Die vorliegende Erfindung betrifft neue Nucleinsäuren und Polypeptide, die die katalytische Untereinheit von Telomerase codieren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die katalytische Untereinheit von menschlicher Telomerase. Die Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen bereit, die die Medizin, Molekularbiologie, Chemie, Pharmakologie und medizinische, diagnostische und prognostische Verfahren betreffen.
Die folgende Diskussion soll den Leser in das Gebiet, auf das sich die vorliegende Erfindung bezieht, einführen. Das Zitieren verschiedener Literaturstellen in diesem Abschnitt soll nicht als ein Eingeständnis einer Vorwegnahme der Erfindung verstanden werden.
Es ist schon lange bekannt, dass die vollständige Replikation der Enden von eukaryotischen Chromosomen spezialisierte Zellbestandteile erfordert (Watson, Nature New. Biol. 239 (1972), 197 und Olovnikov, J. Theor. Biol. 41 (1973), 181). Die Replikation eines linearen DNA-Strangs durch übliche DNA-Polymerasen erfordert einen RNA-Primer und sie kann nur in 5 min -3 min -Richtung fortschreiten. Bei Entfernung der an das äussere 5 min -Ende chromosomaler eukaryotischer DNA-Stränge gebundene RNA wird eine Lücke eingeführt, was zu einer fortschreitenden Verkürzung der Tochterstränge bei jeder Replikationsrunde führt. Diese Verkürzung von Telomeren, die die an den Enden von Chromosomen physisch lokalisierten Protein/DNA-Strukturen darstellen, scheint der Grund für das Phänomen der zellulären Seneszenz oder Alterung (siehe z.B. Goldstein, Science 249 (1990), 1129; Martin et al., Lab.
Invest. 23 (1979), 86; Goldstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 64 (1969), 155 und Schneider und Mitsui, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73 (1976), 3584) normaler menschlicher somatischer Zellen in vitro und in vivo zu sein.
Die Länge und Integrität von Telomeren steht somit mit dem Eintritt einer Zelle in einen seneszenten Status (d.h. den Verlust der Proliferationsfähigkeit) in Zusammenhang. Da rüber hinaus dürfte die Fähigkeit einer Zelle die Telomerlänge zu bewahren (oder zu steigern) es der Zelle erlauben, der Seneszenz zu entgehen, d.h. unsterblich zu werden.
Die Struktur von Telomeren und Telomer-DNA wurde in zahlreichen Systemen untersucht (siehe z.B. Harley und Villeponteau, Curr. Opin. Genet. Dev. 5 (1995), 249). In den meisten Organismen besteht Telomer-DNA aus einem Tandemarray von sehr einfachen Sequenzen; in Menschen und anderen Vertebraten besteht Telomer-DNA aus hunderten bis tausenden von Tandemwiederholungseinheiten der Sequenz TTAGGG. Verfahren zur Bestimmung und Modulierung der Telomerlänge in Zellen sind in den PCT-Veröffentlichungen WO 93/23 572 und WO 96/41 016 beschrieben.
Die Wahrung von Telomeren ist eine Funktion einer Telomerspezifischen DNA-Polymerase, die als Telomerase bekannt ist. Telomerase ist ein Ribonucleoprotein (RNP), das einen Anteil seiner RNA-Einheit als eine Matrize für die Synthese der DNA-Telomer-Wiederholungseinheiten verwendet (Morin, Eur. J. Cancer 33 (1997), 750; Yu et al., Nature 344 (1990) 126; Singer und Gottschling, Science 266 (1994), 404; Autexier und Greider, Genes Develop. 8 (1994), 563; Gilley et al., Genes Develop. 9 (1995), 2214; Mc Eachern und Blackburn, Nature 367 (1995), 403; Blackburn, Ann. Rev. Biochem. 61 (1992), 113; Greider, Ann. Rev. Biochem. 65 (1996), 337). Die RNA-Bestandteile von menschlichen und anderen Telomerasen wurden cloniert und charakterisiert (siehe die PCT-Veröffentlichung WO 96/01835 und Feng et al., Science 269 (1995), 1236).
Die Charakterisierung der Proteinbestandteile von Telomerase war jedoch schwierig. Dies rührt teilweise daher, dass es sich als schwierig herausgestellt hat, Telomerase-RNP zu reinigen, das in Zellen, in denen es exprimiert wird, nur in äusserst geringen Konzentrationen vorhanden ist. Beispielsweise nahm man an, dass menschliche Zellen, von denen man weiss, dass sie hohe Spiegel an Telomerase-Aktivität exprimieren, lediglich etwa 100 Enzymmoleküle pro Zelle besitzen.
Übereinstimmend mit der Beziehung von Telomeren und Telomerase mit der Proliferationsfähigkeit einer Zelle (d.h. der Fähigkeit einer Zelle, sich unbegrenzt zu teilen), wurde Telomerase-Aktivität in unsterblichen Zellinien und in ausgesprochen unterschiedlichen Arten von Tumorgeweben nachgewiesen, sie wurde jedoch nicht in normalen somatischen Zellkulturen oder normalen Geweben in Nachbarschaft eines Tumors (siehe US-Patente mit den Nummern 5 629 154; 5 489, 508; 5 648 215 und 5 639 613; siehe auch Morin, Cell 59 (1989) 521; Shay und Bacchetti, Eur. J. Cancer 33 (1997), 78 7; Kim et al., Science 266 (1994), 2011; Counter et al., EMBO J. 11 (1992), 1921; Counter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 2900 und Counter et al., J. Virol. 68 (1994), 3410) nachgewiesen (d.h. war nicht vorhanden oder unter der Nachweisgrenze des Assays).
Darüber hinaus wurde über einen Zusammenhang zwischen dem Spiegel an Telomeraseaktivität in einem Tumor und des wahrscheinlichen klinischen Verlaufs der Krankheit des Patienten berichtet (z.B. US-Patent Nr. 5,639,613, a.a.O., und Langford et al., Hum. Pathol. 28 (1997), 416). Telomerase-Aktivität wurde auch in menschlichen Keimzellen, proliferierenden Stammzellen oder Nachkommen davon und aktivierten Lymphocyten nachgewiesen. In somatischen Stammzellen oder den Nachkommen davon und in aktivierten Lymphocyten ist die Telomerase-Aktivität typischerweise entweder sehr gering oder nur transient exprimiert (siehe Chiu et al., Stem Cells 14 (1996), 239, Bodnar et., Exp. Cell Res. 228 (1996), 58 und Taylor et al., J. Invest. Dermatology 106 (1996), 759).
Menschliche Telomerase ist ein ideales Ziel für die Diagnose und Behandlung menschlicher Krankheiten, die sich auf zelluläre Proliferation und Seneszenz, wie beispielsweise Krebs, beziehen. Verfahren zur Diagnose und Behandlung von Krebs und anderen mit Telomerase in Zusammenhang stehenden Krankheiten in Menschen sind in den US-Patenten Nr. 5 489 508, 5 639 613 und 5 645 986 beschrieben. Verfahren zur Vorhersage des Fortschreitens eines Tumors durch Beobachtung von Telomerase sind in dem US-Patent Nr. 5 639 613 beschrieben. Das Auffinden und die Charakterisierung der katalytischen Protein-Untereinheit menschlicher Telomerase würde zusätzliche nützliche Assays für Telomerase und für die Diagnose und Therapie von Krankheiten bereitstellen.
Darüber hinaus würde es die Clonierung und die Bestimmung der Primärsequenz der katalytischen Protein-Untereinheit erlauben, wirksamere Therapien für menschlichen Krebs und andere Krankheiten, die mit der Proliferationsfähigkeit und Seneszenz von Zellen zusammenhängen, bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine isolierte, im wesentlichen reine oder rekombinante Proteinpräparation eines Telomerase-reverse Transkriptase-Proteins oder einer Variante oder eines Fragments davon bereit. In einer Ausführungsform weist das Protein folgende Aminosäuresequenz auf:
EMI5.1
wobei X eine beliebige Aminosäure ist und eine tiefgestellte Zahl sich auf die Anzahl von aufeinanderfolgenden Resten bezieht, R1 Leucin ist oder Isoleucin, R2 Glutamin oder Arginin, R3 Phenylalanin oder Tyrosin und R4 Lysin oder Histidin. In einer Ausführungsform hat das Protein eine Sequenz von menschlicher TRT. In anderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung Peptide und Polypeptide, die mit einer Untersequenz solcher Proteine im wesentlich Sequenzidentität gemeinsam haben.
In einer verwandten Ausführungsform stellt die Erfindung eine isolierte, im wesentlichen reine oder rekombinante Nucleinsäure bereit, die ein Telomerase-reverse Transkriptase-Protein codiert. In einer Ausführungsform hat das Protein die folgende Aminosäuresequenz:
EMI5.2
In einer Ausführungsform hat die Nucleinsäure eine Sequenz menschlicher TRT. In weiteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung Oligonucleotide und Polynucleotide, die mit einer Untereinheit solcher Nucleinsäuren wesentliche Sequenzidentität gemeinsam haben.
Ein erfindungsgemässer Aspekt betrifft menschliche Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT). Somit stellt die Erfindung in einer Ausführungsform eine isolierte, im wesentlichen reine oder rekombinante Proteinpräration eines menschlichen Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-Proteins oder einer Variante oder eines Fragments davon bereit.
In einer Ausführungsform ist das Protein durch eine Aminosäure gekennzeichnet mit mindestens etwa 75% oder mindestens etwa 80% Sequenzidentität zu dem hTRT-Protein von SEQ. ID. Nr. 2 (Fig. 17) oder eine Variante oder eines Fragments davon. In einer verwandten Ausführungsform hat das hTRT-Protein die Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2. In einigen Ausführungsformen weist das Protein eine oder mehrere Telomerase-Aktivitäten auf, beispielsweise katalytische Aktivität. In einer Ausführungsform weist das hTRT-Proteinfragment mindestens 6 Aminosäurereste auf.
Die Erfindung stellt auch eine, ein hTRT-Protein und eine RNA umfassende Zusammensetzung bereit. Die RNA kann eine Telomerase-RNA sein, beispielsweise eine RNA menschlicher Telomerase. In einer Ausführungsform bilden das hTRT-Protein und die RNA menschlicher Telomerase einen Ribonucleoproteinkomplex mit einer Telomerase-Aktivität.
Ein erfindungsgemässer Aspekt betrifft die Bereitstellung isolierter menschlicher Telomerase, beispielsweise einer im wesentlichen reinen menschlichen Telomerase, die menschliche Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT) und menschliche Telomerase RNA (hTR) umfasst. In einer Ausführungsform hat die Telomerase eine Reinheit von mindestens etwa 95%. Die Telomerase kann aus einer Zelle isoliert sein.
Ein weiterer erfindungsgemässer Gesichtspunkt betrifft die Bereitstellung eines isolierten, synthetischen, im wesentlichen reinen oder rekombinanten Polynucleotids, das eine ein hTRT-Protein codierende Nucleinsäuresequenz umfasst. In einer Ausführungsform hat das Polynucleotid eine Nucleotidsequenz, die ein hTRT-Protein codiert, das eine in SEQ. ID. Nr. 2 angegegebene Aminosäuresequenz hat, oder eine Sequenz, die eine oder mehrere konservative Substitutionen in dieser Aminosäuresequenz umfasst. Ein verwandter Aspekt betrifft die Bereitstellung eines Polynucleotids, das unter stringenten Bedingungen mit einem Polynucleotid mit der Sequenz von SEQ. ID. Nr. 1 hybridisiert. In einer weiteren verwandten Ausführungsform hat die Nucleotidsequenz des Polynucleotids eine kleinste Summenwahrscheinlichkeit von weniger als etwa 0,5 im Vergleich zu einer in SEQ. ID.
Nr. 1 angegebenen Nucleotidsequenz mittels des BLAST-Algorithmus unter Verwendung von Voreinstellungsparametern.
Ein weiterer erfindungsgemässer Aspekt betrifft die Bereitstellung eines Polynucleotids mit einer Promotorsequenz, die mit der das hTRT-Protein codierenden Sequenz funktionell verknüpft ist. Der Promotor kann ein Promotor sein, der nicht dem natürlich vorkommenden hTRT-Promotor entspricht. Ein verwandter erfindungsgemässer Gesichtspunkt betrifft die Bereitstellung eines Expressionsvektors, der das hTRT-Polynucleotid umfasst.
Die Erfindung stellt auch ein isoliertes, synthetisches, im wesentlichen reines oder rekombinantes Polynucleotid bereit, das eine Länge von mindestens 10 Nucleotiden aufweist und eine aufeinanderfolgende Sequenz von mindestens 10 Nucleotiden umfasst, die zu einer aufeinanderfolgenden Sequenz in einem natürlich vorkommenden hTRT-Gen oder hTRT-mRNA identisch oder genau komplementär ist. In einigen Ausführungsformen ist das Polynucleotid eine RNA, eine DNA, oder es enthält ein oder mehrere nicht natürlich vorkommende, synthetische Nucleotide. In einer Ausführungsform ist das Polynucleotid identisch oder genau komplementär zu der aufeinanderfolgenden Sequenz von mindestens 10 aufeinanderfolgenden Nucleotiden in einem natürlich-vorkommenden hTRT-Gen oder einer hTRT-mRNA. Beispielsweise kann das Polynucleotid ein "antisense"-Polynucleotid sein.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das antisense-Polynucleotid mindestens etwa 20 Nucleotide.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung rekombinanter Telomerase durch Inkontaktbringen eines rekombinanten hTRT-Proteins mit einem Telomerase-RNA-Bestandteil unter solchen Bedingungen bereit, dass das rekombinante Protein und der Telomerase-RNA-Bestandteil zur Bildung eines Telomerase-Enzyms assoziieren, das die Hinzufügung von Nucleotiden zu einem Telomerase-Substrat katalysieren kann. In einer Ausführungsform hat das hTRT-Protein die Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2. Das hTRT-Protein kann in einem in vitro-Expressionssystem hergestellt und mit einer Telomerase-RNA vermischt werden; in einer anderen Ausführungsform wird die Telomerase-RNA in dem in vitro-Expressionssystem coexprimiert. In einer Ausführungsform ist die Telomerase-RNA menschliche Telomerase-RNA.
In einer alternativen Ausführungsform geschieht das Inkontaktbringen in einer Zelle, beispielsweise einer menschlichen Zelle. In einer Ausführungsform weist die Zelle keine Telomeraseaktivität vor dem Inkontaktbringen von hTRT und der RNA eines hTRT-Polynucleotids (oder der Einführung z.B. durch Transfektion) auf. In einer Ausführungsform wird die Telomerase-RNA natürlicherweise von der Zelle exprimiert.
Die Erfindung stellt auch eine Zelle bereit, beispielsweise eine menschliche Zelle, Mauszelle oder Hefezelle, die die erfindungsgemässen rekombinanten Polynucleotide enthält, beispielsweise ein Polynucleotid mit einer mit einem Promotor funktionell verknüpften, ein hTRT-Protein codierenden Sequenz. Hinsichtlich bestimmter Aspekte ist die Zelle eine Vertebratenzelle, beispielsweise eine Zelle eines Säugers, z.B. eines Menschen, und weist eine erhöhte Proliferationsfähigkeit relativ zur Zelle auf, die ansonsten identisch ist, jedoch nicht das rekombinante Polynucleotid umfasst, oder sie weist einen erhöhten Telomerase-Aktivitätsspiegel auf, relativ zu einer Zelle, die ansonsten identisch ist, jedoch nicht rekombinante Polynucleotide umfasst. In einigen Ausführungsformen ist die Zelle unsterblich.
