.B. in einem zellfreien Expressionssystem) das Vorhandensein von hTRT-Protein (oder eines hTRT codierenden Polynucleotids) in der Probe zu einer nachweisbaren Änderung der hTRT-Mobilität. In a similar embodiment, a mobility shift assay is used (see e.g. Ausubel et al., Supra). For example, labeled hTR associates with hTRT and migrates with changed mobility in electrophoresis in a non-denatured polyacrylamide gel etc. Thus, for example, if a labeled hTR probe or a labeled telomerase primer is mixed with a sample containing hTRT or co-expressed with hTRT the presence of hTRT protein (or a polynucleotide encoding hTRT) in the sample (eg in a cell-free expression system) results in a detectable change in hTRT mobility.

76 76

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

3) Immunassays A) Allgemeines 3) Immunoassays A) General

Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Nachweis von hTRT-Polypeptiden bereit, wobei eine oder mehrere erfindungsgemässe Antikörperreagenzien verwendet werden (d.h. Immunassays). Wie hier verwendet, bezeichnet ein Immunassay einen Assay, bei dem ein Antikörper (wie hier ausführlich definiert gehören dazu auch Fragmente, chimäre und andere bindende Agenzien) verwendet wird, der spezifisch an ein hTRT-Polypeptid oder -Epitop bindet. Erfindungsgemässe Antikörper können durch eine Vielzahl von dem Fachmann bekannten Verfahren, beispielsweise den vorstehend beschriebenen, hergestellt werden. The present invention also provides methods for the detection of hTRT polypeptides using one or more antibody reagents according to the invention (i.e. immunoassays). As used herein, an immunoassay refers to an assay that uses an antibody (including fragments, chimeric, and other binding agents, as defined herein in detail) that specifically binds to an hTRT polypeptide or epitope. Antibodies according to the invention can be produced by a large number of methods known to the person skilled in the art, for example those described above.

Es ist eine Anzahl von gut etablierten immunologischen Bindungs-Assayformaten bekannt, die für die Durchführung der Erfindung geeignet sind (siehe z.B. US-Patente 4 366 241, 4 376 110, 4 517 288 und 4 837 168 und Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, Herausg. Academic Press, Inc. New York (1993); Basic and Clinical Immunology, 7. Ausgabe, Stites & Terr Herausg. (1991) Harlow und Lane, a.a.O.) z.B. Kapitel 14) und Ausubel et al., a.a.O. (z.B. Kapitel 11), wobei jedes dieser Dokumente durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden kann. Typischeweise wird in immunologischen Bindungsassays (oder Immunassays) ein «Einfang»-Agens zur spezifischen Bindung an den Analyten und oft auch dessen Immobilisierung verwendet. In einer Ausführungsform ist das «Einfang»-Agens eine Einheit, die an ein hTRT-Polypeptid oder eine Untersequenz spezifisch bindet, beispielsweise ein antihTRT-Antikörper. In einer alternativen Ausführungsform kann das «Einfang»-Agens unter solchen Bedingungen an hTRT assoziiertes Protein oder -RNA binden, bei denen das hTRT-assoziierte Molekül an die hTRT gebunden bleibt (so dass, falls das hTRT-assoziierte Molekül immobilisiert ist, das hTRT-Protein ähnlich immobilisiert ist). In Assays, bei denen ein hTRT-assoziiertes Molekül eingefangen wird, wird normalerweise das assoziierte hTRT-Protein, beispielsweise mittels eines anti-hTRT-Antikörpers oder ähnlichem nachgewiesen werden. Immunassays zum Nachweis von Proteinkomplexen sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z.B. Harlow und Lane, a.a.O., S. 583). A number of well-established immunological binding assay formats are known which are suitable for practicing the invention (see, for example, U.S. Patents 4,366,241, 4,376,110, 4,517,288 and 4,837,168 and Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, ed. Academic Press, Inc. New York (1993); Basic and Clinical Immunology, 7th edition, Stites & Terr Ed. (1991) Harlow and Lane, op Chapter 14) and Ausubel et al., Loc. Cit. (e.g. Chapter 11), each of which may be considered part of this description by reference in its entirety and for all purposes. Typically, a "capture" agent is used in immunological binding assays (or immunoassays) for specific binding to the analyte and often also its immobilization. In one embodiment, the "capture" agent is a unit that specifically binds to an hTRT polypeptide or a sub-sequence, for example an antihTRT antibody. In an alternative embodiment, the "capture" agent can bind to hTRT-associated protein or RNA under conditions in which the hTRT-associated molecule remains bound to the hTRT (so that if the hTRT-associated molecule is immobilized, the hTRT -Protein is similarly immobilized). In assays in which an hTRT-associated molecule is captured, the associated hTRT protein will normally be detected, for example by means of an anti-hTRT antibody or the like. Immunoassays for the detection of protein complexes are known in the art (see e.g. Harlow and Lane, op. Cit., P. 583).

Normalerweise wird das zu untersuchenden hTRT-Genprodukt direkt oder indirekt mittels einer nachweisbaren Markierung nachgewiesen. Die in dem Assay verwendete spezielle Markierung bzw. die nachweisbare Gruppe ist normalerweise kein kritischer Aspekt der Erfindung solange diese nicht die spezifische Bindung des in dem Assay verwendeten Antikörpers oder den Antikörper wesentlich stört. Die Markierung kann mit dem «Einfang»-Agens kovalent verknüpft sein (z.B. ein anti-TRT-Antikörper) oder er kann an eine dritte Einheit angeknüpft sein, beispielsweise einem anderen Antikörper, der beispielsweise an das hTRT-Polypeptid spezifisch bindet (an ein anderes Epitop als das, das von dem «Einfang»-Agens erkannt wird, das «Einfang»-Agens (z.B. ein anti-(erster Antikörper) Immunglobulin); ein anti-TRT-Antikörper; ein Antikörper, der an einen anti-TRT-Antikörper bindet oder ein Antikörper/Te-lomerase-Komplex (z.B. über die Bindung an ein assoziiertes Molekül, beispielsweise ein Telomeraseas-soziiertes Protein). Andere Proteine, die an dem in dem Assay verwendeten Antikörper binden können, z.B. Protein A oder Protein G, können auch markiert sein. In einigen Ausführungsformen kann es zweckmässig sein, mehr als ein markiertes Molekül zu verwenden (d.h. solche, die voneinander unterschieden werden können). Zusätzlich kann ein markierter Antikörper, der das Protein oder die RNA, die mit dem hTRT-Protein assoziiert ist, erkennt, verwendet werden, wenn das durch das «Einfang»-Agens (z.B. ein anti-hTRT-Antikörper) gebundene (beispielsweise immobilisierte) Ziel ein Komplex ist (d.h. ein Komplex aus hTRT und einem TRT-assoziierten Protein, hTR oder einem anderen TRT-assoziierten Molekül. Wenn es sich bei dem Komplex um einen Protein/Nucleinsäure-Komplex (z.B. TRT-hTR) handelt, kann das Reportermolekül ein Polynucleotid oder ein anderes Molekül (z.B. ein Enzym) sein, das die RNA-Komponente des Komplexes erkennt. Normally, the hTRT gene product to be examined is detected directly or indirectly by means of a detectable label. The specific label or detectable group used in the assay is normally not a critical aspect of the invention as long as it does not substantially interfere with the specific binding of the antibody used in the assay or the antibody. The label can be covalently linked to the “capture” agent (for example an anti-TRT antibody) or it can be linked to a third unit, for example another antibody that specifically binds to the hTRT polypeptide, for example (to another Epitope as that recognized by the "capture" agent, the "capture" agent (e.g. an anti (first antibody) immunoglobulin); an anti-TRT antibody; an antibody linked to an anti-TRT Antibody binds or an antibody / telomerase complex (eg via binding to an associated molecule, for example a telomeraseas-associated protein). Other proteins which can bind to the antibody used in the assay, for example protein A or protein G, may also be labeled In some embodiments, it may be appropriate to use more than one labeled molecule (ie, those that can be distinguished from one another) otein or the RNA that is associated with the hTRT protein can be used if this is caused by the "capture" agent (e.g. an anti-hTRT antibody) bound (e.g. immobilized) target is a complex (ie a complex of hTRT and a TRT-associated protein, hTR or another TRT-associated molecule. If the complex is a protein / nucleic acid- Complex (for example TRT-hTR), the reporter molecule can be a polynucleotide or another molecule (for example an enzyme) which recognizes the RNA component of the complex.

Bei einigen Immunassayformaten ist die Verwendung von markierten Bestandteilen nicht erforderlich. Beispielsweise können Agglutinationsassays zum Nachweis des Vorhandenseins der Ziel-Antikörper verwendet werden. In diesem Fall werden Antigen-geschichtete Partikel durch die Zielantikörper enthaltenden Proben agglutiniert. Bei diesem Assay-Format müssen die Bestandteile nicht markiert sein und die Anwesenheit des Ziel-Antikörpers kann durch einfache visuelle Überprüfung nachgewiesen werden. Some immunoassay formats do not require the use of labeled components. For example, agglutination assays can be used to detect the presence of the target antibody. In this case, antigen-coated particles are agglutinated by the samples containing target antibodies. In this assay format, the components need not be labeled and the presence of the target antibody can be verified by simple visual inspection.

b) Nicht-kompetitive Assayformate b) Non-competitive assay formats

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Reagenzien für kompetitive und nicht-kompetitive Immunassays zum Nachweis von hTRT-Polypeptiden bereit. Bei nichtkompetitiven Immunassays handelt es sich um Assays, bei denen die Menge des eingefangenen Analyten (in diesem Fall hTRT) direkt gemessen wird. Ein Beispiel für einen solchen Assay ist ein auf monoclonalen Antikörpern basierender «twosite»-lmmunassay, bei dem monoclonale Antikörper verwendet werden, die mit zwei nicht-interferie-renden Epitopen auf dem hTRT-Protein reaktionsfähig sind. Siehe beispielsweise Maddox et al, i. Exp. Med. 158 (1983), 1211 bezüglich Hintergrundinformation. In einem bevorzugten «Sandwich»-Assay wird das «Einfang»-Agens (z.B. ein anti-TRT-Antikörper) direkt an ein festes Substrat gebunden, wo es immobilisiert wird. Diese immobilisierten Antikörper fangen dann jedes in der Testprobe vorhandene hTRT- The present invention provides methods and reagents for competitive and non-competitive immunoassays for the detection of hTRT polypeptides. Non-competitive immunoassays are assays in which the amount of analyte captured (in this case hTRT) is measured directly. An example of such an assay is a monoclonal antibody-based "twosite" immunoassay that uses monoclonal antibodies that are reactive with two non-interfering epitopes on the hTRT protein. See, for example, Maddox et al, i. Exp. Med. 158 (1983), 1211 for background information. In a preferred "sandwich" assay, the "capture" agent (e.g. an anti-TRT antibody) is bound directly to a solid substrate where it is immobilized. These immobilized antibodies then capture any hTRT present in the test sample.

77 77

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Protein ein. Das so immobilisierte hTRT kann dann markiert werden, d.h. durch Bindung an einen zweiten, eine Markierung tragenden anti-hTRT-Antikörper. In einer alternativen Ausführungsform kann der zweite anti-hTRT-Antikörper zwar keine Markierung aufweisen, jedoch durch einen markierten dritten Antikörper gebunden werden, der spezifisch für Antikörper der Spezies ist, von der der zweite Antikörper stammt. In einer weiteren alternativen Ausführungsform kann der zweite Antikörper mit einer nachweisbaren Einheit modifiziert sein, beispielsweise Biotin, die ein drittes markiertes Molekül spezifisch binden kann, beispielsweise Enzym-markiertes Streptavidin. Protein. The hTRT immobilized in this way can then be labeled, i.e. by binding to a second anti-hTRT antibody bearing a label. In an alternative embodiment, the second anti-hTRT antibody may not have a label, but may be bound by a labeled third antibody that is specific for antibodies of the species from which the second antibody is derived. In a further alternative embodiment, the second antibody can be modified with a detectable unit, for example biotin, which can specifically bind a third labeled molecule, for example enzyme-labeled streptavidin.

c) Kompetitive Assayformate c) Competitive assay formats

In kompetitiven Assays wird die Menge des in einer Probe vorhandenen hTRT-Proteins indirekt durch Messung der Menge an zugegebenen (exogenen) hTRT bestimmt, das durch das in der Probe vorhandene hTRT-Protein von einem «Einfang»-Agens(z.B. einem anti-TRT-Antikörper) verdrängt, oder weg-kompetitiert wurde. In einem dieser kompetitiven Assays wird eine bekannte Menge eines markierten hTRT-Proteins zu der Probe gegeben und danach die Probe mit einem «Einfang»-Agens (z.B. einem Antikörper, der hTRT-Protein spezifisch bindet) in Kontakt gebracht. Die Menge an exogenem (markiertem) an dem Antikörper gebundenem hTRT-Protein ist umgekehrt proportional zu der Konzentration an in der Probe vorhandenem hTRT-Protein. In einer Ausführungsform ist der Antikörper auf einem festen Substrat immobilisiert. Die Menge an hTRT-Protein, das an den Antikörper gebunden ist, kann entweder durch Messung der Menge an hTRT-Protein, die in einem TRT-Antikörper-Komplex vorhanden ist, bestimmt werden oder alternativ durch Bestimmung der Menge an übrigbleibendem nicht-komplexierten TRT-Protein. Die Menge an hTRT-Protein kann durch die Bereitstellung eines markierten hTRT-Mole-küls nachgewiesen werden. In competitive assays, the amount of hTRT protein present in a sample is determined indirectly by measuring the amount of (exogenous) hTRT added, which is caused by the hTRT protein present in the sample from a "capture" agent (eg an anti-TRT -Antibody) was displaced, or was competed away. In one of these competitive assays, a known amount of a labeled hTRT protein is added to the sample and then the sample is contacted with a "capture" agent (e.g. an antibody that specifically binds hTRT protein). The amount of exogenous (labeled) hTRT protein bound to the antibody is inversely proportional to the concentration of hTRT protein present in the sample. In one embodiment, the antibody is immobilized on a solid substrate. The amount of hTRT protein bound to the antibody can either be determined by measuring the amount of hTRT protein present in a TRT-antibody complex or, alternatively, by determining the amount of remaining uncomplexed TRT -Protein. The amount of hTRT protein can be detected by providing a labeled hTRT molecule.

Ein Hapten-Hemmungsassay stellt ein weiteres Beispiel für einen kompetitiven Assay dar. In diesem Assay ist hTRT-Protein auf einem festen Substrat immobilisiert. Eine bekannte Menge an anti-TRT-Anti-körper wird zu der Probe gegeben und danach die Probe mit dem immobilisierten hTRT-Protein in Kontakt gebracht. In diesem Fall ist die Menge an anti-TRT-Antikörper, der an das immobilisierte hTRT-Pro-tein gebunden ist, umgekehrt proportional zu der Menge an hTRT-Protein, das in der Probe vorhanden ist. Die Menge an immobilisiertem Antikörper kann entweder durch Nachweis der immobilisierten Antikörperfraktion bestimmt werden, oder der Antikörperfraktion, die in Lösung bleibt. Dabei kann der Nachweis direkt sein, im Falle, wenn der Antikörper markiert ist, oder indirekt, im Falle, dass die Markierung an ein Molekül gebunden ist, das an den vorstehend beschriebenen Antikörper spezifisch bindet. A hapten inhibition assay is another example of a competitive assay. In this assay, hTRT protein is immobilized on a solid substrate. A known amount of anti-TRT antibody is added to the sample and then the sample is contacted with the immobilized hTRT protein. In this case, the amount of anti-TRT antibody bound to the immobilized hTRT protein is inversely proportional to the amount of hTRT protein present in the sample. The amount of immobilized antibody can be determined either by detection of the immobilized antibody fraction or the antibody fraction that remains in solution. The detection can be direct, in the case when the antibody is labeled, or indirect, in the event that the label is bound to a molecule which specifically binds to the antibody described above.

d) Andere Assayformate d) Other assay formats

Die Erfindung stellt auch Reagenzien und Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung des Vorhandenseins von hTRT in der Probe mittels eines Immunblots (Westernblot)-Formats bereit. In diesem Format werden hTRT-Polypeptide in einer Probe von anderen Bestandteilen der Probe durch Gelelektrophorese (z.B. auf der Basis des Molekulargewichts), die abgetrennten Proteine auf einen geeigneten festen Träger überführt (z.B. ein Nitrocellulosefilter, ein Nylonfilter, ein derivatisierter Nylonfilter etc.) und der Träger wird mit erfindungsgemässen anti-TRT-Antikörpern inkubiert. Die anti-TRT-Antikörper binden spezifisch an hTRT oder anderem TRT auf dem festen Träger. Diese Antikörper können entweder direkt markiert sein oder sie können alternativ anschliessend unter Venwendung markierter Antikörper (z.B. markierten Schaf-anti-Maus-Antikörpern) nachgewiesen werden oder mittels anderer markierter Reagenzien, die spezifisch an den anti-TRT-Antikörper binden. The invention also provides reagents and methods for detecting and quantifying the presence of hTRT in the sample using an immunoblot (Western blot) format. In this format, hTRT polypeptides in a sample of other components of the sample are transferred by gel electrophoresis (e.g. based on molecular weight), the separated proteins onto a suitable solid support (e.g. a nitrocellulose filter, a nylon filter, a derivatized nylon filter etc.) and the carrier is incubated with anti-TRT antibodies according to the invention. The anti-TRT antibodies specifically bind to hTRT or other TRT on the solid support. These antibodies can either be directly labeled or alternatively they can subsequently be detected using labeled antibodies (e.g. labeled sheep anti-mouse antibodies) or using other labeled reagents that specifically bind to the anti-TRT antibody.

Zu weiteren Assayformaten zählen Liposom-Immunassays (LIA), bei denen Liposome verwendet werden, die so konstruiert wurden, dass sie spezifische Moleküle (z.B. Antikörper) binden und eingekapselte Reagenzien oder Marker freisetzen. Die freigesetzten Chemikalien können im Anschluss daran gemäss Standardverfahren nachgewiesen werden (siehe Monroe et al., Amer. Clin. Prod. Rev. 4 (1986), 34). Other assay formats include liposome immunoassays (LIA) that use liposomes that have been designed to bind specific molecules (e.g. antibodies) and release encapsulated reagents or markers. The chemicals released can then be detected according to standard methods (see Monroe et al., Amer. Clin. Prod. Rev. 4 (1986), 34).

Wie bereits vorstehend erwähnt, besitzen Assay-Formate, die FACS (und äquivalente Instrumente oder Verfahren) verwenden, Vorteile, wenn hTRT-Genprodukte in einer heterogenen Probe (z.B. einer sowohl normale als auch maligne Zellen enthaltenden Biopsieprobe) gemessen werden. As mentioned above, assay formats that use FACS (and equivalent instruments or methods) have advantages when measuring hTRT gene products in a heterogeneous sample (e.g., a biopsy sample containing both normal and malignant cells).

e) Substrate, feste Träger, Membrane und Filter e) substrates, solid supports, membranes and filters

Wie bereits vorstehend angemerkt, können in Abhängigkeit von dem Assay verschiedene Bestandteile, einschliesslich dem Antigen, Zielantikörper oder anti-hTRT-Antikörper, an eine feste Oberfläche oder einen festen Träger (d.h. ein Substrat, eine Membran oder Filterpapier) gebunden sein. Viele Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen an eine Vielzahl von festen Oberflächen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Die feste Oberfläche kann beispielsweise eine Membran sein (z.B. Nitrocellulose), eine Mikroti-terplatte (z.B. PVC, Polypropylen oder Polystyrol), ein Teströhrchen (Glas oder Plastik), ein Teststreifen (z.B. Glas, PVC, Polypropylen, Polystyrol, Latex etc.), ein Gefäss für eine Mikrozentrifuge oder ein Glas- oder Plastikkügelchen. Der gewünschte Bestandteil kann kovalent gebunden sein oder durch unspezifische Bindung nicht-kovalent angeknüpft sein. As noted above, depending on the assay, various components, including the antigen, target antibody, or anti-hTRT antibody, may be bound to a solid surface or support (i.e., a substrate, membrane, or filter paper). Many methods for immobilizing biomolecules on a variety of solid surfaces are known in the art. The solid surface can be, for example, a membrane (e.g. nitrocellulose), a microtiter plate (e.g. PVC, polypropylene or polystyrene), a test tube (glass or plastic), a test strip (e.g. glass, PVC, polypropylene, polystyrene, latex etc.) , a microcentrifuge tube or a glass or plastic bead. The desired constituent can be bound covalently or linked non-covalently through non-specific binding.

78 78

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Eine grosse Anzahl verschiedener organischer und anorganischer Polymere, die sowohl natürlich als auch synthetisch sein können, können als Material für die feste Obefläche verwendet werden. Zu solchen Polymeren zählen Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Po-ly(ethylenterephthalat), Rayon, Nylon, Poly(vinylbutyrat), Polyvinylidendifluorid (PVDF), Silikone, Poly-formaldehyd, Cellulose, Celluloseacetat, Nitrocellulose etc. Zu den weiteren Materialien, die verwendet werden können, zählen Papier, Gläser, Keramiken, Metalle, Metalloide, Materialien mit Halbleitereigenschaften, Zemente etc. Zusätzlich können gelbildende Substanzen verwendet werden, beispielsweise Proteine (z.B. Gelatinen), Lipopolysaccharide, Silikate, Agarose und Polyacrylamide. Geeignet sind auch Polymere, die mehrere wässrige Phasen bilden, beispielsweise Dextrane, Polyalkylenglykole oder Tensi-de, beispielsweise Phospholipide, langkettige (12 bis 24 Kohlenstoffatome) Alkylammoniumsalze etc. Bei porösen festen Oberflächen können in Abhängigkeit von der Art des Systems verschiedene Porengrös-sen verwendet werden. A large number of different organic and inorganic polymers, which can be both natural and synthetic, can be used as the material for the solid surface. Such polymers include polyethylene, polypropylene, poly (4-methylbutene), polystyrene, polymethacrylate, poly (ethylene terephthalate), rayon, nylon, poly (vinyl butyrate), polyvinylidene difluoride (PVDF), silicones, poly-formaldehyde, cellulose, cellulose acetate, Nitrocellulose etc. Other materials that can be used include paper, glasses, ceramics, metals, metalloids, materials with semiconductor properties, cements etc. In addition, gel-forming substances can be used, for example proteins (eg gelatins), lipopolysaccharides, silicates, agarose and polyacrylamides. Polymers which form several aqueous phases are also suitable, for example dextrans, polyalkylene glycols or tensides, for example phospholipids, long-chain (12 to 24 carbon atoms) alkylammonium salts etc. In the case of porous solid surfaces, different pore sizes can be used, depending on the type of system become.

Zur Herstellung der Oberfläche kann eine Vielfalt von verschiedenen Substanzen zum Erhalt verschiedener Eigenschaften verwendet werden, insbesondere als Laminate. Beispielsweise können zur Vermeidung einer unspezifischen Bindung, zur Vereinfachung einer kovalenten Konjugation, zur Verstärkung des Signalnachweises etc. Proteinbeschichtungen wie Gelatine verwendet werden. A variety of different substances can be used to obtain different properties to produce the surface, in particular as laminates. For example, protein coatings such as gelatin can be used to avoid non-specific binding, to simplify covalent conjugation, to enhance signal detection, etc.

Wenn eine kovalente Bindung zwischen einer Verbindung und der Oberfläche erwünscht ist, ist die Oberfläche normalerweise polyfunktionell oder sie kann polyfunktionell gemacht werden. Zu den funktionellen Gruppen, die auf der Oberfläche vorhanden und für eine Verknüpfung verwendet werden können, gehören Carboxylsäuren, Aldehyde, Aminogruppen, Cyangruppen, Ethylengruppen, Hydroxylgruppen, Mercaptogruppen etc. Die Art und Weise, wie solche Verknüpfungen durchgeführt werden können, ist für eine grosse Anzahl von Verbindungen an verschiedene Oberflächen allgemein bekannt und in der Literatur ausführlich beschrieben, siehe beispielsweise Immobilized Enzymes, Ichiro Chibata, Halsted Press, New York, 1978 und Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245 (1970) 3059. If a covalent bond between a compound and the surface is desired, the surface is usually polyfunctional or can be made polyfunctional. The functional groups that are present on the surface and can be used for a link include carboxylic acids, aldehydes, amino groups, cyano groups, ethylene groups, hydroxyl groups, mercapto groups, etc. The way in which such linkages can be carried out is large The number of compounds on different surfaces is generally known and is described in detail in the literature, see for example Immobilized Enzymes, Ichiro Chibata, Halsted Press, New York, 1978 and Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245 (1970) 3059.

Zusätzlich zur kovalenten Bindung können verschiedene Verfahren zur nicht-kovalenten Bindung eines Assaybestandteils verwendet werden. Eine nicht-kovalente Bindung ist typischerweise die unspezifische Absorption einer Verbindung an die Oberfläche. In addition to covalent binding, various methods for non-covalently binding an assay component can be used. A non-covalent bond is typically the non-specific absorption of a compound on the surface.

Natürlich ist die Herabsetzung einer unspezifischen Bindung in Immunassays wünschenswert. Insbesondere dann, wenn der Assay ein Antigen oder einen Antikörper beinhaltet, der auf einem festen Substrat immobilisiert ist, ist die Minimierung der Menge an unspezifischer Bindung an das Substrat wünschenswert. Mittel zur Herabsetzung einer solchen unspezifischen Bindung sind dem Fachmann gut bekannt. Dies beinhaltet typischerweise die Beschichtung des Substrats mit einer Proteinzusammensetzung. Insbesondere Proteinzusammensetzungen, die beispielsweise Rinderserumalbumin (BSA), fettfreies Milchpulver und Gelatine werden häufig verwendet, wobei gelegentlich Milchpulver bevorzugt wird. In einer alternativen Ausführungsform kann die Oberfläche so gestaltet sein, dass sie einen Bestandteil unspezifisch bindet, einen anderen jedoch nicht wesentlich bindet. Beispielsweise bindet eine ein Lectin, wie beispielsweise Concanavalin A, tragende Oberfläche eine Kohlenhydrat enthaltende Verbindung, jedoch nicht ejn unglykosyliertes markiertes Protein. Die US-Patente Nr. 4 447 576 und 4 254 082 geben einen Überblick über verschiedene feste Oberflächen zur Venwendung bei der nicht-kovalenten Verknüpfung von Assay-Bestandteilen. Of course, reducing non-specific binding in immunoassays is desirable. Particularly when the assay includes an antigen or an antibody immobilized on a solid substrate, minimizing the amount of non-specific binding to the substrate is desirable. Means to reduce such non-specific binding are well known to those skilled in the art. This typically involves coating the substrate with a protein composition. In particular, protein compositions such as bovine serum albumin (BSA), non-fat milk powder and gelatin are frequently used, with milk powder occasionally preferred. In an alternative embodiment, the surface can be designed such that it binds one component non-specifically, but does not essentially bind another. For example, a surface bearing a lectin such as Concanavalin A binds a carbohydrate-containing compound, but not an unglycosylated labeled protein. U.S. Patent Nos. 4,447,576 and 4,254,082 provide an overview of various solid surfaces for use in the non-covalent linking of assay components.

H. Assays für Anti-TRT-Antikörper H. Assays for Anti-TRT Antibodies

Die vorliegende Erfindung stellt auch Reagenzien und Assays zum Nachweis von-hTRT-spezifischen Immunglobulinen bereit. In einer Ausführungsform wird immobilisierte hTRT (z.B. rekombinante hTRT, die an die Verliefung einer Mikrotiterplatte gebunden ist) mit Serum von einem Patienten unter Bedingungen inkubiert, bei denen anti-hTRT-Antikörper, wenn sie vorhanden sind, die immobilisierte hTRT binden. Nach dem Waschen zur Entfernung von unspezifisch gebundenem Immunglobulin können gebundene Serumantikörper, falls sie vorhanden sind, durch Zugabe von nachweisbar markierten anti-menschliches Ig)-Antikörpern nachgewiesen werden (alternative Ausführungsform oder Variationen sind dem Fachmann gut bekannt; siehe beispielsweise Harlow, a.a.O., Kapitel 14). Diese Assays sind für den Nachweis von anti-hTRT-Antikörpem in beliebigen Quellen einschliesslich tierischem oder menschlichem Serum oder einem Träger, wie beispielsweise Kochsalzlösung, von Nutzen. In einer Ausführungsform werden die Assays zum Nachweis oder zur Überwachung einer Immunantwort auf hTRT-Proteine in einem Patienten verwendet, insbesondere einer Autoimmunantwort (z.B. anti-Telomerase). Anti-hTRT-Antikörper können im Serum, an den Geweben oder Flüssigkeiten von einem Patienten vorhanden sein, der an einer Autoimmunkrankheit oder einem anderen Zustand leidet. The present invention also provides reagents and assays for the detection of hTRT-specific immunoglobulins. In one embodiment, immobilized hTRT (e.g., recombinant hTRT bound to a microtiter plate) is incubated with serum from a patient under conditions where anti-hTRT antibodies, when present, bind the immobilized hTRT. After washing to remove unspecifically bound immunoglobulin, bound serum antibodies, if present, can be detected by adding detectably labeled anti-human Ig) antibodies (alternative embodiments or variations are well known to the person skilled in the art; see, for example, Harlow, loc. Cit., Chapter 14). These assays are useful for the detection of anti-hTRT antibodies in any source including animal or human serum or a vehicle such as saline. In one embodiment, the assays are used to detect or monitor an immune response to hTRT proteins in a patient, particularly an autoimmune response (e.g. anti-telomerase). Anti-hTRT antibodies can be present in the serum, tissues or fluids of a patient suffering from an autoimmune disease or other condition.

I) Assaykombinationen I) Assay combinations

Die hier beschriebenen diagnostischen und prognostischen Assays können in verschiedenen Kombinationen und auch in Verbindung mit anderen diagnostischen oder prognostischen Tests durchgeführt werden. Wenn beispielsweise die vorliegenden Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von Krebszellen in einer Patientenprobe verwendet werden, kann die Anwesenheit von hTRT dazu benutzt werden, um das Krankheitsstadium zu bestimmen, ob es wahrscheinlich ist, dass ein bestimmter Tu- The diagnostic and prognostic assays described here can be carried out in various combinations and also in conjunction with other diagnostic or prognostic tests. For example, if the present methods are used to detect the presence of cancer cells in a patient sample, the presence of hTRT can be used to determine the stage of the disease, whether a particular tumor is likely to

79 79

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

mor in angrenzendes Gewebe eindringt oder zu einem entfernten Standort metastasiert und ob ein erneutes Auftreten des Krebses wahrscheinlich ist. Zu den Tests, die zusätzliche Informationen liefern können, gehören die mikroskopische Analyse von Biopsieproben, der Nachweis von Antigenen (z.B. Zelloberflächenmarkern), die mit einer möglichen Tumorentstehung assoziiert sind (z.B. mittels Histo-cytochemie, FACS etc.), bildgebende Verfahren (z.B. nach Verabreichung eines markierten anti-Tumor-Antikörpers an einen Patienten), Telomerase-Aktivitätsassays, Telomerase-Längenassays, hTR-Assays etc. Solche kombinierten Tests können bezüglich des Fortschreitens einer Krankheit nützliche Information liefern. penetrates adjacent tissue or metastasizes to a distant location and whether the cancer is likely to recur. The tests, which can provide additional information, include microscopic analysis of biopsy samples, the detection of antigens (e.g. cell surface markers) that are associated with possible tumor development (e.g. using histocytochemistry, FACS etc.), imaging methods (e.g. after Administration of a labeled anti-tumor antibody to a patient), telomerase activity assays, telomerase length assays, hTR assays, etc. Such combined tests can provide useful information regarding disease progression.

Die Kombination von Assays kann auch nützliche Information liefern. Beispielsweise können, wie bereits vorstehend angemerkt, Assays für hTRT-mRNA mit Assays für hTR (RNA) oder Telomerase-Aktivität (d.h. TRAP) kombiniert werden, um so Informationen über Telomerase-Assemblierung und -Funktion zu liefern. The combination of assays can also provide useful information. For example, as noted above, assays for hTRT mRNA can be combined with assays for hTR (RNA) or telomerase activity (i.e., TRAP) to provide information about telomerase assembly and function.

J) Kits J) kits

Die vorliegende Erfindung stellt auch Kits bereit, die das Screenen, die Übewachung, Diagnose und Prognose bei Patienten mit einem mit Telomerase in Zusammenhang stehenden Zustand von Nutzen sind oder zur Bestimmung des Expressionsspiegels von hTRT in Zellen oder Zellinien. Die Kits enthalten eines oder mehrere Reagenzien zur Bestimmung des Vorhandenseins oder des Fehlens eines hTRT-Genprodukts (RNA oder Protein) oder zur Quantifizierung der Expression des hTRT-Gens. Zu den bevorzugten Reagenzien gehören Nucleinsäureprimer und Sonden, die an das hTRT-Gen, -RNA, -cDNA oder Anteile davon binden, aber auch Proteine, Peptide, Antikörper und Kontroll-Primer, -Sonden, -Oligonucleotide, -Proteine, -Peptide und -Antikörper. Weitere Substanzen können aufgenommen werden, dazu gehören Enzyme (Z.B. reverse Transkriptasen, DNA-Polymerasen, Ligasen), Puffer und Reagenzien (Markierungen, dNTPs). The present invention also provides kits that are useful in screening, monitoring, diagnosis and prognosis in patients with a telomerase-related condition or for determining the level of expression of hTRT in cells or cell lines. The kits contain one or more reagents for determining the presence or absence of an hTRT gene product (RNA or protein) or for quantifying the expression of the hTRT gene. Preferred reagents include nucleic acid primers and probes that bind to the hTRT gene, RNA, cDNA or portions thereof, but also proteins, peptides, antibodies and control primers, probes, oligonucleotides, proteins, peptides and -Antibody. Other substances can be included, including enzymes (e.g. reverse transcriptases, DNA polymerases, ligases), buffers and reagents (labels, dNTPs).

Die Kits können alternativ oder in Kombination mit irgendwelchen anderen hier beschriebenen Bestandteilen einen Antikörper enthalten, der spezifisch an hTRT-Polypeptide oder Untersequenzen davon bindet. Es kann ein monoclonaler oder polyclonaler Antikörper sein. Der Antikörper kann an eine weitere Einheit konjugiert sein, beispielsweise eine Markierung und/oder er kann auf einem festen Träger (Substrat) immobilisiert sein. Der (die) Kit(s) kann (können) auch einen zweiten Antikörper zum Nachweis von hTRT-Polypeptid/Antikörper-Komptexen oder zum Nachweis von hybridisierten Nucleinsäure-sonden enthalten, sowie ein oder mehrere hTRT-Peptide oder -Proteine zur Kontrolle oder andere Reagenzien. The kits may alternatively or in combination with any of the other ingredients described herein contain an antibody that specifically binds to hTRT polypeptides or sub-sequences thereof. It can be a monoclonal or polyclonal antibody. The antibody can be conjugated to a further unit, for example a label and / or it can be immobilized on a solid support (substrate). The kit (s) may also contain a second antibody for the detection of hTRT polypeptide / antibody complexes or for the detection of hybridized nucleic acid probes, as well as one or more hTRT peptides or proteins for control or others Reagents.

Der Antikörper oder die Hybridisierungssonde kann frei vorliegen oder an einen festen Träger immobilisiert sein, beispielsweise ein Teströhrchen, eine Mikrotiterplatte, ein Teststäbchen etc. Der Kit kann auch Anleitungen enthalten, die die Verwendung des Antikörpers oder der Hybridisierungssonde in einem Assay zum Nachweis einer Prädisposition für TRT beschreiben. Der Kit kann geeignete Reagenzien zum Nachweis von Markierungen oder zur Markierung positiver und negativer Kontrollen, Waschlösungen, Verdünnungspuffer etc. enthalten. The antibody or hybridization probe can be free or immobilized on a solid support, such as a test tube, microtiter plate, test stick, etc. The kit can also include instructions for using the antibody or hybridization probe in an assay to detect a predisposition to Describe TRT. The kit can contain suitable reagents for the detection of labels or for labeling positive and negative controls, washing solutions, dilution buffers etc.

In einer Ausführungsform enthält der Kit ein Primerpaar zur Amplifikation von hTRT-mRNA. Ein solcher Kit kann auch eine Sonde für amplifizierte hTRT-DNA und/oder eine Polymerase, Puffer, dNTPs etc. enthalten. In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Kit eine Sonde, gegebenenfalls eine markierte Sonde. In einer anderen Ausführungsform umfasst der Kit einen Antikörper. In one embodiment, the kit contains a pair of primers for the amplification of hTRT mRNA. Such a kit can also contain a probe for amplified hTRT-DNA and / or a polymerase, buffer, dNTPs etc. In a further embodiment, the kit comprises a probe, optionally a labeled probe. In another embodiment, the kit comprises an antibody.

X. Identifizierung von Modulatoren von Telomerase-Aktivität X. Identification of modulators of telomerase activity

A. Allgemeines A. General

Die Erfindung stellt Verbindungen und Behandlungen bereit, die die Aktivität oder Expression einer Telomerase oder eines Telomerase-Bestandteils (z.B. hTRT-Protein) modulieren. Die Erfindung stellt auch Assays und Screening Verfahren (einschliesslich Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz) zur Identifizierung von Verbindungen und Behandlungen bereit, die Telomerase-Aktivität oder -Expression modulieren. Zu diesen Modulatoren von Telomerase-Aktivität und -Expression (die nachstehend als «Modulatoren» bezeichnet werden) gehören Telomerase-Agonisten (die Telomerase-Aktivität und/oder -Expression steigern) und Telomerase-Antagonisten (die Telomerase-Aktivität und/oder -Expression herabsetzen). The invention provides compounds and treatments that modulate the activity or expression of a telomerase or a telomerase component (e.g., hTRT protein). The invention also provides assays and screening methods (including high throughput screening methods) for identifying compounds and treatments that modulate telomerase activity or expression. These modulators of telomerase activity and expression (hereinafter referred to as "modulators") include telomerase agonists (which increase telomerase activity and / or expression) and telomerase antagonists (which telomerase activity and / or expression reduce).

Die erfindungsgemässen Modulatoren haben eine grosse Anzahl von Anwendungsmöglichkeiten. Beispielsweise wird davon ausgegangen, dass Telomerase-Modulatoren wirksame therapeutische Mittel zur Behandlung von menschlichen Krankheiten sind. Das Screenen nach agonistischer Aktivität und Aktivatoren der Transkription oder Translation erlaubt die Bereitstellung von Zusammensetzungen, die eine Telomerase-Aktivität in einer Zelle (einschliesslich einer Telomer-abhängigen Replikationsfähigkeit oder einer «partiellen» Telomerase-Aktivität) steigern können. Solche agonistischen Zusammensetzungen erlauben auch die Bereitstellung von Verfahren zur Immortalisierung von ansonsten normalen untransfor-mierten Zellen, wozu Zellen gehören, die nützliche Proteine exprimieren können. Solche Agonisten erlauben auch die Bereitstellung von Verfahren zur Regulierung zellulärer Seneszenz. Umgekehrt erlaubt The modulators according to the invention have a large number of possible uses. For example, it is believed that telomerase modulators are effective therapeutic agents for the treatment of human diseases. Screening for agonistic activity and transcription or translation activators allows compositions to be provided that can increase telomerase activity in a cell (including a telomer-dependent replication ability or "partial" telomerase activity). Such agonistic compositions also allow methods to be provided to immortalize otherwise normal untransformed cells, including cells that can express useful proteins. Such agonists also allow methods to regulate cellular senescence to be provided. Conversely allowed

80 80

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

das Screenen nach antagonistischer Aktivität die Bereitstellung von Zusammensetzungen, die eine Telo-mer-abhängige Replikationsfähigkeit herabsetzen und dadurch Zellen mortalisieren, die ansonsten unsterblich sind, beispielsweise Krebszellen. Das Screenen nach antagonistischer Aktivität erlaubt die Bereitstellung von Zusammensetzungen, die Telomerase-Aktivität herabsetzen und dadurch eine unbegrenzte Zellteilung von Zellen, die ein unreguliertes Zellwachstum zeigen, beispielsweise Krebszellen, verhindern. Beispiele von Erkrankungen und Zuständen, die mittels der Modulatoren behandelt werden können, sind hier aufgezählt, beispielsweise in den vorstehenden Abschnitten VII und IX. Im allgemeinen können die erfindungsgemässen Modulatoren immer dann verwendet werden, wenn eine Steigerung oder eine Herabsetzung einer Telomerase-Aktivität in einer Zelle oder einem Organismus erwünscht ist. Somit kann ein Modulator, der hTRT-Expressionsspiegel steigert, zusätzlich zur Verwendung bei der Krankheitsbehandlung zur Herstellung einer kultivierten menschlichen Zellinie verwendet werden, die Eigenschaften aufweist, wie sie allgemein in dem vorstehenden Abschnitt VIII beschrieben sind und er weist zahlreiche andere Anwendungsmöglichkeiten auf, die für den Fachmann offensichtlich sind. screening for antagonistic activity, providing compositions that reduce telomer-dependent replication ability and thereby mortalize cells that are otherwise immortal, for example cancer cells. Screening for antagonistic activity allows compositions to be provided that reduce telomerase activity and thereby prevent unlimited cell division from cells that show unregulated cell growth, such as cancer cells. Examples of diseases and conditions that can be treated by means of the modulators are listed here, for example in sections VII and IX above. In general, the modulators according to the invention can be used whenever an increase or a decrease in a telomerase activity in a cell or an organism is desired. Thus, a modulator that increases hTRT expression levels, in addition to use in disease treatment, can be used to produce a cultured human cell line that has properties generally described in Section VIII above and has numerous other uses that are useful for are obvious to the expert.

Eine Verbindung oder Behandlung moduliert die «Expression» von Telomerase oder eines Telomerase-Bestandteils, wenn die Verabreichung der Verbindung oder der Behandlung die Transkriptionsrate oder den Transkriptionsspiegel des einen Telomerase-Bestandteil codierenden Gens (z.B. hTRT-mRNA codierenden Gens) verändert, beeinflusst die Stabilität oder die posttranskriptionale Prozessierung von einen Telomerase-Bestandteil codierende RNA (z.B. Transport, Spleissen, Polyadenylierung oder eine andere Modifizierung), beeinflusst Translation, Stabilität, posttranslationale Prozessierung oder die Modifizierung eines codierten Proteins (z.B. hTRT) oder verändert auf andere Art und Weise den Spiegel an funktionellem (z.B. katalytisch aktivem) Telomerase-RNP. Eine Verbindung oder Behandlung beeinflusst dann eineTelomerase-«Aktivität», wenn die Verabreichung der Verbindung oder Behandlung eine Telomerase verändert, beispielsweise jene, die in dem vorstehenden Abschnitt IV (B) beschrieben sind (z.B. gehören dazu eine prozessive oder nicht-prozessive katalytische Aktivität von Telomerase; Telo-merase-Prozessivität, konventionelle reverse Transkriptase-Aktivität; nucleolytische Aktivität; Primer-oder Substrat-bindende Aktivität; dNTP-bindende Aktivität; RNA-bindende Aktivität; Beeinflussung der Telomerase-RNP-Assemblierung und Protein-bindende Aktivität). Es gibt nicht unbedingt eine scharfe Abgrenzung zwischen Änderung in der «Aktivität» und Veränderungen in der «Expression». Diese Ausdrücke werden zur Erleichterung der Diskussion, jedoch nicht zur Einschränkung verwendet. Die erfindungsgemässen Modulatoren sollten Telomerase-Aktivität oder -Expression beeinflussen (z.B. ohne allgemein die Expression von «housekeeping»-Proteinen, wie Actin, ändern) und nicht beispielsweise die Expression eines Telomerase-Bestandteils durch unspezifische Vergiftung einer Zielzelle herabsetzen. A compound or treatment modulates the «expression» of telomerase or a telomerase component, if the administration of the compound or treatment changes the transcription rate or the transcription level of the gene encoding a telomerase component (eg gene encoding hTRT-mRNA) affects the stability or the post-transcriptional processing of RNA encoding a telomerase component (e.g. transport, splicing, polyadenylation or another modification), affects translation, stability, post-translational processing or the modification of a coded protein (e.g. hTRT) or changes the level in some other way on functional (eg catalytically active) telomerase RNP. A compound or treatment affects telomerase "activity" when the administration of the compound or treatment alters a telomerase, for example those described in Section IV (B) above (e.g., includes processive or non-processive catalytic activity of) Telomerase; telomerase processivity, conventional reverse transcriptase activity; nucleolytic activity; primer or substrate-binding activity; dNTP-binding activity; RNA-binding activity; influencing the telomerase-RNP assembly and protein-binding activity). There is not necessarily a clear distinction between changes in "activity" and changes in "expression". These terms are used to facilitate discussion, but not to limit it. The modulators according to the invention should influence telomerase activity or expression (e.g. without generally changing the expression of housekeeping proteins such as actin) and should not, for example, reduce the expression of a telomerase component by non-specific poisoning of a target cell.

B. Assays zur Identifizierung von Telomerase-Modulatoren B. Assays to identify telomerase modulators

Die Erfindung stellt Verfahren und Reagenzien zum Screenen nach Zusammensetzungen oder Verbindungen bereit, die die Expression einer Telomerase oder eines Telomerase-Bestandteils beeinflussen können, die Replikationsfähigkeit von Telomerase bezüglich DNA modifizieren können oder anderweitig die Fähigkeit des Telomerase-Enzyms und des TRT-Proteins Telomer-DNA synthetisieren zu können («volle Aktivität») modifizieren. Die Erfindung stellt auch Screening-Verfahren für Modulatoren einer beliebigen «partiellen Aktivität» von hTRT oder allen dieser Aktivitäten bereit. Somit stellt die vorliegende Erfindung Assays bereit, die zum Screenen nach Agensien verwendet werden können, die die Aktivität von Telomerase steigern, beispielsweise dadurch, dass sie dazu führen, dass hTRT-Protein oder Telomerase in einer Zelle exprimiert wird, in der diese normalerweise nicht exprimiert wird, oder durch Steigerung der Spiegel an Telomerase-Aktivität in Telomerase-positiven Zellen. The invention provides methods and reagents for screening compositions or compounds that can affect the expression of a telomerase or a telomerase component, modify the replication ability of telomerase with respect to DNA, or otherwise affect the ability of the telomerase enzyme and the TRT protein telomerase. To be able to synthesize DNA (“full activity”). The invention also provides screening methods for modulators of any "partial activity" of hTRT or all of these activities. Thus, the present invention provides assays that can be used to screen for agents that increase telomerase activity, for example, by causing hTRT protein or telomerase to be expressed in a cell in which it does not normally express or by increasing levels of telomerase activity in telomerase positive cells.

Telomerase oder Proteine einer Telomerase-Untereinheit, deren katalytische oder immunogene Fragmente oder Oligopeptide davon können zum Screenen nach therapeutischen Verbindungen in einer Vielzahl von Verfahren zum Screenen von Wirkstoffen vewendet werden. Das in einem solchen Test ve wendete Fragment kann frei in Lösung vorliegen, an einen festen Träger fixiert sein, von einer Zelloberfläche getragen, oder intrazellulär lokalisiert sein. Die Bildung von Bindungskomplexen zwischen Telomerase oder dem Untereinheitenprotein und dem zu testenden Agens kann gemessen werden. Telomerase or proteins of a telomerase subunit, their catalytic or immunogenic fragments, or oligopeptides thereof, can be used to screen for therapeutic compounds in a variety of methods for screening drugs. The fragment used in such a test can be freely in solution, fixed to a solid support, carried by a cell surface, or located intracellularly. The formation of binding complexes between telomerase or the subunit protein and the agent to be tested can be measured.

In verschiedenen Ausführungsformen zählen zu der Erfindung Verfahren zum Screenen nach Antagonisten, die an das aktive Zentrum des Enzyms binden; die Assoziierung seiner RNA-Einheit, von Telo-merase-assoziierten Proteinen, Nucleotiden oder Telomer-DNA an Telomerase oder hTRT-Protein hemmen; die Dissoziierung des Enzymkomplexes fördern; die Transkription der Telomerase-RNA-Einheit (z.B. hTR) stören oder eine der hier beschriebenen «partiellen Aktivitäten» hemmen. Die Erfindung betrifft auch das Screenen nach Zusammensetzungen, die die Assoziierung von Nucleinsäure und/oder Telomerase-assoziierten Zusammensetzungen mit hTRT, z.B. die Assoziierung von hTR mit hTRT oder die Assoziierung von hTRT mit dem menschlichen Homolog von p80 oder einem anderen assoziierten Protein oder die Assoziierung von hTRT mit einem Telomer oder einem Nucleotid hemmen; das Screenen nach Zusammensetzung, die die Dissoziierung oder Assoziierung (d.h. Assemblierung) des Enzymkomplexes fördern, beispielsweise ein Antikörper, der gegen hTR oder hTRT gerichtet ist; das Screenen nach Agensien, die die Prozessivität des Enzyms beeinflussen und das Screenen nach Nucleinsäuren und anderen Zusammensetzungen, die Telomerase binden, wie beispielsweise eine zu hTR komple81 In various embodiments, the invention includes methods of screening for antagonists that bind to the active site of the enzyme; inhibit the association of its RNA moiety, telomerase-associated proteins, nucleotides or telomeric DNA with telomerase or hTRT protein; promote the dissociation of the enzyme complex; interfere with the transcription of the telomerase RNA unit (e.g. hTR) or inhibit one of the «partial activities» described here. The invention also relates to screening for compositions that associate nucleic acid and / or telomerase-associated compositions with hTRT, e.g. inhibit the association of hTR with hTRT, or the association of hTRT with the human homologue of p80 or other associated protein, or the association of hTRT with a telomer or nucleotide; screening for compositions that promote dissociation or association (i.e., assembly) of the enzyme complex, for example an antibody directed against hTR or hTRT; screening for agents that affect the processivity of the enzyme; and screening for nucleic acids and other compounds that bind telomerase, such as one to hTR complex81

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

mentäre Nucleinsäure. Die Erfindung zieht darüber hinaus auch das Screenen nach Zusammensetzungen in Betracht, die die Transkription des hTRT-Gens und/oder die Translation des hTRT-Genprodukts erhöhen oder herabsetzen. Die Erfindung zieht auch ein Screening-Verfahren in Betracht, Telomerase-Modulatoren in Tieren, in einer Ausführungsform durch die Rekonstitution einer Telomerase-Aktivität oder einer anti-Telomerase-Aktivität in ein Tier, beispielsweise in einem transgenen Tier. Die Erfindung stellt auch in vivoAssaysysteme bereit, zu denen «knockout»-Modelle gehören, bei denen eine oder verschiedene Einheiten der endogenen Telomerase, der Telomerase-RNA-Einheit und/oder Telomeraseas-soziierte Proteine deletiert oder gehemmt wurden. Dabei kann die endogene Telomerase-Aktivität vollständig oder partielle erhalten geblieben sein. In einer Ausführungsform wird eine exogene Telomerase-Aktivität voll oder partiell rekonstituiert. mental nucleic acid. The invention also contemplates screening for compositions that increase or decrease the transcription of the hTRT gene and / or the translation of the hTRT gene product. The invention also contemplates a screening method for telomerase modulators in animals, in one embodiment by the reconstitution of a telomerase activity or an anti-telomerase activity in an animal, for example in a transgenic animal. The invention also provides in vivo assay systems that include knockout models in which one or different endogenous telomerase, telomerase RNA unit, and / or telomeraseas-associated proteins have been deleted or inhibited. The endogenous telomerase activity can be retained completely or partially. In one embodiment, an exogenous telomerase activity is fully or partially reconstituted.

In einer erfindungsgemässen Ausführungsform wird eine Reihe von Assays hinsichtlich einer partiellen Telomerase Aktivität bereitgestellt, die die Identifizierung einer Vielfalt verschiedener Klassen von Modulatoren von Telomerase-Aktivität erlauben. Die erfindungsgemässen «Teilaktivitäts»-Assays erlauben die Identifizierung von Modulatorklassen von Telomerase-Aktivität, die ansonsten in einem «Vollakti-vitäts»-Telomerase-Assay nicht hätten nachgewiesen werden können. Bei einem Teilaktivitäts-Assay ist die nicht-prozessive Aktivität von TRT und Telomerase beteiligt. Die prozessive Natur der Telomerase wird von Morin, Cell 59 (1989), 521-529 beschrieben; siehe auch Prowse «Identification of a nonpro-cessive telomerase-activity from mouse cells» Proc. Nati. Acad. Sci. USA90 (1993), 1493-1497. Bei einem weiteren erfindungsgemässen Teilaktivitäts-Assay wird die «Reverse Transpriptase-ähnliche»-Aktivität von Telomerase genutzt. Bei diesen Assays wird die reverse Transkriptase-Aktivität des hTRT-Proteins untersucht; siehe Lingner «Reverse transcriptase motifs in the catalytic subunit of telomerase», Science 276 (1997), 561-567. Bei einem weiteren erfindungsgemässen Teilaktivitäts-Assay wird die «nucleolytische Aktivität» von hTRT und Telomerase, zu der die Entfernung von mindestens einem Nucleotid vom 3'-Strang, typischerweise Guanosin, durch das Enzym beinhaltet, genutzt. Diese nucleolytische Aktivität wurde in Tetrahymena-Telomerase von Collins «Tetrahymena telomerase catalyzes nu-cleolytic cleavage and nonprocessive elongation» Genes Dev. 7 (1993), 1364-1376 beobachtet. Bei einem weiteren erfindungsgemässen Teilaktivitäts-Assay ist eine Analyse der Fähigkeit von hTRT und Telomerase als Teil deren Aktivität hinsichtlich der prozessiven DNA-Polymerisation bezeichnet. Ein weiterer erfindungsgemässer Teilaktivitäts-Assay beinhaltet die Analyse der Fähigkeit von hTRT oder Telomerase, deren RNA-Einheit zu binden, d.h. hTR menschliche Zellen, die als eine Matrize für die Telo-mer-Synthese verwendet wird. Weitere erfindungsgemässe Teilaktivitäts-Assays beinhalten die Analyse der Fähigkeit von hTRT und Telomerase-Chromosomen in vivo zu binden oder oligonucleotid-Primer in vitro oder in rekonstituierten Systemen zu binden oder Proteine zu binden, die mit chromosomalen Strukturen assoziiert sind (siehe bezüglich eines Beispiels für ein solches Protein Harrington, J. Biol. Chem. 270 (1995), 8893-8901). Zu den chromosomalen Strukturen, die hTRT binden, gehören beispielsweise DNA der Telomer-Wiederholungseinheit, Telomer-Proteine, Histone, nucleäres Matrixprotein, Kontrollproteine für die Zellteilung oder den Zellcyclus etc. In one embodiment of the invention, a series of assays for partial telomerase activity are provided which allow the identification of a variety of different classes of modulators of telomerase activity. The “partial activity” assays according to the invention allow the identification of modulator classes of telomerase activity which otherwise could not have been detected in a “full activity” telomerase assay. In a partial activity assay, the non-processive activity of TRT and telomerase is involved. The processive nature of telomerase is described by Morin, Cell 59 (1989), 521-529; see also Prowse “Identification of a nonpro-cessive telomerase-activity from mouse cells” Proc. Nati. Acad. Sci. USA90 (1993), 1493-1497. The “reverse transcriptase-like” activity of telomerase is used in a further partial activity assay according to the invention. These assays examine the reverse transcriptase activity of the hTRT protein; see Lingner "Reverse transcriptase motifs in the catalytic subunit of telomerase", Science 276 (1997), 561-567. In a further partial activity assay according to the invention, the “nucleolytic activity” of hTRT and telomerase, for which the enzyme involves the removal of at least one nucleotide from the 3 ′ strand, typically guanosine, is used. This nucleolytic activity was observed in Tetrahymena telomerase by Collins "Tetrahymena telomerase catalyzes nu-cleolytic cleavage and nonprocessive elongation" Genes Dev. 7 (1993), 1364-1376. In a further partial activity assay according to the invention, an analysis of the ability of hTRT and telomerase is designated as part of their activity with regard to processive DNA polymerization. Another partial activity assay according to the invention involves analysis of the ability of hTRT or telomerase to bind their RNA moiety, i.e. hTR human cells, which is used as a template for telomer synthesis. Further partial activity assays according to the invention include the analysis of the ability of hTRT and telomerase chromosomes to bind in vivo or to bind oligonucleotide primers in vitro or in reconstituted systems or to bind proteins which are associated with chromosomal structures (see for an example of a such protein Harrington, J. Biol. Chem. 270 (1995), 8893-8901). The chromosomal structures that bind hTRT include, for example, DNA of the telomer repeat unit, telomer proteins, histones, nuclear matrix protein, control proteins for cell division or the cell cycle, etc.

In einer Ausführungsform umfasst ein Assay zur Identifizierung von Modulatoren das Inkontaktbringen von einer oder mehreren Zellen (d.h. «Testzellen») mit einer Testverbindung und die Bestimmung, ob die Testverbindung die Expression oder Aktivität einer Telomerase (oder eines Telomerase-Bestandteils) in der Zelle beeinflusst. Üblicherweise umfasst diese Bestimmung den Vergleich der Aktivität oder der Expression in der Testzelle mit einer ähnlichen Zelle oder Zellen (d.h. Kontrollzellen), die mit der Testverbindung nicht in Kontakt gebracht wurden. In einer alternativen Ausführungsform können anstelle von intakten Zellen Zellextrakte verwendet werden. In einer verwandten Ausführungsform wird die Testverbindung an einen multizellulären Organismus (z.B. eine Pflanze oder ein Tier) verabreicht. Die Telomerase oder der Telomerase-Bestandteil kann für die Zelle oder den multizellulären Organismus vollständig endogen sein (d.h. von natürlich vorkommenden endogenen Genen codiert), es kann sich auch um eine rekombinante Zelle oder einen transgenen Organismus handeln, der einen oder mehrere rekombinant exprimierte Telomerase-Bestandteile umfasst (z.B. hTRT, hTR, Telomerase-assoziierte Proteine) oder die Zelle bzw. der multizelluläre Organismus kann sowohl endogene als auch rekombinante Bestandteile aufweisen. Somit werden in einer Ausführungsform TelomeraseAktivitäts-Modulatoren an sterbliche Zellen verabreicht. In einerweiteren Ausführungsform werden Telomerase-Aktivitäts-Modulato-ren an unsterbliche Zeilen verabreicht. Beispielsweise können Antagonisten der Telomerase-vermittelten DNA-Replikation dadurch identifiziert werden, dass die vermutlich hemmende Zusammensetzung an eine Zelle verabreicht wird, von der bekannt ist, dass sie signifikante Mengen an Telomerase-Aktivität aufweist, beispielsweise Krebszellen. In one embodiment, an assay to identify modulators includes contacting one or more cells (ie, "test cells") with a test compound and determining whether the test compound affects the expression or activity of a telomerase (or a telomerase component) in the cell . Typically, this determination involves comparing the activity or expression in the test cell with a similar cell or cells (i.e. control cells) that have not been contacted with the test compound. In an alternative embodiment, cell extracts can be used instead of intact cells. In a related embodiment, the test compound is administered to a multicellular organism (e.g. a plant or an animal). The telomerase or the telomerase component can be completely endogenous to the cell or the multicellular organism (ie encoded by naturally occurring endogenous genes), or it can also be a recombinant cell or a transgenic organism which contains one or more recombinantly expressed telomerase genes. Components comprises (for example hTRT, hTR, telomerase-associated proteins) or the cell or the multicellular organism can have both endogenous and recombinant components. Thus, in one embodiment, telomerase activity modulators are administered to mortal cells. In another embodiment, telomerase activity modulators are administered on immortal lines. For example, antagonists of telomerase-mediated DNA replication can be identified by administering the presumptive inhibitory composition to a cell known to have significant amounts of telomerase activity, such as cancer cells.

In einer weiteren Ausführungsform wird ein Modulator durch Übewachung einer Veränderung in einer Telomerase-Aktivität eines Ribonucleoprotein-Komplexes (RNP) identifiziert, der eine TRT (z.B. hTRT) und eine Matrizen-RNA (z.B. hTR) umfasst, wobei der RNP in vitro rekonstituiert wird (wie beispielsweise in dem nachstehenden Beispiel 7 beschrieben). In another embodiment, a modulator is identified by monitoring a change in a telomerase activity of a ribonucleoprotein complex (RNP) that includes a TRT (eg hTRT) and a template RNA (eg hTR), the RNP being reconstituted in vitro (as described, for example, in Example 7 below).

In einer weiteren Ausführungsform wird der Modulator durch Übewachung einer Veränderung in der Expression eines TRT-Genprodukts (z.B. RNA oder Protein) in einer Zelle, einem Tier, einem in vitro-Expressionssystem oder anderem Expressionssystem identifiziert. In another embodiment, the modulator is identified by monitoring a change in the expression of a TRT gene product (e.g., RNA or protein) in a cell, animal, in vitro expression system, or other expression system.

In einer weiteren Ausführungsform wird der Modulator anhand der Änderung der Expression eines Reportergens identifiziert, beispielsweise eines solchen, wie es in Beispiel 15 beschrieben wird, wobei In a further embodiment, the modulator is identified on the basis of the change in the expression of a reporter gene, for example one such as is described in Example 15, where

82 82

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

dessen Expression ganz oder teilweise durch ein natürlich vorkommendes TRT-regulatorisches Element, beispielsweise einen Promotor oder Enhancer, reguliert wird. In einer verwandten Ausführungsform wird die Fähigkeit einer Testverbindung, einen Telomerasebestandteil (z.B. hTRT) zu binden, RNA oder eine Gen-regulatorische Sequenz (z.B. den TRT-Genpromotor) untersucht. the expression of which is wholly or partly regulated by a naturally occurring TRT regulatory element, for example a promoter or enhancer. In a related embodiment, the ability of a test compound to bind a telomerase component (e.g. hTRT), RNA or a gene regulatory sequence (e.g. the TRT gene promoter) is examined.

In einer weiteren Ausführungsform wird der Modulator durch die Beobachtung von Veränderungen in der hTRT-prä-mRNA-Prozessierung identifiziert, wobei sich dies beispielsweise auf alternativ gespleisste Produkte, alternative Polyadenylierungsereignisse, RNA-Spaltung etc. bezieht. In einer verwandten Ausführungsform kann die Aktivität des Modulators durch Überwachung der Herstellung von hTRT-Polypep-tiden untersucht werden, von denen einige eine Aktivität für eine dominant-negative Telomerase-Regula-tion besitzen können. In a further embodiment, the modulator is identified by observing changes in the hTRT pre-mRNA processing, this relating, for example, to alternatively spliced products, alternative polyadenylation events, RNA cleavage, etc. In a related embodiment, the activity of the modulator can be examined by monitoring the production of hTRT polypeptides, some of which may have activity for dominant-negative telomerase regulation.

Assay-Formate für die Identifizierung von Verbindungen, die die Expression und Aktivität von Proteinen beeinflussen, sind in der biotechnologischen und pharmazeutischen Industrie gut bekannt und für den Fachmann sind zusätzliche Assays und Variationen der vorstehend zur Veranschaulichung bereitgestellten Assays offensichtlich. Assay formats for identifying compounds that affect protein expression and activity are well known in the biotechnology and pharmaceutical industries, and additional assays and variations of the assays provided above for illustration will be apparent to those skilled in the art.

Veränderungen in Telomerase-Aktivität oder -Expression können durch jedes geeignete Verfahren gemessen werden. Für Änderungen im Expressionsspiegel eines Telomerase-Bestandteils (z.B. des hTRT-Proteins) oder eines Vorläufers (z.B. hTRT-mRNA) können unter Verwendung von dem Fachmann gut bekannten Verfahren untersucht werden. Einige dieser Verfahren sind hier beschrieben, beispielsweise in Abschnitt IX und dazu zählt die Überwachung der Spiegel von TRT-Genprodukten (z.B. Protein und RNAs) durch Hybridisierung (z.B. unter Verwendung der erfindungsgemässen TRT-Sonden und -Primer), Immunassays (z.B. mittels der erfindungsgemässen anti-TRT-Antikörper), RNAse-Schutzassays, Amplifikationsassays oder jedes andere für einen Nachweis geeignete Mittel, das hier beschrieben oder auf dem Fachgebiet bekannt ist. Die Quantifizierung der Mengen an Nucleinsäure in einer Probe (z.B. die Bestimmung von RNA-Spiegeln, beispielsweise hTR- oder hTRT-mRNA) ist ebenfalls für die Bestimmung von transkriptionellen Regulatoren in eis oder trans von Nutzen. Changes in telomerase activity or expression can be measured by any suitable method. Changes in the expression level of a telomerase component (e.g. the hTRT protein) or a precursor (e.g. hTRT mRNA) can be examined using methods well known to those skilled in the art. Some of these methods are described here, for example in Section IX, and this includes monitoring the levels of TRT gene products (for example protein and RNAs) by hybridization (for example using the TRT probes and primers according to the invention), immunoassays (for example using those according to the invention) anti-TRT antibody), RNAse protection assays, amplification assays, or any other means useful for detection described herein or known in the art. Quantifying the amounts of nucleic acid in a sample (e.g. determining RNA levels, e.g. hTR or hTRT mRNA) is also useful for determining transcriptional regulators in ice or trans.

Auf ähnliche Weise können Veränderungen in einer Telomerase-Aktivität unter Verwendung der hier (z.B. in Abschnitt IV (B), s.o.) beschriebenen Verfahren oder anderer Assays bezüglich einer Telomera-se-Funktion gemessen werden. Die Quantifizierung von Telomerase-Aktivität kann, falls erwünscht, durch jedes Verfahren, einschliesslich der hier beschriebenen, durchgeführt werden. Telomerase-Ant-agonisten, die den Verlust einer Telomer-Struktur bewirken oder beschleunigen, können durch Überwachung oder Messung ihres Effekts auf Telomerase-Aktivität in vivo, ex vivo oder in vitro identifiziert werden, aufgrund ihrer Auswirkungen auf die Telomer-Länge (durch Anfärbung oder die Venwendung von «tagged»-Hybridisierungssonden) oder einfach durch die Untersuchung der Zellteilung von Telomerase-positiven Krebszellen (kritisches Verkürzen von Telomeren führt zu einem «Kriese» bezeichneten Phänomen oder zur M2-Seneszenz (Shay, Biochem. Biophys. Acta 1072 (1991) 1-7), wobei dies durch die Aktivierung von Telomerase bei den Krebszellen umgangen wird, jedoch bei dem Fehlen von Telomerase zu deren Seneszenz führt oder zu deren Tod aufgrund einer chromosomalen Deletion und eines chromosomalen Rearrangements). Die Rekonstitution von menschlicher Telomerase-Aktivität in vivo liefert ein Verfahren zum Screenen nach Telomerase-Modulatoren in Zellen oder Tieren jeden Ursprungs. Solche Agonisten können in einem erfindungsgemässen Aktivitätsassay identifiziert werden, was die Bestimmung von messbaren Veränderungen in der Telomer-Länge, wie vorstehend beschrieben, ein-schliesst. Weitere Beispiele von Assays zur Messung von Telomerase-Aktivität in Zellen beinhalten die Akkumulation oder den Verlust von Telomer-Strukturen, den TRAP-Assay oder einen Assay bezüglich einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion. Similarly, changes in telomerase activity can be measured using the methods described here (e.g. in Section IV (B), supra) or other assays for telomerase function. The quantification of telomerase activity can, if desired, be carried out by any method, including those described herein. Telomerase antagonists that cause or accelerate the loss of a telomer structure can be identified by monitoring or measuring their effect on telomerase activity in vivo, ex vivo or in vitro due to their effects on telomer length (by staining or the use of “tagged” hybridization probes) or simply by examining the cell division of telomerase-positive cancer cells (critical shortening of telomeres leads to a phenomenon called “Kriese” or to M2 senescence (Shay, Biochem. Biophys. Acta 1072 ( 1991) 1-7), whereby this is avoided by activating telomerase in the cancer cells, but in the absence of telomerase leads to their senescence or to their death due to a chromosomal deletion and a chromosomal rearrangement). Reconstitution of human telomerase activity in vivo provides a method of screening for telomerase modulators in cells or animals of any origin. Such agonists can be identified in an activity assay according to the invention, which includes the determination of measurable changes in the telomer length, as described above. Further examples of assays for measuring telomerase activity in cells include the accumulation or loss of telomer structures, the TRAP assay, or an assay for a quantitative polymerase chain reaction.

In einer Ausführungsform umfassen die erfindungsgemässen Assays auch ein Verfahren, bei dem die Testverbindung für eine statistisch signifikante Herabsetzung in der Aktivität von hTRT im Vergleich zu den relativen Mengen einer eingebauten Markierung in einer Parallelreaktion sorgt, bei der das Agens fehlt, wodurch nachgewiesen werden kann, dass das Agens ein Telomerase-Inhibitor ist. In one embodiment, the assays according to the invention also comprise a method in which the test compound provides a statistically significant reduction in the activity of hTRT compared to the relative amounts of an incorporated label in a parallel reaction in which the agent is absent, which can be used to detect, that the agent is a telomerase inhibitor.

Die erfindungsgemässen Verfahren können anhand von Protokollen adaptiert werden,die in der wissenschaftlichen Literatur und der Patentliteratur beschrieben sind, und auf dem Fachgebiet bekannt sind. Beispielsweise können dann, wenn eine erfindungsgemässe Telomerase oder ein TRT-Protein zur Identifizierung von Zusammensetzungen verwendet wird, die als Modulatoren von Telomerase-Aktivitä-ten wirken, eine grosse Anzahl von möglichenweise nützlichen Molekülen in einem einzigen Test ge-screent werden. Die Modulatoren können auf eine Telomerase-Aktivität eine hemmende (Antagonisten)-oder potenzierende (Agonisten)-Wirkung aufweisen. Beispielsweise können dann, wenn ein Feld von 1000 Inhibitoren gescreent werden soll, im Prinzip alle 1000 Inhibitoren in eine Mikrotiterplattenvertie-fung gegeben und gleichzeitig getestet werden. Wenn ein solcher Inhibitor entdeckt wird, kann dann der Pool von 1000 in 10 Pools von 100 aufgeteilt werden und der Prozess solange wiederholt werden, bis ein individueller Inhibitor identifiziert ist. The methods according to the invention can be adapted on the basis of protocols which are described in the scientific literature and the patent literature and are known in the art. For example, if a telomerase according to the invention or a TRT protein is used to identify compositions which act as modulators of telomerase activities, a large number of potentially useful molecules can be screened in a single test. The modulators can have an inhibitory (antagonist) or potentiating (agonist) effect on telomerase activity. For example, if a field of 1000 inhibitors is to be screened, in principle all 1000 inhibitors can be placed in a microtiter plate well and tested simultaneously. If such an inhibitor is discovered, the pool of 1000 can then be divided into 10 pools of 100 and the process repeated until an individual inhibitor is identified.

Beim Screenen von Wirkstoffen wird eine hohe Anzahl von Verbindungen hinsichtlich ihrer Fähigkeit als Telomerase-Modulatoren zu wirken, untersucht, wobei dieser Prozess durch Verfahren des Screening mit hohem Durchsatz («high troughput screening») stark beschleunigt wird. Die hier beschriebenen Assays für eine vollständige oder partielle Telomerase-Aktivität können zur Verwendung in einem Verfahren mit hohem Durchsatz adaptiert werden. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass für diesen Zweck zahlreiche Verfahren zur Verfügung stehen. When screening active substances, a large number of compounds are investigated with regard to their ability to act as telomerase modulators, this process being greatly accelerated by methods of high throughput screening. The assays for full or partial telomerase activity described here can be adapted for use in a high throughput method. It will be apparent to those skilled in the art that numerous methods are available for this purpose.

83 83

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Ein weiteres Verfahren zum Screenen von Wirkstoffen, das für das Screenen von Verbindungen mit geeigneten Bindungsaffinitäten für die Telomerase oder ein Protein einer Telomerase-Untereinheit mit hohem Durchsatz verwendet werden kann, ist ausführlich in «Determination of Amino Acid Sequence Antigenicity» von Geysen beschrieben (Geysen, PCT-Veröffentlichung WO 84/034 564, veröffentlicht am 13. September 1984, wobei dieses Dokument duch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden kann). Zusammenfassend kann gesagt werden, dass eine grosse Anzahl von unterschiedlichen kleinen Peptid-Testverbindungen auf einem festen Substrat, beispielsweise Plastikstiften oder einer anderen Oberfläche, synthetisiert wird. Die Peptid-Testverbindungen werden mit Fragmenten von Telomerase oder Proteinuntereinheiten von Telomerase zur Reaktion gebracht und gewaschen. Gebundene Telomerase oder eine Telomerase-Proteinuntereinheit wird dann durch allgemein bekannte Verfahren nachgewiesen. Im wesentlichen gereinigte Telomerase bzw. eine Telomerase-Protein-Unter-einheit kann auch direkt auf Platten zur Verwendung bei den vorstehend erwähnten Verfahren zum Screenen von Wirkstoffen als Beschichtung aufgebracht werden. In einer alternativen Ausführungsform können nicht-neutralisierende Antikörper zum Einfangen des Peptids und zu dessen Immobilisierung auf einem festen Träger verwendet werden. Another method for screening active substances which can be used for the screening of compounds with suitable binding affinities for telomerase or a protein of a telomerase subunit with high throughput is described in detail in "Determination of Amino Acid Sequence Antigenicity" by Geysen (Geysen , PCT publication WO 84/034 564, published September 13, 1984, which document may be incorporated by reference into this description). In summary, it can be said that a large number of different small peptide test compounds are synthesized on a solid substrate, for example plastic sticks or another surface. The peptide test compounds are reacted with fragments of telomerase or protein subunits of telomerase and washed. Bound telomerase or a telomerase protein subunit is then detected by well known methods. Substantially purified telomerase or a telomerase protein subunit can also be applied directly to plates for use in the aforementioned methods for screening active substances as a coating. In an alternative embodiment, non-neutralizing antibodies can be used to capture the peptide and immobilize it on a solid support.

In dieser Erfindung wird auch die Verwendung von kompetitiven Assays zum Screenen von Wirkstoffen in Betracht gezogen, bei denen neutralisierende Antikörper, die Telomerase oder (ein) Untereinheiten-Proteine) binden können, spezifisch mit einer Testverbindung um die Bindung an Telomerase oder das Untereinheiten-Protein konkurrieren. Auf diese Weise können die Antikörper zum Nachweis des Vorhandenseins eines Peptids verwendet werden, das eine oder mehrere antigene Determinanten mit der Telomerase oder einer Protein-Untereinheit gemeinsam hat. This invention also contemplates the use of competitive drug screening assays in which neutralizing antibodies that can bind telomerase or (a) subunit protein) specifically with a test compound for binding to telomerase or the subunit protein compete. In this way, the antibodies can be used to detect the presence of a peptide that shares one or more antigenic determinants with the telomerase or a protein subunit.

Weitere Verfahren zur Identifizierung von Modulatoren einer Telomerase-Aktivität sind, beschrieben in US-Patent 5 645 986 und USSN 08/151 477, eingereicht am 12. November 1993 sowie USSN 08 288 501, eingereicht am 10. August 1994, wobei diese Dokumente durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden können. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verbesserungen von bereits bekannten Verfahren bereit, teilweise dadurch, dass Reagenzien bereitgestellt werden, beispielsweise hTRT-Polynucleotide, -Sonden und -Primer, hoch-gereinigte hTR, hTRT und Telomerase sowie anti-Telomerase- und anti-TRT-Antikörper, die alle in den Assays verwendet werden können, beispielsweise als Kontrollen, Standard-, Bindungs- oder Hybridisierungsagensien oder anderweitig. Other methods for identifying modulators of telomerase activity are described in US Pat. Nos. 5,645,986 and USSN 08/151,477, filed November 12, 1993, and USSN 08 288 501, filed August 10, 1994, which documents Reference can be viewed as part of this description. The present invention also provides improvements to previously known methods, in part by providing reagents such as hTRT polynucleotides, probes and primers, highly purified hTR, hTRT and telomerase, and anti-telomerase and anti-TRT antibodies all of which can be used in the assays, for example as controls, standard, binding or hybridization agents, or otherwise.

Die rekombinant hergestellte erfindungsgemässe Telomerase und TRT (z.B. hTRT) ist natürlich in Assays zur Identifizierung von Modulatoren von Nutzen. Bei den Screening-Assays können auch Telomerase oder hTRT verwendet werden, die aus einer vollen oder partiellen Rekonstitution von Telomerase-Aktivität oder von einer Vermehrung einer existierenden Aktivität abstammen. Die durch die Erfindung bereitgestellten Assays oder Screeningverfahren können dazu verwendet werden, die Fähigkeit von Telomerase zu testen, Telomer-DNA zu synthetisieren oder für einen Test hinsichtlich einer oder aller «partiellen Aktivitäten» von hTRT und TRTs, wie vorstehend allgemein beschrieben. Der Assay kann die ex vivo-Modifizierung von Zellen beinhalten, die zur Expression von Telomerase mit oder ohne deren RNA-Einheit oder assoziierten Proteinen manipuliert wurde, und diese können in ein Tier reimplantiert werden, das für einen in vivo-Test verwendet werden kann. Somit stellt die Erfindung in vivo-As-says und dafür nützliche transgene Tiere bereit. In diesen in vivo-Assay-Systemen können «knockout»-Zellen verwendet werden, bei denen eine oder mehrere Einheiten des endogenen Telomerase-Enzym-Komplexes deletiert oder gehemmt wurden, sowie Zellen, bei denen eine exogene oder endogene Telo-merase-Aktivität rekonstituiert oder aktiviert ist. The recombinantly produced telomerase and TRT (e.g. hTRT) according to the invention is of course useful in assays for the identification of modulators. The screening assays can also use telomerase or hTRT derived from full or partial reconstitution of telomerase activity or from an increase in existing activity. The assays or screening methods provided by the invention can be used to test the ability of telomerase to synthesize telomeric DNA or to test for one or all of the "partial activities" of hTRT and TRTs, as generally described above. The assay can involve the ex vivo modification of cells manipulated to express telomerase with or without its RNA moiety or associated proteins, and can be re-implanted into an animal that can be used for an in vivo test. The invention thus provides in vivo as-say and transgenic animals useful therefor. Knockout cells in which one or more units of the endogenous telomerase-enzyme complex have been deleted or inhibited and cells in which exogenous or endogenous telomerase activity has been reconstituted can be used in these in vivo assay systems or is activated.

Telomerasen und TRT-Proteine, die ortsspezifisch (z.B. durch ortsgerichtete Mutation) zur Modifizierung oder Deletion einer oder aller Funktionen des Telomerase-Enzyms oder des TRT-Proteins modifiziert wurden, können ebenso zur Entdeckung therapeutischer Agensien in den erfindungsgemässen Screening-Verfahren angewandt werden. Beispielsweise kann TRT so manipuliert werden, dass es seine Fähigkeit verliert, Substrat-DNA zu binden, seine RNA-Einheit (wie hTR) zu binden, die Hinzufügung von Telomer-DNA zu katalysieren, Desoxynucleotid-Substrate zu binden, nucleolytische Aktivität aufzuweisen, Telomer-assoziierte Proteine oder chromosomale Strukturen zu binden etc. Die erhaltenen «Mu-tanten-Proteine» oder «Muteine» können zur Identifizierung von Verbindungen verwendet werden, die eine, mehrere oder alle Funktionen oder Aktivitäten des TRT-Proteins oder der Telomerase spezifisch modulieren. Telomerases and TRT proteins that have been modified site-specifically (e.g. by site-directed mutation) to modify or delete one or all functions of the telomerase enzyme or the TRT protein can also be used to discover therapeutic agents in the screening methods according to the invention. For example, TRT can be manipulated to lose its ability to bind substrate DNA, to bind its RNA moiety (such as hTR), to catalyze the addition of telomeric DNA, to bind deoxynucleotide substrates, to have nucleolytic activity, telomer -binding associated proteins or chromosomal structures, etc. The “mutant proteins” or “muteins” obtained can be used to identify compounds which specifically modulate one, more or all functions or activities of the TRT protein or telomerase.

C. Beispiele für Telomerase-Modulatoren 1) Allgemeines C. Examples of Telomerase Modulators 1) General

Bei den Testverbindungen, auf die vorstehend hingewiesen wurde, kann es sich um eine grosse Vielzahl von Verbindungen handeln, sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische, organische und inorganische Verbindungen, sowie Polymere (z.B. Oligopeptide, Polypeptide, Oligonucleotide und Polynucleotide) sowie kleine Moleküle, Antikörper (wie hier ausführlich definiert), Zucker, Fettsäuren, Nucleotide und Nucleotid-Analoge, Analoge von natürlich vorkommenden Strukturen (z.B. Peptid-«Imitatoren», Nucleinsäureanaloge etc.) und zahlreiche weitere Verbindungen. The test compounds referred to above can be a large variety of compounds, both naturally occurring and synthetic, organic and inorganic compounds, as well as polymers (e.g. oligopeptides, polypeptides, oligonucleotides and polynucleotides) as well as small molecules, antibodies (as defined in detail here), sugars, fatty acids, nucleotides and nucleotide analogs, analogs of naturally occurring structures (eg peptide “imitators”, nucleic acid analogs etc.) and numerous other compounds.

Die Erfindung stellt alle Arten von Modulatoren bereit ohne Beschränkung auf einen bestimmten Wir84 The invention provides all types of modulators without being limited to any particular wir84

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

kungsmechanismus. Zum Zweck der Veranschaulichung werden im folgenden Beispiele für Modulatoren, zu denen Verbindungen oder Behandlungen zählen, aufgelistet: mechanism. For purposes of illustration, the following are examples of modulators that include compounds or treatments:

(i) Sie binden an das hTRT-Polypeptid (z.B. das aktive Zentrum des Enzyms) oder an einen anderen Telomerasebestandteil und beeinflussen eine Telomerase-Aktivität; (i) they bind to the hTRT polypeptide (e.g. the active center of the enzyme) or to another telomerase component and affect telomerase activity;

(ii) sie hemmen oder fördern die Assoziierung oder hemmen oder fördern die Dissoziierung eines Telomerase-Bestandteils (z.B. hTRT oder das hTRT-hTR-RNP) mit einem Telomerase-assoziierten Protein (zu denen beispielsweise die im vorgehenden Abschnitt IV(D) zählen); (ii) inhibit or promote association or inhibit or promote dissociation of a telomerase component (e.g. hTRT or the hTRT-hTR-RNP) with a telomerase-associated protein (which include, for example, those in section IV (D) above) ;

(iii) sie hemmen oder fördern die Assoziierung oder hemmen oder fördern die Dissoziierung von Telomerase-Polypeptiden (z.B. hTRT) mit einer Telomerase-RNA (z.B. hTR); (iii) inhibit or promote association or inhibit or promote dissociation of telomerase polypeptides (e.g. hTRT) with a telomerase RNA (e.g. hTR);

(iv) sie hemmen oder fördern die Assoziierung oder hemmen oder fördern die Dissoziierung von Te-lomerase-Polypeptiden (z.B. hTRT) mit Chromosomen (z.B. Telomeren) oder chromosomaler DNA (z.B. Telomer-DNA); (iv) inhibit or promote association or inhibit or promote dissociation of telomerase polypeptides (e.g. hTRT) with chromosomes (e.g. telomeres) or chromosomal DNA (e.g. telomeric DNA);

(v) sie steigern oder senken die Expression eines Genprodukts eines Telomerase-Bestandteils (z.B. Produkte des hTRT-Gens), wozu auch Veränderungen der Rate oder des Spiegels der Transkription des TRT-Gens oder der Translation zählen, der Transport oder die Stabilität eines Genprodukts etc. durch Bindung an das Gen oder Genprodukt (z.B. durch Wechselwirkung mit einem Faktor (z.B. ein die Transkription regulierendes Protein), der die Transkription des hTRT-Gens oder eines anderen Telome-rase-Bestandteils beeinflusst). (v) they increase or decrease the expression of a gene product of a telomerase component (eg products of the hTRT gene), including changes in the rate or level of transcription of the TRT gene or translation, the transport or the stability of a gene product etc. by binding to the gene or gene product (for example by interaction with a factor (for example a transcription regulating protein) which influences the transcription of the hTRT gene or another telomerase component).