Verwandte erfindungsgemässe Ausführungsformen betreffen die Bereitstellung von Organismen und Zellen, die ein Polynucleotid umfassen, das ein menschliches Telomerase-reverse Transkriptase-Polypeptid ist. Dazu zählen ein transgener nicht-menschlicher Organismus, wie beispielsweise Hefe, eine Pflanze oder Bakterium oder ein Tier, beispielsweise eine Maus. Die Erfindung stellt auch transgene Tiere und Zellen bereit, bei denen ein hTRT-Gen deletiert wurde ("knockedout") oder so mutiert wurde, dass das Gen ein natürlich vorkommendes hTRT-Genprodukt nicht exprimiert.
Somit hat in alternativen Ausführungsformen das transgene Tier ein mutiertes Telomerasegen, ist ein hinsichtlich einer Telomerase-Aktivität defizientes Tier, ist ein Tier, dessen TRT-Defizienz das Ergebnis eines mutierten Gens ist, das eine TRT mit einem herabgesetzten Spiegel an Telomerase-Aktivität im Vergleich zu einem Wildtyp-TRT besitzt oder ein Tier mit einem mutierten TRT-Gen mit einer oder mehreren Mutationen, wozu "missense" Mutationen, "nonsense"-Mutationen, Insertionen und Deletionen zählen.
Die Erfindung stellt auch einen isolierten oder rekombinanten Antikörper oder ein Fragment davon bereit, die an hTRT-Protein spezifisch binden. In einer Ausführungsform bindet der Antikörper mit einer Affinität von mindestens etwa 10<8>M<-><1>. Der Antikörper kann eine monoclonale oder polyclonale Zusammensetzung, beispielsweise ein polyclonales Antiserum, sein. Ein verwandter erfindungsgemässer Aspekt betrifft die Bereitstellung einer Zelle, die den Antikörper sezernieren kann, beispielsweise ein Hybridom.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Nachweis zur Verfügung, ob eine Verbindung oder eine Behandlung ein Modulator einer reversen Transkriptase-Aktivität von Telomerase oder der hTRT-Expression ist durch den Nachweis oder die Überwachung einer Veränderung in der Aktivität oder Expression in einer Zelle, einem Tier oder einer Zusammensetzung, die ein hTRT-Protein oder entsprechendes Polynucleotid umfasst, nach Verabreichung der Verbindung oder der Behandlung. In einer Ausführungsform beinhaltet das Verfahren die folgenden Schritte: Bereitstellung einer TRT-Zusammensetzung, Inkontaktbringen der TRT mit der Testverbindung und Messung der Aktivität der TRT, wobei eine Veränderung in der TRT-Aktivität in Gegenwart der Testverbindung ein Indikator dafür ist, ob die Testverbindung TRT-Aktivität moduliert.
In bestimmten Ausführungsformen ist die Zusammensetzung eine Zelle, ein Organismus, ein transgener Organismus oder ein in vitro-System, beispielsweise ein Expressionssystem, das ein ein hTRT-Polypeptid codierendes rekombinantes Polynucleotid enthält. Somit kann die menschliche Telomerase-reverse Transkriptase dieses Verfahrens ein Produkt einer in vitro-Expression sein.
In verschiedenen Ausführungsformen kann der Nachweis einer Telomerase-Aktivität oder -Expression dadurch erfolgen, dass eine Veränderung in der Häufigkeit eines hTRT-Genprodukts dadurch nachgewiesen wird, dass der Einbau einer Nucleotidmarkierung in ein Substrat für Telomerase überwacht wird, die Hybridisierung einer Sonde mit einem verlängerten Telomerase-Substrat, die Amplifikation eines verlängerten Telomerase-Substrats, die Telomerlänge einer der Testverbindung ausgesetzten Zelle und der Verlust der Fähigkeit der Telomerase an ein Chromosom zu binden oder durch die Messung der Anreicherung oder des Verlusts einer Telomerstruktur.
Ein erfindungsgemässer Aspekt betrifft die Bereitstellung eines Verfahrens zum Nachweis eines menschlichen Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-Genprodukts in einer biologischen Probe durch Inkontaktbringen der biologischen Probe mit einer Sonde, die das Genprodukt spezifisch bindet, wobei die Sonde und das Genprodukt einen Komplex bilden, und durch den Nachweis des Komplexes, wobei das Vorhandensein des Komplexes mit dem Vorhandensein des hTRT-Genprodukts in der biologischen Probe korreliert. Das Genprodukt kann RNA, DNA oder ein Polypeptid sein. Zu den Beispielen für Sonden, die zum Nachweis verwendet werden können, zählen, jedoch ohne Beschränkung darauf, Nucleinsäuren und Antikörper.
In einer Ausführungsform ist das Genprodukt eine Nucleinsäure, die durch Amplifikation des Gens und Nachweis des Amplifikationsprodukts nachgewiesen wird, wobei das Vorhandensein des Komplexes oder des Amplifikationsprodukts mit dem Vorhandensein des hTRT-Genprodukts in der biologischen Probe korreliert.
In einer Ausführungsform ist die biologische Probe von einem Patienten beispielsweise einem menschlichen Patienten. In einer weiteren Ausführungsform enthält die biologische Probe mindestens eine Zelle aus einer in vitro-Zellkultur, beispielsweise einer Kultur menschlicher Zellen.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins mindestens einer unsterblichen oder Telomerase-positiven menschlichen Zelle in einer menschlichen Zellen umfassenden biologischen Probe bereit, wobei die menschliche Zellen umfassende biologische Probe erhalten wird und das Vorhandensein einer Zelle mit einem hohen Spiegel eines hTRT-Genprodukts in der Probe nachgewiesen wird, wobei das Vorhandensein einer Zelle mit einem hohen Spiegel an dem hTRT-Genprodukt mit dem Vorhandensein von unsterblichen oder Telomerase-positiven Zellen in der biologischen Probe korreliert.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Diagnose eines mit Telomerase in Zusammenhang stehenden Zustands in einem Patienten durch Gewinnung einer Zelle oder einer Gewebeprobe von dem Patienten, Bestimmung der Menge eines menschlichen Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-Genprodukts in der Zelle oder dem Gewebe und dem Vergleich der Menge des hTRT-Genprodukts in der Zelle oder dem Gewebe mit der Menge in einer gesunden Zelle oder einem gesunden Gewebe des gleichen Typs, wobei eine unterschiedliche Menge des hTRT-Genprodukts in der Probe von dem Patienten im Vergleich zu der gesunden Zelle oder im gesunden Gewebe ein diagnostisches Anzeichen für einen mit Telomerase in Zusammenhang stehenden Zustand ist. In einer Ausführungsform ist der mit Telomerase in Zusammenhang stehende Zustand Krebs.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit zur Diagnose von Krebs in einem Patienten durch Gewinnung einer Probe von dem Patienten und den Nachweis eines menschlichen Telomerase-reverse-Transkriptase-(hTRT)-Genprodukts in der Probe von dem Patienten, wobei der Nachweis des hTRT-Genprodukts in der Probe mit einer Diagnose von Krebs korreliert.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit zur Diagnose von Krebs in einem Patienten durch Gewinnung einer Patientenprobe, Bestimmung der Menge des menschlichen Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-Genprodukts in der Patientenprobe und den Vergleich der Menge des hTRT-Genprodukts mit einem normalen Wert oder Kontrollwert, wobei eine Menge des hTRT-Genprodukts in dem Patienten, die in dem Vergleich zu dem Normalwert oder Kontrollwert grösser ist, ein diagnostisches Anzeichen für Krebs ist.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Diagnose von Krebs in einem Patienten durch Gewinnung einer Patientenprobe, die mindestens eine Zelle enthält, Bestimmung der Menge des hTRT-Genprodukts, in einer Zelle in der Probe und den vergleich der Menge des hTRT-Genprodukts in der Zelle mit einem für die Zellen normalen Wert, wobei eine Menge des hTRT-Genprodukts die über dem Normalwert liegt, ein diagnostisches Anzeichen für Krebs ist. In einer Ausführungsform wird davon ausgegangen, dass die Probe mindestens eine maligne Zelle enthält.
Die Erfindung stellt ausserdem ein Verfahren zur Bereitstellung einer Prognose für einen Krebspatienten bereit, wobei die Menge des hTRT-Genprodukts in einer von dem Patienten erhaltenen Krebszelle bestimmt wird und die Menge von hTRT in der Krebszelle mit einem prognostischen Wert für hTRT pro Krebszelle, konsistent mit einer Prognose hinsichtlich Krebs ist, wobei eine hTRT-Menge pro Zelle in der Probe, die bei dem prognostischen Wert liegt, die spezielle Prognose bereitstellt.
Die Erfindung stellt ausserdem ein Verfahren bereit zur Überwachung der Wirksamkeit einer Antikrebsbehandlung, die Proliferationskapazität von Krebszellen in einem Patienten herabzusetzen, dadurch, dass zuerst eine Messung der Menge eines hTRT-Genprodukts in mindestens einer Krebszelle von dem Patienten durchgeführt wird, eine zweite Messung hinsichtlich des Spiegels an hTRT-Genprodukts in mindestens einer Krebszelle des Patienten durchgeführt wird, wobei die Antikrebsbehandlung dem Patienten vor der zweiten Messung oder zur gleichen Zeit verabreicht wird und durch den Vergleich der ersten mit der zweiten Messung, wobei ein niedriger Spiegel an hTRT-Genprodukt in der zweiten Messung mit der Wirksamkeit einer Antikrebsbehandlung korreliert, die Proliferationskapazität von Krebszellen in dem Patienten herabzusetzen.
Die Erfindung stellt auch Kits für den Nachweis eines hTRT-Gens oder Genprodukts zur Verfügung. In einer Ausführungsform enthält der Kit einen Behälter, der ein Molekül umfasst, ausgewählt aus einer hTRT-Nucleinsäure oder einer Untersequenz davon, ein hTRT-Polypeptid oder eine Untersequenz davon und einen anti-hTRT-Antikörper. Die Erfindung stellt auch Behandlungsverfahren für menschliche Krankheiten zur Verfügung. Ein erfindungsgemässer Aspekt betrifft die Bereitstellung eines Verfahrens zur Steigerung der Proliferationskapazität einer Vertebratenzelle, beispielsweise einer Säugerzelle, durch Einführung eines rekombinanten Polynucleotids in die Zelle, wobei das Polynucleotid eine Sequenz umfasst, die ein menschliches Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-Polypeptid umfasst. In einer Ausführungsform hat das hTRT-Polypeptid eine Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2 (Fig. 17).
In einer Ausführungsform ist die Sequenz mit einem Promotor funktionell verknüpft. In einer Ausführungsform weist die hTRT katalytische Aktivität von Telomerase auf. In einer Ausführungsform ist die Zelle menschlich, beispielsweise eine Zelle in einem menschlichen Patienten.
In einer alternativen Ausführungsform wird die Zelle in vitro kultiviert. In einer verwandten Ausführungsform wird die Zelle in einen menschlichen Patienten eingeführt.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit zur Behandlung einer menschlichen Krankheit durch Einführung eines rekombinanten hTRT-Polynucleotids in mindestens eine Zelle in einem Patienten. In einer Ausführungsform wird ein Vektor für Gentherapie verwendet. In einer verwandten Ausführungsform besteht das Verfahren ferner in der Einführung eines Polynucleotids in die Zelle, das eine menschliche Telomerase-RNA codierende Sequenz umfasst, beispielsweise ein hTRT-Polynucleotid, das mit einem Promotor funktionell verknüpft ist.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Steigerung der Proliferationsfähigkeit einer Vertebratenzelle, wobei das Verfahren die Einführung einer wirksamen Menge eines menschlichen Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-Polypeptids in die Zelle umfasst. In einer Ausführungsform hat das hTRT-Polypeptid katalytische Aktivität von Telomerase. Die Erfindung stellt ferner Zellen und Nachkommen der Zellen mit erhöhter Proliferationskapazität bereit.
Die Erfindung stellt auch Arzneimittel bereit, die einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten und ein Molekül ausgewählt aus: einem hTRT-Polypeptid, einem ein hTRT-Polypeptid codierenden Polynucleotid und einer hTRT-Nucleinsäure oder einer Untersequenz davon.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Behandlung eines Zustands, der mit einem erhöhten Spiegel an Telomerase-Aktivität innerhalb einer Zelle assoziiert ist, wobei das Verfahren die Einführung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Inhibitors von Telomerase-Aktivität in die Zelle umfasst, wobei der Inhibitor ein hTRT-Polypeptid oder ein hTRT-Polynucleotid ist. In einer Ausführungsform ist der In hibitor ein Polypeptid, das die Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2 oder 4 oder eine Untersequenz davon umfasst. In weiteren Ausführungsformen hemmt das Polypeptid eine TRT-Aktivität, beispielsweise die Bindung endogener TRT an Telomerase-RNA.
Die Erfindung stellt auch ein Vakzin bereit, das ein hTRT-Polypeptid und ein Adjuvans umfasst.
Beschreibung der Figuren
Fig. 1
zeigt hochkonservierte Reste in TRT-Motiven von Menschen, S. pombe (tez1), S. cerevisiae (EST2) und Euplotes aediculatus (p123). Identische Aminosäuren sind mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet, während ähnliche Aminosäurereste durch einen Punkt ( &cirf& ) gekennzeichnet sind. Motiv "0" in der Figur wird auch Motif T genannt; Motiv "3" wird auch Motiv A genannt.
Fig. 2
zeigt die Lage Telomerase-spezifischer Motive und RT-spezifischer Sequenzmotive von Telomerase-Proteinen und anderen reversen Transkriptasen. Die Lage des Telomerase-spezifischen Motivs T und der konservierten RT-Motive 1, 2 und A-E sind durch gefüllte Kästchen gekennzeichnet. Das mit einem offenen Rechteck gekennzeichnete HIV-1 RT kennzeichnet den in Fig. 3 gezeigten Anteil dieses Proteins.
Fig. 3
zeigt die Kristallstruktur der p66-Untereinheit von HIV-1-reverse Transkriptase ("Brookhaven code" 1HNV). Die Ansicht ist, vom rechten Handrücken aus gesehen, dargestellt, damit alle Motive erkennbar sind.
Fig. 4
zeigt mehrere Sequenzausrichtungen von Telomerase-RTs (Sp_Trt1p, S. pombe TRT (hier auch mit "tez1p" bezeichnet); bTRT, menschliche TRT; Ea_p123, Euplotes p123; Sc_Est2p, S. cerevisiae Est2P) und Mitglieder anderer RT-Familien (S_a1, Cytochrom-oxidase Gruppe II Intron I-codiertes Protein von S. cerevisiae-Mitochondrien, Dm_TART, reverse Transkriptase von Drosophila melanogaster TART-nicht-LTR-Retrotransposon-Element); HIV-1, reverse Transkriptase von menschlichem HIV). TRT con und RT con repräsentieren "Consensus"-Sequenzen für Telomerase-RTs und nicht-Telomerase-RTs. Aminosäuren sind gekennzeichnet mit einem h, hydrophob; p, polar; c, geladen. Dreiecke bezeichnen Reste, die innerhalb der Telomerase-Proteine konserviert sind, in anderen RTs jedoch unterschiedlich sind. Die dicke Linie unter Motiv E bezeichnet den "Primergriff" ("primer grip")-Bereich.
Fig. 5
zeigt die Expression von hTRT-RNA in Telomerase-negativen sterblichen Zellstämmen und Telomerase-positiven unsterblichen Zellinien, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Fig. 6
zeigt einen möglichen phylogenetischen Stammbaum von Telomerasen und Retroelementen mit RNA-abhängigen RNA-Polymerasen als Wurzel.
Fig. 7
zeigt eine Restriktionskarte des lambda-Clons G. PHI 5.
Fig. 8
zeigt eine Karte von Chromosom Sp mit der Lage des STS-Markers D5S678 (der in der Nähe des hTRT-Gens lokalisiert ist).
Fig. 9
zeigt die Konstruktion eines hTRT-Promotor-Reporterplasmids.
Fig. 10
(zwei Seiten) zeigt die in vitro-Coexpression von hTRT und hTR zur Herstellung katalytisch aktiver menschlicher Telomerase.
Fig. 11
(zwei Seiten) zeigt die Ausrichtung von Sequenzen von vier TRT-Proteinen und interessierende Motive sind gekennzeichnet. TRT con bezeichnet eine TRT-"Consensus"-Sequenz. RT con bezeichnet "Consensus"-Reste bei anderen reversen Transkriptasen. "Consensus"-Reste mit Grossbuchstaben kennzeichnen absolute Konservierung in TRT-Proteinen.
Fig. 12
zeigt eine Topoisomerase II-Spaltstelle und NF kappa B-Bindungsstellen-Motive in einem hTRT-Intron, wobei die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 7 (Fig. 12) entspricht.
Fig. 13
(zwei Seiten) zeigt die Sequenz der DNA, die die Euplotes 123 kD-Telomerase-Proteinuntereinheit codiert (Euplotes TRT-Protein).
Fig. 14
zeigt die Aminosäuresequenz der Euplotes 123 kD-Telomerase-Proteinunterheit (Euplotes TRT-Protein).
Fig. 15
(vierzehn Seiten) zeigt die DNA- und Aminosäuresequenzen der katalytischen Untereinheit der S. pombe-Telomerase (S. pombe-TRT).
Fig. 16
(zwei Seiten) zeigt die hTRT-cDNA-Sequenz, wobei die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 1 entspricht.
Fig. 17
zeigt das hTRT-Protein, codiert durch die cDNA von Fig. 16. Die gezeigte Proteinsequenz entspricht SEQ. ID. Nr. 2.
Fig. 18
zeigt die Sequenz des Clons 712562, wobei die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 3 entspricht.
Fig. 19
zeigt ein Protein mit 259 Resten, das von dem Clon 712562 codiert wird, wobei die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 10 entspricht.
Fig. 20
(sieben Seiten) zeigt die Sequenz einer Nucleinsäure mit einem offenen Leserahmen, die eine DELTA 182-Polypeptidvariante codiert, wobei die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 4 entspricht. Diese Figur zeigt auch die Aminosäuresequenz dieser DELTA 182-Polypeptidvariante, wobei die gezeigte Aminosäuresequenz SEQ. ID. Nr. 5 entspricht.
Fig. 21
(sechs Seiten) zeigt die Sequenz eines genomischen hTRT-Clons, wobei die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 6 entspricht. "Consensus"-Motive und Elemente sind angegeben, dazu gehören auch Sequenzen, die charakteristisch sind für eine Topoisomerase II-Spaltstelle, NF kappa B-Bindungsstellen, eine Alu-Sequenz und andere Sequenzelemente.
Fig. 22
zeigt die Auswirkung einer Mutation des TRT-Gens in Hefe, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Fig. 23
zeigt die Sequenz von EST AA281296, die SEQ. ID. Nr. 8 entspricht.
Fig. 24
zeigt die Sequenz der 182 Basenpaare, die in Clon 712562 deletiert sind, wobei die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 9 entspricht.
Fig. 25
zeigt die Ergebnisse eines Assays auf Telomerase-Aktivität von BJ-Zellen, die mit einem ein hTRT-Protein codierenden Expressionsvektor (pGRN133) oder einem Kontrollplasmid (pBBS212) transfiziert wurden, wie in Beispiel 13 beschrieben.
Fig. 26
ist ein schematisches Diagramm hinsichtlich der Affinitätsreinigung von Telomerase, das die Bindungsschritte und Elutionsschritte durch Verdrängung zeigt.
Fig. 27
ist ein Photo eines Northern-Blots von Telomerase-Präparationen, die während des in Beispiel 1 beschriebenen Reinigungsprotokolls erhalten wurden. Spur 1 enthielt 1,5 fMol Telomerase-RNA, Spur 2 4,6 fMol, Spur 3 14 fMol, Spur 4 41 fMol, Spur 5 nucleären Extrakt (42 fMol Telomerase), Spur 6 Affi-Gel-Heparin-gereinigte Telomerase (47 fMol Telomerase), Spur 7 affinitätsgereinigte Telomerase (68 fMol) und Spur 8 über Glyceringradienten gereinigte Telomerase (35 fMol).
Fig. 28
zeigt Telomerase-Aktivitäten während eines Reinigungsprotokolls.
Fig. 29
ist ein Photo eines SDS-PAGE-Gels, das die Anwesenheit eines Polypeptids mit etwa 123 kD und einer Dublette mit etwa 43 kD von Euplotes aediculatus zeigt.
Fig. 30
ist eine Graphik, die den Sedimentationskoeffizienten von Euplotes aediculatus-Telomerase zeigt.
Fig. 31
ist ein Photo eines Polyacrylamid/Harnstoff-Gels mit 36% Formamid, das die Substratverwertung von Euplotes-Telomerase zeigt.
Fig. 32
zeigt die vermuteten Ausrichtungen von Telomerase-RNA-Matrize und Haarnadelstruktur-Primern mit Telomerase-RNA.
Fig. 33
ist ein Photo der Spuren 25 bis 30 des in Fig. 31 gezeigten Gels mit geringerer Belichtung.
Fig. 34
zeigt die DNA-Sequenz des Gens, das die 43 kD-Telomerase-Proteinuntereinheit von Euplotes codiert.
Fig. 35
(vier Seiten) zeigt die DNA-Sequenz sowie die Aminosäuresequenzen aller drei offenen Leserahmen der 43 kD Telomerase-Proteinuntereinheit von Euplotes.
Fig. 36
zeigt einen Sequenzvergleich zwischen der 123 kD-Telomerase-Proteinuntereinheit von Euplotes (obere Sequenz) und der 80 kD-Polypeptid-Untereinheit von T. thermophila (untere Sequenz).
Fig. 37
zeigt einen Sequenzvergleich zwischen der 123 kD-Telomerase-Proteinunterheit von E. aediculatus (obere Sequenz) und dem 95 kD-Telomerase-Polypeptid von T. thermophila (untere Sequenz).
Fig. 38
zeigt die "best-fit"-Ausrichtung zwischen einem Teil der "La-Domäne" der 43 kD-Telomerase-Proteinuntereinheit von E. aediculatus (obere Sequenz) und einem Teil der 95 kD-Polypeptiduntereinheit von T. thermophila (untere Sequenz).
Fig. 39
zeigt die "best-fit"-Ausrichtung zwischen einem Teil. der "La-Domäne" der 43 kD-Telomerase-Proteinuntereinheit von E. aediculatus (obere Sequenz) und einem Teil der 80 kD-Polypeptid-Untereinheit von T. thermophila (untere Sequenz).
Fig. 40
zeigt die Ausrichtung und die Motive der Polymerase-Domäne der 123 kD-Telomerase-Proteinuntereinheit von E. aediculatus und der Polymerase-Domänen von verschiedenen reversen Transkriptasen, wozu auch ein Cytochrom-Oxidase-Gruppe II Intron 1-codiertes Protein von S. cerevisiae-Mitochondrien (al S.c. (Gruppe II)) zählen, Dong (LINE) und Hefe ESTp (L8543.12).
Fig. 41
zeigt die Ausrichtung einer Domäne der 43 kD Telamerase-Proteinuntereinheit mit verschiedenen LaProteinen.
Fig. 42
zeigt die Nucleotidsequenz, die T. thermophila 80 kD-Protein-Untereinheit codiert.
Fig. 43
zeigt die Aminosäuresequenz der T. thermophila 80 kD-Protein-Untereinheit.
Fig. 44
zeigt die Nucleotidsequenz, die die T. thermophila 95 kD-Protein-Untereinheit codiert.
Fig. 45
zeigt die Aminosäuresequenz der T. thermophila 95 kD Protein-Untereinheit.
Fig. 46
zeigt die Aminosäuresequenz von L8543.12 ("Est2p").
Fig. 47
zeigt die Ausrichtung der durch das Oxytricha PCR-Produkt codierten Aminosäuresequenz mit der Euplotes p123-Sequenz.
Fig. 48
zeigt die DNA-Sequenz von Est2.
Fig. 49
zeigt die partielle Aminogäuresequenz eines cDNA-Clons, der Peptidmotive menschlicher Telomerase codiert.
Fig. 50
zeigt die partielle DNA-Sequenz eines cDNA-Clons, der Peptidmotive menschlicher Telomerase codiert.
Fig. 51
zeigt die Aminosäuresequenz von tez1, das auch als S. pombe trt bezeichnet wird.
Fig. 52
(zwei Seiten) zeigt die DNA-Sequenz von tez1. Intron-Bereiche und andere nicht codierende Bereiche sind in Kleinbuchstaben gezeigt und Exons (d.h. codierende Bereich) sind mit Grossbuchstaben angegeben.
Fig. 53
zeigt die Ausrichtung- von EST2p, Euplotes und Tetrahymena-Sequenzen, sowie "Consensus"-Sequenzen.
Fig. 54
zeigt die Sequenzen von Peptiden, die für die Herstellung von anti-hTRT-Antikörpern nützlich sind.
Fig. 55
ist eine schematische Zusammenfassung der tez1<+>-Sequenzierungsexperimente.
Fig. 56
zeigt zwei degenerierte Primer, die in der PCR zur Identifizierung des S. pombe-Homologen zu den E. aediculatus p123-Sequenzen verwendet wurden.
Fig. 57
zeigt die vier Hauptbanden, die in der PCR mit den degenerierten Primern zur Identifizierung des S. pombe-Homologen, zu den E. aediculatus p123-Sequenzen verwendet wurden.
Fig. 58
zeigt die Ausrichtung des M2-PCR-Produkts mit E. aediculatus p123, S. cerevisiae und Oxytricha-Telomerase-Proteinsequenzen.
Fig. 59
ist ein Schema, das die 3 min -RT-PCR-Strategie für die Identifizierung des S. pombe-Homologen zu dem E. aediculatus p123 zeigt.
Fig. 60
zeigt Merkmale der Banken, die verwendet wurden, um nach S. pombe Telomerase-Proteinsequenz zu screenen und die Ergebnisse des Screenings.
Fig. 61
zeigt die positiven Ergebnisse, die mit den HindIII-gespaltenen positiven genomischen Clonen erhalten wurden, die die S. pombe-Telomerase-Sequenz enthalten.
Fig. 62
ist ein Schema, das die 5 min -RT-PCR-Strategie zeigt, die zum Erhalt des S. pombe TRT-Clons mit vollständiger Länge verwendet wurde.
Fig. 63
zeigt die Ausrichtung von RT-Domänen von katalytischen Untereinheiten von Telomerase für S. pombe (S.p.), S. cerevisiae (S.c.) und E. aediculatus (E.a.).
Fig. 64
zeigt die Ausrichtung von Sequenzen von Euplotes ("Ea_P123"), S. cerevisiae ("Sc_Est2P") und S. pombe ("Sp_Tez1p"). In Teil A kennzeichnen die schattierten Bereiche Reste, die beide Sequenzen gemeinsam haben. In Teil B bezeichnen die schattierten Bereiche Reste, die alle drei Sequenzen gemeinsam haben.
Fig. 65
zeigt die für die Telomerase-Gene in S. pombe verwendete Disruptionsstrategie.
Fig. 66
zeigt die experimentellen Ergebnisse, die die Disruption von tez1 bestätigen.
Fig. 67
zeigt die progressive Verkürzung von Telomeren in S. pombe aufgrund der Disruption von tez1.
Fig. 68
(vier Seiten) zeigt die DNA-Sequenz und Aminosäuresequenz des ORF, der ein Telomerase-Protein von etwa 63 kD codiert oder ein Fragment davon, codiert von der EcoRI-NotI-Insertion des Genbank-Clons #AA281296.
Fig. 69
zeigt eine Ausrichtung von reverser Transkriptase-Motiven aus verschiedenen Quellen.
Fig. 70
ist eine Restriktionskarte und funktionelle Karte von Plasmid pGRN121.
Fig. 71
(zwei Seiten) zeigt die Ergebnisse von vorläufigen Analysen der Nucleinsäure-Sequenzierung einer hTRTcDNA-Sequenz.
Fig. 72
(10 Seiten) zeigt die vorläufige Nucleinsäure von hTRT und die abgeleiteten ORF-Sequenzen in den drei Leserahmen.
Fig. 73
ist eine Restriktionskarte und funktionelle Karte von Plasmid pGRN121.
Fig. 74
(8 Seiten) zeigt die verbesserte Nucleinsäuresequenz und abgeleitete ORF-Sequenzen von hTRT.
Fig. 75
zeigt eine Restriktionskarte des lambda-Clons 25-1.1.
Fig. 76
zeigt eine Karte der Restriktions-Stellen und Bereiche von DNA pGRN144.4.
I. Einleitung
Telomerase ist ein Ribonucleoproteinkomplex (RNP), der einen RNA-Bestandteil und einen katalytischen Protein-Bestandteil umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft die Clonierung und Charakterisierung des katalytischen Proteinbestandteils der Telomerase, der nachstehend "TRT" (Telomerase-reverse-Transkriptase) bezeichnet wird. Dieses Protein wird deshalb als TRT bezeichnet, weil es als eine RNA-abhängige DNA-Polymerase arbeitet, wobei der RNA-Bestandteil der Telomerase (nachstehend mit "TR" bezeichnet) zur Steuerung der Synthese der Telomer-DNA-Wiederholungssequenzen verwendet wird. Darüber hinaus ist TRT mit anderen reversen Transkriptasen evolutionär verwandt (siehe Beispiel 12).
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Clonierung und Charakterisierung des katalytischen Proteinbestandteils der menschlichen Telomerase, die nachstehend als "hTRT" bezeichnet wird. Menschliche TRT ist deshalb von ausserordentlichem Interesse und Wert, da, wie nachstehend angemerkt, Telomerase-Aktivität in Menschen (und weiteren Säuger-Zellen) mit der Eigenschaft der Zellproliferation, Zellimmortalität und der Entwicklung eines neoplastischen Phänotyps korreliert. Beispielsweise ist in unsterblichen menschlichen Zellen (z.B. maligne Tumorzellen und unsterbliche Zellinien) die Telomerase-Aktivität und, wie in Beispiel 2 nachstehend gezeigt, die Menge an Genprodukten menschlicher TRT gegenüber sterblichen Zellen (z.B. den meisten menschlichen somatischen Zellen) erhöht.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren und Zusammensetzungen bereit, die zur Diagnose, Prognose und zur Behandlung von menschlichen Erkrankungen und Krankheitszuständen von Wert ist, wie dies nachstehend ausführlich beschrieben wird. Ausserdem werden Verfahren und Reagenzien zur Verfügung gestellt, die zur Immortalisierung von Zellen (in vivo und ex vivo) von Nutzen sind, wobei transgene Tiere mit erwünschten Merkmalen hergestellt werden, sowie zahlreiche weitere Verwendungsmöglichkeiten, die zum grossen Teil nachstehend beschrieben werden. Die Erfindung stellt auch Verfahren und Agenzien bereit, die für die Herstellung, die Clonierung und Re-Clonierung von TRT-Genen und -Proteinen aus Ciliaten, Pilzen, Vertebraten, beispielsweise Säugern, und anderen Organismen von Nutzen sind.