2) Peptid-Modulatoren 2) Peptide modulators

Zu den möglichen Modulatoren von Telomerase-Aktivität zählen auch Peptide (z.B. hemmende (Antagonist) und aktivierende (Agonist) Peptid-Modulatoren). Beispielsweise können Oligopeptide mit nach dem Zufallsprinzip erzeugten Sequenzen gescreent werden, um so Peptidmodulatoren (Agonisten oder Inhibitoren) von Telomerase-Aktivität auffinden zu können. Solche Peptide können direkt als Wirkstoffe vewendet werden, oder um die Orientierung oder Lage einer funktionellen Gruppe aufzufinden, die eine Telomerase-Aktivität hemmen kann, was wiederum zum Entwurf und dem Austesten eines inhibitorischen kleinen Moleküls führt, oder wobei das Peptid das Rückgrat für chemische Modifizierung wird, die dessen pharmakologischen Vewendungsmöglichkeiten steigern. Bei dem Peptid kann es sich um strukturelle «Imitatoren» handeln, und Molekülmodulierungsprogramme können vewendet werden, um «Imitatoren» basierend auf der charakteristischen Sekundär- und/oder Tertiärstruktur eines Telomerase-Enzyms und hTRT-Proteins zu entwerfen. Solche strukturellen «Imitatoren» können auch in vivo als Modulatoren von Telomerase-Aktivität (Agonisten und Antagonisten) vewendet werden. Strukturelle «Imitatoren» können auch als Immunogene zur Erzeugung von anti-Telomerase- oder anti-TRT-Protein-Antikörpern vewendet werden. Possible modulators of telomerase activity also include peptides (e.g. inhibitory (antagonist) and activating (agonist) peptide modulators). For example, oligopeptides can be screened with randomly generated sequences so that peptide modulators (agonists or inhibitors) of telomerase activity can be found. Such peptides can be used directly as drugs, or to find the orientation or location of a functional group that can inhibit telomerase activity, which in turn leads to the design and testing of an inhibitory small molecule, or where the peptide is the backbone for chemical modification will increase its pharmacological uses. The peptide can be structural “imitators” and molecular modulation programs can be used to design “imitators” based on the characteristic secondary and / or tertiary structure of a telomerase enzyme and hTRT protein. Such structural “imitators” can also be used in vivo as modulators of telomerase activity (agonists and antagonists). Structural “imitators” can also be used as immunogens to generate anti-telomerase or anti-TRT protein antibodies.

3) Inhibitorische natürliche Verbindungen als Modulatoren von Telomerase-Aktivität 3) Inhibitory natural compounds as modulators of telomerase activity

Darüber hinaus kann eine grosse Anzahl von möglicheweise nützlichen aktivitätsmodifizierenden Verbindungen in Extrakten von natürlichen Produkten als Ausgangsmaterial gescreent werden. Solche Extrakte können aus einer grossen Anzahl von Quellen stammen, nämlich den Spezies Pilze, Actinomyce-ten, Algen, Insekten, Protozoen, Pflanzen und Bakterien. Die Extrakte, die inhibitorische Aktivität zeigen, können dann zur Isolierung des aktiven Moleküls analysiert werden. Siehe beispielsweise Turner, i. Eth-nopharmacol. 51 (1-3) (1996), 39-43 und Suh, Antcancer Res. 15 (1995) 233-239. In addition, a large number of potentially useful activity modifying compounds can be screened in extracts from natural products as a starting material. Such extracts can come from a large number of sources, namely the species fungi, actinomyces, algae, insects, protozoa, plants and bacteria. The extracts that show inhibitory activity can then be analyzed to isolate the active molecule. See for example Turner, i. Eth-nopharmacol. 51 (1-3) (1996), 39-43 and Suh, Antcancer Res. 15 (1995) 233-239.

4) Inhibitorische Oligonucleotide 4) Inhibitory oligonucleotides

Zu einem besonders nützlichen Satz an Inhibitoren, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, gehören Oligonucleotide, die entweder an eine hTRT-Protein codierende mRNA binden können, oder an das hTRT-Gen, wobei in beiden Fällen die Herstellung von funktionellem hTRT-Protein verhindert oder gehemmt wird. Andere erfindungsgemässe Oligonucleotide interagieren mit der RNA-Einheit von Telomerase, beispielsweise hTR, oder können die Bindung von Telomerase oder hTRT an sein jeweiliges DNA-Ziel, oder von einem Telomerase-Bestandteil an einen anderen oder an ein Substrat verhindern. Solche Oligonucleotide können auch das Telomerase-Enzym hTRT-Protein oder Protein und RNA und, wie bereits vorstehend beschrieben, eine partielle Aktivität inhibieren (wie z.B. deren prozessive Aktivität, reverse Transkriptase-Aktivität, nucleolytische Aktivität etc.). Die Assoziierung kann über eine Sequenz-spezifische Hybridisierung an eine andere Nucleinsäure oder durch eine allgemeine Bindung, wie beispielsweise einem Aptamer, oder durch beides erfolgen. A particularly useful set of inhibitors provided by the present invention include oligonucleotides that can either bind to an mRNA encoding hTRT protein or to the hTRT gene, in both cases preventing the production of functional hTRT protein or is inhibited. Other oligonucleotides according to the invention interact with the RNA unit of telomerase, for example hTR, or can prevent the binding of telomerase or hTRT to its respective DNA target, or from one telomerase component to another or to a substrate. Such oligonucleotides can also inhibit the telomerase enzyme hTRT protein or protein and RNA and, as already described above, a partial activity (such as their process activity, reverse transcriptase activity, nucleolytic activity etc.). The association can be via a sequence-specific hybridization to another nucleic acid or through a general binding, such as an aptamer, or both.

Telomerase-Aktivität kann dadurch gehemmt werden, dass die hTRT-mRNA mit «anti-sense»-Oli-gonucleotiden als Ziel versehen wird, die die hTRT-mRNA binden können. Telomerase activity can be inhibited by targeting the hTRT mRNA with “anti-sense” oligonucleotides which can bind the hTRT mRNA.

Zu einer weiteren nützlichen Klasse von Inhibitoren zählen Oligonucleotide, die eine Inaktivierung oder Spaltung von hTRT-mRNA oder hTR bewirken. Dabei ist das Oligonucleotid chemisch modifiziert, oder weist enzymatische Aktivität auf, was solch eine Spaltung bewirkt. Zu solchen Oligonucleotiden zählen Ribozyme oder an ein Oligonucleotid gebundenes EDTA. Es kann sich auch um eine kovalente Another useful class of inhibitors include oligonucleotides that inactivate or cleave hTRT mRNA or hTR. The oligonucleotide is chemically modified or has enzymatic activity, which causes such cleavage. Such oligonucleotides include ribozymes or EDTA bound to an oligonucleotide. It can also be a covalent one

85 85

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Bindung handeln, beispielsweise Psoralen oder quervernetzende Reagenzien, die an ein Oligonucleotid gebunden sind. Wie bereits vorstehend angemerkt, kann ein Pool von vielen unterschiedlichen solcher Oligonucleotide nach solchen mit der gewünschten Aktivität gescreent werden. Act binding, for example psoralen or cross-linking reagents that are bound to an oligonucleotide. As noted above, a pool of many different such oligonucleotides can be screened for those with the desired activity.

Zu einer weiteren Klasse von nützlichen Inhibitoren zählen Oligonucleotide, die Polypeptide binden. Doppel- oder einzelsträngige DNA-Moleküle oder doppel- oder einzelsträngige RNA-Moleküle, die an spezifische Polypeptidziele binden, werden «Aptamere» genannt. Die spezifische Oligonucleotid/Poly-peptid-Assoziierung kann durch elektrostatische Wechselwirkungen vermittelt werden. Beispielsweise binden Aptamere spezifisch an Anionenbindende Aussenseiten auf Thrombin, das an das polyanioni-sche Heparin physiologisch bindet (Bock, Nature 355 (1992), 564-566). Da hTRT-Protein sowohl an hTR als auch deren DNA-Substrat bindet, und da die vorliegende Erfindung hTRT- und andere TRT-Proteine in gereinigter Form in grossen Mengen bereitstellt, kann der Fachmann unter Verwendung der erfindungsgemässen Verfahren leicht nach TRT-bindenden Aptameren screenen. Another class of useful inhibitors include oligonucleotides that bind polypeptides. Double or single stranded DNA molecules or double or single stranded RNA molecules that bind to specific polypeptide targets are called "aptamers". The specific oligonucleotide / poly-peptide association can be mediated by electrostatic interactions. For example, aptamers bind specifically to anion-binding outer sides on thrombin which physiologically binds to the polyanionic heparin (Bock, Nature 355 (1992), 564-566). Since hTRT protein binds to both hTR and its DNA substrate, and since the present invention provides hTRT and other TRT proteins in large quantities in purified form, the person skilled in the art can easily screen for TRT-binding aptamers using the methods according to the invention .

Oligonucleotide (z.B. RNA-Oligonucleotide), die Telomerase, hTRT, HTR oder Anteile davon binden, können mittels der SELEX-Verfahren erzeugt werden (Tuerk, Methods Mol. Biol. 67 (1997), 2190). Bei diesem Verfahren wird ein sehr grosser Pool (106-109) aus Nucleinsäuren mit Zufallssequenzen unter Bedingungen an das Ziel (z.B. hTRT) gebunden, die einer sehr starken Unterscheidung zwischen Molekülen mit hoher Affinität und niedriger Affinität bezüglich der Bindung des Ziels führen. Die gebundenen Moleküle werden von nichtgebundenen abgetrennt und die gebundenen Moleküle kraft einer spezifischen Nucleinsäuresequenz, die in ihren Enden enthalten ist, und mittels geeigneter Amplifikationsrea-genzien amplifiziert. Dieser Prozess wird verschiedene Male solange wiederholt, bis eine relativ kleine Anzahl von Molekülen übrig bleibt, die eine hohe Bindungsaffinität für das Ziel aufweisen. Diese Moleküle können im Anschluss daran auf ihre Fähigkeit Telomerase-Aktivität zu modulieren, wie hier beschrieben, getestet werden. Oligonucleotides (e.g. RNA oligonucleotides) that bind telomerase, hTRT, HTR or portions thereof can be generated using the SELEX method (Tuerk, Methods Mol. Biol. 67 (1997), 2190). In this method, a very large pool (106-109) of nucleic acids with random sequences is bound to the target under conditions (e.g. hTRT) which result in a very strong distinction between molecules with high affinity and low affinity with regard to the binding of the target. The bound molecules are separated from unbound ones and the bound molecules are amplified by means of a specific nucleic acid sequence which is contained in their ends and by means of suitable amplification reagents. This process is repeated several times until a relatively small number of molecules remain that have a high binding affinity for the target. These molecules can then be tested for their ability to modulate telomerase activity as described here.

Antagonisten einer Telomerase-vermittelten DNA-Replikation können auch auf einer Hemmung von hTR (Norton, Nature Biotechnology 14 (1996) 615-619) über komplementäre Sequenz-Erkennung oder -Spaltung, wie dies bei Ribozymen der Fall ist, basieren. Antagonists of telomerase-mediated DNA replication can also be based on inhibition of hTR (Norton, Nature Biotechnology 14 (1996) 615-619) via complementary sequence recognition or cleavage, as is the case with ribozymes.

Die erfindungsgemässen inhibitorischen Oligonucleotide können unter Venwendung einer Vielfalt von auf dem Fachgebiet gut bekannten Verfahren in die Zelle transferiert werden. Beispielsweise können Oligonucleotide spontan ohne spezifische Modifikation in das Plasma transportiert werden. In einer alternativen Ausführungsform können sie mittels Liposomen, die mit der zellulären Membran fusionieren oder durch Endocytose aufgenommen werden, zugeliefert werden, d.h. durch die Verwendung vom an das Liposom angehefteten Liganden oder durch direkte Anheftung an das Oligonucleotid, wobei diese dann an Oberflächenmembran-Proteinrezeptoren der Zelle binden, was zu einer Endocytose führt. In einer alternativen Ausführungsform können die Zellen zur Steigerung des Transports der Oligonucleotide in die Zelle ohne Verletzung der Wirtszellen permeabilisiert werden. Es kann auch ein DNA-bindendes Protein, beispielsweise HBGF-1, von dem bekannt ist, dass es ein Oligonucleotid in eine Zelle transportieren kann, verwendet werden. The inhibitory oligonucleotides of the invention can be transferred into the cell using a variety of methods well known in the art. For example, oligonucleotides can be transported into the plasma spontaneously without specific modification. In an alternative embodiment, they can be delivered by means of liposomes that fuse with the cellular membrane or are taken up by endocytosis, i.e. by using the ligand attached to the liposome or by direct attachment to the oligonucleotide, which then bind to surface membrane protein receptors of the cell, resulting in endocytosis. In an alternative embodiment, the cells can be permeabilized to increase the transport of the oligonucleotides into the cell without damaging the host cells. A DNA binding protein, for example HBGF-1, which is known to transport an oligonucleotide into a cell, can also be used.

5) Inhibitorische Ribozyme 5) Inhibitory ribozymes

Ribozyme wirken durch Bindung an eine Ziel-RNA über den die Ziel-RNA bindenden Anteil eines Ri-bozyms, der in enger Nachbarschaft zu einem enzymatischen Anteil der RNA gehalten wird, der die Ziel-RNA spaltet. Somit erkennt und spaltet das Ribozym eine Ziel-RNA normalerweise über Paarung mit komplementären Basen und nachdem es an der richtigen Stelle gebunden ist wirkt es als Enzym, wobei es die Ziel-RNA spaltet und inaktiviert. Die Spaltung einer Ziel-RNA auf eine solche Weise zerstört deren Fähigkeit, die Synthese eines codierten Proteins zu steuern, vorausgesetzt, die Spaltung geschieht in der codierenden Sequenz. Nachdem ein Ribozym sein RNA-Ziel gebunden und gespalten hat, wird es typischerweise von der RNA freigesetzt, so dass es wiederholt neue Ziele binden und spalten kann. Ribozymes act by binding to a target RNA via the portion of a ri-enzyme that binds the target RNA, which is kept in close proximity to an enzymatic portion of the RNA that cleaves the target RNA. Thus, the ribozyme normally recognizes and cleaves a target RNA via pairing with complementary bases and, once bound in the right place, acts as an enzyme, cleaving and inactivating the target RNA. Cleaving a target RNA in such a manner destroys its ability to direct the synthesis of a coded protein, provided that the cleavage occurs in the coding sequence. After a ribozyme has bound and cleaved its RNA target, it is typically released from the RNA so that it can repeatedly bind and cleave new targets.

6) Die Identifizierung von Telomerase-Assoziierten Proteinen zur Verwendung als Modulatoren 6) The identification of telomerase-associated proteins for use as modulators

In einer erfindungsgemässen Ausführungsform wird die Telomerase zur Identifizierung von Telomera-se-assoziierten Proteinen verwendet, d.h. Telomerase-assoziierten Proteinen, die Telomerase-Aktivität modulieren oder ansonsten ergänzen. Wie bereits vorstehend angemerkt, können diese Proteine oder Fragmente davon eine Funktion dadurch modulieren, dass sie die Dissoziierung des Telomerase-En-zymkomplexes bewirken oder die Assoziierung verhindern, die Assemblierung des Telomerase-Komple-xes verhindern, hTRT an deren Bindung an ihre, eine ergänzende Einheit darstellende Nucleinsäure hindern oder an ihre Bindung an ihre DNA-Matrize, hTRT an der Bindung von Nucleotiden hindern, oder eine oder mehrere oder alle der Teilaktivitäten des Telomerase-Enzyms oder des hTRT-Proteins, wie bereits vorstehend beschrieben, verhindern, steigern oder hemmen. In one embodiment of the invention, telomerase is used to identify telomerase-associated proteins, i.e. Telomerase-associated proteins that modulate or otherwise complement telomerase activity. As noted above, these proteins or fragments thereof can modulate a function by causing the telomerase-enzyme complex to dissociate or prevent association, prevent assembly of the telomerase complex, hTRT from binding to their one prevent complementary unit-forming nucleic acid or prevent it from binding to its DNA template, hTRT from binding nucleotides, or prevent, increase or increase one or more or all of the partial activities of the telomerase enzyme or the hTRT protein as already described above inhibit.

Der Fachmann kann die erfindungsgemässen Verfahren für den Nachweis dafür verwenden, welche Anteile (z.B. Domänen) dieser Telomerase-assoziierten Proteine mit Telomerase in Kontakt kommen. In einer erfindungsgemässen Ausführungsform werden diese Telomerase-assoziierten Proteine oder Fragmente davon als Modulatoren von Telomerase-Aktivität verwendet. The person skilled in the art can use the methods according to the invention for the detection of which fractions (e.g. domains) of these telomerase-associated proteins come into contact with telomerase. In an embodiment according to the invention, these telomerase-associated proteins or fragments thereof are used as modulators of telomerase activity.

86 86

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

7) Telomerase-Assoziierte Proteine als Dominant-negative Mutanten 7) Telomerase-associated proteins as dominant-negative mutants

In einer erfindungsgemässen Ausführungsform werden Telomerase-assoziierte Proteine als Modulatoren von Telomerase-Aktivität verwendet. Zu Telomerase-assoziierten Proteinen zählen chromosomale Strukturen, beispielsweise Histone, Proteine der nucleären Matrix, Kontrollproteine der Zellteilung/des Zellcyclus etc. Zu weiteren Telomerase-assoziierten Proteinen, die für den erfindungsgemässen Zweck als Modulatoren verwendet werden können! zählen p80 und p95, das menschliche Protein und ihre menschlichen Homologe, beispielsweise TP1 und TRF-1 (Chong, Science 270 (1995), 1663-1667). Zusätzlich können Fragmente dieser Telomerase-assoziierten Proteine vom Fachmann gemäss den erfindungsgemässen Verfahren identifiziert und als Modulatoren von Telomerase-Aktivität verwendet werden. In an embodiment according to the invention, telomerase-associated proteins are used as modulators of telomerase activity. Telomerase-associated proteins include chromosomal structures, for example histones, proteins of the nuclear matrix, control proteins of cell division / cell cycle, etc. Other telomerase-associated proteins which can be used as modulators for the purpose according to the invention! include p80 and p95, the human protein and their human homologs, for example TP1 and TRF-1 (Chong, Science 270 (1995), 1663-1667). In addition, fragments of these telomerase-associated proteins can be identified by the person skilled in the art in accordance with the methods according to the invention and used as modulators of telomerase activity.

8) Dominant-negative Mutanten 8) Dominant-negative mutants

Acht hochkonservierte Motive wurden innerhalb der TRTs verschiedener nicht-menschlicher Spezies identifiziert, wie bereits vorstehend beschrieben (siehe auch Lingner, Science 276 (1997), 561-567). Fig. 4 zeigt ein Schema der menschlichen TRT (hTRT)-codierenden cDNA-Sequenz (von pGRN121) und von RT-Motiven im Vergleich zu S. pombe-Trtlp, Euplotes p123 und S. cerevisiae Est2p. Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante und synthetische Nucleinsäuren bereit, in denen die Codons für die konservierten Aminosäurereste in jedem der acht Motive gegen jedes der anderen Codons ausgetauscht wurden. Eine Vielzahl der erhaltenen codierten Sequenzen exprimieren eine nichtfunktionelle hTRT. Siehe beispielsweise Beispiel 16. Somit stellt die vorliegende Erfindung beispielsweise eine grosse Anzahl von «mutierten» Telomerase-Enzymen und TRT-Proteinen zur Verfügung, die eine Teilaktivität von Telomerase aufweisen, jedoch nicht die gesamte Aktivität. Beispielsweise kann eine solche Polymerase telomere Strukturen binden, jedoch nicht Telomerase-assoziierte RNA (d.h. hTR). Solch eine Telomerase-Mutante kann, wenn sie in ausreichend hoher Konzentration exprimiert wird, zur Verarmung eines notwendigen Telomerase-Bestandteils (z.B. hTR) führen und dadurch als ein Inhibitor von Wildtyp-Telomerase-Aktivität fungieren. Eine auf diese Weise wirkende mutierte Telomerase stellt einen Antagonisten dar oder eine sogenannte «dominant-negative» Mutante. Eight highly conserved motifs were identified within the TRTs of various non-human species, as already described above (see also Lingner, Science 276 (1997), 561-567). Figure 4 shows a schematic of the human TRT (hTRT) coding cDNA sequence (from pGRN121) and RT motifs compared to S. pombe-Trtlp, Euplotes p123 and S. cerevisiae Est2p. The present invention provides recombinant and synthetic nucleic acids in which the codons for the conserved amino acid residues in each of the eight motifs have been exchanged for each of the other codons. A large number of the coded sequences obtained express a non-functional hTRT. See, for example, Example 16. Thus, for example, the present invention provides a large number of “mutated” telomerase enzymes and TRT proteins which have partial activity of telomerase but not all of the activity. For example, such a polymerase can bind telomeric structures, but not telomerase-associated RNA (i.e. hTR). Such a telomerase mutant, when expressed at a high enough concentration, can deplete a necessary telomerase component (e.g. hTR) and thereby act as an inhibitor of wild-type telomerase activity. A mutant telomerase acting in this way represents an antagonist or a so-called "dominant-negative" mutant.

9) Antikörper 9) Antibodies

Die erfindungsgemässen Antikörper können allgemein zur Identifizierung, Reinigung oder Hemmung irgendeiner oder aller Aktivitäten eines Telomerase-Enzyms und hTRT-Proteins vewendet werden. Antikörper können als Antagonisten von Telomerase-Aktivität auf verschiedene Weise wirken, beispielsweise dadurch, dass sie verhindern, dass der Telomerase-Komplex oder das Nucleotid an deren DNA-Sub-strate bindet, dadurch, dass sie verhindern, dass die Telomerase-Bestandteile einen aktiven Komplex bilden, durch Aufrechterhaltung einer funktionellen (Telomerase-Komplex) quaternären Struktur oder durch Bindung an eine der aktiven Zentren des Enzyms oder an andere Stellen, die allosterische Auswirkungen auf Aktivität haben (die unterschiedlichen Teilaktivitäten von Telomerase sind ausführlich an anderer Stelle dieser Beschreibung beschrieben). The antibodies of the invention can generally be used to identify, purify or inhibit any or all of the activities of a telomerase enzyme and hTRT protein. Antibodies can act as antagonists of telomerase activity in various ways, for example, by preventing the telomerase complex or the nucleotide from binding to their DNA substrates, by preventing the telomerase components from being active Complex by maintaining a functional (telomerase complex) quaternary structure or by binding to one of the active centers of the enzyme or to other sites that have allosteric effects on activity (the different partial activities of telomerase are described in detail elsewhere in this description) .

D) Das Entwerfen von Modulatoren D) Designing modulators

Die erfindungsgemässen Telomerase-Modulatoren können mittels Verfahren, die in der Pharmazie gut bekannt sind, entworfen oder hergestellt werden, dazu gehören kombinatorische Verfahren und «rational drug design»-Verfahren. The telomerase modulators according to the invention can be designed or manufactured using methods that are well known in pharmacy, including combinatorial methods and “rational drug design” methods.

1) Methodik der kombinatorischen Chemie 1) Methodology of combinatorial chemistry

Die Herstellung und das simultane Screenen von grossen Banken aus synthetischen Molekülen kann mittels gut bekannter Verfahren der kombinatorischen Chemie ausgeführt werden, siehe beispielsweise van Breemen, Anal. Chem. 69 (1997), 2159-2164 und Lam, Anticancer Drug Des. 12 (1997), 145-167. The production and simultaneous screening of large banks of synthetic molecules can be carried out using well known combinatorial chemistry techniques, see for example van Breemen, Anal. Chem. 69 (1997), 2159-2164 and Lam, Anticancer Drug Des. 12: 145-167 (1997).

Wie bereits vorstehend angemerkt, kann die Methodik der kombinatorischen Chemie dazu vewendet werden, eine riesige Anzahl von Oligonucleotiden zu erzeugen, die hinsichtlich spezifischer- Oligonucleotide, die geeignete Bindungsaffinitäten besitzen, sehr schnell gescreent werden können und Spezifitäten gegen ein beliebiges Ziel, wie die erfindungsgemässen TRT-Proteine, können genutzt werden (siehe für eine allgemeine Hintergrundinformation Gold, J. of Biol. Chem. 270 (1995), 13581-13584). As noted above, combinatorial chemistry methodology can be used to generate a huge number of oligonucleotides that can be screened very quickly for specific oligonucleotides that have suitable binding affinities and specificities against any target, such as the inventive TRT -Proteins can be used (see for a general background information Gold, J. of Biol. Chem. 270 (1995), 13581-13584).

2) «Rational Drug Design» 2) "Rational Drug Design"

«Rational drug design» beinhaltet einen integrierten Satz an Methoden, zu denen die Strukturanalyse von Zielmolekülen, synthetische Chemie und fortgeschrittene Computerverfahren zählen. Bei der Verwendung zum Entwurf von Modulatoren, beispielsweise Antagonisten/Inhibitoren von Proteinzielen, wie beispielsweise das Telomerase-Enzym und hTRT-Protein, besteht das Ziel von «rational drug design» in einem Verständnis der dreidimensionalen Gestalt und der Chemie eines Moleküls. «Rational drug de87 "Rational drug design" includes an integrated set of methods, including structural analysis of target molecules, synthetic chemistry and advanced computer processes. When used to design modulators, such as antagonists / inhibitors of protein targets, such as the telomerase enzyme and hTRT protein, the goal of "rational drug design" is to understand the three-dimensional shape and chemistry of a molecule. «Rational drug de87

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

sign» wird unterstützt von Daten, die durch Röntgenstrukturanalyse oder NMR gewonnen wurden und die nun für das hTRT-Protein und Telomerase-Enzym gemäss den durch die Erfindung bereitgestellten Verfahren und unter Verwendung der erfindungsgemässen Reagenzien bestimmt werden können. Hilfreich sind auch Berechnungen hinsichtlich elektrostatischer Eigenschaften, Hydrophobizitäten und der Lösungsmittelzugänglichkeit. Siehe beispielsweise Coldren, Proc. Nati. Acad. Sei. USA 94 (1997), 6635-6640. sign »is supported by data obtained by X-ray structure analysis or NMR and which can now be determined for the hTRT protein and telomerase enzyme according to the methods provided by the invention and using the reagents according to the invention. Calculations with regard to electrostatic properties, hydrophobicity and solvent access are also helpful. See, for example, Coldren, Proc. Nati. Acad. Be. USA 94: 6635-6640 (1997).

D) Kits D) kits

Die Erfindung stellt auch Kits bereit, die zu einer Bestimmung dafür verwendet werden können, ob eine Testverbindung ein Modulator einer TRT-Aktivität ist. Der Kit beinhaltet typische weise eine oder mehrere der folgenden Bestandteile: ein im wesentlichen gereinigtes TRT-Polypeptid oder Polynucleotid (einschliesslich Sonden und Primern), ein Plasmid, das eine TRT (z.B. hTRT) exprimieren kann, wenn es in eine Zelle oder ein zellfreies Expressionssystem eingeführt wird; ein Plasmid, das eine TR (z.B. hTR) exprimieren kann, wenn es in eine Zelle oder ein zellfreies Expressionssystem eingeführt wird; Zellen oder Zellinien; eine Zusammensetzung zum Nachweis einer Veränderung in einer TRT-Aktivität und eine Anleitung die zeigt, wie eine Veränderung in der TRT-Aktivität nachgewiesen und gemessen werden kann, wobei angezeigt wird, dass eine Änderung in der Telomerase-Aktivität in Gegenwart der Testverbindung ein Indikator dafür ist, ob die Testverbindung die Telomerase-Aktivität moduliert und ein Behälter. Der Kit kann auch Mittel enthalten, wie beispielsweise ein TRAP-Assay oder ein Assay, der auf einer quantitativen Polymerase-Kettenrekation beruht, um so eine Änderung in einer TRT-Aktivität messen zu können. Der Kit kann auch eine Anleitung dafür enthalten, wie eine Veränderung in der TRT-Aktivität nachgewiesen und gemessen werden kann, wobei angezeigt wird, dass eine Veränderung in der Telomerase-Aktivität in Anwesenheit der Testverbindung ein Indikator dafür ist, ob die Testverbindung die Telomerase-Aktivität moduliert. The invention also provides kits that can be used to determine whether a test compound is a modulator of TRT activity. The kit typically includes one or more of the following: an essentially purified TRT polypeptide or polynucleotide (including probes and primers), a plasmid that can express a TRT (e.g. hTRT) when in a cell or a cell-free expression system is introduced; a plasmid that can express a TR (e.g. hTR) when introduced into a cell or cell-free expression system; Cells or cell lines; a composition for detecting a change in TRT activity and a guide showing how a change in TRT activity can be detected and measured, indicating that a change in telomerase activity in the presence of the test compound is an indicator of this is whether the test compound modulates telomerase activity and a container. The kit may also include agents such as a TRAP assay or a quantitative polymerase chain reaction based assay so as to measure a change in TRT activity. The kit may also include instructions on how to detect and measure a change in TRT activity, indicating that a change in telomerase activity in the presence of the test compound is an indicator of whether the test compound is the telomerase Activity modulated.

XI. Transgene Organismen (Telomerase-«knockout»-Zellen und Tiermodelle) XI. Transgenic organisms (telomerase “knockout” cells and animal models)

Die Erfindung stellt auch transgene nicht-menschliche mehrzellige Organismen (z.B. Pflanzen und Tiere) oder einzellige Organismen (z.B. Hefe) bereit, die eine exogene TRT-Gensequenz enthalten, bei der es sich um eine codierende Sequenz oder eine regulatorische Sequenz (z.B. einen Promotor) handeln kann. In einer Ausführungsform exprimiert der Organismus ein exogenes TRT-Polypeptid mit einer Sequenz von einem menschlichen TRT-Protein. In einer verwandten Ausführungsform exprimiert der Organismus auch einen Telomerase-RNA-Bestandteil (z.B. hTR). The invention also provides transgenic non-human multicellular organisms (e.g. plants and animals) or unicellular organisms (e.g. yeast) which contain an exogenous TRT gene sequence which is a coding sequence or a regulatory sequence (e.g. a promoter) can act. In one embodiment, the organism expresses an exogenous TRT polypeptide with a sequence from a human TRT protein. In a related embodiment, the organism also expresses a telomerase RNA component (e.g. hTR).

Die Erfindung stellt auch einzellige und mehrzellige Organismen (oder Zellen davon) bereit, bei denen mindestens ein, eine Telomerase-Untereinheit (z.B. TRT oder TR) oder ein Telomerase-assoziiertes Protein codierendes Gen mutiert oder deletiert ist (d.h. in einem codierenden oder regulatorischen Bereich), so dass keine native Telomerase exprimiert wird oder diese mit einem herabgesetzen Spiegel exprimiert oder im Vergleich zu Wildtypzellen oder Organismen mit unterschiedlichen Aktivitäten exprimiert wird. Solche Zellen und Organismen werden oft als «gene knock-out»-Zellen oder -Organismen bezeichnet. The invention also provides unicellular and multicellular organisms (or cells thereof) in which at least one gene encoding a telomerase subunit (e.g. TRT or TR) or a telomerase-associated protein is mutated or deleted (ie in a coding or regulatory region ), so that no native telomerase is expressed or that it is expressed with a reduced level or is expressed in comparison with wild-type cells or organisms with different activities. Such cells and organisms are often referred to as “gene knock-out” cells or organisms.

Die Erfindung stellt ferner Zellen und Organismen bereit, bei denen ein endogenes Telomerase-Gen (z.B. Maus-TRT) mutiert oder deletiert ist und ein exogenes Telomerase-Gen (z.B. für menschliche TRT) eingeführt und exprimiert wird. Zellen und Organismen dieses Typs sind beispielsweise als Modellsysteme von Nutzen, um: Modulatoren von hTRT-Aktivität oder -Expression zu identifizieren; die Auswirkungen von Mutationen in Genen für Telomerase-Bestandteile bestimmen zu können und beispielsweise das Timing im Hinblick auf den Entwicklungszustand und die Gewebelokalisierung von Telomerase-Aktivität bestimmen zu können (um beurteilen zu können, wann ein Telomerase-Modulator verabreicht werden soll und um mögliche Nebenwirkungen feststellen zu können). The invention further provides cells and organisms in which an endogenous telomerase gene (e.g. mouse TRT) is mutated or deleted and an exogenous telomerase gene (e.g. for human TRT) is introduced and expressed. For example, cells and organisms of this type are useful as model systems to: identify modulators of hTRT activity or expression; to be able to determine the effects of mutations in genes for telomerase components and, for example, to be able to determine the timing with regard to the state of development and the tissue localization of telomerase activity (in order to be able to assess when a telomerase modulator should be administered and possible side effects to be able to determine).

Zu den Beispielen für mehrzellige Organismen gehören Pflanzen, Insekten und Tiere, wie beispielsweise Mäuse, Ratten, Kaninchen, Affen, Menschenaffen, Schweine und andere Säuger. Ein Beispiel für einen einzelligen Organismus ist Hefe. Examples of multicellular organisms include plants, insects and animals such as mice, rats, rabbits, monkeys, apes, pigs and other mammals. An example of a unicellular organism is yeast.

Verfahren zur Änderung oder Unterbrechung eines spezifischen Gens (z.B. endogener TRT-Gene) sind dem Fachmann gut bekannt, siehe beispielsweise Baudin et al., Nucl. Äcids Res. 21 (1993) , 3329; Wach et al. , Yeast 10 (1994) 1793; Rothstein, Methods Enzymol. 194 (1991), 281; Anderson, Methods Cell Biol. 48 (1995), 31; Pettitt et al., Development 122 (1996), 4149-4157; Ramirez-Solis et al., Methods Enzymol. 225 (1993), 855 und Thomas et al., Cell 51 (1987), 503, wobei jedes dieser Dokumente durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil der Beschreibung anzusehen ist. Methods for changing or disrupting a specific gene (e.g. endogenous TRT genes) are well known to those skilled in the art, see for example Baudin et al., Nucl. Acids Res. 21 (1993), 3329; Wach et al. , Yeast 10 (1994) 1793; Rothstein, Methods Enzymol. 194: 281; Anderson, Methods Cell Biol. 48 (1995), 31; Pettitt et al., Development 122 (1996), 4149-4157; Ramirez-Solis et al., Methods Enzymol. 225 (1993), 855 and Thomas et al., Cell 51 (1987), 503, each of which is to be considered by reference in its entirety and for all purposes as a part of the description.

Zu den erfindungsgemässen «knockout»-Zellen und -Tieren gehören Zellen und Tiere, in denen eine oder mehrere Einheiten des endogenen Telomerase-Enzymkomplexes deletiert oder gehemmt sind. Die Rekonstitution von TelomeraseAktivität bewahrt die Zelle oder das Tier vor dem unvermeidlichen Zelltod, der durch dessen Unvermögen, Telomere zu bewahren, bedingt ist. Verfahren zur Änderung der Expression von endogenen Genen sind dem Fachmann gut bekannt. Typischerweise beinhalten solche Verfahren die Veränderung oder den Austausch aller regulatorischen Sequenzen, die die Expression ei- The “knockout” cells and animals according to the invention include cells and animals in which one or more units of the endogenous telomerase-enzyme complex have been deleted or inhibited. Reconstitution of telomerase activity prevents the cell or animal from inevitable cell death due to its inability to preserve telomeres. Methods for changing the expression of endogenous genes are well known to those skilled in the art. Typically, such methods involve the modification or replacement of all regulatory sequences that express expression.

88 88

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

nés bestimmten zu regulierenden Gens kontrollieren, oder eines Anteils davon. Die regulatorischen Sequenzen, beispielsweise der native Promotor, können verändert werden. Das übliche Verfahren für eine zielgerichtete Mutation von Genen beinhaltet die Einfügung eines, das gewünschte Gen enthaltenden genomischen DNA-Fragments in einen Vektor, wonach sich die Clonierung von zwei genomischen Armen um eine selektierbare Neomycin-Resistenzkassette in einem Thymidinkinase enthaltenden Vektor anschliesst. Mit diesem «knock-out»-Konstrukt wird dann eine geeignete Zelle transfiziert, d.h. eine embryonale Stammzelle (ES) der Maus, wobei die Zellen danach einer positiven Selektion (mittels G418 und beispielsweise auf Neomycin-Resistenz zu selektieren) und einer negativen Selektion (wobei beispielsweise FIAU vewendet wird, um Zellen auszuschliessen, denen Thymidinkinase fehlt) unterworfen werden. Dies erlaubt die Selektion von Zellen, die mit dem «knockout»-Vektor eine homologe Rekombination eingegangen sind. Dieses Vorgehen führt zur Inaktivierung des gewünschten Gens. Siehe beispielsweise die US-Patente 5 464 764; 5 631 153; 5 487 992 und 5 627 059. control certain genes to be regulated, or a portion thereof. The regulatory sequences, for example the native promoter, can be changed. The common method for targeted mutation of genes involves inserting a genomic DNA fragment containing the desired gene into a vector, followed by cloning two genomic arms around a selectable neomycin resistance cassette in a vector containing thymidine kinase. A suitable cell is then transfected with this «knock-out» construct, i.e. an embryonic stem cell (ES) of the mouse, the cells then being subjected to a positive selection (using G418 and, for example, for neomycin resistance) and a negative selection (using, for example, FIAU to exclude cells which lack thymidine kinase). This allows the selection of cells that have made a homologous recombination with the “knockout” vector. This procedure leads to the inactivation of the desired gene. See, for example, U.S. Patents 5,464,764; 5,631,153; 5,487,992 and 5,627,059.

«Knocking out»-Expression eines endogenen Gens kann auch erreicht werden mittels homologer Rekombination, die zur Einführung einer heterologen Nucleinsäure in die regulatorischen Sequenzen (z.B. einen Promotor) des gewünschten Gens verwendet wird. Um die Expression von funktionellem Enzym oder Produkt zu verhindern, sind einfache Mutationen geeignet, die entweder den Leserahmen ändern oder den Promotor unterbrechen. Zur Hochregulation der Expression kann ein nativer Promotor gegen einen heterologen Promotor ausgetauscht werden, der höhere Transkriptionsspiegel induziert. Es kann auch die «gene trap insertion» verwendet werden, um ein Wirtsgen zu unterbrechen. Embryonale Stammzellen (ES) der Maus können zur Herstellung von transgenen «knockout»-Tieren verwendet wer-denf wie dies beispielsweise in Holzschu Transgenic Res. 6 (1997), 97-106 beschrieben ist. Knocking out expression of an endogenous gene can also be achieved by means of homologous recombination, which is used to introduce a heterologous nucleic acid into the regulatory sequences (e.g. a promoter) of the desired gene. In order to prevent the expression of functional enzyme or product, simple mutations are suitable which either change the reading frame or interrupt the promoter. To upregulate expression, a native promoter can be exchanged for a heterologous promoter that induces higher levels of transcription. Gene trap insertion can also be used to interrupt a host gene. Mouse embryonic stem cells (ES) can be used to produce transgenic “knockout” animals, as described, for example, in Holzschu Transgenic Res. 6 (1997), 97-106.

Die Änderung der Expression von endogenen Genen durch homologe Rekombination kann auch unter Verwendung von Nucleinsäuresequenzen erreicht werden, die das fragliche Strukturen enthalten. Stromaufwärts gelegene Sequenzen werden dafür verwendet, um Konstrukte bezüglich einer heterologen Rekombination zum Ziel zu führen. Unter Verwendung der Information hinsichtlich des TRTStruktur-gens, beispielsweise SEQ. ID. Nr. 1, kann der Fachmann Konstrukte für eine homologe Rekombination herstellen, was lediglich Routineexperimente erforderlich macht. Homologe Rekombination zur Änderung der Expression von endogenen Genen ist beschrieben in US-Patent Nr. 5,272,071 und WO 91/09 955, WO 93/09 222, WO 96/29 411, WO 95/31 560 und WO 91/12 650. Homologe Rekombination in Myco-bakterien ist beschrieben in Azad Proc. Nati. Acad. Sei. USA 93 (1996), 4787; Baulard, J. Bacteriol. 178 (1996), 3091 und Pelicic, Mol. Microbiol. 20 (1996), 991. Homologe Rekombination in Tieren ist beschrieben von Moynahan, Hum. Mol. Genet. 5 (1996), 875 und in Pflanzen von Offringa, EMBO J. 9 (1990) 3077. The change in expression of endogenous genes by homologous recombination can also be achieved using nucleic acid sequences that contain the structures in question. Upstream sequences are used to target constructs for heterologous recombination. Using the information regarding the TRT structural gene, for example SEQ. ID. No. 1, the person skilled in the art can produce constructs for a homologous recombination, which only requires routine experiments. Homologous recombination for changing the expression of endogenous genes is described in US Pat. No. 5,272,071 and WO 91/09 955, WO 93/09 222, WO 96/29 411, WO 95/31 560 and WO 91/12 650. Homologs Recombination in Myco bacteria is described in Azad Proc. Nati. Acad. Be. USA 93 (1996), 4787; Baulard, J. Bacteriol. 178 (1996), 3091 and Pelicic, Mol. Microbiol. 20 (1996), 991. Homologous recombination in animals is described by Moynahan, Hum. Mol. Genet. 5 (1996), 875 and in plants from Offringa, EMBO J. 9 (1990) 3077.

XI. Glossar XI. glossary

Die folgenden Bezeichnungen werden nachstehend definiert, um dem Fachmann bei der Ausführung der Erfindung eine zusätzliche Anleitung zu geben: Adjuvans, Allel (& Allelsequenz), Aminosäuren (einschliesslich hydrophobe, polare, geladene), konservative Substitution, Kontrollelemente (und regulatorische Sequenzen), de ri vatisie rt, nachweisbare Markierung, erhöhter Spiegel, Epitop, günstige und ungünstige Prognose, Fusionsprotein, Genprodukt, hTR, unsterblich, Immunogen und immunogen, isoliert, Modulator, Motiv, Nucleinsäure (& Polynucleotid), Oligonucleotide (& Oligomere), funktionell verknüpft, Polypeptide, Sonde (einschliesslich Nucleinsäuresonden und Antikörpersonden), rekombinant, Selektionssystem, Sequenz, spezifische Bindung, stringente Hybridisierungsbedingungen (& Stringenz), wesentliche Identität (& wesentliche Ähnlichkeit), im wesentlichen rein (& im wesentlichen gereinigt), Telo-merase-negative und Telomerase-positive Zellen, katalytische Aktivität von Telomerase, Telomerasever-wandt und Testverbindung. The following terms are defined below to provide additional guidance to those skilled in the art when practicing the invention: adjuvant, allele (& allele sequence), amino acids (including hydrophobic, polar, charged), conservative substitution, control elements (and regulatory sequences), de ri vatisie rt, detectable labeling, elevated level, epitope, favorable and unfavorable prognosis, fusion protein, gene product, hTR, immortal, immunogen and immunogenic, isolated, modulator, motif, nucleic acid (& polynucleotide), oligonucleotides (& oligomers), functionally linked, Polypeptides, probe (including nucleic acid probes and antibody probes), recombinant, selection system, sequence, specific binding, stringent hybridization conditions (& stringency), essential identity (& essential similarity), essentially pure (& essentially purified), telomerase negative and Telomerase positive cells, catalytic activity of telomerase , Telomerase-related and test compound.

Der hier verwendete Ausdruck «Adjuvans» betrifft in seiner normalen Bedeutung jede Substanz, die die Immunantwort gegenüber einem Antigen, mit dem es vermischt ist, erhöht. Zu den für die vorliegende Erfindung nützlichen Adjuvantien gehören, jedoch ohne Beschränkung darauf, Freund's Adjuvans, Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, und oberflächenaktive Substanzen, beispielsweise Lysolecithin, plu-ronische Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, «Keyhole limpet»-Hemocyanin und Dinitrophenol. BCG («Bacillus Calmette-Guerin») und Corynebacterium parvum sind ebenfalls nützliche Adjuvantien. The term "adjuvant" as used here refers to any substance that increases the immune response to an antigen with which it is mixed. Adjuvants useful in the present invention include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, and surfactants such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin, and dinitrophenol. BCG (Bacillus Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum are also useful adjuvants.

Die hier verwendete Bezeichnung «Allel» oder «Allelsequenz» betrifft eine alternative Form einer Nu-cleinsäuresequenz (d.h. einer hTRT-Protein codierenden Nucleinsäure). Allele sind das Ergebnis von Mutationen (d.h. Änderungen in der Nucleinsäuresequenz) und es kommt dadurch im allgemeinen zur Herstellung veränderter und/oder unterschiedlich regulierter mRNAs oder Polypeptide, deren Struktur und/oder Funktion geändert sein kann oder nicht. Übliche auf Mutationen beruhende Änderungen, die zur Entstehung von Allelen führen, werden allgemein natürlichen Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Nucleotiden zugeschrieben, die die codierten Aminosäuren beeinflussen können oder auch nicht. Jede Art dieser Änderung kann allein vorkommen, in Kombination mit den anderen oder einmal oder öfter innerhalb eines gegebenen Gens, Chromosoms oder einer anderen zellulären Nucleinsäure. Jedes gegebene Gen kann keine, eine oder viele allele Formen haben. Die hier verwendete Bezeichnung für «Allel» bezieht sich entweder auf ein Gen oder eine von dem Gen transkribierte mRNA oder beides. The term "allele" or "allele sequence" used here refers to an alternative form of a nucleic acid sequence (i.e. a nucleic acid encoding hTRT protein). Alleles are the result of mutations (i.e. changes in the nucleic acid sequence) and this generally leads to the production of modified and / or differently regulated mRNAs or polypeptides, the structure and / or function of which may or may not be changed. Common mutation-based changes that lead to the formation of alleles are generally attributed to natural deletions, additions, or substitutions of nucleotides that may or may not affect the encoded amino acids. Each type of change can occur alone, in combination with the others, or once or more within a given gene, chromosome, or other cellular nucleic acid. Any given gene can have none, one, or many allelic forms. The term “allele” used here refers to either a gene or an mRNA transcribed by the gene or both.

89 89

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Die hier beschriebenen «Aminosäuren» werden gelegentlich durch den Standard-Einbuchstabencode bezeichnet: Àlanin (A), Serin (S), Threonin (T), Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E), Asparagin (N), Glutamin (Q), Arginin (R), Lysin (K), Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V), Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W), Prolin (P), Glycin (G), Histidin (H), Cystein (C). Dazu zählen auch synthetische und nicht-natürlich vorkommende Aminosäure-Analoge (und/oder Peptidverknüpfungen). The “amino acids” described here are sometimes referred to by the standard one-letter code: Àlanin (A), serine (S), threonine (T), aspartic acid (D), glutamic acid (E), asparagine (N), glutamine (Q), Arginine (R), Lysine (K), Isoleucine (I), Leucine (L), Methionine (M), Valine (V), Phenylalanine (F), Tyrosine (Y), Tryptophan (W), Proline (P), Glycine (G), histidine (H), cysteine (C). This also includes synthetic and non-naturally occurring amino acid analogs (and / or peptide linkages).

Der hier verwendete Ausdruck «hydrophobe Aminosäuren» bezieht sich auf A, L, I, V, P, F, W und M. Der hier verwendete Ausdruck «polare Aminosäuren» bezieht sich auf G, S, T, Y, C, N und Q. Der hier verwendete Ausdruck «geladene Aminosäuren» bezieht sich auf D, E, H, K und R. The term "hydrophobic amino acids" used here refers to A, L, I, V, P, F, W and M. The term "polar amino acids" used here refers to G, S, T, Y, C, N and Q. The term "charged amino acids" used here refers to D, E, H, K and R.

Der hier verwendete Ausdruck «konservative Substitution» bezieht sich bei der Beschreibung eines Proteins auf eine Veränderung in der Aminosäurezusammensetzung des Proteins, die die Aktivität des Proteins nicht wesentlich verändert. Somit bezieht sich der Ausdruck «konservativ modifizierte Variationen» einer bestimmten Aminosäuresequenz auf Aminosäuresubstitutionen, bei denen Aminosäuren ausgetauscht sind, die für die Proteinaktivität nicht kritisch sind, oder auf die Substitution von Aminosäuren gegen andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (sauer, basisch, positiv oder negativ geladen, polar oder nicht-polar etc.), so dass die Substitutionen selbst von kritischen Aminosäuren die Aktivität nicht wesentlich ändern. Tabellen hinsichtlich konservativer Substitution, die funktionell ähnliche Aminosäuren aufzählen, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Die folgenden sechs Gruppen enthalten jeweils Aminosäuren, die gegenüber einander konservative Substitutionen darstellen: 1) Alanin (A), Serin (S), Threonin (T); 2) Asparaginsäure (D) Glutaminsäure (E) 3) Asparagin (N), Glutamin (Q); 4) Arginin (R), Lysin (K), 5) Isoleucin (I), Leucin (L) Methionin (M); Valin (V); und 6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W) (siehe auch Creighton, Proteins, (1984), W.H. Freeman and Company). Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass die vorstehend angegebenen Austausche nicht die einzigen möglichen konservativen Substitutionen darstellen. Beispielsweise könnte man den Austausch einer geladenen Aminosäure gegen eine andere geladene Aminosäure als konservative Substitution erachten, unabhängig davon, ob sie positiv oder negativ geladen ist. Zusätzlich sind individuelle Substitutionen, Deletionen oder Additionen, die eine einzelne Aminosäure oder einen kleinen Prozentsatz von Aminosäuren in einer codierten Sequenz ändern, hinzufügen oder deletieren, ebenfalls «konservativ modifizierte Variationen». Eine «konservative Substitution» kann in ein rekombinantes Protein dadurch eingeführt werden, dass ein oder mehrere Codons verwendet werden, die sich von den Codons unterscheiden, die von dem nativen Gen oder Wildtyp-Gen verwendet werden. In diesem Fall beinhaltet eine konservative Substitution auch die Substitution eines Codons für eine Aminosäure gegen ein anderes Codon für dieselbe Aminosäure. The term “conservative substitution” used here refers to a change in the description of a protein in a change in the amino acid composition of the protein that does not significantly change the activity of the protein. Thus, the term "conservatively modified variations" of a particular amino acid sequence refers to amino acid substitutions in which amino acids are exchanged that are not critical for protein activity, or to the substitution of amino acids with other amino acids with similar properties (acidic, basic, positive or negative charged, polar or non-polar, etc.), so that the substitutions even of critical amino acids do not significantly change the activity. Conservative substitution tables that list functionally similar amino acids are well known in the art. The following six groups each contain amino acids that are conservative substitutions for one another: 1) alanine (A), serine (S), threonine (T); 2) aspartic acid (D) glutamic acid (E) 3) asparagine (N), glutamine (Q); 4) arginine (R), lysine (K), 5) isoleucine (I), leucine (L) methionine (M); Valine (V); and 6) phenylalanine (F), tyrosine (Y), tryptophan (W) (see also Creighton, Proteins, (1984), W.H. Freeman and Company). It will be apparent to those skilled in the art that the above exchanges are not the only possible conservative substitutions. For example, replacing a charged amino acid with another charged amino acid could be considered a conservative substitution, regardless of whether it is positively or negatively charged. In addition, individual substitutions, deletions, or additions that change, add, or delete a single amino acid or a small percentage of amino acids in a coded sequence are also “conservatively modified variations”. A "conservative substitution" can be introduced into a recombinant protein by using one or more codons that differ from the codons used by the native or wild-type gene. In this case, conservative substitution also includes substitution of one codon for an amino acid with another codon for the same amino acid.

Die hier verwendeten Bezeichnungen «Kontrollelemente» oder «regulatorische Sequenzen» beinhalten Enhancer, Promotoren, Transkriptionsterminatoren, Replikationsursprünge, chromosomalintegrierte Sequenzen, 5'- und 3'- nicht translatierte Bereiche, mit denen Proteine oder andere Biomoleküle zur Durchführung von Transkription und Translation interagieren. Bei eukaryotischen Zellen enthalten die Kontrollsequenzen einen Promotor und vorzugsweise einen Enhancer, der beispielsweise von Im-munglobulingenen, SV40, Cytomegalovirus stammt, und eine Polyadenylierungssequenz. Sie können auch Donor- und Akzeptor-Sequenzen für die Spleissung enthalten. Je nach verwendetem Vektorsystem und verwendetem Wirt kann eine beliebige Anzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen zu denen auch konstitutive und induzierbare Promotoren gehören, verwendet werden. The terms “control elements” or “regulatory sequences” used here include enhancers, promoters, transcription terminators, origins of replication, chromosome-integrated sequences, 5'- and 3'- untranslated regions with which proteins or other biomolecules interact in order to carry out transcription and translation. In the case of eukaryotic cells, the control sequences contain a promoter and preferably an enhancer, which is derived, for example, from immunoglobulin genes, SV40, cytomegalovirus and a polyadenylation sequence. They can also contain donor and acceptor sequences for the splicing. Depending on the vector system used and the host used, any number of suitable transcription and translation elements, including constitutive and inducible promoters, can be used.

Die hier verwendete Bezeichnung «derivatisierte(s)» Polynucleotid, Oligonucleotid oder Nucleinsäure bezieht sich auf ein Oligo- oder Polynucleotid, das einen derivatisierten Substituenten umfasst. In einigen Ausführungsformen ist der Substituent im wesentlichen hinsichtlich der Hybridisierung mit komplen-tären Polynucleotiden nicht störend. Derivatisierte Oligo- oder Polynucleotide, die mit hinzugefügten chemischen Substituenten modifiziert wurden (z.B. durch Modifikation eines bereits synthetisierten Oligo-oder Polynucleotids oder durch Einbau einer modifizierten Base oder eines Rückgrat-Analogen während der Synthese) können in eine metabolisch aktive eukaryotische Zelle eingeführt werden, um mit einer hTRT-DNA, -RNA oder einem hTRT-Protein zu hybridisieren, wobei sie eine Veränderung oder chemische Modifikation an einer dortigen DNA, RNA oder einem dortigen Protein erzeugen. In einer alternativen Ausführungsform können die derivatisierten Oligo- oder Polynucleotide mit hTRT-Polypeptiden, Te-lomerase-assoziierten Proteinen oder anderen Faktoren, die mit hTRT-DNA oder hTRT-Genprodukten interagieren, in Wechselwirkung treten und diese ändern, oder die Expression oder Funktion von hTRT-DNA oder -RNA oder -Proteinen ändern oder modulieren. Zu den Beispielen für angeknüpfte chemische Substituenten zählen: Europium (III) texaphyrin, quervernetzende Mittel, Psoralen, Metallchelate (z.B. Ei-sen/EDTA-Chelat für eine Eisen-katalysierte Spaltung), Topoisomerasen, Endonucleasen, Exonucleasen, Ligasen, Phosphodiesterasen, photodynamische Porphyrine, chemotherapeutische Wirkstoffe (z.B. Adriamycin, Doxirubicin), interkalierende Mittel, Basen-modifizierende Mittel, Immunglobulinketten und Oligonucleotide. Eisen/EDTA-Chelate sind chemische Substituenten, die oft dann verwendet werden, wenn eine lokale Spaltung einer Polynucleotidsequenz erwünscht ist (Hertzberg et al., J. Am. Chem. Soc. 104 (1982), 313; Hertzberg und Dervan, Biochemistry 23 (1984), 3934; Taylor et al., Tetrahedron 40 (1984), 457 und Dervan, Science 232 (1986), 464). Zu Beispielen von chemischen Verfahren zur Anknüpfung zählen: direkte Verbindung z.B. über eine angehängte reaktive Aminogruppe (Corey und Schultz, Science 238 (1988), 1401, wobei dieses Dokument durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen ist) und andere chemische Verfahren für direkte Verbindungen, wobei aller- The term “derivatized (s)” polynucleotide, oligonucleotide or nucleic acid used here refers to an oligo- or polynucleotide that comprises a derivatized substituent. In some embodiments, the substituent is essentially non-interfering with hybridization with complementary polynucleotides. Derivatized oligonucleotides or polynucleotides which have been modified with added chemical substituents (eg by modification of an already synthesized oligo or polynucleotide or by incorporation of a modified base or a backbone analog during synthesis) can be introduced into a metabolically active eukaryotic cell hybridize with an hTRT-DNA, -RNA or an hTRT-protein, whereby they produce a change or chemical modification to a DNA, RNA or a protein there. In an alternative embodiment, the derivatized oligo- or polynucleotides may interact and change with hTRT polypeptides, Te-isomerase-associated proteins, or other factors that interact with hTRT-DNA or hTRT gene products, or the expression or function of Modify or modulate hTRT DNA or RNA or proteins. Examples of attached chemical substituents include: Europium (III) texaphyrin, cross-linking agents, psoralen, metal chelates (e.g. iron / EDTA chelate for iron-catalyzed cleavage), topoisomerases, endonucleases, exonucleases, ligases, phosphodiesterases, photodynamic porphyrins , chemotherapeutic agents (eg adriamycin, doxirubicin), intercalating agents, base modifying agents, immunoglobulin chains and oligonucleotides. Iron / EDTA chelates are chemical substituents that are often used when local cleavage of a polynucleotide sequence is desired (Hertzberg et al., J. Am. Chem. Soc. 104 (1982), 313; Hertzberg and Dervan, Biochemistry 23 (1984), 3934; Taylor et al., Tetrahedron 40 (1984), 457 and Dervan, Science 232 (1986), 464). Examples of chemical methods of attachment include: direct connection e.g. via an attached reactive amino group (Corey and Schultz, Science 238 (1988), 1401, which document is to be considered part of this description by reference) and other chemical processes for direct compounds, all of which

90 90

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

dings auch Verbindungsverfahren für Streptavidin/Biotin und Digoxigenin/anti-Digoxigenin-Antikörper verwendet werden können. Verfahren zur Kopplung chemischer Substituenten werden bereitgestellt in den US-Patenten 5 135 720, 5 093 245, und 5 055 556, die aufgrund der Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden können. Andere chemische Kopplungsverfahren liegen im Ermessen des Fachmanns. However, connection methods for streptavidin / biotin and digoxigenin / anti-digoxigenin antibodies can also be used. Methods for coupling chemical substituents are provided in U.S. Patents 5,135,720, 5,093,245, and 5,055,556, which are incorporated by reference into this specification. Other chemical coupling methods are at the discretion of those skilled in the art.

Die hier verwendete Bezeichnung «nachweisbare Markierung» besitzt die auf dem Fachgebiet übliche Bedeutung und betrifft ein Atom (z.B. ein Radionuclid), Molekül (z.B. Fluorescein) oder einen Komplex, der dafür verwendet wird oder dafür verwendet werden kann, um die Anwesenheit eines Moleküls nachzuweisen (z.B. aufgrund einer physikalischen oder chemischen Eigenschaft) oder anzuzeigen, oder um die Bindung eines anderen Moleküls zu ermöglichen, an das es kovalent gebunden oder eng assoziiert ist. Die Bezeichung «Markierung» bezieht sich auch auf kovalent gebundene oder eng assoziierte Moleküle (z.B. ein Biomolekül, beispielsweise ein Enzym), das auf ein Substrat zur Erzeugung eines nachweisbaren Atoms, Moleküls oder Komplexes einwirkt. Zu den für die erfindungsgemässe Venwendung geeigneten nachweisbaren Markierungen zählen alle Zusammensetzungen, die durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunchemische, elektrische, optische oder chemische Mittel nachweisbar sind. Zu den für die vorliegende Erfindung nützlichen Markierungen gehören Biotin zur Anfär-bung mit markiertem Streptavidin-Konjugat, magnetische Kügelchen (z.B. DynabeadsV), Fluoreszenzfarbstoffe (z.B. Fluorescein,Texas-rot, Rhodamin, grün-fluoreszierendes Protein («greenfluorescent protein»), verstärktes grün-fluoreszierendes Protein («enhanced green fluorescent protein»), Lissamin, Phycoery-thrin, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, «FluorX» (Amersham), «SyBR Green I & II» (Molecular Probes), etc.), radioaktive Markierungen (z.B. 3H, 125|, 35S, 14C oder 32P), Enzyme (z.B. Hydrolasen, insbesondere Phosphatasen, wie beispielsweise alkalische Phosphatase, Esterasen und Glycosidasen oder Oxidoreductasen, insbesondere Peroxidasen, wie beispielsweise Meerrettichperoxidase und andere üblicherweise in einem ELISA verwendete Enzyme), Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, chemiluminescente Gruppen, chromogene Mittel und colorimetrische Markierungen, wie beispielsweise kolloidales Gold oder gefärbte Glas- oder Plastik (z.B. Polystyrol, Polypropylen, Latexetc.) Kügelchen. Zu denen Patenten, deren Lehre die Verwendung solcher Markierungen betrifft, zählen US-Patent 3 817 837; 3 850 752; 3 939 350; 3 996 345; 4 277 437; 4 275 149 und 4 366 241. Mittel zum Nachweis solcher Markierungen sind dem Fachmann gut bekannt. Somit können beispielsweise radioaktive Markierungen und che-milumineszente Markierungen mittels eines photographischen Films oder Szintillationszählern nachgewiesen werden und Fluoreszenzmarker können zum Nachweis von emitiertem Licht mit einem Photodetektor (z.B. bei der Fluoreszenz aktivierten Zellsortierung) nachgewiesen werden. Enzymatische Markierungen werden typischerweise dadurch nachgewiesen, dass das Enzym mit einem Substrat versehen wird und dass durch die Wirkung des Enzyms auf das Substrat das erzeugte Reaktionsprodukt nachgewiesen wird. Colorimetrischen Markierungen werden einfach durch Sichtbarmachung der gefärbten Markierung nachgewiesen. Somit ist eine Markierung jede Zusammensetzung, die durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunchemische, elektrische, optische oder chemische Mittel nachweisbar ist. Die Markierung kann an den gewünschten Assay-Bestandteil gemäss auf dem Fachgebiet gut bekannter Verfahren direkt oder indirekt gekoppelt werden. Nicht radioaktive Markierungen werden oft durch indirekte Mittel angebracht. Im allgemeinen ist ein Ligandenmolekül (z.B. Biotin) kovalent an das Molekül gebunden. Der Ligand bindet dann ein anti-Ligandenmolekül (z.B. Streptavidin), das entweder inhärent nachweisbar ist oder an ein ein Signal erzeugendes System kovalent gebunden ist, wie beispielsweise ein nachweisbares Enzym, eine fluoreszierende Verbindung oder eine chemilumines-zierende Verbindung. Es kann eine Reihe von Liganden und anti-Liganden verwendet werden. In den Fällen, in denen ein Ligand einen natürlichen anti-Liganden aufweist, beispielsweise Biotin, Thyroxin oder Cortison, kann er in Verbindung mit den markierten, natürlich vorkommenden anti-Liganden verwendet werden. Alternativ kann jedes Hapten oder jede antigene Verbindung in Kombination mit einem Antikörper verwendet werden. Die Moleküle können auch direkt an signalerzeugende Verbindungen konjugiert sein, beispielsweise durch Konjugation mit einem Enzym oder Fluorophor. Mittel zum Nachweis von Markierungen sind dem Fachmann gut bekannt. Somit zählen beispielsweise dann, wenn die Markierung eine radioaktive Markierung ist, zu den Nachweismitteln ein Szintillationszähler, photographischer Film, wie bei der Autoradiographie, oder eine Bildgebung mittels gespeichertem Phosphor («Storage phosphor imaging»). Eine Fluoreszenzmarkierung kann durch Anregung des Fluorchroms mit Licht einer geeigneten Wellenlänge und dem Nachweis der erhaltenen Fluoreszenz nachgewiesen werden. Die Fluoreszenz kann visuell nachgewiesen werden, mit Hilfe eines photographischen Films, mittels eines elektronischen Detektors, wie beispielsweise ladungsgekoppelte Vorrichtungen (CCDs) oder Sekundärelektronenvervielfacher etc. Auf ähnliche Weise können enzymatische Markierungen dadurch nachgewiesen werden, dass für das Enzym die geeigneten Substrate bereitgestellt werden, und das erhaltene Reaktionsprodukt nachgewiesen wird. Auch können einfache colorimetrische Markierungen durch die Beobachtung der mit der Markierung assoziierten Farbe nachgewiesen werden. Wenn Paare von Fluo-rophoren in einem Assay verwendet werden, wird es oft bevorzugt, dass diese unterschiedliche Emissionsmuster (Wellenlängen) besitzen, so dass sie leicht unterschieden werden können. The term "detectable label" as used herein has the usual meaning in the art and relates to an atom (eg a radionuclide), molecule (eg fluorescein) or a complex which can be used or can be used to detect the presence of a molecule (e.g. due to a physical or chemical property) or to indicate, or to enable the binding of another molecule to which it is covalently bound or closely associated. The term “label” also refers to covalently bound or closely associated molecules (e.g. a biomolecule, for example an enzyme) that acts on a substrate to produce a detectable atom, molecule or complex. Detectable markings suitable for the use according to the invention include all compositions which can be detected by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, electrical, optical or chemical means. The labels useful for the present invention include biotin for staining with labeled streptavidin conjugate, magnetic beads (e.g. DynabeadsV), fluorescent dyes (e.g. fluorescein, Texas red, rhodamine, green fluorescent protein) green fluorescent protein («enhanced green fluorescent protein»), lissamin, phycoery-thrin, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, «FluorX» (Amersham), «SyBR Green I & II» ( Molecular Probes), etc.), radioactive labels (e.g. 3H, 125 |, 35S, 14C or 32P), enzymes (e.g. hydrolases, especially phosphatases such as alkaline phosphatase, esterases and glycosidases or oxidoreductases, especially peroxidases such as horseradish peroxidase and other enzymes commonly used in an ELISA), substrates, cofactors, inhibitors, chemiluminescent groups, chromogenic agents and colorimetric labels such as colloidal gold or colored glass or plastic (e.g. Polystyrene, polypropylene, latex etc.) beads. Patents whose teaching relates to the use of such markers include U.S. Patent 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 and 4,366,241. Means for detecting such markings are well known to those skilled in the art. Thus, for example, radioactive markings and chemiluminescent markings can be detected using a photographic film or scintillation counters and fluorescent markers can be detected with a photodetector (e.g. in the case of fluorescence-activated cell sorting) to detect emitted light. Enzymatic labels are typically detected in that the enzyme is provided with a substrate and that the reaction product produced is detected by the action of the enzyme on the substrate. Colorimetric markings are detected simply by making the colored marking visible. Thus, a label is any composition that can be detected by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, electrical, optical or chemical means. The label can be directly or indirectly coupled to the desired assay component according to methods well known in the art. Non-radioactive labels are often applied by indirect means. In general, a ligand molecule (e.g. biotin) is covalently attached to the molecule. The ligand then binds an anti-ligand molecule (e.g. streptavidin) that is either inherently detectable or is covalently bound to a signal generating system, such as a detectable enzyme, a fluorescent compound, or a chemiluminescent compound. A number of ligands and anti-ligands can be used. In cases where a ligand has a natural anti ligand, for example biotin, thyroxine or cortisone, it can be used in conjunction with the labeled, naturally occurring anti ligands. Alternatively, any hapten or antigenic compound can be used in combination with an antibody. The molecules can also be conjugated directly to signal-generating compounds, for example by conjugation with an enzyme or fluorophore. Means for the detection of markings are well known to the person skilled in the art. Thus, for example, if the marking is a radioactive marking, the detection means include a scintillation counter, photographic film, such as in autoradiography, or imaging using stored phosphorus (“storage phosphor imaging”). A fluorescent label can be detected by excitation of the fluorochrome with light of a suitable wavelength and the detection of the fluorescence obtained. The fluorescence can be detected visually, using a photographic film, using an electronic detector, such as charge-coupled devices (CCDs) or secondary electron multipliers, etc. Similarly, enzymatic labels can be detected by providing the appropriate substrates for the enzyme, and the reaction product obtained is detected. Simple colorimetric markings can also be detected by observing the color associated with the marking. When pairs of fluorophores are used in an assay, it is often preferred that they have different emission patterns (wavelengths) so that they can be easily distinguished.

Die Bezeichnung «erhöhter Spiegel» bezieht sich auf eine Menge an hTRT-Genprodukt (oder einer anderen angegebenen Substanz oder Aktivität) in einer Zelle, die erhöht ist, oder höher im Vergleich mit dem Spiegel in einem Referenzstandard, zu dem Spiegel in normalen Telomerasenegativen Zellen in ei- The term "elevated level" refers to an amount of hTRT gene product (or other specified substance or activity) in a cell that is elevated, or higher compared to the level in a reference standard, to the level in normal telomerase negative cells in a

91 91

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

ner Person oder in anderen Personen, die nicht an dem entspechenden Zustand leiden, beispielsweise für eine Diagnose, und für eine Prognose, zum Spiegel in Tumorzellen von einer Reihe von Stadien, oder Klassen von beispielsweise Tumoren. a person or in other people who do not suffer from the corresponding condition, for example for a diagnosis and for a prognosis, for the level in tumor cells of a number of stages, or classes of for example tumors.

Der hier verwendete Ausdruck «Epitop» hat seine übliche Bedeutung, d.h. er bezieht sich auf eine Stelle auf einem Antigen, die von einem Antikörper erkannt wird. Epitope sind typische Abschnitte von Aminosäuren, die einen kleinen Anteil des Gesamtproteins darstellen. Epitope können die Konformation betreffen (d.h. diskontinuierlich). Das heisst, sie können durch Aminosäuren gebildet werden, die von nichtzusammenhängenden Teilen an Primersequenz codiert werden, und die aufgrund der Proteinfaltung nebeneinander zu liegen kommen. The term "epitope" used here has its usual meaning, i.e. it refers to a location on an antigen that is recognized by an antibody. Epitopes are typical sections of amino acids that represent a small fraction of the total protein. Epitopes can affect the conformation (i.e. discontinuously). This means that they can be formed by amino acids which are encoded by non-contiguous parts of the primer sequence and which come to lie side by side due to the protein folding.

Die Bezeichnungen «günstige Prognose» und «ungünstige Prognose» sind auf dem Fachgebiet bekannt. Im Zusammenhang mit Krebs bedeutet «günstige Prognose», dass sich ein Tumor wahrscheinlich zurückbilden wird, oder längere Überlebenschancen für Patienten mit einer günstigen Prognose bestehen im Vergleich zu denen mit einer ungünstigen Prognose, während der Ausdruck «ungünstige Prognose» bedeutet, dass der Tumor wahrscheinlich aggressiver ist, was zu einem schlechten Krankheitsverlauf für den Patienten führt oder einem schnellerem Fortschreiten der Krankheit. The terms "favorable prognosis" and "unfavorable prognosis" are known in the art. In the context of cancer, “favorable prognosis” means that a tumor is likely to regress, or there is a longer chance of survival for patients with a favorable prognosis compared to those with an unfavorable prognosis, while the term “unfavorable prognosis” means that the tumor is likely is more aggressive, which leads to poor disease progression for the patient or faster progression of the disease.

Der hier verwendete Ausdruck «Fusionsprotein» bezieht sich auf ein zusammengesetztes Protein, d.h. eine einzelne zusammenhängende Aminosäuresequenz, die aus zwei (oder mehreren) unterschiedlichen heterologen Polypeptiden aufgebaut ist, die normalerweise nicht in einer einzigen Aminosäuresequenz zusammen fusioniert sind. Somit kann ein Fusionsprotein eine einzelne Aminosäuresequenz beinhalten, die zwei vollkommen verschiedene Aminosäuresequenzen enthält oder zwei ähnliche oder identische Poiypeptidsequenzen, vorausgesetzt, dass diese Sequenzen normalerweise nicht zusammen in einer einzigen Aminosäuresequenz aufgefunden werden. Fusionsproteine können allgemein unter Verwendung entweder von Nucleinsäure-Rekombinationsverfahren hergestellt werden, d.h. als das Ergebnis von Transkription und Translation eines rekombinanten Genfusionsprodukts, wobei die Fusion einen Abschnitt umfasst, der ein erfindungsgemässes Polypeptid codiert und einen Abschnitt, der ein he-terologes Protein codiert, oder durch auf dem Fachgebiet allgemein bekannte chemische Syntheseverfahren. Der (Die) nicht-hTRT-Bereich(e) des Fusionsproteins können an den Aminoterminus des hTRT-Polypeptids, den Carboxy-Terminus oder beide fusioniert werden. The term "fusion protein" as used herein refers to a composite protein, i.e. a single contiguous amino acid sequence constructed from two (or more) different heterologous polypeptides that are normally not fused together in a single amino acid sequence. Thus, a fusion protein can include a single amino acid sequence that contains two completely different amino acid sequences, or two similar or identical polypeptide sequences, provided that these sequences are not normally found together in a single amino acid sequence. Fusion proteins can generally be made using either nucleic acid recombination techniques, i.e. as the result of transcription and translation of a recombinant gene fusion product, the fusion comprising a portion encoding a polypeptide of the invention and a portion encoding a heterologous protein, or by chemical synthesis methods well known in the art. The non-hTRT region (s) of the fusion protein can be fused to the amino terminus of the hTRT polypeptide, the carboxy terminus, or both.

Der hier verwendete Ausdruck «Genprodukt» bezieht sich auf ein von einem Gen transkribiertes RNA-Molekül oder ein Protein, das von dem Gen codiert oder von der RNA translatiert wird. The term “gene product” as used herein refers to an RNA molecule transcribed from a gene or a protein that is encoded by the gene or translated by the RNA.

Der hier verwendete Ausdruck «hTR» (menschliche Telomerase-RNA) bezieht sich auf den RNA-Be-standteil von menschlicher Telomerase und aller natürlich vorkommender Allele und Varianten oder re-kombinate Varianten. hTR wird ausführlich in dem US-Patent Nr. 5 583 016 beschrieben, das durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden kann. The term “hTR” (human telomerase RNA) used here refers to the RNA component of human telomerase and all naturally occurring alleles and variants or recombined variants. hTR is described in detail in U.S. Patent No. 5,583,016, which may be incorporated by reference in its entirety and for all purposes, as a part of this specification.

Der hier verwendete Ausdruck «unsterblich» hat, wenn er sich auf eine Zelle bezieht, seine normale Bedeutung auf dem Telomerase betreffenden Fachgebiet und bezieht sich auf Zellen, die ein offensichtlich unbegrenztes replikatives Potential besitzen. Der Ausdruck «unsterblich» kann sich auch auf Zellen mit erhöhter Proliferationsfähigkeit im Vergleich zu ihren unmodifizierten Gegenstücken beziehen. Beispiele für unsterbliche menschliche Zellen sind maligne Tumorzellen, Keimbahnzellen und bestimmte transformierte menschliche Zellinien, die in vitro kultiviert sind (z.B. Zellen, die nach Transformation durch virale Oncogene unsterblich wurden). Im Gegensatz dazu sind die meisten normalen menschlichen somatischen Zellen sterblich, d.h. sie besitzen ein begrenztes replikatives Potential und werden nach einer ähnlichen Zahl von Zellteilungen senescent. The term "immortal" as used herein, when referring to a cell, has its normal meaning in the field of telomerase and refers to cells that have an apparently unlimited replicative potential. The term "immortal" can also refer to cells with increased proliferation ability compared to their unmodified counterparts. Examples of immortal human cells are malignant tumor cells, germline cells and certain transformed human cell lines that are cultured in vitro (e.g. cells that became immortal after transformation by viral oncogenes). In contrast, most normal human somatic cells are mortal, i.e. they have limited replicative potential and become senescent after a similar number of cell divisions.

Die hier verwendeten Ausdrücke «Immunogen» und «immunogen» haben die auf diesem Fachgebiet übliche Bedeutung, d.h. ein Immunogen ist ein Molekül, beispielsweise ein Protein oder ein anderes Antigen, das eine adaptive Immunantwort nach Injektion in eine Person oder ein Tier auslöst. The terms "immunogen" and "immunogen" used here have the usual meaning in this field, i.e. an immunogen is a molecule, such as a protein or other antigen, that triggers an adaptive immune response after injection into a person or animal.

Der hier verwendete Ausdruck «isoliert» bedeutet, wenn er sich auf ein Molekül oder eine Zusammensetzung bezieht, beispielsweise auf ein RNP (z.B. mindestens ein Protein und mindestens eine RNA), dass das Molekül oder die Zusammensetzung von mindestens einer weiteren Verbindung (z.B. ein Protein, andere RNAs oder andere Verunreinigungen mit denen es in vivo oder in seinem natürlich vorkommenden Status assoziiert ist, abgetrennt wurde. Somit wird ein RNP dann als «isoliert» angesehen, wenn er beispielsweise von einer Zellmembran, beispielsweise aus einem Zellextrakt, isoliert wurde. Eine isolierte Zusammensetzung kann jedoch auch im wesentlichen rein sein. The term “isolated” as used here, when it refers to a molecule or a composition, for example an RNP (for example at least one protein and at least one RNA), means that the molecule or the composition of at least one further compound (for example a protein , other RNAs or other contaminants with which it is associated in vivo or in its naturally occurring state has been separated off, so an RNP is considered "isolated" if, for example, it was isolated from a cell membrane, for example from a cell extract however, the isolated composition can also be substantially pure.

Der hier verwendete Begriff «Modulator» bezieht sich auf jede synthetische oder natürliche Verbindung oder Zusammensetzung, die auf beliebige Weise sowohl die «volle» oder jede «Teilaktivität» einer Telomerase-reversen Transkriptase (TRT) verändern kann. Ein Modulator kann ein Agonist oder ein Antagonist sein. Ein Modulator kann, allerdings ohne Beschränkung darauf, eine beliebige organische oder anorganische Verbindung sein. Dazu gehören beispielsweise kleine Moleküle, Peptide, Proteine, Zucker, Nucleinsäure, Fettsäuren etc. Die hier verwendete Bezeichnung «Motiv» bezieht sich auf eine Sequenz von aufeinanderfolgenden Aminosäuren (oder auf eine Nucleinsäuresequenz, die eine Sequenz von aufeinanderfolgenden Aminosäuren codiert), die ein Merkmal oder eine Struktur in einem Protein definiert, die allen Proteinen einer definierten Klasse oder eines definierten Typs gemeinsam ist, oder innerhalb dieser Proteine konserviert ist. Das Motiv oder die «Konsensus»-Sequenz können sowohl konservierte als auch nicht-konservierte Reste enthalten, die konservierten Reste in der Motivse92 The term “modulator” as used herein refers to any synthetic or natural compound or composition that can alter in any way both the “full” or any “partial activity” of a telomerase reverse transcriptase (TRT). A modulator can be an agonist or an antagonist. A modulator can be, but is not limited to, any organic or inorganic compound. These include, for example, small molecules, peptides, proteins, sugars, nucleic acids, fatty acids etc. The term “motif” used here refers to a sequence of successive amino acids (or to a nucleic acid sequence that codes a sequence of successive amino acids) that have a characteristic or defines a structure in a protein that is common to all proteins of a defined class or a defined type, or is conserved within these proteins. The motif or the “consensus” sequence can contain both conserved and non-conserved residues, the conserved residues in the motif sequence92

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

quenz zeigen jedoch an, dass der konservierte Rest oder die Klasse von Resten (d.h. hydrophob, polar, nicht-polar oder eine andere Klasse) typischerweise an der angegebenen Position in jedem Protein (oder Gen oder mRNA) der Klasse von Proteinen, die durch das Motiv definiert sind, vorhanden ist. Motive können sich entsprechend der Proteinklasse unterscheiden. Somit bilden beispielsweise die reverse Transkriptase-Enzyme eine Klasse von Proteinen, die durch eines oder mehrere Motive definiert sein kann und zu dieser Klasse gehören auch Telomerase-Enzyme. Die Telomerase-Enzyme können jedoch als die Klasse von Enzymen mit Motiven definiert werden, die für diese Klasse charakteristisch sind. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass die Identifizierung eines Restes als konservierter Rest in einem Motiv nicht bedeutet, dass jedes Mitglied der durch das Motiv definierten Klasse diesen angegebenen Rest (oder Klasse von Resten) an der angegebenen Position aufweist und dass eines oder mehrere Mitglieder der Klasse einen unterschiedlichen Rest an der konservierten Position besitzen kann (können). However, the sequence indicates that the conserved residue or class of residues (ie, hydrophobic, polar, non-polar, or another class) is typically at the indicated position in each protein (or gene or mRNA) of the class of proteins that are characterized by the Motive are defined, is present. Motifs can differ according to the protein class. Thus, for example, the reverse transcriptase enzymes form a class of proteins, which can be defined by one or more motifs, and telomerase enzymes also belong to this class. However, the telomerase enzymes can be defined as the class of enzymes with motifs that are characteristic of this class. It is obvious to a person skilled in the art that the identification of a residue as a conserved residue in a motif does not mean that every member of the class defined by the motif has this indicated residue (or class of residues) in the indicated position and that one or more members the class may have a different remainder at the conserved position.

Die hier verwendeten Ausdrücke «Nucleinsäure» und «Polynucleotid» werden gegenseitig austauschbar verwendet. Bei der Verwendung des Ausdrucks «Polynucleotid» ist der Ausschluss von Oligonucleotiden (d.h. kurzen Polynucleotiden) nicht beabsichtigt und dieser Ausdruck kann sich auch auf synthetische und/oder nicht-natürlich vorkommende Nucleinsäuren beziehen (d.h. Nucleinsäure-Analoge oder modifizierte Rückgratreste oder Bindungen umfassen). The terms "nucleic acid" and "polynucleotide" used here are used interchangeably. The use of the term "polynucleotide" is not intended to exclude oligonucleotides (i.e. short polynucleotides) and this term may also refer to synthetic and / or non-naturally occurring nucleic acids (i.e. include nucleic acid analogs or modified backbone residues or bonds).

Die hier verwendeten Ausdrücke «Oligonucleotide» oder «Oligomere» beziehen sich auf eine Nuclein-säuresequenz aus etwa 7 Nucleotiden oder mehr und bis zu etwa 700 Nucleotiden, die als eine Sonde oder «Amplimer» verwendet werden können. Oligonucleotide weisen vorzugsweise eine Länge von zwischen etwa 10 und etwa 50 Nucleotiden auf, mehr bevorzugt von etwa 14 bis etwa 35 Nucleotiden und am meisten bevorzugt von etwa 15 bis etwa 25 Nucleotiden und dieser Ausdruck kann sich auch auf synthetische und/oder nicht natürlich vorkommende Nucleinsäuren beziehen (d.h. Nucleinsäure-Analoge oder modifizierte Rückgratreste oder Bindungen umfassen). The terms "oligonucleotides" or "oligomers" as used herein refer to a nucleic acid sequence of about 7 nucleotides or more and up to about 700 nucleotides that can be used as a probe or "amplimer". Oligonucleotides are preferably between about 10 and about 50 nucleotides in length, more preferably from about 14 to about 35 nucleotides, and most preferably from about 15 to about 25 nucleotides, and this term can also refer to synthetic and / or non-naturally occurring nucleic acids refer (ie include nucleic acid analogs or modified backbone residues or bonds).

Der hier verwendete Ausdruck «funktionell verknüpft» bezieht sich auf eine funktionelle Beziehung zwischen zwei oder mehr Nucleinsäuresegmenten (z.B. DNA): Beispielsweise ist ein Promotor oder Enhancer mit einer codierenden Sequenz funktionell verknüpft, wenn er die Transkription der Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle oder einem anderen Expressionssystem stimuliert. Sequenzen, die funktionell verknüpft sind, sind im allgemeinen aufeinanderfolgend und im Fall einer Signalsequenz sowohl aufeinanderfolgend und im Leserahmen. Enhancer müssen jedoch nicht in enger Nachbarschaft zu den codierenden Sequenzen, deren Transkription sie erhöhen sollen, gelegen sein. The term "functionally linked" as used herein refers to a functional relationship between two or more nucleic acid segments (eg DNA): For example, a promoter or enhancer is functionally linked to a coding sequence if it transcribes the sequence in a suitable host cell or another Expression system stimulated. Sequences that are functionally linked are generally sequential and in the case of a signal sequence both sequential and in the reading frame. However, enhancers do not have to be in close proximity to the coding sequences, the transcription of which they are intended to increase.

Der hier verwendete Ausdruck «Polypeptid» und die Bezeichnung «Protein» werden gegenseitig austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Polymer, das aus Aminosäureresten zusammengesetzt ist, wozu synthetische, natürlich vorkommende und nicht natürlich vorkommende Analoge davon zählen. Peptide sind Beispiele für Polypeptide. The term "polypeptide" and the term "protein" used here are used interchangeably and refer to a polymer composed of amino acid residues, including synthetic, naturally occurring and non-naturally occurring analogs thereof. Peptides are examples of polypeptides.