Wie nachstehend ausführlich beschrieben wird, wurde TRT zuerst nach Reinigung von Telomerase aus dem Ciliaten Euplotes aediculatus charakterisiert. Die umfassende Reinigung von E. aediculatus Telomerase unter Verwendung von RNA-Affinitätschromatographie und weiterer Verfahren lieferte das Protein "p123". Überraschenderweise stellte sich heraus, dass p123 mit Proteinen, von denen bisher angenommen wurde, dass sie Proteinuntereinheiten des Telomerase-Holoenzyms darstellen (d.h. die p80- und p95-Proteine von Tetrahymena thermophila) nicht verwandt ist. Die Analyse der Sequenzen der p123-DNA und des Proteins (Genbank-Zugangsnummer U95964; Fig. 13 und 14) ergab das Vorhandensein von Motiven von reverser Transkriptase (RT) , was mit der Rolle von p123 als katalytische Untereinheit der Telomerase konsistent ist (siehe z.B. Fig. 11).
Darüber hinaus ist p123 mit dem Est1p-Protein aus S. cerevisiae (Hefe) verwandt, von dem bekannt war, dass es eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Telomere in S. cerevisiae spielt (Genbank-Zugangsnummer S5396). Es wurde jedoch vor der vorliegenden Erfindung nicht erkannt, dass dieses ein Protein einer katalytischen Untereinheit von Telomerase codiert (siehe beispielsbeise Lendvay et al., Genetics 144 (1996), 1399).
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Reagenzien und Verfahren zur Identifizierung und Clonierung neuer TRTs unter Verwendung von: Nucleinsäuresonden und Primern, die von den offenbarten TRT-Polynucleotiden erzeugt oder abgeleitet sind (z.B. zur Clonierung von TRT-Genen und cDNAs); Antikörpern, die Motive, Motivsequenzen oder andere TRT-Epitope spezifisch erkennen (z.B. zur Expressionsclonierung von TRT-Genen oder zur Reinigung von TRT-Proteinen); das Screening von Computer-Datenbanken oder weiterer Hilfsmittel. Beispielsweise wurde die in Beispiel 1 beschriebene PCR-Amplifikation (Polymerase-Kettenreaktion) von DNA von S. pombe mit Primern mit degenerierten Sequenzen, die anhand der Euplotes p123 RT Motive B min und C entworfen wurden, ausgewählt.
Von den vier erzeugten Hauptprodukten codierte eines eine Peptidsequenz, die homolog ist zur Euplotes p123 und S. cerevisiae Est2p. Die vollständige Sequenz des zur S. pombe TRT homologen Proteins wurde unter Verwendung dieses PCR-Produkts als Sonde durch Screenen von cDNA- und genomischen Banken von S. pombe und Amplifikation von S. pombe RNA durch reverse Transkription und PCR (RT-PCR) erhalten. Die vollständige Sequenz des S. pombe Gens (trt1 min min ; Genbank-Zugangsnummer AF015783; Fig. 15) ergab, dass die Homologie zwischen p123 und Est2p in den Motiven für reverse Transkriptase besonders hoch war.
Die Amplifikation unter Verwendung von degenerierten Primern, die von den Telomerase RT-Motiven abgeleitet waren, wurde auch zum Erhalt von TRT-Gensequenzen aus Oxytricha trifallax und Tretrahymena thermophila, wie in Beispiel 1 beschrieben, verwendet.
Die erfindungsgemässen Sequenzen Euplotes p123, S. pombe trt1 und S. cerevisiae Est2p wurden bei der Suche in computerisierten Datenbanken von menschlichen exprimierten Sequenzen "tags" (ESTs) unter Verwendung des Programms "BLAST" (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403) verwendet. Die Suche in dieser Datenbank mit der Est2p-Sequenz ergab keine Übereinstimmung, ein menschliches EST (Genbank-Zugangsnummer AA281296; siehe SEQ. ID. Nr. 8) konnte jedoch wie in Beispiel 1 beschrieben durch Suche mit p123- und trt1-Sequenzen identifiziert werden. Dieses menschliche EST codiert vermutlich ein homologes Protein. Die vollständige Sequenzierung des cDNA-Clons, der das EST enthält (nachstehend als "Clon 712562" bezeichnet; siehe SEQ. ID. Nr. 3) zeigte das Vorhandensein von sieben RT-Motiven.
Dieser Clon konnte jedoch ein zusammenhängendes menschliches TRT nicht codieren, da die Motive B min , C, D und E im Vergleich zu den mehr NH2-terminal gelegenen Motiven in einem unterschiedlichen offenen Leserahmen (ORF) enthalten waren. Darüber hinaus war der Abstand zwischen den Motiven A und B min wesentlich geringer als bei den bereits charakterisierten TRTs. (Clon 712562 wurde von dem I.M.A.G.E.-Consortium erhalten; Lennon et al., Genomics 33 (1996), 151).
Der cDNA-Clon pGRN121, der ein funktionales hTRT codiert (SEQ. ID. Nr. 1) wurde aus einer cDNA-Bank isoliert, die von der humanen Zellinie 293 stammte (siehe Beispiel 1). Der Vergleich des Clons 712562 mit pGRN121 ergab, dass Clon 712562 zwischen den Motiven A und B min eine Deletion von 182 Basenpaaren (SEQ. ID. Nr. 9) aufweist. Die in pGRN121 zusätzlich vorhandenen 182 Basenpaare führen dazu, dass alle TRT-Motive in einem einzigen offenen Leserahmen vorhanden sind, und dass sich der Abstand zwischen den Bereichen des Motivs A und des Motivs B min so vergrössert, dass dies konsistent ist mit dem Abstand bei anderen bekannten TRTs. Wie nachstehend in den Beispielen beschrieben (z.B. Beispiel 7) codiert SEQ. ID. Nr. 1 ein katalytisch aktives Telomerase-Protein mit der Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2. Das Polypeptid von SEQ. ID.
Nr. 2 weist 1132 Aminosäuren und ein geschätztes Molekulargewicht von etwa 127 Kilodaltons (kD) auf.
Wie nachstehend diskutiert und in Beispiel 9 beschrieben, werden die für den Clon 712562 charakteristische Deletion von 182 Basenpaaren aufweisende TRT-cDNAs im Anschluss an die reverse Transkription von mRNA aus Telomerase-positiven Zellen (z.B. Testes- und 293-Zellen) nachgewiesen. hTRT-RNAs, denen diese Sequenz von 182 Basenpaaren fehlt, werden allgemein als " DELTA 182-Varianten" bezeichnet und diese können eine, zwei oder mehrere Spezies repräsentieren. Die hTRT-Varianten, denen die in der pGRN121-cDNA (SEQ. ID.
Nr. 1) gefun dene Sequenz von 182 Basenpaaren fehlt, codieren zwar höchstwahrscheinlich kein Telomerase-Enzym mit vollständiger katalytischer Aktivität, sie können jedoch eine Rolle bei der Telomerase-Regulation, wie nachstehend beschrieben, spielen und/oder partielle Telomerase-Aktivität aufweisen, beispielsweise eine Aktivität für die Telomer-Bindung oder hTR-Bindung, wie nachstehend diskutiert.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht somit in der Bereitstellung eines isolierten Polynucleotids mit einer Sequenz eines natürlich vorkommenden menschlichen TRT-Gens oder einer mRNA, wobei ein Polynucleotid mit der Sequenz von SEQ. ID. Nr. 1 eingeschlossen ist, allerdings ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Ein verwandter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung eines Polynucleotids, das ein hTRT-Protein codiert, ein Fragment, eine Variante oder ein Derivat. Ein weiterer verwandter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung von "sense"- und "antisense"-Nucleinsäuren, die an ein hTRT-Gen oder mRNA binden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner hTRT-Proteine bereit, die entweder synthetisiert oder von natürlichen Quellen gereinigt wurden, sowie Antikörper und weitere Agenzien, die spezifisch ein hTRT-Protein oder ein Fragment davon binden. Die vorliegende Erfindung stellt auch viele neue Verfahren bereit, zu denen Verfahren gehören, die die vorstehend erwähnten Zusammensetzungen verwenden, beispielsweise durch Bereitstellung von diagnostischen und prognostischen Assays bezüglich menschlicher Erkrankungen, Verfahren zur Entwicklung von Arzneimitteln und therapeutischen Verfahren, zur Identifizierung von Telomerase-assoziierten Proteinen und Verfahren zum Screenen nach Agenzien, die Telomerase-Aktivität aktivieren oder hemmen können. Zahlreiche weitere Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nachstehend bereitgestellt.
Ein Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Polynucleotids, das eine Länge von etwa 10 kb oder mehr aufweist, und eine aufeinanderfolgende Sequenz von mindestens 10 Nucleotiden umfasst, die zu einer aufeinanderfolgenden Sequenz in einem natürlich vorkommenden hTRT-Gen oder einer hTRT-mRNA identisch oder genau komplementär ist zum Untersuchen oder dem Screenen (nach) einer hTRT-Gensequenz oder einer hTRT-mRNA oder zur Herstellung einer rekombinanten Wirtszelle. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Agens, das die Expression von hTRT erhöht, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Zustands, der durch die Erhöhung der Proliferationskapazität einer Vertebratenzelle behandelt wird, wobei gegebenenfalls das Arzneimittel zur Hemmung der Auswirkungen des Alterns verwendet wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines Inhibitors von Telomerase-Aktivität bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Zustands, der mit einem erhöhten Spiegel an Telomerase-Aktivität innerhalb einer menschlichen Zelle assoziiert ist. Die erfindungsgemässen Proteine, Varianten und Fragmente und die codierenden Polynucleotide oder Fragmente, werden auch in einem weiteren Aspekt dieser Erfindung zur Verwendung als Arzneimittel bereitgestellt.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines Proteins, einer Variante oder eines Fragments davon oder eines Polynucleotids oder Fragments, wie hier definiert, bei der Herstellung eines Medikaments, beispielsweise bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung eines Effekts des Alterns oder von Krebs.
In bestimmten erfindungsemässen Ausführungsformen sind die hTRT-Polynucleotide nicht das Polynucleotid mit 389 Nucleotiden von SEQ. ID. Nr. 8 und/oder nicht Clon 712562, das Plasmid, das eine Insertion enthält mit der Sequenz von SEQ. ID. Nr. 3 in Fig. 18.
Die nachstehende Beschreibung ist nach Themen aufgebaut. Teil II beschreibt weitere für TRT-Proteine charakteristische Aminosäuremotive. Die Teile III bis VI beschreiben unter anderem Nucleinsäuren, Proteine, Antikörper und gereinigte Zusammensetzungen der Erfindung, wobei der Schwerpunkt auf mit menschlicher TRT verwandten Zusammensetzungen liegt. Teil VII beschreibt unter anderem Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung, die zur Behandlung von menschlichen Erkrankungen von Nutzen sind. Teil VIII beschreibt die Herstellung und Identifizierung von immortalisierten menschlichen Zellinien. Teil IX beschreibt unter anderem die Verwendung der erfindungsgemässen Nucleinsäuren, Polynucleotide und weiterer Zusammensetzungen zur Diagnose von menschlichen Erkrankungen. Teil X ist ein Glossar der in den Teilen I bis IX verwendeten Bezeichnungen.
Teil XI beschreibt Beispiele, die sich auf spezifische erfindungsgemässe Ausführungsformen beziehen. Die Beschreibung der Erfindung ist nach Themen und Unterthemen gegliedert, um den Stoff verständlicher zu machen, stellt jedoch in keiner Weise eine Einschränkung dar.
II. TRT-Gene und Proteine
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte und/oder rekombinante Gene und Proteine bereit, die eine Sequenz einer katalytischen Untereinheit des Telomerase-Proteins (d.h. Telomerase-reverse-Transkriptase) aufweisen, wozu, allerdings ohne Beschränkung darauf, die natürlich vorkommenden Formen solcher Gene und Proteine in isolierter oder rekombinanter Form gehören. Typischerweise sind TRTs grosse, basische Proteine mit für reverse Transkriptase (RT) und Telomerase-spezifischen Aminosäuremotiven, so wie dies hier offenbart ist. Da diese Motive innerhalb unterschiedlicher Organismen konserviert sind, könnnen TRT-Gene zahlreiche Organismen unter Verwendung der erfindungsgemässen Verfahren oder unter Verwendung erfindungsgemässer Primer, Nucleinsäuresonden und Antikörpern, beispielsweise solcher, die für ein oder mehrere der Motivsequenzen spezifisch sind, erhalten werden.
Die sieben in TRTs gefundenen RT-Motive ähneln zwar den in anderen reversen Transkriptasen gefundenen, weisen jedoch besondere Kennzeichen auf. Beispielsweise gibt es innerhalb der TRT-RT-Motive wie in Fig. 4 gezeigt, eine Reihe von Aminosäuresubstitutionen (mit Pfeil markiert) in Aminosäureresten, die innerhalb der anderen RTs hoch konserviert sind. Beispielsweise kommen die zwei Asparaginsäurereste (DD) im Motiv C, die die Metallionen im aktiven Zentrum koordinieren (siehe Kohlstaedt et al., Science 256 (1992), 1783; Jacobo-Molina et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90 (1993), 6320; Patel et al., Biochemistry 34 (1995), 5351) in dem Kontext hxDD(F/Y) in den RTs von Telomerase vor, während diese in den anderen RTs im Kontext (F/Y)xDDh vorkommen, wobei h eine hydrophobe Aminosäure ist und "x" eine beliebige Aminosäure ist; siehe Xiong et al., EMBO J. 9 (1990) 3353; Eickbush, in The Evolutionary Biology of Viruses (S. Morse Herausg. Raven-Press, NY, S. 121 (1994".
Weitere für die TelomeraseUntergruppen charakteristische systematische Austausche kommen in dem Motiv E vor, in dem WxGxSx eine "Consensus"Sequenz darstellt oder innerhalb der Telomerase-Proteine konserviert ist, während hLGxxh für andere RTs charakteristisch ist (Xiong et al., a.a.0; Eickbush, a.a.O.) Dieses Motiv E wird als der "Primer-Griff" (primer-grip) bezeichnet und es wurde beschrieben, dass Mutationen in diesem Bereich das "RNA-Priming" beeinflussen, jedoch nicht das "DNA-Priming" (Powell et al., J. Biol. Chem. 272 (1997), 13262). Da Telomerasen einen DNA-Primer, (z.B. das 3 min -Ende des Chromosoms) benötigen, ist es nicht überraschend, dass sich Telomerase von anderen RTs im Bereich des "Primer-Griffs" unterscheidet.
Darüber hinaus ist die Entfernung zwischen den Motiven A und B min in den TRTs grösser wie dies typischerweise in den anderen RTs der Fall ist, wobei dies eine Insertion innerhalb des "Finger"-Bereichs der Struktur, die einer rechten Hand ähnelt, darstellen kann (Fig. 3; siehe Kohlstaedt et al., a.a.O.; Jacobo-Molina et al., a.a.O.; und Patel et al., a.a.O.).
Weiterhin ist das T-Motiv, wie vorstehend erwähnt, ein zusätzliches Kennzeichen von TRT-Proteinen. Das beispielsweise in der Fig. 4 gezeigte T-Motiv (W-L-X-Y-X-X-h-h-X-h-h-X-p-F-F-Y-X-T-E-X-p-X-X-X-p-X-X-X-Y-X-R-K-X-X-W, wobei X eine beliebige Aminosäure ist, h hydrophob und p polar ist) umfasst eine Sequenz, die unter Verwendung der folgenden Formel beschrieben werden kann:
EMI31.1
wobei X eine beliebige Aminosäure ist und die tiefgestellte Zahl sich auf eine Zahl von aufeinanderfolgenden Resten bezieht, R1 Leucin oder Isoleucin ist, R2 Glutamin oder Arginin, R3 Phenylalanin oder Tyrosin und R4 Lysin oder Histidin ist.
Das T-Motiv kann auch unter Verwendung der folgenden Formel beschrieben werden:
EMI31.2
wobei X eine beliebige Aminosäure ist und sich eine tiefgestellte Zahl auf eine Anzahl von aufeinanderfolgenden Resten bezieht, R1 Leucin oder Isoleucin ist, R2 Glutamin oder Arginin, R3 Phenylalanin oder Tyrosin, R4 Lysin oder Histidin, h eine hydrophobe Aminosäure ausgewählt als Ala, Leu, Ile, Val, Pro, Phe, Trp, und Met und p eine polare Aminosäure ausgewählt als Gly, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn und Gln ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung isolierte, natürlich vorkommende und rekombinante TRT-Proteine bereit, die eines oder mehrere der in Fig. 11 dargestellten Motive umfassen, beispielsweise,
EMI32.1
Wenn das gezeigte TRT-Protein mehr als ein TRT-Motiv enthält, ist die Reihenfolge (NH2->COOH) wie in Fig. 4 gezeigt.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung isolierte, natürlich vorkommende TRT-Proteine bereit, die folgendes Supermotiv umfassen:
EMI32.2
Es ist für den Fachmann, der über die hier offenbarten Reagenzien, einschliesslich der TRT-Sequenzen verfügt, offensichtlich, dass mit diesen Reagenzien und den hier bereitgestellten Verfahren und Lehren (einschliesslich spezifischer nachstehend beschriebenen Verfahrensweisen) TRT-Gene und -Proteine vom Fachmann erhalten, isoliert und in rekombinanter Form hergestellt werden können. Beispielsweise werden Primer (z.B. degenerierte Amplifikationsprimer) bereitgestellt, die mit Gensequenzen hybridisieren, die für TRT charakteristische RT- und T-Motive codieren.
Beispielsweise können einer oder mehrere Primer oder degenerierte Primer hergestellt werden, die mit Sequenzen hybridisieren, die den FFYXTE-Bereich des T-Motivs, weitere TRT-Motive (wie nachstehend diskutiert) oder Kombinationen von Motiven oder "Consensus"-Sequenzen codieren, basierend auf der Codon-Verwendung des Zielorganismus, und zur Amplifikation der TRT-Gensequenz aus genomischer DNA oder cDNA, die von dem Zielorganismus hergestellt wurde, verwendet werden. Die Verwendung von degenerierten Primern ist auf dem Fachgebiet gut bekannt. Dazu gehören auch Primersätze, die mit dem Satz von Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, die möglicherweise die Aminosäuren des Zielmotivs codieren. Dabei muss die Bevorzugung und Verwendung bestimmter Codons innerhalb des Zielorganismus in Erwägung gezogen werden. Dabei werden auch Amplifikations- (z.B.
PCR)-Bedingungen angewandt, die geeignet sind, Fehlpaarungen von Basen bei den Anlagerungsschritten der PCR zu erlauben. Typischerweise werden zwei Primer verwendet, Amplifikationssysteme mit einem einzigen Primer (oder in diesem Fall ein Satz mit einem einzelnen degenerierten Primer) sind allgemein bekannt, und diese können auch zum Erhalt von TRT-Genen verwendet werden.
Tabelle 1 zeigt Beispiele von erfindungsgemässen Primern, die zur Amplifikation neuer TRT-Nucleinsäuren, insbesondere solchen aus Vertebraten (z.B. Säuger), verwendet werden können. "N" ist ein äquimolares Gemisch aller vier Nucleotide und Sequenzen in Klammern stellen äquimolare Gemische der angegebenen Nucleotide dar.
EMI34.1
In einer Ausführungsform wird eine amplifizierte TRT-Nucleinsäure als Hybridisierungssonde zur Kolonie-Hybridisierung mit einer Genbank (z.B. einer cDNA-Bank), die aus dem Zielorganismus hergestellt wurde, verwendet, wobei eine Nucleinsäure mit der das gesamte TRT-Protein oder einen wesentlichen Anteil davon codierende Sequenz identifiziert und isoliert oder cloniert wird. Reagenzien und Verfahren, wie beispielsweise die gerade beschriebenen, werden in Übereinstimmung mit den hier beschriebenen Verfahren zum Erhalt von TRT-Gensequenzen aus Oxytricha trifallax und Tetrahymena thermophila, wie nachstehend ausführlich beschrieben, verwendet.
Natürlich kann im Anschluss an die Clonierung eines bisher nicht charakterisierten TRT-Gens die Sequenz durch Routineverfahren bestimmt und das codierte Polypeptid synthetisiert und auf eine TRT-Aktivität, beispielsweise der katalytischen Aktivität von Telomerase, untersucht werden (wie hier beschrieben und/oder mittels auf dem Fachgebiet bekannter Telomerase-Assays).
Es ist für den Fachmann auch offensichtlich, dass TRT-Gene unter Verwendung einer Vielzahl von erfindungsgemässen Clonierungsverfahren cloniert werden können, da die TRT-Motivsequenzen und die solche Sequenzen umfassenden erfindungsgemässen Nucleinsäuren in einer grossen Anzahl solcher Verfahren verwendet werden können. Beispielsweise kann Hybridisierung unter Verwendung einer Sonde, die auf der Sequenz einer bekannten TRT basiert mit DNA- oder weiteren Nucleinsäure-Banken aus dem Zielorganismus, wie in Beispiel 1 beschrieben, verwendet werden. Degenerierte PCR-Primer oder ihre Amplifikationsprodukte, beispielsweise die vorstehend beschriebenen, können selbst markiert sein und als Hybridisierungssonden verwendet werden. In einer weiteren Ausführungsform werden Expressionsclonierungs-Verfahren angewandt.
Beispielsweise können einer oder mehrere Antikörper, die Peptide spezifisch binden, die ein TRT-Motiv oder ein anderes TRT-Epitop umspannen, beispielsweise das FFYXTE-Motiv (wobei X eine beliebige der 20 Standard-Aminosäuren darstellt) spezi fisch binden, zur Isolation eines ribosomalen Komplexes verwendet werden, der ein TRT-Protein und die dieses codierende mRNA umfasst. Zur Herstellung der erfindungsgemässen Antikörper weisen die Peptid-Immunogene typischerweise eine Länge von 6 bis 30 Aminosäuren auf, bevorzugt 10 bis 20 Aminosäuren. Die Antikörper können auch zum Absuchen einer cDNA-Expressionsbank, die von dem gewünschten Organismus stammt, zur Identifikation eines eine TRT-Sequenz codierenden Clons verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform können zur Identifikation eines eine TRT-Sequenz codierten Clons DNA-Datenbanken per Computer nach DNAs durchsucht werden, die innerhalb bekannter TRTs konservierte Sequenzen enthalten.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung von Zusammensetzungen, die ein isoliertes oder rekombinantes Polypeptid mit der Sequenz eines natürlich vorkommenden TRT-Proteins umfassen. Üblicherweise hat die natürlich vorkommende TRT ein Molekulargewicht zwischen etwa 80 000 Daltons (d) und etwa 150 000 d, bevorzugt zwischen etwa 95 000 d und etwa 130 000 d. Typischerweise hat die natürlich vorkommende TRT bei einem pH-Wert von 7 eine positive Gesamtladung (wobei der geschätzte pI typischerweise über 9 liegt). In einer Ausführungsform weist das Polypeptid eine wie hier definierte Telomerase-Aktivität auf. In einer verwandten Ausführungsform weist das Polypeptid eine Sequenz für einen TRT-spezifischen Bereich (T-Motiv) auf und eine Telomerase-Aktivität. Die Erfindung stellt ferner Fragmente solcher Polypeptide bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ausserdem isolierte oder rekombinante Polynucleotide mit der Sequenz eines natürlich vorkommenden, ein TRT-Protein codierenden Gens bereit. Die Erfindung stellt auch isolierte TRT-Polynucleotide mit einer Sequenz einer TRT eines Nicht-Vertebraten (z.B. von Hefe) und Vertebraten, beispielsweise Säugern (z.B. Mäusen oder Menschen) bereit. Die isolierten Polynucleotide können mit anderen natürlich vorkommenden oder Vektor-Nucleinsäuresequenzen assoziiert sein. Typischerweise liegt die Länge der isolierten Nucleinsäure unter etwa 300 kb, bevorzugt unter etwa 50 kb, mehr bevorzugt unter etwa 20 kb und am meisten bevorzugt unter etwa 10 kb. Gelegentlich liegt die Länge unter etwa 5 kb oder 2 kb.
In einigen Ausführungsformen ist das isolierte TRT-Polynucleotid sogar noch kleiner, beispielsweise handelt es sich dabei um ein Genfragment, einen Primer oder eine Sonde mit einer Länge unter etwa 1 kb oder 0,1 kb.
III. Nucleinsäuren
A) Allgemeines
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte und rekombinante Nucleinsäuren bereit mit einer Sequenz eines Polynucleotids, das eine katalytische Untereinheit des Telomerase-Proteins (TRT) codiert, beispielsweise ein rekombinantes TRT-Gen aus Euplotes, Tetrahymena, S. pombe oder Menschen. Beispiele für Polynucleotide sind dargestellt in Fig. 13 (Euplotes), Fig. 15 (S. pombe) und Fig. 16 (Mensch, Genbank-Zugangsnummer AF15950). Die vorliegende Erfindung stellt "sense" und "anti-sense"-Polynucleotide mit einer TRT-Gensequenz bereit, dazu zählen auch Sonden, Primer, TRT-Protein-codierende Polynucleotide und ähnliches.
B) Menschliche TRT
Die vorliegende Erfindung stellt Nucleinsäuren bereit mit einer Sequenz einer katalytischen Untereinheit einer Telomerase aus Menschen (d.h. hTRT).
Ein Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung eines Polynucleotids mit einer Sequenz oder Untersequenz eines menschlichen TRT-Gens oder einer RNA. In einer Ausführungsform besitzt das erfindungsgemässe Polynucleotid eine Sequenz der SEQ. ID. Nr. 1 (Fig. 16) oder eine Untersequenz davon. In einer weiteren Ausführungsform weist das Polynucleotid eine Sequenz der SEQ. ID. Nr. 3 (Fig. 18), SEQ. ID. Nr. 4 (Fig. 20) oder Untersequenzen davon auf. Die Erfindung stellt auch Polynucleotide mit im wesentlichen zu den hier offenbarten hTRT-Nucleinsäuresequenzen identischen Sequenzen bereit, beispielsweise SEQ. ID. Nr. 1 und die weiteren offenbarten Sequenzen (z.B. SEQ. ID. Nr. 4, 6 (Fig. 21) und 7 (Fig. 12)).
Somit stellt die Erfindung natürlich vorkommende Allele der menschlichen TRT-Gene und Varianten der Polynucleotidsequenzen bereit mit einer oder mehreren Nucleotiddeletionen, Insertionen oder Substitutionen, bezogen auf eine hier offenbarte hTRT-Nucleinsäuresequenz. Wie nachstehend beschrieben, können Varianten der Nucleinsäuren unter Verwendung der nachstehend beschriebenen Rekombinationsverfahren oder synthetischer Verfahren oder durch andere Mittel hergestellt werden.
Die Erfindung stellt auch isolierte und rekombinante Polynucleotide mit einer Sequenz eines flankierenden Bereichs eines menschlichen TRT-Gens bereit. Zu diesen Polynucleotiden zählen solche, die von genomischen Sequenzen von untranslatierten Bereichen der hTRT-mRNA abstammen. Ein Beispiel für eine genomische Sequenz ist SEQ. ID. Nr. 6 (Fig. 21). Wie in Beispiel 4 beschrieben, wurde SEQ. ID. Nr. 6 durch Sequenzierung des Clons lambda G PHI 5, der aus einer menschlichen Genombank isoliert wurde, erhalten. lambda G PHI 5 enthält eine Insertion mit einer Länge von 15 Kilobasenpaaren (kbp) , die ungefähr 13 000 Basen 5 min zu den hTRT codierenden Sequenzen einschliessen. Dieser Clon enthält hTRT-Promotorsequenzen und weitere regulatorische Sequenzen des hTRT-Gens (z.B. Enhancer).
Die Erfindung stellt auch isolierte und rekombinante Polynucleotide mit einer Sequenz aus einem Intronbereich eines menschlichen TRT-Gens bereit. Ein Beispiel für eine Intronsequenz ist SEQ. ID. Nr. 7 (siehe Beispiel 3 und Fig. 12) . In einigen Ausführungsformen sind hTRT-Introns in "Minigenen" zur verbesserten Expression von hTRT-Proteinen in eukaryotischen Zellen eingeschlossen.
Ein verwandter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung von Polynucleotiden, die hTRT-Proteine oder Proteinfragmente codieren, dazu zählen modifizierte und geänderte hTRT-Polypeptide und Varianten der hTRT-Polypeptide. In einer Ausführungsform weist das codierte hTRT-Protein oder Fragment eine wie in SEQ. ID. Nr. 2 (Fig. 17) gezeigte Aminosäuresequenz auf oder eine Aminosäuresequenz mit konservativen Austauschen der SEQ. ID. Nr. 2. In einer Ausführungsform weisen das codierte hTRT-Protein oder -Fragment Austausche auf, die eine Aktivität des Proteins (z.B. katalytische Aktivität von Telomerase) aufweisen.
Natürlich müssen aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes die das hTRT-Protein codierenden Nucleinsäuren nicht die Sequenz eines natürlich vorkommenden hTRT-Gens aufweisen, d.h. eine Vielzahl von Polynucleotiden kann ein hTRT-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ. ID. Nr. 2 codieren. Die vorliegende Erfindung stellt jede mögliche Variation von Nucleotidsequenzen bereit, die durch die Auswahl von Kombinationen hergestellt werden, die auf der Auswahl möglicher Codons in Übereinstimmung mit dem bekannten genetischen Triplett-Code basieren. All diese Variationen sind hiermit ausdrücklich offenbart.
Zwar sind somit in einigen Fällen hTRT-Polypeptid codierende Nucleotidsequenzen, die mit den Nucleotidsequenzen der natürlich vorkommenden Sequenz (unter entsprechend ausgewählten Bedingungen der Stringenz) hybridisieren können, bevorzugt, es kann jedoch in anderen Fällen vorteilhaft sein, hTRT-codierende Nucleotidsequenzen herzustellen, die eine im wesentlichen unterschiedliche Condonverwendung aufweisen.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung hTRT-Oligo- und -Polynucleotide bereit, die eine Untersequenz einer hier offenbarten hTRT-Nucleinsäure umfassen (z.B. SEQ. ID. Nr. 1, 4, 6 und 7). Die erfindungsgemässen Nucleinsäuren umfassen typischerweise mindestens etwa 10, bevorzugt mindestens etwa 12 oder etwa 15 aufeinanderfolgende Basen des er läuterten hTRT-Polynucleotids auf. Oft umfassen die erfindungsgemässen Nucleinsäuren auch eine längere Sequenz, beispielsweise eine Sequenz mit einer Länge von mindestens etwa 25, etwa 50, etwa 100, etwa 200 oder mindestens etwa 500 Basen, beispielsweise wenn die Expression eines Polypeptids angestrebt wird. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich das hTRT-Polynucleotid von einem Polynucleotid mit der Sequenz von EST AA281296 (SEQ. ID. Nr. 8).