Der hier verwendete Ausdruck «Sonde» bezieht sich auf ein Molekül, das ein anderes Molekül spezifisch bindet. Ein Beispiel einer Sonde ist eine «Nucleinsäuresonde», die an eine im wesentlichen komplementäre Nucleinsäure spezifisch bindet (d.h. sich anlagert oder hybridisiert). Ein weiteres Beispiel einer Sonde ist eine «Antikörper-Sonde», die an ein entsprechendes Antigen oder Epitop spezifisch bindet. The term “probe” used here refers to a molecule that specifically binds another molecule. An example of a probe is a "nucleic acid probe" that specifically binds (i.e., attaches or hybridizes) to an essentially complementary nucleic acid. Another example of a probe is an "antibody probe" that specifically binds to a corresponding antigen or epitope.

Der hier verwendete Ausdruck «rekombinant» bezieht sich auf ein Polynucleotid, das in vitro synthetisiert oder auf andere weise manipuliert wurde (z.B. ein «rekombinantes Polynucleotid»), auf Verfahren, die sich auf die Verwendung rekombinanter Polynucleotide zur Herstellung von Genprodukten in Zellen oder anderen biologischen Systemen beziehen oder auf ein Polypeptid («rekombinantes Protein»), das von einem rekombinanten Polynucleotid codiert wird. The term "recombinant" as used herein refers to a polynucleotide that has been synthesized in vitro or otherwise manipulated (eg, a "recombinant polynucleotide"), to methods that relate to the use of recombinant polynucleotides to produce gene products in cells or others biological systems or a polypeptide ("recombinant protein") encoded by a recombinant polynucleotide.

Der hier verwendet Ausdruck «Selektionssystem» bezieht sich im Zusammenhang mit stabil transformierten Zellinien auf ein Verfahren zur Identifizierung und/oder Selektion von Zellen, die eine gewünschte rekombinante Nucleinsäure enthalten. Eine grosse Vielzahl von Selektionssystemen zur Identifizierung von transformierten Zellen ist bekannt und diese sind zur Anwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet. Beispielsweise können durch Plasmide oder andere Vektoren transformierte Zellen durch die Resistenz gegen Antibiotika selektiert werden, die durch auf den Plasmiden enthaltene Gene verliehen wird, beispielsweise die gut bekannten Gene amp, gpt, neo und hyg oder andere Gene, wie beispielesweise die Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase-Gene (Wigler et al., Cell 11 (1977), 223-32 und das Adeninphosphoribosyltransferasegen (Lowy et al., Cell 22 (1980), 817), die in tk~- bzw. aprt"-Zellen verwendet werden können. Auch die Resistenz gegen einen Antimetaboliten, ein Antibiotikum oder Herbizid kann als Basis für eine Selektion verwendet werden; beispielsweise dhfr, das Resistenz gegen Metotrexat verleiht und auch für eine Genamplifikation von Nutzen ist (Wigler et al. Proc. Nati. Acad. Sei., 77 (1980), 3567); npt, das Resistenz gegen die Aminoglykoside Neomycin und G-418 verleiht (Col-bere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150 (1981), 1) und als oder pat, die Resistenz gegen Chlorsulfuron bzw. Phosphinotricin-Acetyltransferase verleihen (Murry, in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill, New York NY, Seiten 191-196 (1992)). Es werden weitere selektierbare Gene beschrieben, beispielsweise trpB, ein Gen das Hygromycin-Resistenz verleiht und Zellen erlaubt anstelle von Tryptophan Indol zu verwenden, oder hisD, das es Zellen erlaubt anstelle von Histidin Histinol zu verwenden (Hartman und Mulligan, Proc. Nati. Acad. Sei., 85 (1988), 8047). Erst kürzlich hat dieVer-wendung von sichtbaren Markern grosse Popularität erreicht, wobei solche Marker wie Anthocyanine, ß- The term “selection system” used here refers in connection with stably transformed cell lines to a method for identifying and / or selecting cells which contain a desired recombinant nucleic acid. A wide variety of selection systems for the identification of transformed cells are known and these are suitable for use in the present invention. For example, cells transformed by plasmids or other vectors can be selected by the resistance to antibiotics conferred by genes contained on the plasmids, for example the well-known genes amp, gpt, neo and hyg or other genes, such as the herpes simplex virus -Thymidine kinase genes (Wigler et al., Cell 11 (1977), 223-32 and the adenine phosphoribosyltransferase gene (Lowy et al., Cell 22 (1980), 817), which are used in tk ~ and aprt "cells Resistance to an antimetabolite, an antibiotic or herbicide can also be used as the basis for a selection, for example dhfr, which confers resistance to metotrexate and is also useful for gene amplification (Wigler et al. Proc. Nati. Acad ., 77 (1980), 3567); npt, which confers resistance to the aminoglycosides neomycin and G-418 (Col-bere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150 (1981), 1) and as or pat , the resistance to chlorosulfuron or Grant phosphinotricin acetyltransferase (Murry, in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill, New York NY, pages 191-196 (1992)). Other selectable genes are described, for example trpB, a gene which confers resistance to hygromycin and allows cells to use indole instead of tryptophan, or hisD, which allows cells to use histinol instead of histidine (Hartman and Mulligan, Proc. Nati. Acad Se., 85 (1988), 8047). Recently, the use of visible markers has become very popular, with markers such as anthocyanins, ß-

93 93

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Glucuronidase und dessen Substrat, GUS und Luciferase und dessen Substrat, Luciferin, nicht nur zur Identifizierung von Transformanten beide Verwendung finden sondern auch zur Quantifizierung der Menge von transienter oder stabiler Proteinexpression, die einem spezifischen Vektorsystem zugeschrieben werden kann (Rhodes et al., Meth. Mol. Biol 55 (1995), 121). Glucuronidase and its substrate, GUS and luciferase and its substrate, luciferin, are not only used to identify transformants, but also to quantify the amount of transient or stable protein expression that can be attributed to a specific vector system (Rhodes et al., Meth. Mol. Biol 55 (1995), 121).

Der hier verwendete Ausdruck «Sequenz» eines Gens, einer Nucleinsäure, eines Proteins oder Peptids bezieht sich (falls nicht spezifisch anders angegeben) auf die Anordnung von Nucleotiden entweder in einem Strang oder beiden Strängen eines doppelsträngigen DNA-Moleküls, beispielsweise auf die Sequenz sowohl des codierenden Strangs als auch des dazu komplementären Strangs, oder in einem einzelsträngigen Nucleinsäuremolekül, oder auf die Anordnung von Aminosäuren in einem Peptid oder Protein. The term "sequence" of a gene, a nucleic acid, a protein or a peptide, as used herein, refers (unless specifically stated otherwise) to the arrangement of nucleotides in either one or both strands of a double-stranded DNA molecule, for example the sequence of both coding strand as well as the complementary strand, or in a single-stranded nucleic acid molecule, or on the arrangement of amino acids in a peptide or protein.

Der hier verwendete Ausdruck «spezifisch bindend» bezieht sich auf die Fähigkeit eines Moleküls, typischerweise eines Antikörpers oder Polynucleotids, mit einem anderen spezifischen Molekül selbst in Gegenwart von vielen anderen unterschiedlichen Molekülen in Kontakt zu kommen und zu assoziieren. Beispielsweise kann ein einzelsträngiges Polynucleotid spezifisch an ein einzelsträngiges Polynucleotid, das in seiner Sequenz komplementär ist, spezifisch binden, und ein Antikörper bindet spezifisch an sein korrespondierendes Antigen (oder «ist spezifisch immunreaktiv damit»). The term "specifically binding" as used herein refers to the ability of a molecule, typically an antibody or polynucleotide, to contact and associate with another specific molecule even in the presence of many other different molecules. For example, a single-stranded polynucleotide can specifically bind to a single-stranded polynucleotide that is complementary in sequence, and an antibody specifically binds to (or "is specifically immunoreactive therewith" with) its corresponding antigen.

Der hier verwendete Ausdruck «stringente Hybridisierungsbedingungen» oder «Stringenz» bezieht sich auf Bedingungen im Bereich von etwa 5°C bis etwa 20°C oder 25°C unter der Schmelztemperatur (Tm) der Zielsequenz und einer Sonde mit einer exakten oder fast exakten Komplementarität zum Ziel. Der hier verwendete Ausdruck «Schmelztemperatur» bezieht sich auf die Temperatur, bei der eine Population von doppelsträngigen Nucleinsäuremolekülen halb in Einzelstränge dissoziiert. Verfahren zur Berechnung des Tm von Nucleinsäuren sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt (siehe z.B. Berger und Kimmel (1987) Methods in Enzymology, Bd. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc. und Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Bände 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (nachstehend als «Sambrook» bezeichnet), wobei beide Dokumente aufgrund der Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden können). Wie in Standardreferenzen angegeben, kann eine einfache Bestimmung des Tm-Wertes anhand der Gleichung: Tm = 81,5 + 0,41 (% G + C) berechnet werden, wenn eine Nucleinsäure sich in wässri-ger Lösung bei 1 M NaCI befindet (siehe z.B. Anderson und Young, Quantitative Filter Hybridization in: Nucleic Acid Hybridization (1985)). Andere Referenzen enthalten verfeinerte Berechnungen, wobei sowohl strukturellen Merkmalen als auch Sequenzmerkmalen bei der Berechnung des Tm Rechnung getragen wird. Die Schmelztemperatur eines Hybrids (und somit die Bedingungen für eine stringente Hybridisierung) werden durch verschiedene Faktoren beeinflusst, beispielsweise die Länge und Art (DNA, RNA, Basenzusammensetzung) der Sonde und der Art des Ziels (DNA, RNA, Basenzusammensetzung, in Lösung vorhanden oder immobilisiert etc.) und der Konzentration von Salzen und anderen Bestandteilen (z.B. das Vorhandensein oder Fehlen von Formamid, Dextransulfat, Polyethylenglykol). Die Auswirkungen dieser Faktoren sind allgemein bekannt und werden in Standardreferenzen bezüglich dieses Fachgebiets diskutiert; siehe z.B. Sambrook, a.a.O., und Ausubel et al., a.a.O. Typischenweise entsprechen stringente Hybridisierungsbedingungen Salzkonzentrationen unter etwa 1,0 M Natriumionen, typischerweise etwa 0,01 bis 1,0 M Natriumionen bei einem pH-Wert von 7,0 bis 8,3 und Temperaturen von mindestens etwa 30°C für kurze Sonden (z.B. 10 bis 50 Nucleotide) und mindestens etwa 60°C für lange Sonden (z.B. über 50 Nucleotide). Wie bereits angemerkt, können stringente Bedingungen auch durch die Zugabe von destabilisierenden Mitteln wie beispielsweise Formamid erreicht werden, wobei in diesem Fall niedrigere Temperaturen angewandt werden können. The term “stringent hybridization conditions” or “stringency” used here refers to conditions in the range from about 5 ° C. to about 20 ° C. or 25 ° C. below the melting temperature (Tm) of the target sequence and a probe with an exact or almost exact complementarity to the goal. The term "melting temperature" as used herein refers to the temperature at which a population of double-stranded nucleic acid molecules half dissociates into single strands. Methods for calculating the Tm of nucleic acids are well known in the art (see, e.g., Berger and Kimmel (1987) Methods in Enzymology, Vol. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc. and Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Volumes 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (hereinafter referred to as "Sambrook"), both of which may be considered part of this description by reference). As indicated in standard references, a simple determination of the Tm value can be calculated using the equation: Tm = 81.5 + 0.41 (% G + C) when a nucleic acid is in aqueous solution at 1 M NaCI ( see, for example, Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization in: Nucleic Acid Hybridization (1985)). Other references contain refined calculations, whereby both structural features and sequence features are taken into account when calculating the Tm. The melting temperature of a hybrid (and thus the conditions for stringent hybridization) are influenced by various factors, e.g. the length and type (DNA, RNA, base composition) of the probe and the type of target (DNA, RNA, base composition, in solution or immobilized etc.) and the concentration of salts and other components (e.g. the presence or absence of formamide, dextran sulfate, polyethylene glycol). The effects of these factors are well known and are discussed in standard references related to this subject; see e.g. Sambrook, op. Cit., And Ausubel et al., Op. Cit. Typically, stringent hybridization conditions correspond to salt concentrations below about 1.0 M sodium ions, typically about 0.01 to 1.0 M sodium ions at pH 7.0 to 8.3 and temperatures of at least about 30 ° C for short probes (e.g. 10 to 50 nucleotides) and at least about 60 ° C for long probes (e.g. over 50 nucleotides). As already noted, stringent conditions can also be achieved by adding destabilizing agents such as formamide, in which case lower temperatures can be used.

Der hier verwendete Ausdruck «wesentliche Sequenzidentität» im Zusammenhang mit Nucleinsäuren bezieht sich auf das Ausmass von Sequenzähnlichkeit zwischen zwei Polynucleotiden. Wesentliche Sequenzidentität kann durch Hybridisierung unter stringenten Bedingungen, durch direkten Vergleich oder andere Massnahmen bestimmt werden. Beispielsweise können zwei Polynucleotide als wesentliche Sequenzidentität aufweisend identifiziert werden, wenn sie miteinander unter stringenten Hybridisierungsbedingungen spezifisch hybridisieren können. Andere Grade an Sequenzidentität (z.B. weniger als «wesentlich» können durch Hybridisierung unter unterschiedlichen Stringenz-Bedingungen charakterisiert werden. Alternativ kann wesentliche Sequenzidentität als ein Prozentsatz an Identität zwischen zwei Nucleotidsequenzen (oder Polypeptidsequenzen) beschrieben werden. Zwei Sequenzen werden dann als wesentlich identisch erachtet, wenn sie zu mindestens etwa 60% identisch sind, bevorzugt mindestens etwa 70%, mindestens etwa 80%, mindestens etwa 90% oder mindestens etwa 95 oder 98 bis 100%. Die prozentuale Sequenzidentität (Nucleotid oder Aminosäure) wird typischerweise durch Bestimmung der optimalen Ausrichtung zwischen zwei Sequenzen oder durch Vergleichen der zwei Sequenzen berechnet. Beispielsweise kann ein für eine «sense»-Suppression verwendetes exogenes Transkript als ein bestimmter Prozentsatz an Identität oder Ähnlichkeit im Vergleich zu einer Referenzsequenz (z.B. der korrespondierenden endogenen Sequenz) aufweisen, beschrieben werden. Die optimale Ausrichtung von Sequenzen kann unter Verwendung des Algorithmus von Smith und Waterman, Adv. Appi. Math. 2 (1981), 482, der sich auf die lokale Homologie bezieht («local homology algorithm») durchgeführt werden, durch den Algorithmus, der sich auf die Homologie-Ausrichtung bezieht, («homology alignment algorithm») von Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48 (1970), 443, durch das «search for similarity»-Verfahren von Pearson und Lipman, Proc. Nati. Acad. Sei. USA 85 (1988), 2444, durch Ausführung die- The term "essential sequence identity" used here in connection with nucleic acids refers to the extent of sequence similarity between two polynucleotides. Significant sequence identity can be determined by hybridization under stringent conditions, by direct comparison or other measures. For example, two polynucleotides can be identified as having essential sequence identity if they can specifically hybridize with one another under stringent hybridization conditions. Other degrees of sequence identity (eg, less than "essential" can be characterized by hybridization under different stringency conditions. Alternatively, essential sequence identity can be described as a percentage of identity between two nucleotide sequences (or polypeptide sequences). Two sequences are then considered to be essentially identical, if they are at least about 60% identical, preferably at least about 70%, at least about 80%, at least about 90% or at least about 95 or 98 to 100% The percent sequence identity (nucleotide or amino acid) is typically determined by determining the optimal alignment between two sequences or by comparing the two sequences. For example, an exogenous transcript used for sense suppression may have a certain percentage of identity or similarity compared to a reference sequence (eg the corresponding endogenous sequence), to be discribed. The optimal alignment of sequences can be done using the algorithm of Smith and Waterman, Adv. Appi. Math. 2 (1981), 482, which relates to local homology ("local homology algorithm") can be carried out by the algorithm, which relates to homology alignment ("homology alignment algorithm") by Needleman and Wunsch , J. Mol. Biol. 48 (1970), 443, by the “search for similarity” method by Pearson and Lipman, Proc. Nati. Acad. Be. USA 85 (1988), 2444, by designing the

94 94

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

ser Algorithmen mittels Computer (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA in dem Software-Paket von Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl) oder durch Betrachtung. Die beste Ausrichtung (die den höchsten Prozentsatz an Identität ergibt), die durch die verschiedenen Verfahren erzeugt wurde, wird ausgewählt. Typischerweise vergleichen diese Algorithmen zwei Sequenzen über ein «Vergleichsfenster» (normalerweise mit einer Länge von mindestens 18 Nucleotiden) um so lokale Bereiche an Sequenzähnlichkeit identifizieren und vergleichen zu können, wobei kleine Additionen oder Deletionen (d.h. Lücken) erlaubt sind. Additionen und Deletionen betragen typischerweise 20% oder weniger der Länge der Sequenz relativ zu der Referenzsequenz, die keine Additionen oder Deletionen enthält. Es ist gelegentlich wünschenswert, Sequenzidentität zwischen zwei Sequenzen im Bezug auf eine bestimmte Länge oder einen bestimmten Bereich zu beschreiben (z.B. können zwei Sequenzen als mindestens 95% Identität über eine Länge von mindestens 500 Basenpaaren aufweisend beschrieben werden). Normalerweise beträgt die Länge mindestens etwa 50, 100, 200, 300, 400 oder 500 Basenpaare, Aminosäuren oder andere Reste. Der Prozentsatz an Sequenzidentität wird durch Vergleich zweier optimal ausgerichteter Sequenzen über den Vergleichsbereich berechnet, die Bestimmung der Anzahl an Positionen, an denen die identischen Nucleinsäurebase (z.B. A, T, C, G oder U) in beiden Sequenzen vorkommt, um so die Anzahl an gepaarten Positionen zu ermitteln, und durch Bestimmung der Anzahl (oder des Prozentsatzes) an gepaarten Positionen im Vergleich zu der Gesamtanzahl von Basen in der Referenzsequenz oder der Vergleichsregion. Ein zusätzlicher Algorithmus, der für die Bestimmung von Sequenzähnlichkeit geeignet ist, ist der BLAST-Algorithmus, der beschrieben ist in Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410 und Shpaer, Genomics 38 (1996), 179-191. Software zur Durchführung von BLAST-Analysen ist öffentlich erhältlich bei National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Dieser Algorithmus beinhaltet zuerst die Identifizierung von Sequenzpaaren mit denen viele Treffer erreicht werden («high scoring sequence pairs, HSPs)») durch die Identifizierung kurzer Wörter mit der Länge W in der Abfragesequenz, die mit einem positiv bewerteten Punkt T übereinstimmen oder diesen erfüllen, wenn sie gegen ein Wort derselben Länge in einer Datenbanksequenz ausgerichtet werden. T bezieht sich auf die «neighborhood word score threshold» (Altschul et al., a.a.O.). Diese anfänglichen Treffer des Nachbarschaftsworts wirken als Ausgangspunkte für die Initiierung von Suchvorgängen, die zur Auffindung von längeren, diese enthaltenden HSPs führen sollen. Die Worttreffer werden in beiden Richtungen entlang jeder Sequenz verlängert, soweit der Treffer bezüglich der kumulativen Ausrichtung erhöht werden kann. Die Verlängerung der Worttreffer in jeder Richtung kommt zum Stillstand, wenn: der Treffer bezüglich der kumulativen Ausrichtung verringert sich um die Menge X von dem maximal erreichbaren Wert; der kumulative Treffer geht gegen 0 oder darunter aufgrund der Akkumulation von einer oder mehreren Ausrichtungen von negative Treffer erzielenden Resten; oder das Ende jeder Sequenz ist erreicht. Die Parameter W, T und X des BLAST-Algorithmus bestimmen die Empfindlichkeit und die Schnelligkeit der Ausrichtung. Das BLAST-Programm verwendet als Voreinstellung eine Wortlänge (W) von 11, die «BLOSUM62 scoring matrix» (siehe Heni-koff, Proc. Nati. Acad. Sei. USA 89 (1992), 10915-10919), Ausrichtungen (B) von 50, Erwartung (E) von 10, M = 5, N = —4, und eines Vergleichs beider Stränge. Der Ausdruck BLAST bezieht sich auf den BLAST-Algorithmus, der eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durchführt; siehe beispielsweise Karlin, Proc. Nati. Acad. Sei. USA 90 (1993), 5873-5787. Eine durch den BLAST-Algorithmus gelieferte Ähnlichkeitsmessung ist die kleinste Wahrscheinlichkeit der Summe («smallest sum probability») (P(N)), die die Wahrscheinlichkeit anzeigt, mit der eine Paarung zwischen zwei Nucleotiden oder Aminosäuresequenzen zufällig vorkommen würde. Beispielsweise kann eine Nucleinsäure als zu einer TRT-Nucleinsäure ähnlich erachtet werden, wenn die kleinste Wahrscheinlichkeit der Summe («smallest sum probability») beim Vergleich der Test-Nucleinsäure mit einer TRT-Nucleinsäure weniger als etwa 0,5, 0,2, 0,1, 0,01 oder 0,001 ist. Alternativ ist ein anderes Anzeichen dafür, dass zwei Nu-cleinsäuresequenzen ähnlich sind, dass das Polynucleotid, das die erste Nucleinsäure codiert, mit dem von der zweiten Nucleinsäure codierten Polypeptid immunologisch kreuzreagiert. algorithms using computers (GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the software package from Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl) or by viewing. The best targeting (which gives the highest percentage of identity) generated by the various methods is selected. Typically, these algorithms compare two sequences using a "comparison window" (usually at least 18 nucleotides in length) in order to be able to identify and compare local areas of sequence similarity, allowing small additions or deletions (i.e. gaps). Additions and deletions are typically 20% or less of the length of the sequence relative to the reference sequence that contains no additions or deletions. It is sometimes desirable to describe sequence identity between two sequences in terms of a particular length or range (e.g., two sequences can be described as having at least 95% identity over a length of at least 500 base pairs). Usually the length is at least about 50, 100, 200, 300, 400 or 500 base pairs, amino acids or other residues. The percentage of sequence identity is calculated by comparing two optimally aligned sequences over the comparison range, determining the number of positions at which the identical nucleic acid base (e.g. A, T, C, G or U) occurs in both sequences, so the number determine paired positions, and by determining the number (or percentage) of paired positions compared to the total number of bases in the reference sequence or the comparison region. An additional algorithm that is suitable for determining sequence similarity is the BLAST algorithm, which is described in Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410 and Shpaer, Genomics 38 (1996), 179- 191. Software for performing BLAST analysis is available publicly from the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). This algorithm first includes the identification of sequence pairs with which many hits are achieved ("high scoring sequence pairs, HSPs)") by the identification of short words with the length W in the query sequence that match or meet a positively evaluated point T, if they are aligned against a word of the same length in a database sequence. T refers to the neighborhood word score threshold (Altschul et al., Op. Cit.). These initial hits of the neighborhood word act as starting points for initiating searches which are intended to find longer HSPs containing them. The word hits are lengthened in both directions along each sequence as far as the hit can be increased in terms of cumulative alignment. The prolongation of the word hits in each direction comes to a standstill if: the hit with regard to the cumulative alignment decreases by the amount X of the maximum achievable value; the cumulative hit goes to 0 or below due to the accumulation of one or more alignments of remainder hits; or the end of each sequence has been reached. The parameters W, T and X of the BLAST algorithm determine the sensitivity and the speed of the alignment. The BLAST program uses a word length (W) of 11 by default, the "BLOSUM62 scoring matrix" (see Heni-koff, Proc. Nati. Acad. Sei. USA 89 (1992), 10915-10919), alignments (B) of 50, expectation (E) of 10, M = 5, N = -4, and a comparison of both strands. The term BLAST refers to the BLAST algorithm, which performs a statistical analysis of the similarity between two sequences; see for example Karlin, Proc. Nati. Acad. Be. USA 90: 5873-5787 (1993). A similarity measurement provided by the BLAST algorithm is the smallest sum probability (P (N)), which indicates the probability that a pairing between two nucleotides or amino acid sequences would happen accidentally. For example, a nucleic acid can be considered similar to a TRT nucleic acid if the smallest sum probability when comparing the test nucleic acid to a TRT nucleic acid is less than about 0.5, 0.2, 0 , 1, 0.01 or 0.001. Alternatively, another indication that two nucleic acid sequences are similar is that the polynucleotide encoding the first nucleic acid cross-reacts immunologically with the polypeptide encoded by the second nucleic acid.

Die hier verwendeten Ausdrücke «wesentliche Identität» oder «wesentliche Ähnlichkeit» im Zusammenhang mit einem Polypeptid bezieht sich auf den Grad an Ähnlichkeit zwischen zwei Polypeptiden, bei denen ein Polypeptid eine Sequenz mit mindestens 70%, 80%, 85% oder bis zu 100% Sequenzidentität umfasst, bezogen auf eine Referenzsequenz oder am meisten bevorzugt 90% Identität über ein Vergleichsfenster von etwa 10 bis 20 Aminosäureresten. Aminosäuresequenzähnlichkeit oder Sequenzidentität wird durch Optimierung der Paarung der Reste bestimmt, falls nötig durch die Einführung von Lücken, soweit dies erforderlich ist. Siehe Needleham et al., J. Mol. Biol 48 (1970), 443-453; Sankoff et al. (1983) Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequenze Com-parison, Kapitel Eins, Addison-Wesley, Reading, MA; und Software-Pakete von IntelliGenetics, Mountain View, CA und der University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, Wl. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass die Bezeichnungen «wesentliche Identität», «wesentliche Ähnlichkeit» und «wesentliche Sequenzidentität» bezüglich Polypeptiden oder Polynucleotiden gegenseitig austauschbar verwendet werden können. The terms "essential identity" or "essential similarity" used in connection with a polypeptide refer to the degree of similarity between two polypeptides in which a polypeptide has a sequence of at least 70%, 80%, 85% or up to 100% Sequence identity includes, based on a reference sequence or most preferably 90% identity over a comparison window of about 10 to 20 amino acid residues. Amino acid sequence similarity or sequence identity is determined by optimizing the pairing of the residues, if necessary by introducing gaps, if necessary. See Needleham et al., J. Mol. Biol 48 (1970), 443-453; Sankoff et al. (1983) Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequences Com-parison, Chapter One, Addison-Wesley, Reading, MA; and software packages from IntelliGenetics, Mountain View, CA and the University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, Wl. It is obvious to a person skilled in the art that the terms “essential identity”, “essential similarity” and “essential sequence identity” can be used interchangeably with respect to polypeptides or polynucleotides.

Der hier verwendete Ausdruck «wesentlich rein» oder «wesentlich gereinigt» bedeutet dann, wenn er sich auf eine Zusammensetzung bezieht, die ein angegebenes Reagens enthält, beispielsweise einen Antikörper (z.B. einen anti-hTRT-Antikörper), dass das angegebene Reagens mindestens etwa 75%, mindestens etwa 90%, mindestens etwa 95%, mindestens etwa 99% oder mehr der Zusammensetzung The term "substantially pure" or "substantially purified" as used herein, when referring to a composition containing a specified reagent, such as an antibody (e.g., an anti-hTRT antibody), means that the specified reagent is at least about 75 %, at least about 90%, at least about 95%, at least about 99% or more of the composition

95 95

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

(ohne beispielsweise Puffer) darstellt. Somit ist beispielsweise eine bevorzugte erfindungsgemässe Im-munglobulin-Präparation, die spezifisch ein hTRT-Polypeptid bindet, im wesentlichen gereinigt. (without buffer, for example). Thus, for example, a preferred immunoglobulin preparation according to the invention which specifically binds an hTRT polypeptide is essentially purified.

Wie hier vewendet, ist eine «Telomerase-negative» Zelle eine Zelle, in der Telomerase nicht exprimiert wird, d.h. es kann keine katalytische Aktivität von Telomerase unter Vewendung eines üblichen Assays oder eines TRAP-Assays für katalytische Aktivität von Telomerase nachgewiesen werden. Wie hier vewendet, ist eine «Telomerase-positive» Zelle eine Zelle, in der Telomerase exprimiert wird (d.h. Telomerase-Aktivität kann nachgewiesen werden). As used here, a "telomerase negative" cell is a cell in which telomerase is not expressed, i.e. no catalytic activity of telomerase can be detected using a conventional assay or a TRAP assay for catalytic activity of telomerase. As used here, a "telomerase positive" cell is a cell in which telomerase is expressed (i.e., telomerase activity can be detected).

Wie hier vewendet, ist eine «mit Telomerase in Zusammenhang stehende» Krankheit oder ein Zustand eine Krankheit oder ein Zustand in einem Versuchsobjekt, die (der) mit einem anormal hohen Spiegel an Telomerase-Aktivität in Zellen des Versuchsobjekts korreliert, wobei dies jede Telomerase Aktivität für die meisten normalen somatischen Zellen umfassen kann, oder die (der) mit einem niedrigen Spiegel an Telomerase-Aktivität korreliert, der zu einer Beeinträchtigung einer normalen Zellfunktion führt. Zu den Beispielen für mit Telomerase in Zusammenhang stehende Zustände gehören beispielsweise Krebs (hohe Telomerase-Aktivität in malignen Zellen) und Unfruchtbarkeit (geringe TelomeraseAktivität in Keimbahnzellen). As used herein, a "telomerase-related" disease or condition is a disease or condition in a subject that correlates with an abnormally high level of telomerase activity in the subject's cells, which is any telomerase activity for most normal somatic cells, or that correlates with a low level of telomerase activity that results in impairment of normal cell function. Examples of conditions related to telomerase include cancer (high telomerase activity in malignant cells) and infertility (low telomerase activity in germline cells).

Der hier vewendete Ausdruck «Testverbindung» bezieht sich auf jede synthetische oder natürliche Verbindung oder Zusammensetzung. Zu diesem Ausdruck zählen alle organischen und anorganischen Verbindungen einschliesslich beispielsweise kleine Moleküle, Peptide, Proteine, Zucker, Nucleinsäuren, Fettsäuren etc. The term "test compound" as used herein refers to any synthetic or natural compound or composition. This expression includes all organic and inorganic compounds including, for example, small molecules, peptides, proteins, sugars, nucleic acids, fatty acids etc.

XII. Beispiele XII. Examples

Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung und sollen keine Einschränkung darstellen. The following examples are intended to illustrate the present invention and are not intended to be limiting.

In den folgenden Abschnitten werden die folgenden Abkürzungen vewendet: eq (Äquivalente); M (Molar); pM (Mikromolar); N (Normal), Mol (Mole), mMol (Millimole) jiMol (Mikromole); nMol (Nanomole); g (Gramm), mg (Milligramm); ng (Mikrogramm), ng (Nanogramm); I oder L (Liter), ml (Milliliter), nl (Mikroliter); cm (Zentimeter); mm (Millimeter); um (Mikrometer), nm (Nanometer); °C (Grad Celsius); RPN (Ribonucleoprotein); remN(2'-0-Methylribonucleotide); dNTP (Desoxyribonucleotid); dh^O (destilliertes Wasser); DDT (Dithiothreitol); PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid); TE (10 mM Tris-HCI; 1 mM EDTA, pH-Wert etwa 7,2); KGIu (Kaliumglutamat); SSC (Salz- und Natriumeitratpuffer); SDS (Natriumdodecyl-sulfat); PAGE (Polyacrylamidgelelektrophorese); Novex (Novex, San Diego, CA); BioRad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), Pharmacia (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), Boehringer-Mannheim (Boeh-ringer-Mannheim Corp., Concord, CA); Amersham (Amersham, Inc., Chicago, IL); Stratagene (Stratege-ne Cloning Systems, La Jolla, CA); NEB (New England Biolabs, Beverly, MA); Pierce (Pierce Chemical Co., Rockford IL); Beckman (Beckman Instruments, Fullerton, CA), Lab Industries (Lab Industries, Inc., Berkeley, CA), Eppendorf (Eppendorf Scientific, Madison, Wl); und Molecular Dynamics (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). The following abbreviations are used in the following sections: eq (equivalents); M (molar); pM (micromolar); N (normal), mole (mole), mmole (millimole) jiMol (micromole); nmoles (nanomoles); g (grams), mg (milligrams); ng (micrograms), ng (nanograms); I or L (liter), ml (milliliter), nl (microliter); cm (centimeters); mm (millimeters); um (micrometer), nm (nanometer); ° C (degrees Celsius); RPN (ribonucleoprotein); remN (2'-0-methylribonucleotides); dNTP (deoxyribonucleotide); dh ^ O (distilled water); DDT (dithiothreitol); PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride); TE (10mM Tris-HCl; 1mM EDTA, pH about 7.2); KGIu (potassium glutamate); SSC (salt and sodium citrate buffer); SDS (sodium dodecyl sulfate); PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis); Novex (Novex, San Diego, CA); BioRad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), Pharmacia (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), Boehringer-Mannheim (Boeh-ringer-Mannheim Corp., Concord, CA); Amersham (Amersham, Inc., Chicago, IL); Stratagene (Strategist-Cloning Systems, La Jolla, CA); NEB (New England Biolabs, Beverly, MA); Pierce (Pierce Chemical Co., Rockford IL); Beckman (Beckman Instruments, Fullerton, CA), Lab Industries (Lab Industries, Inc., Berkeley, CA), Eppendorf (Eppendorf Scientific, Madison, Wl); and Molecular Dynamics (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

Beispiel 1 example 1

Isolierung von Telomerase-Proteinen und -Clonen Isolation of telomerase proteins and clones

Das folgende Beispiel beschreibt ausführlich die Isolierung von Telomerase-Proteinen und -Clonen von verschiedenen Organismen, einschliesslich der hTRT- und S. pombe-Telomerasec-DNA-Clone The following example describes in detail the isolation of telomerase proteins and clones from different organisms, including the hTRT and S. pombe telomerasec DNA clones

A. Hintergrund i) Einführung A. Background i) Introduction

Der Abschnitt gibt einen Überblick über die Reinigung und Clonierung, die in nachfolgenden Abschnitten dieses Beispiels ausführlicher beschrieben werden. Telomerase-RNA-Untereinheiten wurden zwar in Ciliaten, Hefe und Säugern identifiziert, vor der vorliegenden Erfindung wurden jedoch Protein-Unterein-heiten des Enzyms als solche nicht identifiziert. Die Reinigung von Telomerase von dem Protozoan Euplotes aediculatus ergab zwei Proteine, die mit p123 und p43 bezeichnet werden (siehe nachstehend; Lingner, Proc. Nati. Acad. Sei. USA 93 (1996) 10712). Euplotes aediculatus ist ein hypotricher Ciliat mit einem Macronucleus, der etwa 8 x 107 Telomere und etwa 3 x 105 Telomerasemoleküle enthält. Nach der Reinigung zeigte der aktive Telomerase-Komplex ein Molekulargewicht von etwa 230 kD, was einer RNA-Untereinheit von 66 kD und zwei Proteinen von etwa 123 kD und 43 kD entspricht (siehe vorstehend Lingner (1996)). Experimente mit Photo-Quervernetzung zeigten an, dass das grössere p123-Pro-tein an der spezifischen Bindung des Telomer-DNA-Substrats beteiligt war (Lingner (1996), a.a.O.). The section provides an overview of purification and cloning, which is described in more detail in subsequent sections of this example. Although telomerase RNA subunits have been identified in ciliates, yeast and mammals, protein subunits of the enzyme as such were not identified prior to the present invention. Purification of telomerase from the protozoan Euplotes aediculatus yielded two proteins, designated p123 and p43 (see below; Lingner, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93 (1996) 10712). Euplotes aediculatus is a hypotricher ciliate with a macronucleus that contains about 8 x 107 telomeres and about 3 x 105 telomerase molecules. After purification, the active telomerase complex showed a molecular weight of approximately 230 kD, which corresponds to an RNA subunit of 66 kD and two proteins of approximately 123 kD and 43 kD (see Lingner (1996) above). Experiments with photo cross-linking indicated that the larger p123 protein was involved in the specific binding of the telomeric DNA substrate (Lingner (1996), op. Cit.).

Die p123- und p43-Proteine wurden sequenziert und die diese Proteine codierenden cDNA-Clone isoliert. Es stellte sich heraus, dass diese Euplotes-Sequenzen mit den Telomerase-assoziierten Proteinen von Tetrahymena p80 und p95 nicht ve wandt sind. Die Sequenzanalyse des Euplotes-p123 ergab die Anwesenheit von Motiven von reverser Transkriptase (RT). Weiterhin wurde durch die Sequenzanalyse The p123 and p43 proteins were sequenced and the cDNA clones encoding these proteins were isolated. It was found that these Euplotes sequences are not related to the telomerase-associated proteins of Tetrahymena p80 and p95. Sequence analysis of Euplotes-p123 revealed the presence of reverse transcriptase (RT) motifs. Furthermore, by sequence analysis

96 96

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

des Euplotes p123 ein homologes Hefeprotein gefunden, das als Est2-Protein bezeichnet wird (Lingner, Science 276 (1997), 561). Es konnte kürzlich gezeigt werden, dass das Hefe-Est2 für die Aufrechterhaltung von Telomeren in vivo essentiell ist (Lendvay, Genetics 144 (1996), 1399), es wurde jedoch nicht als ein katalytisches Teiomerase-Protein identifiziert. Ortsgerichtete Mutagenese zeigte, dass die RT-Motive von Hefe-Est2 für die Synthese von Telomer-DNA in vivo und in vitro essentiell sind (Lingner (1997) a.a.O.). of the Euplotes p123 found a homologous yeast protein which is referred to as Est2 protein (Lingner, Science 276 (1997), 561). Yeast Est2 has recently been shown to be essential for the maintenance of telomeres in vivo (Lendvay, Genetics 144 (1996), 1399), but has not been identified as a catalytic teiomerase protein. Site-directed mutagenesis showed that the RT motifs of yeast Est2 are essential for the synthesis of telomer DNA in vivo and in vitro (Lingner (1997) cited above).

ii) Identifizierung und Charakterisierung von S. pombe-Telomerase ii) Identification and characterization of S. pombe telomerase

Die PCR-Amplifikation von S. pombe-DNA wurde mit degenerierten Sequenzprimern, die nach den Euplotes-p123-RT-Motiven, wie nachstehend beschrieben, entworfen wurden, durchgeführt. Eines der erzeugten vier Haupt-PCR-Produkte war eine Bande von 120 Basenpaaren, die eine zu p123 und Est2 homologe Peptidsequenz codierte. Dieses PCR-Produkt wurde als Sonde bei Koloniehybridisierung verwendet und damit konnten zwei überlappende Clone aus einer genomischen Bank von S. pombe und drei von einer cDNA-Bank von S. pombe identifiziert werden. Die Sequenzanalyse ergab, dass keiner der drei S. pombe-cDNACIone eine vollständige Länge auswies, deshalb wurde zum Erhalt von Sequenzen, die den N-Terminus des Proteins codieren, reverse Transkriptase (RT)-PCR verwendet. PCR amplification of S. pombe DNA was performed with degenerate sequence primers designed according to the Euplotes p123 RT motifs as described below. One of the four major PCR products generated was a 120 base pair band encoding a peptide sequence homologous to p123 and Est2. This PCR product was used as a probe in colony hybridization and thus two overlapping clones from a S. pombe genomic library and three from a S. pombe cDNA library could be identified. Sequence analysis revealed that none of the three S. pombe cDNACIones were full length, so reverse transcriptase (RT) -PCR was used to obtain sequences encoding the N-terminus of the protein.

Die vollständige Sequenzierung dieser Clone zeigte ein vermutliches S. pombe-Telomerase-RT-Gen, trtl. Die vollständige Nucleotidsequenz von trtl wurde bei GenBank mit der Zugangsnummer AF015783 hinterlegt. Die Analyse der Sequenz ergab, dass trtl ein basisches Protein mit einem geschätzten Molekulargewicht von 116 kD codiert. Es zeigte sich, dass die Homologie zu p123 und Est2 in den sieben reverse Transkriptase-Motiven aussergewöhnlich hoch war. Diese Motive sind unterstrichen und als Motive 1, 2, A, B, C, D und E bezeichnet (siehe Fig. 1). Es wurde ein zusätzliches Telomerase-spezifi-sches Motiv gefunden, das als das T-Motiv bezeichnet wurde. 15 Introns im Grössenbereich von 36 bis 71 Basenpaaren unterbrachen die codierende Sequenz. The complete sequencing of these clones showed a putative S. pombe telomerase RT gene, trtl. The full nucleotide sequence of trtl has been deposited with GenBank under accession number AF015783. Analysis of the sequence revealed that trtl encodes a basic protein with an estimated molecular weight of 116 kD. The homology to p123 and Est2 in the seven reverse transcriptase motifs was found to be exceptionally high. These motifs are underlined and designated as motifs 1, 2, A, B, C, D and E (see Fig. 1). An additional telomerase-specific motif was found, which was referred to as the T motif. 15 introns in the size range from 36 to 71 base pairs interrupted the coding sequence.

Um S. pombe-trtl als eine katalytische Untereinheit zu testen, wurden zwei Deletionskonstrukte erzeugt. Bei einem wurden nur die Motive B bis D in den RT-Domänen entfernt. Bei dem zweiten wurden 99% des offenen Leserahmens entfernt. To test S. pombe-trtl as a catalytic subunit, two deletion constructs were created. In one, only motifs B to D in the RT domains were removed. The second removed 99% of the open reading frame.

Haploide Zellen, die aus S. pombe-Sporen von beiden Mutanten gewachsen waren, zeigten fortschreitende Telomer-Kürzung bis zu dem Punkt, an dem eine Hybridisierung an Telomer-Wiederholungseinheiten praktisch nicht mehr nachweisbar war. Ein trt1+/trt1"-Diploid wurde sporulieren gelassen und die erhaltenen Tetraden wurden gegliedert und auf einem Hefeextrakt-Medium, das mit Aminosäure supplementiert war, auskeimen gelassen (eine YES-Platte, Alfa, (1993) Experiments with Fission Yeast, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Die von jeder Spore erhaltenen Kolonien wurden 3 Tage bei 32°C gezüchtet und alle drei Tage auf frischen YES-Platten ausgestrichen. Eine Kolonie aus jeder Runde wurde bei 32°C in 6 ml einer YES-Flüssigkultur gegeben und bis zur stationären Phase gezüchtet. Es wurde genomische DNA präpariert. Nach der Spaltung mit Apal wurde die DNA auf einem 2,3%igem Agarosegel elektrophoretisiert, zur Bestätigung, dass in jeder Spur etwa gleiche Mengen gegeben wurden, mit Ethidiumbromid angefärbt, danach auf eine Nylon-Membran transferiert und mit einer Telomer-DNA-Sonde hybridisiert. Haploid cells that had grown from S. pombe spores from both mutants showed progressive telomeric shortening to the point where hybridization to telomer repeat units was practically undetectable. A trt1 + / trt1 "diploid was sporulated and the resulting tetrads were parsed and germinated on a yeast extract medium supplemented with amino acid (YES plate, Alfa, (1993) Experiments with Fission Yeast, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) The colonies obtained from each spore were grown for 3 days at 32 ° C. and streaked on fresh YES plates every three days, one colony from each round was placed in 6 ml of a YES at 32 ° C. "Liquid culture added and grown to stationary phase. Genomic DNA was prepared. After cleavage with Apal, the DNA was electrophoresed on a 2.3% agarose gel to confirm that approximately equal amounts were given in each lane, stained with ethidium bromide , then transferred to a nylon membrane and hybridized with a telomeric DNA probe.

Seneszenz wurde angezeigt durch den verzögerten Beginn der Unfähigkeit auf Agar wachsen zu können (typischerweise beim vierten Ausstreichen nach der Keimung), durch Kolonien mit Rändern, die in zunehmendem Masse ausgefranst waren (die Koloniemorphologie ist in Fig. 22B gezeigt) und durch eine hohe Anzahl von Fraktionen verlängerter Zellen, die immer mehr zunahmen (wie in Fig. 22C gezeigt). Zellen wurden auf Minimalmedium (Alfa, (1993), a.a.O.), wobei Glutaminsäure gegen Ammoniumchlorid ausgetauscht war, 2 Tage bei 32°C vor dem Photographieren ausplattiert. Senescence was indicated by the delayed onset of inability to grow on agar (typically the fourth streak after germination), by colonies with margins that were increasingly frayed (the colony morphology is shown in Figure 22B) and by a high number of elongated cell fractions that increased more and more (as shown in Figure 22C). Cells were plated on minimal medium (Alfa, (1993), op. Cit.), With glutamic acid replaced by ammonium chloride, at 32 ° C. for 2 days prior to photography.

Bei der Trennung einzelner vergrösserter Zellen unter dem Dissektions-Mikroskop zeigte sich, dass die Mehrheit der Zellen keiner weiteren Teilung unterlag. Die gleiche Telomerase-negative (trt1~) Zellpopulation enthielt immer Zellen mit normaler Grösse, die fortfuhren sich zu teilen, jedoch häufig sich nicht teilende Nachkommen hervorbrachten. Die Telomerase-negativen überlebenden Zellen könnten einen Rekombinationsmodus der Telomer-Bewahrung verwenden, wie dies für knospende Hefestämme dokumentiert wurde, mit denen verschiedene Gene für die Telomer-Replikation deletiert sind (Lendvay (1996) a.a.O. und Lundblad Cell 73 (1993), 347. The separation of individual enlarged cells under the dissection microscope showed that the majority of the cells were not subject to any further division. The same telomerase negative (trt1 ~) cell population always contained cells of normal size that continued to divide but often produced non-dividing offspring. The telomerase-negative surviving cells could use a recombination mode of telomer preservation, as documented for budding yeast strains with which various genes for telomer replication have been deleted (Lendvay (1996) op. Cit. And Lundblad Cell 73 (1993), 347.

iii) Die Identifizieruno und Charakterisierung von menschlicher Telomerase iii) The identification and characterization of human telomerase

Ein von menschlicher Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-cDNA stammendes EST (exprimerte Sequenz-«tag») wurde durch eine BLAST-Suche der dbEST (exprimierte Sequenz-«tag») Gen-Bank-Datenbank identifiziert und als Genbank AA28196 bezeichnet, wobei die Euplotes-123 kD Peptid und die entsprechenden Nucleinsäuresequenzen sowie das Schizosaccharomyces-Protein und korrespondierende cDNA (tezl)-Sequenzen verwendet wurden. Das AA281296 EST weist eine Länge von 389 Nucleotiden auf und die Positionen seiner Reste in dem hTRTcDNA-Clon (Fig. 16) liegen zwischen den Resten 1679 bis 2076. Ein die EST-Sequenz enthaltender Clon, der die Bezeichnung Clon #712562 (Fig. 18) trägt, wurde von dem I.M.A.G.E.-Consortium (Human Genome Center, DOE, Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA) erhalten. Dieser Clon wurde aus einer cDNA- An EST (expressed sequence "tag") derived from human telomerase reverse transcriptase (hTRT) cDNA was identified by a BLAST search of the dbEST (expressed sequence "tag") gene bank database and designated as Genbank AA28196, the Euplotes-123 kD peptide and the corresponding nucleic acid sequences as well as the Schizosaccharomyces protein and corresponding cDNA (tezl) sequences were used. The AA281296 EST is 389 nucleotides in length and the positions of its residues in the hTRTcDNA clone (Fig. 16) lie between residues 1679 to 2076. A clone containing the EST sequence which is called clone # 712562 (Fig. 18) was obtained from the IMAGE Consortium (Human Genome Center, DOE, Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA). This clone was made from a cDNA

97 97

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Bank von aufkeimenden B-Zellen erhalten, die aus einer Fliesssortierung («flow sorting») von Mandelzellen stammten. Die vollständige Sequenzierung dieses hTRT-cDNA-Clons ergab die Anwesenheit aller acht Telomerase-RT(TRT)-Motive, wie dies in Fig. 1 gezeigt ist. Dieser hTRT-Clon codierte keinen aneinandergrenzenden Bereich von TRT, da die RT-Motive B', C, D und E im Vergleich zu den mehr N-terminal gelegenen RT-Motiven in einem anderen offenen Leserahmen enthalten waren. Zusätzlich war die Entfernung zwischen den RT-Motiven A und B wesentlich geringer als die der drei bereits bekannten (nicht-menschlichen) TRTs. Bank of germinating B cells obtained from a flow sorting of almond cells. Complete sequencing of this hTRT cDNA clone revealed the presence of all eight telomerase RT (TRT) motifs, as shown in Figure 1. This hTRT clone did not encode a contiguous region of TRT since the RT motifs B ', C, D and E were contained in a different open reading frame compared to the more N-terminally located RT motifs. In addition, the distance between RT motifs A and B was much smaller than that of the three previously known (non-human) TRTs.

Um einen cDNA-Clon mit vollständiger Länge isolieren zu können, wurde eine cDNA-Bank, die von der menschlichen Zellinie 293 (die vorstehend beschrieben wurde) stammt, die hohe Spiegel an Telomerase-Aktivität exprimiert, gescreent. Eine lambda-cDNA-Bank von der Zellinie 293 wurde in 25 Pools aufgeteilt, die jeweils etwa 200 000 Plaques enthielten. Jeder Pool wurde mittels PCR mit den Primer-paren 5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3' und 5'-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3' gescreent. Sechs Sub-Pools eines positiven primären Pools wurden mittels PCR unter Venwendung desselben Primerpaars weiter gescreent. Sowohl bei dem Screenen des primären Pools und des sekundären Sub-Pools wurde hTRT mit insgesamt 31 Cyclen amplifiziert, 45 Sekunden bei 94°C, 45 Sekunden bei 60°C und 90 Sekunden bei 72°C. Als Kontrolle wurde RNA des «house-keeping»-Enzyms GAPDH mittels der Prime rpaa re 5'-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3' und 5 -ATGATCI l GAGGCTGT 1GTCATA-3' mit insgesamt 16 Cyclen amplifiziert, jeweils 45 Sekunden bei 94°C, 45 Sekunden bei 55°C und 90 Sekunden bei 72°C. To isolate a full length cDNA clone, a cDNA library derived from human cell line 293 (described above) that expresses high levels of telomerase activity was screened. A lambda cDNA library from cell line 293 was divided into 25 pools, each containing approximately 200,000 plaques. Each pool was screened by PCR with the primer pairs 5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3 'and 5'-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3'. Six sub-pools of a positive primary pool were further screened by PCR using the same pair of primers. When screening the primary pool and the secondary sub-pool, hTRT was amplified with a total of 31 cycles, 45 seconds at 94 ° C, 45 seconds at 60 ° C and 90 seconds at 72 ° C. As a control, RNA of the house-keeping enzyme GAPDH was amplified using the prime rpaa re 5'-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3 'and 5 -ATGATCI l GAGGCTGT 1GTCATA-3' with a total of 16 cycles, each 45 seconds at 94 ° C, 45 Seconds at 55 ° C and 90 seconds at 72 ° C.

Ein hTRT-positiver Sub-Pool aus dem sekundären Screenen wurde dann mittels Plaque-Hybridisie-rung mit einer Sonde von dem 5'-Bereich von Clon #712562 gescreent. Ein Phage konnte als positiv identifiziert werden (mit der Bezeichnung Lambda-Phage 25-1.1, ATCC 209024, hinterlegt am 12. Mai 1997). Er enthielt eine Insertion von etwa 4 Kilobasen, diese wurde ausgeschnitten und in die EcoRI-Stelle des «Bluescript II SK+»-Vektors (Stratagene, San Diego, CA) als ein EcoRI-Fragment subcloniert. Dieses den cDNA-Clon enthaltende Plasmid erhielt die Bezeichnung pGRN121. Die cDNA-lnsertion weist insgesamt eine Länge von etwa 4 Kilobasenpaaren auf. Die vollständige Nucleotidsequenz der menschlichen hTRT-cDNA (pGRN121) wurde bei Genbank hinterlegt (Zugangsnummer AF015950) und bei der ATCC mit der Zugangsnummer ATCC 209016 am 6. Mai 1997. An hTRT positive sub-pool from the secondary screening was then screened by plaque hybridization with a probe from the 5 'region of clone # 712562. One phage could be identified as positive (with the designation Lambda phage 25-1.1, ATCC 209024, deposited on May 12, 1997). It contained an insert of about 4 kilobases, which was cut out and subcloned into the EcoRI site of the “Bluescript II SK +” vector (Stratagene, San Diego, CA) as an EcoRI fragment. This plasmid containing the cDNA clone was named pGRN121. The cDNA insertion is approximately 4 kilobase pairs in length. The complete nucleotide sequence of the human hTRT cDNA (pGRN121) was deposited with Genbank (accession number AF015950) and with ATCC accession number ATCC 209016 on May 6, 1997.

B. Züchtung von Euplotes aediculatus B. Cultivation of Euplotes aediculatus

Die in diesem Beispiel verwendeten Kulturen von E. aediculatus wurden von Dr. David Prescott, MCDB, University of Colorado, erhalten. Dr. Prescott isolierte diese Kultur ursprünglich aus Wasser eines Teichs, dieser Organismus ist aber auch von der ATCC erhältlich (ATCC #30859). Kulturen wurden wie von Swanton et al., (Swanton et al., Chromosoma 77 (1980), 203) in 15-Liter-Glasbehältern gezüchtet, die Chlorogonium als eine Nahrungsquelle enthielten. Die Organismen wurden nach Erreichen einer Dichte von etwa 104Zellen/ml von den Kulturen geerntet. The cultures of E. aediculatus used in this example were developed by Dr. David Prescott, MCDB, University of Colorado. Dr. Prescott originally isolated this culture from water in a pond, but this organism is also available from the ATCC (ATCC # 30859). Cultures were grown as in Swanton et al., (Swanton et al., Chromosoma 77 (1980), 203) in 15 liter glass containers containing chlorogonium as a food source. The organisms were harvested from the cultures after reaching a density of about 104 cells / ml.

C. Präparation von nucleären Extrakten C. Preparation of Nuclear Extracts

In diesem Beispiel wurden nucleäre Extrakte von E. aediculatus mittels des Verfahrens von Lingner et al., (Lingner et al., Genes Develop. 8 (1994) 1984) mit den nachstehend beschriebenen geringen Modifikationen präpariert. Zusammengefasst wurden Zellen, die wie in Teil B beschrieben gezüchtet wurden, mit 15 um Nytex-Filtern konzentriert und auf Eis gekühlt. Das Zellpellet wurde zu einem Endvolumen von 110 ml TMS/PMSF/Spermidinphosphat-Puffer resuspendiert. Der TMS/PMSF/Spermidinphos-phat-Vorratspuffer wurde durch Zugabe von 0,075 g Spermidinphosphat (USB) und 0,75 ml PMSF (aus einer in Ethanol hergestellten 100 mM Vorratslösung) zu 150 ml TMS hergestellt. TMS enthielt 10 mM Tris-Acetat, 10 mM MgCh, 85,5752 g Saccharose/Liter und 0,33297 g CaCfe/Liter, pH-Wert 7,5. In this example, nuclear extracts from E. aediculatus were prepared using the method of Lingner et al., (Lingner et al., Genes Develop. 8 (1994) 1984) with the minor modifications described below. In summary, cells grown as described in Part B were concentrated with 15 µm Nytex filters and cooled on ice. The cell pellet was resuspended to a final volume of 110 ml TMS / PMSF / spermidine phosphate buffer. The TMS / PMSF / spermidine phosphate storage buffer was prepared by adding 0.075 g of spermidine phosphate (USB) and 0.75 ml of PMSF (from a 100 mM stock solution prepared in ethanol) to 150 ml of TMS. TMS contained 10 mM Tris acetate, 10 mM MgCh, 85.5752 g sucrose / liter and 0.33297 g CaCfe / liter, pH 7.5.

Nach Resuspendierung in TMS/PMSF/Spermidinphosphat-Puffer wurden 8,8 ml 10% NP-40 und 94,1 g Saccharose zugegeben. Das Gemisch wurde in einen silikonisierten Glasbecher mit einem Rührstab aus rostfreiem Stahl, der an einem darüber befindlichen Motor angebracht war, gegeben. Das Gemisch wurde gerührt, bis die Zellen vollständig lysiert waren (etwa 20 Minuten). Das Gemisch wurde dann 10 Minuten bei 7500 UpM (8950 x g) bei 4°C mittels eines Beckman JS-13-Ausschwingrotors zen-trifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet aus Nuclei in TMS/PMSF/Spermidinphosphat-Puffer resuspendiert, danach erneut 5 Minuten bei 7500 UpM (8950 x g) bei 4°C mittels eines Beckman JI-D-13-Ausschwingrotors zentrifugiert. After resuspending in TMS / PMSF / spermidine phosphate buffer, 8.8 ml of 10% NP-40 and 94.1 g of sucrose were added. The mixture was placed in a siliconized glass beaker with a stainless steel stir bar attached to a motor above it. The mixture was stirred until the cells were completely lysed (about 20 minutes). The mixture was then centrifuged for 10 minutes at 7500 rpm (8950 x g) at 4 ° C using a Beckman JS-13 swing-out rotor. The supernatant was removed and the pellet from nuclei was resuspended in TMS / PMSF / spermidine phosphate buffer, then centrifuged again at 7500 rpm (8950 x g) at 4 ° C. for 5 minutes using a Beckman JI-D-13 swing-out rotor.

Der Überstand wurde entfernt und das Pellet aus Nuclei in einem Puffer resuspendiert, der 50 mM Tris-Acetat, 10 mM MgCl2, 10% Glycerin, 0,1% NP-40, 0,4 M KGIu, 0,5 mM PMSF, pH-Wert 7,5 enthielt, wobei ein Puffervolumen von 0,5 ml pro 10 g geernteter Zellen verwendet wurde. Die resuspen-dierten Nuclei wurden danach in einem «dounced»-Glashomogenisator mit etwa 50 Auf- und Abbewe-gungen homogenisiert und danach 25 Minuten mit 14 000 UpM bei 4°C in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Der den nucleären Extrakt enthaltene Überstand wurde gesammelt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zu seiner Verwendung bei -80°C aufbewahrt. The supernatant was removed and the pellet was resuspended from nuclei in a buffer containing 50 mM Tris acetate, 10 mM MgCl2, 10% glycerol, 0.1% NP-40, 0.4 M KGIu, 0.5 mM PMSF, pH -Value 7.5, using a buffer volume of 0.5 ml per 10 g of cells harvested. The resuspended nuclei were then homogenized in a “dounced” glass homogenizer with about 50 up and down movements and then centrifuged for 25 minutes at 14,000 rpm at 4 ° C. in an Eppendorf centrifuge. The supernatant containing the nuclear extract was collected, frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C until used.

98 98

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

D. Reinigung von Telomerase D. Purification of Telomerase

In diesem Beispiel wurden wie in Teil C beschrieben, präparierte nucleäre Extrakte zur Reinigung von In this example, as described in Part C, prepared nuclear extracts for the purification of

E. aediculatus-Telomerase vewendet. Bei diesem Reinigungsprotokoll wurde Telomerase zuerst durch Chromatographie auf einer Affi-Gel-Heparinsäule angereichert und danach ausgiebig durch Affinitätsreinigung mit einem «antisense»-Oligonucleotid gereinigt. Da der Matrizenbereich von Telomerase-RNA in dem Telomerase RNP-Partikel einer Hybridisierung zugänglich ist, wurde ein «antisense»-Oligonucleotid (d.h. das «Affinitätsoligonucleotid») als ein «Affinitätsköder» für die Telomerase synthetisiert, wobei dieses Oligonucleotid zu diesem Matrizenbereich komplementär war. Ein Biotinrest wurde an das 5'-Ende des Oligonucleotids angefügt, damit dieses an einer Avidinsäule immoblisiert werden konnte. E. aediculatus telomerase used. In this purification protocol, telomerase was first enriched by chromatography on an Affi-Gel heparin column and then extensively purified by affinity purification with an "antisense" oligonucleotide. Since the template region of telomerase RNA in the telomerase RNP particle is amenable to hybridization, an "antisense" oligonucleotide (ie the "affinity oligonucleotide") was synthesized as an "affinity bait" for the telomerase, this oligonucleotide being complementary to this template region . A biotin residue was added to the 5 'end of the oligonucleotide so that it could be immobilized on an avidin column.

Nach der Bindung der Telomerase an das Oligonucleotid und gründlichem Waschen wurde die Telomerase mittels eines Verdrängungsoligonucleotids eluiert. Das Affinitätsoligonucleotid enthielt DNA-Basen, die zu der 5' zu der Telomerase-spezifischen Sequenz gelegenen Telomerase-RNA nicht komplementär war. Da das Verdrängungs-Oligonucleotid zu dem Affinitäts-Oligonucleotid über seine gesamte Länge komplementär war, konnte es eine thermodynamisch stabilere Duplex bilden als die Telomerase, die an das Affinitäts-Oligonucleotid gebunden war. Somit führte die Zugabe des Verdrängungs-Oligonu-cleotids zu der Elution der Telomerase von der Säule. After binding the telomerase to the oligonucleotide and washing thoroughly, the telomerase was eluted using a displacement oligonucleotide. The affinity oligonucleotide contained DNA bases that were not complementary to the telomerase RNA 5 'to the telomerase-specific sequence. Because the displacement oligonucleotide was complementary to the affinity oligonucleotide along its entire length, it was able to form a thermodynamically more stable duplex than the telomerase bound to the affinity oligonucleotide. Thus, the addition of the displacement oligonucleotide resulted in the elution of the telomerase from the column.

In diesem Beispiel wurden aus 45 Liter-Kulturen präparierte nucleäre Extrakt gefroren, bis eine Gesamtmenge von 34 ml an nucleärem Extrakt gewonnen werden konnte. Dies entsprach 630 Liter Kultur (etwa 4 x 109 Zellen). Der nucleäre Extrakt wurde mit einem Puffer auf 410 ml verdünnt, wobei Endkonzentrationen von 20 mM Tris-Acetat, 1 mM MgCb, 0,1 mM EDTA, 33 mM KGIu, 10% (Vol./Vol.) Glyce-rin, 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) bei einem pH-Wert von 7,5 erhalten wurden. In this example, nuclear extract prepared from 45 liter cultures was frozen until a total of 34 ml of nuclear extract could be obtained. This corresponded to 630 liters of culture (approximately 4 x 109 cells). The nuclear extract was diluted to 410 ml with a buffer, with final concentrations of 20 mM Tris acetate, 1 mM MgCb, 0.1 mM EDTA, 33 mM KGIu, 10% (v / v) glycerin, 1 mM Dithiothreitol (DTT) and 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) were obtained at a pH of 7.5.

Der verdünnte nucleäre Extrakt wurde auf eine Affi-Gel-Heparin-Gelsäule (Bio-Rad) mit einem Endvolumen von 230 ml und einem Durchmesser von 5 cm gegeben, mit dem gleichen Puffer äquilibriert und mit einem 2 Liter-Gradienten von 33 bis 450 mM KGIu eluiert. Die Säule wurde mit einer Fliessgeschwindigkeit von einem Säulenvolumen/Stunde bei 4=C betrieben. Fraktionen von jeweils 50 ml wurden gesammelt und nach einer Telomerase-Aktivität wie in Teil D beschrieben, untersucht. The diluted nuclear extract was applied to an Affi-Gel heparin gel column (Bio-Rad) with a final volume of 230 ml and a diameter of 5 cm, equilibrated with the same buffer and with a 2 liter gradient from 33 to 450 mM KGIu eluted. The column was operated at a flow rate of one column volume / hour at 4 = C. Fractions of 50 ml each were collected and examined for telomerase activity as described in Part D.

Telomerase eluierte von der Säule bei etwa 170 mM KGIu. Telomerase enthaltende Fraktionen (etwa 440 ml) wurden vereinigt und eingestellt auf 20 mM Tris-Acetat, 10 mM M9Cb, 1 mM EDTA, 300 mM KGIu, 10% Glycerin, 1 mM DTT und 1% Nonidet P-40. Dieser Puffer wurde mit «WB» bezeichnet. Telomerase eluted from the column at approximately 170 mM KGIu. Fractions containing telomerase (approximately 440 ml) were pooled and adjusted to 20 mM Tris acetate, 10 mM M9Cb, 1 mM EDTA, 300 mM KGIu, 10% glycerin, 1 mM DTT and 1% Nonidet P-40. This buffer was called «WB».

Zu dieser Präparation wurden jeweils 1,5 mMol der zwei kompetitorischen DNA-Oligonucleotide (5'-TAGACCTGTTAGTGTACATTTGAATTGAAGC-3') und For this preparation, 1.5 mmol of the two competitive DNA oligonucleotides (5'-TAGACCTGTTAGTGTACATTTGAATTGAAGC-3 ') and

(5'-TAGACCTGTTAGGTTGGAl I l GTGGCATCA-3'), 50 ng Hefe-RNA (Sigma) und 0,3 nMol Biotin-markiertes Telomerase-spezifisches Oligonucleotid (5'-TAGACCTGTTAGGTTGGAl I l GTGGCATCA-3 '), 50 ng yeast RNA (Sigma) and 0.3 nMol biotin-labeled telomerase-specific oligonucleotide

(5'-Biotin-TAGACCTGTTTA-(rmeG)2-(rmeU)4-(rmeG)4-rmeG-3')) pro ml des Pools gegeben. Die 2-O-Me-thylribonucleotide der Telomerase-spezifischen Oligonucleotide waren zu dem Matrizenbereich der Telomerase-RNA komplementär; die Desoxyribonucleotide waren nicht komplementär. Der Einschluss von kompetitorischen, nicht-spezifischen DNA-Oligonucleotiden erhöhte die Wirksamkeit der Reinigung, da die Auswirkungen von Nucleinsäure-bindenden Proteinen und anderen Bestandteilen in dem Gemisch, die entweder an das Affinitätsnucleotid binden oder die Telomerase aus dem Gemisch entfernen würden, minimiert wurden. (5'-Biotin-TAGACCTGTTTA- (rmeG) 2- (rmeU) 4- (rmeG) 4-rmeG-3 ')) per ml of the pool. The 2-O-methylribonucleotides of the telomerase-specific oligonucleotides were complementary to the template region of the telomerase RNA; the deoxyribonucleotides were not complementary. The inclusion of competitive, non-specific DNA oligonucleotides increased the effectiveness of the purification because the effects of nucleic acid binding proteins and other components in the mixture that would either bind to the affinity nucleotide or would remove the telomerase from the mixture were minimized.

Dieses Material wurde dann zu einem «Ultralink»-immobilisierten «Neutravidin plus» (Pierce)-Säulen-material bei einem Volumen von 60 nl Suspension pro ml Pool gegeben. Das Säulenmaterial wurde zweimal jeweils 15 Minuten vorblockiert, wobei eine Präparation von WB vewendet wurde, die 0,01% Nonidet P-40, 0,5 mg BSA, 0,5 mg/ml Lysozym, 0,05 mg/ml Glycogen und 0,1 mg/ml Hefe-RNA enthielt. Die Blockierung wurde mittels einer sich drehenden Scheibe durchgeführt, um so das Säulenmaterial gründlich zu blockieren. Nach dem ersten und vor dem zweiten Blockierungsschritt wurde das Säulenmaterial 2 Minuten bei 200 x g zur Pelletierung der Matrix zentrifugiert. This material was then added to an "Ultralink" immobilized "Neutravidin plus" (Pierce) column material at a volume of 60 nl suspension per ml pool. The column material was pre-blocked twice for 15 minutes each time using a preparation of WB containing 0.01% Nonidet P-40, 0.5 mg BSA, 0.5 mg / ml lysozyme, 0.05 mg / ml glycogen and 0 , 1 mg / ml yeast RNA contained. The blocking was carried out by means of a rotating disc so as to block the column material thoroughly. After the first and before the second blocking step, the column material was centrifuged at 200 x g for 2 minutes to pellet the matrix.

Das Gemisch aus Pool und Säule wurde auf einer rotierenden Scheibe (etwa 10 UpM; Labindustries) 8 Minuten bei 30°C und im Anschluss daran nochmals 2 Stunden bei 4°C inkubiert, um so die Bindung zu erlauben. Das Gemisch aus Pool und Säule wurde dann 2 Minuten bei 200 x g zentrifugiert und der ungebundenes Material enthaltende Überstand wurde entfernt. Das Gemisch aus Pool und Säule wurde danach gewaschen. Dieser Waschprozess umfasste folgende Schritte: Spülen des Gemischs aus Pool und Säule bei 4aC mit WB, 15 Minuten Waschen des Gemisches bei 4°C mit WB, Spülen mit WB, 5 Minuten Waschen bei 30°C mit 0,6 M KGIu und kein Nonidet P-40 enthaltendem WB, 5 Minuten Waschen bei 25°C mit WB und zuletzt wiederum Spülen mit WB. Das nach dem letzten Waschschritt verbleibende Volumen wurde gering gehalten, um so ein Verhältnis von Puffer zu Säulenmaterial von etwa 1:1 zu erreichen. The mixture of pool and column was incubated on a rotating disk (about 10 rpm; lab industries) for 8 minutes at 30 ° C. and then again for 2 hours at 4 ° C., in order to allow binding. The pool and column mixture was then centrifuged at 200 x g for 2 minutes and the supernatant containing unbound material was removed. The pool and column mixture was then washed. This washing process comprised the following steps: rinsing the mixture of pool and column at 4aC with WB, 15 minutes washing the mixture at 4 ° C with WB, rinsing with WB, 5 minutes washing at 30 ° C with 0.6 M KGIu and no nonidet P-40 containing WB, 5 minutes washing at 25 ° C with WB and finally rinsing again with WB. The volume remaining after the last washing step was kept low so as to achieve a ratio of buffer to column material of approximately 1: 1.

Telomerase wurde von dem Säulenmaterial durch Zugabe von 1 nMol Verdrängungs-Oligonucleotid (5'-CA4C4A4C2TA2CAG2TCTA-3'), pro ml Säulenmaterial und 30 Minuten Inkubation bei 25cC inkubiert. Das Material wurde 2 Minuten bei 14 000 UpM in einer Mikrozentrifuge (Eppendorf) zentrifugiert und das Eluat gesammelt. Die Elutionsprozedur wurde noch zweimal wiederholt, wobei jeweils frisches Verdrängungs-Oligonucleotid vewendet wurde. Wie bereits vorstehend angemerkt, formte das Verdrän- Telomerase was incubated from the column material by adding 1 nmol of displacement oligonucleotide (5'-CA4C4A4C2TA2CAG2TCTA-3 '), per ml of column material and 30 minutes incubation at 25cC. The material was centrifuged at 14,000 rpm in a microcentrifuge (Eppendorf) for 2 minutes and the eluate was collected. The elution procedure was repeated two more times, each time using fresh displacement oligonucleotide. As noted above, the crowding out

99 99

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

gungsoligonucleotid mit dem Affinitätsoligonucleotid einen thermodynamisch stabileren Komplex im Vergleich zu Telomerase, da es zu dem Affinitäts-Oligonucleotid komplementär war. Somit wurde durch die Zugabe des Verdrängungs-Oligonucleotids zu einer Affinitäts-gebundenen Telomerase eine wirksame Elution von Telomerase unter nativen Bedingungen erzielt. In diesem Stadium schien die Polymerase etwa 50% rein zu sein, dies wurde anhand einer Analyse auf einem Proteingel bestimmt. Die Affinitäts-Reinigung von Telomerase und Elution mit einem Verdrängungs-Oligonucleotid ist in Fig. 26 (Spur A bzw. B) gezeigt. In dieser Fig. werden die 2'-0-Methylzucker des Affinitäts-Oligonucleotids durch die dikke Linie angezeigt. Die schwarzen und schattierten ovalen Formen sollen in dieser Figur graphisch die erfindungsgemässen Protein-Untereinheiten darstellen. oligonucleotide with the affinity oligonucleotide a thermodynamically more stable complex compared to telomerase, since it was complementary to the affinity oligonucleotide. Thus, by adding the displacement oligonucleotide to an affinity-bound telomerase, effective elution of telomerase was achieved under native conditions. At this stage the polymerase appeared to be about 50% pure, as determined by analysis on a protein gel. Affinity purification of telomerase and elution with a displacement oligonucleotide is shown in Figure 26 (lanes A and B, respectively). In this figure, the 2'-0-methyl sugars of the affinity oligonucleotide are indicated by the thick line. The black and shaded oval shapes are intended to graphically represent the protein subunits according to the invention in this figure.

Die Proteinkonzentrationen des Extrakts und des nach Affi-Gel-Heparin-Säulenchromatographie erhaltenen Materials wurde mittels des Verfahrens von Bradford bestimmt (Bradford, Anal. Biochem. 72 (1976), 248), wobei für die Standards BSA verwendet wurde. Lediglich eine Fraktion der Telomerase-Präparation wurde auf einem Glyceringradienten weiter gereinigt. The protein concentrations of the extract and the material obtained after Affi-Gel heparin column chromatography were determined by the method of Bradford (Bradford, Anal. Biochem. 72 (1976), 248), using BSA for the standards. Only a fraction of the telomerase preparation was further purified on a glycerol gradient.

Der Sedimentationskoeffizient von Telomerase wurde durch Glycerin-Gradientenzentrifugation, wie in Teil I beschrieben, bestimmt. The sedimentation coefficient of telomerase was determined by glycerol gradient centrifugation as described in Part I.

Tabelle 5 stellt eine Telomerase bezüglich einer Reinigung für Telomerase dar, die gemäss den Verfahren dieses Beispiels gereinigt wurde. Die Telomerase war im Vergleich zu den Gesamtzellextrakten in nucleären Extrakten 12fach angereichert, wobei eine Ausbeute von 80% erzielt wurde; 85% der Telomerase wurden nach Extraktion aus Nuclei solubilisiert. Table 5 shows a telomerase related to a purification for telomerase that was purified according to the procedures of this example. The telomerase was 12-fold enriched in nuclear extracts compared to the total cell extracts, with a yield of 80% being achieved; 85% of the telomerase was solubilized after extraction from nuclei.

Tabelle 5 Table 5

Reinigung von Telomerase Purification of telomerase

Fraktion fraction

Protein protein

(mg) (mg)

Telomerase (pMol RNP) Telomerase (pMol RNP)

Telomerase/ Protein/pMol RNP/mg Telomerase / Protein / pmol RNP / mg

Ausbeute yield

(%) (%)

Reinigungsfaktor nucleärer Extrakt Nuclear extract cleaning factor

2020 2020

1720 1720

0,9 0.9

100 100

1 1

Heparin Heparin

125 125

1040 1040

8,3 8.3

60 60

10 10th

Affinität affinity

0,3" 0.3 "

680 680

2270 2270

40 40

2670 2670

Glyceringradient Glycerin gradient

NA* N / A*

NA* N / A*

NA* N / A*

25 25th

NA* N / A*

* NA = Nicht verfügbar * NA = Not available

** Dieser Wert wurde aus der gemessenen Menge an Telomerase (680 pMol) berechnet, bei einer angenommenen Reinheit von 50% (basierend auf einem Proteingel). ** This value was calculated from the measured amount of telomerase (680 pmol), with an assumed purity of 50% (based on a protein gel).

E. Telomerase-Aktivität E. Telomerase activity

Bei jedem Schritt bei der Reinigung von Telomerase wurde die Präparation mittels drei getrennter Assays analysiert, einer dieser Assays beruhte auf der Bestimmung der Aktivität, wie in diesem Beispiel beschrieben. Im allgemeinen wurden Telomerase-Assays in einem Volumen von 40 nl ausgeführt, das 0,003 bis 0,3 nl nucleären Extrakt, 50 mM Tris-Cl (pH-Wert 7,5), 50 mM KGIu, 10 mM MgCb, 1 mM DTT, 125 mM dTTP, 125 ^M dGTP und etwa 0,2 pMol 5'-32P-markiertes Oligonucleotidsubstrat (d.h. etwa 400 000 cpm) enthielt. Oligonucleotidprimer wurden vor der Zugabe zum Reaktionsgemisch hitzedenaturiert. Die Reaktionen wurden auf Eis zusammengestellt und 30 Minuten bei 25°C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 200 pl 10 mM Tris-Cl (pH-Wert 7,5), 15 mM EDTA, 0,6% SDS und 0,05 mg/ml Proteinase K gestoppt und mindestens 30 Minuten bei 45°C inkubiert. Nach Ethanolprä-zipitation wurden die Produkte auf denaturierenden 8%ige PAGE-Gelen analysiert, wie dies auf dem Fachgebiet bekannt ist (siehe z.B. Sambrook et al., 1989). At each step in the purification of telomerase, the preparation was analyzed using three separate assays, one of which was based on the determination of activity as described in this example. In general, telomerase assays were carried out in a volume of 40 nl, the 0.003 to 0.3 nl nuclear extract, 50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 50 mM KGIu, 10 mM MgCb, 1 mM DTT, Contained 125 mM dTTP, 125 ^ M dGTP and about 0.2 pmole 5'-32P-labeled oligonucleotide substrate (ie about 400,000 cpm). Oligonucleotide primers were heat denatured before addition to the reaction mixture. The reactions were assembled on ice and incubated at 25 ° C for 30 minutes. The reactions were stopped by adding 200 μl of 10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 15 mM EDTA, 0.6% SDS and 0.05 mg / ml Proteinase K and incubated at 45 ° C. for at least 30 minutes . After ethanol precipitation, the products were analyzed on 8% denaturing PAGE gels as is known in the art (see e.g. Sambrook et al., 1989).

F. Quantifizierung von Telomerase-Aktivität F. Quantification of Telomerase Activity

In diesem Beispiel wird die Quantifizierung von Telomerase-Aktivität während der Reinigungsprozedur beschrieben. Die Quantifizierung wurde durch Untersuchung der Verlängerung von Oligonucleotidpri-mem in Gegenwart von dGTP und [u-32P]dTTP erreicht. This example describes the quantification of telomerase activity during the purification procedure. The quantification was achieved by examining the extension of oligonucleotide primes in the presence of dGTP and [u-32P] dTTP.

Kurz zusammengefasst: 1 ^M 5'-(G4T4)2-3'-Oligonucleotid wurde in einem 20 nl-Reaktionsgemisch in Gegenwart von 2 ni [a-32P]dTTP (10 mCi/ml, 400 Ci/mMol; 1 Ci = 37 GBq) und 125 nM dGTP wie in Lingner et al., (Genes Develop. 8 (1994), 1984) beschrieben verlängert und auf ein 80%ige PAGE-Se-quenzierungsgel, so wie dies auf dem Fachgebiet bekannt ist, aufgetragen (siehe z.B. Sambrook et al., 1989). Briefly summarized: 1 ^ M 5 '- (G4T4) 2-3'-oligonucleotide was in a 20 nl reaction mixture in the presence of 2 ni [a-32P] dTTP (10 mCi / ml, 400 Ci / mmol; 1 Ci = 37 GBq) and 125 nM dGTP as described in Lingner et al. (Genes Develop. 8 (1994), 1984) and applied to an 80% PAGE sequencing gel as is known in the art ( see for example Sambrook et al., 1989).

Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Fig. 28 gezeigt. In Spur 1 ist keine Telomerase vorhanden (d.h. negative Kontrolle), die Spuren 2, 5, 8 und 11 enthielten 0,14 fMol Telomerase; die Spuren 3, 6, 9 und 12 enthielten 0,42 fMol Telomerase und die Spuren 4, 7, 10 und 13 enthielten 1,3 fMol Telomerase. Die Aktivität wurde mittels eines «Phosphorlmager» (Molecular Dynamics) gemäss den Anwei- The results of this study are shown in Fig. 28. Lane 1 had no telomerase (i.e. negative control), lanes 2, 5, 8 and 11 contained 0.14 fmol telomerase; lanes 3, 6, 9 and 12 contained 0.42 fmol telomerase and lanes 4, 7, 10 and 13 contained 1.3 fmol telomerase. The activity was determined using a “phosphor leaner” (Molecular Dynamics) according to the instructions

100 100

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

sungen des Herstellers quantifiziert. Die Messung ergab, dass unter diesen Bedingungen 1 fMol affini-tätsgereinigte Telomerase 21 fMol dTTP in 30 Minuten einbaute. solutions of the manufacturer quantified. The measurement showed that under these conditions 1 fmol of affinity-purified telomerase incorporated 21 fmol of dTTP in 30 minutes.

Wie in dieser Figur gezeigt, änderte sich die spezifische Aktivität der Telomerase nicht wesentlich während der Reinigungsprozedur. Affinitätsgereinigte Telomerase war vollständig aktiv. Bei hohen Konzentrationen konnte jedoch eine inhibitorische Aktivität nachgewiesen werden und die Aktivität der Rohextrakte war nicht linear. Daher wurde in dem in Fig. 28 gezeigten Assay der hohe Extrakt 700-7000fach verdünnt. Durch die Reinigung wurde die inhibitorische Aktivität entfernt und es wurde selbst bei hohen Enzymkonzentrationen keine inhibitorische Wirkung in den Präparationen von gereinigter Telomerase nachgewiesen. As shown in this figure, the specific activity of telomerase did not change significantly during the purification procedure. Affinity-purified telomerase was completely active. However, inhibitory activity could be demonstrated at high concentrations and the activity of the crude extracts was not linear. Therefore, in the assay shown in Fig. 28, the high extract was diluted 700-7000 times. The inhibitory activity was removed by the purification and no inhibitory effect was found in the preparations of purified telomerase even at high enzyme concentrations.

G. Gelelektrophorese und Northern-Blots G. Gel electrophoresis and Northern blots

Wie in Teil E angegeben, wurde bei jedem Reinigungsschritt für Telomerase die Präparation mittels dreier getrennter Assays analysiert. In diesem Beispiel werden Gelelektrophorese-Prozeduren und Blot-ting-Prozeduren beschrieben, die zur Quantifizierung von in Fraktionen enthaltener Telomerase-RNA und zur Analyse der Integrität des Telomerase-Ribonucleoprotein-Partikels verwendet wurden. As indicated in Part E, the preparation of each telomerase purification step was analyzed using three separate assays. This example describes gel electrophoresis procedures and blotting procedures that were used to quantify telomerase RNA contained in fractions and to analyze the integrity of the telomerase ribonucleoprotein particle.

i) Denaturierende Gele und Northem-Blots i) Denaturing gels and Northem blots

In diesem Beispiel diente eine synthetische T7-transkribierte Telomerase-RNA mit bekannter Konzentration als Standard. Während dieser Untersuchung wurde der RNA-Bestandteil als ein Mass für Telomerase verwendet. In this example, a synthetic T7-transcribed telomerase RNA with known concentration served as the standard. During this study, the RNA component was used as a measure of telomerase.

Es wurde mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ein Konstrukt für die Transkription von E. aediculatus-Telomerase-RNA durch die T7-Phagen-RNA-Polymerase hergestellt. Das Telomerase-RNA-Gen wurde mit Primern amplifiziert, die sich an die beiden Enden des Gens anlagerten. Die Primer, die sich an das 5'-Ende anlagerten, codierten auch eine «hammerhead»-Ribozymsequenz, um so das natürliche 5'-Ende nach Spaltung der transkribierten RNA zu erzeugen, eine T7-Promotorsequenz und eine EcoRI-Stelle für die Subclonierung. A construct for the transcription of E. aediculatus telomerase RNA by the T7 phage RNA polymerase was produced by means of the polymerase chain reaction (PCR). The telomerase RNA gene was amplified with primers that attached to both ends of the gene. The primers that attached to the 5 'end also encoded a hammerhead ribozyme sequence to produce the natural 5' end after cleaving the transcribed RNA, a T7 promoter sequence, and an EcoRI site for subcloning .

Die Sequenz dieses 5'-Primers war 5'- The sequence of this 5 'primer was 5'

GCGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAAGAAACTCTGATGAGGCCGA AAGGCCGAAACTCCACGAAAGTGGAGTAAGTTTCTCGATAATTGATCTGTA GCGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAAGAAACTCTGATGAGGCCGA AAGGCCGAAACTCCACGAAAGTGGAGTAAGTTTCTCGATAATTGATCTGTA

G-3'. Der 3'-Primer enthielt eine Earl-Stelle für die Termination der Transkription an dem natürlichen 3-Ende und eine BamHI-Stelle für die Clonierung. Die Sequenz dieses 3"-Primers war 5'-CGGGGATCC-TCTTCAAAAGATGAGAGGACAGCAAAC-3'. Das PCR-Amplifikationsprodukt wurde mit EcoRI und BamHI gespalten und in die entsprechenden Stellen von pUC19 (NEB) subcloniert, wobei «pEaT7» erhalten wurde. Durch DNA-Sequenzierung wurde die korrekte Insertion bestätigt. T7-Transkription wurde wie von Zaug et al., Biochemistry 33 (1994) 14935 beschrieben mit einem Earl-Iinearisierten Plasmid durchgeführt. Die RNA wurde gelgereinigt und die Konzentration bestimmt (bei A260 von 1 = 40 ^g/ml). Die RNA wurde als Standard zur Bestimmung der in verschiedenen Präparationen von Telomerase vorhandenen Telomerase-RNA als Standard verwendet. G-3 '. The 3 'primer contained an Earl site for termination of transcription at the natural 3 end and a BamHI site for cloning. The sequence of this 3 "primer was 5'-CGGGGATCC-TCTTCAAAAGATGAGAGGACAGCAAAC-3 '. The PCR amplification product was digested with EcoRI and BamHI and subcloned into the corresponding sites of pUC19 (NEB) to give" pEaT7 ". The correct insertion was confirmed by sequencing. T7 transcription was carried out with an Earl linearized plasmid as described by Zaug et al., Biochemistry 33 (1994) 14935. The RNA was gel-purified and the concentration determined (for A260 of 1 = 40 ^ g The RNA was used as a standard for determining the telomerase RNA present in various preparations of telomerase as a standard.