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellen " DELTA 182hTRT"-Polynucleotide bereit mit einer Sequenz, die natürlich vorkommende oder nicht natürlich vorkommende hTRTPolynucleotide codieren, beispielsweise SEQ. ID. Nr. 3 oder SEQ. ID. Nr. 4, die nicht die in pGRN121 aufgefundene 182 Basenpaarsequenz (SEQ. ID. Nr. 9 (Fig. 24)), die in Clon 712562 ebenfalls fehlt) enthalten. Diese Polynucleotide sind teilweise von Interesse, da sie Polypeptide codieren, die Kombinationen von TRT-Motiven enthalten, die sich von dem in hTRT-Polypeptid mit vollständiger Länge gefundenen (SEQ. ID. Nr. 2), beispielsweise dem von pGRN121 codierten Polypeptid, unterscheiden.
Wie nachstehend diskutiert, wird davon ausgegangen, dass diese Polypeptide in der Natur eine biologische Rolle spielen können (z.B. bei der Regulation der Expression von Telomerase in Zellen) und/oder als Arzneimittel Verwendung finden können (z.B. als dominant-negative Produkte, die die Funktion des Wildtyp-Proteins hemmen) oder dass diese Polypeptide weitere Rollen und Verwendungen, beispielsweise die hier beschriebenen, aufweisen.
Beispielsweise codiert Clon 712562 im Gegensatz zu dem Clon pGRN121 ein Protein mit 259 Aminosäureresten und einem geschätzten Molekulargewicht von ungefähr 30 kD (nachstehend als "712562 hTRT" bezeichnet. Das 712562 hTRT-Polypeptid (SEQ. ID. Nr. 10 (Fig. 19) ) enthält die Motive T, 1, 2 und A, jedoch nicht die Motive B min , C, D und E. In ähnlicher Weise kann eine Variante des hTRT-Polypeptids mit therapeu tischen und weiteren Aktivitäten von einer Nucleinsäure exprimiert werden, die der pGRN121-cDNA gleicht, der jedoch die 182 Basenpaare fehlen, die der Clon 712562 nicht aufweist, beispielsweise mit der Sequenz SEQ. ID. Nr. 4.
Diese Nucleinsäure (nachstehend mit "pro90hTRT" bezeichnet), die unter Verwendung von Routine-Syntheseverfahren oder rekombinanten Verfahren, wie sie hier beschrieben sind, synthetisiert werden kann, codiert ein Protein mit 807 Aminosäureresten (geschätztes Molekulargewicht etwa 90 kD), das dieselben Amino-terminalen Sequenzen wie das von SEQ. ID. Nr. 1 codierte hTRT-Protein aufweist, jedoch am Carboxy-terminalen Bereich abweicht (die ersten 763 Aminosäurereste haben beide Proteine gemeinsam, die letzten 44 Aminosäurereste von pro90hTRT unterscheiden sich von dem hTRT mit vollständiger Länge). Das pro90hTRT-Polypeptid enthält die Motive T, 1, 2 und A, nicht jedoch die Motive B, C, D und E und kann daher einige, jedoch nicht alle Telomerase-Aktivitäten aufweisen.
C) Herstellung von menschlichen TRT-Nucleinsäuren
Für die erfindungsgemässen Polynucleotide ergeben sich zahlreiche Anwendungen. Dazu zählen, allerdings ohne Beschränkung darauf, die Expression von Polypeptiden, die hTRT oder Fragmente davon codieren, die Verwendung als "sense"- oder "antisense"-Sonden oder Primer zur Hybridisierung und/oder Amplifikation von natürlich vorkommenden hTRT-Genen oder RNAs (z.B. für diagnostische oder prognostische Anwendungen) und als Arzneimittel (z.B. in "antisense"-, Triplex- oder Ribozym-Zusammensetzungen). Nach Lektüre dieser Offenbarung ist offensichtlich, dass diese Anwendungsmöglichkeiten eine gewaltige Auswirkung auf die Diagnose und die Behandlung von menschlichen Erkrankungen, die sich auf Alterung, Krebs und Fruchtbarkeit beziehen, und darüber hinaus auf das Wachstum, die Reproduktion und die Herstellung von Produkten, die auf Zellen basieren, haben.
Wie in den nachstehenden Abschnitten beschrieben, können die erfindungsgemässen hTRT-Nucleinsäuren unter Verwendung bekannter Techniken (z.B. durch Clonierung, Synthese oder Amplifikation) hergestellt werden.
1) Clonierung, Amplifikation und Rekombinante Herstellung
In einer Ausführungsform werden hTRT-Gene oder cDNAs unter Verwendung einer Nucleinsäuresonde cloniert, die an hTRT-mRNA, cDNA oder genomische DNA spezifisch hybridisiert. Eine für diesen Zweck geeignete Probe ist ein Polynucleotid mit der Sequenz, die in SEQ. ID. Nr. 1 bereitgestellt wird oder eine Untersequenz davon. Typischerweise wird die genomische DNA oder cDNA mit dem Ziel-hTRT in einen Vektor ligiert (z.B. ein Plasmid, Phage, Virus, künstliches Hefechromosom etc.) und sie kann in einer genomischen Bank oder cDNA-Bank (z.B. einer cDNA-Bank von menschlicher Plazenta) gefunden werden. Nachdem eine hTRT-Nucleinsäure identifiziert ist, kann sie gemäss dem Fachmann bekannten Standardverfahren isoliert werden.
Ein das Screenen einer menschlichen cDNA-Bank nach dem hTRT-Gen veranschaulichendes Beispiel ist Beispiel 1; ein ähnliches Beispiel, das sich auf das Screenen einer menschlichen genomischen Bank bezieht, ist Beispiel 4. Clonierungsverfahren sind allgemein bekannt und beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); Berger und Kimmel, Methods In Enzymology, Vol. 152: Guide To Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc. (1987); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York (1997); Cashion et al., US-Patent Nr. 5 017 478; und Carr. EP-B1 0 246 864, beschrieben.
Die Erfindung stellt ferner genomische hTRT-Nucleinsäuren oder cDNA-hTRT-Nucleinsäuren zur Verfügung, die durch Amplifikationsverfahren wie z.B. die Polymerasekettenreaktion (PCR), isoliert wurde, zur Verfügung. In einer Ausführungsform wird die das hTRT-Protein codierende Sequenz aus einer RNA-Probe oder cDNA-Probe amplifiziert (z.B. doppelsträngige Plazenta-cDNA (Clontech, Palo Alto CA" unter Verwendung der Primer
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In einigen Ausführungsformen kann ein dritter Primer oder ein zweites Primerpaar verwendet werden, beispielsweise für "nested PCR" zur Erhöhung der Spezifität. Ein Beispiel eines zweiten Primerpaares ist
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Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass zahlreiche andere Primer und Primerkombinationen, die für die Amplifikation von hTRT-Nucleinsäuren von Nutzen sind, durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden.
Darüber hinaus stellt die Erfindung Primer zur Verfügung, die einen beliebigen spezifischen Bereich amplifizieren (beispielsweise codierende Bereiche, Promotorbereiche und/oder Introns) oder eine Untersequenz genomischer hTRTDNA, cDNA oder RNA. Beispielsweise kann das hTRT-Intron an der Position 274/275 von SEQ. ID. Nr. 1 (siehe Beispiel 3) amplifiziert werden (z.B. zum Nachweis genomischer Clone) unter Verwendung der Primer TCP1.57 und TCP1.52 (Primerpaar 1) oder der Primer TCP1.49 und TCP1.50 (Primerpaar 2). (Die Bezeichnungen für die Primer beziehen sich auf die in der nachstehenden Tabelle 2 aufgelisteten Primer). Die Primerpaare können individuell oder in einer "nested PCR" verwendet werden, in der der Primersatz 1 zuerst verwendet wird.
Ein weiteres veranschaulichendes Beispiel bezieht sich auf Primer, die spezifisch das 5 min -Ende der hTRT-mRNA oder das Exon, das das 5 min -Ende des hTRT-Gens codiert, amplifizieren und somit nachweisen (z.B. um die Grösse oder die Vollständigkeit eines cDNA-Clons zu beurteilen). Die folgenden Primerpaare sind zur Amplifikation des 5 min -Endes von hTRT von Nutzen: Primer K320 und K321 (Primerpaar 3); Primer K320 und TCP1.61 (Primerpaar 4); Primer K320 und K322 (Primerpaar 5). Die Primersätze können in einer "nested PCR" in der Reihenfolge Satz 5, dann Satz 4 oder Satz 3, oder Satz 4 und dann Satz 3 verwendet werden.
Ein weiteres veranschaulichendes Beispiel betrifft Primer, die zur spezifischen Amplifikation oder zum spezifischen Nachweis des konservierten hTRT-TRT-Motivbereichs ausgewählt wurden, der etwa das mittlere Drittel der mRNA umfasst (z.B. zur Verwendung als Hybridisierungssonde zur Identifizierung von TRT-Clonen aus nicht-menschlichen Organismen). Die folgenden Primerpaare sind zur Amplifikation des TRT-Motivbereichs von hTRT-Nucleinsäuren von Nutzen: Primer K304 und TCP1.8 (Primerpaar 6), oder Primer LT1 und TCP1.15 (Primerpaar 7). Die Primersätze können in einem Experiment mit "nested PCR" in der Reihenfolge Satz 6, dann Satz 7 verwendet werden.
Geeignete Bedingungen für die PCR-Amplifikation sind dem Fachmann bekannt. Dazu gehören (ohne Beschränkung darauf) 1 Einheit Taq-Polymerase (Perkin Elmer, Norwalk CT), jeweils 100 mu M dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 x PCR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris, pH-Wert 8,3 bei Raumtemperatur, 1,5 mM MgCl2, 0,01% Gelatine) und 0,5 mu M Primer, wobei die Amplifikation etwa 30 Cyclen bei 94 DEG C für 45 Sekunden, 55 DEG C für 45 Sekunden und 72 DEG C für 90 Sekunden umfasst. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass andere thermostabile DNA-Polymerasen, Reaktionsbedingungen und Parameter bezüglich der Cyclen ebenfalls eine geeignete Amplifikation liefern. Weitere geeignete Verfahren für die Amplifikation in vitro, die zum Erhalt von hTRT-Nucleinsäuren verwendet werden können, umfassen, jedoch ohne Beschränkung darauf, die nachstehend beschriebenen Verfahren.
Nach Amplifikation können die hTRT-Nucleinsäuren, falls erwünscht, unter Verwendung von Routineverfahren der Molekularbiologie in einer Vielzahl von Vektoren cloniert werden, nachgewiesen oder auf andere Art und Weise in Übereinstimmung mit den erfindungsgemässen Verfahren angewandt werden.
Es ist dem Fachmann bewusst, dass die wie vorstehend beschrieben erhaltenen clonierten oder amplifizierten hTRT-Nucleinsäuren unter Verwendung weiterer Verfahren hergestellt oder vermehrt werden können, beispielsweise durch chemische Synthese oder Replikation durch Transformation in bakterielle Systeme wie beispielsweise E. coli (siehe beispielsweise Ausubel et al., a.a.O.) oder eukaryotische Expressionssysteme, beispielsweise Säuger-Expressionssysteme.
In ähnlicher Weise kann hTRT-RNA in Übereinstimmung mit den erfindungsgemässen in vitro-Verfahren oder in bakteriellen Systemen wie E. coli exprimiert werden, beispielsweise ohne Verwendung von im Handel erhältlichen Vektoren, die Promotoren enthalten, die von einer RNA-Polymerase erkannt werden, wie beispielsweise T7, T3 oder SP6 oder durch Transkription von DNA, die durch PCR-Amplifikation erzeugt wurde, unter Verwendung von Primern, die einen RNA-Polymerase-Promotor enthalten.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner veränderte oder modifizierte hTRT-Nucleinsäuren bereit. Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass die erhaltenen clonierten oder amplifizierten hTRT-Nucleinsäuren durch allgemein bekannte Verfahren (z.B. ortsgerichtete Mutagenese, "Linker-Scanning"-Mutagenese) modifiziert werden können, beispielsweise verkürzt, derivatisiert, verändert), oder einfach de novo, wie nachstehend beschrieben, synthetisiert werden können. Die veränderten oder modifizierten hTRT-Nucleinsäuren sind für eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten von Nutzen, zu denen ohne Beschränkung darauf die Erleichterung der Clonierung, die Manipulation eines hTRT-Gens oder Genprodukts oder die Expression einer Variante eines hTRT-Genprodukts gehören.
In einer Ausführungsform wird beispielsweise die hTRT-Gensequenz so verändert, dass sie ein hTRT-Polypeptid mit veränderten Eigenschaften oder Aktivitäten codiert, wie dies ausführlich nachstehend diskutiert wird, beispielsweise durch Mutation in einem konservierten Motiv von hTRT. In einem weiteren veranschaulichenden Beispiel können die Muta tionen in dem das Protein codierenden Bereich einer hTRT-Nucleinsäure zur Veränderung des Glykosylierungsmusters, zur Veränderung von Codon-Präferenzen, zur Herstellung von Spleiss-Varianten, zur Entfernung von Protease-empfindlichen Stellen, zur Erzeugung von antigenen Domänen, zur Modifikation der spezifischen Aktivität etc. eingeführt werden.
In weiteren Ausführungsformen wird die hTRT und seine Derivate codierende Sequenz ohne Änderung der codierten Aminosäuresequenzen verändert, beispielsweise zur Herstellung von RNA-Transkripten mit mehr erwünschten Eigenschaften, wie beispielsweise erhöhte Translationeffizienz oder eine grössere oder kürzere Halbwertszeit im Vergleich zu Transkripten, die von der natürlich vorkommenden Sequenz hergestellt wurden. In einer weiteren Ausführungsform werden zur Erhöhung der Expressionsrate des Peptids in einem speziellen prokaryotischen oder eukaryotischen Expressionswirt gemäss der Frequenz, mit der bestimmte Codons von dem Wirt verwendet werden, veränderte Codons ausgewählt.
Nützliche in vitro und in vivo-Rekombinationsverfahren, die zur Herstellung der erfindungsgemässen hTRT-Polynucleotidvarianten verwendet werden können, können in Sambrook et al. und Ausubel et al., a.a.O., gefunden werden.
Wie bereits vorstehend erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung Nucleinsäuren mit flankierenden (5 min oder 3 min ) und Intron-Sequenzen des hTRT-Gens bereit. Die Nucleinsäuren sind u.a. deshalb von Interesse, da sie Promotoren und weitere regulatorische Elemente enthalten, die an der hTRT-Regulation beteiligt und zur Expression von hTRT und anderer rekombinanter Proteine oder RNA-Genprodukte von Nutzen sind. Es ist offensichtlich, dass zusätzlich zu den in SEQ. ID. Nr. 6 (Fig. 17) und 7 bereitgestellten Nucleinsäuresequenzen zusätzliche hTRT-Intronsequenzen und flankierende Sequenzen unter Verwendung von Routineverfahren der Molekularbiologie einfach erhalten werden können. Beispielsweise kann eine zusätzliche genomische hTRT-Sequenz durch weitere Sequenzierung des Lambda-Clons G PHI 5, der vorstehend und in Beispiel 4 beschrieben ist, erhalten werden.
Darüber hinaus können weitere genomische hTRT-Clone und Sequenzen durch Screenen einer menschlichen genomischen Bank unter Verwendung einer hTRT-Nucleinsäuresonde mit einer Sequenz oder Untersequenz von SEQ. ID. Nr. 1 erhalten werden. Weitere Clone und Sequenzen (z.B. noch weiter stromaufwärts) können unter Verwendung von markierten Sequenzen oder Subclonen, die von lambda G PHI 5 stammen, zum Absuchen geeigneter Genbanken erhalten werden. Andere nützliche Verfahren zur weiteren Charakterisierung von flankierenden hTRT-Sequenzen sind die allgemeinen Verfahren, die von Gobinda et al., PCR Meth. Applic. 2 (1993), 318; Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16 (1988), 8186; Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1 (1991), 111; und Parker et al., Nucleic Acids Res. 19 (1991), 3055, beschrieben werden.
Intron-Sequenzen können durch Routinemittel identifiziert werden, beispielsweise durch Vergleich der genomischen hTRT-Sequenz mit hTRT-cDNA-Sequenzen (siehe beispielsweise Beispiel 3), durch S1-Analyse (siehe Ausubel et al., a.a.O.; Kapitel 4), oder zahlreiche weitere auf dem Fachgebiet bekannte Mittel. Intron-Sequenzen können auch in prä-mRNA (d.h. ungespleissten oder unvollständig gespleissten mRNA-Vorläufern) gefunden werden. Diese können amplifiziert oder nach reverser Transkription von zellulärer RNA cloniert werden.
Falls erwünscht, kann die clonierte, amplifizierte oder anderweitig synthetisierte hTRT-Nucleinsäure oder andere TRT-Nucleinsäure bestimmt oder unter Verwendung von allgemein bekannten Verfahren für die DNA-Sequenzierung verifiziert werden (siehe beispielsweise Ausubel et al., a.a.O.) Bei den nützlichen Sequenzierungsverfahren werden Enzyme wie beispielsweise das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, Sequenase (US Biochemical Corp., Cleveland OH), Taq DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Norwalk CT), thermostabile T7-Polymerase (Amersham, Chicago IL), oder Kombinationen von rekombinanten Polymerasen und Exonucleasen mit "proofreading"-Aktivität angewandt, beispielsweise das ELONGASE-Amplifikations-System, das von Gibco BRL (Gaithersburg MD) erhältlich ist. Zur Sequenzierung oder Verifizierung der Sequenz von Oligonucleotiden, (wie z.B.
Oligonucleotiden, die durch die de novo-chemische Synthese hergestellt wurden) wird das Verfahren von Maxam und Gilbert bevorzugt (Maxam und Gilbert, Meth. Enz. 65 (1980), 499; Ausubel et al., a.a.O., Kapitel 7).
Die 5 min -untranslatierten Sequenzen von hTRT oder anderen TRT-mRNAs können durch Clonierung einer hTRT mit "vollständiger Länge" oder einer anderen cDNA unter Verwendung von Standardverfahren wie der reversen Transkription von mRNA und im Anschluss daran durch Clonierung und Sequenzierung der erhaltenen cDNA direkt bestimmt werden. Bevorzugte durch oligo(dT)-"priming" erhaltene Genbanken zum Screenen oder Amplifizieren von cDNAs mit vollständiger Länge, die zum Einschluss grösserer cDNAs nach Grösse selektiert wurden, werden bevorzugt. Durch "Zufalls-Priming" erhaltene Genbanken sind ebenfalls geeignet. Diese enthalten oft einen grösseren Anteil von Clonen, die 5 min -Bereiche von Genen enthalten. Es können weitere allgemein bekannte Verfahren zum Erhalt von 58-RNA-Sequenzen verwendet werden, beispielsweise das von Frohman et al., Proc. Nat. Acad.
Sci., USA 85 (1988), 8998, beschriebene RACE-Protokoll. Falls erwünscht, kann die Transkriptions-Startstelle einer hTRT oder einer anderen TRTmRNA durch Routineverfahren unter Verwendung der hier bereitgestellten Nucleinsäuren (z.B. solcher mit der Sequenz von SEQ. ID. Nr. 1) bestimmt werden. Ein Verfahren ist die S1-Nuclease-Analyse (Ausubel et al., a.a.O.), bei der eine markierte DNA mit einer Sequenz des 5 min -Bereichs von SEQ. IDNr. 1 verwendet wird.
2) Chemische Synthese von Nucleinsäuren
Die vorliegende Erfindung stellt auch hTRT-Polynucleotide (RNA, DNA oder modifiziert) bereit, die durch direkte chemische Synthese hergestellt werden. Chemische Synthese wird im allgemeinen für die Herstellung von Oligonucleotiden oder von Oligonucleotiden und Polynucleotiden, die Nicht-Standardnucleotide enthalten (z.B. Sonden, Primer und "antisense"-Oligonucleotide) bevorzugt. Die direkte chemische Synthese von Nucleinsäuren kann durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren erfolgen, beispielsweise durch das Phosphotriester-Verfahren von Narang et al., Meth. Enzymol. 68 (1979), 90; das Phosphodiester-Verfahren von Brown et al., Meth. Enzymol. 68 (1979), 109; das Diethylphosphoramidit-Verfahren von Beaucage et al., Tetra. Lett. 22 (1981), 1859; und das Verfahren des US-Patents Nr. 4 458 066, bei dem ein fester Träger verwendet wird.
Durch die chemische Synthese wird typischerweise ein einzelsträngiges Oligonucleotid hergestellt, das durch Hybridisierung mit einer komplementären Sequenz oder durch Polymerisation mit einer DNA-Polymerase und eines Oligonucleotidprimers unter Verwendung des Einzelstrangs als Matrize in eine doppelsträngige DNA umgewandelt werden kann. Der Fachmann ist sich dessen bewusst, dass zwar die chemische Synthese von DNA oft auf Sequenzen von etwa 100 oder 150 Basen beschränkt ist, längere Sequenzen jedoch durch Ligierung der kürzeren Sequenzen oder durch ausgefeiltere Syntheseverfahren erhalten werden können.
Die erfindungsgemässen hTRT-Polynucleotide und Oligonucleotide (oder hTRT- oder weitere Polynucleotide oder Oligonucleotide) können unter Verwendung von Nicht-Standardbasen (z.B. solche, die sich von Adenin, Cytidin, Guanin, Thymin und Uridin unterscheiden) oder Nicht-Standard-Rückgratstrukturen zur Erzielung gewünschter Eigenschaften (z.B. erhöhte Nuclease-Resistenz, engere Bindung, Stabilität oder ein gewünschter TM) hergestellt werden. Zu den für die Herstellung von Nuclease-resistenten Oligonucleotiden zählen die in der PCT-Veröffentlichung WO 94/12 633 beschriebenen Verfahren.
Eine grosse Anzahl von nützlichen modifizierten Oligonucleotiden kann hergestellt werden, dazu zählen Oligonucleotide mit einem Peptid-Nucleinsäure (PNA)-Rückgrat (Nielsen et al., Science 254 (1991), 1497) oder der Einbau von 2 min -O-Methylribonucleotiden, Phosphorthioat-Nucleotiden, Methylphosphonat-Nucleotiden, Phosphotriester-Nucleotiden, Phosphorthioat-Nucleotiden und Phosphoramidaten.
Weitere nützliche Oligonucleotide können Alkyl- und Halogen-substituierte Zuckeranteile enthalten, die an der 2 min -Position eine der folgenden Gruppen enthalten: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3OCH3, OCH3O(CH2)nCH3, O(CH2)nNH2 oder O(CH2)nCH3, wobei n von 1 bis etwa 10 ist; C1 bis C10-Niederalkyl, substituiertes Niederalkyl, Alkaryl oder Aralkyl; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S-, oder N-Alkyl; O-, S-, oder N-Alkenyl; SOCH3, SO2CH3; ONO2; NO2; N3, NH2; Heterocycloalkyl; Heterocycloalkaryl; Aminoalkylamino; Polyalkylamino, substituiertes Silyl; eine RNA-spaltende Gruppe, eine Cholesteringruppe, eine Folatgruppe, eine Reportergruppe, ein Intercalator, eine Gruppe zur Verbesserung der pharmacokinetischen Eigenschaften eines Oligonucleotids; oder eine Gruppe zur Verbesserung der pharmacodynamischen Eigenschaften eines Oligonucleotids und weiterer Substituenten mit ähnlichen Eigenschaften.
Folat, Cholesterin und weitere Gruppen, die die Aufnahme des Oligonucleotids erleichtern, wie beispielsweise Lipid-Analoga, können direkt oder über einen Linker an der 2 min -Position jedes Nucleosids oder an der 3 min - oder 5 min -Position des 3 min -terminalen bzw. 5 min -terminalen Nucleosids konjugiert werden. Es können eines oder mehrere solcher Konjugate verwendet werden. Oligonucleotide können auch Zucker "mimetics" aufweisen, beispielsweise Cyclobutyle anstelle der Pentofuranosylgruppe. Weitere Ausführungsformen können mindestens eine modifizierte Basenform oder eine "universelle Base" wie Inosin beinhalten oder den Einschluss von anderen Nicht-Standardbasen wie Queosin und Wybutosin sowie Acetyl-, Methyl-, Thio- und ähnlich modifizierte Formen von Adenin, Cytidin, Guanin, Thymin und Uridin, die von Endonucleasen nicht so leicht erkannt werden.
Die Erfindung stellt ferner Oligonucleotide mit Rückgratanalogen bereit, dazu gehören Phosphodiester, Phosphorthioat, Phosphordithioat, Methylphosphonat, Phosphoramidat, Alkylphosphotriester, Sulfamat, 3 min -Thioacetyl, Methylen(methylimino), 3 min -N-Carbamat, Morpholincarbamat, Chiral-Methylphosphonate, Nucleotide mit kurzkettigen Alkyl- oder Cycloalkylverknüpfungen zwischen den Zuckern, kurzkettige Verknüpfungen ("Rückgratverknüpfungen") zwischen den Zuckern mit unterschiedlichen Atomen oder solche die heterocyclisch sind oder CH2-NH-OCH2, CH2-N(CH3)-OCH2, CH2(-N(CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2 und O-N(CH3)-CH2-CH2-Rückgrate (wobei Phosphodiester O-P-O-CH2 ist), oder Mischungen dieser Verbindungen. Von Nutzen sind ausserdem Oligonucleotide mit Morpholino-Rückgrat-Struktur (US-Patent Nr. 5 034 506).
*Zur weiteren nützlichen Literatur zählt: Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, F. Eckstein (Herausg.) IRL Press bei Oxford University Press (1991); Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Bd. 600, Baserga und Denhardt (Herausg.) (NYAS 1992), Milligan et al., J. Med. Chem. 36 (14) (9. Juli 1993), 1923-1937; Antisense Research and Applications (1993, CRC Press) die gesamte Veröffentlichung und speziell Kapitel 15 von Sanghvi, mit dem Titel "Heterocyclic base modifications in nucleic acids and their applications in antisense oligonucleotides." Antisense Therapeutics, Sudhir Agrawal (Herausgeber (Humana Press, Totowa, New Jersey, 1996).
D) Die Markierung von Nucleinsäuren
Es ist oft von Nutzen, die erfindungsgemässen Nucleinsäuren zu markieren, beispielsweise wenn die hTRT oder andere Oligonucleotide oder Polynucleotide als Nucleinsäuresonden verwendet werden sollen. Die Markierungen (siehe nachstehend) können durch beliebige, dem Fachmann allgemein bekannte Mit tel eingebaut werden. In einer Ausführungsform wird eine nicht-amplifizierte Nucleinsäure (z.B. mRNA, poly-A-mRNA, cDNA) markiert. Mittel zur Herstellung markierter Nucleinsäuren sind dem Fachmann allgemein bekannt. Dazu gehören beispielsweise Nick-Translation, Markierung mittels "Zufalls-Priming", Endmarkierung (z.B. unter Verwendung einer Kinase) und chemische Konjugation (z.B. Photobiotinylierung). In einer weiteren Ausführungsform wird die Markierung gleichzeitig während eines Amplifikationsschritts bei der Herstellung der Proben-Nucleinsäuren eingebaut.
Somit liefern beispielsweise die Polymerasekettenreaktion (PCR) oder andere Nucleinsäureamplifikationsverfahren mit markierten Primern oder markierten Nucleotiden ein markiertes Amplifikationsprodukt. In einer weiteren Ausführungsform wird durch Transkriptionsamplifikation unter Verwendung eines markierten Nucleotids (z.B. Fluorescein-markiertes UTP und/oder CTP) eine Markierung in die transkribierten Nucleinsäuren eingebaut. Ein Amplifikationsprodukt kann auch oder alternativ nach Beendigung der Amplifikation markiert werden.
E) Beispiele für Oligonucleotide
Wie bereits vorstehend angemerkt und nachstehend ausführlich diskutiert werden Oligonucleotide für eine Vielzahl von Verwendungsmöglichkeiten verwendet, beispielsweise als Primer, Sonden, therapeutische oder andere "antisense"-Oligonucleotide und Triplex-Oligonucleotide. Zahlreiche weitere Verwendungsmöglichkeiten ergeben sich aus der vorliegenden Beschreibung. Tabelle 2 veranschaulicht bestimmte spezifische Oligonucleotide, die bei der Ausführung der Erfindung verwendet werden können. Natürlich können zahlreiche weitere nützliche erfindungsgemässe Oligonucleotide durch den Fachmann anhand der hier zur Verfügung gestellten Lehre synthetisiert werden.
In Tabelle 2 bedeutet "seq", dass der Primer zur Sequenzierung verwendet wurde oder dafür von Nutzen ist; "PCR" bedeu tet, dass der Primer zur PCR verwendet wurde oder dafür von Nutzen ist; "AS" bedeutet, dass der Primer zur "antisense"-Hemmung von Telomerase-Aktivität verwendet wurde oder dafür von Nutzen ist; "CL" bedeutet, dass der Primer zur Clonierung von Bereichen von hTRT-Genen oder RNA verwendet wurde oder dafür von Nutzen ist; "mut" bedeutet, dass der Primer zur Konstruktion von Mutanten von hTRT-Genen oder Genprodukten verwendet wurde oder für von Nutzen ist. "UC" bedeutet "Upper case" [Grossschreibung], und "lc" bedeutet "lower case" [Kleinschreibung]. Fehlpaarungen und Insertionen (relativ zu SEQ. ID Nr. 1) sind unterstrichen; Deletionen werden durch ein "-" angegeben.
Selbstverständlich soll keine der Angaben in Tabelle 2 eine Einschränkung der Verwendung eines bestimmten Oligonucleotids auf irgendeine Einzelverwendung oder einen Satz von Anwendungsmöglichkeiten beschränken.