Das Hybridisierungssignal war proportional zu der Menge an Telomerase-RNA und die abgeleiteten RNA-Konzentrationen stimmten mit den durch native Gelelektrophorese erhaltenen Konzentrationen im Prinzip überein, waren jedoch leicht höher. Der Vergleich der Menge an gesamter Telomerase-RNA in Gesamt-Zell-RNA mit seriellen Verdünnungen von bekannten T7-RNA-Transkriptkonzentrationen zeigte an, dass jede E. aediculatus-Zelle etwa 300 000 Telomerase-Moleküle enthielt. The hybridization signal was proportional to the amount of telomerase RNA and the deduced RNA concentrations were in principle consistent with the concentrations obtained by native gel electrophoresis, but were slightly higher. Comparison of the amount of total telomerase RNA in total cell RNA with serial dilutions of known T7 RNA transcript concentrations indicated that each E. aediculatus cell contained approximately 300,000 telomerase molecules.

Die Sichtbarmachung der Telomerase wurde durch Northern-Blot-Hybridisierung an deren RNA-Bestandteil erzielt, wobei die von Lingner et al. beschriebenen Verfahren verwendet wurden (Lingner et al., Genes Develop. 8 (1994), 1984). Kurz zusammengefasst: RNA (0,5 ng/Spur oder weniger) wurde durch 8%ige PAGE aufgetrennt und auf eine «Hybond-N»-Membran (Amersham), wie dies auf dem Fachgebiet bekannt ist, elektrogeblottet (siehe z.B. Sambrook et al. 1989) Der Blot wurde in 10 ml 4 x SSC, 10 x Denhardt-Lösung, 0,1% SDS und 50 n/ml denaturierte Heringssperma-DNA über Nacht hybridisiert. Nach 3 Stunden Vorhybridisierung wurden 2 x 106 cpm-Sonde/ml Hybridisierungslösung zugegeben. Die zufallsmarkierte Sonde war ein PCR-Produkt, das das gesamte Telomerase-RNA-Gen bedeckte. Der Blot wurde bei verschiedenen Pufferaustauschen 30 Minuten 2 x SSC, 0,1% SDS und danach 1 Stunde in 0,1 x SSC und 0,1% SDS bei 45°C gewaschen. Visualization of the telomerase was achieved by Northern blot hybridization to its RNA component, the method described by Lingner et al. described methods were used (Lingner et al., Genes Develop. 8 (1994), 1984). Briefly summarized: RNA (0.5 ng / lane or less) was separated by 8% PAGE and electroblotted onto a «Hybond-N» membrane (Amersham), as is known in the art (see eg Sambrook et al 1989) The blot was hybridized overnight in 10 ml of 4 x SSC, 10 x Denhardt's solution, 0.1% SDS and 50 n / ml denatured herring sperm DNA. After 3 hours of pre-hybridization, 2 x 106 cpm probe / ml hybridization solution were added. The randomly labeled probe was a PCR product that covered the entire telomerase RNA gene. The blot was washed with different buffer exchanges for 2 minutes 2 x SSC, 0.1% SDS and then for 1 hour in 0.1 x SSC and 0.1% SDS at 45 ° C.

ii) Native Gele und Northem-Blots ii) Native gels and Northem blots

In diesem Experiment wurde die Präparation an gereinigter Polymerase auf nativen (d.h. nicht-dena-turierenden) Gelen aus 3,5% Polyacrylamid und 0,33% Agarose aufgetrennt, wie dies auf dem Fachgebiet bekannt und von Lamond und Sproat beschrieben ist (Lamond and Sproat (1994), a.a.O.) Die Telomerase comigrierte etwa mit dem Farbstoff Xylencyanol. In this experiment, the preparation of purified polymerase was separated on native (ie non-denaturing) gels made from 3.5% polyacrylamide and 0.33% agarose, as is known in the art and described by Lamond and Sproat (Lamond and Sproat (1994), loc. Cit.) The telomerase comigrated with the dye xylene cyanole.

101 101

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Die Ergebnisse mit nativen Gelen zeigten an, dass während des Reinigungsverfahrens Telomerase als RNP beibehalten wurde. Fig. 27 ist ein Foto eines Northem-Blots, das die Mobilität der Telomerase in verschiedenen Fraktionen auf einem nicht-denaturierenden Gel zeigt, sowie die Mobilität von in vitro-transkribierter Telomerase. Spur 1 in dieser Figur enthielt 1,5 fMol Telomerase-RNA, Spur 2 4,6 fMol Telomerase-RNA, Spur 3 14 fMol Telomerase-RNA, Spur 4 41 fMol-Telomerase-RNA, Spur 5 nucleären Extrakt (42 fMol Telomerase), Spur 6 Affi-Gel-Heparin-gereinigte Telomerase (47 fMol Telomerase), Spur 7 affinitätsgereinigte Telomerase (68 fMol) und Spur 8 über einen Glycerolgradienten gereinigte Telomerase (35 fMol). The results with native gels indicated that telomerase was retained as an RNP during the purification process. Figure 27 is a photo of a Northem blot showing the mobility of telomerase in various fractions on a non-denaturing gel and the mobility of in vitro transcribed telomerase. Lane 1 in this figure contained 1.5 fmol telomerase RNA, lane 2 4.6 fmol telomerase RNA, lane 3 14 fmol telomerase RNA, lane 4 41 fmol telomerase RNA, lane 5 nuclear extract (42 fmol telomerase) , Lane 6 Affi-gel heparin-purified telomerase (47 fMol telomerase), lane 7 affinity-purified telomerase (68 fMol) and lane 8 via a glycerol gradient purified telomerase (35 fMol).

Wie in Fig. 27 gezeigt, war in nucleären Extrakten die Telomerase zu einem RNP-Partikel assem-bliert, der langsamer wanderte als nicht-assemblierte Telomerase-RNA. Durch dieses Verfahren wurde weniger als 1% freie RNA nachgewiesen. Es konnte jedoch in Extrakten gelegentlich auch ein langsamer wandernder Telomerase-RNP-Komplex nachgewiesen werden. Nach Reinigung auf der Affi-Gel-He-parinsäule wies der Telomerase-RNP-Partikel keine Veränderung in der Mobilität auf (Fig. 27, Spur 6). Nach Affinitätsreinigung war jedoch die Mobilität des RNA-Partikels leicht erhöht (Fig. 27, Spur 7), was vielleicht anzeigt, dass eine Protein-Untereinheit oder ein -Fragment verlorenging. Auf Glyceringradien-ten veränderte die affinitätsgereinigte Telomerase ihre Grösse nicht, es waren jedoch etwa 2% freie Telomerase-RNA nachweisbar (Fig. 27, Spur 8), was nahelegt, dass eine geringe Disassemblierung des RNP-Partikels eingetreten war. As shown in Figure 27, in nuclear extracts, the telomerase was assembled into an RNP particle that migrated more slowly than unassembled telomerase RNA. Less than 1% free RNA was detected by this method. However, a slow migrating telomerase-RNP complex was occasionally detected in extracts. After purification on the Affi-Gel-Heparin column, the telomerase RNP particle showed no change in mobility (FIG. 27, lane 6). However, after affinity purification, the mobility of the RNA particle was slightly increased (Fig. 27, lane 7), which may indicate that a protein subunit or fragment was lost. The affinity-purified telomerase did not change its size on glycerol radii, but about 2% free telomerase RNA was detectable (FIG. 27, lane 8), which suggests that there was little disassembly of the RNP particle.

G. Telomerase-Protein-Zusammensetzung G. Telomerase Protein Composition

In diesem Beispiel ist die Analyse der gereinigten Telomerase-Protein-Zusammensetzung beschrieben. This example describes the analysis of the purified telomerase protein composition.

In diesem Beispiel wurden die in Teil D erhaltenen Glyceringradienten-Fraktionen auf einem 4 bis 20%igen Polyacrylamidgel (Novex) aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomas-sie-Brilliant-Blau angefärbt. Fig. 29 zeigt ein Photo dieses Gels. Die Spuren 1 und 2 enthielten Moleku-largewichtsmarker (Pharmacia) wie dies auf der linken Seite des in Fig. 29 gezeigten Gels angezeigt ist. Die Spuren 3 bis 5 enthielten vereinigte Glycerin-Gradientenfraktionen, wie dies oberhalb des Gels angezeigt ist (d.h. Spur 3 enthielt Fraktionen 9-14, Spur 4 Fraktionen 15-22 und Spur 5 Fraktionen 23-32). Spur 4 enthielt den Pool mit 1 pMol Telomerase-RNA. In den Spuren 6 bis 9 wuren BSA-Stan-dards mit den oberhalb des Gels in Fig. 29 angezeigten Konzentrationen laufen gelassen (d.h. Spur 6 enthielt 0,5 pMol BSA, Spur 7 1,5 pMol BSA, Spur 8 4,5 pMol BSA und Spur 9 15 pMol BSA). In this example, the glycerol gradient fractions obtained in Part D were separated on a 4 to 20% polyacrylamide gel (Novex). After electrophoresis, the gel was stained with Coomas Sie Brilliant Blue. Figure 29 shows a photo of this gel. Lanes 1 and 2 contained molecular weight markers (Pharmacia) as indicated on the left side of the gel shown in FIG. 29. Lanes 3 through 5 contained pooled gradient glycerin fractions as indicated above the gel (i.e. lane 3 contained fractions 9-14, lane 4 fractions 15-22 and lane 5 fractions 23-32). Lane 4 contained the pool with 1 pmole of telomerase RNA. In lanes 6 through 9, BSA standards were run at the concentrations indicated above the gel in Figure 29 (ie lane 6 contained 0.5 pmol BSA, lane 7 1.5 pmol BSA, lane 8 4.5 pmol BSA and lane 9 15 pmol BSA).

Wie in Fig. 29 gezeigt ist, wurden Polypeptide mit einem Molekulargewicht von 120 und 43 kD zusammen mit der Telomerase aufgereinigt. Das 43 kD-Polypeptid trat als eine Dublette auf. Es wurde festgestellt, dass das Polypeptid mit etwa 43 kD in Spur 3 anders wanderte als die Dublette in Spur 4, es könnte sich dabei um ein nicht-verwandtes Protein handeln. Das 120 kD-Protein und die 43 kD-Du-blette zeigen beide nach Anfärbung mit «Coomassie-Brilliant-Blau» einen Spiegel von etwa 1 pMol im Vergleich zu BSA-Standards. Da diese Fraktion 1 pMol Telomerase-RNA enthielt, die vollständig zu einem RNP-Partikel assembliert war (siehe Fig. 27, Spur 8), scheint es zwei Polypeptid-Untereinheiten zu geben, die zu der Telomerase-RNA stöchiometrisch sind. Es kann jedoch auch möglich sein, dass die zwei Proteine um 43 kD getrennte Enzym-Untereinheiten sind. As shown in Figure 29, 120 and 43 kD molecular weight polypeptides were purified along with the telomerase. The 43 kD polypeptide appeared as a doublet. It was found that the approximately 43 kD polypeptide in lane 3 migrated differently from the doublet in lane 4, and it could be an unrelated protein. The 120 kD protein and the 43 kD Du blette both show a level of about 1 pmole after staining with "Coomassie Brilliant Blue" compared to BSA standards. Since this fraction contained 1 pmole of telomerase RNA, which was completely assembled into an RNP particle (see FIG. 27, lane 8), there appear to be two polypeptide subunits that are stoichiometric to the telomerase RNA. However, the two proteins may also be enzyme subunits separated by 43 kD.

Affinitätsgereinigte Telomerase, die nicht einer Fraktionierung auf einem Glyceringradienten unterworfen wurde, enthielt zusätzliche Polypeptide mit einem geschätzten Molekulargewicht von 35 bzw. 37 kD. Es wurde geschätzt, dass diese letztere Fraktion zu mindestens 50% rein ist. Die hier in dem affinitäts-gereinigten Material vorhandenen 35 kD- und 37 kD-Polypeptide wurden jedoch durch Glyceringradien-ten-Zentrifugation nicht reproduzierbar aufgetrennt. Diese Polypeptide können Verunreinigungen darstellen, da sie nicht in allen Aktivitäts-enthaltenden Präparationen sichtbar waren. Affinity-purified telomerase, which was not subjected to fractionation on a glycerol gradient, contained additional polypeptides with an estimated molecular weight of 35 or 37 kD. It has been estimated that this latter fraction is at least 50% pure. However, the 35 kD and 37 kD polypeptides present here in the affinity-purified material were not reproducibly separated by centrifugation with glycerin gradients. These polypeptides can be contaminants because they were not visible in all activity-containing preparations.

H. Sedimentationskoeffizient H. Sedimentation coefficient

Der Sedimentationskoeffizient für Telomerase wurde durch Glyceringradienten-Zentrifugation bestimmt. In diesem Beispiel wurden nucleärer Extrakt und affinitäts-gereinigte Telomerase auf 15-40%igen Glyceringradienten fraktioniert, die 20 mM Tris-Acetat, 1 mM MgCh, 0,1 mM EDTA, 300 mM KGIu und 1 mM DTT, pH-Wert 7,5, enthielten. Glyceringradienten wurden in 5 ml-Röhrchen (13 x 51 mm) gegeben und mittels eines SW55Ti-Rotors (Beckman) 14 Stunden mit 55 000 UpM bei 4°C zentrifugiert. The sedimentation coefficient for telomerase was determined by glycerol gradient centrifugation. In this example, nuclear extract and affinity-purified telomerase were fractionated on 15-40% glycerol gradients containing 20 mM Tris acetate, 1 mM MgCh, 0.1 mM EDTA, 300 mM KGIu and 1 mM DTT, pH 7. 5, contained. Glycerin gradients were placed in 5 ml tubes (13 x 51 mm) and centrifuged for 14 hours at 55,000 rpm at 4 ° C. using a SW55Ti rotor (Beckman).

In einem parallelen Gradienten wurden Marker-Proteine laufen gelassen; es ergab sich ein Sedimentationskoeffizient von 7, 6 S für Alkoholdehydrogenase (ADH) 113 S für Katalase, 17,3 S für Apoferritin und 19,3 S für Thyroglobulin. Der Telomerase-Peak wurde durch Elektrophorese von Gradientenfraktionen auf einem nativen Gel und im Anschluss daran Blot-Hybridisierung an deren RNA-Komponente identifiziert. Marker proteins were run in a parallel gradient; there was a sedimentation coefficient of 7.6 S for alcohol dehydrogenase (ADH), 113 S for catalase, 17.3 S for apoferritin and 19.3 S for thyroglobulin. The telomerase peak was identified by electrophoresis of gradient fractions on a native gel and then blot hybridization on their RNA component.

Fig. 30 ist eine graphische Darstellung, die den Sedimentationskoeffizienten für Telomerase zeigt. Wie in dieser Figur gezeigt ist, co-sedimentierte affinitätsgereinigte Telomerase mit Katalase bei 11,5 S, während Telomerase aus nucleären Extrakten etwas schneller sedimentierte mit dem Peak um 12,5 S. Somit scheint gereinigte Telomerase ein proteolytisches Fragment oder eine lose assoziierte Untereinheit verloren zu haben, was mit der Mobilität des Enzyms in nativen Gelen übereinstimmt. Fig. 30 is a graph showing the sedimentation coefficient for telomerase. As shown in this figure, affinity-purified telomerase co-sedimented with catalase at 11.5 S, while telomerase from nuclear extracts sedimented somewhat faster with the peak around 12.5 S. Thus, purified telomerase appears to lose a proteolytic fragment or a loosely associated subunit to have what is consistent with the mobility of the enzyme in native gels.

102 102

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Das geschâtze Molekulargewicht für Telomerase ergibt einen Gesamtwert von insgesamt 229 kD, wenn man davon ausgeht, dass sie aus einer Protein-Untereinheit mit 120 kD, einer Protein-Untereinheit mit 43 kD und einer RNA-Untereinheit mit 66 kD besteht. Dies ist in eng er Übereinstimmung mit dem Molekulargewicht von 232 kD von Katalase. Der Sedimentationskoeffizient ist jedoch nicht nur eine Funktion des Molekulargewichts sondern auch des spezifischen Teilvolumens und des Reibungskoeffizienten des Moleküls, wobei beide Parameter für das Telomerase-RNP nicht bekannt sind. The estimated molecular weight for telomerase is 229 kD in total, assuming that it consists of a 120 kD protein subunit, a 43 kD protein subunit, and a 66 kD RNA subunit. This is in close agreement with the molecular weight of 232 kD of catalase. However, the sedimentation coefficient is not only a function of the molecular weight, but also of the specific partial volume and the coefficient of friction of the molecule, neither parameter for the telomerase RNP being known.

I. Substratverwertung I. substrate recycling

In diesem Beispiel wurden die Erfordernisse von Telomerase hinsichtlich des Substrats untersucht. Ein einfaches Modell für die Replikation von DNA-Enden geht von der Annahme aus, dass nach semikonservativer DNA-Replikation Telomerase doppelsträngige, mit glatten Enden versehene DNA-Moleküle verlängert. Bei einer Variation dieses Modells wird davon ausgegangen, dass ein einzelsträngiges 3"-Ende durch eine Helicase oder Nuclease nach Replikation erzeugt wird. Dieses 3'-Ende wird dann von der Telomerase für die Bindung und Verlängerung verwendet. In this example, the requirements of telomerase for the substrate were examined. A simple model for the replication of DNA ends assumes that after semi-conservative DNA replication, telomerase extends double-stranded, blunt-ended DNA molecules. A variation of this model assumes that a single-stranded 3 "end is generated by a helicase or nuclease after replication. This 3 'end is then used by the telomerase for binding and extension.

Um zu bestimmen, ob Telomerase mit glatten Enden versehene Moleküle verlängern kann, wurden Modell-Haarnadelstrukturen mit an deren 3'-Enden gelegenen Telomer-Wiederholungseinheiten synthetisiert. Diese Primersubstrate wurden gelgereinigt, mit Polynucleotidkinase 5'-endmarkiert, 5 Minuten bei 80°C und bei 0,4 nM erhitzt und dann in einem Hitzeblock langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, um so eine Renaturierung und Helixbildung der Haarnadelstrukturen zu erlauben. Die Substratmobilität auf einem nicht-denaturierenden Gel zeigte, dass im Vergleich zur Dimerisierung eine sehr effiziente Haarnadelbildung vorhanden war. To determine whether telomerase can elongate blunt-ended molecules, model hairpin structures with telomer repeat units located at their 3 'ends were synthesized. These primer substrates were gel cleaned, 5'-end labeled with polynucleotide kinase, heated at 80 ° C and 0.4 nM for 5 minutes and then slowly cooled to room temperature in a heat block to allow renaturation and helix formation of the hairpin structures. The substrate mobility on a non-denaturing gel showed that there was very efficient hairpin formation compared to dimerization.

In diesem Beispiel wurden Assays durchgeführt mit unmarkiertem 125 nM dGTP, 125 nM dTTP und 0,02 nM 5'-endmarkierten Primer (5'-32P-markiertem Oligonucleotid-Substrat) in 10 pl Reaktionsgemischen, die 20 mM Tris-Acetat enthielten mit 10 mM MgCfe, 50 mM KGIu und 1 mM DTT bei einem pH-Wert von 7,5. Diese Gemische wurden 30 Minuten bei 25°C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von Formamid-Auftragspuffer gestoppt (d.h. TBE, Formamid, Bromthymol-Blau und -Cyanol, Sambrook, 1989, a.a.O.). In this example, assays were carried out with unlabeled 125 nM dGTP, 125 nM dTTP and 0.02 nM 5'-end-labeled primer (5'-32P-labeled oligonucleotide substrate) in 10 pl reaction mixtures containing 20 mM Tris acetate with 10 mM MgCfe, 50 mM KGIu and 1 mM DTT at pH 7.5. These mixtures were incubated at 25 ° C for 30 minutes. The reactions were stopped by adding formamide application buffer (i.e. TBE, formamide, bromothymol blue and cyanol, Sambrook, 1989, op. Cit.).

Primer wurden ohne Telomerase inkubiert («->»), mit 5,9 fMol affinitätsgereinigter Telomerase («+»), oder mit 17,6 fMol affinitätsgereinigter Telomerase (« +++ •>). Die in diesem Assay verwendete affinitätsgereinigte Telomerase wurde mit einer Membran mit einer molekularen Ausschlussgrenze von 100 kD dialysiert, um so das Verdrängungsoligonucleotid zu entfernen. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 8%igen PAGE (Harnstoffgel, das zur Denaturierung der Haarnadelstruktur 36% Formamid enthielt) aufgetrennt. Die Sequenzen der in dieser Untersuchung verwendeten Primer sowie ihre Spurzuordnungen sind in Tabelle 6 gezeigt. Primers were incubated without telomerase («->»), with 5.9 fMol of affinity-purified telomerase («+»), or with 17.6 fMol of affinity-purified telomerase («+++ •>). The affinity-purified telomerase used in this assay was dialyzed with a membrane with a molecular cutoff of 100 kD to remove the displacement oligonucleotide. The reaction products were separated on an 8% PAGE (urea gel, which contained 36% formamide to denature the hairpin structure). The sequences of the primers used in this study and their track assignments are shown in Table 6.

103 103

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Tabelle 6 Primersequenzen Table 6 Primer sequences

Spur track

Primersequenz (5' nach 3') Primer sequence (5 'after 3')

1-3 1-3

C4(A4C4)3CACA(G4T4)3G4 C4 (A4C4) 3CACA (G4T4) 3G4

4-6 4-6

C2(A4C4)3CACA(G4T4)3G4 C2 (A4C4) 3CACA (G4T4) 3G4

7-9 7-9

(A4C4)3CACA(G4T4)3G4 (A4C4) 3CACA (G4T4) 3G4

10-12 10-12

A:C4(A4C4)2CACA(G4T4)3G4 A: C4 (A4C4) 2CACA (G4T4) 3G4

13-15 13-15

C4(A4C4),CACA(G4T4), C4 (A4C4), CACA (G4T4),

16-18 16-18

(A4C4)3CACA(G4T4)3 (A4C4) 3CACA (G4T4) 3

19-21 19-21

A3C4(A4C4):CACA(G4T4)3 A3C4 (A4C4): CACA (G4T4) 3

22-24 22-24

C4(A4C4)2CACA(G4T4)3 C4 (A4C4) 2CACA (G4T4) 3

25-27 25-27

C2(A4C4)2CACA(G4T4)j C2 (A4C4) 2CACA (G4T4) j

28-30 28-30

(A4C4)2CACA(G4T4)3 (A4C4) 2CACA (G4T4) 3

Die mit den Gelen erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 31 gezeigt. Die Spuren 1-15 enthielten Substrate mit Telomer-Wiederholungseinheiten, die mit vier G-Resten endeten. Die Spuren 16-30 enthielten Substrate mit Telomer-Wiederholungseinheiten, die mit vier T-Resten endeten. Die mutmassliche Ausrichtung auf der Telomerase-RNA-Matrize ist in Fig. 32 angegeben. Es wird angenommen, dass die Primersätze sich an zwei verschiedenen Positionen in der in Fig. 32 gezeigten Matrize (d.h. 32A bzw. 32B). Dies könnte ihre Bindungs- und/oder Verlängerungsrate beeinflusst haben. The results obtained with the gels are shown in Fig. 31. Lanes 1-15 contained substrates with telomer repeat units that ended with four G residues. Lanes 16-30 contained substrates with telomer repeat units that ended with four T residues. The putative orientation on the telomerase RNA template is shown in FIG. 32. It is believed that the primer sets are at two different positions in the template shown in Figure 32 (i.e. 32A and 32B, respectively). This could have affected their retention and / or renewal rates.

Fig. 33 zeigt eine geringere Belichtung der Spuren 25-30 von Fig. 31. Die geringere Belichtung von Fig. 33 wurde deshalb durchgeführt, um die Sichtbarmachung der Nucleotide zu erlauben, die zugegeben wurden, und der Verzögerungspositionen in verlängertem Produkten. Der Prozentsatz an verlängerten Substrat wurde für jede dritte Linie eines Satzes auf einem «Phosphorlmager», wie dies in der Fig. 31 unten gezeigt ist, quantifiziert. Fig. 33 shows a lower exposure of lanes 25-30 of Fig. 31. The lower exposure of Fig. 33 was therefore made to allow visualization of the nucleotides that were added and the delay positions in extended product. The percentage of elongated substrate was quantified for every third line of a set on a "phosphor lean" as shown in Figure 31 below.

Die Wirksamkeit djeser Haarnadelstrukturen als Substrat wurde mit doppelsträngigen Telomer-ähnli-chen Strukturen mit Überhängen unterschiedlicher Länge verglichen. Ein Modellsubstrat, das mit vier G-Resten endete (siehe die Spuren 1 bis 15 von Fig. 31), wurde dann nicht verlängert, wenn es ein glattes Ende enthielt (siehe Spuren 1-3). Es wurde jedoch eine leichte Verlängerung mit einer Überhanglänge von zwei Basen beobachtet. Die Verlängerung wurde jedoch effizient, wenn der Überhang etwa 4 Basen lang war. Die Telomerase wirkte auf ähnliche Weise mit einem doppelsträngigen Substrat, das mit vier T-Resten endete, wobei ein Überhang von 6 Basen für eine hocheffiziente Verlängerung erforderlich war. Die schwachen Banden unter den Primern in den Spuren 10-15 von Fig. 31, die unabhängig von Telomerase sind, stellen kürzere Oligonucleotide in den Primerpräparationen dar. The effectiveness of this hairpin structure as a substrate was compared with double-stranded telomer-like structures with overhangs of different lengths. A model substrate that ended with four G residues (see lanes 1 to 15 of Figure 31) was not elongated if it contained a smooth end (see lanes 1-3). However, a slight elongation with an overhang length of two bases was observed. However, the extension became efficient when the overhang was about 4 bases long. Telomerase worked similarly with a double-stranded substrate that ended with four T residues, requiring a 6 base overhang for highly efficient elongation. The weak bands among the primers in lanes 10-15 of FIG. 31, which are independent of telomerase, represent shorter oligonucleotides in the primer preparations.

Durch die schwächere Belichtung der Spuren 25-30 in Fig. 33 zeigt sich eine Leiter von verlängerten Produkten, wobei die dunkelsten Banden mit der vermutlichen 5'-Grenze der Matrize korrelieren (wie von Lingner et al., Genes Develop. 8 (1994), 1984 beschrieben). Das häufige Auftreten von Produkten, die anderen Positionen in der Matrize entsprechen, legte nahe, dass ein «Innehalten» und/oder eine «Dissoziierung» mit der gereinigten Polymerase an Stellen vorkommt, die nicht der Translokationsstelle entsprechen. The weaker exposure of lanes 25-30 in Fig. 33 shows a ladder of elongated products, the darkest bands correlating with the presumed 5 'boundary of the matrix (as described by Lingner et al., Genes Develop. 8 (1994) , 1984). The frequent occurrence of products that correspond to other positions in the template suggested that "pausing" and / or "dissociating" with the purified polymerase occurs at sites that do not correspond to the translocation site.

Wie in Fig. 31 gezeigt, waren doppelsträngige, mit glatten Enden versehene Oligonucleotide keine Substrate für Telomerase. Um herauszufinden, ob diese Moleküle an Telomerase binden können, wurde ein Kompetitionsexperiment durchgeführt. In diesem Experiment wurden 2 nM 5'-endmarkiertes Substrat mit der Sequenz (G-tT^ bzw. ein Haarnadelsubstrat mit einem Überhang von sechs Basen mit 0,125 mM Telomerase verlängert (Fig. 31, Spuren 25-27). Obwohl die gleichen unmarkierten Oligonucleotid- As shown in Figure 31, double-stranded, blunt-ended oligonucleotides were not substrates for telomerase. A competition experiment was carried out to find out whether these molecules could bind to telomerase. In this experiment, 2 nM 5 'end-labeled substrate was extended with the sequence (G-tT ^ or a hairpin substrate with an overhang of six bases with 0.125 mM telomerase (Fig. 31, lanes 25-27). Although the same unlabeled oligonucleotide -

104 104

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

substrate effizient mit dem markierten Substrat bezüglich der Verlängerung konkurrierten, wurde keine Herabsetzung an Aktivität beobachtet, wenn die doppelsträngigen, mit glatten Enden versehenen Haar-nadel-Oligonucleotide als Kompetitoren verwendet wurden, selbst in Gegenwart eines 100fachen Überschusses von Haamadelstrukturen. substrate competitively competed for elongation with the labeled substrate, no decrease in activity was observed when the double-stranded, smooth-ended hairpin oligonucleotides were used as competitors, even in the presence of a 100-fold excess of hairpin structures.

Diese Ergebnisse zeigten an, dass doppelsträngige, mit glatten Enden versehene Oligonucleotide bei dem in diesem Beispiel getesteten Konzentrationen Telomerase nicht binden können, d.h. ein einzelsträngiges 3'-Ende ist für eine Bindung erforderlich. Wahrscheinlich wird dieses 3'-Ende für eine Basenpaarung mit der Telomerase-RNA-Matrize benötigt. These results indicated that double-stranded, blunt-ended oligonucleotides cannot bind at the concentrations of telomerase tested in this example, i.e. a single-stranded 3 'end is required for binding. This 3 'end is probably required for base pairing with the telomerase RNA template.

J. Clonierung & Sequenzierung des 123 kD-Polypeptids J. Cloning & sequencing of the 123 kD polypeptide

In diesem Beispiel wird die Clonierung des 123 kD-Polypeptids von Telomerase, (d.h. die 123 kD-Protein-Untereinheit) beschrieben. In dieser Untersuchung wurde ein internes Fragment des Telomera-segens mittels PCR amplifiziert. Es wurden Oligonucleotid-Primer verwendet, die so konstruiert waren, dass sie mit den von dem im vorstehenden Teil D erhaltenen gereinigten Polypeptid erhaltenen Peptid-sequenzen übereinstimmten. Die Polypeptidsequenz wurde mittels des «nanoES-Tandem»-Massenspek-troskopieverfahrens bestimmt, das auf dem Fachgebiet bekannt und von Calvio et al., RNA 1 (1995), 724-733 beschrieben ist. Die in diesem Beispiel verwendeten Oligonucleotidprimer hatten die folgenden Sequenzen, wobei degenerierte Positionen in Klammern gezeigt sind: This example describes the cloning of the 123 kD polypeptide from telomerase (i.e. the 123 kD protein subunit). In this study, an internal fragment of the Telomera gene was amplified using PCR. Oligonucleotide primers were used that were designed to match the peptide sequences obtained from the purified polypeptide obtained in Part D above. The polypeptide sequence was determined using the "nanoES tandem" mass spectroscopy method known in the art and described by Calvio et al., RNA 1 (1995), 724-733. The oligonucleotide primers used in this example had the following sequences, with degenerate positions shown in parentheses:

5 1 - rCT(G/A)AA(G/A)TA(G/A)TG(T/G/A)GT(G/A/T/C)A(T/G/A)(G/A)TT(G/A)TTCA t - 3 ' und 5 1 - rCT (G / A) AA (G / A) TA (G / A) TG (T / G / A) GT (G / A / T / C) A (T / G / A) (G / A) TT (G / A) TTCA t - 3 'and

5'- GCGGATCCATGAA(T/C)CC(A/T)GA(G/A)AA(T/C)CC(A/T)AA(T/C)GT-3' 5'- GCGGATCCATGAA (T / C) CC (A / T) GA (G / A) AA (T / C) CC (A / T) AA (T / C) GT-3 '

Eine 50 nl-Reaktion enthielt 0,2 mM dNTPs, 0,15 ng E. aediculatus chromosomale DNA, 0,5 n' Taq (Boehringer Mannheim), jeweils 0,8 ng Primer und 1 x Reaktionspuffer (Boehringer Mannheim). Die Reaktion wurde in einem «Thermocycler» (Perkin-Elmer) inkubiert, wobei 5 Minuten bei 95°C inkubiert wurde, danach folgten 30 Cyclen von jeweils 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 52°C und 2 Minuten bei 72°C. Die Reaktion wurde durch 10minütige Inkubation bei 72°C vervollständigt. A 50 nl reaction contained 0.2 mM dNTPs, 0.15 ng E. aediculatus chromosomal DNA, 0.5 n 'Taq (Boehringer Mannheim), each 0.8 ng primer and 1 x reaction buffer (Boehringer Mannheim). The reaction was incubated in a "thermal cycler" (Perkin-Elmer), incubating for 5 minutes at 95 ° C, followed by 30 cycles of 1 minute each at 94 ° C, 1 minute at 52 ° C and 2 minutes at 72 ° C. The reaction was completed by incubation at 72 ° C for 10 minutes.

Eine genomische DNA-Bank wurde aus der chromosomalen DNA von E. aediculatus durch Clonierung von DNA mit glatten Enden in die Smal genannte Stelle des «pCR-Script»-Plasmidvektors (Stratagene) präpariert. Diese Bank wurde durch Koloniehybridisierung mit dem radioaktiv markierten gel-gerei-nigten PCR-Produkt gescreent. Die Plasmid-DNA von positiven Clonen wurde präpariert und gemäss dem Didesoxy-Verfahren sequenziert (Sanger et al., Proc. Nati. Acad. Sei., 74 (1977), 5463) oder manuell mittels eines automatischen Sequenziergeräts (ABI). Die DNA-Sequenz des Gens, das dieses Polypeptid codiert, ist in Fig. 13 gezeigt. Das von der DNA-Sequenz abgeleitete Startcodon liegt in dieser Sequenz bei dem Nucleotid an der Position 101 und der offene Leserahmen endet an Position 3193. Der genetische Code von Euplotes unterscheidet sich von anderen Organismen dadurch, dass das «UGA»-Codon einen Cystein-Rest codiert. Die von der DNA-Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz des Polypeptids ist in Fig. 14 gezeigt. Dabei wurde angenommen, dass keine ungewöhnlichen Aminosäuren während der Translation eingebaut werden und keine posttranslationalen Modifizierungen vorkommen. A genomic DNA library was prepared from the chromosomal DNA of E. aediculatus by cloning DNA with blunt ends into the site of the “pCR-Script” plasmid vector (Stratagene) called Smal. This bank was screened by colony hybridization with the radiolabelled gel-purified PCR product. The plasmid DNA from positive clones was prepared and sequenced according to the dideoxy method (Sanger et al., Proc. Nati. Acad. Sei., 74 (1977), 5463) or manually using an automatic sequencer (ABI). The DNA sequence of the gene encoding this polypeptide is shown in Figure 13. The start codon derived from the DNA sequence is in this sequence at the nucleotide at position 101 and the open reading frame ends at position 3193. The genetic code of Euplotes differs from other organisms in that the “UGA” codon is a cysteine Rest coded. The amino acid sequence of the polypeptide derived from the DNA sequence is shown in FIG. 14. It was assumed that no unusual amino acids were incorporated during translation and that there were no post-translational modifications.

K. Clonierung und Sequenzierung des 43 kD-Polypeptids K. Cloning and sequencing of the 43 kD polypeptide

In diesem Beispiel wird die Clonierung des 43 kD-Polypeptids von Telomerase (d.h. der 43 kD-Protein-Untereinheit) beschrieben. Bei dieser Untersuchung wurde ein internes Fragment des Telomerase-Gens mittels PCR amplifiziert, wobei Oligonucleotidprimer verwendet wurden, die so entworfen wurden, dass sie zu den Peptidsequenzen passen, die von dem im vorstehenden Teil D erhaltenen gereinigten Polypeptid erhalten wurden. Die Polypeptidsequenz wurde mittels der auf dem Fachgebiet bekannten und von Calvio et al., RNA 1 (1995), 724-733 beschriebenen «nanoES-Tandem»-Massenspektroskopie-verfahren bestimmt. Die in diesem Beispiel verwendeten oligonucleotidprimer hatten die folgenden Sequenzen: This example describes the cloning of the 43 kD polypeptide from telomerase (i.e. the 43 kD protein subunit). In this study, an internal fragment of the telomerase gene was PCR amplified using oligonucleotide primers designed to match the peptide sequences obtained from the purified polypeptide obtained in Part D above. The polypeptide sequence was determined using the "nanoES tandem" mass spectroscopy methods known in the art and described by Calvio et al., RNA 1 (1995), 724-733. The oligonucleotide primers used in this example had the following sequences:

5'-NNNGTNAC(C/T/A)GG(Cn"/A)AT(C/T/A)AA(C/T)AA-3' und 5'-(T/G/A)GC(T/G/A)GT (C/T)T C(T/C)T G(G/A)TC(G/A)TT (G/A)T A-3". 5'-NNNGTNAC (C / T / A) GG (Cn "/ A) AT (C / T / A) AA (C / T) AA-3 'and 5' - (T / G / A) GC (T / G / A) GT (C / T) TC (T / C) TG (G / A) TC (G / A) TT (G / A) T A-3 ".

In dieser Sequenz bedeutet «N» die Anwesenheit eines von vier Nucleotiden (d.h. A, T, G oder C). In this sequence, "N" means the presence of one of four nucleotides (i.e. A, T, G or C).

Eine 50 nl-Reaktion enthielt 0,2 mM dNTPs, 0,2 ng E. aediculatus chromosomale DNA, 0,5 nl Taq (Boehringer Mannheim), jeweils 0,8 pg Primer und 1 x Reaktionspuffer (Boehringer Mannheim). Die Reaktion wurde in einem «Thermocycler» (Perkin-Elmer) inkubiert, wobei 5 Minuten bei 95°C inkubiert wurde, danach folgten 30 Cyclen von jeweils 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 52°C und 1 Minute bei 72°C. Die Reaktion wurde durch 10minütige Inkubation bei 72°C vervollständigt. A 50 nl reaction contained 0.2 mM dNTPs, 0.2 ng E. aediculatus chromosomal DNA, 0.5 nl Taq (Boehringer Mannheim), each 0.8 pg primer and 1 x reaction buffer (Boehringer Mannheim). The reaction was incubated in a "thermal cycler" (Perkin-Elmer), incubating for 5 minutes at 95 ° C, followed by 30 cycles of 1 minute each at 94 ° C, 1 minute at 52 ° C and 1 minute at 72 ° C. The reaction was completed by incubation at 72 ° C for 10 minutes.

Eine genomische DNA-Bank wurde aus der chromosomalen DNA von E. aediculatus durch Clonie- A genomic DNA library was created from the chromosomal DNA of E. aediculatus by cloning

105 105

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

rung von DNA mit glatten Enden in die Smal genannte Stelle des «pCR-Script»-Plasmidvektors (Stratagene) präpariert. Diese Bank wurde durch Koloniehybridisierung mit den radioaktiv markierten gel-gerei-nigten PCR-Produkten gescreent. Die Plasmid-DNA von positiven Clonen wurde präpariert und gemäss dem Didesoxy-Verfahren sequenziert (Sanger et al., Proc. Nati. Acad. Sei., 74 (1977), 5463) oder ma-5 nuell mittels eines automatischen Sequenziergeräts (ABI). Die DNA-Sequenz des Gens, das dieses Polypeptid codiert, ist in Fig. 34 gezeigt. Drei mögliche Leserahmen sind für diese Sequenz gezeigt, wie dies in Fig. 35 dargestellt ist. Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist die Aminosäuresequenz unter der Nucleotidsequenz für alle drei Leserahmen angegeben. Diese Leserahmen tragen die Bezeichnungen «a», «b» und «c». Ein mögliches Startcodon wird an der Nucleotidposition 84 im Lesenrahmen «c» co-10 diert. Der codierende Bereich könnte an Position 1501 in Leserahmen «b» enden. Codons für einen vorzeitigen Stop, die in dieser Figur mit Sternchen bezeichnet sind, kommen in allen drei Leserahmen zwischen den Nucleotidpositionen 337-350 vor. Preparation of DNA with smooth ends into the Smal site of the «pCR-Script» plasmid vector (Stratagene). This bank was screened by colony hybridization with the radioactively labeled gel-purified PCR products. The plasmid DNA from positive clones was prepared and sequenced according to the dideoxy method (Sanger et al., Proc. Nati. Acad. Sei., 74 (1977), 5463) or ma-5 manually using an automatic sequencer (ABI) . The DNA sequence of the gene encoding this polypeptide is shown in Figure 34. Three possible reading frames are shown for this sequence, as shown in FIG. 35. For the sake of clarity, the amino acid sequence is shown under the nucleotide sequence for all three reading frames. These reading frames are labeled "a", "b" and "c". A possible start codon is co-doped at nucleotide position 84 in the reading frame “c”. The coding area could end at position 1501 in reading frame "b". Premature stop codons, indicated with asterisks in this figure, occur in all three reading frames between nucleotide positions 337-350.

Die «La-Domäne» ist durch fette Buchstaben gekennzeichnet. Weiter stromabwärts scheint die Proteinsequenz durch unterschiedliche Leserahmen codiert zu sein, da keiner dieser Leserahmen durch 15 Stopcodons unterbrochen ist. Darüber hinaus sind Peptidsequenzen von dem gereinigten Protein in allen drei Leserahmen codiert. Somit scheint dieses Gen Intronsequenzen zu enthalten, oder, alternativ, die RNA wird editiert. Zu weiteren Möglichkeiten zählen ribosomale Leserahmenverschiebung oder Sequenzierungsfehler. Die Homologie zu der Sequenz des La-Proteins bleibt jedoch von grossem Interesse. Es soll nochmals angemerkt werden, dass in Euplotes das «UGA»-Codon einen Cystein-Rest co-20 diert. The “La domain” is identified by bold letters. Further downstream, the protein sequence appears to be encoded by different reading frames, since none of these reading frames is interrupted by 15 stop codons. In addition, peptide sequences from the purified protein are encoded in all three reading frames. Thus this gene appears to contain intron sequences or, alternatively, the RNA is edited. Other options include ribosomal reading frame shifting or sequencing errors. However, the homology to the sequence of the La protein remains of great interest. It should be noted once again that the "UGA" codon in Euplotes co-co-20 a cysteine residue.

L. Vergleiche von Aminosäuren und Nucleinsäuren L. Comparisons of amino acids and nucleic acids

In diesem Beispiel werden Vergleiche zwischen veröffentlichten Sequenzen und den Sequenzen der 25 123 kD- und 43 kD-Telomerase-Polypeptid-Untereinheiten durchgeführt. In this example, comparisons are made between published sequences and the sequences of the 25 123 kD and 43 kD telomerase polypeptide subunits.

i) Vergleiche mit der 123 kD-Telomerase-Untereinheit von E. aediculatus i) Compare to the 123 kD telomerase subunit of E. aediculatus

Die Aminosäuresequenz des 123 kD-Polypeptids von Euplotes aediculatus wurde mit der Sequenz 30 der 80 kD-Telomerase-Protein-Untereinheit von Tetrahymena thermophila (GenBank-Zugangsnummer #U25641) zur Untersuchung ihrer Ähnlichkeit verglichen. Die dieses Protein codierende Nucleotidsequenz, die von GenBank erhalten wurde ist in Fig. 42 gezeigt. Die Aminosäuresequenz dieses Proteins, so wie es von GenBank erhalten wurde, ist in Fig. 43 gezeigt. Der Sequenzvergleich zwischen dem 123 kD-Protein von E. aediculatus und dem 80 kD-Protein von T. thermophila ist in Fig. 36 gezeigt. In die-35 ser Figur stellt die Sequenz von E. aediculatus die obere Sequenz dar und die Sequenz von T. thermophila die untere Sequenz. In dieser sowie in den Fig. 37-39 sind Identitäten durch vertikale Balken angezeigt, während einzelne Punkte zwischen den Sequenzen Aminosäuren mit etwas Ähnlichkeit anzeigen und Doppelpunkte zwischen den Sequenzen Aminosäuren mit grösserer Ähnlichkeit anzeigen. Die nachgewiesene Identität lag bei etwa 19%, während der Prozentsatz an Ähnlichkeit etwa 45% betrug. 40 Diese Werte ähneln denen, die mit einer beliebigen Zufallsproteinsequenz beobachtet werden. The amino acid sequence of the 123 kD polypeptide from Euplotes aediculatus was compared to the sequence 30 of the 80 kD telomerase protein subunit from Tetrahymena thermophila (GenBank accession number # U25641) to investigate their similarity. The nucleotide sequence encoding this protein obtained from GenBank is shown in Figure 42. The amino acid sequence of this protein as obtained from GenBank is shown in Figure 43. The sequence comparison between the 123 kD protein from E. aediculatus and the 80 kD protein from T. thermophila is shown in FIG. 36. In this figure, the sequence of E. aediculatus represents the upper sequence and the sequence of T. thermophila the lower sequence. In this, as well as in FIGS. 37-39, identities are indicated by vertical bars, while individual dots between the sequences indicate amino acids with somewhat similarity and colons between the sequences indicate amino acids with greater similarity. The proven identity was about 19%, while the percentage of similarity was about 45%. 40 These values are similar to those observed with any random protein sequence.

Die Aminosäuresequenz des 123 kD-Polypeptids von Euplotes aediculatus wurde auch mit der Sequenz der 95 kD-TelomeraseProtein-Untereinheit von Tetrahymena thermophila (GenBank-Zugangsnummer #U25642) zur Untersuchung der Ähnlichkeiten verglichen. Die von GenBank erhaltene, dieses Protein codierende Nucleotidsequenz ist in Fig. 44 gezeigt. Die Aminosäuresequenz des von Gen-Bank er-45 haltenen Proteins erhaltenen Proteins ist in Fig. 45 gezeigt, und der Sequenzvergleich in Fig. 37. In dieser Figur ist die Sequenz von E. aediculatus die obere Sequenz und die Sequenz von T. thermophila die untere Sequenz. Identitäten sind durch vertikale Balken angezeigt. Die beobachtete Identität betrug etwa 20%, während der Prozentsatz an Ähnlichkeit etwa 43% betrug. Diese Werte ähneln den Werten, die man mit einer beliebigen Zufallsproteinsequenz beobachtet. The amino acid sequence of the 123 kD polypeptide from Euplotes aediculatus was also compared to the sequence of the 95 kD telomerase protein subunit from Tetrahymena thermophila (GenBank accession number # U25642) to investigate the similarities. The nucleotide sequence encoding this protein obtained from GenBank is shown in FIG. 44. The amino acid sequence of the protein obtained from Gen-Bank er-45 protein is shown in Fig. 45, and the sequence comparison in Fig. 37. In this figure, the sequence of E. aediculatus is the upper sequence and the sequence of T. thermophila that lower sequence. Identities are indicated by vertical bars. The identity observed was about 20%, while the percentage of similarity was about 43%. These values are similar to the values observed with any random protein sequence.

50 Es ist auffallend, dass die Aminosäuresequenz des 123 kD-Proteins von E. aediculatus die fünf Motive enthält, die charakteristisch für reverse Transkriptasen sind. Das 123 kDPolypeptid wurde auch mit den Polymerase-Domänen von verschiedenen reversen Transkriptasen verglichen. Fig. 40 zeigt die Ausrichtung des 123 kD-Polypeptids mit dem vermutlichen Hefe-Homologen (L8543.12 oder ESTp) . Die Aminosäuresequenz von L8543.12 (oder ESTp), die von GenBank erhalten wurde, ist in Fig. 46 gezeigt. 55 Vier Motive (A, B, C und D) waren Bestandteil dieses Vergleichs. In Fig. 40 sind hochkonservierte Reste durch weisse Buchstaben auf schwarzem Hintergrund gekennzeichnet. Reste der Sequenzen von E. aediculatus, die in der anderen Sequenz konserviert sind, sind durch Fettdruck gekennzeichnet. Das «h» bezeichnet das Vorhandensein einer hydrophoben Aminosäure. Die Ziffern zwischen den Aminosäureresten der Motive bezeichnen die Menge von Lücken innerhalb der Sequenzen. Beispielsweise be-60 trifft die «100» zwischen den Motiven A und B eine Lücke von 100 Aminosäuren in der Sequenz zwischen den Motiven. 50 It is striking that the amino acid sequence of the 123 kD protein from E. aediculatus contains the five motifs which are characteristic of reverse transcriptases. The 123 kD polypeptide was also compared to the polymerase domains of various reverse transcriptases. Figure 40 shows the alignment of the 123 kD polypeptide with the putative yeast homolog (L8543.12 or ESTp). The amino acid sequence of L8543.12 (or ESTp) obtained from GenBank is shown in Figure 46. 55 Four motifs (A, B, C and D) were part of this comparison. In Fig. 40 highly preserved residues are identified by white letters on a black background. Remains of the sequences of E. aediculatus that are conserved in the other sequence are marked in bold. The «h» indicates the presence of a hydrophobic amino acid. The digits between the amino acid residues of the motifs indicate the amount of gaps within the sequences. For example, the "100" between motifs A and B affects a gap of 100 amino acids in the sequence between motifs.

Durch das Absuchen der Genbank konnte ein Hefeprotein (GenBank Zugangsnummer #u20618) und das Gen «L8543.12» (Est2) identifiziert werden, das etwas Homologie zu der 123 kD-Telomerase-Ünter-einheit von E. aediculatus zeigt. Anhand der Beobachtung, dass beide Proteine reverse Transkriptase-65 Motive in ihren C-terminalen Bereichen enthalten; dass beiden Proteinen gemeinsam ist, dass sie Ähn106 By searching the gene bank, a yeast protein (GenBank accession number # u20618) and the gene "L8543.12" (Est2) could be identified, which shows some homology to the 123 kD telomerase subunit of E. aediculatus. Based on the observation that both proteins contain reverse transcriptase-65 motifs in their C-terminal regions; that both proteins have in common that they are similar106

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

lichkeit in Bereichen ausserhalb des reverse Transkriptase-Motivs zeigen; dass die Proteine ähnlich basisch sind (pl = 10,1 für E. aediculatus und pl = 10,0 für Hefe) ; und beide Proteine gross sind (123 kD für E. aediculatus und 103 kD für Hefe) kann gefolgert werden, dass diese Sequenzen den katalytischen Kern ihrer entsprechenden Telomerasen umfassen. Aufgrund dieser Beobachtung bezüglich der Homologie zwischen zwei phylogenetisch entfernten Organismen wie E. aediculatus und Hefe wird davon ausgegangen, dass menschliche Telomerase ein Protein enthält, das dieselben Merkmale aufweist (d.h. reverse Transkriptase-Motive aufweist, basisch ist und gross (> 100 kD)). show sensitivity in areas outside the reverse transcriptase motif; that the proteins are similarly basic (pl = 10.1 for E. aediculatus and pl = 10.0 for yeast); and both proteins are large (123 kD for E. aediculatus and 103 kD for yeast) it can be concluded that these sequences encompass the catalytic core of their corresponding telomerases. Based on this observation regarding the homology between two phylogenetically removed organisms such as E. aediculatus and yeast, it is assumed that human telomerase contains a protein that has the same characteristics (ie has reverse transcriptase motifs, is basic and large (> 100 kD)) .

ii) Veraleiche mit der 43 kD-Telomerase-Untereinheit von E. aediculatus ii) Compare with the 43 kD telomerase subunit of E. aediculatus

Die Aminosäuresequenz der «La-Domäne» des 43-kD-Polypeptids von Euplotes aediculatus wurde mit der Sequenz der 95 kD-Telomerase-Protein-Untereinheit von Tetrahymena thermophila (vorstehend beschrieben) zur Untersuchung deren Ähnlichkeit verglichen. Der Sequenzvergleich ist in Fig. 38 gezeigt. In dieser Figur ist die E. aediculatus-Sequenz die obere Sequenz und die Sequenz von T. thermophila ist die untere Sequenz. Identitäten sind mit vertikalen Balken gekennzeichnet. Die beobachtete Identität betrug etwa 23%, während der Prozentsatz an Ähnlichkeit etwa 46% betrug. Diese Werte ähneln denen, die man mit beliebigen Zufallsproteinsequenzen beobachten würde. The amino acid sequence of the "La domain" of the 43 kD polypeptide from Euplotes aediculatus was compared to the sequence of the 95 kD telomerase protein subunit from Tetrahymena thermophila (described above) to examine their similarity. The sequence comparison is shown in Fig. 38. In this figure, the E. aediculatus sequence is the top sequence and the T. thermophila sequence is the bottom sequence. Identities are marked with vertical bars. The observed identity was about 23%, while the percentage of similarity was about 46%. These values are similar to those that you would observe with any random protein sequences.

Die Aminosäuresequenz der «La-Domäne» des 43 kD-Polypeptids von Euplotes aediculatus wurde mit der Sequenz der 80 kD-Telomerase-Protein-Untereinheit von Tretrahymena thermophila (vorstehend beschrieben) zur Untersuchung deren Ähnlichkeit verglichen. Der Sequenzvergleich ist in Fig. 39 gezeigt. In dieser Figur ist die Sequenz von E. aediculatus die obere Sequenz und die Sequenz von T. thermophila die untere Sequenz. Identitäten sind mit vertikalen Balken gekennzeichnet. Die beobachtete Identität betrug etwa 26%, während der Prozentsatz an Ähnlichkeit etwa 49% betrug. Diese Werte ähneln denen, die man mit beliebigen Zufallsroteinsequenzen beobachten würde. The amino acid sequence of the "La domain" of the 43 kD polypeptide from Euplotes aediculatus was compared to the sequence of the 80 kD telomerase protein subunit from Tretrahymena thermophila (described above) to examine their similarity. The sequence comparison is shown in Fig. 39. In this figure, the sequence of E. aediculatus is the upper sequence and the sequence of T. thermophila is the lower sequence. Identities are marked with vertical bars. The observed identity was about 26%, while the percentage of similarity was about 49%. These values are similar to those that would be observed with any random red sequences.

Die Aminosäuresequenz einer Domäne des 43 kD-Polypeptids von E. aediculatus wurde auch mit La-Proteinen von zahlreichen anderen Organismen verglichen. Diese Vergleiche sind in Fig. 41 gezeigt. In dieser Figur sind hochkonservierte Reste durch weisse Buchstaben auf schwarzem Hintergrund gekennzeichnet. Reste der Sequenzen von E. aediculatus, die in der anderen Sequenz konserviert sind, sind durch Fettdruck gekennzeichnet. The amino acid sequence of a domain of the 43 kD polypeptide from E. aediculatus was also compared to La proteins from numerous other organisms. These comparisons are shown in Fig. 41. In this figure, highly preserved residues are identified by white letters on a black background. Remains of the sequences of E. aediculatus that are conserved in the other sequence are marked in bold.

M. Identifizierung von Telomerase-Protein-Untereinheiten in einem anderen Organismus M. Identification of telomerase protein subunits in another organism

In diesem Beispiel wurden die in den vorstehenden Beispielen identifizierten Sequenzen zur Identifizierung der Telomerase-Protein-Untereinheiten von Oxytricha trifallax verwendet. Dies ist ein Ciliat, der mit E. aediculatus nur sehr entfernt verwandt ist. In diesem Beispiel wurden basierend auf dem konservierten Bereich des 123 kD-Polypeptids von E. aediculatus Primer ausgewählt, die die Motive der re-versen Transkriptase-Domäne umfassten. Geeignete Primer wurden synthetisiert und in einer PCR-Re-aktion mit Gesamt-DNA von Oxytricha verwendet. Oxytricha-DNA wurde gemäss auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren präpariert. Die PCR-Produkte wurden danach unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren cloniert und sequenziert. In this example, the sequences identified in the previous examples were used to identify the telomerase protein subunits of Oxytricha trifallax. This is a ciliate that is only distantly related to E. aediculatus. In this example, primers were selected based on the conserved region of the 123 kD polypeptide from E. aediculatus, which included the motifs of the reverse transcriptase domain. Suitable primers were synthesized and used in a PCR reaction with total DNA from Oxytricha. Oxytricha DNA was prepared according to methods known in the art. The PCR products were then cloned and sequenced using methods known in the art.

Die für die Primer verwendeten Oligonucleotidsequenzen waren: The oligonucleotide sequences used for the primers were:

5 ' - (T/C)A(A/G)AC(T/A/C)AA(G/A)GG(T/A/C)AT(T/C)CC(C/T/A)(C/T)A(G/A)GG-3' 5'-(G/A/T)GT(G/A/T)ATNA(G/A)NA(G/A)(G/A)TA(G/A)TC(G/A)TC-3' 5 '- (T / C) A (A / G) AC (T / A / C) AA (G / A) GG (T / A / C) AT (T / C) CC (C / T / A) (C / T) A (G / A) GG-3 '5' - (G / A / T) GT (G / A / T) ATNA (G / A) NA (G / A) (G / A) TA (G / A) TC (G / A) TC-3 '

Positionen, die degeneriert waren, sind in Klammern gezeigt, wobei die alternativen Basen in den Klammern gezeigt sind. «N» entspricht einem beliebigen Nucleotid aus den vier Nucleotiden. Positions that were degenerate are shown in parentheses with the alternative bases shown in parentheses. “N” corresponds to any of the four nucleotides.

Die PCR-Reaktion (50 pl) enthielt 0,2 mM dNTPs, 0,3 ng chromosomale DNA von Oxytricha trifallax, 1 pl Taq-Polymerase (Boehringer Mannheim), jeweils 2 nM Primer, 1 x Reaktionspuffer (Boehringer Mannheim). Das Reaktionsgemisch wurde in einem «Thermocycler» (Perkin-Elmer) unter den folgenden Bedingungen inkubiert: 1x5 Minuten bei 95°C, 30 Cyclen jeweils 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 53°C und 1 Minute bei 72°C, danach 1x10 Minuten bei 72°C. Das PCR-Produkt wurde gelgereinigt und mittels des Didesoxy-Verfahrens (siehe z.B. Sanger et al., Proc. Nati. Acad. Sei. 74 (1977), 5463-5467) oder anderer auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren sequenziert. The PCR reaction (50 pl) contained 0.2 mM dNTPs, 0.3 ng chromosomal DNA from Oxytricha trifallax, 1 pl Taq polymerase (Boehringer Mannheim), each 2 nM primer, 1 x reaction buffer (Boehringer Mannheim). The reaction mixture was incubated in a "thermocycler" (Perkin-Elmer) under the following conditions: 1x5 minutes at 95 ° C, 30 cycles each 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 53 ° C and 1 minute at 72 ° C, then 1x10 minutes at 72 ° C. The PCR product was gel purified and sequenced using the dideoxy method (see, e.g., Sanger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 74 (1977), 5463-5467) or other methods known in the art.

Von dem PCR-Produkt wurde die Aminosäuresequenz abgeleitet und mit der Sequenz von E. aediculatus verglichen. Fig. 47 zeigt die Ausrichtung dieser Sequenzen, wobei die Sequenz von 0. trifallax in der oberen Reihe gezeigt ist und die E. aediculatus-Sequenz in der unteren Reihe gezeigt ist. Wie aus dieser Figur ersichtlich ist, besteht ein grosser Grad an Homologie zwischen der in diesem Beispiel identifizierten 0. trifallax Polypeptidsequenz und der Polypeptidsequenz von E. aediculatus. Somit ist es klar, dass die in der vorliegenden Erfindung identifizierten Sequenzen für die Identifizierung von homologen Telomerase-Protein-Untereinheiten in anderen eukaryotischen Organismen von Nutzen sind. Tatsächlich konnten aufgrund der erfindungsgemässen Entwicklung homologe Telomerase-Sequenzen in zahlreichen unterschiedlichen Spezies identifiziert werden. The amino acid sequence was derived from the PCR product and compared with the sequence of E. aediculatus. Fig. 47 shows the alignment of these sequences, the sequence of 0. Trifallax being shown in the top row and the E. aediculatus sequence being shown in the bottom row. As can be seen from this figure, there is a high degree of homology between the 0th trifallax polypeptide sequence identified in this example and the polypeptide sequence of E. aediculatus. Thus, it is clear that the sequences identified in the present invention are useful for the identification of homologous telomerase protein subunits in other eukaryotic organisms. In fact, due to the development according to the invention, homologous telomerase sequences could be identified in numerous different species.

107 107

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

N. Identifizierung von Telomerase-Sequenzen von Tetrahymena N. Identification of Tetrahymena Telomerase Sequences

In diesem Beispiel wurde ein Tetrahymena-Clon erzeugt, der Homologie mit den Euplotes-Sequenzen und EST2p aufweist. In this example, a Tetrahymena clone was created that has homology with the Euplotes sequences and EST2p.

Bei diesem Experiment wurde eine PCR mit degenerierten Oligonucleotidprimern verwendet, die gegen konservierte Motive gerichtet waren, um so Homologiebereiche zwischen Tetrahymena-, Euplotes-und EST2p-Sequenzen identifizieren zu können. Das in diesem Beispiel verwendete PCR-Verfahren stellt ein neues Verfahren dar, das zur spezifischen Amplifikation von seltenen DNA-Sequenzen aus komplexen Gemischen entworfen wurde. Bei diesem Verfahren wird das Problem der Amplifikation von DNA-Produkten mit dem gleichen PCR-Primer an beiden Enden (d.h. Produkte, eines einzelnen Primers), dem man in PCR-Clonierungsverfahren üblicherweise begegnet, vermieden. Durch diese Produkte eines einzelnen Primers wird ein unerwünschter Hintergrund erzeugt und dies kann oft die Amplifikation und den Nachweis des gewünschten Produkts von zwei Primern erschweren. Bei diesem in diesen Experimenten verwendeten Verfahren wird bevorzugt auf Produkte von zwei Primern selektiert. Das Besondere ist, dass ein Primer biotinyliert ist und der andere nicht. Nach mehreren PCR-Amplifikationsrun-den werden die Produkte unter Venwendung von magnetischen Streptavidin-Kügelchen gereinigt und Produkte von zwei Primem werden mittels Hitzedenaturierung spezifisch eluiert. Dieses Verfahren findet auch im Rahmen anderer Experimente, die in diesen Beispielen nicht beschrieben wurden, seine Verwendung. Tatsächlich ist dieses Verfahren bei Anwendungen in Gebrauch, bei denen es wünschenswert ist, seltene DNA-Sequenzen zu amplifizieren, wozu die einleitenden Schritte bei Clonierungsverfahren, beispielsweise 5' und 3, gehören, RACE und jedes Verfahren, das in der PCR degenerierte Primer verwendet. In this experiment, a PCR was used with degenerate oligonucleotide primers, which were directed against conserved motifs, in order to be able to identify regions of homology between tetrahymena, Euplotes and EST2p sequences. The PCR method used in this example represents a new method that was designed for the specific amplification of rare DNA sequences from complex mixtures. This method avoids the problem of amplifying DNA products with the same PCR primer at both ends (i.e. products, a single primer) that is commonly encountered in PCR cloning procedures. These products of a single primer create an undesirable background and this can often complicate the amplification and detection of the desired product from two primers. This method used in these experiments is preferably selected for products from two primers. The special thing is that one primer is biotinylated and the other is not. After several rounds of PCR amplification, the products are purified using magnetic streptavidin beads and products from two primers are specifically eluted by means of heat denaturation. This method is also used in other experiments that were not described in these examples. Indeed, this method is in use in applications where it is desirable to amplify rare DNA sequences, including the initial steps in cloning methods, e.g. 5 'and 3, RACE and any method that uses degenerate primers in PCR.

Ein erster PCR-Lauf wurde unter Verwendung von macronucleärer DNA von Tetrahymena als Matrize durchgeführt, die gemäss auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren isoliert wurde. Es wurde ein 24-mer-Vorwärts-Primer verwendet mit der Sequenz A first PCR run was performed using Tetrahymena macronuclear DNA as a template, which was isolated according to methods known in the art. A 24-mer forward primer was used with the sequence

5'-Biotin-GCCTATTT(TC)TT(TC)TA(TC)(GATC)(GATC)(GATC)AC(GATC)GA-3', die als «K231» bezeichnet wird, und dem FFY>0"E-Bereich entspricht und der 23-mer-Rückwärts-Primer mit der Sequenz 5'-CCAGATAT(GATC)A(TGA)(GATC)A(AG)(AG)AA(AG)TC(AG)TC-3', der als «K220» bezeichnet wird und dem DDFL(FIL)I-Bereich entspricht. Diese PCR-Reaktion enthielt 2,5 pl DNA (50 ng), jeweils 4 pl Primer (20 pM), 3 pl 10 x PCR-Puffer, 3 pl 10 x dNTPs, 2 pl Mg, 0,3 pl Taq und 11,2 pl dh^O. Mit dem Gemisch wurden 8 Cyclen durchgeführt, jeweils 45 Sekunden bei 94°C 45 Sekunden bei 37°C und 1 Minute bei 72°C. 5'-Biotin-GCCTATTT (TC) TT (TC) TA (TC) (GATC) (GATC) (GATC) AC (GATC) GA-3 ', which is referred to as "K231" and the FFY> 0 "E Area corresponds and the 23-mer reverse primer with the sequence 5'-CCAGATAT (GATC) A (TGA) (GATC) A (AG) (AG) AA (AG) TC (AG) TC-3 ', the is referred to as “K220” and corresponds to the DDFL (FIL) I. This PCR reaction contained 2.5 pl of DNA (50 ng), each 4 pl of primer (20 pM), 3 pl of 10 × PCR buffer, 3 pl 10 x dNTPs, 2 pl Mg, 0.3 pl Taq and 11.2 pl dh ^ O. 8 cycles were carried out with the mixture, 45 seconds each at 94 ° C, 45 seconds at 37 ° C and 1 minute at 72 ° C.

Das Gemisch der PCR-Reaktion wurde an 200 pl magnetische Streptavidin-Kügelchen gebunden, mit 200 pi TE gewaschen, in 20 pl dH2Ü resuspendiert und danach durch 2minütiges Kochen bei 100°C hitzedenaturiert. Die Kügelchen wurden heruntergezogen und das Eluat wurde entfernt. Danach wurden 2,5 pl dieses Eluats erneut unter den vorstehenden Bedingungen amplifiziert, mit der Ausnahme, dass 0,3 pl a-32P dATP enthalten war und 33 PCR-Cyclen durchgeführt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde auf einem denaturierendem 5%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und der geeignete Bereich aus dem Gel ausgeschnitten. Diese Produkte wurden mit weiteren 34 Cyclen unter den vorstehend aufgezählten Bedingungen erneut amplifiziert, ausser, dass die Anlagerungstemperatur 42°C betrug. The mixture of the PCR reaction was bound to 200 pl magnetic streptavidin beads, washed with 200 pi TE, resuspended in 20 pl dH2Ü and then heat-denatured by boiling at 100 ° C for 2 minutes. The beads were pulled down and the eluate was removed. Thereafter, 2.5 pl of this eluate was amplified again under the above conditions, except that 0.3 pl a-32P dATP was contained and 33 PCR cycles were carried out. The reaction mixture was separated on a denaturing 5% polyacrylamide gel and the appropriate area was cut out of the gel. These products were re-amplified with another 34 cycles under the conditions listed above, except that the annealing temperature was 42 ° C.

Ein zweiter PCR-Lauf wurde unter Verwendung von makronucleärer DNA von Tetrahymena, die unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren isoliert wurde, als Matrize durchgeführt, wobei der 23-mer-Vorwärts-Primer mit der Sequenz 5' A second PCR run was performed using Tetrahymena macronuclear DNA isolated using methods known in the art as a template, the 23-mer forward primer having the sequence 5 '

AC AAT G(C A)G(G AT C)(TC A)T (GAT C)(T C A)T (G AT C)C C(G AT C) AA( AG) AA-3 ' AC AAT G (C A) G (G AT C) (TC A) T (GAT C) (T C A) T (G AT C) C C (G AT C) AA (AG) AA-3 '

mit der Bezeichnung «228» verwendet wurde, der nach dem Bereich R(LI) (LI)PKK entspricht und eines reversen Primers mit der Sequenz 5'- with the designation “228” was used, which corresponds to PKK after the region R (LI) (LI) and a reverse primer with the sequence 5′-

ACGAATC(GT)(GATC)GG(TAG)AT(GATC)(GC)(TA)(AG)TC(AG)TA(AG)CA 3 ' ACGAATC (GT) (GATC) GG (TAG) AT (GATC) (GC) (TA) (AG) TC (AG) TA (AG) CA 3 '

mit der Bezeichnung «K224», der dem CYDSIPR-Bereich entspricht. Diese PCR-Reaktion enthielt 2,5 pl DNA (50 ng), jeweils 4 pl Primer (20 pM) , 3 pl 10 x PCR-Puffer, 3 pl 10 x dNTPs, 2 pl Mg, 0,3 pl a-32P-dATP, 0,3 pl Taq und 10,9 pl dH2Ü. Das Reaktionsgemisch wurde auf einem denaturierendem 5%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und der geeignete Bereich aus dem Gel ausgeschnitten. Diese Produkte wurden mit 34 zusätzlichen Cyclen erneut unter den vorstehend angegebenen Bedingungen amplifiziert, ausser dass die Anlagerungstemperatur 42°C betrug. with the designation «K224», which corresponds to the CYDSIPR range. This PCR reaction contained 2.5 pl DNA (50 ng), each 4 pl primer (20 pM), 3 pl 10 x PCR buffer, 3 pl 10 x dNTPs, 2 pl Mg, 0.3 pl a-32P- dATP, 0.3 pl Taq and 10.9 pl dH2Ü. The reaction mixture was separated on a denaturing 5% polyacrylamide gel and the appropriate area was cut out of the gel. These products were amplified again with 34 additional cycles under the conditions given above, except that the annealing temperature was 42 ° C.

10 pl des Reaktionsprodukts aus Lauf 1 wurden an magnetische Streptavidin-beschichtete Kügelchen in 200 pi TE gebunden. Die Kügelchen wurden mit 200 pi TE gewaschen und danach in 20 pl dH2Ü resuspendiert, hitzedenaturiert und das Eluat wurde entfernt. Das Reaktionsprodukt aus Lauf 2 wurde danach zu den Kügelchen gegeben und mit 30 pl 0,5 x SSC verdünnt. Das Gemisch wurde auf 94°C erhitzt und auf 50°C abkühlen gelassen. Das Eluat wurde entfernt und die Kügelchen wurden dreimal in 0,5 x SSC bei 55°C gewaschen. Die Kügelchen wurden danach in 20 pl dH2Ü resuspendiert, hitzedenaturiert, und das Eluat mit der Bezeichnung «Runde 1-Eluat» entfernt und aufbewahrt. 10 pl of the reaction product from Run 1 was bound to magnetic streptavidin-coated beads in 200 pi TE. The beads were washed with 200 pi TE and then resuspended in 20 pl dH2Ü, heat denatured and the eluate was removed. The reaction product from Run 2 was then added to the beads and diluted with 30 pl 0.5 x SSC. The mixture was heated to 94 ° C and allowed to cool to 50 ° C. The eluate was removed and the beads were washed three times in 0.5 x SSC at 55 ° C. The beads were then resuspended in 20 pl dH2Ü, heat denatured, and the eluate labeled "Round 1 eluate" was removed and stored.

108 108

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Zur Isolierung der Tetrahymena-Bande wurde das Runde 1-Eluat mit dem Vorwärts-Primer K228 und den reversen Primer K227 mit der Sequenz 5'- To isolate the Tetrahymena band, the round 1 eluate with the forward primer K228 and the reverse primer K227 with the sequence 5'-

CAATTCTC(AG)TA(AG)CA(GATC)(CG)(TA)(CT)TT(AGT)AT(GA)TC-3 ' (SEQ ID CAATTCTC (AG) TA (AG) CA (GATC) (CG) (TA) (CT) TT (AGT) AT (GA) TC-3 '(SEQ ID

was dem DIKSCYD-Bereich entspricht, erneut amplifiziert. Die PCR-Reaktionen wurden wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 5%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt, die etwa 295 Nucleotide entsprechende Bande aus dem Gel ausgeschnitten und sequenziert. which corresponds to the DIKSCYD range, amplified again. The PCR reactions were carried out as described above. The reaction products were separated on a 5% polyacrylamide gel, the band corresponding to approximately 295 nucleotides was cut out of the gel and sequenced.

Der Clon mit der Bezeichnung 168-3 wurde sequenziert. Es wurde folgende DNA-Sequenz (einschliesslich der Primersequenzen) gefunden: The clone labeled 168-3 was sequenced. The following DNA sequence (including the primer sequences) was found:

GATTACTCCCGAAGAAAGGATCTTTCCGTCCAATCATGACTTTCTTAAGAAA GATTACTCCCGAAGAAAGGATCTTTCCGTCCAATCATGACTTTCTTAAGAAA

GGAC AAGC AAAAAAAT ATT AAGTT AAAT CT AAATT AAATT CT AAT GGAT AG GGAC AAGC AAAAAAAT ATT AAGTT AAAT CT AAATT AAATT CT AAT GGAT AG

CC AACTTGT GTTT AGGAATTT AAAAG AC AT GCTGGGAT AAAAGAT AGGAT A CC AACTTGT GTTT AGGAATTT AAAAG AC AT GCTGGGAT AAAAGAT AGGAT A

CTCAGTCTTTGATAATAAACAAATTTCAGAAAAATTTGCCTAATTCATAGAG CTCAGTCTTTGATAATAAACAAATTTCAGAAAAATTTGCCTAATTCATAGAG

AAATGGAAAAATAAAGGAAGACCTCAGCTATATTATGTCACTCTAGACATA AAATGGAAAAATAAAGGAAGACCTCAGCTATATTATGTCACTCTAGACATA

AAGACTTGCTAC AAGACTTGCTAC

Eine zusätzliche Sequenz dieses Gens wurde mittels PCR erhalten, wobei ein neuer Primer verwendet wurde, der so konstruiert war, dass er mit der Sequenz von 168-3 («K2-97» mit der Sequenz 5'-GAGTG ACAT AAT AT ACGT GA-3'; paart und der Primer K231 (FFYXTE). Die Sequenz des aus dieser Reaktion erhaltenen Fragments, zusammen mit 1683 ist wie folgt (ohne die Primersequenzen): An additional sequence of this gene was obtained by PCR, using a new primer designed to match the sequence of 168-3 («K2-97» with the sequence 5'-GAGTG ACAT AAT AT ACGT GA- 3 '; mated and primer K231 (FFYXTE). The sequence of the fragment obtained from this reaction, together with 1683, is as follows (without the primer sequences):

AAACACAAGGAAGGAAGTCAAATATTCTATTACCGTAAACCAATATGGAA ATT AGT G AGT AAATT AACT ATT GT C AAAGT AAG AATTT AGTTTT CT G AAAAG AAT AAAT AAAT G AAAAAT AATTTTT AT C AAAAAATTT AGCTT G AAG AGG AG AATTT GG AAAAAGTT G AAG AAAAATT G AT ACC AG AAG ATT C ATTTT AG AAA TACCCTCAAGGAAAGCTAAGGATTATACCTAAAAAAGGATCTTTCCGTCCA ATC AT G ACTTT CTT AAG AAAGG AC AAGC AAAAAAAT ATT AAGTT AAATCTA AATT AAATT CT AAT GGATAGC C AACTT GT GTTT AGG AATTTAAAAG AC ATG CT GGG ATAAAAG AT AGG ATACTC AGT CTTT G AT AATAAAC AAATTT C AGAA AAATTTGCCTAATTCATAGAGAAATGGAAAAATAAAGGAAGACCTCAGCTA TATTATGTCACTCTA AAACACAAGGAAGGAAGTCAAATATTCTATTACCGTAAACCAATATGGAA ATT AGT G AGT AAATT AACT ATT GT C AAAGT AAG AATTT AGTTTT CT G AAAAG AAT AAAT AAAT G AAAAAT AATTTTT AT C AAAAAATTT AGCTT G AAG AGG AG AATTT GG AAAAAGTT G AAG AAAAATT G AT ACC AG AAG ATT C ATTTT AG AAA TACCCTCAAGGAAAGCTAAGGATTATACCTAAAAAAGGATCTTTCCGTCCA ATC AT G ACTTT CTT AAG AAAGG AC AAGC AAAAAAAT ATT AAGTT AAATCTA AATT AAATT CT AAT GGATAGC C AACTT GT GTTT AGG AATTTAAAAG AC ATG CT GGG ATAAAAG AT AGG ATACTC AGT CTTT G AT AATAAAC AAATTT C AGAA AAATTTGATACAGTAAAAT

Die diesem DNA-Fragment entsprechende Aminosäuresequenz ist: The amino acid sequence corresponding to this DNA fragment is:

KHKEGSQIFYYRKPIWKLVSKLTIVKVRIQFSEKNKQMKNNFYQKIQLEEENLE KVEEKLIPEDSFQKYPQGKLRIIPKKGSFRPIMTFLRKDKQKNIKLNLNQILMDS QLVFRNLKDMLGQläGYSVFDNKQISEKFAQFIEKWKNKGRPQLYYVTL KHKEGSQIFYYRKPIWKLVSKLTIVKVRIQFSEKNKQMKNNFYQKIQLEEENLE KVEEKLIPEDSFQKYPQGKLRIIPKKGSFRPIMTFLRKDKQKNIKLNLNQILMDS QLVFRNLKKQYQIEQ

Diese Aminosäuresequenz wurde gegen andere Telomerase-Gene (EST2p und Euplotes) ausgerichtet. Die Ausrichtung ist in Fig. 53 gezeigt. Eine «Consensus»-Sequenz ist in dieser Figur ebenfalls gezeigt. This amino acid sequence was aligned against other telomerase genes (EST2p and Euplotes). The orientation is shown in Fig. 53. A "consensus" sequence is also shown in this figure.

109 109

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

P. Identifizierung von Telomerase-Sequenzen von Schizosaccharomyces pombe P. Identification of Schizosaccharomyces pombe Telomerase Sequences

In diesem Beispiel wurde die tez1-Sequenz von S. pombe als ein Homologes von p123 von E. aediculatus und Est2p von S. cerevisiae identifiziert. In this example, the S. pombe tez1 sequence was identified as a homologue of E. aediculatus p123 and S. cerevisiae Est2p.

Fig. 55 zeigt eine Zusammenfassung dieser Experimente. In dieser Figur zeigt der obere Bereich (Teil A) die Beziehung zwischen den beiden überlappenden genomischen Clonen und den Bereich von 5825 bp, der sequenziert wurde. Die mit «tez1» bezeichnete Region entspricht dem Protein codierenden Bereich, wobei auch die flankierenden Sequenzen gezeigt sind. Die Box unterhalb des Bereichs von 5825 bp ist ein Hindlll-Fragment von etwa 2 kb, das zur Herstellung des tez1-Disruptionskonstrukts, wie nachstehend beschrieben, verwendet wurde. 55 shows a summary of these experiments. In this figure, the upper region (part A) shows the relationship between the two overlapping genomic clones and the 5825 bp region that was sequenced. The region labeled “tez1” corresponds to the protein coding region, the flanking sequences also being shown. The box below the 5825 bp range is an approximately 2 kb HindIII fragment used to prepare the tez1 disruption construct as described below.

Die untere Hälfte von Fig. 55 (Teil B) ist ein «aufgeschlüsseltes» Schema des gleichen DNA-Bereichs. Die als «Original-PCR» bezeichnete Sequenz ist das ursprüngliche degenerierte PCR-Fragment, das mit dem degenerierten Oligonucleotid-Primerpaar erzeugt wurde, das auf der Basis der Sequenz von Motiv 4 (B') und Motiv 5 (C) von Euplotes, wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben, entworfen worden war. The lower half of Figure 55 (Part B) is an "broken down" scheme of the same DNA region. The sequence referred to as the "original PCR" is the original degenerate PCR fragment generated with the degenerate oligonucleotide primer pair based on the sequence of motif 4 (B ') and motif 5 (C) from Euplotes, such as described in the previous examples.

i) PCR mit degenerierten Primern i) PCR with degenerate primers

Eine PCR unter Verwendung der genetischen Primer wurde verwendet, um in S. pombe das zu p123 von E. aediculatus homologe Protein zu finden. Fig. 56 zeigt die Sequenzen der in dieser Reaktion verwendeten degenerierten Primer (bezeichnet als «poly 4» und «poly 1»). Die PCR-Läufe wurden unter den gleichen Pufferbedingungen wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben durchgeführt (siehe beispielsweise den vorstehendenTeil K) mit einer 5minütigen «ramp»-Zeit von 94°C,wonach sich Cyclen für jeweils 30 Sekunden bei 94°C, 45 Sekunden bei 50°C und Sekunden bei 72°C anschlössen, dann 7 Minuten bei 72°C, und anschliessend wurde das Reaktionsgemisch bei 4°C aufbewahrt. Die PCR-Läufe wurden unterunterschiedlichen Bedingungen durchgeführt (d.h. verschiedene Konzentrationen an DNA von S. pombe und verschiedene MgCb-Konzentrationen). Die PCR-Produkte wurden auf Agarosegelen aufgetrennt und mit Ethidiumbromid wie vorstehend beschrieben angefärbt. Verschiedene PCR-Läufe ergaben die Produktion von 3 Banden (mit «T», «M1» und «B») bezeichnet). Diese Banden wurden unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben erneut amplifiziert und auf Gelen aufgetrennt. Nach dieser erneuten Amplifikation wurden vier Banden beobachtet («T», »M1», «M2» und «B»), wie in Fig. 57 gezeigt. Diese vier Banden wurden dann unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben erneut amplifiziert. Die dritte Bande von dem oberen Bereich der Spur in Fig. 57 wurde als eine Bande identifiziert, die die richtige Sequenz für ein Teiomerase-Protein enthielt. Es zeigte sich, dass das mit M2 bezeichnete PCR-Produkt zu anderen Telomerase-Proteinen relativ gut passt, wie dies in Fig. 58 gezeigt ist. Zusätzlich zu der gezeigten Ausrichtung zeigt diese Figur auch die tatsächliche Sequenz von tez1. In dieser Figur bezeichnen Sternchen Reste, die alle vier Sequenzen gemeinsam haben (Oxytricha «OT»; E. aediculatus «Ea_p123», S. cerevisiae «Sc_p103» und M2), und die Kreise (d.h. Punkte) kennzeichnen ähnliche Aminosäurereste. PCR using the genetic primers was used to find the protein homologous to p123 of E. aediculatus in S. pombe. Figure 56 shows the sequences of the degenerate primers used in this reaction (referred to as "poly 4" and "poly 1"). The PCR runs were carried out under the same buffer conditions as described in the examples above (see, for example, Part K above) with a 5-minute ramp time of 94 ° C, after which cycles were carried out for 30 seconds at 94 ° C, 45 seconds Connect at 50 ° C and seconds at 72 ° C, then 7 minutes at 72 ° C, and then the reaction mixture was kept at 4 ° C. The PCR runs were carried out under different conditions (i.e. different concentrations of S. pombe DNA and different MgCb concentrations). The PCR products were separated on agarose gels and stained with ethidium bromide as described above. Different PCR runs resulted in the production of 3 bands (labeled "T", "M1" and "B"). These bands were amplified again under the same conditions as described above and separated on gels. After this renewed amplification, four bands were observed ("T", "M1", "M2" and "B") as shown in Fig. 57. These four bands were then re-amplified under the same conditions as described above. The third band from the top of the lane in Figure 57 was identified as a band that contained the correct sequence for a teiomerase protein. It was found that the PCR product labeled M2 fits relatively well with other telomerase proteins, as shown in FIG. 58. In addition to the orientation shown, this figure also shows the actual sequence of tez1. In this figure, asterisks denote residues that have all four sequences in common (Oxytricha "OT"; E. aediculatus "Ea_p123", S. cerevisiae "Sc_p103" and M2), and the circles (i.e. dots) denote similar amino acid residues.

ii) 3'-RT-PCR ii) 3'-RT-PCR

Um eine zusätzliche Sequenzinformation zu erhalten, wurden 3'- und 5'-RT-PCR an dem in Fig. 58 angegebenen Telomerase-Kandidaten durchgeführt. Fig. 59 zeigt ein Schema der verwendeten 3'-RT-PCR-Strategie. Zuerst wurde mittels des Oligonucleotidprimers «Qt» (5'-CCA GTG AGC AGA GTG ACG AGG ACT CGA GCT CAA GCT I I I I I I TTT I I I TT-3'; aus mRNA cDNA präpariert, danach diese cDNA als eine Matrize für OCR mit «Qo» (5'-CCA GTG AGC AGA GTG ACG-3'; verwendet und ein Primer auf der Basis der ursprünglichen degenerierten PCRReaktion entworfene, (d.h. «M2-T» mit der Sequenz 5'-G TGT CAT TTC TAT ATG GAA GAT TTG ATT GAT G-3'). Die zweite PCR-Reaktion (d.h. «nested» PCR) wurde mit «Qi» (5'-GAG GAC TCG AGC TCA AGC-3'); und einem weiteren PCR-Primer, der mit einer Sequenz entworfen wurde, die von der ursprünglichen degenerierten PCR-Reakti-on stammte oder «M2-T2» mit der Sequenz 5'-AC CTA TCG TTT ACG AAA AAG AAA GGA TCA GTG-3'; durchgeführt. Die in dieser PCR verwendeten Puffer entsprachen den vorstehend beschriebenen, wobei die durchgeführte Amplifikation mit einem 5minütigem «ramp up» bei 94°C begann, wonach sich 30 Cyclen von jeweils 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 3 Minuten bei 72°C anschlössen, danach wurde 7 Minuten bei 72°C inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden bis zu ihrer Verwendung bei 4°C aufbewahrt. In order to obtain additional sequence information, 3 'and 5' RT-PCR were carried out on the telomerase candidate shown in FIG. 58. 59 shows a diagram of the 3'-RT-PCR strategy used. First, the oligonucleotide primer «Qt» (5'-CCA GTG AGC AGA GTG ACG AGG ACT CGA GCT CAA GCT IIIIII TTT III TT-3 '; was prepared from mRNA cDNA, then this cDNA as a template for OCR with «Qo» ( 5'-CCA GTG AGC AGA GTG ACG-3 '; used and a primer designed on the basis of the original degenerate PCR reaction (ie «M2-T» with the sequence 5'-G TGT CAT TTC TAT ATG GAA GAT TTG ATT GAT G-3 '). The second PCR reaction (ie «nested» PCR) was carried out using «Qi» (5'-GAG GAC TCG AGC TCA AGC-3'); and another PCR primer that was designed with a sequence that originated from the original degenerate PCR reaction or “M2-T2” with the sequence 5'-AC CTA TCG TTT ACG AAA AAG AAA GGA TCA GTG-3 ';. The buffers used in this PCR corresponded to those as described above, the amplification carried out starting with a 5-minute ramp up at 94 ° C., after which 30 cycles of 30 seconds each at 94 ° C., 30 seconds at 55 ° C and 3 minutes at 72 ° C, then incubated at 72 ° C for 7 minutes. The reaction products were stored at 4 ° C until used.

iii) Screenen von aenomischen und cDNA-Banken iii) Screening aenomic and cDNA libraries

Nach Erhalt dieser zusätzlichen Sequenzinformation wurden verschiedene genomische und cDNA-Banken gescreent, um somit alle Banken identifizieren zu können, die diesen Kandidaten für das Telomerase-Gen enthielten. Die verwendete Vorgehensweise sowie die Genbanken und Ergebnisse sind in Fig. 60 gezeigt. In dieser Figur werden in Teil A die in diesem Experiment getesteten Genbanken aufgezählt; Teil B zeigt die verwendeten Bereiche; die Teile C und D zeigen die mit diesen Banken erhal110 After receiving this additional sequence information, various genomic and cDNA libraries were screened in order to be able to identify all banks which contained this candidate for the telomerase gene. The procedure used as well as the gene banks and results are shown in FIG. 60. In this figure, part A lists the gene banks tested in this experiment; Part B shows the areas used; parts C and D show those obtained with these banks

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

tenen Ergebnisse der Dot-Blot-Hybridisierung. Positive Banken wurden dann zum Erhalt des genomischen tez1-Gens und einer cDNA-Version des tez1-Gens durch Koloniehybridisierung gescreent. In diesem Experiment wurden etwa 3 x 104 Kolonien von der genomischen Hindlll-Bank gescreent und es konnten sechs positive Clone identifiziert werden (etwa 0,01%). Danach wurde DNA von zwei unabhängigen Clonen (A5 und B2) präpariert. Fig. 61 zeigt die mit den Hindill-gespaltenen positiven genomischen Clone A5 und B2 erhaltenen Ergebnisse. results of dot blot hybridization. Positive libraries were then screened to obtain the tez1 genomic gene and a cDNA version of the tez1 gene by colony hybridization. In this experiment, approximately 3 x 104 colonies were screened from the Hindlll genomic library and six positive clones were identified (approximately 0.01%). Then DNA from two independent clones (A5 and B2) was prepared. Figure 61 shows the results obtained with Hindill-cleaved positive genomic clones A5 and B2.

Zusätzlich wurden cDNA-REP-Banken verwendet. Es wurden etwa 3 x 105 Kolonien gescreent und es konnten 5 positive Clone (0,002%) identifiziert werden. Von drei unabhängigen Clonen (2-3, 4-1 und 5-20) wurde DNA präpariert. In späteren Experimenten wurde herausgefunden, dass 2-3 und 5-20 identische Insertionen enthielten. In addition, cDNA REP banks were used. About 3 x 105 colonies were screened and 5 positive clones (0.002%) were identified. DNA was prepared from three independent clones (2-3, 4-1 and 5-20). In later experiments it was found that 2-3 and 5-20 contained identical insertions.

iv) 5'-RT-PCR iv) 5'-RT-PCR

Da die cDNA-Version des Genprodukts bis zu diesem Punkt nicht vollständig war, wurde zum Erhalt eines Clons vollständiger Länge eine 5'-RT-PCR durchgeführt. Die Strategie ist schematisch in Fig. 62 gezeigt. Bei diesem Experiment wurde cDNA präpariert mittels des DNA-Oligonucleotid-Primers «M2-B» (5'-CAC TG A TCC TTT CTT TTT CGT AAA CGA TAG GT-3'); und «M2-B2» (5'-C ATC AAT CAA ATC TTC CAT ATA GAA ATG ACA3'); die anhand von bekannten und bereits früher identifizierten Bereichen von tezi entworfen worden waren. Ein Oligonucleotid-Linker «PCR Adapt Sfil» mit einem phosphorylier-ten 5'-Ende («P") (p-GGG CCG TGT TGG CCT AGT TCT CTG CTC3'); wurde danach mit dem 3'-Ende dieser cDNA ligiert und dieses Konstrukt wurde als die Matrize für eine «nested»-PCR verwendet. In der ersten PCR-Runde wurden PCR Adapt SFI und M2-B als Primer verwendet. In der zweiten Runde wurde PCR Adapt Sfili (5-GAG GAG GAG AAG AGC AGA GAA CTA GGC CAA CAC GCC CCS); und M2-B2 (5'-ATC AAT CAA ATC TTC CAT ATA GAA ATG ACA-3'); als Primer verwendet. «Nested»-PCR wurde zur Steigerung der Spezifität der Reaktion verwendet. Since the cDNA version of the gene product was not complete up to this point, a 5 'RT-PCR was carried out to obtain a full-length clone. The strategy is shown schematically in Fig. 62. In this experiment, cDNA was prepared using the DNA oligonucleotide primer «M2-B» (5'-CAC TG A TCC TTT CTT TTT CGT AAA CGA TAG GT-3 '); and "M2-B2" (5'-C ATC AAT CAA ATC TTC CAT ATA GAA ATG ACA3 '); which were designed by tezi based on known and previously identified areas. An oligonucleotide linker "PCR Adapt Sfil" with a 5 'phosphorylated end ("P") (p-GGG CCG TGT TGG CCT AGT TCT CTG CTC3') was then ligated to the 3 'end of this cDNA and this construct was used as the template for a “nested” PCR. In the first round of PCR, PCR Adapt SFI and M2-B were used as primers. In the second round, PCR Adapt Sfili (5-GAG GAG GAG AAG AGC AGA GAA CTA GGC CAA CAC GCC CCS); and M2-B2 (5'-ATC AAT CAA ATC TTC CAT ATA GAA ATG ACA-3 '); used as primer. "Nested" PCR was used to increase the specificity of the reaction.

v) Sequenzausrichtunaen v) Sequence alignments

Nachdem die Sequenz von tezi bestimmt war, wurde sie mit bereits früher beschriebenen Sequenzen verglichen. Fig. 63 zeigt die Ausrichtung von reverser Transkriptase (RT)-Domänen von katalytischen Telomerase-Untereinheiten von S. pombe («S.p. Tezlp»), S. cerevisiae «S.c. Est2p»), und E. aediculatus p123 (E.a. p123»). In dieser Figur bezeichnet «h» hydrophobe Reste, «p» kleine polare Reste und «c» geladene Reste. Die über der Ausrichtung angegebenen Aminosäurereste zeigen das «Consensus»-RT-Motiv von Y. Xiong und T.H. Eickbush (Y. Xiong und T.H. Eickbush, EMBO J. 9 (1990) 3353-3362). Die Sternchen bezeichnen die Reste, die in allen drei Proteinen konserviert sind. «Motiv 0» wurde hier als ein Motiv identifiziert, das spezifisch für diese Telomerase-Untereinheit ist und im allgemeinen in reversen Transkriptasen nicht gefunden wird. Es ist somit wertvoll, um andere Aminosäuresequenzen als gute Kandidaten für katalytische Telomerase-Untereinheiten identifizieren zu können. After the sequence was determined by tezi, it was compared to previously described sequences. Figure 63 shows the alignment of reverse transcriptase (RT) domains from telomerase catalytic subunits of S. pombe ("S.p. Tezlp"), S. cerevisiae "S.c. Est2p »), and E. aediculatus p123 (E.a. p123»). In this figure, "h" denotes hydrophobic residues, "p" small polar residues and "c" charged residues. The amino acid residues indicated above the alignment show the “Consensus” RT motif by Y. Xiong and T.H. Eickbush (Y. Xiong and T.H. Eickbush, EMBO J. 9 (1990) 3353-3362). The asterisks indicate the residues that are conserved in all three proteins. "Motif 0" was identified here as a motif that is specific for this telomerase subunit and is generally not found in reverse transcriptases. It is therefore valuable in order to be able to identify other amino acid sequences as good candidates for catalytic telomerase subunits.

Fig. 64 zeigt die Ausrichtung der gesamten Sequenzen von Euplotes («Ea_P123»), S. cerevisiae («Sc_Est2P») und S. pombe («Sp_Tez1p»), In Teil A kennzeichnen schattierte Bereiche Reste, die beide Sequenzen gemeinsam haben. In Teil B bezeichnen schattierte Bereiche Reste, die alle drei Sequenzen gemeinsam haben. 64 shows the alignment of the entire sequences of Euplotes ("Ea_P123"), S. cerevisiae ("Sc_Est2P") and S. pombe ("Sp_Tez1p"). In Part A, shaded areas indicate residues that both sequences have in common. In Part B, shaded areas denote residues that all three sequences have in common.

vi) Genetische Disruption von tezi vi) Tezi's genetic disruption

In diesem Beispiel wurden die Auswirkungen einer Disruption von tezi untersucht. Da Telomerase an der Telomer-Beibehaltung beteiligt ist, wurde davon ausgegangen, dass, falls tezi tatsächlich ein Telomerase-Bestandteil ist, die Disruption von tezi zu einer graduellen Telomer-Verkürzung führen sollte. In this example, the effects of tezi's disruption were examined. Since telomerase is involved in the maintenance of telomeres, it was assumed that if tezi is actually a component of telomerase, tezi's disruption should lead to a gradual telomer shortening.

In diesen Experimenten wurde zur spezifischen Disruption des tez1-Gens in S. pombe homologe Rekombination verwendet. Diese Vorgehensweise ist schematisch in Fig. 65 gezeigt. Wie in Fig. 65 angegeben, wurde Wild-Typ-tez1 gegen ein Fragment, das den ura4- oder LEU2-Marker enthielt, ausgetauscht. In these experiments homologous recombination was used for the specific disruption of the tez1 gene in S. pombe. This procedure is shown schematically in FIG. 65. As indicated in Figure 65, wild-type tez1 was exchanged for a fragment containing the ura4 or LEU2 marker.

Die Disruption des tez1-Gens wurde durch PCR bestätigt (Fig. 66) und ein Southern-Blot wurde zur Überprüfung der Telomer-Länge durchgeführt. Fig. 67 zeigt die Southern-Blot-Ergebnisse dieses Experiments. Da eine Apal-Restriktionsenzymstelle im unmittelbaren Anschluss zu einer Telomer-Sequenz in S. pombe vorhanden ist, erlaubt die Spaltung von genomischen DNA-Präparationen von S. pombe die Analyse der Telomer-Länge. Somit wurde DNA von S. pombe mit Apal geschnitten, die Spaltprodukte wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt und diese dann mit einer für eine Telomer-Sequenz spezifischen Sonde hybridisiert, um so herauszufinden, ob die Telomere der disruptierten S. pombe-Zellen verkürzt waren. Die Ergebnisse sind in Fig. 67 gezeigt. Aus diesen Ergebnissen konnte geschlossen werden, dass eine Disruption des tez1-Gens eine Verkürzung der Telomere bewirkte. Disruption of the tez1 gene was confirmed by PCR (Fig. 66) and a Southern blot was performed to check the telomer length. Figure 67 shows the Southern blot results of this experiment. Since an Apal restriction enzyme site is immediately adjacent to a telomer sequence in S. pombe, the cleavage of genomic DNA preparations from S. pombe allows the telomer length to be analyzed. Thus, S. pombe DNA was cut with Apal, the cleavage products were separated on an agarose gel and these were then hybridized with a probe specific for a telomer sequence in order to find out whether the telomeres of the disrupted S. pombe cells were shortened. The results are shown in Fig. 67. From these results it could be concluded that disruption of the tez1 gene caused a shortening of the telomeres.

111 111

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Q. Clonierung und Charakterisierung von menschlichem Teiomerase-Protein und -cDNA Q. Cloning and characterization of human teiomerase protein and cDNA

In diesem Beispiel wurde die Information bezüglich der Nucleinsäuresequenz und Aminosäuresequenz für menschliche Telomerase ermittelt. Partiell homologe Sequenzen wurden zuerst mittels einer BLAST-Suche identifiziert, die mittels der Euplotes 123 kD-Peptid- und Nucleinsäuresequenzen sowie der Sequenzen des Schizosaccharomyces-Proteins und der korrespondierenden cDNA (tezl)-Sequenz. Die menschlichen Sequenzen (auch mit «hTCP1.1» bezeichnet) wurden von einem partiellen cDNA-Clon ermittelt (Clon 712562). Sequenzen von diesem Clon wurden gegen die wie in vorherigen Beispielen beschrieben bestimmten Sequenzen ausgerichtet. In this example, information regarding the nucleic acid sequence and amino acid sequence for human telomerase was obtained. Partially homologous sequences were first identified using a BLAST search using the Euplotes 123 kD peptide and nucleic acid sequences as well as the sequences of the Schizosaccharomyces protein and the corresponding cDNA (tezl) sequence. The human sequences (also referred to as “hTCP1.1”) were determined from a partial cDNA clone (clone 712562). Sequences from this clone were aligned against the sequences determined as described in previous examples.

Fig. 1 zeigt die Sequenzausrichtung von Euplotes («p123») Schizosaccharomyces (»tezi»), Est2p (d.h. das von der Est2-Nucleinsäuresequenz codierte Protein von S. cerevisiae, das hier auch mit «L8543.12» bezeichnet wird) und dem in dieser Vergleichssuche identifizierten menschlichen Homologen. Fig. 51 zeigt die Aminosäuresequenz von tezi und Fig. 52 die DNA-Sequenz von tezi. In Fig. 52 sind die Introns und andere nicht codierende Bereiche mit kleinen Buchstaben dargestellt und die Exons (d.h. codierenden Bereiche) in Grossbuchstaben. 1 shows the sequence alignment of Euplotes ("p123") Schizosaccharomyces ("tezi"), Est2p (ie the protein of S. cerevisiae encoded by the Est2 nucleic acid sequence, which is also referred to here as "L8543.12") and the like human homologues identified in this comparison search. Figure 51 shows the amino acid sequence of tezi and Figure 52 shows the DNA sequence of tezi. In Fig. 52, the introns and other non-coding areas are shown in small letters and the exons (i.e. coding areas) in capital letters.

Wie in Fig. 75 gezeigt, gibt es Bereiche, die unter diesen Proteinen hochkonserviert sind. Beispielsweise zeigt sich in dieser Figur, dass es Identitätsbereiche «Motiv 0», «Motiv 1», «Motiv 2» und «Motiv 3» gibt. Die identischen Aminosäuren sind durch ein Sternchen (*) gekennzeichnet und die ähnlichen Aminosäurereste durch einen Kreis (•). Dies zeigt, dass es Bereiche innerhalb der Telomerase-Motive gibt, die innerhalb einer grossen Anzahl von Eukaryoten, die von der Hefe über Ciliate bis zum Menschen reichen, konserviert sind. Es wird davon ausgegangen, dass weitere Organismen ebenso solche konservierten Sequenzbereiche enthalten. Fig. 49 zeigt die partielle Aminosäuresequenz des Clons, der menschliche Telomerase-Motive codiert und Fig. 50 die korrespondierende DNA-Sequenz des Genbank-Clons #AA281296. As shown in Fig. 75, there are areas that are highly conserved among these proteins. For example, this figure shows that there are areas of identity "Motif 0", "Motif 1", "Motif 2" and "Motif 3". The identical amino acids are marked with an asterisk (*) and the similar amino acid residues with a circle (•). This shows that there are areas within the telomerase motifs that are conserved within a large number of eukaryotes, which range from yeast to ciliate to human. It is believed that other organisms also contain such conserved sequence regions. Fig. 49 shows the partial amino acid sequence of the clone encoding human telomerase motifs and Fig. 50 the corresponding DNA sequence of the Genbank clone # AA281296.

Um die Information über die Sequenz des Genbank-Clons #AA281296 zu vervollständigen wurden die Sanger-Didesoxy-Sequenzierung und andere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren angewandt. Einige der bei der Sequenzierung verwendeten Primer sind in Tabelle 7 gezeigt. Diese Primer wurden so entworfen, dass sie mit dem Clon (GenBank-Zugangsnummer #AA281296) hybridisieren; dies basierte auf Sequenzkomplementarität entweder zu der Sequenz des Plasmidrückgrats oder der Sequenz der Insertion der menschlichen cDNA im Clon. To complete the information on the sequence of Genbank clone # AA281296, Sanger dideoxy sequencing and other methods known in the art were used. Some of the primers used in sequencing are shown in Table 7. These primers were designed to hybridize to the clone (GenBank accession number # AA281296); this was based on sequence complementarity to either the sequence of the plasmid backbone or the sequence of insertion of the human cDNA into the clone.

112 112

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Tabelle 7 Primer Table 7 Primers

Primer Primer

Sequenz sequence

TCP1.I TCP1.I

GTGAAGGCACTGTTCAGCG GTGAAGGCACTGTTCAGCG

TCP 1.2 TCP 1.2

GTGGATGATTTCTTGTTGG GTGGATGATTTCTTGTTGG

TCPl.3 TCPl.3

ATGCTCCTGCGTTTGGTGG ATGCTCCTGCGTTTGGTGG

TCP 1.4 TCP 1.4

CTGGACACTCAGCCCTTGG CTGGACACTCAGCCCTTGG

TCPl.5 TCPl.5

GGCAGGTGTGCTGGACACT GGCAGGTGTGCTGGACACT

TCPl.6 TCPl.6

TTTGATGATGCTGGCGATG TTTGATGATGCTGGCGATG

TCPl.7 TCPl.7

GGGGCTCGTCTTCTACAGG GGGGCTCGTCTTCTACAGG

TCPl.8 TCPl.8

CAGCAGGAGGATCTTGTAG CAGCAGGAGGATCTTGTAG

TCPl.9 TCPl.9

TGACCCCAGGAGTGGCACG TGACCCCAGGAGTGGCACG

TCPl.10 TCPl.10

TCAAGCTGACTCGACACCG TCAAGCTGACTCGACACCG

TCPl.11 TCPl.11

CGGCGTGACAGGGCTGC CGGCGTGACAGGGCTGC

TCPl.12 TCPl.12

GCTGAAGGCTGAGTGTCC GCTGAAGGCTGAGTGTCC

TCPl.13 TCPl.13

TAGTCCATGTTCACAATCG TAGTCCATGTTCACAATCG

Anhand dieser Experimente wurde herausgefunden, dass die EcoRI-Notl-lnsertion des Genbank-Clons #AA281296 nur einen partiellen offenen Leserahmen für das menschliche Teiomerase-Protein enthält, allerdings könnte er ein aktives Fragment dieses Proteins codieren. Der offene Leserahmen im Clon codiert ein Protein von etwa 63 kD. Die Sequenz des längsten ermittelten offenen Leserahmens ist in Fig. 68 gezeigt. Der offene Leserahmen (ORF) beginnt an dem ATG-Codon mit dem in der Figur gekennzeichneten «met». Der poly-A-Schwanz am 3'-Ende der Sequenz ist ebenfalls gezeigt. Fig. 69 zeigt eine vorläufige Ausrichtung von reverser Transkriptase-Proteinen von Telomerase von der menschlichen Sequenz (menschliches Telomerase «Core Protein 1», «HS TCP1»), E. aediculatus p123 («Ep p123»), S. pombe tezi («Sp Tezi»), S. cerevisiae EST2 («Sc Est2») und der «Consensus»-Sequenz. In dieser Figur sind verschiedene Motive angegeben. Based on these experiments, it was found that the EcoRI Not insertion of the Genbank clone # AA281296 contains only a partial open reading frame for the human teiomerase protein, but it could encode an active fragment of this protein. The open reading frame in the clone encodes a protein of approximately 63 kD. The sequence of the longest open reading frame found is shown in FIG. 68. The open reading frame (ORF) begins at the ATG codon with the “met” marked in the figure. The poly A tail at the 3 'end of the sequence is also shown. 69 shows a preliminary alignment of reverse transcriptase proteins from telomerase from the human sequence (human telomerase “core protein 1”, “HS TCP1”), E. aediculatus p123 (“Ep p123”), S. pombe tezi (“ Sp Tezi »), S. cerevisiae EST2 (« Sc Est2 ») and the« Consensus »sequence. Various motifs are given in this figure.

Um einen vollständigen Clon zu erhalten, wurden die Hybridisierung einer cDNA-Bank und 5'-RACE durchgeführt, um so Clone zu erhalten, die Bereiche von bisher nicht clonierten Bereichen codieren. In diesen Experimenten wurde zur Erzeugung von Material für eine Sequenzanalyse RACE angewandt (schnelle Amplifikation von cDNA-Enden, «Rapid Amplification of cDNA Ends»; siehe z.B. M. A. Froh-man, «RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends», in Innis et al. (Herausg.) PCR-Protocols: A Guide to Methods and Applications (1990) S. 2838, und Frohman et al., Proc. Nati. Acad. Sei. 85 (1988) 8998-9002). Vier solcher Clone wurden erzeugt und zur Bereitstellung zusätzlicher 5'-Sequenzinformation (pFWRP5, 6, 19 und 20) verwendet. In order to obtain a complete clone, the hybridization of a cDNA library and 5'-RACE was carried out, so as to obtain clones which encode regions of regions which have not yet been cloned. In these experiments, RACE was used to generate material for a sequence analysis (rapid amplification of cDNA ends, “Rapid Amplification of cDNA Ends”; see, for example, MA Froh-man, “RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends”, in Innis et al . (Ed.) PCR-Protocols: A Guide to Methods and Applications (1990) p. 2838, and Frohman et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 85 (1988) 8998-9002). Four such clones were generated and used to provide additional 5 'sequence information (pFWRP5, 6, 19 and 20).

Zusätzlich wurden menschliche cDNA-Banken (in lambda inseriert) mit dem EcoRI-Notl-Fragment des Clons (#AA281296) hybridisiert. Ein lambda-Clon mit der Bezeichnung «lambda 25-1.1» (ATCC-Zu-gangsnummer #209024) wurde gefunden, der komplementäre Sequenzen enthielt. Fig. 75 zeigt eine Restriktionskarte dieses lambda-Clons. Die Insertion von humaner cDNA wurde von diesem Clon als ein EcoRI-Restriktionsfragment in die EcoRI-Stelle des im Handel erhältlichen «phagemids» pBluescriptllSK+ (Stratagene) subcloniert, wodurch das Plasmid «pGRN121» erzeugt wurde, das bei der ATCC hinterlegt wurde (ATCC-Zugangsnummer #209016). Vorläufige Ergebnisse zeigten, dass das Plasmid pGRN121 die vollständige Sequenz des offenen Leserahmens (ORF) enthält, der das menschliche Teiomerase-Protein codiert. In addition, human cDNA libraries (inserted in lambda) were hybridized with the EcoRI-NotI fragment of the clone (# AA281296). A lambda clone called "lambda 25-1.1" (ATCC accession number # 209024) was found which contained complementary sequences. Figure 75 shows a restriction map of this lambda clone. The insertion of human cDNA was subcloned from this clone as an EcoRI restriction fragment into the EcoRI site of the commercially available "phagemid" pBluescriptIISK + (Stratagene), creating the plasmid "pGRN121" which was deposited with the ATCC (ATCC- Accession number # 209016). Preliminary results showed that the plasmid pGRN121 contains the complete sequence of the open reading frame (ORF), which encodes the human Teiomerase protein.

Die cDNA-lnsertion von Plasmid pGRN121 wurde unter Verwendung von auf dem Fachgebiet be113 The cDNA insertion of plasmid pGRN121 was performed using art113

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

kannter Verfahren sequenziert. Fig. 70 zeigt eine Karte des Plasmids pGRN121 bezüglich Restriktionsstellen und Funktion, deren Bestimmung auf dieser vorläufigen Arbeit basiert. Die Ergebnisse dieser vorläufigen Sequenzanalyse sind in Fig. 71 gezeigt. Aufgrund dieser Analyse, und wie in Fig. 70 gezeigt, wurde eine vermutliche Startstelle für den codierenden Bereich bei einer Position, die etwa 50 5 Nucleotide von der EcoRI-Stelle entfernt liegt, gefunden (bei Position 707 gelegen) und die Lage der Telomerase-spezifischen Motive «FFYVTE», «PKP», «AYD», «QG» und «DD». Zusätzlich wurde eine vermutliche Stopstelle bei Nucleotid #3571 gefunden (siehe Fig. 72). Fig. 72 zeigt die DNA-Sequenzen und entsprechenden Aminosäuresequenzen für die offenen Leserahmen in der Sequenz («a», «b» und «c»). Aufgrund der vorläufigen Natur dieser frühen Sequenzierungsarbeiten stellte sich jedoch heraus, 10 dass die Leserahmen für die verschiedenen Motive nicht richtig ausgerichtet sind. known method sequenced. 70 shows a map of the plasmid pGRN121 with regard to restriction sites and function, the determination of which is based on this preliminary work. The results of this preliminary sequence analysis are shown in Fig. 71. Based on this analysis, and as shown in FIG. 70, a putative starting site for the coding region was found at a position approximately 50 5 nucleotides from the EcoRI site (located at position 707) and the location of the telomerase specific motifs «FFYVTE», «PKP», «AYD», «QG» and «DD». In addition, a putative stop point was found at nucleotide # 3571 (see Fig. 72). Fig. 72 shows the DNA sequences and corresponding amino acid sequences for the open reading frames in the sequence ("a", "b" and "c"). However, due to the tentative nature of this early sequencing work, 10 it emerged that the reading frames for the various motifs were not properly aligned.

Eine zusätzliche mit pGRN121 durchgeführte Analyse ergab, dass das Plasmid signifikante Bereiche des 5'-Endes der codierenden Sequenzen enthielt, die auf dem Genbank-Clon mit der Zugangsnummer #AA281296 nicht vorhanden sind. Es stellte sich weiterhin heraus, dass pGRN121 eine Variante der codierenden Sequenz enthält, die eine Insertion von etwa 182 Nucleotiden enthält. Es zeigte sich, dass 15 diese Insertion in dem Genbank-Clon mit der Zugangsnummer #AA281296 fehlt. Solche Varianten können wie die E. aediculatus-Sequenzen in funktionellen Assays getestet werden, beispielsweise Telome-rase-Assays, um so das Vorhandensein einer funktionellen Telomerase in einer Probe nachweisen zu können. An additional analysis performed with pGRN121 revealed that the plasmid contained significant regions of the 5 'end of the coding sequences which are not present on the Genbank clone with the accession number # AA281296. It was further found that pGRN121 contains a variant of the coding sequence which contains an insertion of approximately 182 nucleotides. It was found that 15 this insertion is missing in the Genbank clone with the accession number # AA281296. Such variants, like the E. aediculatus sequences, can be tested in functional assays, for example telomerase assays, in order to be able to detect the presence of a functional telomerase in a sample.

Durch eine weitere Sequenzanalyse konnte die cDNA-Sequenz von pGRN121 bestimmt werden, wo-20 bei ein zusammenhängender offener Leserahmen gefunden wurde, der ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 127 000 Dalton und 1132 Aminosäuren, wie in Fig. 74 gezeigt, codiert. Eine auf dieser Analyse basierende verbesserte Karte von pGRN121 ist in Fig. 73 gezeigt. Die Ergebnisse der zusätzlichen Sequenzanalyse der hTRT-cDNA sind in Fig. 16 gezeigt. Further sequence analysis determined the cDNA sequence of pGRN121, where-20 was found in a contiguous open reading frame encoding a protein with a molecular weight of approximately 127,000 daltons and 1132 amino acids as shown in Fig. 74. An improved map of pGRN121 based on this analysis is shown in FIG. 73. The results of the additional sequence analysis of the hTRT cDNA are shown in FIG. 16.

25 Beispiel 2 25 Example 2

Die Korrelation von hTRT-Häufigkeit und Zellunsterblichkeit The correlation between hTRT frequency and cell immortality

Die relative Häufigkeit von hTRT-mRNA wurde in sechs Stämmen von Telomerase-negativen sterbli-30 chen Zellen und sechs Zellinien von Telomerase-positiven unsterblichen Zellen bewertet (Fig. 5). Der Fliessgleichgewicht kleinere Spiegel von hTRT-mRNA war in unsterblichen Zellen, für die früher gezeigt werden konnte, dass sie aktive Telomerase besitzen, signifikant erhöht. Niedrigere Spiegel der hTRT-mRNA wurden in einigen Stämmen Telomerase-negativer Zellen entdeckt. The relative abundance of hTRT mRNA was assessed in six strains of telomerase-negative mortal cells and six cell lines of telomerase-positive immortal cells (Fig. 5). The steady state of minor levels of hTRT mRNA was significantly increased in immortal cells that were previously shown to have active telomerase. Lower levels of hTRT mRNA were found in some strains of telomerase negative cells.

Es wurde RT-PCR für hTRT, hTR, TP1 (Telomerase-assoziiertes Protein, das mit Tetrahymena p80 35 verwandt ist (Harrington et al., Science 275 (1997) 973 und Nakayama et al., Cell 88 (1997), 875)) und GAPDH (um für gleiche Mengen an RNA-Matrize zu normalisieren) mit RNA ausgeführt, die von den folgenden Zellen stammte: (1) Menschliche fötale Lungenfibroblasten GFL, (2) menschliche fötale Haut-fibroblasten GFS, (3) erwachsene Prostata Stromal-Fibroblasten 31 YO, (4) menschliche fötale Kniesyn-ovial-Fibroblasten HSF, (5) neonatale Vorhaut-Fibroblasten Bi, (6) menschliche fötale Lungenfibroblasten 40 IMR90 und die immortalisierten Zellinien: (7) Melanom LOX IMVI, (8) Leukämie U251, (9) Lungenkrebs NCI H23, (10) Colon-Adenocarcinom SW620, (11) Brusttumor MCF7, (12) 293 Adenovirus-E1-transformierte menschliche embryonale Nierenzellinie. RT-PCR was performed for hTRT, hTR, TP1 (telomerase-associated protein, which is related to Tetrahymena p80 35 (Harrington et al., Science 275 (1997) 973 and Nakayama et al., Cell 88 (1997), 875) ) and GAPDH (to normalize for equal amounts of RNA template) with RNA derived from the following cells: (1) human fetal lung fibroblast GFL, (2) human fetal skin fibroblast GFS, (3) adult prostate stromal -Fibroblasts 31 YO, (4) human fetal Kniesyn-oval fibroblasts HSF, (5) neonatal foreskin fibroblasts Bi, (6) human fetal lung fibroblasts 40 IMR90 and the immortalized cell lines: (7) melanoma LOX IMVI, (8) leukemia U251, (9) lung cancer NCI H23, (10) colon adenocarcinoma SW620, (11) breast tumor MCF7, (12) 293 adenovirus E1-transformed human embryonic kidney cell line.

hTRT-Nucleinsäure wurde von cDNA mittels der Oligonucleotid-primer LT5 und LT6 amplifiziert (Tabelle 2) mit insgesamt 31 Cyclen (94°C 45 s, 60°C 45 s, 72°C 90 s). GAPDH wurde mittels des Primers 45 K136 (CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA) und K137 (ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA) mit insgesamt 16 Cyclen amplifi ziert (94°C 45 s, 55°C 45 s, 72°C 90 s). hTR wurde mit den Primern F3B (TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG) und R3c (GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG) mit insgesamt 22 Cyclen amplifiziert (94°C 45 s, 55°C 45 s, 72°C 90 s). TP1-mRNA wurde mit den Primern TP1.1 und TP1.2 in 28 Cyclen (die Cyclen waren die gleichen wie für hTRT) amplifiziert. Die Reaktions-50 produkte wurden auf einem 8%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt, mit «SYBR Green» (Molecular Probes) angefärbt und durch Scannen auf einem «Storm 860» (Molecular Dynamics) sichtbar gemacht. Die in Fig. 5 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass hTRT-mRNA-Spiegel direkt mit den Spiegeln an Telomerase-Aktivität in den getesteten Zellen korrelieren. hTRT nucleic acid was amplified by cDNA using the oligonucleotide primers LT5 and LT6 (Table 2) with a total of 31 cycles (94 ° C. 45 s, 60 ° C. 45 s, 72 ° C. 90 s). GAPDH was amplified using the primer 45 K136 (CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA) and K137 (ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA) with a total of 16 cycles (94 ° C 45 s, 55 ° C 45 s, 72 ° C 90 s). hTR was amplified with the primers F3B (TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG) and R3c (GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG) with a total of 22 cycles (94 ° C 45 s, 55 ° C 45 s, 72 ° C 90 s). TP1 mRNA was amplified with the primers TP1.1 and TP1.2 in 28 cycles (the cycles were the same as for hTRT). The reaction 50 products were separated on an 8% polyacrylamide gel, stained with “SYBR Green” (Molecular Probes) and visualized by scanning on a “Storm 860” (Molecular Dynamics). The results shown in Figure 5 show that hTRT mRNA levels correlate directly with the levels of telomerase activity in the cells tested.

55 Beispiel 3 55 Example 3

Charakterisierung einer hTRT-Intron-Sequenz Characterization of an hTRT intron sequence

Ein vermutetes Intron wurde zuerst durch PCR-Amplifikation menschlicher genomischer DNA, wie in 60 diesem Beispiel beschrieben, identifiziert und das Ergebnis wurde im Anschluss daran durch Sequenzierung des genomischen Clons XGo5 (siehe Beispiel 4) bestätigt. PCR-Amplifikation wurde mittels des Vorwärts-Primers TCP1.57 durchgeführt, der in Kombination mit den einzelnen reversen Primern TCP1.46, TCP1.48, TCP1.50, TCP1.52, TCP1.54, TCP1.56 und TCP1.58 kombiniert wurde (siehe Tabelle 2). Die Produkte von genomischer DNA der Amplifikation mit TCP1.57/TCP1.46, TCP1.48, 65 TCP1.50, TCP1.52, TCP1.54 oder TCP1.56 waren etwa 100 Basenpaare länger als die Produkte der A suspected intron was first identified by PCR amplification of human genomic DNA as described in this example, and the result was then confirmed by sequencing the genomic clone XGo5 (see Example 4). PCR amplification was carried out using the forward primer TCP1.57, which in combination with the individual reverse primers TCP1.46, TCP1.48, TCP1.50, TCP1.52, TCP1.54, TCP1.56 and TCP1.58 was (see Table 2). The products of genomic DNA amplified with TCP1.57 / TCP1.46, TCP1.48, 65 TCP1.50, TCP1.52, TCP1.54 or TCP1.56 were about 100 base pairs longer than the products of

114 114

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

pGRN121-Amplifikationen. Die Amplifikation mit TCP1.57/TCP1.58 war bei Venwendung genomischer DNA und pGRN121-DNA gleich. Dies zeigte, dass die genomische DNA eine Insertion zwischen den Stellen für TCP1.58 und TCP1.50 enthielt. Die PCR-Produkte von TCP1.57/TCP1.50 und TCP1.57/ TCP1.52 wurden ohne Subclonierung mit den Primern TCP1.39, TCP1.57 und TCP1.49 direkt sequenziert. pGRN121 amplifications. The amplification with TCP1.57 / TCP1.58 was the same when using genomic DNA and pGRN121-DNA. This indicated that the genomic DNA contained an insert between the sites for TCP1.58 and TCP1.50. The PCR products of TCP1.57 / TCP1.50 and TCP1.57 / TCP1.52 were directly sequenced with the primers TCP1.39, TCP1.57 and TCP1.49 without subcloning.

Wie nachstehend gezeigt, ist die Intron-Sequenz von 104 Basen (SEQ. ID. Nr. 7) (Fig. 12) in der hTRT-mRNA (in Fettdruck gezeigt) an der Verbindung, die den Basen 274 und 275 von SEQ. ID. Nr. 1 entspricht, inseriert: As shown below, the intron sequence of 104 bases (SEQ. ID NO: 7) (Fig. 12) in the hTRT mRNA (shown in bold) is on the compound that is linked to bases 274 and 275 of SEQ. ID. No. 1 corresponds to:

CCCCCCGCCGCCCCCTCCTTCCGCCAG/GTGGGCCTCCCCGGGGTCGGCG CCCCCCGCCGCCCCCTCCTTCCGCCAG / GTGGGCCTCCCCGGGGTCGGCG

TCCGGCTGGGGTTGAGGGCGGCCGGGGGGAACCAGCGACATGCGGAGAG TCCGGCTGGGGTTGAGGGCGGCCGGGGGGAACCAGCGACATGCGGAGAG

CAGCGCAGGCGACTCAGGGCGCTTCCCCCGCAG/GTGTCCTGCCTGAAGG AGCTGGTGGCCCG A.GTGCTGCAG CAGCGCAGGCGACTCAGGGCGCTTCCCCCGCAG / GTGTCCTGCCTGAAGG AGCTGGTGGCCCG A.GTGCTGCAG

«/» kennzeichnet die Spieisspunkte, die Sequenz zeigt gute Übereinstimmungen mit den «Consen-sus»-5'- und 3'-Spleisspunktsequenzen, die typisch für menschliche Introns sind. «/» Indicates the spitting points, the sequence shows good correspondences with the «Consen-sus» -5 'and 3' splicing point sequences, which are typical for human introns.

Dieses Intron enthält Motive, die charakteristisch für eine Spaltstelle für Topoisomerase II sind und eine NFKB-Bindungsstelle (siehe Fig. 21). Diese Motive sind teilweise deshalb von Interesse, da die Expression von Topoisomerase II in den meisten Tumoren hoch reguliert ist. Topoisomerase II bewirkt eine Relaxierung von DNA durch Schneiden und erneutes Auffinden der DNA, wodurch die Expression bestimmter Gene erhöht wird. Es konnte gezeigt werden, dass Inhibitoren von Topoisomerase II als anti-Tumor-Agenzien wirken. Im Falle von NFKB könnte dieser Transkriptionsfaktor eine Rolle bei der Regulation von Telomerase während der terminalen Differenzierung spielen. NFKB könnte eine Rolle spielen bei der frühen Repression von Telomerase während der Entwicklung und stellt somit ein weiteres Ziel für eine therapeutische Intervention hinsichtlich der Regulierung von Telomerase-Aktivität in Zellen dar. This intron contains motifs which are characteristic of a cleavage site for topoisomerase II and an NFKB binding site (see FIG. 21). These motives are partly of interest because the expression of topoisomerase II is highly regulated in most tumors. Topoisomerase II relaxes DNA by cutting and retrieving the DNA, which increases the expression of certain genes. It has been shown that inhibitors of topoisomerase II act as anti-tumor agents. In the case of NFKB, this transcription factor could play a role in the regulation of telomerase during terminal differentiation. NFKB could play a role in the early repression of telomerase during development and is therefore another target for therapeutic intervention in regulating telomerase activity in cells.

Beispiel 4 Example 4

Clonierung des Lambda-phagen G<t>5 und Charakterisierung von genomischen hTRT-Sequenzen a) Lambda Gtf>5 Cloning of the lambda phage G <t> 5 and characterization of genomic hTRT sequences a) Lambda Gtf> 5

Eine menschliche genomische DNA-Bank wurde mittels PCR und Hybridisierung gescreent, wobei ein hTRT-RNA codierende Sequenzen enthaltender genomischer Clon gefunden wurde. Bei der Bank handelt es sich um eine genomische Bank von menschlichen Fibroblasten, die mittels DNA von W138 Lun-genfibroblastenzellen hergestellt wurde (Stratagene, Katalog #946204). In dieser Bank sind partielle Sau3AI-Fragmente in die Xhol-Stelle des Lambda-Vektors FIXRII (Stratagene) mit einer Insertionsgrösse von 9-22 kb inseriert. A human genomic DNA library was screened by PCR and hybridization, and a genomic clone containing sequences encoding hTRT-RNA was found. The bank is a genomic bank of human fibroblasts that was made using DNA from W138 lung fibroblast cells (Stratagene, catalog # 946204). In this bank, partial Sau3AI fragments are inserted into the Xhol site of the lambda vector FIXRII (Stratagene) with an insertion size of 9-22 kb.

Diese genomische Bank wurde in Pools von jeweils 150 000 Phagen aufgeteilt und jeder Pool durch «nested» PCR gescreent (äusseres Primerpaar TCP1.52 & TCP1.57; inneres Primerpaar TCP1.49 & TCPl.50, siehe Tabelle 1). Diese Primerpaare umspannen ein vermutetes Intron (siehe das vorstehende Beispiel 3) in der genomischen DNA von hTRT und sie gewährleisten, dass das PCR-Produkt von einer genomischen Quelle stammte und nicht von einer Verunreinigung durch den hTRTcDNA-Clon. Positive Pools wurden weiter aufgeteilt, bis ein Pool von 2000 Phagen erhalten wurde. Dieser Pool wurde mit niedriger Dichte ausplattiert und durch Hybridisierung mit einem DNA-Fragment, das die Basenpaare 1552-2108 von SEQ. ID. Nr. 1 umfasst (Restriktionsstellen Sphl bzw. EcoRV) gescreent. This genomic bank was divided into pools of 150,000 phages each and each pool was screened by “nested” PCR (outer primer pair TCP1.52 &TCP1.57; inner primer pair TCP1.49 & TCPl.50, see Table 1). These primer pairs span a suspected intron (see Example 3 above) in the genomic DNA of hTRT and ensure that the PCR product was from a genomic source and not from contamination by the hTRTcDNA clone. Positive pools were further divided until a pool of 2000 phages was obtained. This pool was plated out at low density and by hybridization with a DNA fragment that the base pairs 1552-2108 of SEQ. ID. No. 1 includes (restriction sites Sphl or EcoRV) screened.

Zwei positive Clone wurden isoliert und erneut über «nested» PCR wie vorstehend beschrieben gescreent. Beide Clone waren am Rande der PCR positiv. Einer der Clone (XGo5) wurde mit Noti gespalten, wobei sich eine Insertionsgrösse von etwa 20 kb zeigte. Die nachfolgende Kartierung (siehe unten) ergab eine Insertionsgrösse von 15 kb und zeigte, dass der Phage Go>5 etwa 13 kb an DNA stromaufwärts von der Startstelle der cDNA-Sequenz enthält. Two positive clones were isolated and screened again using nested PCR as described above. Both clones were positive on the edge of the PCR. One of the clones (XGo5) was cleaved with Noti, with an insertion size of about 20 kb. The subsequent mapping (see below) showed an insertion size of 15 kb and showed that the phage Go> 5 contains approximately 13 kb of DNA upstream from the starting point of the cDNA sequence.

Der Phage G<d5 wurde mittels Restriktionsenzymspaltung und DNA-Sequenzierung kartiert. Die erhaltene Karte ist in Fig. 7 gezeigt. Die Phagen-DNA wurde mit Ncol gespalten und die Fragmente in pBBS167 cloniert. Die erhaltenen Subclone wurden durch PCR gescreent, um jene zu identifizieren, die Sequenzen enthalten, die dem 5'-Bereich der hTRT-cDNA entsprechen. Ein Subclon (pGRN140), der ein Ncol-Fragment von 9 kb (mit der hTRT-Gensequenz und 4 bis 5 kb der lambda-Vektor-Sequenz) enthielt, wurde partiell sequenziert, um die Orientierung der Insertion zu bestimmen. pGRN 140 wurde zur Entfernung von lambda-Vektor-Sequenzen mit Sali geschnitten, wobei pGRN144 erhalten wurde. pGRN144 wurde danach sequenziert. Vorläufige Ergebnisse der Sequenzierung sind in Fig. 76 gezeigt und die Ergebnisse einer weiteren Sequenzierung sind in SEQ. ID. Nr. 6 (Fig. 21) bereitgestellt. Das The phage G <d5 was mapped by restriction enzyme cleavage and DNA sequencing. The map obtained is shown in FIG. 7. The phage DNA was digested with Ncol and the fragments cloned into pBBS167. The subclones obtained were screened by PCR to identify those containing sequences corresponding to the 5 'region of the hTRT cDNA. A subclone (pGRN140) containing a 9 kb Ncol fragment (with the hTRT gene sequence and 4 to 5 kb of the lambda vector sequence) was partially sequenced to determine the orientation of the insert. pGRN 140 was cut with Sali to remove lambda vector sequences to give pGRN144. pGRN144 was then sequenced. Preliminary results of sequencing are shown in Figure 76 and the results of further sequencing are shown in SEQ. ID. No. 6 (Fig. 21). The

115 115

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

5'-Ende der hTRT-mRNA entspricht der Base 2441 von SEQ. ID. Nr. 6 (Fig. 21). Wie in Fig. 7 gezeigt, liegen zwei Alu-Sequenzelemente 1700 Basenpaare stromaufwärts von dem 5'-Ende der hTRT-cDNA und diese liefern wahrscheinlich die stromaufwärts gelegene Grenze hinsichtlich des Promotorbereichs von hTRT. Die Sequenz besitzt auch ein Intron, das bei der Base 4173 (SEQ. ID. Nr. 6) (Fig. 21) liegt, 3' gelegen zu dem in dem vorstehenden Beispiel 3 beschriebenen Intron. The 5 'end of the hTRT mRNA corresponds to base 2441 of SEQ. ID. No. 6 (Fig. 21). As shown in Figure 7, two Alu sequence elements are 1700 base pairs upstream of the 5 'end of the hTRT cDNA and these are likely to provide the upstream limit on the promoter region of hTRT. The sequence also has an intron located at base 4173 (SEQ ID NO: 6) (Fig. 21), 3 'to the intron described in Example 3 above.

b) Zusätzliche genomische Clone b) Additional genomic clones

Zusätzlich zu dem vorstehend beschriebenen genomischen Clon werden zwei P1-Bacteriophagenclo-ne und ein menschlicher BAC-Clon als veranschaulichende erfindungsgemässe Ausführungsformen bereitgestellt. Die P1 -Insertionen haben gewöhnlich eine Länge von 75 bis 100 kb und die BAC-Insertio-nen üblicherweise von mehr als 100 kb. In addition to the genomic clone described above, two P1 bacteriophage clones and a human BAC clone are provided as illustrative embodiments of the invention. The P1 insertions usually have a length of 75 to 100 kb and the BAC insertions usually exceed 100 kb.

Die P1-Clone (DMPC-HFF#1-477(F6) -GS#15371 und DMPC-HEF#1-1103(H6) -GS#15372) wurden durch PCR-Screenen einer menschlichen P1-Bank erhalten, die von menschlichen Vorhaut-Fibroblasten-zellen stammte (Shepherd et al., PNAS USA 91 (1994) 2629) wobei die Primer TCP1.12 und UTR2 verwendet wurden, die das 3'-Ende von hTRT amplifizieren. Diese Clone waren beide negativ mit Primern, die das 5'-Ende von hTRT amplifizieren (d.h. es fand keine Amplifikation statt). The P1 clones (DMPC-HFF # 1-477 (F6) -GS # 15371 and DMPC-HEF # 1-1103 (H6) -GS # 15372) were obtained by PCR screening of a human P1 library by human Foreskin fibroblast cells were derived (Shepherd et al., PNAS USA 91 (1994) 2629) using primers TCP1.12 and UTR2 which amplify the 3 'end of hTRT. These clones were both negative with primers that amplify the 5 'end of hTRT (i.e., no amplification took place).

Der menschliche BAC-Clon (326 E 20) wurde mittels eines Hybridisierungs-Screenings einer menschlichen genomischen BAC-Bank mittels eines 1143 bp Sphl/Xmnl-Fragments von SEQ. ID. Nr. 1 (Basen 1552-2695) erhalten, das den RT-Motivbereich umfasst. Es wird davon ausgegangen, dass dieser Clon das 5' enthält. Es wird davon ausgegangen, dass die genomischen hTRT-Clone in diesem Beispiel das gesamte hTRT-Gen umfassen. The human BAC clone (326 E 20) was hybridized to a human genomic BAC library using an 1143 bp Sphl / Xmnl fragment from SEQ. ID. No. 1 (bases 1552-2695) obtained, which includes the RT motif area. This clone is believed to contain the 5 '. It is believed that the genomic hTRT clones in this example encompass the entire hTRT gene.

Beispiel 5 Example 5

Chromosomale Lage des hTRT-Gens Chromosomal location of the hTRT gene

Das hTRT-Gen wurde auf dem Chromosom 5p durch «radiation hybrid»-Kartierung lokalisiert (Boehnke et al., Am. J. Hum. Genet. 49 (1991) 1174 und Walter et al., Nature Genet. 7 (1994) 22) unter Verwendung des «medium resolution Stanford G3 panel» von 83 RH-Clonen des gesamten menschlichen Genoms (erzeugt am Stanford Human Genome Center). Eine menschliche Lymphoblastoid-Zelli-nie (Donor; rM) wurde gegen 10 000 rad Röntgenstrahlen exponiert und dann mit nicht bestrahlten Hamster-Rezipientenzellen (A3) fusioniert. 83 unabhängige Hybridclone aus somatischen Zellen wurden isoliert, wobei jeder Clon ein Fusionsereignis zwischen einer bestrahlten Donorzelle und einer Hamster-Rezipientenzelle darstellt. Die DNA von Tafel G3 wurde zum Ordnen von Markern in dem gewünschten Bereich sowie zur Etablierung der Entfernung zwischen diesen Markem verwendet. The hTRT gene was located on chromosome 5p by radiation hybrid mapping (Boehnke et al., Am. J. Hum. Genet. 49 (1991) 1174 and Walter et al., Nature Genet. 7 (1994) 22 ) using the “medium resolution Stanford G3 panel” of 83 RH clones of the entire human genome (generated at the Stanford Human Genome Center). A human lymphoblastoid cell (donor; rM) was exposed to 10,000 rad X-rays and then fused to non-irradiated hamster recipient cells (A3). 83 independent hybrid clones from somatic cells were isolated, each clone representing a fusion event between an irradiated donor cell and a hamster recipient cell. The DNA from panel G3 was used to order markers in the desired area and to establish the distance between these markers.

Die für die RH-Kartierung verwendeten Primer waren TCP1.12 und UTR2, wobei 45 Cyclen mit Taq-Puffern von Boehringer Mannheim und Taq-Polymerase von Perkin-Elmer verwendet wurden, jeweils 45 Sekunden 94°C, 45 Sekunden 55°C und 45 Sekunden 72°C. Die 83 Pools wurden unabhängig voneinander amplifiziert und 14 (17%) waren positiv hinsichtlich hTRT (durch Auftreten einer Bande von 346 bp). Die Amplifikationsergebnisse wurden dem «Stanford RH server» eingegeben, der dann die Kartenposition 5p und den nächsten Marker, STS D5S678 lieferte. The primers used for RH mapping were TCP1.12 and UTR2, using 45 cycles with Boehringer Mannheim Taq buffers and Perkin-Elmer Taq polymerase, 45 seconds 94 ° C, 45 seconds 55 ° C and 45, respectively Seconds 72 ° C. The 83 pools were amplified independently and 14 (17%) were positive for hTRT (by occurrence of a 346 bp band). The amplification results were entered into the “Stanford RH server”, which then provided the card position 5p and the next marker, STS D5S678.

Durch Abfragen der «Genethon genom mapping» - web site konnte bei der Kartierung ein YAC identifiziert werden, das den STS-Marker D5S678 enthält: CEPH YAC 780_C_3, Grösse: 390 660 kb. Dieses YAC enthielt auch Marker für das Chromosom 17. Dieses Ergebnis zeigte an, dass sich das hTRT-Gen auf Chromosom 5 befindet, nahe dem Telomer-Ende. In einer Reihe von Tumoren gibt es erhöhte Kopienanzahlen für 5p. Das Katzenschrei-Syndrom wurde auch zu Deletionen in diesem Bereich kartiert. By querying the "Genethon genom mapping" website, a YAC was identified during the mapping, which contains the STS marker D5S678: CEPH YAC 780_C_3, size: 390 660 kb. This YAC also contained markers for chromosome 17. This result indicated that the hTRT gene is on chromosome 5, near the telomer end. In a number of tumors there are increased number of copies for 5p. The cat cry syndrome has also been mapped to deletions in this area.

Beispiel 6 Example 6

Entwurf und Konstruktion von Vektoren zur Expression von hTRT-Proteinen und -Polynucleotiden Expression von hTRT in Bakterien Design and construction of vectors for the expression of hTRT proteins and polynucleotides Expression of hTRT in bacteria

Das folgende Beispiel beschreibt ausführlich den Entwurf von hTRT-exprimierenden bakteriellen Expressionsvektoren, mit denen grosse Mengen an biologisch aktivem hTRT mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2) hergestellt werden können. Die Erzeugung von biologisch aktivem hTRT-Protein auf diese Weise ist von Nutzen für die Telomerase-Rekonstitutionsassays, für die Untersuchung von Modulatoren von Telomerase-Aktivität, für die Analyse der Aktivität von neu isolierten Spezies von hTRT, zur Identifizierung und Isolierung von Verbindungen, die spezifisch mit hTRT assoziieren, für die Analyse der Aktivität einer hTRT-Proteinvariante, die, wie vorstehend beschrieben, ortsspezifisch mutiert wurde, und als ein Immunogen, um nur einige Beispiele zu nennen. The following example describes in detail the design of hTRT-expressing bacterial expression vectors with which large amounts of biologically active full-length hTRT (SEQ. ID. No. 2) can be produced. The production of biologically active hTRT protein in this manner is useful for telomerase reconstitution assays, for the study of modulators of telomerase activity, for the analysis of the activity of newly isolated species of hTRT, for the identification and isolation of compounds that associate specifically with hTRT, for the analysis of the activity of an hTRT protein variant that has been site-specifically mutated as described above, and as an immunogen, to name just a few examples.

116 116

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Der bakterielle Expressionsvektor pThioHis A/hTRT The bacterial expression vector pThioHis A / hTRT

Um grosse Mengen an hTRT (SEQ. ID. Nr. 2) mit vollständiger Länge herstellen zu können, wurde der bakterielle Expressionsvektor pThioHis A (Invitrogen, San Diego, CA) als Expressionssystem ausgewählt. Die hTRT-codierende Insertion enthält die Nucleotide 707 bis 4776 der hTRT-lnsertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1). Diese Nucleotidsequenz enthält die vollständige codierende Sequenz des hTRT-Proteins (SEQ. ID. Nr. 2). In order to be able to produce large amounts of full-length hTRT (SEQ. ID. No. 2), the bacterial expression vector pThioHis A (Invitrogen, San Diego, CA) was selected as the expression system. The hTRT-encoding insert contains nucleotides 707 to 4776 of the hTRT insertion in the plasmid pGRN121 (SEQ. ID. No. 1). This nucleotide sequence contains the complete coding sequence of the hTRT protein (SEQ. ID. No. 2).

Dieser erfindungsgemässe Expressionsvektor kann für induzierbare Expressionen in Bakterien entworfen werden. Die Induktion der Expression kann erfolgen, um in E. coli hohe Spiegel eines Fusionsproteins zu codieren, das aus einer spaltbaren, «HIS-tagged» Thioredoxineinheit und dem hTRT-Protein mit vollständiger Länge zusammengesetzt ist. Die Verwendung des Expressionssystems erfolgte im wesentlichen gemäss den Anleitungen des Herstellers. Die Aminosäuresequenz des von dem erfindungsgemässen erhaltenen Vektor-codierten Fusionsproteins wird nachfolgend gezeigt: (-*-) kennzeichnet eine Spaltstelle für Enterokinase; This expression vector according to the invention can be designed for inducible expressions in bacteria. Expression can be induced to encode high levels of a fusion protein in E. coli, which is composed of a cleavable, “HIS-tagged” thioredoxin unit and the full-length hTRT protein. The expression system was used essentially according to the manufacturer's instructions. The amino acid sequence of the vector-encoded fusion protein obtained according to the invention is shown below: (- * -) denotes a cleavage site for enterokinase;

msdkiihltddsfd7dvlkadgailvdfwahwcgpckmiapildeiadeyqgkltvax lridhnpgtapkygirgiptlllfkngevaatxvgalskgqlkefldanlagsgsgdd ddk - * -vpmheleifefaaastqrcvllrtwealapatpampraprcravrsllrshy revlplatfvrrlgpqgwrlvqrgdpaafralvaqclvcvpwdarpppaapsfrqvsc lkelvarvlqrlcergaknvlafgfalldgarggppeapttsvrsylpntvtdalrgs gawglllrrvgddvlvhllarcalfvlvapscayqvcgpplyqlgaatqarppphasg prrrlgcerawnksvreagvplglpapgarrrggsasrslplpkrprrgaapepertp vgqgswahpgrtrc-psdrgfcwsparpaeeatslegalsgtrkshpsvgrqhhagp? stsrpprpwdtfcppvyaetkhflyssgdkeqlrpsfllsslrpsltgarrlvetifl gsrpwmpgtprrlprlpqrywqmrplflellgnhaqcpygvllkthcplraavtpaag vcarexpqgsvaapeeedtdprrlvqllrqhsspwqvygfvraclrrlvppglwgsrh nerrflr-n'tkkf i slgkha:<lslqeltw:o:svrdcawlrrs?gvgcvpaaz:-:rlrez i lakflkwlmsvywellrsffyvtettfqknrlffyrksvwsklqsigirqhlxrvql relseaevrqhrearpalltsrlrfipkpdglrpivnmdywgartfrrexraerlts rvkalfsvlnyerarrpgllgasvlglddihrawrtfvlrvraqdpppelyfvkvdvt gaydtipqdrltevi as 11kpqntycvrryawqkaahghvrkafkshvstltdlqpy mrqfvaklqetsplrdawieqssslneassglfdvflrfmchhavrirgxsyvqcqg ipqgsilstllcslcygdmenklfagirrdglllrlvddfllvtphlthaxtflrtlv rgvpeygcwnlrktwnf pvedealggtafvqmpahglf pwcgllldtrtlevqsdy ssyartsirasltfnrgfkagrnmrrklfgvlrlkchslfldlqvnslqtvctniyki lllqayrfhacvlqlpfhqqvwknptfflrvisdtaslcysilkaknagmslgakgaa gplpseavqwlchqafllkltrhrvtyvpllgslrtaqtqlsrklpgttltaleaaan palpsdfktild msdkiihltddsfd7dvlkadgailvdfwahwcgpckmiapildeiadeyqgkltvax lridhnpgtapkygirgiptlllfkngevaatxvgalskgqlkefldanlagsgsgdd ddk - * -vpmheleifefaaastqrcvllrtwealapatpampraprcravrsllrshy revlplatfvrrlgpqgwrlvqrgdpaafralvaqclvcvpwdarpppaapsfrqvsc lkelvarvlqrlcergaknvlafgfalldgarggppeapttsvrsylpntvtdalrgs gawglllrrvgddvlvhllarcalfvlvapscayqvcgpplyqlgaatqarppphasg prrrlgcerawnksvreagvplglpapgarrrggsasrslplpkrprrgaapepertp vgqgswahpgrtrc-psdrgfcwsparpaeeatslegalsgtrkshpsvgrqhhagp? ? Stsrpprpwdtfcppvyaetkhflyssgdkeqlrpsfllsslrpsltgarrlvetifl gsrpwmpgtprrlprlpqrywqmrplflellgnhaqcpygvllkthcplraavtpaag vcarexpqgsvaapeeedtdprrlvqllrqhsspwqvygfvraclrrlvppglwgsrh nerrflr-n'tkkf i slgkha: <lslqeltw: o: svrdcawlrrs gvgcvpaaz: - rlrez i lakflkwlmsvywellrsffyvtettfqknrlffyrksvwsklqsigirqhlxrvql relseaevrqhrearpalltsrlrfipkpdglrpivnmdywgartfrrexraerlts rvkalfsvlnyerarrpgllgasvlglddihrawrtfvlrvraqdpppelyfvkvdvt gaydtipqdrltevi as 11kpqntycvrryawqkaahghvrkafkshvstltdlqpy mrqfvaklqetsplrdawieqssslneassglfdvflrfmchhavrirgxsyvqcqg ipqgsilstllcslcygdmenklfagirrdglllrlvddfllvtphlthaxtflrtlv rgvpeygcwnlrktwnf pvedealggtafvqmpahglf pwcgllldtrtlevqsdy ssyartsirasltfnrgfkagrnmrrklfgvlrlkchslfldlqvnslqtvctniyki lllqayrfhacvlqlpfhqqvwknptfflrvisdtaslcysilkaknagmslgakgaa gplpseavqwlchqafllkltrhrvtyvpllgslrtaqtqlsrklpgttltaleaaan palpsdfktild

117 117

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

pGEX-2TK mit den hTRT-Nucleotiden 3272 bis 4177 von pGRN121 pGEX-2TK with hTRT nucleotides 3272-4177 from pGRN121

Dieses erfindungsgemässe Konstrukt wird für die Herstellung von Fusionsprotein verwendet, beispielsweise um polyclonaie und monoclonale Antikörper gegen das hTRT-Protein erhalten zu können. This construct according to the invention is used for the production of fusion protein, for example in order to be able to obtain polyclonal and monoclonal antibodies against the hTRT protein.

5 Fragmente von hTRT können auch für andere Zwecke verwendet verwendet werden, beispielsweise zur Modulation von Telomerase-Aktivität, z.B. als eine dominant-negative Mutante oder um die Assoziierung von Telomerase mit anderen Proteinen oder Nucleinsäuren zu verhindern. 5 fragments of hTRT can also be used for other purposes, e.g. for modulating telomerase activity, e.g. as a dominant-negative mutant or to prevent association of telomerase with other proteins or nucleic acids.

Zur Produktion grosser Mengen eines hTRT-Proteinfragments wurde der E. coli-Expressionsvektor pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.) ausgewählt und im wesentlichen nach den Anleitun-10 gen des Herstellers verwendet. Damit wurde ein erfindungsgemässes Expressionssystem hergestellt. Das erhaltene Konstrukt enthält eine Insertion, die von den Nucleotiden 3272 bis 4177 der hTRT-lnsertion im Plasmid pGRN121 stammt. Der Vektor steuert die Expression von hohen Spiegeln eines Fusionsproteins in E. coli, das aus der Glutathion-S-Transferase-Sequenz (nachstehend unterstrichen), der Spalt-Sequenz für Thrombin (doppelt unterstrichen), der Erkennungssequenz für Herzmuskel-Proteinki-15 nase (kursiv), durch Clonierung eingeführte Reste (in Klammern, GSVTK) und dem hTRT-Proteinfrag-ment (in Fettdruck) (SEQ. ID. Nr. 38) wie nachfolgend gezeigt, zusammengesetzt ist: For the production of large amounts of an hTRT protein fragment, the E. coli expression vector pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.) was selected and used essentially according to the instructions of the manufacturer. An expression system according to the invention was thus produced. The construct obtained contains an insert derived from nucleotides 3272 to 4177 of the hTRT insertion in the plasmid pGRN121. The vector controls the expression of high levels of a fusion protein in E. coli, consisting of the glutathione-S-transferase sequence (underlined below), the cleavage sequence for thrombin (double underlined), the recognition sequence for cardiac muscle protein ki-15 nose (italics), residues introduced by cloning (in brackets, GSVTK) and the hTRT protein fragment (in bold) (SEQ. ID. No. 38) as shown below:

MSPILGYWKIKGLVOPTRLLLEYLES:<YEEHLYERDgGnKWRNK:<?ET.(;r.f:fpkn.pw 20 ISGDVKLTOSMAIIRYIADKKNMLGGCPKE^AET.qMLEGAVLDIRYGV.qSTAy.qyn?? TLyy!3?LS:<I,?EML:<M?EDRLCK:<TYLNGDKVTHPDFMLYDALDWLYMnPMrT.na-3 MSPILGYWKIKGLVOPTRLLLEYLES: <YEEHLYERDgGnKWRNK: <? ET. (; Rf: fpkn.pw 20 ISGDVKLTOSMAIIRYIADKKNMLGGCPKE ^ AET.qMLEGAVLDIRYGV.qSTAy.qyn LSLYDMLD? 3rd

KLVCr:<KRI5AIPOIDKYLKSSKYIAWPLOGWQATFGGGDK?P:<SDLVPRGfigga.<7y f KLVCr: <KRI5AIPOIDKYLKSSKYIAWPLOGWQATFGGGDK? P: <SDLVPRGfigga. <7y f

GSVTK]IPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKT 25 FLRTLVRGVPEYGCWNLRKTWNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTL EVQSDYSSYARTSIRASVTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVC TNIYXILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILXAKNAGMSL GAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTA GSVTK] IPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKT 25 FLRTLVRGVPEYGCWNLRKTWNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTL EVQSDYSSYARTSIRASVTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVC TNIYXILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILXAKNAGMSL GAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTA

30 LEAAANPALPSDFKTILD 30 LEAAANPALPSDFKTILD

Bei der Expression dieses Fusionsproteins wurden unlösliche Aggregate gebildet. Es wurde allgemein wie vorstehend im Abschnitt «Reinigung von Proteinen aus Einschlusskörperchen» behandelt. Dabei 35 wurden induzierte Zellen in PBS (20 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,4 und 150 mM NACI) suspendiert und durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen. NP-40 wurde bis zu 0,1% zugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei 4°C unter leichtem Mischen inkubiert. Das unlösliche Material wurde durch 30minütige Zentrifugation mit 25 000 g bei 4°C gewonnen. Das unlösliche Material wurde einmal in 4 M Harnstoff in PBS gewaschen, durch Zentrifugation gewonnen und dann erneut in PBS gewaschen. Es wurde ge-40 schätzt, dass das gewonnene Pellet mehr als 75% Fusionsprotein enthielt. Dieses Material wurde in einem Vakuum schnell getrocknet, danach für die Injektion in Mäuse und Kaninchen zur Erzeugung von Antikörpern in einem Adjuvans suspendiert. Die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Gluta-thion-S-Transferase-Einheit wird durch ortsspezifische Proteolyse mittels Thrombin gemäss den Anleitungen des Herstellers durchgeführt. When this fusion protein was expressed, insoluble aggregates were formed. It was treated generally as described above in the section “Purifying proteins from inclusion bodies”. In this case, induced cells were suspended in PBS (20 mM sodium phosphate, pH 7.4 and 150 mM NACI) and broken up by ultrasound treatment. NP-40 was added up to 0.1% and the mixture incubated for 30 minutes at 4 ° C with gentle mixing. The insoluble material was obtained by centrifugation at 25,000 g at 4 ° C for 30 minutes. The insoluble material was washed once in 4 M urea in PBS, collected by centrifugation and then washed again in PBS. The pellet recovered was estimated to contain more than 75% fusion protein. This material was quickly dried in a vacuum, then suspended in an adjuvant for injection into mice and rabbits to generate antibodies. The recombinant protein is separated from the glutathione S-transferase unit by site-specific proteolysis using thrombin in accordance with the manufacturer's instructions.

45 45

pGEX-2TK mit den Nucleotiden 2426 bis 3274 von pGRN121 mit einem «HIS-8-Tag» pGEX-2TK with nucleotides 2426 to 3274 of pGRN121 with an «HIS-8 tag»

Zur Herstellung grosser Mengen eines Fragments von hTRT wurde ein weiteres E. coli-Expressions-vektor pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.)-Konstrukt hergestellt. Dieses Konstrukt enthält 50 eine Insertion, die von den Nucleotiden 2426 bis 3274 der hTRT-lnsertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) und eine Sequenz, die acht aufeinanderfolgende Histidinreste codiert (HIS-8-Tag). Um dieses «HIS-8-Tag» zu inserieren, wurde der Vektor pGEX-2TK mit den hTRT-Nucleotiden 2426 bis 3274 von pGRN121 mit BamHI linearisiert. Dadurch wird das Plasmid an der Verbindung zwischen GST-Throm-bin-Herzmuskelproteinase und der hTRT codierenden Sequenz geöffnet. Zu dem linearisierten Plasmid 55 wurde ein doppelsträngiges Oligonucleotid mit BamHI-kompatiblen Enden, wie dies in der nachstehend gezeigten Sequenz zu sehen ist, ligiert, was die Einführung von acht Histidin-Resten stromaufwärts der hTRT-Sequenz im Leserahmen ergab. Another E. coli expression vector pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.) construct was produced to produce large quantities of a fragment of hTRT. This construct contains 50 an insert that consists of nucleotides 2426 to 3274 of hTRT insertion in plasmid pGRN121 (SEQ. ID. No. 1) and a sequence encoding eight consecutive histidine residues (HIS-8 tag). To insert this “HIS-8 tag”, the vector pGEX-2TK was linearized with the hTRT nucleotides 2426 to 3274 of pGRN121 with BamHI. This opens the plasmid at the junction between GST-thrombin-myocardial proteinase and the sequence encoding hTRT. A double-stranded oligonucleotide with BamHI-compatible ends, as seen in the sequence shown below, was ligated to the linearized plasmid 55, which resulted in the insertion of eight histidine residues upstream of the hTRT sequence in the reading frame.

Der Vektor steuert in E. coli die Expression von hohen Spiegeln eines Fusionsproteins, das zusammengesetzt ist aus der Glutathion-S-Transferase-Sequenz (unterstrichen); der Spaltsequenz für Throm-60 bin (doppelt unterstrichen); der Erkennungssequenz für Herzmuskel-Proteinkinase (kursiv); einem Satz von drei und einem Satz von fünf Resten, die durch Clonierung eingeführt wurden (GSV und GSVTK) acht auf einanderfolgenden Histidinen (auch doppelt unterstrichen) und dem hTRT-Proteinfragment (in Fettdruck) (SEQ. ID. Nr. 39): In E. coli, the vector controls the expression of high levels of a fusion protein which is composed of the glutathione-S-transferase sequence (underlined); the cleavage sequence for Throm-60 bin (double underlined); the recognition sequence for cardiac muscle protein kinase (italic); a set of three and a set of five residues introduced by cloning (GSV and GSVTK) eight on successive histidines (also underlined) and the hTRT protein fragment (in bold) (SEQ. ID. No. 39):

65 65

118 118

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

mspilgywkikglvoptrllleyleekyeehlyerdf.gdkwrnkkfelgi.f.fp nt.pyyidodvkt.tosmaiiryiadkhnmlggcpkeraeismlegavldirygvs rtayskdfetlkvdflskt.pemlkmff.dri.chktylngdhvthpdfmlydal dvvlymdpmct.dafpklvcfkkrieaîpoidkylksskytawplogwqatfgg gdhppksplvprgsflflawgsvlhhhhhhhhrgsvtklmsvyvvellrsffyv tettfqknrlffyrpsvwsklqsigirqhlkrvqlrelseaevrqhrearp alltsrlrfipkpdglrpivnmdywgartfrrekraerltsrvkalfsvl nyerarrpgllgasvlglddihrawrtfvlrvraqdpppelyfvkvdvtg mspilgywkikglvoptrllleyleekyeehlyerdf.gdkwrnkkfelgi.f.fp nt.pyyidodvkt.tosmaiiryiadkhnmlggcpkeraeismlegavldirygvs rtayskdfetlkvdflskt.pemlkmff.dri.chktylngdhvthpdfmlydal dvvlymdpmct.dafpklvcfkkrieaîpoidkylksskytawplogwqatfgg gdhppksplvprgsflflawgsvlhhhhhhhhrgsvtklmsvyvvellrsffyv tettfqknrlffyrpsvwsklqsigirqhlkrvqlrelseaevrqhrearp alltsrlrfipkpdglrpivnmdywgartfrrekraerltsrvkalfsvl nyerarrpgllgasvlglddihrawrtfvlrvraqdpppelyfvkvdvtg

AYDTIPQDRLTEVIASnKPQNTYCVRRYAWQKAAHGHVRKAFKSHVSTL AYDTIPQDRLTEVIASnKPQNTYCVRRYAWQKAAHGHVRKAFKSHVSTL

tdlqpymrqfvahlqetsplrdawteqssslneassglfdvflrfmchha vrirgksyvqcqgi tdlqpymrqfvahlqetsplrdawteqssslneassglfdvflrfmchha vrirgksyvqcqgi

Dieser Vektor kann zur Herstellung von Fusionsprotein zur Erzeugung von polyclonalen und monoclonalen Antikörpern gegen ein hTRT-Protein verwendet werden. Dieses Fusionsprotein kann ausserdem dazu verwendet werden, um gegen hTRT-Peptide, die innerhalb des Fusionsproteins enthalten sind, gerichtete Antikörper einer Affinitätsreinigung zu unterwerfen. Die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Glutathion-S-Transferase-Einheit kann durch ortsspezifische Proteolyse mittels Thrombin gemäss den Anweisungen des Herstellers erzielt werden. This vector can be used to produce fusion protein to generate polyclonal and monoclonal antibodies to an hTRT protein. This fusion protein can also be used to affinity purify antibodies directed against hTRT peptides contained within the fusion protein. The recombinant protein can be separated from the glutathione-S-transferase unit by site-specific proteolysis using thrombin in accordance with the manufacturer's instructions.

pGEX-2TK mit den hTRT-Nucleotiden 2426 bis 3274 von pGRN121 ohne «HIS-8-TAG» pGEX-2TK with the hTRT nucleotides 2426 to 3274 of pGRN121 without «HIS-8-TAG»

Zur Herstellung grosser Mengen eines hTRT-Fragments wurde ein anderes E. coli-Expressionsvektor pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.)-Konstrukt hergestellt. Dieses Vektorkonstrukt kann zur Herstellung von Fusionsprotein für die Erzeugung von polyclonalen und monoclonalen Antikörpern gegen das hTRT-Protein verwendet werden. Dieses Fusionsprotein kann ausserdem dazu verwendet werden, gegen hTRT-Peptide, die in dem Fusionsprotein enthalten sind, gerichtete Antikörper einer Affinitätsreinigung zu untenwerfen. Another E. coli expression vector pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.) construct was produced to produce large amounts of an hTRT fragment. This vector construct can be used to produce fusion protein for the generation of polyclonal and monoclonal antibodies against the hTRT protein. This fusion protein can also be used to affinity purify antibodies directed against hTRT peptides contained in the fusion protein.

Dieses Konstrukt enthält eine Insertion, die von den Nucleotiden 2426 bis 3274 der hTRT-lnsertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) stammt, jedoch ohne das «His-8-tag». Der Vektor steuert in E. coli die Expression von hohen Spiegeln eines Fusionsproteins, das zusammengesetzt ist aus Glutathi-on-S-Transferase (unterstrichen), einer Spaltsequenz für Thrombin (doppelt unterstrichen), einer Erkennungssequenz für die Herzmuskel-Proteinkinase (kursiv), durch Clonierung eingeführte Reste (in Klammern, GSVTK) und das hTRT-Proteinfragment (in Fettdruck) (SEQ. ID. Nr. 40): This construct contains an insert derived from nucleotides 2426 to 3274 of the hTRT insertion in plasmid pGRN121 (SEQ. ID. No. 1), but without the "His-8-tag". In E. coli, the vector controls the expression of high levels of a fusion protein which is composed of glutathi-on-S-transferase (underlined), a cleavage sequence for thrombin (double underlined), a recognition sequence for the heart muscle protein kinase (italic), residues introduced by cloning (in brackets, GSVTK) and the hTRT protein fragment (in bold) (SEQ. ID. No. 40):

MSPILGYWKIKGLVOPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYY IDGDVKLTOSMAIIRYIADKHNMT.GGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRTAYSKDFF. TLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDKVTHPDFMLYDALDVVLYMPPMCLPAFP KLVCFKKRIEAIPOrDKYLKSSKYIAWPLOGWOATFGGGDHPPKSnT.VPRGSgRASVr GSVTK] MSVYWELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRPSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRE L S EAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMD YWGARTFRREKRAERLTSRK ALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPEYFVKVDVTGAYD TIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAWQKAAHGVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFV AHLQETSPLRDAWIEQSSSLNEASGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGI MSPILGYWKIKGLVOPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYY IDGDVKLTOSMAIIRYIADKHNMT.GGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRTAYSKDFF. TLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDKVTHPDFMLYDALDVVLYMPPMCLPAFP KLVCFKKRIEAIPOrDKYLKSSKYIAWPLOGWOATFGGGDHPPKSnT.VPRGSgRASVr GSVTK] MSVYWELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRPSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRE L S EAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMD YWGARTFRREKRAERLTSRK ALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPEYFVKVDVTGAYD TIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAWQKAAHGVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFV AHLQETSPLRDAWIEQSSSLNEASGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGI

Die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Glutathion-S-Transferase-Einheit kann durch ortsspezifische Proteolyse mittels Thrombin gemäss den Angaben des Herstellers erzielt werden. The recombinant protein can be separated from the glutathione S-transferase unit by site-specific proteolysis using thrombin in accordance with the manufacturer's instructions.

pGEX-2TK mit den hTRT-Nucleotiden 1625 bis 2458 von gPRN121 pGEX-2TK with the hTRT nucleotides 1625 to 2458 of gPRN121

Zur Herstellung grosser Mengen eines hTRT-Proteinfragments wurde ein weiteres E. coli-Expressionsvektor pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.)-Konstrukt hergestellt. Dieses Vektorkonstrukt kann zur Herstellung von Fusionsprotein zur Erzeugung polyclonaler und monoclonaler Antikörper gegen ein hTRT-Protein verwendet werden. Darüber hinaus kann dieses Fusionsprotein dazu verwendet werden, gegen hTRT-Peptide, die in dem Fusionsprotein enthalten sind, gerichtete Antikörper einer Affinitätsreinigung zu unterwerfen. Another E. coli expression vector pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.) construct was produced to produce large amounts of an hTRT protein fragment. This vector construct can be used to produce fusion protein for generating polyclonal and monoclonal antibodies against an hTRT protein. In addition, this fusion protein can be used to affinity purify antibodies directed against hTRT peptides contained in the fusion protein.

Dieses Konstrukt enthält eine Insertion, die von den Nucleotiden 1625 bis 2458 der hTRT-lnsertion This construct contains an insert from nucleotides 1625 to 2458 of the hTRT insertion

119 119

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) stammt. Der Vektor steuert in E. coli die Expression von hohen Spiegeln eines Fusionsproteins, das zusammengesetzt ist aus Glutathion-S-Transferase (unterstrichen), einer Spaltsequenz für Thrombin (doppelt unterstrichen), einer Erkennungssequenz für Herzmuskel-Pro-teinkinase (kursiv), durch Clonierung eingeführte Reste (in Klammern, GSVTK) und dem hTRT-Protein-fragment (in Fettdruck) (SEQ. ID. Nr. 41): in plasmid pGRN121 (SEQ. ID. No. 1). In E. coli, the vector controls the expression of high levels of a fusion protein which is composed of glutathione-S-transferase (underlined), a cleavage sequence for thrombin (double underlined), a recognition sequence for cardiac muscle protein kinase (italics) Cloning introduced residues (in brackets, GSVTK) and the hTRT protein fragment (in bold) (SEQ. ID. No. 41):

MSPII-GYWKIKGLVOPTRLI .LEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFF.T .GT .F.FP MSPII-GYWKIKGLVOPTRLI .LEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFF.T .GT .F.FP

NLPYYTDGDVKLTQSMAITRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVT.DTRYGV NLPYYTDGDVKLTQSMAITRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVT.DTRYGV

SRIAYSKDFETLKVDFLSKLPF.MLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMI.YDA SRIAYSKDFETLKVDFLSKLPF.MLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMI.YDA

LDWLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPOIDKYLKSSKYIAWPLOGWOATFG LDWLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPOIDKYLKSSKYIAWPLOGWOATFG

GGDHPPKSDLVPRGSfl&4SVrGSVTKlATSLEGALSGTRHSHPSVGROHHAGP GGDHPPKSDLVPRGSfl & 4SVrGSVTKlATSLEGALSGTRHSHPSVGROHHAGP

PSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGÀRR PSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGÀRR

LVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLL LVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLL

KTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPW KTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPW

QVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELT QVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELT

WKMSVRDCAWLRJRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLR WKMSVRDCAWLRJRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLR

S S

Die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Glutathion-S-Transferase-Einheit wird durch ortsgerichtete Proteolyse mittels Thrombin gemäss den Anweisungen des Herstellers erzielt. The recombinant protein is separated from the glutathione-S-transferase unit by site-directed proteolysis using thrombin in accordance with the manufacturer's instructions.

pGEX-2TK mit den hTRT-Nucleotiden 782 bis 1636 von pGRN121 pGEX-2TK with hTRT nucleotides 782-1636 from pGRN121

Zur Herstellung grosser Mengen eines hTRT-Proteinfragments wurde ein weiteres E. coli-Expressi-onsvektor pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.)-Konstrukt hergestellt. Dieses Vektorkon-strukt kann zur Herstellung von Fusionsprotein zur Erzeugung polyclonaler und monoclonaler Antikörper gegen ein hTRT-Protein verwendet werden. Darüber hinaus kann dieses Fusionsprotein dazu verwendet werden, gegen hTRT-Peptide, die in dem Fusionsprotein enthalten sind, gerichtete Antikörper einer Affinitätsreinigung zu unterwerfen. Another E. coli expression vector pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.) construct was produced to produce large amounts of an hTRT protein fragment. This vector construct can be used to produce fusion protein for generating polyclonal and monoclonal antibodies against an hTRT protein. In addition, this fusion protein can be used to affinity purify antibodies directed against hTRT peptides contained in the fusion protein.

Dieses Konstrukt enthält eine Insertion, die von den Nucleotiden 782 bis 1636 der hTRT-lnsertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) stammt. Der Vektor steuert in E. coli die Expression von hohen Spiegeln eines Fusionsproteins, das zusammengesetzt ist aus Glutathion-S-Transferase (unterstrichen), einer Spaitsequenz für Thrombin (doppelt unterstrichen), einer Erkennungssequenz für Herzmuskel-Pro-teinkinase (kursiv), durch Clonierung eingeführte Reste (in Klammern, GSVTK) und einem hTRT-Pro-teinfragment (in Fettdruck) (SEQ. ID. Nr. 42): This construct contains an insert derived from nucleotides 782 to 1636 of hTRT insertion in plasmid pGRN121 (SEQ. ID. No. 1). In E. coli, the vector controls the expression of high levels of a fusion protein which is composed of glutathione-S-transferase (underlined), a spa sequence for thrombin (double underlined), a recognition sequence for cardiac muscle protein kinase (italics) Cloning introduced residues (in brackets, GSVTK) and an hTRT protein fragment (in bold) (SEQ. ID. No. 42):

MSPILGYWXIKGT.VOPTRLLLEYLEEXyEEHLYERPF.GDKWRNXKFELGLEFPNLPYY IDGDVKLTOSMATIRYIADXHNMLGGCPKERAEISN'.LEGAVLDIRYGVSRTAYSXDFE TLXVDFLSXLPEMLKMFEDRLCKKTYLNGntTVTHFDFMLYDALDWLYMDPMCr.nAFP MSPILGYWXIKGT.VOPTRLLLEYLEEXyEEHLYERPF.GDKWRNXKFELGLEFPNLPYY IDGDVKLTOSMATIRYIADXHNMLGGCPKERAEISN'.LEGAVLDIRYGVSRTAYSXDFE TLXLKDTVFDMLRLCLKKDFLFLMLDLCLKKDFLFLMDG

GSVTK]MPRAPRCRAVRSLLSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQ CLVCVPWDARPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPP EATTSVRSYL PNTVTD ALRGS GAWGL L LRRVGDD VLVHLLARCAL FVL VAP CAYQ VC G PPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASR SLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCWSPARPAEEATSL GSVTK] MPRAPRCRAVRSLLSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQ CLVCVPWDARPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPP EATTSVRSYL PNTVTD ALRGS GAWGL L LRRVGDD VLVHLLARCAL FVL VAP CAYQ VC G PPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASR SLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCWSPARPAEEATSL

Die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Glutathion-S-Transferase-Einheit wird durch ortsspezifische Proteolyse mittels Thrombin gemäss den Anleitungen des Herstellers erzielt. The recombinant protein is separated from the glutathione-S-transferase unit by site-specific proteolysis using thrombin in accordance with the manufacturer's instructions.

pT7FLhTRT mit hTRT-cDNA, der die 5'-nicht-codierende Sequenz fehlt pT7FLhTRT with hTRT cDNA lacking the 5 'non-coding sequence

Wie bereits vorstehend beschrieben, stellt die Erfindung in einer Ausführungsform ein hTRT bereit, das zur Erleichterung der Clonierung in bakterielle, Säuger-, Hefe- und Insekten-Expressionsvektoren auf ortsgerichtete Weise modifiziert ist und keine 5'-untranslatierte hTRT-Sequenz enthält. Unter manchen Umständen erlaubt die Minimierung der Menge an nicht-Protein-codierender Sequenz die verbesserte Proteinherstellung (Ausbeute) und führt zu einer erhöhten mRNA-Stabilität. In dieser erfindungsge- As described above, in one embodiment, the invention provides an hTRT that is site-modified to facilitate cloning in bacterial, mammalian, yeast, and insect expression vectors and does not contain a 5'-untranslated hTRT sequence. In some circumstances, minimizing the amount of non-protein coding sequence allows for improved protein production (yield) and leads to increased mRNA stability. In this invention

120 120

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

mässen Ausführungsform wurde vor der Clonierung in dem bakteriellen Expressionsvektor der 5'-nicht-codierende Bereich von hTRT entfernt. According to the embodiment, the 5'-non-coding region of hTRT was removed in the bacterial expression vector before cloning.

Dies wurde durch Erzeugung einer zusätzlichen Restriktionsschnittstelle unmittelbar stromaufwärts (5') von dem Startcodon (ATG) der hTRT-codierenden Sequenz (Fig. 16) bewirkt. Die Erzeugung einer Restriktionsschnittstelle unmittelbar 5' zum codierenden Bereich des Proteins gestattet die effiziente Herstellung einer grossen Anzahl von Vektoren, die Fusionsproteine codieren, beispielsweise Fusionsproteine, die Markierungen und Peptid-»TAGs» enthalten zum Immunnachweis und zur Reinigung. This was accomplished by creating an additional restriction site immediately upstream (5 ') from the start codon (ATG) of the hTRT coding sequence (Fig. 16). The creation of a restriction site immediately 5 'to the coding region of the protein allows the efficient production of a large number of vectors which encode fusion proteins, for example fusion proteins which contain labels and peptide "TAGs" for immunodetection and purification.

In diesem Fall wurde das Oligonucleotid 5'-CCGGCCACCCCCCATATGCCGCGCGCTCCC-3', wie oben beschrieben, zur Modifikation der hTRT-cDNA-Nucleotide 779 bis 781 der hTRT-cDNA (Fig. 16) von GCG zu CAT verwendet. Diese 3 Nucleotide sind die letzten Nucleotide vor dem ATG-Startcodon, somit führt diese Änderung nicht zur Modifikation der Proteinsequenz. Die Sequenzänderung führt zur Erzeugung einer einzigen Ndel-Restriktionsstelle in der hTRT-cDNA. Einzelsträngige hTRT-DNA wurde als eine DNA-Quelle für die ortsgerichtete Mutagenese verwendet. Das erhaltene Plasmid wurde zur Bestätigung einer erfolgreichen Mutagenese sequenziert. In this case, the oligonucleotide 5'-CCGGCCACCCCCCATATGCCGCGCGCTCCC-3 'as described above was used to modify the hTRT cDNA nucleotides 779 to 781 of the hTRT cDNA (Fig. 16) from GCG to CAT. These 3 nucleotides are the last nucleotides before the ATG start codon, so this change does not lead to modification of the protein sequence. The sequence change leads to the creation of a single Ndel restriction site in the hTRT cDNA. Single stranded hTRT DNA was used as a source of DNA for site-directed mutagenesis. The plasmid obtained was sequenced to confirm successful mutagenesis.

Diese Modifikation erlaubte die Konstruktion des nachfolgend beschriebenen erfindungsgemässen Plasmids mit der Bezeichnung pT7FLhTRT. Die ortsspezifisch modifizierte hTRT-Sequenz (Hinzufügung der Ndel-Restriktionsstelle) wurde mit Ndel und Noti gespalten, wobei ein hTRT-Fragment erzeugt wurde. Dieses Fragment wurde danach in ein pSL3418-Plasmid cloniert, das vorher mit Ndel und Smal (auch ein Restriktionsenzym bei dessen Spaltung glatte Enden entstehen) geschnitten worden war, cloniert. pSL 3418 ist ein modifziertes paED4-Plasmid, in das eine FLAG-Sequenz (Immunex Corp. Seattle WA) und eine Enterokinase-Sequenz unmittelbar stromaufwärts von der vorstehend erwähnten Ndel-Stelle inseriert wurden. Dieses Plasmid mit der Bezeichnung pT7FLhTR erlaubt die Expression von hTRT mit vollständiger Länge (mit einem «Flag-Tag» an ihrem 5'-Ende) in einem E. coli Stamm, der T7-RNA-Polymerase exprimiert. This modification allowed the construction of the plasmid according to the invention described below with the name pT7FLhTRT. The site-specifically modified hTRT sequence (addition of the Ndel restriction site) was cleaved with Ndel and Noti, an hTRT fragment being generated. This fragment was then cloned into a pSL3418 plasmid which had previously been cut with Ndel and Smal (also a restriction enzyme whose cleavage results in blunt ends). pSL 3418 is a modified paED4 plasmid into which a FLAG sequence (Immunex Corp. Seattle WA) and an enterokinase sequence have been inserted immediately upstream of the aforementioned Ndel site. This plasmid, called pT7FLhTR, allows full-length expression of hTRT (with a "flag tag" at its 5 'end) in an E. coli strain that expresses T7 RNA polymerase.

Vektor, in dem eine hTRT-codierende Sequenz durch den MPSV-Promotor gesteuert wird Vector in which an hTRT coding sequence is controlled by the MPSV promoter

Die Erfindung stellt auch einen Säuger-Expressionsvektor bereit, in dem hTRT so orientiert ist, dass die hTRT-codierende Sequenz durch den MPSV-Promotor (nachstehend beschrieben) gesteuert wird. Ein EcoRI-Restriktionsfragment von pGRN137, das den hTRT-ORF enthält, wurde in die EcoRI-Stelle von pBBS212 (siehe nachstehend) cloniert, wodurch der 5'-untranslatierte Bereich (5'-UTR) von hTRT entfernt wurde (pGRN137 wurde durch Ausschneiden eines Sall-Sse8387 I-Fragments von pGRN130 (nachstehend beschrieben), das die Kozak-Mutation von hTRT. In den Sall-SSE 83871-Stellen von pGRN136 enthält, konstruiert, wodurch ein Säuger-Expressionsplasmid entsteht, das hTRT (eine «Kozak-Consensus»-Sequenz enthält) von dem MPSV-Promotor exprimiert) (pGRN136 wurde durch Ausschneiden eines Hindlll-Sall-Fragments von pGRN126 konstruiert, das den hTRT-ORF enthält und Clonierung in die Hindlll-Sall-Stellen von pBBS242. Dadurch entsteht ein Säugerexpressionsplasmid, das hTRT vom MPSV-Promotor exprimiert). Dadurch wurde ein Säuger-Expressionsplasmid mit der Bezeichnung pGRN145 erhalten, das hTRT mit einer «Kozak-Consensus»-Sequenz unter Verwendung des MPSV-Promotors exprimiert. Siehe auch den pGRN152-MPSV-Promotor gesteuerten Säuger-Expressionsvektor, der nachstehend beschrieben wird. The invention also provides a mammalian expression vector in which hTRT is oriented so that the hTRT coding sequence is controlled by the MPSV promoter (described below). An EcoRI restriction fragment from pGRN137 containing the hTRT ORF was cloned into the EcoRI site of pBBS212 (see below), thereby removing the 5'-untranslated region (5'-UTR) from hTRT (pGRN137 was excised) a Sall-Sse8387 I fragment of pGRN130 (described below) that contains the Kozak mutation of hTRT, constructed in the Sall-SSE 83871 sites of pGRN136, to produce a mammalian expression plasmid called hTRT (a «Kozak- Consensus sequence contains) from the MPSV promoter (pGRN136 was constructed by cutting out a Hindlll-Sall fragment from pGRN126 containing the hTRT-ORF and cloning into the Hindlll-Sall sites of pBBS242. This produces a mammalian expression plasmid expressing hTRT from the MPSV promoter). This gave a mammalian expression plasmid called pGRN145, which expresses hTRT with a “Kozak Consensus” sequence using the MPSV promoter. See also the mammalian expression vector, pGRN152-MPSV promoter, which is described below.

Plasmide mit hTRT-cDNA, der die 3'-nicht-codierende Sequenz fehlt Plasmids with hTRT cDNA lacking the 3 'non-coding sequence

Wie bereits vorstehend diskutiert, stellt die Erfindung TRTcodierende Nucleinsäuren enthaltende Ex-presionsvektoren bereit, in denen einige oder alle nicht-codierenden Sequenzen deletiert wurden. Unter manchen Umständen erlaubt die Minimierung der Menge an nicht-Protein-codierender Sequenz die verbesserte Proteinproduktion (Ausbeute) und sie erhöht die mRNA-Stabilität. In dieser erfindungsgemässen Ausführungsform wurde vor der Clonierung in das bakterielle Expressionsplasmid der 3"-nicht-trans-latierte Bereich von hTRT deletiert. As discussed above, the invention provides expression vectors containing TRT-encoding nucleic acids in which some or all of the non-coding sequences have been deleted. In some circumstances, minimizing the amount of non-protein coding sequence allows for improved protein production (yield) and increases mRNA stability. In this embodiment according to the invention, the 3 "untranslated region of hTRT was deleted before cloning into the bacterial expression plasmid.

Das Plasmid pGRN121, das hTRT-cDNA mit vollständiger Länge, wie vorstehend diskutiert, enthält, wurde zuerst hinsichtlich aller APAI-Stellen deletiert. Danach folgte die Deletion des MscI-Hincll-hTRT-Restriktionsfragments, das den 3-'UTR enthält. Das Ncol-Xbal-Fragment, das das Stopcodon von hTRT enthält, wurde dann in die Ncol-Xbal-Stelle von pGRN121 inseriert, wobei ein Plasmid mit der Bezeichnung pGRN124 erhalten wurde, das äquivalent zu pGRN121 ist, ausser dass ihm der 3"-UTR fehlt. Plasmid pGRN121, which contains full length hTRT cDNA as discussed above, was first deleted for all APAI sites. This was followed by the deletion of the MscI-Hincll-hTRT restriction fragment, which contains the 3-'UTR. The Ncol-Xbal fragment containing the stop codon of hTRT was then inserted into the Ncol-Xbal site of pGRN121 to give a plasmid called pGRN124, which is equivalent to pGRN121, except that it was 3 "- UTR is missing.

Bakterielle Expressionsvektoren mit Antibiotika-Selektionsmarkern Bacterial expression vectors with antibiotic selection markers

Die Erfindung stellt auch bakterielle Expressionsvektoren bereit, die Selektionsmarker zur Verleihung eines selektierbaren Phänotyps in transformierten Zellen enthält, und Sequenzen, die für die Beibehaltung des Vektors als Episom und Replikation codieren, so dass die Integration in das Wirtsgenom nicht erforderlich ist. Beispielsweise kann der Marker die Biotikaresistenz codieren, beispielsweise Resistenz gegen Chloramphenicol (siehe Harrod, Nucleic Acids Res. 25 (1997), 1720-1726), Kanamycin, G418, Bleomycin und Hygromycin, was die Selektion der Zellen erlaubt, die mit den gewünschten DNA-Se- The invention also provides bacterial expression vectors containing selection markers for conferring a selectable phenotype in transformed cells and sequences encoding the maintenance of the vector as an episome and replication so that integration into the host genome is not required. For example, the marker can encode biotic resistance, for example resistance to chloramphenicol (see Harrod, Nucleic Acids Res. 25 (1997), 1720-1726), Kanamycin, G418, bleomycin and hygromycin, which allows the selection of the cells that contain the desired DNA -Se-

121 121

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

quenzen transformiert wurden; siehe beispielsweise Blondelet-Rouault, Gene 190 (1997), 315-317 und Mahan, Proc. Nati. Acad. Sei. USA 92 (1995), 669-673. sequences were transformed; see, for example, Blondelet-Rouault, Gene 190 (1997), 315-317 and Mahan, Proc. Nati. Acad. Be. USA 92: 669-673 (1995).

In einer erfindungsgemässen Ausführungsform wurde die hTRT mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 1) in einen modifizierten «BlueScript»-Plasmidvektor (Stratagene, San Diego, CA) cloniert, der die Bezeichnung pBBS235 trägt, und in dem ein Resistenzgen für das Antibiotikum Chloramphenicol inseriert worden war. Das Notl-Fragment von pGRN124 (vorstehend diskutiert), das den hTRT-ORF enthält, wurde in die Notl-Stelle von pBBS235 cloniert, so dass der TRT-ORF in der umgekehrten Richtung bezogen auf den lac-Promotor des Vektors vorliegt. Dadurch entsteht ein Plasmid, das für die Mutagenese von Plasmidinsertionen geeignet ist, beispielsweise den erfindungsgemässen TRT-Nucleinsäuren. Dieses Plasmidkonstrukt mit der Bezeichnung pGPN125 wird in den erfindungsgemässen Verfahren verwendet, die Mutagenese von Telomerase-Enzym und TRT-Protein codierenden Sequenzen beinhalten. Es kann auch für die in vitro-Transkription von hTRT mittels des T7-Promotors und die in vitro-Tran-skription von «antisense»-hTRT mittels des T3-Promotors verwendet werden. In one embodiment according to the invention, the full-length hTRT (SEQ. ID. No. 1) was cloned into a modified “BlueScript” plasmid vector (Stratagene, San Diego, CA), which bears the designation pBBS235, and in which a resistance gene for the Antibiotic chloramphenicol had been inserted. The NotI fragment of pGRN124 (discussed above) containing the hTRT ORF was cloned into the NotI site of pBBS235 so that the TRT ORF is in the opposite direction to the lac promoter of the vector. This creates a plasmid which is suitable for the mutagenesis of plasmid insertions, for example the TRT nucleic acids according to the invention. This plasmid construct with the name pGPN125 is used in the methods according to the invention which include mutagenesis of telomerase enzyme and sequences coding for TRT protein. It can also be used for the in vitro transcription of hTRT using the T7 promoter and the in vitro transcription of "antisense" hTRT using the T3 promoter.

In einer weiteren erfindungsgemässen Ausführungsform wurden die hTRT-ORF enthaltenden Notl-Re-striktionsfragmente von pGRN124 in die Notl-Stelle von pBBS235 (nachstehend beschrieben) subclo-niert, so dass der TRT-ORF die gleiche Orientierung hat wie der lac-Promotor des Vektors. Dadurch entsteht ein Plasmid mit der Bezeichnung pGRN126, das zur Expression von hTRT mit vollständiger Länge in E. coli verwendet werden kann. Das exprimierte Produkt enthält 29 Aminosäuren, die von dem Vektor pBBS235 codiert werden, woran sich 18 Aminosäuren anschliessen, die von dem 5'-UTR von hTRT codiert werden und danach folgt das hTRT-Protein mit vollständiger Länge. In a further embodiment according to the invention, the hTRT-ORF-containing NotI restriction fragments of pGRN124 were subcloned into the Notl site of pBBS235 (described below), so that the TRT-ORF has the same orientation as the lac promoter of the vector . This creates a plasmid called pGRN126 that can be used to express full-length hTRT in E. coli. The expressed product contains 29 amino acids encoded by the vector pBBS235, followed by 18 amino acids encoded by the 5'-UTR of hTRT, followed by the full-length hTRT protein.

In einer weiteren erfindungsgemässen Ausführungsform wurde zur Konvertierung des ATG-Initiations-codons von hTRT in einem «Kozak-Consensus»-Sequenz und zur Erzeugung von EcoRI- und Bglll-Re-striktionsschnittstellen zur Erleichterung der Clonierung in die bakteriellen Expressionsvektoren eine in vitro-Mutagenese von pGRN125 durchgeführt. In a further embodiment according to the invention, an in vitro mutagenesis was carried out for converting the ATG initiation codon from hTRT in a “Kozak consensus” sequence and for generating EcoRI and BglII restriction interfaces to facilitate cloning into the bacterial expression vectors carried out by pGRN125.

Bei dieser Mutagenese-Prozedur wurde das Oligonucleotid In this mutagenesis procedure, the oligonucleotide

5'-T GCGCACGTGGGAAGCCCT GGCagatctgAatt CcaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3' 5'-T GCGCACGTGGGAAGCCCT GGCagatctgAatt CcaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3 '

(SEQ. ID. Nr. 43) verwendet. Dieser neue Expressionsvektor erhielt die Bezeichnung pGRN127. (SEQ. ID No. 43) is used. This new expression vector was named pGRN127.

In einer weiteren erfindungsgemässen Ausführungsform wurde das zweite Asp des TRT-«DD-Motivs» (vorstehend beschrieben) zu einem Alanin umgewandelt, um ein nicht-funktionelles Telomerase-Enzym zu erzeugen und damit ein Mutanten-TRT-Protein zur Verwendung in Experimenten mit dominant/negativen Mutanten. hTRT (SEQ. ID. Nr. 1) wurde in vitro mutagenisiert mit dem Oligonucleotid In a further embodiment according to the invention, the second Asp of the TRT “DD motif” (described above) was converted to an alanine in order to generate a non-functional telomerase enzyme and thus a mutant TRT protein for use in experiments with dominant / negative mutants. hTRT (SEQ. ID No. 1) was mutagenized in vitro with the oligonucleotide

5 ' - CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCA C CTCACC-3" 5 '- CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCA C CTCACC-3 "

(SEQ. ID. Nr. 44), um das Asparagin bei dem Rest 869 (Asp869) (von SEQ. ID. Nr. 2) zu einem Alanin (Ala)-Codon umzuwandeln. Dadurch wurde auch eine Mlul-Restriktionsschnittstelle erzeugt. Dieses Expressionsplasmid erhielt die Bezeichnung pGRN130 und enthält auch die «Kozak-Consensus»-Se-quenz wie für pGRN127 beschrieben. (SEQ. ID # 44) to convert the asparagine at residue 869 (Asp869) (from SEQ. ID # 2) to an alanine (Ala) codon. This also created a Mlul restriction site. This expression plasmid was given the designation pGRN130 and also contains the “Kozak Consensus” sequence as described for pGRN127.

Die Erfindung stellt auch einen Vektor bereit, der zur Expression eines «antisense»-Sequenzfrag-ments von hTRT entworfen wurde. Das Plasmid pGRN126 wurde mit den Restriktionsenzymen Mscl und Sma! vollständig gespalten und erneut ligiert, wobei über 95% des hTRT-ORF in Säugerzellen deletiert wurden. Ein Smal-MscI-Fragment wurde während dieses Prozesses, um wieder CAT-Aktivität zu erzeugen, erneut inseriert. Dieses ungereinigte Plasmid wurde dann erneut mit Sali und EcoRI geschnitten und das Initiationscodon von hTRT enthaltende Fragment in die Sall-EcoRI-Schnittstellen von pBBS212 (vorstehend beschrieben) inseriert. Dadurch entstand ein «antisense»-Expressionsplasmid, das die «antisense»-Sequenz exprimiert, die den 5'-UTR und 73 Basenpaarreste des hTRT-ORF umspannt. Dieses Plasmid erhielt die Bezeichnung pGRN135. The invention also provides a vector designed to express an "antisense" sequence fragment from hTRT. The plasmid pGRN126 was with the restriction enzymes Mscl and Sma! completely cleaved and religated, with over 95% of the hTRT ORF being deleted in mammalian cells. A Smal-MscI fragment was reinserted during this process to generate CAT activity again. This unpurified plasmid was then cut again with Sali and EcoRI and the fragment containing the initiation codon of hTRT was inserted into the SalI-EcoRI sites of pBBS212 (described above). This created an "antisense" expression plasmid that expresses the "antisense" sequence that spans the 5'-UTR and 73 base pair residues of the hTRT-ORF. This plasmid was named pGRN135.

Expression von hTRT-Telomerase in Hefe Expression of hTRT telomerase in yeast

Im folgenden Beispiel wird im Detail die Konstruktion der erfindungsgemässen hTRT-exprimierenden Hefe-Expressionsvektoren zur Produktion grosser Mengen an biologisch aktiver hTRT (SEQ. ID. Nr. 2) mit vollständiger Länge dargestellt. Die Verwendung von biologisch aktiver hTRT in vielen erfindungsgemässen Ausführungen ist vorstehend beschrieben. In the following example, the construction of the hTRT-expressing yeast expression vectors according to the invention for the production of large amounts of biologically active hTRT (SEQ. ID. No. 2) is shown in full length. The use of biologically active hTRT in many embodiments according to the invention has been described above.

Pichia pastoris-Expressionsvektor pPICZ B und hTRT mit vollständiger Länge Pichia pastoris full length pPICZ B and hTRT expression vector

Zur Produktion grosser Mengen an biologisch aktivem hTRT wurde der Pichia pastoris-Expressions-vektor PPICZ B (Invitrogen, San Diego, CA) ausgewählt. Die Insertion für die hTRT-codierende Se122 The Pichia pastoris expression vector PPICZ B (Invitrogen, San Diego, CA) was selected for the production of large amounts of biologically active hTRT. The insertion for the hTRT coding Se122

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

quenz stammte von den Nucleotiden 659 bis 4801 der hTRT-lnsertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1). Diese Nucleotidsequenz enthält die hTRT codierende Sequenz in voller Länge (SEQ. ID. Nr. 2). Dieser Expressionsvektor wurde für die induzierbare Expression von hohen Mengen an unmodifiziertem hTRT-Protein (SEQ. ID. Nr. 2) mit vollständiger Länge in P. pastoris entworfen. Die Expression wird von einem Hefepromotor gesteuert, die exprimierte Sequenz verwendet jedoch die hTRT-lnitiations- und Ter-minationscodons. Keine exogenen Codons wurden durch die Clonierung eingeführt. Der erhaltene Vektor PPICZ B/hTRT (Invitrogen, San Diego, CA) wurde zur Transformation der Hefe verwendet. The sequence was derived from nucleotides 659 to 4801 of the hTRT insertion in plasmid pGRN121 (SEQ. ID. No. 1). This nucleotide sequence contains the full-length hTRT coding sequence (SEQ. ID. No. 2). This expression vector was designed for the inducible expression of large amounts of unmodified hTRT protein (SEQ. ID. No. 2) with full length in P. pastoris. Expression is controlled by a yeast promoter, but the expressed sequence uses the hTRT initiation and termination codons. No exogenous codons were introduced by cloning. The resulting PPICZ B / hTRT vector (Invitrogen, San Diego, CA) was used to transform the yeast.

Pichia pastoris-Expressionsvektor hTRT-His6/pPICZ B Pichia pastoris expression vector hTRT-His6 / pPICZ B

Ein zweiter erfindungsgemässer Pichia pastoris-Expressionsvektor, der von pPICZ B (Invitrogen, San Diego, CA) abgeleitet war, enthält auch die hTRT codierende Sequenz mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2), die von den Nucleotiden 659 bis 4801 der hTRT-lnsertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) stammt. Dieser Expressionsvektor hTRT-His6/pPICZ B codiert das hTRT-Protein (SEQ. ID. Nr. 2) mit vollständiger Länge und fusioniert mit dem Myc-Epitop- und His6-Reportersequenzen an seinem C-Terminus. Das hTRT-Stopcodon wurde entfernt und durch Vektorsequenzen ersetzt, die das Myc-Epitop und das His6-Reporter—tag» sowie ein Stopcodon codieren. Dieser Vektor wurde zur Steuerung der induzierbaren Expression des nachfolgenden Fusionsproteins mit hohen Spiegeln in Hefe entworfen, wobei dieses Fusionsprotein aus hTRT-Sequenz (unterstrichen), Vektorsequenzen (in Klammern L und NS-AVD) dem Myc-Epitop (doppelt unterstrichen) und dem His6-«tag» (kursiv) (SEQ. ID. Nr. 45) besteht: A second Pichia pastoris expression vector according to the invention, which was derived from pPICZ B (Invitrogen, San Diego, CA), also contains the full-length hTRT coding sequence (SEQ. ID. No. 2), which is derived from nucleotides 659 to 4801 of the hTRT insertion in plasmid pGRN121 (SEQ. ID. No. 1). This hTRT-His6 / pPICZ B expression vector encodes the full-length hTRT protein (SEQ. ID. No. 2) and fuses with the Myc epitope and His6 reporter sequences at its C-terminus. The hTRT stop codon was removed and replaced by vector sequences encoding the Myc epitope and the His6 reporter tag, as well as a stop codon. This vector was designed to control the inducible expression of the subsequent high level fusion protein in yeast, this fusion protein comprising the hTRT sequence (underlined), vector sequences (in brackets L and NS-AVD), the Myc epitope (double underlined) and the His6 - «day» (italics) (SEQ. ID. No. 45) exists:

mpraprcravrsllrshyrevlplatfvrrlgpogwrlvorodpaafraiva oci.vcvpwdarpppaapsfrovsclkelvarvi.orlcergaknvlafgfat.r. mpraprcravrsllrshyrevlplatfvrrlgpogwrlvorodpaafraiva oci.vcvpwdarpppaapsfrovsclkelvarvi.orlcergaknvlafgfat.r.

dgarggppeafttsvrsylpntvtdalrgsgawglllrrvgddvlvhllarc alfvlvapscayovcgpplyolgaatoarppphasgprrrlgcerawhhsvr eagvplglpapgarrrggsasrslplpkrprrgaapepertpvgogswahpgr trgpsdrgfcwsparpaefatslegalsgtrhshpsvgrohhagppstsrppr pwdtpcppvyaetkhflyssgdkfolrpsfllsslrpsltgarrlvetiflgsrp wmpgtprrlprlporywomrplflellgnhaocpygvllkthcplraavtpa agvcarekpogsvaapeeedtdprrlvqllrohsspwovygfvraclrrlvp pglwgsrhnerrflrntkkfislgkhaklsloeltwkmsvrdcawlrrspgv gcvpaaehrlrffii.akflhwlmsvywellrsffyvtettfoknrlffyrks vwsklosrgirohlkrvolrelseaevrohrearpalltsrlrftpkpdglrprv nmdywgartfrrekraerltsrvkalfsvlnyf.rarrpgllgasvlglddih rawrtfvlrvraodpppelyfvkvdvtgaydtipodrlteviashkpontycv rryavvokaahghvrkafkshvsti.tdlopymrofvahloftsplrdawie ossslneassglfdvflrfmchhavrirgksyvocogipogsilstllcslcygd menklfagirrdgrjj-rivddfllvtphlthaktflrtlvrgvpfygcvvnt.r ktvvnfpvedeai.ggtafvqmpahglfpwcgllr.dtrtlevosdyssyart.si rasltfnrgfkagrnmrrklfgvlrlkchslfldlovnslotvctn1ykillt.o dgarggppeafttsvrsylpntvtdalrgsgawglllrrvgddvlvhllarc alfvlvapscayovcgpplyolgaatoarppphasgprrrlgcerawhhsvr eagvplglpapgarrrggsasrslplpkrprrgaapepertpvgogswahpgr trgpsdrgfcwsparpaefatslegalsgtrhshpsvgrohhagppstsrppr pwdtpcppvyaetkhflyssgdkfolrpsfllsslrpsltgarrlvetiflgsrp wmpgtprrlprlporywomrplflellgnhaocpygvllkthcplraavtpa agvcarekpogsvaapeeedtdprrlvqllrohsspwovygfvraclrrlvp pglwgsrhnerrflrntkkfislgkhaklsloeltwkmsvrdcawlrrspgv gcvpaaehrlrffii.akflhwlmsvywellrsffyvtettfoknrlffyrks vwsklosrgirohlkrvolrelseaevrohrearpalltsrlrftpkpdglrprv nmdywgartfrrekraerltsrvkalfsvlnyf.rarrpgllgasvlglddih rawrtfvlrvraodpppelyfvkvdvtgaydtipodrlteviashkpontycv rryavvokaahghvrkafkshvsti.tdlopymrofvahloftsplrdawie ossslneassglfdvflrfmchhavrirgksyvocogipogsilstllcslcygd menklfagirrdgrjj-rivddfllvtphlthaktflrtlvrgvpfygcvvnt.r ktvvnfpvedeai.ggtafvqmpahglfpwcgllr.dtrtlevosdyssyart.si rasltfnrgfkagrnmrrklfgvlrlkchslfldlovnslotvctn1ykillt.o

AGPLPSEAVOWTCHOAFLLKr.TRHRVTYVPr.T GST.RTA.OTOLSRKLPGTTI.TA LEAAAXPAl.PSnFKTU nrLlEOKLISEF.Dr.rNSAVTÏÏHHHHHH AGPLPSEAVOWTCHOAFLLKr.TRHRVTYVPr.T GST.RTA.OTOLSRKLPGTTI.TA LEAAAXPAl.PSnFKTU nrLlEOKLISEF.Dr.rNSAVTÏÏHHHHHH

Expression von hTRT in Insektenzellen Expression of hTRT in insect cells

Im folgenden Beispiel ist ausführlich die Konstruktion von hTRT-Telomerase exprimierenden Expressionsvektoren für Insektenzellen zur Herstellung grosser Mengen an biologisch aktivem hTRT mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2 und SEQ. ID. Nr. 4) beschrieben. In the following example, the construction of hTRT-telomerase-expressing expression vectors for insect cells for the production of large amounts of biologically active hTRT with full length (SEQ. ID. No. 2 and SEQ. ID. No. 4) is described in detail.

123 123

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Baculovirus-Expressionsvektor pVL1393 und hTRT mit vollständiger Länge Full-length baculovirus expression vector pVL1393 and hTRT

Die gewünschte Telomerase codierende Sequenz wurde in den Baculovirus-Expressionsvektor pVL1393 (Invitrogen, San Diego, CA) cloniert. Dieses Konstrukt wurde danach in Spodoptera fungupei-da (sf-9)-Zellen mit linearisierter DNA des Autograph California-nucleäre-Polyhedrosis-Virus (Baculogold-AcMNPV) cotransfiziert. Die erhaltenen rekombinanten Baculoviren wurden im Anschluss daran plaque-gereinigt und gemäss veröffentlichter Protokolle expandiert. The desired telomerase coding sequence was cloned into the baculovirus expression vector pVL1393 (Invitrogen, San Diego, CA). This construct was then cotransfected in Spodoptera fungupei-da (sf-9) cells with linearized DNA from the Autograph California nuclear-polyhedrosis virus (Baculogold-AcMNPV). The recombinant baculoviruses obtained were then plaque-cleaned and expanded in accordance with published protocols.

Dieser Expressionsvektor erlaubt die Expression von hohen Spiegeln an hTRT-Protein mit vollständiger Länge in Insektenzellen. Die Expression wird von einem Baculovirus-Polyhedrin-Genpromotor gesteuert. Keine exogenen Codons wurden durch die Clonierung eingeführt. This expression vector allows the expression of high levels of full-length hTRT protein in insect cells. Expression is controlled by a baculovirus polyhedrin gene promoter. No exogenous codons were introduced by cloning.

Baculovirus-Expressionsvektor pBlueBacHis2 B und hTRT mit vollständiger Länge Full-length baculovirus expression vector pBlueBacHis2 B and hTRT

Zur Herstellung grosser Mengen an biologisch aktivem hTRT mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2) wurde der Baculovirus-Expressionsvektor pBlueBacHis2 B (Invitrogen, San Diego, CA) als eine Quelle für Kontrollelemente ausgewählt. Die hTRT-codierende Insertion bestand aus den Nucleotiden 707 bis 4776 von der hTRT-lnsertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1), die die hTRT codierende Sequenz mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2) enthält. The baculovirus expression vector pBlueBacHis2 B (Invitrogen, San Diego, CA) was selected as a source of control elements to produce large amounts of biologically active full-length hTRT (SEQ. ID. No. 2). The hTRT-coding insert consisted of nucleotides 707 to 4776 from the hTRT insertion in plasmid pGRN121 (SEQ. ID. No. 1), which contains the full-length hTRT coding sequence (SEQ. ID. No. 2).

Ein hTRT mit vollständiger Länge mit einem His6- und «anti-Xpress tags» (Invitrogen) wurde ebenfalls konstruiert. Dieser Vektor enthält eine Insertion, die aus den Nucleotiden 707 bis 4776 der hTRT-lnsertion von Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) besteht. Dieser Vektor steuert die Expression von hohen Spiegeln an hTRT-Protein mit vollständiger Länge, das an ein spaltbares 6-Histidin und «anti-Xpress tags» fusioniert ist in Insektenzellen. Die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins ist nachstehend gezeigt; (-*-) kennzeichnet eine Spaltstelle für Enterokinase: A full length hTRT with His6 and anti-Xpress tags (Invitrogen) was also constructed. This vector contains an insert consisting of nucleotides 707 to 4776 of the hTRT insertion of plasmid pGRN121 (SEQ. ID. No. 1). This vector controls the expression of high levels of full-length hTRT protein fused to a cleavable 6-histidine and anti-Xpress tags in insect cells. The amino acid sequence of the fusion protein is shown below; (- * -) indicates a cleavage site for enterokinase:

MPRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDL-*-DPSSRSAAGTMEFAAAS MPRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDL - * - DPSSRSAAGTMEFAAAS

TQRCVLLRTWEALAPATPAMPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQ TQRCVLLRTWEALAPATPAMPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQ

GWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQ GWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQ

RLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGL RLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGL

LLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHAS LLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHAS

GPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAP GPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAP

EPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPS EPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPS

VGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRP VGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRP

SLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPY SLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPY

GVLLKTHCPLRAAVTPÂAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSP GVLLKTHCPLRAAVTPÂAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSP

WQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTW WQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTW

KMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFY KMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFY

VTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPAL VTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPAL

LTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERA LTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERA

RRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQD RRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQD

RLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQF RLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQF

VAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVR1RGKSYVQCQ VAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVR1RGKSYVQCQ

GIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFL GIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFL

RTLVRGVPEYGCWNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLD RTLVRGVPEYGCWNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLD

TRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQ TRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQ

VNSLQTVCTNIYK1LLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCY VNSLQTVCTNIYK1LLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCY

SILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSL SILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSL

RTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD RTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD

Baculovirus-Expressionsvektor pBlueBac4.5 und hTRT-Protein mit vollständiger Länge Baculovirus expression vector pBlueBac4.5 and full-length hTRT protein

Zur Herstellung grosser Mengen an biologisch aktiven hTRT mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2) wurde ein zweiter Baculovirus-Expressionsvektor, pBlueBac4.5 (Invitrogen, San Diego, CA), konstruiert. Die hTRT-codierende Insertion bestand aus den Nucleotiden 707 bis 4776 von der hTRT vom Plasmid A second baculovirus expression vector, pBlueBac4.5 (Invitrogen, San Diego, CA), was constructed to produce large amounts of full-length biologically active hTRT (SEQ. ID. No. 2). The hTRT coding insert consisted of nucleotides 707 to 4776 from the hTRT from the plasmid

124 124

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) Diese Nucleotidsequenz enthält die hTRT-codierende Sequenz mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2). pGRN121 (SEQ. ID. No. 1) This nucleotide sequence contains the full-length hTRT coding sequence (SEQ. ID. No. 2).

Baculovirus-Expressionsvektor pMelBacB und hTRT-Protein mit vollständiger Länge Baculovirus expression vector pMelBacB and full-length hTRT protein

Zur Herstellung grosser Mengen an biologisch aktivem hTRT mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2) wurde ein dritter Baculovirus-Expressionsvektor pMelBacB (Invitrogen, San Diego, CA), konstruiert. Die hTRT-codierende Insertion besteht auch aus den Nucleotiden 707 bis 4776 von der hTRT-lnsertion vom Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1). Diese Nucleotidsequenz enthält die hTRT codierende Sequenz mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2). A third baculovirus expression vector pMelBacB (Invitrogen, San Diego, CA) was constructed to produce large amounts of biologically active full-length hTRT (SEQ. ID. No. 2). The hTRT-encoding insert also consists of nucleotides 707 to 4776 from the hTRT insert from plasmid pGRN121 (SEQ. ID. No. 1). This nucleotide sequence contains the full-length hTRT coding sequence (SEQ. ID. No. 2).

pMelBacB steuert die Expression von hTRT mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2) in Insektenzellen in das extrazelluläre Medium über den sekretorischen Stoffwechselweg unter der Verwendung der Melittin-Signalsequenz. Somit werden hohe Spiegel an hTRT mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2) sezerniert. Die Melittin-Signalsequenz wird nach Ausscheidung gespalten, ist jedoch ein Teil des Proteinpools, der intrazellulär verbleibt. Aus diesem Grund ist sie in der folgenden Sequenz in Klammem angegeben. Die von dem Vektor codierte Sequenz des Fusionsproteins (SEQ. ID. Nr. 38) ist nachstehend gezeigt: pMelBacB controls the expression of full-length hTRT (SEQ. ID. No. 2) in insect cells into the extracellular medium via the secretory metabolic pathway using the melittin signal sequence. High levels of hTRT with full length (SEQ. ID. No. 2) are thus secreted. The melittin signal sequence is cleaved after excretion, but is part of the protein pool that remains intracellular. For this reason, it is given in parentheses in the following sequence. The sequence of the fusion protein (SEQ. ID No. 38) encoded by the vector is shown below:

(mkflvnvalvfmvvyisyiya)-*-dpssrsaagtmefaaastqrcvllrt\vea lapatpampraprcravrsllrshyrevlplatfvrrlgpqgwrlvqrgdpa afralvaqclvcvpwdarpppaapsfrqvsclkelvarvlqrlcergaknvl afgfalldgarggppeafttsvrsylpntvtdalrgsgawglllfüivgddvl vhllarcalfvlvapscayqvcgpplyqlgaatqarppphasgprrrlgcera wnhsvreagvplglpapgarrrggsasrslplpkrprrgaapepertpvgqgs wahpgrtrgpsdrgfcwsparpaeeatslegalsgtrhshpsvgrqhhagpp stsrpprpwdtpcppvyaetkhflyssgdkeqlrpsfllsslrpsltgarrlvet iflgsrpwmpgtprrlprlpqrywqmrplflellgnhaqcpygvllkthcplr aavtpaagvcarekpqgsvaapeeedtdprrlvqllrqhsspwqvygfvrac lrrlvppglwgsrhnerrflrntkkfislgkhaklslqeltwkmsvrdcawl rrspgvgcvpaaehrlreeilakflhwlmsvywellrsffyvtettfqknrl ffyrksvwsklqsigirqhlkrvqlrelseaevrqhrearpalltsrlrpipkpd glrpivnmdyvvgartfrrekraerltsrvkalfsvlnyerarrpgllgasvl glddihrawrtfvlrvraqdpppelyfvkvdvtgaydtipqdrlteviasiikp qntycvrryawqkaahghvrkafkshvstltdlqpymrqfvahlqetsplr davvieqsssineassglfdvflrfmchhavrjrgksyvqcqgipqgsilstllc slcygdmenklfagirrdglllrlvddfllvtphlthaktflrtlvrgvpeyg cwnlrktwnfpvedealggtafvqmpahglfpwcgllldtrtlevqsdys syartsirasltfnrgfkagrnmrrklfgvlrlkchslfldlqvnslqtvctni ykilllqayrfhacvlqlpfhqqvwknptfflrvisdtaslcysilkaknagms lgakgaagplpseavqwlchqafllkltrhrvtyvpllgslrtaqtqlsrklp gttltaleaaanpalpsdfktild (Mkflvnvalvfmvvyisyiya) - * - dpssrsaagtmefaaastqrcvllrt \ vea lapatpampraprcravrsllrshyrevlplatfvrrlgpqgwrlvqrgdpa afralvaqclvcvpwdarpppaapsfrqvsclkelvarvlqrlcergaknvl afgfalldgarggppeafttsvrsylpntvtdalrgsgawglllfüivgddvl vhllarcalfvlvapscayqvcgpplyqlgaatqarppphasgprrrlgcera wnhsvreagvplglpapgarrrggsasrslplpkrprrgaapepertpvgqgs wahpgrtrgpsdrgfcwsparpaeeatslegalsgtrhshpsvgrqhhagpp stsrpprpwdtpcppvyaetkhflyssgdkeqlrpsfllsslrpsltgarrlvet iflgsrpwmpgtprrlprlpqrywqmrplflellgnhaqcpygvllkthcplr aavtpaagvcarekpqgsvaapeeedtdprrlvqllrqhsspwqvygfvrac lrrlvppglwgsrhnerrflrntkkfislgkhaklslqeltwkmsvrdcawl rrspgvgcvpaaehrlreeilakflhwlmsvywellrsffyvtettfqknrl ffyrksvwsklqsigirqhlkrvqlrelseaevrqhrearpalltsrlrpipkpd glrpivnmdyvvgartfrrekraerltsrvkalfsvlnyerarrpgllgasvl glddihrawrtfvlrvraqdpppelyfvkvdvtgaydtipqdrlteviasiikp qntycvrryawqkaahghvrkafkshvstltdlqpymrqfvahlqetsplr davvieqsssineassglfdvflrfmchhavrjrgksyvqcqgipqgsilstllc slcygdmenklfagirrdglllrlvddfllvtphlthaktflrtlvrgvpeyg cwnlrktwnfpvedealggtafvqm pahglfpwcgllldtrtlevqsdys syartsirasltfnrgfkagrnmrrklfgvlrlkchslfldlqvnslqtvctni ykilllqayrfhacvlqlpfhqqvwknptfflrvisdtaslcysilkaknagps lgaklltakllqqlqqlqlqql

Expression von hTRT in Säugerzellen Expression of hTRT in mammalian cells

Die erfindungsgemässe rekombinante hTRT kann in grossen Mengen als biologisch aktive hTRT mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2) in einer Vielzahl von Säuger-Zellinien hergestellt werden. Diese biologisch aktive, in Säugern hergestellte hTRT ist in vielen erfindungsgemässen Ausführungsformen, wie vorstehend diskutiert, von Nutzen. The recombinant hTRT according to the invention can be produced in large quantities as a biologically active full-length hTRT (SEQ. ID. No. 2) in a large number of mammalian cell lines. This biologically active, mammalian hTRT is useful in many embodiments of the invention as discussed above.

MPSV-hTRT-Expressionsplasmide MPSV hTRT expression plasmids

Die Erfindung stellt auch ein Expressionssystem für die Verwendung in Säugerzellen zur Verfügung, das die höchstmögliche Expression eines rekombinanten Proteins, wie beispielsweise Telomerase, bereitstellt, ohne dass dabei die codierende Sequenz modifiziert werden muss (beispielsweise durch Optimierung der Codonverwendung). In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein MPSV-Säuger-Ex- The invention also provides an expression system for use in mammalian cells that provides the highest possible expression of a recombinant protein, such as telomerase, without the need to modify the coding sequence (for example, by optimizing codon usage). In one embodiment, the invention provides an MPSV mammalian ex

125 125

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

pressionssysteme bereit, das die erfindungsgemässen TRTs von Plasmid pBBS212 exprimieren kann, beschrieben als pMPSV-TM in Lin J.H., Gene 47 (1994), 287-292. Die MPSV-Plasmide können entweder als stabile oder transiente Clone exprimiert werden. ready systems that can express the TRTs of plasmid pBBS212 according to the invention, described as pMPSV-TM in Lin J.H., Gene 47 (1994), 287-292. The MPSV plasmids can be expressed as either stable or transient clones.

In diesem Expressionssystem werden exogene Kontrollelemente für die Transkription in den Vektor eingebaut, während die hTRT codierende Sequenz (SEQ. ID. Nr. 1) selbst unverändert bleibt. Der durch den Cytomegalovirus (CMV)-Enhancer verstärkte «myeloproliferative Sarkomall-Virus (MPSV) LTR (MPSVLTR) -Promotor wird für die Initiation der Transkription eingebaut. Dieser Promotor zeigt durchwegs höhere Expressionsspiegel in Zellinien (siehe Lin, J.H (1994) a.a.O.). Eine «Kozak-Consensus»-Sequenz kann für die Initiation der Translation eingebaut werden (siehe Kozak, Mamm. Genome 7 (1996), 563-574). Alle extra vorliegenden nicht-translatierten 5'- und 3'-hTRT-Sequenzen können entfernt werden, um so sicherzustellen, dass diese Sequenzen die Expression nicht stören, wie bereits vorstehend diskutiert. Das die vollständige hTRT codierende Sequenz enthaltende MPSV-Plasmid, das alle extra-Sequenzen enthält, trägt die Bezeichnung pGRN133. Ein Kontroll-hTRT-«antisense»-Plasmid wurde ebenfalls konstruiert. Dieser Vektor, ist identisch mit pGRN133, ausser dass die TRT-Insertion die «antisense»-Sequenz von hTRT SEQ. ID. Nr. 1 ist (dieser «antisense»-Kontrollvektor trägt die Bezeichnung pGRN134). Das MPSV-Plasmid, das die vollständige hTRT-codierende Sequenz enthält, bei dem jedoch alle extra-Sequenzen entfernt wurden, und das die «Kozak-Consensus»-Sequenz enthält, trägt die Bezeichnung pGRN155. In this expression system, exogenous control elements for transcription are incorporated into the vector, while the hTRT coding sequence (SEQ. ID. No. 1) itself remains unchanged. The “myeloproliferative sarcoma virus (MPSV) LTR (MPSVLTR) promoter, which is enhanced by the cytomegalovirus (CMV) enhancer, is incorporated for the initiation of transcription. This promoter shows consistently higher expression levels in cell lines (see Lin, J.H (1994) op. Cit.). A “Kozak consensus” sequence can be incorporated for the initiation of translation (see Kozak, Mamm. Genome 7 (1996), 563-574). Any extra 5 'and 3' hTRT sequences that are not translated can be removed to ensure that these sequences do not interfere with expression, as previously discussed. The MPSV plasmid containing the complete hTRT coding sequence, which contains all the extra sequences, is called pGRN133. A control hTRT "antisense" plasmid was also constructed. This vector is identical to pGRN133, except that the TRT insertion is the antisense sequence of hTRT SEQ. ID. No. 1 (this «antisense» control vector is called pGRN134). The MPSV plasmid which contains the complete hTRT coding sequence, but from which all extra sequences have been removed, and which contains the “Kozak Consensus” sequence, is designated pGRN155.

Zwei Selektionsmarker, PAC (Puromycin-N-acetyl-Transferase = Puromycin-Resistenz) und HygB (Hy-gromycin B = Hygromycin-Resistenz) sind für die Selektion der Plasmide nach Transfektion vorhanden (siehe die vorstehende Diskussion, die sich auf selektierbare Marker bezieht). Doppelselektion unter Verwendung von Markern auf beiden Seiten des Vektor-Polylinkers sollte die Stabilität der hTRT codierenden Sequenz erhöhen. Eine DHFR (Dihydrofolat-Reduktase) codierende Sequenz wird eingebaut, um die Amplifikation der Expressionskassette nach der Erzeugung stabiler Clone zu erlauben. Weitere Massnahmen zur Genamplifikation können ebenfalls zur Steigerung der Ausbeuten an rekombinanten Proteinen verwendet werden. Two selection markers, PAC (puromycin-N-acetyl-transferase = puromycin resistance) and HygB (hy-gromycin B = hygromycin resistance) are available for the selection of the plasmids after transfection (see the discussion above, which relates to selectable markers ). Double selection using markers on both sides of the vector polylinker should increase the stability of the hTRT coding sequence. A sequence coding for DHFR (dihydrofolate reductase) is inserted in order to allow the amplification of the expression cassette after the generation of stable clones. Further measures for gene amplification can also be used to increase the yields of recombinant proteins.

Die Erfindung stellt auch MPSV-Säuger-Expressionsplasmide bereit, die hTRT-Fusionsproteine enthalten. In einer Ausführungsform ist die hTRT-Sequenz, die ihren 5'-nicht-translatierten Bereich beibehalten hat, mit einem Epitop-«flag» verknüpft, beispielsweise im IBI FLAG (Intranational Biotechnologies Inc. (IBI) Kodak, New Häven, CT) und in das MPSV-Expressionsplasmid inseriert (mit der Bezeichnung pGRN147). Dieses spezielle Konstrukt enthält eine «Kozak»-lnitiationsstelle für die Translation. Das exprimierte Fusionsprotein kann unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers M-1 anti-FLAG-Octa-peptid (IBI, Kodak, a.a.O.) gereinigt werden. The invention also provides MPSV mammalian expression plasmids that contain hTRT fusion proteins. In one embodiment, the hTRT sequence, which has retained its 5 'untranslated region, is linked to an epitope "flag", for example in the IBI FLAG (Intranational Biotechnologies Inc. (IBI) Kodak, New Haeven, CT) and inserted into the MPSV expression plasmid (called pGRN147). This special construct contains a "Kozak" initiation site for translation. The expressed fusion protein can be purified using the M-1 anti-FLAG octa-peptide monoclonal antibody (IBI, Kodak, supra).

In einer weiteren Ausführungsform ist hTRT ortsspezifisch verändert. Ein Aminosäurerest-Codon ist mutagenisiert, wobei Asparaginsäure an Position 869 (SEQ. ID. Nr. 1) in ein Alanin überführt wurde. Diese Asp869-»Ala-hTRT-Mutante, die ihren 5'-nicht-translatierten Bereich beibehalten hat, und in die eine «Kozak»-Sequenz eingebaut worden war, wurde in ein MPSV-Expressionsplasmid inseriert und erhielt die Bezeichnung pGRN146. Die Asp869->Ala-hTRT-Mutanten, wurde so weiter modifiziert, dass sie FLAG-Sequenz, wie vorstehend beschrieben, enthielt, und die clonierte Insertion wurde in ein MPSV-Expressionsplasmid inseriert. Dieses Expressionsplasmid wurde mit pGRN154 bezeichnet. Insbesondere wird für pGRN154 ein Eam1105l-Restriktionsfragment von pGRN146, das die «Kozak»-Sequenz enthielt, die wiederum das «front end» (5'-Segment) von hTRT enthielt, in die Eam11051-Stellen von pGRN147 (siehe vorstehend) cloniert, um so ein MPSV-Expressionsplasmid zu konstruieren, das hTRT zusammen mit einer «Kozak»-Sequenz und der vorstehend beschriebenen D869-»A-Mutation und das «IBI-flag» exprimieren kann. In a further embodiment, hTRT is changed in a site-specific manner. An amino acid residue codon is mutagenized, whereby aspartic acid at position 869 (SEQ. ID. No. 1) has been converted into an alanine. This Asp869- »Ala-hTRT mutant, which had retained its 5'-untranslated region and into which a« Kozak »sequence had been inserted, was inserted into an MPSV expression plasmid and was designated pGRN146. The Asp869-> Ala-hTRT mutant was further modified to contain the FLAG sequence as described above and the cloned insert was inserted into an MPSV expression plasmid. This expression plasmid was designated pGRN154. In particular, for pGRN154, an Eam1105l restriction fragment of pGRN146, which contained the “Kozak” sequence, which in turn contained the “front end” (5 ′ segment) of hTRT, is cloned into the Eam11051 sites of pGRN147 (see above), so as to construct an MPSV expression plasmid which can express hTRT together with a "Kozak" sequence and the D869- "A mutation described above and the" IBI flag ".

Eine weitere erfindungsgemässe Ausführungsform stellt ein weiteres Expressionsplasmid bereit, das von pGRN146 stammt. Das Säuger-Expressionsplasmid mit der Bezeichnung pGRN152 wurde durch Ausschneiden des EcoRI-Fragments von Plasmid pGRN146 (das den hTRT-ORF enthält) erzeugt und zur Entfernung des 5'-UTR von hTRT in die EcoRI-Stelle von pBBS212 cloniert. Die hTRT ist so orientiert, dass deren Expression durch den MPSV-Promotor kontrolliert wird. Dadurch entsteht ein Säuger-Expressionsplasmid, das hTRT zusammen mit einer «Kozak-Consensus»-Sequenz und der D869->A-Mutation unter Verwendung des MPSV-Promotors exprimiert. A further embodiment according to the invention provides a further expression plasmid which is derived from pGRN146. The mammalian expression plasmid, designated pGRN152, was generated by cutting out the EcoRI fragment from plasmid pGRN146 (containing the hTRT ORF) and cloned into the EcoRI site of pBBS212 to remove the 5'-UTR of hTRT. The hTRT is oriented so that its expression is controlled by the MPSV promoter. This creates a mammalian expression plasmid that expresses hTRT together with a “Kozak Consensus” sequence and the D869-> A mutation using the MPSV promoter.

Expression von hTRT in 293-Zellen mittels des episomalen Vektors pEBVHis Expression of hTRT in 293 cells using the episomal vector pEBVHis

Der episomale Vektor, pEBVHis (Invitrogen, San Diego, CA) wurde so modifiziert, dass er ein hTRT (SEQ. ID. Nr. 2)-Fusionsprotein exprimiert, das hTRT mit einem Epitop-«tag» einer N-terminalen Verlängerung das «Xpress»-Epitap (Invitrogen, San Diego, CA) umfasst, exprimiert (mit der Bezeichnung pGRN122). Das Notl-hTRT-Fragment von pGRN121, das den offenen Leserahmen (ORF) von hTRT enthält, wurde in die Notl-Stelle von pEBVHisA cloniert, so dass der hTRT-ORF in der gleichen Orientierung ist wie der Rous Sarkom-Virus (RSV)-Promotor des Vektors. In dieser Orientierung war das «His6 flag» verhältnismässig näher am N-Terminus der hTRT. The episomal vector, pEBVHis (Invitrogen, San Diego, CA), was modified to express an hTRT (SEQ. ID. No. 2) fusion protein that hTRT with an epitope "tag" of an N-terminal extension that " Xpress »-Epitap (Invitrogen, San Diego, CA), expressed (labeled pGRN122). The NotI-hTRT fragment of pGRN121, which contains the open reading frame (ORF) of hTRT, was cloned into the NotI site of pEBVHisA so that the hTRT-ORF is in the same orientation as the Rous Sarcoma Virus (RSV) Promoter of the vector. In this orientation, the His6 flag was relatively closer to the N-terminus of the hTRT.

Es wurde auch ein Kontrollvektor konstruiert, der als Insertion die «antisense»-Sequenz von hTRT enthielt und das Epitop-«tag» (das Kontrollplasmid wurde mit pGRN123 bezeichnet). Der Vektor wurde in 293-Zellen transfiziert und die translatierte hTRT identifiziert und mittels eines für das «Xpress»-Epi- A control vector was also constructed which contained the "antisense" sequence of hTRT and the epitope "tag" (the control plasmid was designated pGRN123). The vector was transfected into 293 cells and the translated hTRT was identified and analyzed for the “Xpress” epi-

126 126

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

top spezifischen Antikörpers isoliert. pEBVHis ist ein Hygromycin resistenter episomaler EBV-Vektor, der das gewünschte Protein fusioniert an ein N-terminales Peptid exprimiert. Die den Vektor tragenden Zellen werden selektiert und expandiert und danach werden nucleäre und cytoplasmatische Extrakte präpariert. Diese sowohl Kontrollextrakte werden mit anti-Xpress-Antikörper immunpräzipitiert und die immun-präzipierten Kügelchen werden mittels eines typischen Assays auf Telomerase-Aktivität getestet. top specific antibody isolated. pEBVHis is a hygromycin resistant episomal EBV vector that expresses the desired protein fused to an N-terminal peptide. The cells carrying the vector are selected and expanded and then nuclear and cytoplasmic extracts are prepared. These both control extracts are immunoprecipitated with anti-Xpress antibody and the immunoprecipitated beads are tested for telomerase activity using a typical assay.

Expression rekombinanter hTRT in sterblichen normalen diploiden menschlichen Zellen Expression of recombinant hTRT in mortal normal diploid human cells

In einer erfindungsgemässen Ausführungsform können rekombinante hTRT und notwendige Telome-rase-Enzymkomplex-Bestandteile in normalen dipoliden sterblichen Zellen exprimiert werden, um so deren direkte Immortalisierung zu erreichen oder deren Immortalisierung zu erleichtern. Dies würde einem erlauben, diploide unsterbliche Zellen zu erhalten, mit einem ansonsten normalen Phänotyp und Karyotyp. Wie bereits vorstehend diskutiert, hat diese Verwendung von Telomerase eine enorme kommerzielle Bedeutung. In an embodiment according to the invention, recombinant hTRT and necessary telomerase enzyme complex components can be expressed in normal dipolar mortal cells in order to achieve their direct immortalization or to facilitate their immortalization. This would allow one to obtain diploid immortal cells with an otherwise normal phenotype and karyotype. As discussed above, this use of telomerase is of enormous commercial importance.

«Sense»-hTRT (Fig. 16) und «antisense»-hTRT (SEQ. ID. Nr. 45) wurden in einem CMV-Vektor cloniert. Diese Vektoren wurden gereinigt und in zwei Clone von normalen sterblichen diploiden menschlichen Zellen transfiziert. Die menschlichen Clone waren die frisch passagierten diploiden menschlichen Zellstämme BJ und IMR90. "Sense" -hTRT (Fig. 16) and "antisense" -hTRT (SEQ. ID No. 45) were cloned in a CMV vector. These vectors were purified and transfected into two clones from normal mortal diploid human cells. The human clones were the freshly passed diploid human cell strains BJ and IMR90.

Die Analyse von Telomerase-Aktivität mittels eines TRAP-Assays (mittels des «TRAPeze» Kit (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD)) ergab, dass bei Transfektion mit «sense»-hTRT sowohl in dem Zellstamm BJ als auch IMR90 Telomerase-Aktivität erzeugt wurde, jedoch nicht bei Transfektion mit «antisense»-hTRT. Analysis of telomerase activity using a TRAP assay (using the “TRAPeze” kit (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD)) showed that when transfected with “sense” -hTRT, both in the cell strain BJ and IMR90 telomerase- Activity was generated, but not when transfected with «antisense» hTRT.

Expression rekombinanter hTRT in immortalisierten menschlichen IMR90-Zellen Expression of recombinant hTRT in immortalized human IMR90 cells

Unter Verwendung des gleichen hTRT-«sense»-Konstrukts, das in die CMV-Vektoren cloniert war, die bei den vorstehend beschriebenen Studien mit diploiden menschlichen BJ- und IMR90-Zellstämmen verwendet wurden, wurde die immortalisierte SW13 ALT-«pathway»-Zellinie (eine mit SV40-Antigen immortalisierte IMR90-Zelle) transient transfiziert. Mittels eines TRAP-Assays (TRAPeze, Oncor, Inc., Gaithersburg, MD) konnte gezeigt werden, dass Telomerase-Aktivität mit dem «sense»-Konstrukt in transfizierten Zellen erzeugt wurde. Using the same hTRT "sense" construct cloned into the CMV vectors used in the studies described above with diploid human BJ and IMR90 cell strains, the immortalized SW13 ALT "pathway" cell line (an IMR90 cell immortalized with SV40 antigen) transiently transfected. Using a TRAP assay (TRAPeze, Oncor, Inc., Gaithersburg, MD) it was possible to show that telomerase activity was generated in transfected cells with the “sense” construct.

Vektoren für die regulierte Expression von hTRT in Säugerzellen: Induzierbare und reprimierbare Expression von hTRT Vectors for the regulated expression of hTRT in mammalian cells: inducible and repressible expression of hTRT

Die Erfindung stellt Vektoren bereit, die manipuliert werden können, um so die Expression der erfindungsgemässen TRTs, beispielsweise hTRT, induzieren oder reprimieren zu können. Beispielsweise wurde hTRT (SEQ. ID. Nr.1) in das Ecdyson-induzierbare Expressionssystem von Invitrogen (San Diego, CA) und die «Tet-On- and Tet-Off»-Tetracyclin-regulierten Systeme von Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) cloniert. Solche induzierbaren Expressionssysteme werden für solche erfindungsgemässen Verfahren bereitgestellt, bei denen es wichtig ist, den Spiegel oder die Rate der Transkription von transfizierter TRT kontrollieren zu können. Beispielsweise stellt die Erfindung Zellinien bereit, die mittels der Expression von hTRT immortalisiert sind. Solche Zellen können durch Hemmung der hTRT-Expression durch den Vektor mittels dessen Kontrollelementen für die Transkription, beispielsweise dem «Tet-Off»-System «sterblich» gemacht werden. Die Erfindung stellt auch Verfahren bereit, bei denen TRT lediglich transient exprimiert wird, um so die konstitutive Expression von hTRT zu vermeiden, was zu einer unerwünschten «Immortalisierung» der transfizierten Zellen, wie bereits vorstehend diskutiert, führen könnte. The invention provides vectors which can be manipulated so as to be able to induce or repress the expression of the TRTs according to the invention, for example hTRT. For example, hTRT (SEQ. ID. No. 1) was incorporated into the Invitrogen's ecdysone-inducible expression system (San Diego, CA) and the "Tet-On and Tet-Off" tetracycline-regulated systems from Clontech Laboratories, Inc. ( Palo Alto, CA) cloned. Such inducible expression systems are provided for those methods according to the invention in which it is important to be able to control the level or the rate of transcription of transfected TRT. For example, the invention provides cell lines that are immortalized by the expression of hTRT. Such cells can be made "mortal" by inhibiting hTRT expression by the vector using its transcriptional control elements, for example the "tet-off" system. The invention also provides methods in which TRT is only expressed transiently so as to avoid the constitutive expression of hTRT, which could lead to an undesired "immortalization" of the transfected cells, as already discussed above.

Das Ecdyson-induzierbare Säuger-Expressionssystem wurde hinsichtlich der Möglichkeit der regulierten Expression des gewünschten Gens in Säugerzellen entworfen. Das System ist durch seinen fest regulierten Mechanismus gekennzeichnet, der in Säugerzellen praktisch keine Basaltranskription gestattet und eine mehr als 200fache Induzierbarkeit aufweist. Das Expressionssystem basiert auf dem heterodimären Ecdyson-Rezeptor von Drosophila. Bei dem Ecdyson-induzierbaren Expressionssystem wird ein Analoges des Steroidhormons Ecdyson, Muristeron A zur Aktivierung der Expression von hTRT über einen heterodimären nucleären Rezeptor verwendet. Es wurde von Expressionsspiegeln berichtet, die mehr als 200fach über den Basisspiegeln lagen, wobei keine Auswirkung auf die Physiologie der Säugerzelle auftrat (No, «Ecdysone-Inducible Gene Expression in Mammalian Cells and Transgenic Mice», Proc. Nati. Acad. Sei. USA 93 (1996), 3346-3351). Nach Bindung von Ecdyson oder Muristeron, einem Analogen von Ecdyson, aktiviert der Rezeptor einen auf Ecdyson ansprechenden Promotor, was zur kontrollierten Expression des gewünschten Gens führt. In dem Ecdyson-induzierbaren Säuger-Expressi-onssystem werden beide Monomere des heterodimären Rezeptors konstitutiv von demselben Vektor pV-gRXR exprimiert. Der auf Ecdyson ansprechende Promotor, der letztlich die Expression des gewünschten Gens steuert, ist auf einem zweiten Vektor pIND lokalisiert, der die Transkription des gewünschten Gens steuert. The ecdysone-inducible mammalian expression system was designed to allow for the regulated expression of the desired gene in mammalian cells. The system is characterized by its tightly regulated mechanism, which allows practically no basal transcription in mammalian cells and is more than 200 times inducible. The expression system is based on the Drosophila heterodimeric ecdysone receptor. In the Ecdyson-inducible expression system, an analog of the steroid hormone Ecdyson, Muristeron A is used to activate the expression of hTRT via a heterodimeric nuclear receptor. Expression levels were reported to be more than 200-fold above base levels with no effect on the physiology of the mammalian cell (No, "Ecdysone-Inducible Gene Expression in Mammalian Cells and Transgenic Mice", Proc. Nati. Acad. Sei. USA 93: 3346-3351 (1996). After binding of Ecdyson or Muristeron, an analog of Ecdyson, the receptor activates an ecdysone-responsive promoter, which leads to the controlled expression of the desired gene. In the ecdysone-inducible mammalian expression system, both monomers of the heterodimeric receptor are constitutively expressed by the same vector pV-gRXR. The ecdysone-responsive promoter that ultimately controls expression of the desired gene is located on a second vector pIND that controls the transcription of the desired gene.

hTRT wird in den Vektor pIND (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) cloniert, der 5 modifizier- hTRT is cloned into the vector pIND (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), which modifies 5

127 127

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

te auf Ecdyson ansprechende Elemente (E/GREs) stromaufwärts eines minimalen Hitzeschock-Promotors enthält und die Mehrfach-Clonierungsstelle. Mit diesem Konstrukt werden danach Zellinien transfiziert, die vorher so verändert wurden, dass sie den Ecdyson-Rezeptor stabil exprimieren. Nach der Transfektion werden die Zellen zur Induktion intrazellulärer Expression von pIND mit Muristeron A behandelt. contains ecdysone responsive elements (E / GREs) upstream of a minimal heat shock promoter and the multiple cloning site. This construct is then used to transfect cell lines that have previously been modified so that they stably express the ecdysone receptor. After transfection, the cells are treated with Muristeron A to induce intracellular expression of pIND.

Die «Tet-on and Tet-off»-Expressionssysteme (Clontech, Palo Alto, CA) erlauben den Zugang zu den regulierten Gen-Expressionssystemen mit einer Expression auf hohem Niveau, die von Gossen «Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline responsive promoters», Proc. Nati. Acad. Sei. USA 89 (1992), 5547-5551, hinsichtlich des «Tet-Off»-Transkriptions-Repressionssystems beschrieben wurden, siehe auch Gossen, «Transcriptional activation by tetracycline in mammalian cells», Science 268 (1995), 1766-1769 hinsichtlich des «Tet-On»-induzierbaren Transkriptionssystems. In «Tet-Off»-transformierten Zellinien wird die Genexpression angeschaltet, wenn Tetracyclin (Tc) oder Doxycyclin («Dox», ein Tc-Derivat) von dem Kulturmedium entfernt werden. Im Gegensatz dazu wird in «Tet-On»-Zellinien die Expression durch die Zugabe von Tc oder «Dox» zu dem Medium angeschaltet. Beide Systeme erlauben die festregulierte Expression clonierter Gene als Antwort auf unterschiedliche Konzentrationen von Tc oder «Dox». The “Tet-on and Tet-off” expression systems (Clontech, Palo Alto, CA) allow access to the regulated gene expression systems with high-level expression, which Gossen says “Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline responsive promoters », Proc. Nati. Acad. Be. USA 89 (1992), 5547-5551, with regard to the “tet-off” transcriptional repression system, see also Gossen, “Transcriptional activation by tetracycline in mammalian cells”, Science 268 (1995), 1766-1769 with regard to the “ Tet-On »inducible transcription system. In "Tet-Off" transformed cell lines, gene expression is switched on when tetracycline (Tc) or doxycycline ("Dox", a Tc derivative) are removed from the culture medium. In contrast, in "Tet-On" cell lines the expression is switched on by the addition of Tc or "Dox" to the medium. Both systems allow the tightly regulated expression of cloned genes in response to different concentrations of Tc or «Dox».

Bei diesem System wird «pTRE» als ein «Antwort»-Plasmid verwendet, das zur Expression eines gewünschten Gens verwendet werden kann. pTRE enthält eine Mehrfachclonierungsstelle (MCS) unmittelbar stromabwärts des auf Tet ansprechenden PhCMV*-1-Promotors. Gewünschte cDNAs oder Gene, die in eine der Stellen in der MCS inseriert wurden, sprechen auf die regulatorischen Proteine tTA und rtTA in den «Tet-Off»- bzw. «Tet-On»-Systemen an. PhCMV*-1 enthält das auf Tet ansprechende Element (TRE), das aus sieben Kopien der tet-Operatorsequenz mit 42-bp (teto) besteht. Das TRE-Element ist unmittelbar stromaufwärts des minimalen CMV-Promotors (PminCMV), dem der Enhancer fehlt, der Teil des vollständigen CMV-Promotors in den pTet-Plasmiden ist. Als Konsequenz ist PhCMV*-l bei einem Fehlen der Bindung von regulatorischen Proteinen an die tetO-Sequenzen abgeschaltet. Die clonierte Insertion muss ein Initiationscodon besitzen. In einigen Fällen kann die Zugabe einer «Kozak-Consensus»-Ribosomenbindungsstelle die Expressionsspiegel verbessern. Es wurden jedoch viele cDNAs in Tet-Systemen effizient exprimiert ohne die Zugabe einer «Kozak»-Sequenz. «pT-RE-Gen X»-Plasmide werden mit pTK-Hyg cotransfiziert, was die Selektion stabiler Transfektanten erlaubt. In this system, "pTRE" is used as a "response" plasmid that can be used to express a desired gene. pTRE contains a multiple cloning site (MCS) immediately downstream of the Tet responsive PhCMV * -1 promoter. Desired cDNAs or genes that have been inserted into one of the sites in the MCS respond to the regulatory proteins tTA and rtTA in the “tet-off” and “tet-on” systems. PhCMV * -1 contains the Tet Responsive Element (TRE), which consists of seven copies of the tet operator sequence at 42 bp (teto). The TRE element is immediately upstream of the minimal CMV promoter (PminCMV), which lacks the enhancer that is part of the full CMV promoter in the pTet plasmids. As a consequence, PhCMV * -l is switched off in the absence of binding of regulatory proteins to the tetO sequences. The cloned insert must have an initiation codon. In some cases, the addition of a Kozak Consensus ribosome binding site can improve expression levels. However, many cDNAs were efficiently expressed in Tet systems without the addition of a "Kozak" sequence. “PT-RE-Gen X” plasmids are co-transfected with pTK-Hyg, which allows the selection of stable transfectants.

Die Etablierung eines «Tet-Off»- oder «Tet-On»-Expressionssystems erfordert im allgemeinen zwei aufeinanderfolgende stabile Transfektionen, um so eine «doppelstabile» Zellinie zu erzeugen, die integrierte Kopien von Genen enthält, die das geeignete regulatorische Protein und TRT unter der Kontrolle eines auf tet ansprechenden Elements (TRE) enthalten. Bei der ersten Transfektion wird ein geeignetes regulatorisches Protein in die Zellinie der Wahl durch Transfektion eines «Regulator-Plasmids», beispielsweise eines «pTet-Off»- oder «pTet-On»-Vektors, das die geeigneten regulatorischen Proteine exprimiert, eingeführt. Die in das in das pTRE «Antwortplasmid» clonierte hTRT wird danach in der zweiten Transfektion eingeführt, um so die doppelstabile «Tet-Off»- oder «Tet-On»-Zellinie zu erzeugen. Beide Systeme ergeben eine sehr genaue ein/aus-Kontrolle der Genexpression, eine regulierte dosisabhängige Induktion und hohe absolute Spiegel der Genexpression. Establishing a "tet-off" or "tet-on" expression system generally requires two consecutive stable transfections to create a "double-stable" cell line that contains integrated copies of genes that contain the appropriate regulatory protein and TRT the control of a responsive element (TRE) included. In the first transfection, a suitable regulatory protein is introduced into the cell line of choice by transfecting a "regulatory plasmid", for example a "pTet-Off" or "pTet-On" vector, which expresses the suitable regulatory proteins. The hTRT cloned into the pTRE “response plasmid” is then introduced in the second transfection in order to generate the double-stable “tet-off” or “tet-on” cell line. Both systems result in very precise on / off control of gene expression, regulated dose-dependent induction and high absolute levels of gene expression.

Expression rekombinanter hTRT mittels DHFR und Adenovirus-Sequenzen Expression of recombinant hTRT using DHFR and adenovirus sequences

Das pGRN155-Plasmidkonstrukt wurde für die transiente Expression von hTRT-cDNA in Säugerzellen entworfen. Eine «Kozak-Consensus»-Sequenz wird an dem 5'-Ende der hTRT-Sequenz inseriert. Die hTRT-lnsertion enthält keine 3'- oder 5'-nicht-translatierten Sequenzen (UTR). Die hTRT-cDNA wird in die EcoRI-Stelle von p91023(B) inseriert (Wong, Science 228 (1985), 810-815). Die hTRT-lnsertion befindet sich in derselben Orientierung wie der offene Leserahmen (ORF) von DHFR. Dadurch ist der Expressionsvektor für eine transiente Expression von besonderem Nutzen. The pGRN155 plasmid construct was designed for the transient expression of hTRT cDNA in mammalian cells. A "Kozak consensus" sequence is inserted at the 5 'end of the hTRT sequence. The hTRT insertion contains no 3 'or 5' untranslated sequences (UTR). The hTRT cDNA is inserted into the EcoRI site of p91023 (B) (Wong, Science 228 (1985), 810-815). The hTRT insertion is in the same orientation as the DHFR open reading frame (ORF). This makes the expression vector particularly useful for transient expression.

pGRN15 enthält den SV40-Replikationsstartpunkt und -Enhancer unmittelbar stromaufwärts eines Adenovirus-Promotors, ein Gen für Tetracyclinresistenz, einen E. coli-Replikationsstartpunkt und einen VAI- und VAII-Genbereich von Adenovirus. Diese Expressionskassette enthält in der folgenden Reihenfolge: den späten Hauptpromotor von Adenovirus; den dreiseitigen Leader von Adenovirus; ein Hybridin-tron, das aus einer 5'-Spleissstelle vom ersten Exon des dreiseitigen Leaders und einer 3'-Spleissstelle des Immunglobulingens der Maus besteht; die hTRT-cDNA; die Maus-DHFR-codierende Sequenz und das SV40-Polyadenylierungssignal. pGRN15 contains the SV40 origin of replication and enhancer immediately upstream of an adenovirus promoter, a gene for tetracycline resistance, an E. coli origin of replication and a VAI and VAII gene region of adenovirus. This expression cassette contains in the following order: the late major adenovirus promoter; the trilateral leader of adenovirus; a hybridin-tron consisting of a 5 'splice from the first exon of the three-sided leader and a 3' splice from the mouse immunoglobulin gene; the hTRT cDNA; the mouse DHFR coding sequence and the SV40 polyadenylation signal.

Jetzt wurde beschrieben, dass der dreiseitige Leader von Adenovirus und die VA-RNAs die Effizienz, mit der polycistronische mRNAs translatiert werden, erhöht. Es wurde auch berichtet, dass die DHFR-Sequenz die Stabilität von Hybrid-mRNA verstärkt. Die DHFR-Sequenz kann auch einen Marker zur Selektion und Amplifikation von Vektorsequenzen liefern (siehe Logan, Proc. Nati. Acad. Sei. USA 81 (1984) 3655; Kaufman, Proc. Nati. Acad. Sei. USA 82 (1985), 689 und Kaufman (1988) persönliche Mitteilung, Focus (Life Technologies, Inc.), Bd. 10 Nr. 3). It has now been described that the tripartite leader of adenovirus and the VA RNAs increase the efficiency with which polycistronic mRNAs are translated. The DHFR sequence has also been reported to enhance the stability of hybrid mRNA. The DHFR sequence can also provide a marker for selection and amplification of vector sequences (see Logan, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 (1984) 3655; Kaufman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82 (1985), 689 and Kaufman (1988) personal communication, Focus (Life Technologies, Inc.), Vol. 10 No. 3).

Für Zwecke der Veranschaulichung wird die folgende Liste von Expressionsplasmiden bereitgestellt. The following list of expression plasmids is provided for purposes of illustration.

128 128

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

pGRN121 pGRN121

Das EcoRI-Fragment des lambda-Clons 25-1.1.6, das die gesamte das hTRT-Protein codierende cDNA enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBluescriptllSK+, so dass das 5'-Ende der cDNA in der Nähe des T7-Promotors im Vektor ist. Der in diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Ampicillin. The EcoRI fragment of lambda clone 25-1.1.6, which contains all of the cDNA encoding the hTRT protein, is inserted into the EcoRI site of pBluescriptIISK + so that the 5 'end of the cDNA is near the T7 promoter is in the vector. The selectable marker used in this vector is ampicillin.

pGRN122 pGRN122

Das Notl-Fragment von pGRN121, das die den hTRT-ORF (offenen Leserahmen) codierende Sequenz enthält, inseriert in die Notl-Stelle von pEBVHisA, so dass die codierende Sequenz mit dem RSV-Promotor funktionell verknüpft ist. Dieses Plasmid exprimiert ein Fusionsprotein, das aus einem mit dem N-Terminus des hTRT-Proteins fusionierten «His6-flag» zusammengesetzt ist. Der verwendbare Marker, der mit diesem Vektor verwendet wird, ist Ampicillin oder Hygromycin. The NotI fragment of pGRN121, which contains the sequence coding for the hTRT-ORF (open reading frame), is inserted into the NotI site of pEBVHisA, so that the coding sequence is functionally linked to the RSV promoter. This plasmid expresses a fusion protein which is composed of a “His6 flag” fused to the N-terminus of the hTRT protein. The marker that can be used with this vector is ampicillin or hygromycin.

pGRN123 pGRN123

Das Notl-Fragment von pGRN121, das die den hTRT-ORF (offener Leserahmen) codierende Sequenz enthält, inseriert in die Notl-Stelle von pEBVHisA, so dass die codierende Sequenz im Vergleich zu dem RSV-Promotor in der entgegengesetzten Richtung orientiert ist, so dass «antisense»-hTRT exprimiert wird. The NotI fragment of pGRN121, which contains the sequence encoding the hTRT-ORF (open reading frame), is inserted into the NotI site of pEBVHisA so that the coding sequence is oriented in the opposite direction compared to the RSV promoter that «antisense» hTRT is expressed.

pGRN124 pGRN124

Alle APAI-Stellen in pGRN121 deletiert und danach erfolgte die Deletion des den 3'-UTR («untransla-tierten Bereich») enthaltenden Mscl-Hincll-Fragments. Das das Stopcodon der hTRT codierenden Sequenz enthaltende Nco-Xbal-Fragment wurde danach in die Nco-Xbal-Stellen von pGRN121 inseriert, wodurch ein Plasmid entstand, das äquivalent zu pGRN121 ist, ausser dass ihm der 3'-UTR fehlt. Dieses Plasmid kann vorzugsweise für gesteigerte Expressionsspiegel in einigen Zellen vewendet werden. All APAI sites in pGRN121 were deleted and then the Mscl-Hincll fragment containing the 3'-UTR (“untranslated region”) was deleted. The Nco-Xbal fragment containing the stop codon of the hTRT coding sequence was then inserted into the Nco-Xbal sites of pGRN121, creating a plasmid that is equivalent to pGRN121 except that it lacks the 3'-UTR. This plasmid can preferably be used for increased expression levels in some cells.

pGRN125 pGRN125

Das die hTRT codierende Sequenz enthaltende Notl-Fragment von pGRN124 inseriert in die Notl-Stelle von pBBS235, so dass der offene Leserahmen im Vergleich zu dem lac-Promotor in der gegenläufigen Orientierung ist. Der nachweisbare Marker, der mit diesem Vektor verwendet wird, ist Chloram-phenicol. The Not I fragment of pGRN124 containing the hTRT coding sequence is inserted into the NotI site of pBBS235 so that the open reading frame is in the opposite orientation compared to the lac promoter. The detectable marker used with this vector is chloram phenicol.

pGRN126 pGRN126

Das die hTRT codierende Sequenz enthaltende Notl-Fragment von pGRN124, inseriert in die Notl-Stelle von pBBS235, so dass die hTRT codierende Sequenz in der gleichen Orientierung wie der lac-Promotor inseriert ist. The NotI fragment of pGRN124 containing the hTRT coding sequence is inserted into the NotI site of pBBS235 so that the hTRT coding sequence is inserted in the same orientation as the lac promoter.

pGRN127 pGRN127

Das Oligonucleotid The oligonucleotide

5 1 - TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCCaCcA 5 1 - TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCCaCcA

TGCCGCGCGCTCCCCGC TG-3 » TGCCGCGCGCTCCCCGC TG-3 »

wurde für die in vitro-Mutagenese von pGRN125 zur Umwandlung des Initiationscodons ATG der hTRT codierenden Sequenz in eine «Kozak-Consensus»-Sequenz verwendet und zur Erzeugung von EcoRI-und Bglll-Stellen für die Clonierung. COD2866 wurde auch zur Umwandlung von AmpS zu AmpR (Am-picillin-Resistenz) verwendet und CODI941 wurde zur Umwandlung von CatR (Chloramphenicol-Resi-stenz, zu CatS (Chloramphenicol-Empfindlichkeit) umgewandelt. was used for the in vitro mutagenesis of pGRN125 to convert the initiation codon ATG of the hTRT coding sequence into a “Kozak consensus” sequence and to generate EcoRI and BglII sites for cloning. COD2866 was also used to convert AmpS to AmpR (am-picillin resistance) and CODI941 was used to convert CatR (chloramphenicol resistance, to CatS (chloramphenicol sensitivity).

pGRN128 pGRN128

Das Oligonucleotid 5 ' - The oligonucleotide 5 '-

TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCCaCcATGCCGCGCGCTCCCCGC TG-3 1 TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCCaCcATGCCGCGCGCTCCCCGC TG-3 1

129 129

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

wurde für die in vitro-Mutagenese verwendet, um so das Initiationscodon ATG von hTRT in einem «Kozak-Consensus»-Sequenz umzuwandeln und EcoRI und Bglll-Stellen für die Clonierung zu erzeugen. Es wurde auch das Oligonucleotid was used for in vitro mutagenesis in order to convert the initiation codon ATG of hTRT into a “Kozak consensus” sequence and to generate EcoRI and BglII sites for cloning. It also became the oligonucleotide

5 ' - 5 '-

CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACGATGACAAA TGAATTCAGATCTGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3' CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACGATGACAAA TGAATTCAGATCTGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3 '

zur Insertion des «IBI Flag» (International Biotechnolgies Inc. (IBI) Kodak, New Häven, CT) am C-Ter-minus verwendet und zur Erzeugung von EcoRI- und Bglll-Stellen für die Clonierung. COD2866 wurde auch zur Umwandlung von AmpS zu AmpR verwendet und CODI941 zur Umwandlung von CatR zu CatS. used to insert the “IBI Flag” (International Biotechnologies Inc. (IBI) Kodak, New Häven, CT) at C-Ter-minus and to create EcoRI and Bglll sites for cloning. COD2866 was also used to convert AmpS to AmpR and CODI941 to convert CatR to CatS.

pGRN129 pGRN129

Das Oligonucleotid 5 ' - The oligonucleotide 5 '-

CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCA CCTCACC-3' CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCA CCTCACC-3 '

wurde zur in vitro-Mutagenese zur Umwandlung von Asp869 in ein Ala-Codon verwendet (d.h. das zweite Asp des DD-Motivs wurde für dominant/negative Experimente in ein Alanin umgewandelt). Dadurch wurde auch eine Mlul-Stelle erzeugt. Auch das Oligonucleotid was used for in vitro mutagenesis to convert Asp869 to an Ala codon (i.e. the second Asp of the DD motif was converted to an alanine for dominant / negative experiments). This also created a Mlul site. The oligonucleotide too

5 ' - 5 '-

CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACGATGACAAA CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACGATGACAAA

TGAATTCAGATCTGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3' TGAATTCAGATCTGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3 '

wurde zur Insertion des «IBI Flag» (IBI, New Häven, CT) am C-Terminus verwendet und zur Erzeugung von EcoRI- und Bglll-Stellen für die Clonierung. Auch COD2866 wurde zur Umwandlung von AmpS zu AmpR vewendet und CODI941 zur Umwandlung von CatR zu CatS. was used to insert the “IBI Flag” (IBI, New Häven, CT) at the C-terminus and to create EcoRI and Bglll sites for cloning. COD2866 was also used to convert AmpS to AmpR and CODI941 to convert CatR to CatS.

pGRN130 pGRN130

Das Oligonucleotid The oligonucleotide

CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCA CCTCACC-3' CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCA CCTCACC-3 '

wurde bei einer in vitro-Mutagenese zur Umwandlung des Asp869-Codons in ein Ala-Codon vewendet (d.h. das zweite Asp des DD-Motivs wurde zur Erzeugung einer dominant/negativen Proteinvariante in ein Alanin umgewandelt). Dadurch wurde auch eine Mlul-Stelle erzeugt. Auch das Oligonucleotid was used in an in vitro mutagenesis to convert the Asp869 codon to an Ala codon (i.e. the second Asp of the DD motif was converted to an alanine to produce a dominant / negative protein variant). This also created a Mlul site. The oligonucleotide too

5 1 - 5 1 -

TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCCaCcATGCCGCGCGCTCCCCGC TG-3 ' TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCCaCcATGCCGCGCGCTCCCCGC TG-3 '

wurde bei einer in vitro-Mutagenese zur Umwandlung des Initiationscodons ATG der hTRT-codierenden Sequenz in eine «Kozak-Consensus»-Sequenz vewendet und zur Erzeugung von EcoRI und Bglll-Stellen für die Clonierung. Auch COD2866 wurde zur Umwandlung von AmpS zu AmpR (Ampicillin-Resi-stenz) vewendet und CODI 941 zur Umwandlung von CatR (Chloramphenicol-Resistenz) zu CatS (Chloramphenicol-Empfindlichkeit). was used in an in vitro mutagenesis to convert the initiation codon ATG of the hTRT coding sequence into a “Kozak consensus” sequence and to generate EcoRI and BglII sites for cloning. COD2866 was also used to convert AmpS to AmpR (ampicillin resistance) and CODI 941 to convert CatR (chloramphenicol resistance) to CatS (chloramphenicol sensitivity).

pGRN131 pGRN131

Das EcoRI-Fragment von pGRN128, das die hTRT-ORF mit einer «Kozak»-Sequenz und «IBI Flag» (IBI, New Häven, CT)-Mutationen enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212, so dass der hTRT-ORF von dem MPSV-Promotor exprimiert wird. The EcoRI fragment from pGRN128, which contains the hTRT ORF with a “Kozak” sequence and “IBI Flag” (IBI, New Haven, CT) mutations, is inserted into the EcoRI site of pBBS212 so that the hTRT ORF is expressed by the MPSV promoter.

pGRN132 pGRN132

Das EcoRI-Fragment von pGRN128, das den hTRT-ORF mit einer «Kozak»-Sequenz und «IBI Flag» The EcoRI fragment from pGRN128, which contains the hTRT ORF with a “Kozak” sequence and “IBI Flag”

130 130

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

(IBI, New Häven, CT)-Mutationen enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212, so dass die «anti-sense»-Sequenz des hTRT-ORF vom MPSV-Promotor exprimiert wird. (IBI, New Häven, CT) contains mutations inserted into the EcoRI site of pBBS212 so that the “anti-sense” sequence of the hTRT-ORF is expressed by the MPSV promoter.

pGRN133 pGRN133

Das EcoRI-Fragment von pGRN121, das die hTRT-codierende Sequenz enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212, so dass das hTRT-Protein unter der Kontrolle des MPSV-Promotors exprimiert wird. The EcoRI fragment from pGRN121, which contains the hTRT coding sequence, inserts into the EcoRI site of pBBS212 so that the hTRT protein is expressed under the control of the MPSV promoter.

pGRN134 pGRN134

Das EcoRI-Fragment von pGRN121, das die hTRT-codierende Sequenz enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212, so dass die «antisense»-Sequenz der hTRT codierenden Sequenz unter der Kontrolle des MPSV-Promotors exprimiert wird. Die mit diesem Vektor verwendeten selektierbaren Marker sind Chlor/HygB/PAC. The EcoRI fragment from pGRN121, which contains the hTRT coding sequence, is inserted into the EcoRI site of pBBS212 so that the “antisense” sequence of the hTRT coding sequence is expressed under the control of the MPSV promoter. The selectable markers used with this vector are chlorine / HygB / PAC.

pGRN135 pGRN135

pGRN126 wurde vollständig mit Mscl und Smal geschnitten und zur Deletion von mehr als 95% der inserierten hTRT codierenden Sequenz erneut ligiert. Ein Smal-MscI-Fragment wurde während dieses Prozesses erneut inseriert, um so für die Selektion die Cat-Aktivität wieder zu erzeugen. Dieses ungereinigte Plasmid wurde dann erneut mit Sali und EcoRI geschnitten und das das Initiationscodon der hTRT codierenden Sequenz enthaltende Fragment in die Sall-EcoRI-Stellen von pBBS212 inseriert. Danach entstand ein «antisense»-Expressionsplasmid, das die «antisense»-Sequenz des 5'-UTR und von 73 Basen der codierenden Sequenz exprimiert. Die mit diesem Vektor verwendbaren selektierbaren Marker sind Chlor/HygB/PAC. pGRN126 was completely cut with Mscl and Smal and re-ligated to delete more than 95% of the inserted hTRT coding sequence. A Smal-MscI fragment was reinserted during this process to re-generate Cat activity for selection. This unpurified plasmid was then cut again with Sali and EcoRI and the fragment containing the initiation codon of the hTRT coding sequence inserted into the Sall-EcoRI sites of pBBS212. An "antisense" expression plasmid was then produced which expresses the "antisense" sequence of the 5'-UTR and of 73 bases of the coding sequence. The selectable markers that can be used with this vector are chlorine / HygB / PAC.

pGRN136 pGRN136

Das Hindlll-Sall-Fragment von pGRN126, das die hTRT codierende Sequenz enthält, inseriert in die Hindlll-Sall-Stellen von pBBS242. The HindIII-SalI fragment of pGRN126, which contains the hTRT coding sequence, inserts into the HindIII-SalI sites of pBBS242.

pGRN137 pGRN137

Das Sall-Sse8387l-Fragment von pGRN130, das die «Kozak»-Sequenz enthält, inseriert in die Sall-Sse8387l-Stellen von pGRN136. The Sall-Sse8387l fragment of pGRN130, which contains the "Kozak" sequence, is inserted into the Sall-Sse8387l sites of pGRN136.

pGRN138 pGRN138

Das EcoRI-Fragment von pGRN124, das hTRT ohne den 3'-UTR enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pEGFP-C2, so dass die Orientierung von hTRT dieselbe ist wie für die EGFP-Domäne. The EcoRI fragment of pGRN124 containing hTRT without the 3'-UTR inserts into the EcoRI site of pEGFP-C2 so that the orientation of hTRT is the same as for the EGFP domain.

pGRN139 Das Oligonucleotid 5 1 - pGRN139 The oligonucleotide 5 1 -

CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACGATGACAAA CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACGATGACAAA

TGAATTCAGATCTGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3' TGAATTCAGATCTGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3 '

wurde zur Insertion des «IBI Flag» (IBI, New Häven, CT) am C-Terminus von hTRT in pGRN125 mittels in-vitro-Mutagenese verwendet und zur Erzeugung von EcoRI- und Bglll-Stellen für die Clonierung. Auch COD2866 wurde zur Umwandlung von AmpS zu AmpR (Ampicillin-Resistenz) verwendet und CODI941 zur Umwandlung von CatR (Chloramphenicol-Resistenz) zu Cats (Chloramphenicol-Empfind-lichkeit). was used to insert the “IBI Flag” (IBI, New Häven, CT) at the C-terminus of hTRT in pGRN125 using in vitro mutagenesis and to generate EcoRI and Bglll sites for cloning. COD2866 was also used to convert AmpS to AmpR (ampicillin resistance) and CODI941 to convert CatR (chloramphenicol resistance) to Cats (chloramphenicol sensitivity).

pGRN140 pGRN140

Das Ncol-Fragment, das die stromaufwärts gelegene Sequenz von genomischer hTRT und das erste Intron von hTRT von lambdaG55 enthält, inseriert in die Ncol-Stelle von pBBS167. Das Fragment ist so orientiert, dass hTRT sich in derselben Richtung befindet wie der lac-Promotor. The Ncol fragment, which contains the upstream sequence of genomic hTRT and the first intron of hTRT from lambdaG55, inserts into the Ncol site of pBBS167. The fragment is oriented so that hTRT is in the same direction as the lac promoter.

131 131

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

pGRN141 pGRN141

Das Ncol-Fragment, das die stromaufwärts gelegenen Sequenzen der genomischen hTRT und das erste Intron von hTRT von lambdaG55 enthält, inseriert in die Ncol-Stelle von pBBS167. Dieses Fragment ist so orientiert, dass hTRT im Vergleich zu dem lac-Promotor in der gegenläufigen Richtung ist. The Ncol fragment, which contains the upstream sequences of the genomic hTRT and the first intron of hTRT from lambdaG55, is inserted into the Ncol site of pBBS167. This fragment is oriented so that hTRT is in the opposite direction compared to the lac promoter.

pGRN142 pGRN142

Das Notl-Fragment vom lambdaG45, das die vollständige genomische -15 kbp-lnsertion, einschliesslich des hTRTGenpromotorbereichs enthält, wurde in die Notl-Stelle von Plasmid pBBS185 inseriert. Das Fragment ist so orientiert, dass der hTRT-ORF sich in einer zu dem lac-Promotor gegensätzlichen Orientierung befindet. The NotI fragment from lambdaG45, which contains the complete genomic -15 kbp insert, including the hTRT gene promoter region, was inserted into the NotI site of plasmid pBBS185. The fragment is oriented so that the hTRT ORF is in an opposite orientation to the lac promoter.

pGRN143 pGRN143

Das Notl-Fragment vom lambdaG45, das die vollständige genomische -15 kbp-lnsertion, einschliesslich des hTRTGenpromotorbereichs enthält, wurde in die Notl-Stelle von Plasmid pBBS185 inseriert. Das Fragment ist so orientiert, dass der hTRT-ORF sich in einer zu dem lac-Promotor selben Orientierung befindet. The NotI fragment from lambdaG45, which contains the complete genomic -15 kbp insert, including the hTRT gene promoter region, was inserted into the NotI site of plasmid pBBS185. The fragment is oriented so that the hTRT ORF is in the same orientation as the lac promoter.

pGRN144 pGRN144

Sall-Deletion von pGRN140 zur Entfernung von lambda-Sequenzen. SALL deletion of pGRN140 to remove lambda sequences.

pGRN145 pGRN145

Dieser Vektor wurde zur Expression von hTRT-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Das EcoRI-Fragment von pGRNl37, das die hTRT-codierende Sequenz enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212 zur Entfernung des Anteils der Sequenz, der dem 5'-UTR von hTRT-mRNA entspricht. Die hTRT codierende Sequenz ist so orientiert, dass sie unter der Kontrolle des MPSV-Promotors exprimiert wird. Die mit diesem Vektor verwendeten selektierbaren Marker sind Chlor/HygB/PAC. This vector was designed to express hTRT sequences in mammalian cells. The EcoRI fragment from pGRNl37 containing the hTRT coding sequence inserts into the EcoRI site of pBBS212 to remove the portion of the sequence that corresponds to the 5'-UTR of hTRT mRNA. The hTRT coding sequence is oriented so that it is expressed under the control of the MPSV promoter. The selectable markers used with this vector are chlorine / HygB / PAC.

pGRN146 pGRN146

Dieser Vektor wurde für die Expression von hTRT-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Das Sse8387l-Notl-Fragment von pGRN130, das die D869A-Mutation von hTRT enthält, inseriert in die Sse8387l-Notl-Stellen von pGRN137. Die mit diesem Vektor verwendeten seiektierbaren Marker sind Ampicillin/HygB/PAC. This vector was constructed for the expression of hTRT sequences in mammalian cells. The Sse8387l-Notl fragment of pGRN130, which contains the D869A mutation of hTRT, inserts into the Sse8387l-Notl sites of pGRN137. The selectable markers used with this vector are ampicillin / HygB / PAC.

pGRN147 pGRN147

Das Sse8387l-Notl-Fragment von pGRN139, das das «IBI Flag» (IBI, New Häven, CT) enthält, inseriert in die Sse8387l-Notl-Stellen von pGRN137. The Sse8387l-Notl fragment of pGRN139, which contains the “IBI Flag” (IBI, New Häven, CT), inserts into the Sse8387l-Notl sites of pGRN137.

pGRN148 pGRN148

Das Bglll-Eco47lll-Fragment von pGRN144, das den Promotorbereich von hTRT enthält, inseriert in Bglll-Nrul-Stellen von pSEAP2, wobei ein hTRT-Promotor/Reporter-Konstrukt entstand. The Bglll-Eco47lll fragment of pGRN144, which contains the promoter region of hTRT, is inserted into Bglll-Nrul sites of pSEAP2, resulting in an hTRT promoter / reporter construct.

pGRN149 pGRN149

Dieser Vektor ist ein Zwischenvektor für die Konstruktion eines Expressionsvektors für ein hTRT-Fusi-onsprotein. Das mutagene Oligonucleotid This vector is an intermediate vector for the construction of an expression vector for an hTRT fusion protein. The mutagenic oligonucleotide

3' wurde zur Anfügung einer Csp45l-Stelle an den C-Terminus von hTRT durch in vitro-Mutagenese von pGRN125 verwendet. Das «Stop»-Codon von hTRT wurde deletiert und gegen eine Csp451 -Stelle ausgetauscht. 3 'was used to add a Csp45l site to the C-terminus of hTRT by in vitro mutagenesis of pGRN125. The “Stop” codon from hTRT was deleted and exchanged for a Csp451 site.

Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Ampicillin. The selectable marker used with this vector is ampicillin.

pGRN150 pGRN150

Das Gblll-Fspl-Fragment von pGRN144, das den Promotorbereich von hTRT enthält, inseriert in die Bglll-Nrul-Stellen von pSEAP2, wodurch ein hTRT-Promotor/Reporter-Konstrukt entstand. The Gblll-Fspl fragment of pGRN144, which contains the promoter region of hTRT, is inserted into the Bglll Nrul sites of pSEAP2, resulting in an hTRT promoter / reporter construct.

132 132

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

pGRN151 pGRN151

Dieser Vektor wurde zur Expression von hTRT-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Das EcoRI-Fragment von pGRN147, das die hTRT codierende Sequenz enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212, um so den Anteil der Sequenz zu entfernen, der dem 5'-UTR der hTRT-mRNA entspricht. Die hTRT codierende Sequenz ist so orientiert, dass sie unter der Kontrolle des MPSV-Promotors exprimiert wird. Die mit diesem Vektor verwendeten Marker sind Chlor/HygB/PAC. This vector was designed to express hTRT sequences in mammalian cells. The EcoRI fragment from pGRN147 containing the hTRT coding sequence inserts into the EcoRI site of pBBS212 so as to remove the portion of the sequence which corresponds to the 5'-UTR of the hTRT mRNA. The hTRT coding sequence is oriented so that it is expressed under the control of the MPSV promoter. The markers used with this vector are chlorine / HygB / PAC.

pGRN152 pGRN152

Das EcoRI-Fragment von pGRN146, das die hTRT codierende Sequenz enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212 zur Entfernung des Anteils der Sequenz, der dem 5'-UTR von hTRT entspricht. Die hTRT codierende Sequenz ist so orientiert, dass sie unter der Kontrolle des MPSV-Promotors exprimiert wird. The EcoRI fragment from pGRN146, which contains the hTRT coding sequence, inserts into the EcoRI site of pBBS212 to remove the portion of the sequence that corresponds to the 5'-UTR of hTRT. The hTRT coding sequence is oriented so that it is expressed under the control of the MPSV promoter.

pGRN153 pGRN153

Das Styl-Fragment von pGRN130, das die D869->A-Mutation von hTRT enthält (eine hTRT-Variante codierende Sequenz) wurde in die Styl-Stellen von pGRN158 inseriert, wodurch ein Plasmid erhalten wurde, das die hTRT codierende Sequenz mit einer «Kozak-Consensus»-Sequenz an seinem 5'-Ende, eine «IBI FLAG»-Sequenz an seinem 3'-Ende der den C-Terminus codierende Bereich und die D869->A-Mutation enthält. The styl fragment of pGRN130 containing the D869-> A mutation of hTRT (a sequence coding for an hTRT variant) was inserted into the styl sites of pGRN158, whereby a plasmid was obtained which contained the hTRT coding sequence with a « Kozak Consensus »sequence at its 5 'end, an" IBI FLAG "sequence at its 3' end, which contains the region coding for the C-terminus and the D869-> A mutation.

pGRN154 pGRN154

Das das hTRT-Gen enthaltende EcoRI-Fragment von pGRN153, wurde in die EcoRI-Stelle von Plasmid pBS212 so inseriert, dass der hTRT-ORF sich in derselben Orientierung befindet wie der MPSV-Promotor. Dadurch ensteht ein MPSV-gesteuertes Expressionsplasmid, das das hTRT-Protein mit einer «Kozak-Consensus»-Sequenz an seinem aminoterminalen Ende eine «IBI FLAG» an seinem C-Termi-nus und die D869-»A-Mutation exprimiert. The EcoRI fragment of pGRN153 containing the hTRT gene was inserted into the EcoRI site of plasmid pBS212 so that the hTRT ORF is in the same orientation as the MPSV promoter. This creates an MPSV-controlled expression plasmid that expresses the hTRT protein with a “Kozak consensus” sequence at its amino terminal end, an “IBI FLAG” at its C-terminus and the D869- “A mutation.

pGRN155 pGRN155

Dieser Vektor wurde zur Expression von hTRT-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Die Insertion enthielt cDNA von hTRT in vollständiger Länge ohne 5'- und 3'-UTR und «Kozak»-Sequenzen. Das EcoRI-Fragment von pGRN145, das die hTRT-cDNA mit der «Kozak-Consensus»-Sequenz jedoch keine 3'- oder 5'-UTR enthält, wurde in die EcoRI-Stelle von p91023(B) inseriert, so dass das hTRT in derselben Orientierung ist wie der DHFR-ORF. Dadurch entsteht ein Expressionsvektor für die transiente Expression von hTRT. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Tetracyclin. This vector was designed to express hTRT sequences in mammalian cells. The insert contained full-length hTRT cDNA without 5 'and 3' UTR and "Kozak" sequences. The EcoRI fragment from pGRN145, which contains the hTRT cDNA with the "Kozak Consensus" sequence but no 3'- or 5'-UTR, was inserted into the EcoRI site of p91023 (B) so that the hTRT is in the same orientation as the DHFR-ORF. This creates an expression vector for the transient expression of hTRT. The selectable marker used with this vector is tetracycline.

pGRN156 pGRN156

Dieser Vektor wurde zur Expression von hTRT-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Das EcoRI-Fragment von pGRN146, das die D869A-Mutation der hTRT-cDNA mit der «Kozak-Consensus»-Se-quenz ohne 3'- oder 5'-UTR enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von p91023(B), so dass hTRT in der gleichen Orientierung ist wie der DHFR-ORF. Dadurch entsteht ein Expressionsvektor für die transiente Expression von hTRT. Die Insertion enthielt cDNA von hTRT mit vollständiger Länge ohne 5'- und 3'-UTR, D869A und «Kozak»-Sequenzen. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Tetracyclin. This vector was designed to express hTRT sequences in mammalian cells. The EcoRI fragment from pGRN146, which contains the D869A mutation of the hTRT cDNA with the "Kozak Consensus" sequence without 3'- or 5'-UTR, is inserted into the EcoRI site of p91023 (B), so that hTRT is in the same orientation as the DHFR ORF. This creates an expression vector for the transient expression of hTRT. The insert contained full length hTRT cDNA without 5 'and 3' UTR, D869A and "Kozak" sequences. The selectable marker used with this vector is tetracycline.

PGRN157 PGRN157

Dieser Vektor wurde für die Expression von hTRT-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Das EcoRI-Fragment von pGRN147, das die hTRT-cDNA mit dem «Kodak flag» am C-Terminus enthält, und die «Kozak-Consensus»-Sequenz ohne 3'- oder 5'-UTR, inseriert in die EcoRI-Stelle von p91023(B), so dass hTRT in der gleichen Orientierung ist wie der DHFR-ORF. Dadurch entsteht ein Expressionsvektor für die transiente Expression von hTRT. Die Insertion enthielt cDNA von hTRT mit vollständiger Länge ohne 5'- und 3'-UTR eine «FLAG»-Sequenz (Immunex Corp., Seattle, WA) und «Kozak»-Sequenzen. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Tetracyclin. This vector was constructed for the expression of hTRT sequences in mammalian cells. The EcoRI fragment from pGRN147, which contains the hTRT cDNA with the “Kodak flag” at the C-terminus, and the “Kozak Consensus” sequence without 3'- or 5'-UTR, inserted into the EcoRI site of p91023 (B) so that hTRT is in the same orientation as the DHFR ORF. This creates an expression vector for the transient expression of hTRT. The insert contained full length hTRT cDNA without 5'- and 3'-UTR, a "FLAG" sequence (Immunex Corp., Seattle, WA) and "Kozak" sequences. The selectable marker used with this vector is tetracycline.

pGRN158 pGRN158

Dieser Vektor wurde für die Expression und Mutagenese von TRT-Sequenzen in E. coli konstruiert. Das EcoRI-Fragment von pGRN151, das den hTRT-ORF enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS183, so dass der hTRT-ORF im Vergleich zu dem lac-Promotor in der gegenläufigen Orientierung This vector was constructed for the expression and mutagenesis of TRT sequences in E. coli. The EcoRI fragment from pGRN151, which contains the hTRT-ORF, inserts into the EcoRI site of pBBS183 so that the hTRT-ORF is in the opposite orientation compared to the lac promoter

133 133

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

vorliegt. Die Insertion enthielt cDNA von hTRT mit vollständiger Länge ohne 5'- und 3'-UTR, eine «FLAG»-Sequenz (Immunex Corp., Seattle, WA) und «Kozak»-Sequenzen. Die codierende Sequenz wird von einem T7-Promotor gesteuert. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Ampicillin. is present. The insert contained full length hTRT cDNA without 5'- and 3'-UTR, a "FLAG" sequence (Immunex Corp., Seattle, WA) and "Kozak" sequences. The coding sequence is controlled by a T7 promoter. The selectable marker used with this vector is ampicillin.

5 5

PGRN159 PGRN159

Dieser Vektor wurde zur Expression und Mutagenese von TRT-Sequenzen in E. coli konstruiert. Das Hel-Kpnl-Fragment von pGRN138, das die Fusion von EGFP an hTRT enthält, inseriert in die Xbal-10 Kpnl-Stellen von pBlueScriptllKS+. Dies ergibt einen T7-Expressionsvektor für das Fusionsprotein (die codierende Sequenz wird von einem T7-Promotor gesteuert). Diese Insertion enthält hTRT-cDNA mit vollständiger Länge ohne den 3'-UTR als ein Fusionsprotein mit EGFP. Der mit diesem Vektor verwendete selektive Marker ist Ampicillin. This vector was constructed for the expression and mutagenesis of TRT sequences in E. coli. The Hel-Kpnl fragment from pGRN138, which contains the fusion of EGFP to hTRT, inserts into the Xbal-10 Kpnl sites of pBlueScriptllKS +. This results in a T7 expression vector for the fusion protein (the coding sequence is controlled by a T7 promoter). This insert contains full length hTRT cDNA without the 3'-UTR as a fusion protein with EGFP. The selective marker used with this vector is ampicillin.

15 pGRN160 15 pGRN160

Dieser Vektor wurde zur Expression von «antisense»-hTR-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Die codierende Sequenz wird von einem MPSV-Promotor gesteuert. Das Xhol-Nsil-Fragment von pGRN90, das hTR mit vollständiger Länge enthält inseriert in die Sall-SSE/8387I-Stellen von pBBS295. Dies er-20 gibt einen transienten stabilen Vektor, der hTR in der «antisense»-Orientierung exprimiert. Ein GPT-Marker wurde in den Vektor eingebaut. Die mit diesem Vektor verwendeten selektierbaren Marker sind Chlor/gpt/PAC. This vector was constructed for the expression of “antisense” hTR sequences in mammalian cells. The coding sequence is controlled by an MPSV promoter. The Xhol-Nsil fragment of pGRN90 containing the full length hTR inserted into the Sall SSE / 8387I sites of pBBS295. This er-20 gives a transient stable vector which expresses hTR in the «antisense» orientation. A GPT marker was built into the vector. The selectable markers used with this vector are chlorine / gpt / PAC.

pGRN161 pGRN161

25 25th

Dieser Vektor wurde zur Expression von «sense»-HT-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Ein Xhol-Nsil-Fragment von pGRN89, das hTR mit vollständiger Länge enthält, inseriert in die Sall-SSE8387I-Stellen von pBBS295. Dies ergibt einen transienten/stabilen Vektor, der hTR in der «sense»-Orientierung exprimiert. Die codierende Sequenz wird von einem MPSV-Promotor gesteuert. Ein GPT-30 Marker wurde in den Vektor eingebaut. Die mit diesem Vektor verwendeten Marker sind Chlor/gpt/PAC. This vector was constructed for the expression of "sense" -HT sequences in mammalian cells. An Xhol-Nsil fragment from pGRN89 containing full-length hTR inserts into the Sall SSE8387I sites of pBBS295. This results in a transient / stable vector that expresses hTR in the “sense” orientation. The coding sequence is controlled by an MPSV promoter. A GPT-30 marker was built into the vector. The markers used with this vector are chlorine / gpt / PAC.

pGRN162 pGRN162

Ein Xhol-Nsil-Fragment von pGRN87, das hTR mit vollständiger Länge enthält, inseriert in die Sali-35 SSE8387I-Stellen von pBBS295. Dies ergibt einen transienten/stabilen Vektor, der verkürzte hTR (von Position +108 bis +435) in der «sense»-Orientierung exprimiert. An Xhol-Nsil fragment from pGRN87 containing full length hTR inserts into the Sali 35 SSE8387I sites of pBBS295. This results in a transient / stable vector which expresses shortened hTR (from position +108 to +435) in the «sense» orientation.

pGRN163 pGRN163

40 Dieser Vektor wurde zur Expression und Mutagenese von TRT-Sequenzen in E. coli konstruiert. Die codierende Sequenz wird von einem T7-Promotor gesteuert. RA45 40 This vector was constructed for the expression and mutagenesis of TRT sequences in E. coli. The coding sequence is controlled by a T7 promoter. RA45

(5'-gccacccccgcgctgcctcgagctccccgctgc-3') (5'-gccacccccgcgctgcctcgagctccccgctgc-3 ')

45 wird in einer in vitro-Mutagenese zur Überführung des Initiations-Met in hTRT zu Leu verwendet und zur Einführung einer Xhol-Stelle in den beiden nächsten Codons nach dem Leu. Auch COD 1941 wurde zur Überführung von CatR nach CatS und Einführung einer BSPHI-Stelle verwendet und COD 2866 zur Überführung vom AmpS zu AmpR, wobei eine Fspl-Stelle eingeführt wurde. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Ampicillin. 45 is used in an in vitro mutagenesis to convert the initiation Met into hTRT to Leu and to introduce an Xhol site in the next two codons after the Leu. COD 1941 was also used for the transfer from CatR to CatS and the introduction of a BSPHI position and COD 2866 for the transfer from AmpS to AmpR, whereby an Fspl point was introduced. The selectable marker used with this vector is ampicillin.

50 pGRN164 50 pGRN164

Dieser Vektor wurde für die Expression von hTR-Sequenzen in E. coli konstruiert. Die Primer hTR+1 ggggaagctttaatacgactcactatagggttgcggagggtgggcctg-3' This vector was constructed for the expression of hTR sequences in E. coli. The primers hTR + 1 ggggaagctttaatacgactcactatagggttgcggagggtgggcctg-3 '

55 55

und hTR +44 5 and hTR +44 5

ccccggatcctgcgcatgtgtgagccgagtcctggg-3' ccccggatcctgcgcatgtgtgagccgagtcctggg-3 '

wurden zur Amplifikation eines Fragments von pGRN33 mittels PCR vewendet, das hTR mit vollständi-60 ger Länge und dem T7-Promotor an seinem 5'-Ende (wie in hTR+l) enthält. Eine BamHI-Hindlll-Spal-tung des PCR-Produkts wurde in die BamHI-Hindlll-Stellen von pUC119 inseriert. Die codierende Sequenz wird von einem T7-Promotor gesteuert. Der mit diesem Vektor vewendete selektierbare Marker ist Ampicillin. were used for amplification of a fragment of pGRN33 by means of PCR which contains hTR with a complete length of 60 and the T7 promoter at its 5 'end (as in hTR + 1). A BamHI HindIII cleavage of the PCR product was inserted into the BamHI HindIII sites of pUC119. The coding sequence is controlled by a T7 promoter. The selectable marker used with this vector is ampicillin.

65 65

134 134

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

pGRN165 pGRN165

Dieser Vektor wurde für die Expression und Mutagenese von hTRT-Sequenzen in E. coli verwendet. Die codierende Sequenz wird von einem T7-Promotor gesteuert. Ein EcoRI-Fragment von pGRN145, das den hTRT-orf mit einer «Kozak»-Sequenz am vorderen Ende enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBluescriptllSK+, so dass hTRT in derselben Orientierung vorliegt wie der T7-Promotor. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Ampicillin. This vector was used for the expression and mutagenesis of hTRT sequences in E. coli. The coding sequence is controlled by a T7 promoter. An EcoRI fragment from pGRN145, which contains the hTRT-orf with a “Kozak” sequence at the front end, is inserted into the EcoRI site of pBluescriptIISK +, so that hTRT is in the same orientation as the T7 promoter. The selectable marker used with this vector is ampicillin.

pGRN166 pGRN166

Dieser Vektor wurde zur Expression und Mutagenese von TRTSequenzen in Säugerzellen konstruiert. Die codierende Sequenz wird von einem T7-Promotor gesteuert. Das EcoRI-Fragment von pGRN151, das den hTRT-ORF mit einer «Kozak»-Sequenz am vorderen Ende enthält und ein «IBI flag» am hinteren Ende, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBluescriptllSK+ so dass hTRT in der gleichen Orientierung vorliegt wie der T7-Promotor. Die Insertion enthielt hTRT-cDNA mit vollständiger Länge ohne 5'- und 3'-UTR, eine «FLAG»-Sequenz (Immunex Corp. Seattle, WA) und «Kozak»-Sequenzen. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Ampicillin. This vector was constructed for the expression and mutagenesis of TRT sequences in mammalian cells. The coding sequence is controlled by a T7 promoter. The EcoRI fragment from pGRN151, which contains the hTRT ORF with a “Kozak” sequence at the front end and an “IBI flag” at the rear end, is inserted into the EcoRI site of pBluescriptllSK + so that hTRT is in the same orientation as the T7 promoter. The insert contained full-length hTRT cDNA without 5 'and 3' UTR, a "FLAG" sequence (Immunex Corp. Seattle, WA) and "Kozak" sequences. The selectable marker used with this vector is ampicillin.

pGRN167 pGRN167

Ein Avrll-Stul-Fragment von pGRN144, das das 5'-Ende des hTRT-ORF enthält, inseriert in die Xbal-Stul-Stellen von pBES161. An Avrll-Stul fragment from pGRN144 containing the 5 'end of the hTRT ORF inserts into the Xbal-Stul sites of pBES161.

pGRN168 pGRN168

Das die optimierte hTRT-Expressionskassette enthaltende EcoRI-Fragment von pGRN145 wurde in die EcoRI-Stelle von pIND so inseriert, dass die hTRT codierende Sequenz in derselben Orientierung ist wie der miniCMV-Promotor. The EcoRI fragment from pGRN145 containing the optimized hTRT expression cassette was inserted into the EcoRI site of pIND so that the hTRT coding sequence is in the same orientation as the miniCMV promoter.

pGRN169 pGRN169

Das die optimierte hTRT-Expressionskassette enthaltende EcoRI-Fragment von pGRN145 wurde so in die EcoRI-Stelle von pIND inseriert, dass das hTRT in der umgekehrten Orientierung ist, bezogen auf den miniCMV-Promotor. The EcoRI fragment of pGRN145 containing the optimized hTRT expression cassette was inserted into the EcoRI site of pIND in such a way that the hTRT is in the opposite orientation with respect to the miniCMV promoter.

pGRN170 pGRN170

Das die optimierte hTRT-Expressionskassette enthaltende EcoRI-Fragment von pGRN145 wurde so in die EcoRI-Stelle von plND(spl) inseriert, dass das hTRT in der gegenläufigen Orientierung vorliegt, bezogen auf den miniCMV-Promotor. The EcoRI fragment from pGRN145 containing the optimized hTRT expression cassette was inserted into the EcoRI site of pIDN (spl) in such a way that the hTRT is in the opposite orientation, based on the miniCMV promoter.

pGRN171 pGRN171

Das Eco47ll-Narl-Fragment von pGRN163 inseriert in die Eco47111-Narl-Stellen von pGRN167. Damit wird die M1L-Mutation in ein Fragment der genomischen hTRT-DNA eingeführt. The Eco47ll-Narl fragment from pGRN163 inserts into the Eco47111-Narl sites of pGRN167. The M1L mutation is thus introduced into a fragment of the genomic hTRT DNA.

pGRN172 pGRN172

Das BamHI-Stul-Fragment von pGRN171, das in hTRT die Mutation Met zu Leu enthält, inseriert in die Bglll-Nrul-Stellen von pSEAP2-«Basic». The BamHI-Stul fragment from pGRN171, which contains the Met to Leu mutation in hTRT, inserts into the Bglll-Nrul sites of pSEAP2- «Basic».

pGRN173 pGRN173

Das EcoRV-Eco47lll-Fragment von pGRN144, das das 5'-Ende des hTRT-Promotorbereichs enthält, wurde in die Srfl-Eco47lll-Stellen von pGRN172 inseriert. Dadurch entstand ein Promotor/Reporter-Plasmid, das den Promotorbereich von hTRT von etwa 2,3 kb stromaufwärts des Starts des hTRT-ORF bis unmittelbar nach dem ersten Intron im codierenden Bereich mit der Met1-»Leu-Mutation enthält. The EcoRV-Eco47lll fragment from pGRN144, which contains the 5 'end of the hTRT promoter region, was inserted into the Srfl-Eco47lll sites of pGRN172. This resulted in a promoter / reporter plasmid which contains the promoter region of hTRT of approximately 2.3 kb upstream of the start of the hTRT-ORF until immediately after the first intron in the coding region with the Met1- »Leu mutation.

pGTN174 pGTN174

Das die «optimierte» hTRT-Expressionskassette enthaltende EcoRI-Fragment von pGRN145 wurde in die EcoRI-Stelle von plND(spl) so inseriert, dass das hTRT dieselbe Orientierung hat wie der miniCMV-Promotor. The EcoRI fragment from pGRN145 containing the “optimized” hTRT expression cassette was inserted into the EcoRI site of pIDN (spl) in such a way that the hTRT has the same orientation as the miniCMV promoter.

135 135

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Beispiel 7 Example 7

Rekonstitution von Telomerase-Aktivität a) Co-Expression von hTRT und hTR in vitro Reconstitution of telomerase activity a) Co-expression of hTRT and hTR in vitro

In diesem Beispiel wird die Co-Expression von hTRT und hTR mittels eines zellfreien in vitro-Ex-pressionssystems beschrieben. Die Ergebnisse zeigen, dass das von pGRN121 codierte hTRT-Polypeptid ein katalytisch aktives Teiomerase-Protein codiert, und dass die in vitro-Rekonstitution (IVR) des Telomerase-RNPs unter Verwendung rekombinant exprimierter hTRT und hTR erzielt werden kann. In this example, the co-expression of hTRT and hTR is described using a cell-free in vitro expression system. The results show that the hTRT polypeptide encoded by pGRN121 encodes a catalytically active teiomerase protein and that the in vitro reconstitution (IVR) of the telomerase RNP can be achieved using recombinantly expressed hTRT and hTR.

Telomerase-Aktivität wurde durch Zugabe linearisierter Plasmide mit hTRT (pGRN121; 1 ng DNA, gespalten mit Xbal) und hTR (pHTR+1; 1 ng, gespalten mit Fspl) zu einem gekoppelten Transpriptions/ Translations-Reticulocyten-Lysat (Promega TNT®) rekonstituiert. pHTR+1 ist ein Plasmid, das nach Linearisierung mit Fspl und anschliessender Transkription durch T7-RNA-Polymerase ein Transkript mit 445 Nucleotiden erzeugt, das mit dem Nucleotid +1 beginnt und sich bis zu dem Nucleotid 446 von hTR erstreckt (Autexier et al., EMBO J. 15 (1996), 5928). Für eine 50 nl-Reaktion wurden die folgenden Bestandteile zugegeben: 2 ngl TNT®-Puffer, 1 n' TNT®-T7-RNA-Polymerase, 1 nl 1 mM Aminosäuregemisch, 40 Einheiten Rnasin® RNase-lnhibitor, jeweils 1 ng linearisierte Matrizen-DNA und 25 nl TNT®-Reticulocytenlysat. Die Bestandteile wurden in dem vom Hersteller empfohlenen Verhältnis zugefügt und 90 Minuten bei 30°C inkubiert. Die Transkription wurde durch den T7-Promotor gesteuert und sie konnte auch vor der Zugabe von Reticulocytenlysat mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt werden. Nach der Inkubation wurden 5 und 10 n' der programmierten Transkriptions/Translations-Reaktion hinsichtlich Te-lomerase-Aktivität mittels des vorstehend beschriebenen TRAP-Assays (Autexier et al., a.a.O.) unter Verwendung von 20 PCR-Cyclen zur Signalamplifikation untersucht. Telomerase activity was increased by adding linearized plasmids with hTRT (pGRN121; 1 ng DNA, cleaved with Xbal) and hTR (pHTR + 1; 1 ng, cleaved with Fspl) to a coupled transcription / translation reticulocyte lysate (Promega TNT®) reconstituted. pHTR + 1 is a plasmid which, after linearization with Fspl and subsequent transcription by T7 RNA polymerase, generates a transcript with 445 nucleotides, which begins with nucleotide +1 and extends to nucleotide 446 of hTR (Autexier et al. , EMBO J. 15 (1996), 5928). For a 50 nl reaction, the following ingredients were added: 2 ngl TNT® buffer, 1 n 'TNT® T7 RNA polymerase, 1 nl 1 mM amino acid mixture, 40 units RNasin® RNase inhibitor, each 1 ng linearized matrices -DNA and 25 nl TNT® reticulocyte lysate. The ingredients were added in the ratio recommended by the manufacturer and incubated at 30 ° C for 90 minutes. The transcription was controlled by the T7 promoter and could also be carried out with similar results before the addition of reticulocyte lysate. After incubation, 5 and 10 n 'of the programmed transcription / translation response for Te-isomerase activity were examined using the TRAP assay described above (Autexier et al., Op. Cit.) Using 20 PCR cycles for signal amplification.

Die Ergebnisse der Rekonstitution sind in Fig. 10 gezeigt. Für jede Transkriptions-Translations-Reakti-on gibt es drei Spuren. Die ersten zwei Spuren sind Duplikat-Assays und die dritte Spur ist eine zum Ausschluss PCR-erzeugter Artefacte vor der TRAP-Phase hitzedenaturierte (953C, 5 Minuten) Duplikatprobe. The results of the reconstitution are shown in Fig. 10. There are three lanes for each transcription-translation reaction. The first two lanes are duplicate assays and the third lane is a duplicate sample heat-denatured (953C, 5 minutes) to exclude PCR-generated artifacts before the TRAP phase.

Wie in Fig. 10 gezeigt, hat das Reticulocytenlysat keine nachweisbare Telomerase-Aktivität (Spur 6). In ähnlicher Weise wird keine nachweisbare Aktivität beobachtet, wenn entweder hTR allein (Spur 1) oder das hTRT-Gen mit vollständiger Länge (Spur 4) zu dem Lysat gegeben werden. Wenn beide Komponenten zugegeben werden (Spur 2), wird Telomerase-Aktivität erzeugt, wie dies anhand des charakteristischen Musters von Wiederholungsleitern gezeigt wird. Wenn der carboxyterminale Bereich des hTRT-Gens durch Spaltung des Vektors mit Ncol entfernt wird («verkürztes hTRT») wird TelomeraseAktivität aufgehoben (Spur 3). Spur 5 zeigt, dass die Translation der verkürzten hTRT allein keine Telomerase-Aktivität erzeugt. Spur «R8» zeigt eine positive Kontrolle für eine Telomerase-Produktleiter, die durch «TRAP» von TSR8 (einem synthetischen Telomerase-Produkt mit einer Nucleotidsequenz des Standards für Quantifizierung) erzeugt wird As shown in Figure 10, the reticulocyte lysate has no detectable telomerase activity (lane 6). Similarly, no detectable activity is observed when either hTR alone (lane 1) or the full length hTRT gene (lane 4) is added to the lysate. When both components are added (lane 2), telomerase activity is generated, as shown by the characteristic pattern of repeats. If the carboxy-terminal region of the hTRT gene is removed by cleavage of the vector with Ncol («shortened hTRT»), telomerase activity is abolished (lane 3). Lane 5 shows that translation of the truncated hTRT alone does not produce telomerase activity. Lane "R8" shows a positive control for a telomerase product ladder generated by "TRAP" from TSR8 (a synthetic telomerase product with a nucleotide sequence of the standard for quantification)

C5'-ATTCCGTCGAGCAGAGTTAG[GGTTAG]r3')). C5'-ATTCCGTCGAGCAGAGTTAG [GGTTAG] r3 ')).

B) Mischen von hTRT und hTR in vitro B) Mixing hTRT and hTR in vitro

Die in vitro-Rekonstitution von Telomerase-Aktivität wurde auch durch Vermischen erzielt. hTRT wurde, wie vorstehend beschrieben, transkribiert und translatiert, jedoch ohne die Zugabe des hTR-Plas-mids. Die Rekonstitution des TelomeraseRNP wurde dann durch Vermischen des hTRT-Translationsge-misches mit hTR (vorher durch die Transkription mit T7-RNA-Polymerase von phTR+1-Fsp erzeugt) im Verhältnis von 2 AI hTRT-Translationsgemisch zu 2 n' hTR (1 ng) und anschliessender 90minütiger Inkubation bei 30°C erzielt. Dieses Verfahren der hTRT-hTR-Rekonstitution wird als «verbundene Rekonstitution» oder «verbundene IVR» bezeichnet. In diesem Gemisch ist Telomerase-Aktivität vorhanden (d.h. kann nachgewiesen werden). Ein verbessertes Signal wurde nach partieller Reinigung der Aktivität durch DEAE-Chromatographie beobachtet. In diesem Fall wurde eine «Millipore Ultrafree- MC DEAE Zentralfilter»-Vorrichtungen gemäss Standardverfahren (d.h. gemäss den Anweisungen des Herstellers) verwendet. Die verwendeten Puffer waren: hypoO.1, hypo0.2 und hypol.0, wobei hypo 20 mM Hepes-KOH, pH-Wert 7,9, 2 mM MgCh, 1 mM EGTA, 10% Glycerin, 0,1% NP-40, 1 mM DTT, 1 mM Natriummetabisulfit, 1 mM Benzamidin und 0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) ist und wobei sich 0.1, 0.2 und 1.0 auf 0,1, 0,2 oder 1,0 M KCl beziehen. Die Filter wurden mit hpyol.O vorkonditioniert, mit hypoO.1 gewaschen, danach wurde die rekonstituierte Telomerase aufgeladen, die Säule mit hypoo.1 und im Anschluss daran hypo0.2 gewaschen und die rekonstituierte Telomerase wurde mit hypo 1.0 mit dem halben Volumen im Vergleich zu dem Aufladvolumen eluiert. Diese Zubereitung konnte bei -70°C in gefrorenem Zustand aufbewahrt werden und sie behält Aktivität. The in vitro reconstitution of telomerase activity was also achieved by mixing. hTRT was transcribed and translated as described above, but without the addition of the hTR plasmid. Reconstitution of the TelomeraseRNP was then accomplished by mixing the hTRT translation mixture with hTR (previously generated by transcription with T7 RNA polymerase from phTR + 1-Fsp) in the ratio of 2 Al hTRT translation mixture to 2 n 'hTR (1 ng) and subsequent 90-minute incubation at 30 ° C. This process of hTRT-hTR reconstitution is referred to as “linked reconstitution” or “linked IVR”. Telomerase activity is present in this mixture (i.e. can be detected). An improved signal was observed after partial purification of the activity by DEAE chromatography. In this case, a “Millipore Ultrafree-MC DEAE central filter” device was used according to standard procedures (i.e. according to the manufacturer's instructions). The buffers used were: hypoO.1, hypo0.2 and hypol.0, with hypo 20 mM Hepes-KOH, pH 7.9, 2 mM MgCh, 1 mM EGTA, 10% glycerol, 0.1% NP- 40, 1mM DTT, 1mM sodium metabisulfite, 1mM benzamidine and 0.2mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and where 0.1, 0.2 and 1.0 refer to 0.1, 0.2 or 1.0 M KCl. The filters were preconditioned with hpyol.O, washed with hypoO.1, then the reconstituted telomerase was charged, the column was washed with hypoo.1 and then hypo0.2, and the reconstituted telomerase was compared with half the volume using hypo 1.0 to the charging volume eluted. This preparation could be stored frozen at -70 ° C and it remains active.

Telomerase-Aktivität wurde in einem zweistufigen Verfahren untersucht. Im ersten Schritt wurde ein Telomerase activity was examined in a two-step procedure. The first step was a

136 136

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

üblicher TelomeraseAssay wie von Morin, Cell 59 (1989), 521 beschrieben durchgeführt, ausser dass keine radioaktive Markierung verwendet wurde. Bei dem zweiten Schritt wurde ein Aliquot mittels des «TRAP»-Verfahrens für 20 bis 30 Cyclen (wie vorstehend beschrieben) untersucht. Der übliche Telome-rase-Assay wurde so durchgeführt, dass 1 bis 10 pl rekonstituierte Telomerase untersucht wurden in 25 mM Tris-HCI, pH-Wert 8,3, 50 mM Kaliumacetat, 1 mM EGTA, 1 mM MgCfe, 2 mM DATP, 2 mM TTP, 10 nM dGTP und 1 nM Primer (üblicherweise M2, AATCCGTCGAGCAGAGTT) in einem Endvolumen von 40 bis 50 nl bei 30°C und für 60 bis 180 Minuten. Die Reaktion wurde durch 5minütiges Erhitzen auf 95°C gestoppt und mit 1-10 jil des Gemisches des ersten Schritts wurde der zweite Schritt, die «TRAP»-Reaktion (50 pl) durchgeführt. Usual telomerase assay as described by Morin, Cell 59 (1989), 521, except that no radioactive labeling was used. In the second step, an aliquot was examined using the “TRAP” method for 20 to 30 cycles (as described above). The usual telomerase assay was carried out in such a way that 1 to 10 μl of reconstituted telomerase were investigated in 25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM potassium acetate, 1 mM EGTA, 1 mM MgCfe, 2 mM DATP, 2 mM TTP, 10 nM dGTP and 1 nM primer (usually M2, AATCCGTCGAGCAGAGTT) in a final volume of 40 to 50 nl at 30 ° C and for 60 to 180 minutes. The reaction was stopped by heating at 95 ° C. for 5 minutes and the second step, the “TRAP” reaction (50 μl), was carried out with 1-10 ml of the mixture from the first step.

In zusätzlichen Experimenten wurde die Synthese von hTRT und hTR während einer in vitro-Rekon-stitution anhand des Einbaus von 35S-Methionin bzw. Northern blotting überwacht. Proteine mit etwa der vorhergesagten Grösse wurden für hTRT (127 kD), hTRT-Nco (85 kD) und pro90hTRT (90 kD) in etwa äquimolaren Mengen (relativ zueinander) synthetisiert. Die Northern-Analyse zeigte, dass die hTR-Synthese die korrekte Grösse (445 Nucleotide) aufwies und vorherrschend intakt war. In additional experiments, the synthesis of hTRT and hTR was monitored during an in vitro reconstitution using the incorporation of 35S methionine and Northern blotting. Proteins of approximately the predicted size were synthesized for hTRT (127 kD), hTRT-Nco (85 kD) and pro90hTRT (90 kD) in approximately equimolar amounts (relative to one another). Northern analysis showed that hTR synthesis was the correct size (445 nucleotides) and was predominantly intact.

Für den Fachmann sind Variationen des oben beschriebenen Rekonstitutionsprotokolls offensichtlich. Beispielsweise können folgende Parameter variiert werden: Rekonstitutionszeit und Temperatur, das Vorhandensein oder die Konzentration von Bestandteilen wie monovalente Salze (z.B. NaCI, KCl, Kaliumacetat, Kaliumglutamat etc.), divalente Salze (MgCfe, MnCb, MgSO-t, etc.), Denaturierungsmittel (Harnstoff, Formamid etc.), Detergenzien (NP-40, Tween, CHAPS, etc.). Es können auch alternative verbesserte Reinigungsverfahren (z.B. Immunpräzipitation, Affinitätschromatographie oder Standardchromatographie) angewandt werden. Diese und andere Parameter können auf systematische Weise variiert werden, um so die Bedingungen für bestimmte Assays oder andere Rekonstitutionsprotokolle zu optimieren. Variations on the reconstitution protocol described above will be apparent to those skilled in the art. For example, the following parameters can be varied: reconstitution time and temperature, the presence or the concentration of constituents such as monovalent salts (e.g. NaCl, KCl, potassium acetate, potassium glutamate etc.), divalent salts (MgCfe, MnCb, MgSO-t, etc.), denaturing agents (Urea, formamide etc.), detergents (NP-40, Tween, CHAPS, etc.). Alternative improved purification methods (e.g. immunoprecipitation, affinity chromatography or standard chromatography) can also be used. These and other parameters can be systematically varied so as to optimize the conditions for certain assays or other reconstitution protocols.

C) Die Rekonstitution mittels hTRT-Varianten und Fusionsproteinen C) Reconstitution using hTRT variants and fusion proteins

Rekonstitution von katalytischer Telomerase-Aktivität trat auf, wenn EGFP-hTRT eine Fusion des «en-hanced green fluorescent-Protein an hTRT (siehe Beispiel 15) oder «Epitop-tagged» hTRT (IBI FLAG, siehe Beispiels 6) mit hTR coexprimiert wurden, wobei beide Telomerase-Aktivität auf ungefähr Wildtyp-Spiegel rekonstituierten. Reconstitution of catalytic telomerase activity occurred when EGFP-hTRT co-expressed a fusion of the en-hanced green fluorescent protein to hTRT (see Example 15) or epitope-tagged hTRT (IBI FLAG, see Example 6) with hTR , both of which reconstituted telomerase activity to approximately wild-type levels.

Im Gegensatz dazu wurde Telomerase-Aktivität nicht rekonstituiert, wenn die hTRT-Variante pro90hTRT (der die RT-Motive B', C, D und E fehlen) verwendet wurde. Dies zeigt, dass pro90hTRT keine katalytische Telomerase-Aktivität besitzt, wobei diese andere Aktivitäten besitzen könnte (z.B. die Fähigkeit zur RNA (d.h. hTR)-Bindung und sie könnte auch als dominant-negativer Regulator von Telomerase in vivo, wie vorstehend beschrieben, wirken. In contrast, telomerase activity was not reconstituted when the hTRT variant pro90hTRT (which lacks the RT motifs B ', C, D and E) was used. This shows that pro90hTRT has no catalytic telomerase activity, which could have other activities (e.g. the ability to bind RNA (i.e. hTR) and it could also act as a dominant-negative regulator of telomerase in vivo as described above.

D) Die Untersuchung von in vitro-rekonstituierter Telomerase-Aktivität mittels des Gel-Blots und des üblichen Telomerase-Assavs D) The investigation of in vitro reconstituted telomerase activity using the gel blot and the usual telomerase assay

Das folgende Beispiel zeigt, dass in vitro-rekonstituierte Telomerase (IVR) zusätzlich zu auf Amplifikation basierenden Assays, (d.h. TRAP) mittels üblicher Telomerase-Assays untersucht werden kann. Telomerase wurde in vitro rekonstituiert (IVR) wie in Teil (B) vostehend beschrieben (das «verbundene Rekonstitutions»-Verfahren) wonach sich eine DEAE-Reinigung, wie vorstehend beschrieben, anschloss. Die IVR-Telomerase wurde mittels des Gel-Blot-Assays unter den folgenden Reaktionsbedingungen untersucht: 1 bis 10 nl IVR-Telomerase in 25 mM Tris-HCI, pH-Wert 8,3, 50 mM Kaliumacetat, 1 mM EG-TA, 1 mM MgCI2, 0,8 mM dATP, 0,8 mM TTP, 1,0 mM dGTP und 1 nM Primer (M2, AATCCGTCGAGCAGAGTT; oder H3.03, TTAGGGTTAGGGTTAGGG) für 180 Minuten bei 30°C und einem Endvolumen von 40 nl- Die synthetisierte Telomer-DNA wurde anhand von Standard-Verfahren isoliert, auf einem Gel mit 8%igem Polyacrylamid und 8 M Harnstoff aufgetrennt, auf eine Nylon-Membran transferiert und unter Verwendung der in dem Dot-Blot-Assay verwendeten 32P-(CCCTAA)n-Ribonucleotidsonde abgesucht. Mittels dieser Sonde konnte eine Leiter von sechs Nucleotiden in der Spur identifiziert werden, die 10 n' IVR-Telomerase repräsentiert, was äquivalent war zu der Leiter, die für 5 nl nativer nucleärer, mit «mono Q» und Heparinchromatographie gereinigter Telomerase beobachtet wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass IVR-Telomerase äquivalent zu nativer Telomerase eine prozessive katalytische Telomerase-Aktivität aufweist. The following example shows that in vitro reconstituted telomerase (IVR) can be tested in addition to amplification based assays (i.e. TRAP) using standard telomerase assays. Telomerase was reconstituted in vitro (IVR) as described in part (B) above (the "linked reconstitution" procedure), followed by DEAE purification as described above. The IVR telomerase was examined by means of the gel blot assay under the following reaction conditions: 1 to 10 nl IVR telomerase in 25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM potassium acetate, 1 mM EG-TA, 1 mM MgCI2, 0.8 mM dATP, 0.8 mM TTP, 1.0 mM dGTP and 1 nM primer (M2, AATCCGTCGAGCAGAGTT; or H3.03, TTAGGGTTAGGGTTAGGG) for 180 minutes at 30 ° C and a final volume of 40 nl- The synthesized telomeric DNA was isolated using standard procedures, separated on a gel with 8% polyacrylamide and 8 M urea, transferred to a nylon membrane and using the 32P- (CCCTAA) used in the dot blot assay. n-Ribonucleotide probe searched. Using this probe, a ladder of six nucleotides in the lane could be identified that represented 10 n 'IVR telomerase, which was equivalent to the ladder observed for 5 nl native nuclear telomerase purified with "mono Q" and heparin chromatography. The results show that IVR telomerase, equivalent to native telomerase, has a processive catalytic telomerase activity.

Die IVR-Telomerase («verbundene Rekonstitution») wurde auch anhand des üblichen, auf dem Einbau von 32P-dGTP basierenden Telomerase-Assays untersucht. Die so rekonstituierte Telomerase, die danach über DEAE-Reinigung, wie vorstehend beschrieben, gereinigt wurde, wurde sowohl unter prozessiven als auch nicht-prozessiven Reaktionsbedingungen untersucht. Die Assay-Bedingungen waren: 5-10 n' rekonstituierte Telomerase («verbundene Rekonstitution») in 25 mM Tris-HCI, pHWert 8,3, 50 mM Kaliumacetat, 1 mM EGTA, 1 mM MgCfe, 2 mM dATP, 2 mM TTP mit 10 nM 32P-dGTP (72 Ci/ mMol) (für den Assay hinsichtlich prozessiver Bedingungen) oder 1 nM 32P-dGTP (720 Ci/mMol) (für nicht-prozessive Bedingungen) und 1 nM Primer (d.h. H3.03 TTAGGGTTAGGGTTAGGG) bei 30°C (für die prozessive Reaktion) oder 37°C für die nicht-prozessive Reaktion für 180 Minuten in einem Endvolumen von 40 nl. Die synthetisierte Telomer-DNA wurde mittels Standardverfahren isoliert und auf einem IVR telomerase (“linked reconstitution”) was also examined using the usual telomerase assay based on the incorporation of 32P-dGTP. The telomerase thus reconstituted, which was then purified via DEAE purification as described above, was examined under both process and non-process reaction conditions. The assay conditions were: 5-10 n 'reconstituted telomerase ("linked reconstitution") in 25mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM potassium acetate, 1mM EGTA, 1mM MgCfe, 2mM dATP, 2mM TTP with 10 nM 32P-dGTP (72 Ci / mmol) (for the assay with regard to process conditions) or 1 nM 32P-dGTP (720 Ci / mmol) (for non-process conditions) and 1 nM primer (ie H3.03 TTAGGGTTAGGGTTAGGG) at 30 ° C (for the process reaction) or 37 ° C for the non-process reaction for 180 minutes in a final volume of 40 nl. The synthesized telomeric DNA was isolated by standard methods and on a

137 137

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

10 10th

30 30th

50 50

55 55

Sequenzierungsgel mit 8%igem Polyacrylamid und 8 M Harnstoff aufgetrennt. Die prozessive Reaktion zeigte eine schwächere Leiter von sechs Nucleotiden, was mit einer prozessiven Telomerase-Reaktion übereinstimmt und bei der nicht-prozessiven Reaktion wurde eine Wiederholungseinheit hinzugefügt, ein Muster, das äquivalent zu der Kontrollreaktion mit einer Präparation nativer Telomerase ist. Übliche Assays unter Verwendung von Telomerase «verbundene Rekonstitution» sind bei der Suche nach Telome-rase-Modulatoren, wie hier beschrieben, nützlich, sowie auch bei anderen Anwendungen, wie beispielsweise der Aufklärung von strukturellen und funktionellen Eigenschaften von Telomerase. Sequencing gel separated with 8% polyacrylamide and 8 M urea. The process response showed a weaker ladder of six nucleotides, which corresponds to a process telomerase reaction, and a repeat unit was added to the non-process reaction, a pattern equivalent to the control reaction with a preparation of native telomerase. Common assays using telomerase "linked reconstitution" are useful in the search for telomerase modulators as described here, as well as in other applications such as the elucidation of structural and functional properties of telomerase.

E) In vitro rekonstituierte Telomerase erkennt 3'-Enden von Primern E) In vitro reconstituted telomerase recognizes 3 'ends of primers

Dieses Experiment zeigt, dass durch «verbundene Rekonstitution» hergestellte Telomerase 3"-Enden von Primem erkennt, äquivalent zu nativer (gereinigter) Telomerase. Telomerase bildet eine Basen-ge-paarte Duplex zwischen dem 3'-Ende eines Primers und dem Matrizenbereich von hTR und fügt das nächste vorgesehene Nucleotid an (Morin, 1989, a.a.O.). Um zu verifizieren, dass (rekombinante) IVR-15 Telomerase («verbundene Rekonstitution») die gleiche Eigenschaft aufweist, wurden die Reaktionen von Primern mit —GGG oder —TAG-3'-Enden (AATCCGTCGAGCAGAGGG bzw. AATCCGTCGAGCAGATAG) mit einem Primer verglichen mit einem —GTT â'-Terminus (M2; AATCCGTCGAGCAGAGTT; der Standard-«TRAP»-Primer), wobei in vitro rekonstituierte und native Telomerase verwendet wurden, die durch den Zwei-Stufen Assay (üblich/TRAP), der vorstehend ausführ-20 lieh beschrieben wurde, untersucht wurden. Die Produktleitern der Primer —GGG und —TAG verschoben sich um +4 bzw. +2 im Vergleich zu dem Standardprimer (--GTT 3'-Ende); derselbe Effekt wurde mit nativer Telomerase beobachtet. Dieses Experiment zeigt, dass in vitro-rekonstituierte («verbundene Rekonstitution») und native Telomerase Primerenden auf die gleiche Weise erkennen. This experiment shows that "linked reconstitution" recognizes telomerase 3 "ends of primers, equivalent to native (purified) telomerase. Telomerase forms a base-paired duplex between the 3 'end of a primer and the template region of hTR and appends the next proposed nucleotide (Morin, 1989, loc. cit.) To verify that (recombinant) IVR-15 telomerase ("linked reconstitution") has the same property, the reactions of primers with —GGG or —TAG- 3 'ends (AATCCGTCGAGCAGAGGG or AATCCGTCGAGCAGATAG) with a primer compared to a —GTTâ' terminus (M2; AATCCGTCGAGCAGAGTT; the standard "TRAP" primer) using in vitro reconstituted and native telomerase used by the The two-step assay (common / TRAP) described above in Figure 20. The product ladders of the primers —GGG and —TAG shifted +4 and +2, respectively, compared to the standard prim he (--GTT 3 'end); the same effect was observed with native telomerase. This experiment shows that in vitro reconstituted ("linked reconstitution") and native telomerase recognize primer ends in the same way.

Diese Ergebnisse (zusammen mit den vorstehenden Ergebnissen, die zeigen, dass IVR-Telomerase 25 sowohl prozessive als auch nicht-prozessive katalytische Aktivität besitzt) zeigen an, dass IVR-Telomerase eine ähnliche Struktur und ähnliche Eigenschaften im Vergleich zu nativer oder gereinigter Telomerase besitzt. These results (along with the results above, which show that IVR telomerase 25 has both processive and non-processive catalytic activity) indicate that IVR telomerase has a similar structure and properties compared to native or purified telomerase.

Beispiel 8 Example 8

Herstellung von Anti-hTRT-Antikörpern A) Die Herstellung von anti-hTRT-Antikörpern oeoen hTRT-Peptide Production of anti-hTRT antibodies A) The production of anti-hTRT antibodies or hTRT peptides

35 Zur Herstellung von anti-hTRT-Antikörpern wurden die folgenden Peptide von hTRT mit der Hinzufügung von C (Cystein) als der Amino-terminale Rest (siehe Fig. 54) synthetisiert: 35 To produce anti-hTRT antibodies, the following peptides of hTRT were synthesized with the addition of C (cysteine) as the amino-terminal residue (see Fig. 54):

S-l: FFY VTE TTF QKN RLF FYR KSV WSK S-l: FFY VTE TTF QKN RLF FYR KSV WSK

40 S-2: RQH LKR VQL RDV SEA EVR QHR EA 40 S-2: RQH LKR VQL RDV SEA EVR QHR EA

S-3: ART F RR EKR AER LTS RVK ALF SVL NYE S-3: ART F RR EKR AER LTS RVK ALF SVL NYE

A-3: PAL LTS RLR FIP KPD GLR PIV NMD YVV A-3: PAL LTS RLR FIP KPD GLR PIV NMD YVV

45 45

Die Cystein-Einheit wurde zur Immobilisierung (d.h. kovalente Verknüpfung) der Peptide an BSA- und KLH- («Keyhole limpet» Hämocyanin)-Trägerproteine verwendet. Die KLH-Peptide wurden als Antigen verwendet. Die BSA-Peptidkonjugate dienten als Material für ELISAs zum Testen der Spezifität von Immunantiseren. The cysteine unit was used to immobilize (i.e. covalently link) the peptides to BSA and KLH (keyhole limpet hemocyanin) carrier proteins. The KLH peptides were used as the antigen. The BSA peptide conjugates served as material for ELISAs to test the specificity of immune antisera.

Die KLH-Peptidkonjugate wurden in «New Zealand White»-Kaninchen injiziert. Die einleitenden Injektionen wurden proximal zu den Lymphknoten der Achselhöhle und der Leisten verabreicht. Nachfolgende Injektionen wurden intramuskulär gegeben. Für einleitende Injektionen war das Antigen mit vollständigem Freund'schen Adjuvans emulgiert, für nachfolgende Injektionen wurde unvollständiges Freund'sches Adjuvans verwendet. Bei den Kaninchen folgte ein Auffrischungs-Impfcyclus von 3 Wochen, wobei 50 ml Blut, die 20 bis 25 ml Serum lieferten, 10 Tage nach jeder Auffrischungsimpfung entnommen wurden. Antiseren gegen jedes der vier Peptide erkannten die hTRT-Einheit von rekombinan-tem hTRT-Fusionsprotein (GST-HIS8-hTRT-Fragment 2426 bis 3274) auf WesternBlots (siehe Beispiel The KLH peptide conjugates were injected into New Zealand White rabbits. The introductory injections were given proximal to the armpit and groin lymph nodes. Subsequent injections were given intramuscularly. The antigen was emulsified with complete Freund's adjuvant for introductory injections, and incomplete Freund's adjuvant was used for subsequent injections. The rabbits followed a 3 week booster cycle, with 50 ml of blood delivering 20 to 25 ml of serum drawn 10 days after each booster. Antisera against each of the four peptides recognized the hTRT unit of recombinant hTRT fusion protein (GST-HIS8-hTRT fragment 2426 to 3274) on Western blots (see example

6)- 6) -

60 Unter Verwendung einer partiell gereinigten Telomerase-Fraktion von menschlichen 293-Zellen (eine etwa 1000fache Reinigung im Vergleich zum nucleären Rohextrakt), die gemäss der Beschreibung in der parallelen US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/833,37 (siehe auch PCT-Anmeldung Nr. 97/ 06012) hergestellt und mit anti-S-2-Antikörpern affinitätsgereinigt worden war, konnte auf einem We-stern-Blot eine 130 kD-Proteindublette nachgewiesen werden. Es wurde ein empfindliches Chemilumi- 60 Using a partially purified telomerase fraction of human 293 cells (approximately 1000-fold purification compared to the crude nuclear extract), which is described in the parallel US patent application with serial no. 08 / 833.37 (see also PCT Application No. 97/06012) and affinity-purified with anti-S-2 antibodies, a 130 kD protein duplicate could be detected on a We-Stern blot. A sensitive chemilumi-

65 neszenz-Nachweisverfahren angewandt («SuperSignal»-Chemilumineszenzsubstrate, Pierce), das Signal 65 nescent detection methods applied (“SuperSignal” chemiluminescent substrates, Pierce), the signal

138 138

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

auf dem Blot war jedoch schwach, was darauf hindeutet, dass hTRT in diesen unsterblichen Zellen in geringer oder sehr geringer Häufigkeit vorhanden ist. Das Auftreten einer Dublette ist konsistent mit einer posttranslationalen Modifizierung von hTRT, d.h. Phosphorylierung oder Glykosylierung. however, the blot was weak, suggesting that hTRT is present in low or very low frequency in these immortal cells. The occurrence of a duplicate is consistent with a post-translational modification of hTRT, i.e. Phosphorylation or glycosylation.

Zur Affinitätsreinigung wurde das S-2-Peptid an «SulfoLink» (Pierce, Rockford, IL) über seinen N-ter-minalen Cysteinrest gemäss dem Protokoll des Herstellers immobilisiert. Erstes Blutserum von einem mit dem KLH-S-2-Peptid an die genimmunisierten Kaninchen wurde über eine S-2-«SulfoLink» geladen und spezifisch an das S-2-Peptid gebundene Antikörper wurden eluiert. For affinity purification, the S-2 peptide was immobilized on “SulfoLink” (Pierce, Rockford, IL) via its N-terminal cysteine residue in accordance with the manufacturer's protocol. First blood serum from a rabbit immunized with the KLH-S-2 peptide was loaded via an S-2 "SulfoLink" and antibodies specifically bound to the S-2 peptide were eluted.

B) Herstelluno von anti-hTRT-Antikörpern gegen hTRT-Fusionsproteine B) Production of anti-hTRT antibodies against hTRT fusion proteins

GST-hTRT-Fusionsproteine wurden in E. coli als das GST-hTRT-Fragment #4 (Nucleotide 3272-4177) und das GST-His8-hTRTFragment #3 (Nucleotide 2426 bis 3274), wie in Beispiel 6 beschrieben, exprimiert. Die Fusionsproteine wurde als unlösliches Protein gereinigt und die Reinheit des Antigens wurde über SDS-Polyacrylamidgele untersucht und auf etwa 75% Reinheit bezüglich des rekombinanten Proteins GST-hTRTFragment #4 und über 75% Reinheit für das rekombinante Protein GST-His8-hTRT-Fragment #3 geschätzt. (Routineverfahren können zur Gewinnung dieser und anderer Fusionsproteine mit einer Reinheit über 90% verwendet werden). Diese rekombinanten Proteine wurden zur Immunisierung sowohl von «New Zealand White»-Kaninchen als auch weiblichen Balb/c-Mäusen verwendet. Für einleitende Injektionen wurde das Antigen mit vollständigen Freund'schem Adjuvans emulgiert, für nachfolgende Injektionen wurde unvollständiges Freund'sches Adjuvans verwendet. Für die Kaninchen und Mäuse erfolgte ein 3-wöchiger Auffrischungsimpfcyclus, wobei Blut 10 Tage nach jeder Auffrischungsimpfung entnommen wurde. GST-hTRT fusion proteins were expressed in E. coli as the GST-hTRT fragment # 4 (nucleotides 3272-4177) and the GST-His8-hTRT fragment # 3 (nucleotides 2426 to 3274) as described in Example 6. The fusion proteins were purified as an insoluble protein and the purity of the antigen was examined via SDS-polyacrylamide gels and checked for approximately 75% purity with respect to the recombinant protein GST-hTRT fragment # 4 and over 75% purity for the recombinant protein GST-His8-hTRT fragment # 3 estimated. (Routine procedures can be used to obtain these and other fusion proteins with a purity greater than 90%). These recombinant proteins were used to immunize both New Zealand White rabbits and female Balb / c mice. The antigen was emulsified with complete Freund's adjuvant for introductory injections and incomplete Freund's adjuvant was used for subsequent injections. A 3 week booster cycle was performed for the rabbits and mice with blood drawn 10 days after each booster.

Die erste und zweite Blutentnahme sowohl von den Mäusen als auch den Kaninchen wurde hinsichtlich der Anwesenheit von anti-hTRT-Antikörpem nach Entfernung von anti-GST-Antikörpem unter Verwendung einer immobilisiertes GST enthaltenden Matrix getestet. Die Antiseren wurden auf anti-hTRT-Antikörpern durch Western-Blots unter Verwendung eines immobilisierten rekombinanten GST-hTRT-Fu-sionsproteins getestet und mittels Immunpräzipitation unter Verwendung des partiell gereinigten nativen Telomeraseenzyms. Bei diesen frühen Blutentnahmen konnte kein Signal beobachtet werden; es wird davon ausgegangen, dass sich die Titer von anti-hTRT-Antikörpern bei nachfolgenden Blutentnahmen erhöhen. The first and second blood draws from both mice and rabbits were tested for the presence of anti-hTRT antibodies after removal of anti-GST antibodies using an immobilized matrix containing GST. The antisera were tested for anti-hTRT antibodies by Western blots using an immobilized recombinant GST-hTRT fusion protein and by immunoprecipitation using the partially purified native telomerase enzyme. No signal was observed at these early blood draws; It is assumed that the titer of anti-hTRT antibodies increases with subsequent blood samples.

Beispiel 9 Example 9

Nachweis einer HTRT-MRNA die der RNA der Al82-Variante entspricht Detection of an HTRT-MRNA that corresponds to the RNA of the Al82 variant

Poly-A+-RNA von menschlichen Hoden und der 293-Zellinie wurde hinsichtlich hTRT-mRNA mittels RT-PCR und «nested»-Primern analysiert. Der erste Primersatz war TCP1.1 und TCP1.15, der zweite Primersatz TCP1.14 und billTCP6. Die Amplifikation mit beiden Primersätzen ergab zwei Produkte, die sich um 182 bp unterschieden. Die grösseren und kleineren Produkte von RNA aus Hoden wurde sequenziert und es stellte sich heraus, dass sie genau pGRN121 (Fig. 16) bzw. dem Clon 712562 (Fig. 18) entsprachen. Das hTRT-RNA-Produkt der Variante wurde in mRNA von SW39i, OVCAR4, 293 und Hoden beobachtet. Poly-A + RNA from human testes and the 293 cell line was analyzed for hTRT mRNA using RT-PCR and «nested» primers. The first set of primers was TCP1.1 and TCP1.15, the second set of primers TCP1.14 and billTCP6. The amplification with both sets of primers resulted in two products which differed by 182 bp. The larger and smaller products of testicular RNA were sequenced and it turned out that they corresponded exactly to pGRN121 (FIG. 16) and clone 712562 (FIG. 18). The variant hTRT-RNA product was observed in mRNA from SW39i, OVCAR4, 293 and testes.

Zusätzliche Experimente wurden durchgeführt, um zu zeigen, dass die A182 cDNA nicht ein Artefact der reversen Transkription war. Kurz zusammengefasst, hTRT-RNA (d.h. ohne Deletion) wurde durch in vitro-Transkription von pGRN121 zur Venwendung als Matrize für RT-PCR hergestellt. Getrennt davon wurden cDNA-Synthese-Reaktionen mittels der «Superscript®» reverser Transkriptase (Bethesda Research Laboratories, Bethesda MD) bei 42°C oder 50°C mit Zufallsprimern oder einem spezifischen Primer durchgeführt. Nach 15 PCR-Cyclen war das längere Produkt nachweisbar, jedoch nicht das kleinere Produkt (d.h. das der Deletion entsprechende, selbst nicht nach 30 oder mehr Cyclen. Dieses zeigt an, dass das RTPCR-Produkt kein Artefact ist. Additional experiments were carried out to show that the A182 cDNA was not an artifact of reverse transcription. Briefly summarized, hTRT-RNA (i.e. without deletion) was generated by in vitro transcription of pGRN121 for use as a template for RT-PCR. Separately, cDNA synthesis reactions were carried out using the “Superscript®” reverse transcriptase (Bethesda Research Laboratories, Bethesda MD) at 42 ° C or 50 ° C with random primers or a specific primer. After 15 PCR cycles, the longer product was detectable, but not the smaller product (i.e. the one corresponding to the deletion, even after 30 or more cycles. This indicates that the RTPCR product is not an artifact.

Beispiel 10 Example 10

Sequenzierung von Hoden-hTRT-mRNA Sequencing of testicular hTRT mRNA

Die Sequenz der in Hoden vorzufindenden Form von hTRT-RNA wurde durch direkte Manuell-Se-quenzierung von DNA-Fragmenten bestimmt, die mittels PCR von Hoden-cDNA («Marathon»-Hoden-cDNA, Clontech, San Diego, CA) unter Verwendung eines «ThermoSequenase radiolabeled terminator cycle»-Sequenzierungskits (Amersham Life Science) erzeugt. Die PCR-Reaktionen wurden mittels «ne-sted»-PCR, wie in Tabelle 7 gezeigt, durchgeführt, soweit nicht anders angegeben. In allen Fällen wurde eine negative Kontrollreaktion mit Primern, jedoch ohne cDNA durchgeführt. Das Fehlen eines Produkts in der Kontrollreaktion zeigte, dass die von der Reaktion mit cDNA stammenden Produkte nicht aufgrund einer Kontamination mit hTRT von pGRN121 oder anderen Zellquellen (z.B. 293-Zellen) vorhanden waren. Die DNA-Fragmente wurden zur Reinigung der DNA vor der Sequenzierung aus Agarosegelen ausgeschnitten. The sequence of the form of hTRT-RNA found in testes was determined by direct manual sequencing of DNA fragments, which were carried out by means of PCR of testicular cDNA (“marathon” testicular cDNA, Clontech, San Diego, CA) using a "ThermoSequenase radiolabeled terminator cycle" sequencing kit (Amersham Life Science). The PCR reactions were carried out using “ne-sted” PCR, as shown in Table 7, unless stated otherwise. In all cases, a negative control reaction was carried out with primers, but without cDNA. The lack of a product in the control reaction indicated that the products derived from the reaction with cDNA were not present due to contamination with hTRT from pGRN121 or other cell sources (e.g. 293 cells). The DNA fragments were excised from agarose gels to purify the DNA prior to sequencing.

139 139

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Die Sequenz der Hoden-mRNA, die den Basen 27 bis 3553 der Insertionssequenz von pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) entspricht und den gesamten hTRT-ORF (Basen S6 bis 3451) wurde erhalten. In diesem Bereich zeigten sich keine Unterschiede zwischen den Hoden- und pGRN121-Sequenzen. The sequence of the testicular mRNA, which corresponds to bases 27 to 3553 of the insertion sequence of pGRN121 (SEQ. ID. No. 1) and the entire hTRT-ORF (bases S6 to 3451) was obtained. In this area there were no differences between the testicle and pGRN121 sequences.

140 140

Oî o en o en o Oî o en o en o

Primersatz 1 Primer set 1

Primersatz 2 Primer set 2

l)A l) A

nn nn

K320 / K322 K320 / K322

A A

K320 /TC1M.-I3 K320 /TC1M.-I3

TCP 1.'10 / TCP 1.3-1 TCP 1.'10 / TCP 1.3-1

11 11

TCIM .'12 / TCPl 3211 TCIM .'12 / TCPl 3211

'l'CPI .3 5 / TCPl .21 'l'CPI .3 5 / TCPl .21

C C.

TCP 1.65 / I CI' 1.66 TCP 1.65 / I CI '1.66

l'CPI.67 /TCI'1.68 l'CPI.67 /TCI'1.68

1)2 1) 2

K30-I / l)i!ITCP6 K30-I / l) i! ITCP6

LT 1 / TCP 1.6 LT 1 / TCP 1.6

1)3 1) 3

TCPl.12 / TCPl.7 TCPl.12 / TCPl.7

TCIM.M /TCIM.15 TCIM.M /TCIM.15

i:i: i: i:

nn nn

TCP 1.7-1 / TCIM.7 TCP 1.7-1 / TCIM.7

i: i:

I CI' 13/ ICI' 1 -1 I CI '13 / ICI' 1 -1

TCP 1.2 / TCIM.9 TCP 1.2 / TCIM.9

i: i:

TCIM .26/ IJTU2 TCIM .26 / IJTU2

TCIM.M) /TCIM.-1 TCIM.M) /TCIM.-1

co co ro f\3 co co ro f \ 3

en o en o en o en o

Tabelle 8 Table 8

End-größe Final size

2 OS 556 <192 HIB 516 2 OS 556 <192 HIB 516

60-1 60-1

201 201

687 687

177 177

Primer für SEQ Primer for SEQ

K320.K322 K320.K322

TCI't .52,'1'CiM .3'.).K322,TCP1 .-1I).TC1' I <11 .'l'CIM.BO.TCP 1.3'I.TCPl .<19 TCPl .3 5.TCP 1.28,TCIM .38,TCIM .2 I .TCIM .-16.TCPl .33.MCIM .48 TCI't .52, '1'CiM .3'.). K322, TCP1.-1I) .TC1 'I <11 .'l'CIM.BO.TCP 1.3'I.TCPl. <19 TCPl .3 5 .TCP 1.28, TCIM .38, TCIM .2 I .TCIM.-16.TCPl .33.MCIM .48

I CI' 1.67.TCP 1.32. I CI' 1.69,1 CI' 1.68.1 Cl' 1.2-1.1Cl' [ .'1A.K303 I CI '1.67.TCP 1.32. I CI '1.69.1 CI' 1.68.1 Cl '1.2-1.1Cl' [.'1A.K303

i.'n.i.Ti .rcp i ,6.trrci'-i ;icp i. 13 ,tcp i .77. ree 1.1 i.'n.i.Ti .rcp i, 6.trrci'-i; icp i. 13, tcp i .77. ree 1.1

TCP 1.6,TCP 1.l-I.TCP 1.73.1 Cl' 1.7H.TCP 1.25.TCP 1,15.1 Cl' l .76 TCP 1.6, TCP 1.l-I.TCP 1.73.1 Cl '1.7H.TCP 1.25.TCP 1.15.1 Cl' l .76

TCP 1,7'I.TCIM .7.TCP 1.75,TCIM. 15.TCIM .3 TCP 1.7'I.TCIM .7.TCP 1.75, TCIM. 15.TCIM .3

TCPl .2.TCT1.8.TCIM .9.TCIM .26 TCPl .2.TCT1.8.TCIM .9.TCIM .26

TCPI.'l.TCPI.M) TCI'I.I I TCPI.'l.TCPI.M) TCI'I.I I

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Beispiel 11 Example 11

Nachweis von hTRT-mRNA durch RNase-Schutzreaktion Detection of hTRT mRNA by RNase protection reaction

5 RNase-Schutzassays können zum Nachweis, zur Überwachung oder zur Diagnose hinsichtlich der Anwesenheit einer hTRT-mRNA oder der mRNA einer Variante verwendet werden. Eine veranschaulichende Sonde für einen solchen Assay ist eine in vitro-synthetisierte RNA, die Sequenzen umfasst, die komplementär zu hTRT-mRNA-Sequenzen sind, und zusätzliche, nicht komplementäre Sequenzen. Die letzteren Sequenzen sind deshalb von Vorteil, um die Sonde mit vollständiger Länge von dem Fragment 10 der Sonde unterscheiden zu können, das von einem positiven Ergebnis in dem Assay herrührt. In einem positiven Assay werden die komplementären Sequenzen der Sonde vor einer Spaltung mit RNase geschützt, da sie mit der hTRTmRNA hybridisiert sind. Die nicht-komplementären Sequenzen werden von der Sonde in Gegenwart von RNase und komplementärer Zielnucleinsäure abgespalten. 5 RNase protection assays can be used to detect, monitor or diagnose for the presence of an hTRT mRNA or the mRNA of a variant. An illustrative probe for such an assay is an in vitro synthesized RNA comprising sequences complementary to hTRT mRNA sequences and additional non-complementary sequences. The latter sequences are therefore advantageous in order to be able to distinguish the full-length probe from fragment 10 of the probe, which results from a positive result in the assay. In a positive assay, the complementary sequences of the probe are protected from cleavage with RNase, since they are hybridized with the hTRTmRNA. The non-complementary sequences are cleaved from the probe in the presence of RNase and complementary target nucleic acid.

Zwei Sonden für die RNase-Schutzassays sind zur Veranschaulichung beschrieben, wobei jede in 15 dem Assay verwendet werden kann. Die Sonden unterscheiden sich in ihren zu hTRT komplementären Sequenzen, enthalten jedoch identische nichtkomplementäre Sequenzen, die in dieser Ausführungsform von der späten Leadersequenz der mRNA von SV40 stammen. In 5'-3'-Richtung umfasst die erste Sonde 33 Nucleotide einer nicht-komplementären Sequenz und 194 Nucleotide einer Sequenz, die komplementär zu den hTRT-Nucleotiden 2513 bis 2707 ist für eine Grösse der Sonde mit vollständiger Länge 20 von 227 Nucleotiden. In 5'-3'-Richtung umfasst die zweite Sonde 33 Nucleotide einer nicht komplementären Sequenz und 198 Nucleotide einer Sequenz, die komplementär zu den hTRT-Nucleotiden 2837 bis 3035 ist für eine Grösse der Sonde mit vollständiger Länge von 231 Nucleotiden. Zur Durchführung des Assays kann jede der beiden Sonden mit RNA d.h. PolyA+-RNA von einer Testprobe hybridisiert werden und im Anschluss daran werden T1-Ribonuclease und RNase A zugegeben. Nach der Spaltung 25 wird die Sonden-RNA gereinigt und durch Gelelektrophorese analysiert. Der Nachweis eines 194 Nucleotide langen Fragments der Nucleotidsonde mit einer Länge von 227 Nucleotiden oder eines 198 Nucleotide langen Fragments der Sonde mit einer Länge von 231 Nucleotiden ist ein Zeichen für die Anwesenheit von hTRT-mRNA in der Probe. Two probes for the RNase protection assays are described for illustration, each of which can be used in the assay. The probes differ in their sequences complementary to hTRT, but contain identical non-complementary sequences which in this embodiment derive from the late leader sequence of the SV40 mRNA. In the 5'-3 'direction, the first probe comprises 33 nucleotides of a non-complementary sequence and 194 nucleotides of a sequence that is complementary to hTRT nucleotides 2513 to 2707 for a full-length probe 20 of 227 nucleotides. In the 5'-3 'direction, the second probe comprises 33 nucleotides of a non-complementary sequence and 198 nucleotides of a sequence that is complementary to the hTRT nucleotides 2837 to 3035 for a full-length probe of 231 nucleotides. To carry out the assay, each of the two probes can be used with RNA, i.e. PolyA + RNA are hybridized from a test sample and then T1 ribonuclease and RNase A are added. After cleavage 25, the probe RNA is purified and analyzed by gel electrophoresis. Detection of a 194 nucleotide fragment of the nucleotide probe with a length of 227 nucleotides or a 198 nucleotide fragment of the probe with a length of 231 nucleotides is a sign of the presence of hTRT-mRNA in the sample.

Die in diesem Beispiel beschriebenen veranschaulichenden Sonden für den RNase-Schutzassay kön-30 nen durch in vitro-Transkription mittels T7-RNA-Polymerase erzeugt werden. Radioaktive oder anderweitig markierte Ribonucleotide können für die Synthese von markierten Sonden eingeschlossen werden. Die Matrizen für die in vitro-Transkriptionsreaktion zur Herstellung der RNA-Sonden sind PCR-Produkte. Diese illustrativen Sonden können nach PCR-Amplifikation von pGRN121-DNA mittels Primern, die den entsprechenden komplementären Bereich des hTRT-Gens oder der hTRT-mRNA umspannen, mit T7-35 Polymerase synthetisiert werden. Ausserdem enthält der Stromabwärts-Primer T7-RNA-Polymerase-Pro-motorsequenzen und die nicht-komplementären Sequenzen. The illustrative probes for the RNase protection assay described in this example can be generated by in vitro transcription using T7 RNA polymerase. Radioactive or otherwise labeled ribonucleotides can be included for the synthesis of labeled probes. The matrices for the in vitro transcription reaction for the production of the RNA probes are PCR products. These illustrative probes can be synthesized with T7-35 polymerase after PCR amplification of pGRN121 DNA using primers that span the corresponding complementary region of the hTRT gene or the hTRT mRNA. In addition, the downstream primer contains T7 RNA polymerase promoter sequences and the non-complementary sequences.

Für die Erzeugung der ersten Sonde für den RNase-Schutzassay wird das PCR-Produkt von dem folgenden Primer-Paar T701 und reverse 01) verwendet: The PCR product from the following primer pair T701 and reverse 01) is used to generate the first probe for the RNase protection assay:

40 T701 5'-GGGAGATCT TAATACGACTCACTATAG ATTCA GGCCATGGTG 40 T701 5'-GGGAGATCT TAATACGACTCACTATAG ATTCA GGCCATGGTG

CTGCGCCGGC TGTCA GGCTCCC ACGACGTAGT CCATGTTCAC-3' CTGCGCCGGC TGTCA GGCTCCC ACGACGTAGT CCATGTTCAC-3 '

und reverse 01 and reverse 01

45 5'-GGGTCTAGAT CCGGAAGAGTGT CTGGAGCAAG-3' 45 5'-GGGTCTAGAT CCGGAAGAGTGT CTGGAGCAAG-3 '

Zur Erzeugung der zweiten Sonde für den RNase-Schutzassay wird das PCR-Produkt von dem folgenden Primerpaar (T702 und reverse 02) verwendet: The PCR product from the following pair of primers (T702 and reverse 02) is used to generate the second probe for the RNase protection assay:

50 50

T702 5'-GGGAGATCT TAATACGACTCACTATAG ATTCA GGCCATGGTG CTGCGCCGGC TGTCA GGGCG GCCTTCTGGA CCACGGCATA CC-3" T702 5'-GGGAGATCT TAATACGACTCACTATAG ATTCA GGCCATGGTG CTGCGCCGGC TGTCA GGGCG GCCTTCTGGA CCACGGCATA CC-3 "

55 und reverse 02 55 and reverse 02

5'-G GTCTAGA CGATATCC ACAGGGCCTG GCGC-3' 5'-G GTCTAGA CGATATCC ACAGGGCCTG GCGC-3 '

60 60

65 65

142 142

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Beispiel 12 Example 12

Konstruktion eines phylogenetischen Stammbaums durch Vergleich von hTRT mit anderen reversen T ranskriptasen Construction of a phylogenetic family tree by comparison of hTRT with other reverse transcriptases

Ein phylogenetischer Stammbaum (Fig. 6) wurde durch Vergleich der sieben von Xiong und Eickbush (EMBO J. 9 (1990), 3353) RT-Domänen konstruiert. Nach Sequenzausrichtung der Motive 1, 2 und A-E von 4 TRTs, 67 RTs und 3 RNA-Polymerasen wurde der Stammbaum unter Verwendung des «NJ («Neighbor joining»)-Verfahrens (Saitou und Nei, Mol. Biol. Evol. 4 (1987), 4406) konstruiert. Elemente von der gleichen Klasse, die auf dem gleichen Zweig des Stammbaums lokalisiert sind, sind vereinfacht als Kästchen wiedergegeben. Die Länge jedes Kästchens entspricht dem am meisten divergenten Element innerhalb des Kästchens. A phylogenetic family tree (Fig. 6) was constructed by comparing the seven Xiong and Eickbush (EMBO J. 9 (1990), 3353) RT domains. After sequence alignment of motifs 1, 2 and AE of 4 TRTs, 67 RTs and 3 RNA polymerases, the family tree was created using the «NJ (« Neighbor joining ») method (Saitou and Nei, Mol. Biol. Evol. 4 (1987 ), 4406). Elements from the same class that are located on the same branch of the family tree are shown simply as boxes. The length of each box corresponds to the most divergent element within the box.

Die TRTs scheinen mit den RTs, die mit msDNA, Gruppe ll-lntrons und nicht-LTR (lange terminale Wiederholungseinheiten)-Retrotransposons enger verwandt zu sein als mit dem LTR-Retrotransposon und viralen RTs. Die Verwandtschaft der Telomerase-RTs zu dem nicht-LTR-Zweig von Retroelementen ist sehr interessant, geht man davon aus, dass diese letzteren Elemente Telomerase für die Telomer-Beibehaltung in Drosophila ausgetauscht haben. Die auffallendste Beobachtung ist jedoch, dass die TRTs eine diskrete Untergruppe bilden, die mit den RNA-abhängigen RNA-Polymerasen von +-strängi-gen RNA-Viren, wie beispielsweise Poliovirus, beinahe genau so eng verwandt ist wie mit einem der bereits bekannten RTs. Wenn man in Erwägung zieht, dass die vier Telomerasegene von evolutionär entfernten Organismen stammen, - Protozoen, Pilze und Säuger - kann diese getrennte Gruppierung nicht durch das Fehlen von phylogenetischer Vielfalt in dem Datensatz erklärt werden. Diese frühzeitige Aufgabelung legt statt dessen nahe, dass die Telomerase-RTs eine sehr alte Gruppe sind, die vielleicht mit dem ersten Eukaryoten entstand. The TRTs appear to be more closely related to the RTs that are associated with msDNA, group II introns and non-LTR (long terminal repeat unit) retrotransposons than with the LTR retrotransposon and viral RTs. The relationship of the telomerase RTs to the non-LTR branch of retro elements is very interesting, given that the latter elements have exchanged telomerase for telomer retention in Drosophila. The most striking observation, however, is that the TRTs form a discrete subset that is almost as closely related to the RNA-dependent RNA polymerases of +-stranded RNA viruses, such as poliovirus, as to one of the previously known RTs . Considering that the four telomerase genes come from evolutionarily distant organisms - protozoa, fungi and mammals - this separate grouping cannot be explained by the lack of phylogenetic diversity in the data set. Instead, this early fork suggests that the telomerase RTs are a very old group that may have arisen with the first eukaryote.

GenBank-Protein-ldentifizierungsnummern oder Zugangsnummem, die für phylogenetische Analyse verwendet wurden, sind: GenBank protein identification numbers or access numbers used for phylogenetic analysis are:

msDNAs (94535, 134069, 134074, 134075, 134078), Gruppe II Introns (483039, 101880, 1332208, 1334433, 1334435, 133345, 1353081), mitochondriales Plasmid/RTL (903835, 134084), nicht-LTR Re-trotransposons (140023, 84806, 103221, 103353, 134083, 435415, 103015, 1335673, 85020, 141475, 106903, 130402, U0551, 903695, 940390, 2055276, L08889), LTR-Retrotransposons (74599, 85105, 130582, 99712, 83589, 84126, 479443, 224319, 130398, 130583, 1335652, 173088, 226407, 101042, 1078824), Hepadnaviren (1 18876, 1706510, 118894), Caulimoviren (331554, 130600, 130593, 93553), Retroviren (130601, 325465, 74601, 130587, 130671, 130607, 130629, 130589, 130631, 1346746, 130651, 130635, 1780973, 130646). Die Ausrichtung wurde mittels «ClustalW 1.5» (J.D. Thompson, D.G. Higgins, T.J.Gibson, Nucleic Acids Res. 22, (1994), 4673) und «PHYLIP.3.5» (J. Felsenstein, Cla-disfics 5 (1989), 164) analysiert. msDNAs (94535, 134069, 134074, 134075, 134078), Group II introns (483039, 101880, 1332208, 1334433, 1334435, 133345, 1353081), mitochondrial plasmid / RTL (903835, 134084), non-LTR re-trotransposons (140023 , 84806, 103221, 103353, 134083, 435415, 103015, 1335673, 85020, 141475, 106903, 130402, U0551, 903695, 940390, 2055276, L08889), LTR-Retrotransposons (74599, 85105, 130582, 99712, 83512 479443, 224319, 130398, 130583, 1335652, 173088, 226407, 101042, 1078824), hepadnaviruses (1 18876, 1706510, 118894), Caulimoviruses (331554, 130600, 130593, 93553), retroviruses (130601, 13054655, 7454 130671, 130607, 130629, 130589, 130631, 1346746, 130651, 130635, 1780973, 130646). Alignment was determined using “ClustalW 1.5” (JD Thompson, DG Higgins, TJGibson, Nucleic Acids Res. 22, (1994), 4673) and “PHYLIP.3.5” (J. Felsenstein, Cla-disfics 5 (1989), 164 ) analyzed.

Beispiel 13 Example 13

Transfektion von kultivierten menschlichen Fibroblasten (BJ) mit einem Kontrollplasmid und einem hTRT codierenden Plasmid Transfection of cultured human fibroblasts (BJ) with a control plasmid and a plasmid encoding hTRT

Dieses Beispiel zeigt, dass die Expression eines rekombinanten hTRT-Proteins in einer Säugerzelle zur Erzeugung einer aktiven Telomerase führt. This example shows that expression of a recombinant hTRT protein in a mammalian cell leads to the generation of an active telomerase.

Subkonfluente Bi-Fibroblasten wurden trypsinisiert und in frischem Medium (DMEM/199, 10% fötales Kälberserum enthaltend) bei einer Konzentration von 4x10® Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden mittels Elektroporation mit dem «Gene Pulser™»-Elektroporator von BioRad transfiziert. Gegebenenfalls kann man auch Zellen unter Verwendung des «Superfect™»-Reagenz (Quiagen) gemäss den Anleitungen des Herstellers transfizieren. Für die Elektroporation wurden 500 ^l Zellsuspension in eine Elektro-porationsküvette (BioRad, 0,4 cm Elektrodenabstand) gegeben. Plasmid-DNA (2 ng) wurden zu den Kü-vetten gegeben und die Suspension vorsichtig gemischt und auf Eis 5 Minuten inkubiert. Das Kontrollplasmid (pBBS212) enthielt keine Insertion hinter dem MPSV-Promotor und das experimentelle Plasmid (pGRN133) exprimierte hTRT vom MPSV-Promotor. Die Zellen wurden bei 300 V und 960 nFD einer Elektroporation unterworfen. Nach Abgabe des Impulses wurden die Küvetten vor der Plattierung auf 100 mm-Gewebekulturplatten in Medium etwa 5 Minuten auf Eis gehalten. Nach 6 Stunden wurde das Medium gegen neues Medium ausgetauscht. 72 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert, einmal mit PBS gewaschen, pelletiert und in gefrorenem Zustand bei -80=0 aufbewahrt. Zellextrakte wurden bei einer Konzentration von 25 000 Zellen/nl durch ein modifiziertes Lyseverfahren mittels Detergentien präpariert (siehe Bodnar et al., Exp. Cell Res. 228 (1996), 58 und Kim et al., Science 266 (1994) 2011 und die Beschreibung in Patenten und Publikationen, die sich auf den vorstehenden TRAP-Assay beziehen) und Telomerase-Aktivität in den Zellextrakten wurde mittels eines modifizierten auf PCR basierenden TRAP-Assays bestimmt (Kim et al., 1994, Bodnar et al., 1996). Kurz zusammen-gefasst, 5 x 104 Zelläquivalente wurden für den Telomerase-Primer Verlängerungsteil der Reaktion verwendet. Während der Extrakt typischerweise direkt von der Telomerase-Verlängerungsreaktion zu der PCR-Amplifikation gegeben wird, kann man auch einmal mit Phenol/Chloroform und einmal mit Chloro143 Sub-confluent bi-fibroblasts were trypsinized and resuspended in fresh medium (DMEM / 199, containing 10% fetal calf serum) at a concentration of 4x10® cells / ml. The cells were transfected by electroporation with BioRad's Gene Pulser ™ electroporator. If necessary, cells can also be transfected using the «Superfect ™» reagent (Quiagen) according to the manufacturer's instructions. For the electroporation, 500 ^ l of cell suspension were placed in an electroporation cuvette (BioRad, 0.4 cm electrode spacing). Plasmid DNA (2 ng) was added to the cuvettes and the suspension was mixed gently and incubated on ice for 5 minutes. The control plasmid (pBBS212) contained no insert behind the MPSV promoter and the experimental plasmid (pGRN133) expressed hTRT from the MPSV promoter. The cells were electroporation at 300 V and 960 nFD. After the pulse was delivered, the cuvettes were kept on ice for approximately 5 minutes before being plated on 100 mm tissue culture plates in medium. After 6 hours the medium was exchanged for new medium. 72 hours after the transfection, the cells were trypsinized, washed once with PBS, pelleted and stored in the frozen state at -80 = 0. Cell extracts were prepared at a concentration of 25,000 cells / nl by a modified lysis method using detergents (see Bodnar et al., Exp. Cell Res. 228 (1996), 58 and Kim et al., Science 266 (1994) 2011 and the Description in patents and publications relating to the above TRAP assay) and telomerase activity in the cell extracts was determined by means of a modified PCR-based TRAP assay (Kim et al., 1994, Bodnar et al., 1996). In short, 5 x 104 cell equivalents were used for the telomerase primer extension part of the reaction. While the extract is typically added directly from the telomerase extension reaction to the PCR amplification, one can also use phenol / chloroform and chloro143

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

form vor der PCR-Amplifikation extrahieren. Ein Fünftel des Materials wurde in dem PCR-Amplifikations-anteil der TRAP-Reaktion verwendet (etwa 10 000 Zelläquivalente). Die Hälfte der TRAP-Reaktion wurde zur Analyse auf ein Gel geladen, so dass jede Spur in Fig. 25 Reaktionsprodukte von 5000 Zelläquivalenten repräsentiert. Extrakte von mit pGRN133 transfizierten Zellen waren hinsichtlich TelomeraseAktivität positiv, während Extrakte von nicht-transfizierten Zellen (nicht gezeigt) oder mit dem Kontroll-plasmid transfizierten Zellen keine Telomerase-Aktivität zeigten. Ähnliche Experimente mit RPE-Zellen ergaben das gleiche Ergebnis. Extract form before PCR amplification. One fifth of the material was used in the PCR amplification portion of the TRAP reaction (approximately 10,000 cell equivalents). Half of the TRAP reaction was loaded on a gel for analysis so that each trace in Figure 25 represents reaction products of 5000 cell equivalents. Extracts from cells transfected with pGRN133 were positive for telomerase activity, while extracts from untransfected cells (not shown) or cells transfected with the control plasmid showed no telomerase activity. Similar experiments with RPE cells gave the same result.

Rekonstitution in BJ-Zellen wurde auch mittels anderer hTRT-Konstrukte durchgeführt (d.h. pGRN145, pGRN155 und pGRN138). Die Rekonstitution unter Verwendung dieser Konstrukte schien zu einer stärkeren Telomerase-Aktivität zu führen im Vergleich zu mit pGRN133 transfizierten Zellen. Reconstitution in BJ cells was also performed using other hTRT constructs (i.e. pGRN145, pGRN155 and pGRN138). Reconstitution using these constructs appeared to result in increased telomerase activity compared to cells transfected with pGRN133.

Der höchste Spiegel an Telomerase-Aktivität wurde mit pGRN155 erzielt. Wie bereits vorstehend diskutiert ist pGRN155 ein Vektor, der den späten Hauptpromotor von Adenovirus als ein Kontrollelement für die Expression von hTRT enthält und es zeigte sich, dass damit Telomerase-Aktivität rekonstituiert werden konnte bei Transfektion in BJ-Zellen. Bemerkenswerterweise ergab die Rekonstitution unter Verwendung mit dem hTRT-GFP-Fusionsprotein pGRN138 (das im Nucleus lokalisiert wird, siehe das nachstehende Beispiel 15) entweder in vitro (siehe Beispiel 7) oder mit in vivo-Rekonstitutionssystemen (Transfektion in Bi-Zellen), ergab Telomerase-Aktivität. Wenn in BJ-Zellen, wie beispielsweise vorstehend beschrieben, transfiziert wurde, war die Telomerase-Aktivität mit der vergleichbar, die sich aus der Rekonstitution mit pGRN133 oder pGRN145 ergab. The highest level of telomerase activity was achieved with pGRN155. As already discussed above, pGRN155 is a vector which contains the late main promoter of adenovirus as a control element for the expression of hTRT and has been shown to be able to reconstitute telomerase activity upon transfection in BJ cells. Remarkably, reconstitution using the hTRT-GFP fusion protein pGRN138 (located in the nucleus, see Example 15 below) gave either in vitro (see Example 7) or with in vivo reconstitution systems (transfection in bi-cells) Telomerase activity. When transfected into BJ cells as described above, for example, the telomerase activity was comparable to that resulting from reconstitution with pGRN133 or pGRN145.

Ähnliche Ergebnisse wurden nach Transfektion von normalen menschlichen pigmenthaltigen retinalen Epithelzellen (RPE) mit den erfindungsgemässen hTRT-Expressionsvektoren erhalten. Es wird davon ausgegangen, dass die Seneszenz von RPE-Zellen zu der Erkrankung der mit dem Alter zusammenhängenden Macula-Degeneration führt oder dazu beiträgt. Gemäss den erfindungsgemässen Verfahren mit den erfindungsgemässen hTRT-Expressionsvektoren behandelte RPE-Zellen sollten eine verzögerte Seneszenz aufweisen im Vergleich zu unbehandelten Zellen und so von Nutzen sein bei Transplantationstherapien zur Behandlung oder zur Verhinderung der mit dem Alter zusammenhängenden Macula-Degeneration. Similar results were obtained after transfection of normal human pigment-containing retinal epithelial cells (RPE) with the hTRT expression vectors according to the invention. RES cell senescence is believed to lead to or contribute to macular degeneration associated with age. RPE cells treated according to the method according to the invention with the hTRT expression vectors according to the invention should have a delayed senescence compared to untreated cells and should therefore be useful in transplantation therapies for the treatment or for the prevention of age-related macular degeneration.

Beispiel 14 Example 14

Promotor-Reporter-Konstrukt Promoter-reporter construct

Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von Plasmiden, bei denen Reportergene mit stromaufwärts gelegenen hTRT-Sequenzen, die Promotorelemente enthalten, funktionell verknüpft sind. Diese Vektoren weisen zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten auf, wozu die Identifizierung von in eis und trans wirkenden Regulationsfaktoren der Transkription in vivo und das Screening nach Agenzien, die die hTRT-Expression modulieren können (z.B. Aktivierung oder Hemmung) zählen (beispielsweise das Screenen von Wirkstoffen). Es können zwar eine Reihe von Reportergenen verwendet werden (beispielsweise Leuchtkörperchen-Luciferase, ß-Glucuronidase, ß-Galactosidase, Chloramphinicolacetyltrans-ferase und GFP), für einleitende Experimente wurde jedoch die sezernierte menschliche alkalische Phosphatase (SEÄP; CloneTech) verwendet. Das SEAP-Reportergen codiert eine verkürzte Form des Enzym aus Plazenta, dem die Domäne für die Membran-Verankerung fehlt, wodurch die effiziente Sekretion des Proteins aus transfizierten Zellen ermöglicht wird. Es konnte gezeigt werden, dass die Spiegel an SEAP-Aktivität, die in dem Kulturmedium nachgewiesen werden, direkt proportional zu Veränderungen in intrazellulären Konzentrationen von SEAP-mRNA und -Protein sind (Berger et al., Gene 66 (1988), 1 und Cullen et al., Meth. Enzymol 216 (1992), 362). This example describes the construction of plasmids in which reporter genes are functionally linked to upstream hTRT sequences containing promoter elements. These vectors have numerous possible uses, including the identification of regulatory factors of transcription acting in ice and trans in vivo and the screening for agents that can modulate hTRT expression (e.g. activation or inhibition) (e.g. screening of active substances). Although a number of reporter genes can be used (for example filament luciferase, β-glucuronidase, β-galactosidase, chloramphinicol acetyltransferase and GFP), the secreted human alkaline phosphatase (SEÄP; CloneTech) was used for preliminary experiments. The SEAP reporter gene encodes a truncated form of the placenta enzyme that lacks the domain for membrane anchoring, thereby enabling efficient protein secretion from transfected cells. It could be shown that the levels of SEAP activity detected in the culture medium are directly proportional to changes in intracellular concentrations of SEAP mRNA and protein (Berger et al., Gene 66 (1988), 1 and Cullen et al., Meth. Enzymol 216 (1992), 362).

Vier Konstrukte (pGRN148, pGRN150, «pSEAP2 basic» (keine Promotorsequenz = negative Kontrolle) und «pSEAP2 control» (das den frühen SV40-Promotor und Enhancer enthält) wurden in dreifacher Ausfertigung in sterblichen und unsterblichen Zellen transfiziert. Four constructs (pGRN148, pGRN150, "pSEAP2 basic" (no promoter sequence = negative control) and "pSEAP2 control" (which contains the early SV40 promoter and enhancer) were transfected in triplicate into mortal and immortal cells.

Plasmid pGRN148 wurde wie in Fig. 9 veranschaulicht konstruiert. Kurz zusammengefasst wurde ein Bglll-Eco47lll-Fragment von pGRN144 gespalten und in die Bglll-Nrul-Stelle von pSEAp2Basic (Clontech, San Diego, CA) cloniert. Ein zweiter Reporterpromotor, das Plasmid pGRN150, enthält die Sequenzen von dem in Beispiel 3 beschriebenen hTRT-Intron, um so regulatorische Sequenzen, die in dem Intron vorhanden sein können, verwenden zu können. Das Initiationscodon Met ist zu Leu mutiert, so dass das zweite dem Promotorbereich folgende ATG das Initiations-ATG des SEAP-ORF ist. Plasmid pGRN148 was constructed as illustrated in Figure 9. Briefly, a Bglll-Eco47lll fragment from pGRN144 was digested and cloned into the Bglll-Nrul site of pSEAp2Basic (Clontech, San Diego, CA). A second reporter promoter, plasmid pGRN150, contains the sequences from the hTRT intron described in Example 3, so that regulatory sequences which may be present in the intron can be used. The initiation codon Met has mutated to Leu, so that the second ATG following the promoter region is the initiation ATG of the SEAP-ORF.

Die Konstrukte pGRN148 und pGRN150, die den hTRT-Promotor enthalten, wurden in sterbliche (BJ-Zellen) und unsterbliche (293)-Zellen transfiziert. Alle Transfektionen wurden parallel mit zwei Kontroll-plasmiden durchgeführt. Ein Plasmid als negative Kontrolle (pSEAP basic) und ein Plasmid als positive Kontrolle («pSEAP control», das den frühen SV40-Promotor und den SV40-Enhancer enthält). Constructs pGRN148 and pGRN150 containing the hTRT promoter were transfected into mortal (BJ cells) and immortal (293) cells. All transfections were carried out in parallel with two control plasmids. One plasmid as a negative control (pSEAP basic) and one plasmid as a positive control («pSEAP control», which contains the early SV40 promoter and the SV40 enhancer).

In unsterblichen Zellen scheinen die Konstrukte pGRN148 und pGRN150 die SEAP-Expression genauso effizient zu steuern, wie die positive «pSEAP2 control» (die den frühen SV40-Promotor und -Enhancer enthält). Im Gegensatz dazu ergab in sterblichen Zellen nur die «pSEAP2 control» nachweisbare Aktivität. Diese Ergebnisse zeigen, dass, wie erwartet, hTRT-Promotorsequenzen in Tumorzellen-aktiv sind, jedoch nicht in sterblichen Zellen. In immortal cells, constructs pGRN148 and pGRN150 seem to control SEAP expression as efficiently as positive pSEAP2 control (which contains the early SV40 promoter and enhancer). In contrast, only the «pSEAP2 control» showed detectable activity in mortal cells. These results show that, as expected, hTRT promoter sequences are active in tumor cells, but not in mortal cells.

Ähnliche Ergebnisse wurden mit einer weiteren normalen Zellinie (RPE), (pigmenthaltige, retinale Epi- Similar results were obtained with another normal cell line (RPE), (pigment-containing, retinal epi

144 144

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

thelzellinie) erhalten. In RPE-Zellen, die mit pGRN150 (das 2,2 kb an stromaufwärts gelegener genomischer Sequenz enthält) transfiziert sind, war der hTRT-Promotorbereich inaktiv, während das Plasmid «pSEAP2 control» aktiv war. received cell line). In RPE cells transfected with pGRN150 (which contains 2.2 kb of upstream genomic sequence), the hTRT promoter region was inactive while the plasmid «pSEAP2 control» was active.

Wie bereits vorstehend angemerkt, sind Plasmide, bei denen Reportergene zur stromaufwärts gelegenen hTRT-Sequenz, die Promotorelemente enthalten, funktionell verknüpft sind, ausgesprochen nützlich für die Identifizierung und das Screening von Telomerase-Aktivität modulierende Agenzien, wobei sowohl Verfahren der transienten als auch der stabilen Transfektion verwendet werden können. Bei einer Vorgehensweise werden beispielsweise stabile Transformanten von pGRN148 in Telomerase-negativen und Telomerase-positiven Zellen durch Cotransfektion mit einem eukariotischen selektierbaren Marker (wie z.B. neo) gemäss Ausubel et al., 1997, a.a.O.) hergestellt. Die erhaltenen Zellinien werden dann für das Screenen von vermuteten Telomerase-modulierenden Agenzien verwendet, beispielsweise durch Vergleich der hTRTPromotor-gesteuerten Expression in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung. As noted above, plasmids in which reporter genes are functionally linked to the upstream hTRT sequence containing promoter elements are extremely useful for the identification and screening of telomerase activity modulating agents, using both transient and stable methods Transfection can be used. In one procedure, for example, stable transformants of pGRN148 in telomerase-negative and telomerase-positive cells are produced by cotransfection with a eukaryotic selectable marker (such as neo) according to Ausubel et al., 1997, cited above. The cell lines obtained are then used for the screening of suspected telomerase-modulating agents, for example by comparing the hTRT promoter-controlled expression in the presence or absence of a test compound.

Die erfindungsgemässen Promotor-Reporter-Vektoren (und andere) werden auch zur Identifizierung von in trans und in eis wirkenden Regulationselementen für die Transkription und Translation verwendet. Zu den Beispielen für in eis wirkenden regulatorischen Elementen der Transkription zählen Promotoren und Enhancer des Telomerasegens. Die Identifizierung und Isolierung von in eis und in trans wirkenden regulatorischen Agenzien führt zur Bereitstellung weiterer Verfahren und Reagenzien zur Identifizierung von Agenzien, die die Transkription und Translation von Telomerase modulieren. The promoter-reporter vectors (and others) according to the invention are also used to identify regulatory elements acting in trans and in ice for transcription and translation. Examples of regulatory elements of transcription acting in ice include promoters and enhancers of the telomerase gene. The identification and isolation of regulatory agents acting in ice and in trans leads to the provision of further methods and reagents for the identification of agents which modulate the transcription and translation of telomerase.

Beispiel 15 Example 15

Subzelluläre Lokalisation von hTRT Subcellular localization of hTRT

Ein Fusionsprotein mit hTRT und «enhanced green fluorescent protein» (EGFP; Cormack et al., Gene 173 (1996), 33)-Bereichen wurde wie nachstehend beschrieben konstruiert. Die EGFP-Einheit liefert ein nachweisbares «tag» oder Signal, womit das Vorhandensein oder die Lage des Fusionsproteins leicht bestimmt werden kann. Da EGFP-Fusionsproteine in den korrekten zellulären Kompartimenten lokalisiert sind, kann dieses Konstrukt zur Bestimmung der subzellulären Lage des hTRT-Proteins verwendet werden. A fusion protein with hTRT and enhanced green fluorescent protein (EGFP; Cormack et al., Gene 173 (1996), 33) areas was constructed as described below. The EGFP unit provides a detectable “tag” or signal, which makes it easy to determine the presence or location of the fusion protein. Since EGFP fusion proteins are located in the correct cellular compartments, this construct can be used to determine the subcellular location of the hTRT protein.

A. Konstruktion von PGRN138 A. Construction of PGRN138

Ein Vektor zur Expression eines hTRT-EGFP-Fusionsproteins in Säugerzellen wurde konstruiert durch Integration der EcoRI-lnsertion von pGRN124 (siehe Beispiel 6) in die EcoRI-Stelle von pEGFP-C2 (Clontech, San Diego, CA). Die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins ist nachstehend gezeigt. EGFP-Reste sind in Fettdruck, durch den 5'-untranslatierten Bereich von hTRT-mRNA codierte Reste sind unterstrichen und die hTRT-Proteinsequenz ist in normaler Schrift angegeben. A vector for expressing an hTRT-EGFP fusion protein in mammalian cells was constructed by integrating the EcoRI insert of pGRN124 (see Example 6) into the EcoRI site of pEGFP-C2 (Clontech, San Diego, CA). The amino acid sequence of the fusion protein is shown below. EGFP residues are in bold, residues encoded by the 5'-untranslated region of hTRT mRNA are underlined and the hTRT protein sequence is given in normal script.

145 145

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

MVSKGEELFTGWPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPT MVSKGEELFTGWPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPT

LVTTLTYGVQCFSRYPDHMRQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTL LVTTLTYGVQCFSRYPDHMRQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTL

VNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLA VNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLA

DHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITI.GMDELYKS DHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITI.GMDELYKS

GRTQISSSSFEFAAASTORCVLLRTWEALAPATPAMPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPI.A GRTQISSSSFEFAAASTORCVLLRTWEALAPATPAMPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPI.A

TFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVL TFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVL

QRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVG QRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVG

DDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNH DDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNH

SVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGP SVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGP

SDRGFCWSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVY SDRGFCWSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVY

AETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQR AETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQR

YWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDP YWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDP

RRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSL RRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSL

QELTWKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYWELLRSFFYVTE QELTWKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYWELLRSFFYVTE

TTFQKNRLFFYRPSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIP TTFQKNRLFFYRPSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIP

KPDGLRPIVNMDYWGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDD KPDGLRPIVNMDYWGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDD

IHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYA IHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYA

WQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAWIEQSSSLNEASSGL WQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAWIEQSSSLNEASSGL

FDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLR FDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLR

LVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCWNLRKTWNFPVEDEALGGTAFVQMPAH LVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCWNLRKTWNFPVEDEALGGTAFVQMPAH

GLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASVTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSL GLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASVTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSL

FLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYS FLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYS

ILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSR ILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSR

KLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD KLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD

Weitere EGFP-Fusionskonstrukte wurden unter Verwendung einer partiellen (z.B. verkürzten) hTRT codierenden Sequenz hergestellt, und, wie nachstehend beschrieben, zur Identifizierung von Aktivitäten bestimmter Bereiche des hTRT-Polypeptids verwendet. Additional EGFP fusion constructs were made using a partial (e.g., truncated) hTRT coding sequence and, as described below, used to identify activities of certain regions of the hTRT polypeptide.

B. Nucleäre Lokalisierung und Verwendungsmöglichkeiten für DGRN138 B. Nuclear localization and uses for DGRN138

Die Transfektion von NIH 293- und BJ-Zellen mit pGRN138 erlaubte die Bestätigung der nucleären Lokalisation von rekombinant exprimierter hTRT. Zellen wurden mit pGRN138 (EGFPhTRT) und einem Kontrollkonstrukt (nur EGFP exprimiert) transfiziert. Die nucleäre Lokalisation der EGFP-hTRT ist in beiden Zelltypen offensichtlich (bestimmt durch Fluoreszenzmikroskopie). Wie bereits vorstehend angemerkt, unterstützt das pGRN138 hTRT-GFP-Fusionsprotein die Rekonstitution von Telomerase-Aktivität sowohl in einem in vitro-Transkriptions/Translationssystem als auch in vivo, wenn es in BJ-Zellen transfiziert wird. The transfection of NIH 293 and BJ cells with pGRN138 allowed the nuclear localization of recombinantly expressed hTRT to be confirmed. Cells were transfected with pGRN138 (EGFPhTRT) and a control construct (only EGFP expressed). The nuclear localization of EGFP-hTRT is evident in both cell types (determined by fluorescence microscopy). As noted above, the pGRN138 hTRT-GFP fusion protein aids in the reconstitution of telomerase activity in both an in vitro transcription / translation system and in vivo when transfected into BJ cells.

hTRT-EGFP-Fusionsproteine (oder ähnliche nachweisbare Fusionsproteine) werden für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet. Beispielsweise wird das in diesem Beispiel beschriebene Fusionskon-strukt oder ein EGFP-Konstrukt und eine verkürzte Form von hTRT zur Beurteilung der Fähigkeit von hTRT und Varianten, in einen Zellnucleus einzutreten und/oder an die Chromosomenenden anlagern zu können, verwendet. Ausserdem werden stabil oder transient mit pGRN138 transfizierte Zellen für das Screenen nach vermuteten Telomerase-modulierenden Wirkstoffen oder Verbindungen verwendet. Agenzien, die die nucleäre Lokalisation oder Telomer-Lokalisation stören, werden als Telomerase-Inhibi-toren identifiziert. Für diesen Zweck sind Tumorzellinien, die EGFP-hTRT stabil exprimieren, verwendet. Potentielle Modulatoren von Telomerase werden diesen transfizierten Zellen verabreicht und die Lokalisation der EGFP-hTRT kann bewertet werden. Ausserdem werden FACS oder andere auf Fluoreszenz basierende Verfahren verwendet, um hTRT exprimierende Zellen selektieren zu können, womit homogene Populationen für das Screenen von Wirkstoffen bereitgestellt werden, insbesondere wenn die transiente Transfektion von Zellen angewandt wird. hTRT-EGFP fusion proteins (or similar detectable fusion proteins) are used for a variety of applications. For example, the fusion construct described in this example or an EGFP construct and a truncated form of hTRT is used to assess the ability of hTRT and variants to enter a cell nucleus and / or to attach to the chromosome ends. In addition, cells transfected stably or transiently with pGRN138 are used for screening for suspected telomerase-modulating active substances or compounds. Agents that interfere with nuclear or telomer localization are identified as telomerase inhibitors. Tumor cell lines which stably express EGFP-hTRT are used for this purpose. Potential modulators of telomerase are administered to these transfected cells and the location of the EGFP-hTRT can be assessed. In addition, FACS or other fluorescence-based methods are used to select cells expressing hTRT, which provides homogeneous populations for the screening of active substances, especially when transient cell transfection is used.

Bei anderen Anwendungen können Bereiche der hTRT zur Identifikation von Bereichen (z.B. Reste 193-196 (PRRR) und Reste 235-240 (PKRRRR)) mutagenisiert werden, die für die nucleäre Lokalisation erforderlich sind, wobei diese Bereiche Ziele für anti-Telomerase-Wirkstoffe (Modulatoren von Telomerase-Aktivität) sind. Zu den weiteren Anwendungen gehören: In other applications, areas of hTRT to identify areas (eg residues 193-196 (PRRR) and residues 235-240 (PKRRRR)) that are required for nuclear localization can be mutagenized, these areas being targets for anti-telomerase agents (Modulators of telomerase activity). Other applications include:

Verwendung des Fusionsproteins als Fluoreszenzmarker für die effiziente Zelltransfektion, sowohl für Use of the fusion protein as a fluorescent marker for efficient cell transfection, both for

146 146

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Experimente hinsichtlich transienter Transfektion als auch für die Etablierung EGFP-hTRT-exprimieren-der stabiler Zellinien; Experiments regarding transient transfection as well as for the establishment of EGFP-hTRT-express-the stable cell lines;

Expression eines hTRT-EGFP-Fusionsproteins mit mutierten Signalen für nucleäre Lokalisation (defi-zient für nucleäre Lokalisation) in unsterblichen Zellen, damit das hTRT-Mutanten-EGFP alle hTR der unsterblichen Zellen einfängt, sie im Cytoplasma zurückhält und die Telomer-Aufrechterhaltung verhindert; Expression of an hTRT-EGFP fusion protein with mutated signals for nuclear localization (deficient for nuclear localization) in immortal cells so that the hTRT mutant EGFP captures all hTR of the immortal cells, retains them in the cytoplasm and prevents telomer maintenance;

Das GFP kann auch als ein «tag» für Immunpräzipitation verwendet werden. The GFP can also be used as a "tag" for immunoprecipitation.

Beispiel 16 Example 16

Die Auswirkung einer Mutation auf eine katalytische Aktivität von Telomerase The effect of a mutation on the catalytic activity of telomerase

Dieses Beispiel beschreibt Experimente hinsichtlich der Veränderung von hTRT-Aminosäuren, sowie die Auswirkung von Aminosäureaustauschen in hTRT auf katalytische Aktivität von Telomerase. Der Austausch von Aminosäuren und im Anschluss daran die funktionelle Analyse ist ein Standardverfahren zur Bewertung der Bedeutung und Funktion einer Polypeptidsequenz. Dieses Beispiel zeigt, dass Veränderungen in den reverse-Transkriptase (RT)- und Telomerase-T-Motiven katalytische Aktivität von Telomerase beeinflussen und es liefert eine zusätzliche Bestätigung der katalytischen Natur des hTRT-Polypeptids. This example describes experiments regarding the modification of hTRT amino acids, as well as the effect of amino acid exchanges in hTRT on the catalytic activity of telomerase. The exchange of amino acids and then the functional analysis is a standard procedure for evaluating the meaning and function of a polypeptide sequence. This example shows that changes in the reverse transcriptase (RT) and telomerase T motifs affect the catalytic activity of telomerase and provides additional confirmation of the catalytic nature of the hTRT polypeptide.

Die übliche Nomenklatur wird zur Beschreibung der Mutanten verwendet: Der Zielrest im nativen Molekül (hTRT) wird durch den Ein-Buchstaben-Code und die Position angegeben, und der entsprechende Rest in dem Mutantenprotein ist durch den Ein-Buchstaben-Code angegeben. Somit kennzeichnet beispielsweise der Ausdruck «K626A» eine Mutante, bei der das Lysin an Position 626 (d.h. im Motiv 1) voh hTRT gegen ein Alanin ausgetauscht ist. The usual nomenclature is used to describe the mutants: the target residue in the native molecule (hTRT) is indicated by the one-letter code and the position, and the corresponding residue in the mutant protein is indicated by the one-letter code. Thus, for example, the expression “K626A” denotes a mutant in which the lysine at position 626 (i.e. in motif 1) is replaced by an alanine by hTRT.

A) Mutagenese des FFYxTE-Motivs von hTRT A) Mutagenesis of the FFYxTE motif from hTRT

In einleitenden Experimenten wurde ein mutiertes hTRT-Protein codierender Vektor, «F560A» hergestellt, bei dem die Aminosäure 560 von SEQ. ID. Nr. 2 von Phenylalanin (F) zu Alanin (A) durch ortsgerichtete Mutagenese von pGRN121 mittels Standardverfahren geändert wurde. Diese Mutation unterbricht das TRT FFYxTE-Motiv. Es konnte gezeigt werden, dass das erhaltene mutierte F560A-Polynu-cleotid die Synthese eines hTRT-Proteins mit vollständiger Länge steuert, wie dies unter Verwendung eines zellfreien Reticulocytenlysat-Transkriptions/Translationssystem in Gegenwart von 35S-Methionin bestimmt werden konnte. In preliminary experiments, a mutated hTRT protein coding vector, "F560A", was produced in which the amino acid 560 from SEQ. ID. No. 2 was changed from phenylalanine (F) to alanine (A) by site-directed mutagenesis of pGRN121 using standard procedures. This mutation interrupts the TRT FFYxTE motif. The mutant F560A polynucleotide obtained was shown to control the synthesis of a full-length hTRT protein, as determined using a cell-free reticulocyte lysate transcription / translation system in the presence of 35S methionine.

Bei Translation des mutierten Polypeptids zusammen mit hTRT, wie in Beispiel 7 beschrieben, wurde mittels des TRAP-Assays unter Verwendung von 20 PCR-Cyclen keine Telomerase-Aktivität entdeckt, während die Kontroll-Cotranslation von hTRT-hTR-Aktivität rekonstituierte. Bei Venwendung von 30 PCR-Cyclen im TRAP-Assay war Telomerase-Aktivität mit der mutierten hTRT nachweisbar, sie war jedoch beträchtlich geringer im Vergleich zu der Kontroll (Wildtyp)-hTRT. When the mutant polypeptide was translated together with hTRT as described in Example 7, no telomerase activity was detected by means of the TRAP assay using 20 PCR cycles, while the control cotranslation of hTRT-hTR activity reconstituted. When using 30 PCR cycles in the TRAP assay, telomerase activity was detectable with the mutated hTRT, but was significantly lower compared to the control (wild-type) hTRT.

B) Zusätzliche ortsgerichtete Mutagenese von hTRT-Aminosäureresten B) Additional site-directed mutagenesis of hTRT amino acid residues

Konservierte Aminosäuren in sechs RT-Motiven wurden zu Alanin abgeändert, um ihren Beitrag zur katalytischen Aktivität zu beurteilen, wobei Standardverfahren für die ortsgerichtete Mutagenese verwendet wurden (siehe beispielsweise Ausubel, a.a.O.). Die Mutanten wurden mittels IVR-Telomerase untersucht, wobei der in Beispiel 7 ausführlich beschriebene Zwei-Schritt-Assay (üblich/TRAP) verwendet wurde. Conserved amino acids in six RT motifs were changed to alanine to assess their contribution to catalytic activity using standard site-directed mutagenesis techniques (see, for example, Ausubel, op. Cit.). The mutants were examined using IVR telomerase, using the two-step assay (common / TRAP) described in detail in Example 7.

Die Mutanten K626A (Motiv 1), R631A (Motiv 2), D712A (Motiv A), Y717A (Motiv A) und D868A (Motiv C) zeigten stark herabgesetzte oder nicht-nachweisbare Telomerase-Aktivität, während die Mutanten Q833A (Motiv B) und G932A (Motiv E) mittlere Aktivitätsspiegel aufwiesen. Zwei Mutationen ausserhalb der RT-Motive (R688A und D897A) zeigten Aktivität, die äquivalent zu der Aktivität von Wildtyp-hTRT war. Diese Ergebnisse waren konsistent mit analogen Mutationen in reverser Transkriptase (Joyce et al., Ann. Rev. Biochem. 63 (1994), 777), und ähnlich zu dem mit Est2P erhaltenen Ergebnissen (siehe Lingner, Science 276 (1997), 561). Durch diese Experimente konnten Reste in den RT-Motiven identifiziert werden, die für enzymatische Aktivität kritisch sind. Diese Experimente zeigen auch das hTRT, das das katalytische Protein von menschlicher Telomerase ist. Durch die Mutationen werden hTRT-Polypep-tidvarianten erzeugt, die als dominant-negative Regulatoren von Telomerase-Aktivität verwendet werden können. Mutants K626A (motif 1), R631A (motif 2), D712A (motif A), Y717A (motif A) and D868A (motif C) showed greatly reduced or undetectable telomerase activity, while the mutants Q833A (motif B) and G932A (Motif E) had moderate activity levels. Two mutations outside of the RT motifs (R688A and D897A) showed activity that was equivalent to the activity of wild-type hTRT. These results were consistent with analogous mutations in reverse transcriptase (Joyce et al., Ann. Rev. Biochem. 63 (1994), 777), and were similar to the results obtained with Est2P (see Lingner, Science 276 (1997), 561) . These experiments identified residues in the RT motifs that are critical for enzymatic activity. These experiments also show the hTRT, which is the catalytic protein of human telomerase. The mutations produce hTRT polypeptide variants which can be used as dominant-negative regulators of telomerase activity.

Durch Aminosäureausrichtung der bekannten TRTs konnte das Telomerase-spezifische Motiv T (siehe vorstehend) identifiziert werden. Um die katalytische Rolle dieses Motivs in hTRT zu bestimmen, wurde eine Deletion von sechs Aminosäuren in diesem Motiv (A560-565; FFYxTE) unter Verwendung von Standardverfahren für die ortsgerichtete Mutagenese konstruiert (Ausubel, a.a.O.). Die Deletion wurde unter Verwendung von IVR-Telomerase mittels in Beispiel 7 ausführlich beschriebener Zwei-Schritt-Assays (üblich/TRAP) untersucht. Die Mutante A560-565 zeigte keine nachweisbare Telomerase-Aktivität nach 25 PCR-Cyclen, während Wildtyp-hTRT-IVR-Telomerase ein starkes Signal erzeugte. Jeder The telomerase-specific motif T (see above) was identified by amino acid alignment of the known TRTs. To determine the catalytic role of this motif in hTRT, a six amino acid deletion in this motif (A560-565; FFYxTE) was constructed using standard site-directed mutagenesis techniques (Ausubel, op. Cit.). The deletion was examined using IVR telomerase by means of two-step assays (common / TRAP) described in detail in Example 7. Mutant A560-565 showed no detectable telomerase activity after 25 PCR cycles, while wild-type hTRT-IVR telomerase generated a strong signal. Everyone

147 147

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

Aminosäurerest in Motiv T wurde auf ähnliche Weise unabhängig untersucht. Die Mutanen FS60A, Y562A, TS64 und E565A behielten mittlere Spiegel an Telomerase-Aktivität bei, während die Kontroll-mutante F487A eine minimale Auswirkung auf die Aktivität hatte. Bemerkenswerterweise zeigte die Mutante F561A eine stark herabgesetzte oder nicht nachweisbare Telomerase-Aktivität, während in ihrer «Revertante» F561A561P Aktivität voll wiederhergestellt war. Bei der F561A561F befindet sich an der mutierten Position wieder das ursprüngliche Phenylalanin. Dies stellt eine Kontrolle dar, die zeigt, dass keine weiteren Aminosäureaustausche in dem Plasmid vorkamen, die die beobachtete verringerte Aktivität hätten erklären können. Somit ist das T-Motiv das erste Nicht-RT-Motiv, für das gezeigt werden konnte, dass es für Telomerase-Aktivität erforderlich ist. Amino acid residue in motif T was examined independently in a similar manner. The mutants FS60A, Y562A, TS64 and E565A maintained moderate levels of telomerase activity, while the control mutant F487A had minimal effect on activity. Remarkably, the mutant F561A showed a greatly reduced or undetectable telomerase activity, while in its "revertant" F561A561P activity was fully restored. With the F561A561F, the original phenylalanine is again at the mutated position. This is a control that shows that there were no further amino acid changes in the plasmid that could have explained the reduced activity observed. Thus, the T motif is the first non-RT motif that has been shown to be required for telomerase activity.

Motiv T ist von Nutzen für die Identifizierung von TRTs von anderen Organismen und als ein potentieller dominant/negativ-Regulator von Telomerase-Aktivität. Im Gegensatz zu den meisten anderen RTs assoziierte Telomerase stabil mit einem kleinen Anteil einer einzelnen RNA (d.h. hTR) und kopiert diesen prozessiv, somit könnte das Motiv T an der Vermittlung der hTR-Bindung, der Prozessivität der Reaktion oder anderen Funktionen beteiligt sein, die für die Telomerase-RT einzigartig sind. Motif T is useful for the identification of TRTs from other organisms and as a potential dominant / negative regulator of telomerase activity. Unlike most other RTs, telomerase stably associates with a small portion of a single RNA (ie hTR) and copies it processively, so the motif T could be involved in mediating hTR binding, processivity of the reaction, or other functions that are unique for the Telomerase-RT.

Beispiel 17 Example 17

Screenen nach Modulatoren von Telomerase-Aktivität mittels rekombinant exprimierter Telomerase-Bestandteile Screen for modulators of telomerase activity using recombinantly expressed telomerase components

In diesem Beispiel wird die Verwendung von in vitro-rekonstituierter Telomerase zum Screenen und zur Identifizierung von Modulatoren von Telomerase-Aktivität beschrieben. Der beschriebene Assay kann leicht für Verfahren mit hohem Durchsatz adaptiert werden (z.B. mittels Platten mit vielfachen Vertiefungen und/oder Robotertechniksystem). Für den Fachmann sind die zahlreichen Variationsmöglichkeiten hinsichtlich der Assayschritte offensichtlich. This example describes the use of in vitro reconstituted telomerase to screen and identify modulators of telomerase activity. The described assay can easily be adapted for high throughput processes (e.g. using multiple well plates and / or robotic technology systems). The numerous possible variations with regard to the assay steps are obvious to the person skilled in the art.

Rekombinante Clone für Telomerase-Bestandteile (z.B. hTRT und hTRR) werden in einer in vitro-Re-aktion wie folgt und in dem vorstehend beschriebenen Beispiel 7 mittels des TNT® T7gekoppelten Reti-culocytenlysat-Systems (Promega; das in US-Patent Nr. 5 324 637 beschrieben ist und gemäss den Angaben des Herstellers verwendet wurde) transkribiert und translatiert (nur hTRT): Recombinant clones for telomerase components (e.g. hTRT and hTRR) are produced in an in vitro reaction as follows and in Example 7 described above using the TNT® T7-coupled reticulocyte lysate system (Promega; described in US Pat. No. 5 324 637 and was used according to the manufacturer's instructions) transcribed and translated (only hTRT):

Reagenz Reagent

Mengepro Reaktion (ml) Amount per reaction (ml)

TNT-Kaninchen-Reticulocytenlysat TNT rabbit reticulocyte lysate

25 25th

TNT-Reaktionspuffer TNT reaction buffer

2 2nd

TNT T7-RNA-Polymerase TNT T7 RNA polymerase

1 1

AA-Gemisch (vollständig) AA mixture (complete)

1 1

«Prime» RNase-lnhibitor "Prime" RNase inhibitor

1 1

Nuclease-freies Wasser Nuclease-free water

16 16

Xbal-geschnittenes pGRN121 (hTRT, 0,5 ng) Xbal-cut pGRN121 (hTRT, 0.5 ng)

2 2nd

Fspl-geschnittenes pGRN164 (hTR, 0,5 ng) FSPL-cut pGRN164 (hTR, 0.5ng)

2 2nd

Die Reaktion wird 2 Stunden bei 30°C inkubiert. Danach wird das Produkt auf einem «ultrafree-MC» DEAE-Filter (Millipore) gereinigt. The reaction is incubated at 30 ° C for 2 hours. The product is then cleaned on an “ultrafree-MC” DEAE filter (Millipore).

Das rekombinante Telomerase-Produkt (IVRP) wird in Gegenwart oder Abwesenheit vielfacher Konzentrationen an Testverbindungen, die in DMSO (z.B. 10 nM bis 100 nM) solubilisiert wurden, untersucht. Die Testverbindungen werden 30 Minuten bei Raumtemperatur in einem Gesamtvolumen von 25 n' vorinkubiert, in der Gegenwart von 2, 5 nl IVRP, 2,5% DMSO und 1 x TRAP-Puffer (20 mM Tris-HCI, pH-Wert 8,3, 1,5 mM MgCfe, 63 mM KCl, 0,05% Tween 20, 1,0 mM EGTA und 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin) vorinkubiert. Nach der Vorinkubation werden zu jeder Probe 25 nl TRAP-Assay-Reakti-onsgemisch zugegeben. Das TRAP-Assay-Reaktionsgemisch besteht aus 1 x TRAP-Puffer, 50 nl dNTP, 2,0 nQ/ml Primer ACX, 4 ng/ml Primer U2, 0,8 Attomol/ml TSU2, 2 Einheiten 50 nl Taq-Polymerase (Perkin Elmer) und 2 ng/ml [32P]5'-endmarkierter Primer TS (3000 Ci/mMol). Die Röhrchen mit dem Reaktionsgemisch werden dann in den PCR-Thermocycler (MJ Research) gestellt und die PCR wird wie folgt durchgeführt: 60 Minuten bei 30°C, 20 Cyclen von jeweils 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C und 30 Sekunden bei 72°C, dann 1 Minute bei 72°C und Abkühlen auf 10°C. Der TRAP-Assay ist, wie bereits vorstehend erwähnt, in dem US-Patent Nr. 5 629 154 beschrieben. Die verwendeten Primer und Substrate haben die Sequenzen: The recombinant telomerase product (IVRP) is tested in the presence or absence of multiple concentrations of test compounds that have been solubilized in DMSO (e.g. 10 nM to 100 nM). The test compounds are preincubated for 30 minutes at room temperature in a total volume of 25 n ', in the presence of 2.5 nl IVRP, 2.5% DMSO and 1 x TRAP buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.3 , 1.5 mM MgCfe, 63 mM KCl, 0.05% Tween 20, 1.0 mM EGTA and 0.1 mg / ml bovine serum albumin). After the preincubation, 25 nl TRAP assay reaction mixture are added to each sample. The TRAP assay reaction mixture consists of 1 x TRAP buffer, 50 nl dNTP, 2.0 nQ / ml primer ACX, 4 ng / ml primer U2, 0.8 attomol / ml TSU2, 2 units 50 nl Taq polymerase ( Perkin Elmer) and 2 ng / ml [32P] 5'-end-labeled primer TS (3000 Ci / mmol). The tubes with the reaction mixture are then placed in the PCR thermal cycler (MJ Research) and the PCR is carried out as follows: 60 minutes at 30 ° C, 20 cycles of 30 seconds each at 94 ° C, 30 seconds at 60 ° C and 30 seconds at 72 ° C, then 1 minute at 72 ° C and cooling to 10 ° C. As mentioned above, the TRAP assay is described in U.S. Patent No. 5,629,154. The primers and substrates used have the sequences:

148 148

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 689 672 A9 CH 689 672 A9

TS-Primer (5'-aATCCGTCGAGCaGAGTT-3'); TS primer (5'-aATCCGTCGAGCaGAGTT-3 ');

ACX- Primer (5..GCGCGG[CTTACq3CTAACC-3'); ACX primer (5th.GCGCGG [CTTACq3CTAACC-3 ');

U2 - Primer (S'-ATCGCTTCTCGGCCTTTTo); U2 primer (S'-ATCGCTTCTCGGCCTTTTo);

TSU2 (5,-AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT-3') TSU2 (5, -AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT-3 ')

Nach Beendigung des PCR-Schritts werden zu jedem Reaktionsröhrchen 4 n' 10 x Bromphenolblau enthaltender Auftragspuffer zugegeben und die Produkte (20 pl) auf einem 12,5%igen nicht-denaturie-renden PAGE-Gel in 0,5 x TBE bei 400 V laufen gelassen. Nach Beendigung des Gellaufs wird das Gel getrocknet und die TRAP-Produkte werden mittels des «Phosphorimager» oder durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Telomerase-Aktivität in Gegenwart der Testverbindung wird dadurch gemessen, dass der Einbau der Markierung in das Reaktionsprodukt mit einer Parallelreaktion ohne das Agens verglichen wird. After completion of the PCR step, 4 n '10 x bromophenol blue containing application buffer are added to each reaction tube and the products (20 pl) on a 12.5% non-denaturing PAGE gel in 0.5 x TBE at 400 V let run. After the gel run has ended, the gel is dried and the TRAP products are made visible using the “phosphor imager” or by autoradiography. The telomerase activity in the presence of the test compound is measured by comparing the incorporation of the label into the reaction product with a parallel reaction without the agent.

Die folgenden in den Beispielen beschriebenen Clone wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD20852, USA hinterlegt. The following clones described in the examples were deposited with the American Type Culture Collection, Rockville, MD20852, USA.

Lambda-Phage X 25-1.1 ATCC-Zugangsnummer 209024 Lambda-Phage X 25-1.1 ATCC accession number 209024

pGRN121 ATCC-Zugangsnummer 209016 pGRN121 ATCC accession number 209016

Lambda-Phage xG<u5 ATCC-Zugangsnummer 98505 Lambda phage xG <u5 ATCC accession number 98505

Diese Hinterlegungen unter dem Budapester Vertrag erfolgten für ATCC 209024 am 12. Mai 1997, für ATCC 209016 am 6. Mai 1997 und für ATCC 98505 am 14. August 1997. These deposits under the Budapest Treaty were made on May 12, 1997 for ATCC 209024, on May 6, 1997 for ATCC 209016 and on August 14, 1997 for ATCC 98505.

Die vorliegende Erfindung stellt neue Verfahren und Substanzen zur Diagnose und der Behandlung von mit Telomerase in Zusammenhang stehenden Krankheiten bereit. Es wurden spezifische Beispiele bereitgestellt, die vorstehende Beschreibung dient jedoch nur zur Veranschaulichung und soll keine Einschränkung darstellen. Für den Fachmann sind nach Lesen der Beschreibung viele Variationsmöglichkeiten hinsichtlich der Erfindung offensichtlich. Der Umfang der Erfindung wird somit nicht durch die vorstehende Beschreibung bestimmt, sondern soll durch die nachstehenden Patentansprüche zusammen mit dem vollen Umfang ihrer Äquivalente bestimmt werden. The present invention provides new methods and substances for the diagnosis and treatment of diseases related to telomerase. Specific examples have been provided, but the above description is illustrative only and is not intended to be limiting. After reading the description, many possibilities of variation with regard to the invention are obvious to the person skilled in the art. The scope of the invention is thus not determined by the foregoing description, but is intended to be determined by the claims below, along with the full scope of its equivalents.

Alle in dieser Anmeldung zitierten Publikationen und Patentdokumente sind aufgrund der Bezugnahme und für alle Zwecke als Bestandteil der Beschreibung anzusehen und zwar in dem gleichen Aus-mass als wenn jede einzelne Veröffentlichung oder jedes einzelne Patentdokument individuell bezeichnet worden wäre. All publications and patent documents cited in this application are to be regarded as part of the description by reference and for all purposes, to the same extent as if each individual publication or patent document had been individually designated.

Claims (53)

PatentansprücheClaims 1. Menschliches Telomerase-reverse Transkriptase-(hTRT-) Polypeptid oder eine Variante davon oder ein Fragment davon, wobei das Polypeptid oder die Variante davon oder das Fragment davon mindestens eine der mit nativer hTRT assoziierten funktionellen Aktivitäten aufweist und die oder diese Aktivitäten aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus:1. Human telomerase reverse transcriptase (hTRT) polypeptide or a variant thereof or a fragment thereof, wherein the polypeptide or variant thereof or the fragment thereof has at least one of the functional activities associated with native hTRT and the activity or activities from the Group are selected, which consists of: - der Aktivität, die einem DNA-Primer oder ein Substrat um mindestens einen TTAGGG-Repeat verlängert, d.h. der katalytischen Aktivität von Telomerase,the activity that extends a DNA primer or substrate by at least one TTAGGG repeat, i.e. the catalytic activity of telomerase, - der Aktivität von konventioneller reverser Transkriptase,the activity of conventional reverse transcriptase, - der Aktivität, die exogene RNA transkribiert,the activity that exogenous RNA transcribes, - der nukleolytischen Aktivität,- the nucleolytic activity, - der primer- oder substratbindenden Aktivität,- the primer- or substrate-binding activity, - der proteinbindenden Aktivität,- protein binding activity, - der Aktivität, die die RNA menschlicher Telomerase (hTR) bindet.- the activity that binds human telomerase (hTR) RNA. 2. hTRT-Polypeptid oder Variante davon oder Fragment davon nach Anspruch 1, mit mindestens 75% Sequenzidentität zu dem hTRT-Polypeptid SEQ. Id. Nr. 2.2. hTRT polypeptide or variant thereof or fragment thereof according to claim 1, with at least 75% sequence identity to the hTRT polypeptide SEQ. Id. No. 2. 3. hTRT-Polypeptid nach Anspruch 1, mit der Sequenz von SEQ. Id. Nr. 2 und mit vollständiger Län-9e-3. hTRT polypeptide according to claim 1, with the sequence of SEQ. Id. No. 2 and with complete Län-9e- 4. hTRT-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polypeptid oder die Variante oder das Fragment davon katalytische Aktivität von Telomerase haben.4. hTRT polypeptide according to any one of claims 1 to 3, wherein the polypeptide or the variant or the fragment thereof have catalytic activity of telomerase. 5. Zusammensetzung, umfassend ein hTRT-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und eine RNA.5. A composition comprising an hTRT polypeptide according to any one of claims 1 to 4 and an RNA. 6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei die RNA eine menschliche Telomerase-RNA ist.6. The composition of claim 5, wherein the RNA is a human telomerase RNA. 7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das hTRT-Polypeptid und die menschliche Telomerase-RNA einen Ribonukleoproteinkomplex mit einer Telomerase-Aktivität bilden.7. The composition of claim 6, wherein the hTRT polypeptide and human telomerase RNA form a ribonucleoprotein complex with telomerase activity. 149149 CH 689 672 A9CH 689 672 A9 8. Nukleinsäuresequenz, die ein hTRT-Polypeptid oder ein Fragment davon nach Anspruch 1 codiert.8. A nucleic acid sequence encoding an hTRT polypeptide or a fragment thereof according to claim 1. 9. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 8, die ein hTRT-Polypeptid codiert, wobei das hTRT-Polypeptid eine wie in SEQ. Id. Nr. 2 angegebene Aminosäuresequenz hat, oder eine Sequenz, die eine oder mehrere konservative Substitutionen in der Aminosäuresequenz umfasst.9. The nucleic acid sequence according to claim 8, which encodes an hTRT polypeptide, wherein the hTRT polypeptide is one as in SEQ. Id. No. 2 has given amino acid sequence, or a sequence that includes one or more conservative substitutions in the amino acid sequence. 5 5 10. Nukleinsäuresequenz, die ein hTRT-Polypeptid nach Anspruch 3 codiert.10. A nucleic acid sequence encoding an hTRT polypeptide according to claim 3. 11. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 10, umfassend die das hTRT-Polypeptid codierende Sequenz des Einschubs von pGRN121 (ATCC-Zugangsnummer 209016).11. The nucleic acid sequence according to claim 10, comprising the sequence encoding the hTRT polypeptide of the insertion of pGRN121 (ATCC accession number 209016). 12. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 10, mit der in Fig. 16 (SEQ. Id. Nr. 1) gezeigten Sequenz.12. Nucleic acid sequence according to claim 10, with the sequence shown in Fig. 16 (SEQ. Id. No. 1). 13. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 8, die die Sequenz von SEQ. Id. Nr. 1 aufweist.13. A nucleic acid sequence according to claim 8, which is the sequence of SEQ. Id. No. 1. 10 10th 14. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 8, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die exakt komplementär zur Sequenz von SEQ. Id. Nr. 1 ist.14. Nucleic acid sequence according to claim 8, which hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence which is exactly complementary to the sequence of SEQ. Id No. 1 is. 15. Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 8 bis 14.15. A polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to one of claims 8 to 14. 16. Nukleinsäuresequenz, die exakt oder fast exakt komplementär zur Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 8 bis 14 ist.16. Nucleic acid sequence that is exactly or almost exactly complementary to the nucleic acid sequence according to one of claims 8 to 14. 15 15 17. Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 16.17. A polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to claim 16. 18. Polynukleotid nach Anspruch 15 oder 17, umfassend eine mit der hTRT-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpfte Promotorsequenz.18. A polynucleotide according to claim 15 or 17, comprising a promoter sequence functionally linked to the nucleic acid sequence encoding the hTRT polypeptide. 19. Ein im wesentlichen reines Polynukleotid nach Anspruch 15 oder 17, das eine Länge von mindestens 10 Nukleotiden hat und eine aufeinanderfolgende Sequenz von mindestens 12 Nukleotiden um-19. A substantially pure polynucleotide according to claim 15 or 17, which has a length of at least 10 nucleotides and a sequential sequence of at least 12 nucleotides. 20 fasst, die zu einer aufeinanderfolgenden Sequenz in einem natürlich vorkommenden hTRT-Gen oder einer hTRTmRNA identisch oder genau komplementär ist.20 that is identical or exactly complementary to a successive sequence in a naturally occurring hTRT gene or an hTRTmRNA. 20. Polynukleotid nach Anspruch 19, mit mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden.20. Polynucleotide according to claim 19, with at least 15 consecutive nucleotides. 21. Polynukleotid nach Anspruch 19, mit mindestens 25 aufeinanderfolgenden Nukleotiden.21. Polynucleotide according to claim 19, with at least 25 consecutive nucleotides. 22. Nukleinsäuresequenz oder Polynukleotid nach einem der Ansprüche 8 bis 15, die/das zu der zu-22. Nucleic acid sequence or polynucleotide according to one of claims 8 to 15, which / to the 25 sammenhängenden Sequenz in einem natürlich vorkommenden hTRT-Gen oder einer hTRT-mRNA25 contiguous sequence in a naturally occurring hTRT gene or an hTRT mRNA identisch ist.is identical. 23. Nukleinsäuresequenz oder Polynukleotid nach Anspruch 16 oder 17, die/das zu der zusammenhängenden Sequenz in einem natürlich vorkommenden hTRT-Gen oder einer hTRT-mRNA genau komplementär ist.23. The nucleic acid sequence or polynucleotide according to claim 16 or 17, which is exactly complementary to the connected sequence in a naturally occurring hTRT gene or an hTRT mRNA. 30 30th 24. Expressionsvektor, der eine Nukleinsäuresequenz oder ein Polynukleotid nach einem der Ansprüche 8 bis 23 umfasst.24. Expression vector comprising a nucleic acid sequence or a polynucleotide according to any one of claims 8 to 23. 25. Ex vivo-Zelle oder -Zellinie, die mit einer Nukleinsäuresequenz oder einem Polynukleotid nach einem der Ansprüche 8 bis 23 transfiziert ist.25. Ex vivo cell or cell line transfected with a nucleic acid sequence or a polynucleotide according to any one of claims 8 to 23. 26. Zelle nach Anspruch 25, die eine menschliche Zelle ist.26. The cell of claim 25 which is a human cell. 35 35 27. Zelle nach Anspruch 25 oder 26, die eine erhöhte Proliferationskapazität hat im Vergleich zu einer Zelle, die zwar ansonsten identisch ist, jedoch die Nukleinsäuresequenz oder das Polynukleotid nicht enthält.27. The cell of claim 25 or 26, which has an increased proliferation capacity compared to a cell which is otherwise identical but does not contain the nucleic acid sequence or the polynucleotide. 28. Antikörper oder Fragment davon, die an ein hTRT-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 spezifisch binden.28. Antibodies or fragments thereof that specifically bind to an hTRT polypeptide according to any one of claims 1 to 4. 40 40 29. Ex vivo-Zelle, die den Antikörper nach Anspruch 28 sezernieren kann.29. Ex vivo cell which can secrete the antibody of claim 28. 30. Verfahren zur Untersuchung, ob eine Verbindung ein Modulator einer Telomerase-reverse Tran-skriptase-Aktivität oder einer hTRT-Expression ist, umfassend das Inkontaktbringen einer ex vivo-Zelle, eines Zellextraktes oder einer Zusammensetzung enthaltend ein hTRT-Polypeptid nach Anspruch 1 oder ein Polynukleotid nach Anspruch 15 mit der Verbindung und den Nachweis einer Veränderung in der30. A method of testing whether a compound is a modulator of telomerase reverse transcriptase activity or hTRT expression, comprising contacting an ex vivo cell, a cell extract or a composition containing an hTRT polypeptide according to claim 1 or a polynucleotide according to claim 15 with the connection and the detection of a change in the 45 Telomerase-reverse Transkriptase-Aktivität oder hTRT-Expression in der ex vivo-Zelle, dem Zellextrakt oder der Zusammensetzung.45 Telomerase reverse transcriptase activity or hTRT expression in the ex vivo cell, the cell extract or the composition. 31. Verfahren zur Untersuchung, ob eine Testverbindung ein Modulator einer Telomerase-reverse-Transkriptase-Aktivität ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:31. A method of examining whether a test compound is a modulator of telomerase reverse transcriptase activity, the method comprising the steps of: a) Bereitstellung eines Polypeptides nach einem der Ansprüche 1 bis 4;a) providing a polypeptide according to any one of claims 1 to 4; 50 b) Inkontaktbringen des Polypeptides mit der Testverbindung; und c) Messung der Aktivität des hTRT-Polypeptides, wobei eine Veränderung in der Telomerase-reverse Transkriptase-Aktivität, die in Gegenwart der Testverbindung gemessen wurde, im Vergleich zu der Aktivität in Abwesenheit der Testverbindung einen Nachweis dafür liefert, dass die Testverbindung die Telo-merase-reverse-Transkriptase-Aktivität moduliert.50 b) contacting the polypeptide with the test compound; and c) measuring the activity of the hTRT polypeptide, wherein a change in the telomerase reverse transcriptase activity measured in the presence of the test compound compared to the activity in the absence of the test compound provides evidence that the test compound detects the telo -merase reverse transcriptase activity modulated. 55 55 32. Verfahren zur Herstellung rekombinanter Telomerase nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das die Züchtung einer Zelle nach Anspruch 26 oder 27 und die Isolierung des Polypeptides aus der Kultur umfasst.32. A method for producing recombinant telomerase according to any one of claims 1 to 4, which comprises culturing a cell according to claim 26 or 27 and isolating the polypeptide from the culture. 33. Verfahren nach Anspruch 32, das ferner das Inkontaktbringen des rekombinanten hTRT-Polypeptides mit einem Telomerase-RNA-Bestandteil umfasst, unter solchen Bedingungen, dass das rekombi-33. The method of claim 32, further comprising contacting the recombinant hTRT polypeptide with a telomerase RNA component under conditions such that the recombinant 60 nante Polypeptid und der Telomerase-RNA-Bestandteil zur Bildung eines Telomerase-Enzyms assoziieren, das die Anfügung von Nukleotiden an ein Telomerasesubstrat katalysieren kann.Associate 60 nante polypeptide and the telomerase RNA component to form a telomerase enzyme that can catalyze the attachment of nucleotides to a telomerase substrate. 34. Verfahren zum Nachweis eines hTRT-Genproduktes in einer biologischen Probe, umfassend:34. A method for the detection of an hTRT gene product in a biological sample, comprising: a) Inkontaktbringen der biologischen Probe mit einer Sonde, die spezifisch an das hTRT-Genprodukt hybridisiert, wobei die Sonde und das Genprodukt einen Komplex bilden, und Nachweis des Komple-a) contacting the biological sample with a probe which hybridizes specifically to the hTRT gene product, the probe and the gene product forming a complex, and detection of the complex 65 xes; oder65 xes; or 150150 55 1010th 1515 2020th 2525th 3030th 3535 4040 4545 5050 5555 6060 6565 CH 689 672 A9CH 689 672 A9 b) spezifische Amplifikation des Genproduktes in der biologischen Probe, und Nachweis des Amplifi-kationsproduktes, wobei die Anwesenheit des Komplexes oder des Amplifikationsproduktes mit dem Vorhandensein des hTRT-Genproduktes in der biologischen Probe korreliert ist, und wobei das Genprodukt ein Polynukleotid nach Anspruch 15 oder 17 ist.b) specific amplification of the gene product in the biological sample, and detection of the amplification product, the presence of the complex or the amplification product being correlated with the presence of the hTRT gene product in the biological sample, and wherein the gene product is a polynucleotide according to claim 15 or 17 is. 35. Verfahren zum Nachweis eines hTRT-Polypeptides nach Anspruch 1 in einer biologischen Probe, umfassend:35. A method for detecting an hTRT polypeptide according to claim 1 in a biological sample, comprising: Inkontaktbringen der biologischen Probe mit einer Sonde, die spezifisch das hTRT-Polypeptid bindet, wobei die Sonde und das hTRT-Polypeptid einen Komplex bilden, und Nachweis des Komplexes,Contacting the biological sample with a probe which specifically binds the hTRT polypeptide, the probe and the hTRT polypeptide forming a complex, and detection of the complex, wobei die Anwesenheit des Komplexes mit dem Vorhandensein des hTRT-Polypeptides in der biologischen Probe korreliert ist.the presence of the complex being correlated with the presence of the hTRT polypeptide in the biological sample. 36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde ein monoklonaler Antikörper ist.36. The method according to claim 35, characterized in that the probe is a monoclonal antibody. 37. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von mindestens einer telomerase-positiven menschlichen Zelle in einer, menschliche Zellen nach Anspruch 23 enthaltenden biologischen Probe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:37. A method for detecting the presence of at least one telomerase-positive human cell in a biological sample containing human cells according to claim 23, the method comprising the following steps: a) Bestimmung der Menge an hTRT-Genprodukt in der Probe,a) determining the amount of hTRT gene product in the sample, b) Vergleich der gemessenen Menge mit einer Kontrolle, die mit einer keine telomerase-positiven Zellen enthaltenden Probe korreliert,b) comparison of the measured amount with a control which correlates with a sample containing no telomerase positive cells, wobei das Vorhandensein eines höheren Spiegels des hTRT-Genproduktes in der Probe im Vergleich zu der Kontrolle mit dem Vorhandensein von telomerase-positiven Zellen in der biologischen Probe korreliert ist.the presence of a higher level of the hTRT gene product in the sample compared to the control being correlated with the presence of telomerase positive cells in the biological sample. 38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die telomerase-positiven Zellen Krebszellen sind.38. The method of claim 37, wherein the telomerase positive cells are cancer cells. 39. Verfahren zur Diagnose eines mit Telomerase in Zusammenhang stehenden Zustands an einer Zellprobe oder Gewebeprobe eines Patienten, umfassend:39. A method of diagnosing a telomerase-related condition on a patient's cell sample or tissue sample, comprising: a) Bestimmung der Menge an hTRT-Genprodukt in der Probe,a) determining the amount of hTRT gene product in the sample, b) Vergleich der Menge an hTRT-Genprodukt in der Probe mit der Menge in einer gesunden Zelle des gleichen Typs, wobei eine sich von der Menge in der gesunden Zelle unterscheidende Menge an hTRT-Genprodukt in der Probe ein diagnostisches Anzeichen für einen mit Telomerase in Zusammenhang stehenden Zustand ist, wobei das Genprodukt ein Polynukleotid nach Anspruch 15 ist.b) Comparison of the amount of hTRT gene product in the sample with the amount in a healthy cell of the same type, wherein an amount of hTRT gene product in the sample which differs from the amount in the healthy cell is a diagnostic indicator of a telomerase in Related state, wherein the gene product is a polynucleotide according to claim 15. 40. Kit zum Nachweis eines hTRT-Gens oder -Genproduktes, wobei der Kit eines oder mehrere Reagenzien enthält, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus den Polynukleotiden nach Anspruch 15 oder 17, den Polypeptiden nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und dem Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 28 besteht.40. Kit for the detection of an hTRT gene or gene product, the kit containing one or more reagents selected from the group consisting of the polynucleotides according to claim 15 or 17, the polypeptides according to one of claims 1 to 7 and the Antibody or fragment thereof according to claim 28. 41. Verfahren zur Steigerung der Proliferationskapazität einer Vertebratenzelle ex vivo, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression von hTRT nach Anspruch 1 in der Zelle gesteigert wird.41. A method for increasing the proliferation capacity of a vertebrate cell ex vivo, characterized in that the expression of hTRT according to claim 1 is increased in the cell. 42. Verfahren zur Steigerung der Proliferationskapazität einer Vertebratenzellen ex vivo durch Einführung eines rekombinanten Polynukleotids in die Zelle, wobei das Polynukleotid eine, ein hTRT-Polypeptid nach Anspruch 1 codierende Sequenz umfasst und wobei die Sequenz mit einem Promotor funktionell verknüpft ist.42. A method for increasing the proliferation capacity of a vertebrate cell ex vivo by introducing a recombinant polynucleotide into the cell, the polynucleotide comprising a sequence encoding an hTRT polypeptide according to claim 1 and wherein the sequence is functionally linked to a promoter. 43. Verfahren nach Anspruch 42, wobei das hTRT-Polypeptid die Sequenz des hTRT-Polypeptids aufweist, das durch pGRN121 (ATCC-Zugangsnummer 209016) codiert wird.43. The method of claim 42, wherein the hTRT polypeptide has the sequence of the hTRT polypeptide encoded by pGRN121 (ATCC accession number 209016). 44. Arzneimittel, umfassend ein Molekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den hTRT-Polypeptiden nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dem Polynukleotid nach Anspruch 15, das ein hTRT-Polypeptid codiert, und dem Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 28.44. Medicament, comprising a molecule selected from the group consisting of the hTRT polypeptides according to one of claims 1 to 4, the polynucleotide according to claim 15, which encodes an hTRT polypeptide, and the antibody or fragment thereof according to claim 28. 45. Arzneimittel, umfassend einen Inhibitor der Telomerase-Aktivität, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei der Inhibitor ein hTRT-Polypeptid nach Anspruch 1, ein hTRT-Antikörper nach Anspruch 28 oder ein hTRT-Polynukleotid nach Anspruch 15 oder 17 ist.45. A pharmaceutical composition comprising an inhibitor of telomerase activity, optionally in combination with a pharmaceutically acceptable carrier, the inhibitor being an hTRT polypeptide according to claim 1, an hTRT antibody according to claim 28 or an hTRT polynucleotide according to claim 15 or 17 . 46. Die Verwendung eines Inhibitors von Telomerase-Aktivität zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Zustands, der mit einem erhöhten Spiegel an Telomerase-Aktivität innerhalb einer menschlichen Zelle assoziiert ist, wobei dieser Inhibitor:46. The use of an inhibitor of telomerase activity in the manufacture of a medicament for the treatment of a condition associated with an increased level of telomerase activity within a human cell, said inhibitor: a) ein Polypeptid nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz ist, die zu einer aufeinanderfolgenden Sequenz von mindestens sechs Aminosäuren in hTRT identisch ist;a) is a polypeptide according to claim 1 having an amino acid sequence which is identical to a successive sequence of at least six amino acids in hTRT; b) ein hTRT-bindender Antikörper ist;b) is an hTRT binding antibody; c) ein Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz ist, die zu einer aufeinanderfolgenden Sequenz von mindestens 12 Nukleotiden in einer hTRT-codierenden Sequenz identisch oder komplementär ist; oder d) eine Verbindung, die durch ein Screenen identifiziert wurde, das das Inkontaktbringen einer Testverbindung mit einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz umfasst, die mit einer aufeinanderfolgenden Sequenz von mindestens sechs Aminosäuren in hTRT identisch ist.c) is a polynucleotide with a nucleotide sequence which is identical or complementary to a successive sequence of at least 12 nucleotides in an hTRT coding sequence; or d) a compound identified by screening comprising contacting a test compound with a polypeptide having an amino acid sequence that is identical to a sequential sequence of at least six amino acids in hTRT. 47. Die Verwendung des Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4, des Polynukleotids nach Anspruch 15 oder 17, oder des Antikörpers oder Fragments nach Anspruch 28 zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung von Krebs oder von Altersbeschwerden.47. The use of the protein according to any one of claims 1 to 4, the polynucleotide according to claim 15 or 17, or the antibody or fragment according to claim 28 for the manufacture of a medicament for inhibiting cancer or aging. 48. Verwendung eines Polynukleotides, das mindestens 6 Basen lang und genügend komplementär zu SEQ. Id. Nr. 1 ist, um mit letzterer zu hybridisieren, als Primer in der Amplifikation der Polynukleotide nach Anspruch 15 oder 17.48. Use of a polynucleotide that is at least 6 bases long and sufficiently complementary to SEQ. No. 1, in order to hybridize with the latter, is a primer in the amplification of the polynucleotides according to claim 15 or 17. 49. Venwendung nach Anspruch 48, worin das Polynukleotid mindestens 15 Basen lang ist.49. Use according to claim 48, wherein the polynucleotide is at least 15 bases long. 151151 CH 689 672 A9CH 689 672 A9 50. Verwendung nach Anspruch 48, worin das Polynukleotid mindestens 25 Basen lang ist.50. Use according to claim 48, wherein the polynucleotide is at least 25 bases long. 51. Verwendung eines Polynukleotides, das mindestens 10 Basen lang ist und an SEQ. Id. Nr. 1 oder sein Komplement hybridisiert, als Sonde zum Nachweis des Polynukleotides nach Anspruch 15 oder 17.51. Use of a polynucleotide that is at least 10 bases long and attached to SEQ. Id. No. 1 or its complement hybridizes as a probe for the detection of the polynucleotide according to claim 15 or 17. 5 5 52. Verwendung nach Anspruch 51, worin das Polynukleotid mindestens 20 Basen lang ist.52. Use according to claim 51, wherein the polynucleotide is at least 20 bases long. 53. Verwendung nach Anspruch 51, worin das Polynukleotid markiert ist und die Markierung das nachweisbare Signal liefert.53. Use according to claim 51, wherein the polynucleotide is labeled and the label provides the detectable signal. 1010th 1515 2020th 2525th 3030th 3535 4040 4545 5050 1 !1 ! 6060 152152
CH02312/97A 1996-10-01 1997-10-01 Catalytic subunit of human telomerase. CH689672A9 (en)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US72464396A 1996-10-01 1996-10-01
US84441997A 1997-04-18 1997-04-18
US84601797A 1997-04-25 1997-04-25
US08/851,843 US6093809A (en) 1996-10-01 1997-05-06 Telomerase
US08/854,050 US6261836B1 (en) 1996-10-01 1997-05-09 Telomerase
US91131297A 1997-08-14 1997-08-14
US08/912,951 US6475789B1 (en) 1996-10-01 1997-08-14 Human telomerase catalytic subunit: diagnostic and therapeutic methods

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CH689672A5 CH689672A5 (en) 1999-08-13
CH689672A9 true CH689672A9 (en) 2000-02-29

Family

ID=27569901

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CH02312/97A CH689672A9 (en) 1996-10-01 1997-10-01 Catalytic subunit of human telomerase.

Country Status (1)

Country Link
CH (1) CH689672A9 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7402307B2 (en) 1998-03-31 2008-07-22 Geron Corporation Method for identifying and killing cancer cells

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002509716A (en) 1998-03-31 2002-04-02 ユニバーシティ テクノロジー コーポレイション Methods and compositions for raising an immune response to a telomerase antigen

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7402307B2 (en) 1998-03-31 2008-07-22 Geron Corporation Method for identifying and killing cancer cells

Also Published As

Publication number Publication date
CH689672A5 (en) 1999-08-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69723531T3 (en) Catalytic subunit of human telomerase
US6610839B1 (en) Promoter for telomerase reverse transcriptase
US7750121B2 (en) Antibody to telomerase reverse transcriptive
US8709995B2 (en) Method for eliciting an immune response to human telomerase reverse transcriptase
US7413864B2 (en) Treating cancer using a telomerase vaccine
US20050013825A1 (en) Vaccine containing the catalytic subunit of telomerase for treating cancer
CH689672A9 (en) Catalytic subunit of human telomerase.
AU763956B2 (en) Promoter for human telomerase reverse transcriptase
AU6551801A (en) Human telomerase catalytic subunit
NZ510761A (en) Human telomerase promoter and in vitro use is described

Legal Events

Date Code Title Description
PFA Name/firm changed

Owner name: GERON CORPORATION

Free format text: GERON CORPORATION#230 CONSTITUTION DRIVE#MENLO PARK, CA 94025 (US) $ UNIVERSITY TECHNOLOGY CORPORATION#3101 IRIS AVENUE, SUITE 250#BOULDER CO 80301 (US) -TRANSFER TO- GERON CORPORATION#230 CONSTITUTION DRIVE#MENLO PARK, CA 94025 (US) $ UNIVERSITY TECHNOLOGY CORPORATION#3101 IRIS AVENUE, SUITE 250#BOULDER CO 80301 (US)

PCAR Change of the address of the representative

Free format text: NEW ADDRESS: HOLBEINSTRASSE 36-38, 4051 BASEL (CH)

PL Patent ceased