EMI54.1
EMI55.1
EMI56.1
EMI57.1
EMI58.1
IV. TRT-Proteine und Peptide
A) Allgemeines
Die Erfindung stellt eine grosse Vielzahl von hTRT-Proteinen bereit, die unter anderem zur Hemmung von Telomerase-Aktivität in einer Zelle von Nutzen sind, zur Induktion einer anti-hTRT-Immunantwort, als ein therapeutisches Reagenz, als Standard oder Kontrolle in einem diagnostischen Assay, als ein Ziel beim Screenen nach Aktivierung oder Hemmung einer Aktivität von hTRT oder Telomerase und zahlreiche weitere Anwendungsmöglichkeiten sind entweder hier beschrieben oder für den Fachmann offensichtlich.
Zu den erfindungsgemässen hTRT-Proteinen gehören funktionell aktive Proteine (die z.B. zur Übertragung von Telomerase-Aktivität in eine Telomerase-negative Zelle von Nutzen sind) und Varianten, inaktive Varianten (die z.B. zur Hemmung von Telomerase-Aktivität in einer Zelle von Nutzen sind), hTRT-Polypeptide, Proteine und Telomerase-RNPs (z.B. die Proteine umfassenden Ribonucleoproteinkomplexe), die eine, verschiedene oder alle funktionelle Aktivitäten von natürlich vorkommender hTRT und Telomerase aufweisen, wie dies zur Veranschaulichung noch ausführlicher nachstehend diskutiert wird.
In einer Ausführungsform ist das erfindungsgemässe hTRT-Protein ein Polypeptid mit der Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2 (Fig. 17) oder ein Fragment davon. In einer weiteren Ausführungsform unterscheidet sich das hTRT-Polypeptid von SEQ. ID. Nr. 2 durch interne Deletion, Insertionen oder konservative Austausche von Aminosäureresten. In einer verwandten Ausführungsform stellt die Erfindung hTRT-Polypeptide bereit, die der SEQ. ID. Nr. 2 im wesentlichen gleichen. Die Erfindung stellt ferner hTRT-Polypeptide bereit, die bezogen auf die Aminosäuresequenz von SEQ. ID. Nr. 2 modifiziert sind, d.h. beispielsweise verkürzt, mutiert, derivatisiert oder an andere Sequenzen fusioniert sind (beispielsweise zur Bildung eines Fusionsproteins).
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung Telomerase-RNPs bereit, die ein erf indungsgemässes hTRT-Protein umfassen, das mit einer Matrizen-RNA einen Komplex bildet (z.B. hTR). In weiteren Ausführungsformen sind eines oder mehrere Telomerase-assoziierte Proteine mit einem hTRT-Protein und/oder hTR assoziiert.
Die Erfindung enz ist und n 8-20 oder 60-30 ist und q 1 bis 4 ist. In einer weiteren Ausführungsform weist der DNA-Primer ein 5 min -Ende auf, das zu der RNA-Matrize nicht komplementär ist, so dass bei Anlagerung das 5 min -Ende ungebunden bleibt. Zusätzliche Modifikationen von Standard-Assays bezüglich reverser Transkription, die bei den erfindungsgemässen Verfahren angewandt werden können, sind auf dem Fachgebiet bekannt.
b) Nucleolytische Aktivität
Nucleolytische Aktivität von Telomerase wird beispielsweise beschrieben in Morin, 1997, a.a.0. Collins und Grieder, Genes and development 7 (1993) 1364. Telomerase besitzt eine nucleolytische Aktivität (Joyce und Steitz, Trends Biochem. Sci. 12 (1987), 288), jedoch weist die Telomerase-Aktivität besondere Merkmale auf. Telomerase entfernt Nucleotide, üblicherweise nur eines, vom 3 min -Ende, wenn das 3 min -Ende der DNA an der 5 min -Grenze der DNA-Matrize positioniert ist. In Men schen und bei Tetrahymena ist dieses Nucleotid das erste G der Telomer-Wiederholungseinheit (TTAGG im Menschen). Telomerase entfernt bevorzugt G-Reste, weist jedoch keine nucleolytische Aktivität gegenüber anderen Nucleotiden auf. Diese Aktivität kann überwacht werden. Hier werden zur Veranschaulichung zwei unterschiedliche Verfahren beschrieben.
Ein Verfahren beinhaltet eine übliche Telomerase-Reaktion mit einem Primer, der die gesamte Matrizensequenz bindet (d.h. an der Matrizengrenze endet; -TAGGGATTAG im Menschen). Nucleolytische Aktivität wird durch Überwachung des Austauschs des letzten dG-Restes gegen ein in dem Assay zur Verfügung gestelltes radioaktiv markiertes dGTP nachgewiesen. Der Austausch wird durch Auftreten einer Bande mit der Grösse des Ausgangsprimers in der Gelelektrophorese und Autoradiographie überwacht.
In einem bevorzugten Verfahren wird ein DNA-Primer verwendet, der ein "blockiertes" 3 min -Ende aufweist, das durch Telomerase nicht verlängert werden kann. Der 3 min -blockierte Primer kann in Standard-Telomerase-Assays verwendet werden, er wird jedoch solange nicht verlängert, bis das 3 min -Nucleotid durch die nucleolytische Aktivität von Telomerase entfernt wird. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass Telomerase-Aktivität durch verschiedene Standardmassnahmen überwacht werden kann, und das Signal stark und leichter zu quantifizieren ist. Die Blockierung des 3 min -Endes des Primers kann auf verschiedene Weise erreicht werden. In einem Verfahren wird ein 3 min -Desoxy-dNTP-Rest an das 3 min -Ende des Primers unter Verwendung von Standard-Oligonucleotidsyntheseverfahren angefügt.
Dieses Ende weist ein 2 min OH auf, jedoch nicht das für Telomerase erforderliche 3 min OH. Es gibt noch weitere Möglichkeiten zur Blockierung des 3 min -Endes, beispielsweise die Verwendung eines 3 min -Didesoxy-Endes eines 3 min -Amin-Endes etc. Ein Beispiel für einen Primer für einen Assay bezüglich einer nucleolytischen Aktivität von hTRT ist 5 min -TTAGGGTTAGGGTTA (G3 min ), wobei der letzte Rest einem 3 min -Desoxy-guanosinrest entspricht (Glen Research, Sterling, VA). Dem Fachmann sind zahlreiche weitere Varianten bezüglich eines kleinen Primers, die auf der hier zur Verfügung gestellten Lehre basieren, bekannt.
c) Primer (Telomer)-Bindungsaktivität
Primer (Telomer)-Bindungsaktivität von Telomerase wird beispielsweise von Morin, 1997, a.a.O.; Collins et al., Cell 81 (1995), 667 und Harrington et al., J. Biol. Chem. 270 (1995), 8893 beschrieben. Man nimmt an, dass Telomerase zwei Stellen aufweist, die einen Telomer-DNA-Primer binden. Die mit der Primerbindung assoziierten RT-Motive zeigen, dass hTRT und/oder hTRT/hTR DNA-Primer-Bindungsaktivität aufweist. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, Primer-Bindungsaktivität zu bestimmen. Allerdings haben die meisten Verfahren einen Schritt gemeinsam, nämlich die Inkubation eines markierten DNA-Primers mit hTRT oder hTRT/hTR oder anderen TRT/TR-Kombinationen unter geeigneten Bindungsbedingungen. Die meisten Verfahren verwenden auch ein Mittel zur Abtrennung ungebundener DNA von Protein-gebundener DNA. Diese Verfahren beinhalten folgende Schritte:
i) Gel-"shift"-Assays (die auch als "electrophoretic/mobility shift"-Assays bezeichnet werden) sind Assays, bei denen ungebundener DNA-Primer von Protein-gebundenem DNA-Primer durch Elektrophorese in einem nicht-denaturierenden Gel abgetrennt wird (Ausubel et al., a.a.O).
ii) Matrixbindungs-Assays beinhalten verschiedene Variationen hinsichtlich des Grundverfahrens. Dazu gehören die Bindung der hTRT oder des hTRT/hTR-Komplexes an eine Matrix (z.B. Nitrocellulose) entweder vor oder nach Inkubation mit dem markierten Primer. Durch die Bindung der hTRT an eine Matrix kann der ungebundene Primer von dem gebundenen Primer mechanisch abgetrennt werden. Restliche ungebundene DNA kann durch Waschen der Membran vor der Quantifizierung entfernt werden. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass es ver schiedene Möglichkeiten zur Kopplung von Proteinen an solche Matrices, feste Träger und Membranen gibt, dazu gehören beispielsweise chemische, photochemische und UV-Quervernetzung, Antikörper/Epitop und nicht-kovalente, hydrophobe, (elektrostatische etc.) Interaktionen.
Als DNA-Primer kann jede DNA mit einer Affinität für Telomerase verwendet werden, beispielsweise ein Telomer-DNA-Primer, wie (TTAGGG)n, wobei n 1 bis 10 sein kann und typischerweise 3 bis 5 ist. Die 3 min - und 5 min -Enden können an jeder Position der Wiederholungssequenz enden. Die Primer können auch 5 min - oder 3 min -Verlängerungen von Nicht-Telomer-DNA aufweisen, die eine Markierung oder einen Nachweis erleichtern können. Die Primer können auch derivatisiert sein, um beispielsweise den Nachweis oder die Isolierung zu erleichtern.
d) dNTP-Bindungsaktivität
dNTP-Bindungsaktivität von Telomerase wird beispielsweise in Morin, 1997, a.a.O., und Spence et al., a.a.O. beschrieben. Telomerase benötigt für die Synthese von DNA dNTPs. Das hTRT-Protein weist eine Nucleotid-Bindungsaktivität auf und es kann hinsichtlich einer dNTP-Bindung ähnlich wie andere Nucleotid-bindende Proteine untersucht werden (Kantrowitz et al., Trends Biochem. Sci. 5 (1980), 124). Typischerweise wird die Bindung eines markierten dNTPs oder eines dNTP-Analogs überwacht, so wie dies auf dem Fachgebiet für Nicht-Telomerase-RT-Proteine bekannt ist.
e) RNA (d.h. hTR)-Bindungsaktivität
RNA (d.h. hTR)-Bindungsaktivität von Telomerase wird beispielsweise in Morin, 1997, a.a.O., beschrieben, Harrington et al., Science 275 (1997), 973 und Collins et al., Cell 81 (1995), 677. Die RNA-Bindungsaktivität eines erfindungsgemässen TRT-Proteins kann auf ähnliche Weise wie dies vorstehend bezüglich des DNA-Primer-Bindungsassays beschrieben wurde, unter Verwendung einer markierten RNA-Sonde nachgewiesen werden. Verfahren zur Abtrennung gebundener und nicht-gebundener RNA und zum Nachweis von RNA sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Diese können für die erfindungsgemässen Aktivitätsassays auf ähnliche Weise wie dies für den DNA-Primer-Bindungsassay beschrieben wurde, angewandt werden. Bei der RNA kann es sich um hTR mit vollständiger Länge handeln, Fragmente von hTR oder andere RNAs, für die gezeigt werden kann, dass sie eine Affinität für Telomerase oder hTRT aufweisen.
Siehe US-Patent Nr. 5 583 016 und PCT-Veröffentlichung Nr. 96/40 868 (siehe auch USSN 08/478 352, eingereicht am 7. Juni 1995).
3) Telomerase-Motive als Ziele
Wie bereits vorstehend angemerkt, stellt die vorliegende Erfindung hTRT-Polypeptide bereit, die nicht den vollen Satz (wie vorstehend beschrieben) an Telomerase-Aktivitäten von natürlich vorkommender Telomerase, hTRT oder anderen TRTProteinen aufweisen. Es ist angesichts der hier vorliegenden Beschreibung von RT und von Telomerase-spezifischen Motiven von TRT offensichtlich, dass Änderungen oder Mutationen von konservierten Aminosäureresten, die in den oben diskutierten Motivsequenzen gefunden werden können, zur Entstehung von Mutanten mit Aktivitätsverlusten führen, die für therapeutische Zwecke, zum Screenen und zur Charakterisierung von Arzneimitteln und für weitere Anwendungsmöglichkeiten von Nutzen sind.
Beispielsweise führt die Deletion der Motive B in den RT-Domänen des endogenen TRT-Gens in s. pombe, wie in Beispiel 1 beschrieben, zu haploiden Zellen, in denen eine progressive Telomerverkürzung bis zu dem Punkt, an dem eine Hybridisierung mit Telomer-Wiederholungseinheiten fast nicht mehr nachweisbar war, beobachtet werden konnte, was einen Verlust einer katalytischen Aktivität von Telomerase anzeigt. Auf ähnliche Weise können Änderungen in der WxGxS-Stelle von Motiv E die DNA-Primerbindung oder Funktion von Telomerase beeinflussen. Darüber hinaus können Änderungen der Aminosäuren in den Motiven A, B min und C die katalytische Aktivität von Telomerase beeinflussen. Die Mutation des DDMotivs von hTRT kann Telomerase-Aktivität erheblich verringern oder aufheben (siehe Beispiel 16).
C) Die Synthese von hTRT und anderen TRT-Polypeptiden
Die Erfindung stellt eine Reihe von Verfahren zur Herstellung der hier offenbarten hTRT und anderer TRT-Polypeptide bereit. In den folgenden Abschnitten wird die chemische Synthese und die rekombinante Expression von hTRT-Proteinen, einschliesslich Fusionsproteinen ausführlich beschrieben.
1) Chemische Synthese
Die Erfindung stellt hTRT-Polypeptide bereit, die ganz oder teilweise unter Verwendung von allgemeinen, auf dem Fachgebiet gut bekannten chemischen Verfahren synthetisiert wurden (siehe beispielsweise Caruthers et al., Nucleic Acids Res. Symp. Ser. (1980) 215-223 und Horn et al., Nucleic Acids Res. Symp. Ser. (1980), 225-232). Beispielsweise kann eine Peptidsynthese unter Verwendung verschiedener Festphasenverfahren durchgeführt werden (Roberge et al., Science 269 (1995) 202), darunter fällt auch die automatische Synthese (z.B. unter Verwendung des Peptid Synthesizers ABI 431A von Perkin Elmer gemäss den Anweisungen des Herstellers). Wenn ein Protein mit vollständiger Länge erwünscht ist, können kürzere Polypeptide durch Kondensation des Aminoterminus eines Moleküls mit dem Carboxylterminus des anderen Moleküls zur Bildung einer Peptidbindung fusioniert werden.
Die neu synthetisierten Peptide können wesentlich gereinigt werden, beispielsweise durch präparative HPLC (siehe beispielsweise Creighton Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York NY (1983). Die Zusammensetzung der synthetischen Peptide (oder beliebiger anderer erfindungsgemässer Peptide oder Polypeptide) kann durch Aminosäureanalyse oder Sequenzierung (z.B. das Verfahren des Edman-Abbaus; Creighton, a.a.O.) bestätigt werden. Es ist wichtig anzumerken, dass die Aminosäuresequenz von hTRT oder einem beliebigen Teil davon während der Synthese verändert werden kann und/oder unter Verwendung chemischer Verfahren mit Sequenzen von anderen Proteinen kombiniert werden kann.
Dies kann auch anderweitig durchgeführt werden und einen beliebigen Teil der Aminosäuresequenzen für jeden beliebigen Zweck zur Herstellung einer Variante der erfindungsgemässen Polypeptide umfassen.
2) Rekombinante Expression von hTRT und anderen Trtproteinen
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren, Reagenzien, Vektoren und Zellen bereit, die zur Expression von hTRT-Polypeptiden und Nucleinsäuren von Nutzen sind, wobei in vitro (zellfrei), ex vivo oder in vivo (auf Zellen oder Organismen basierende) rekombinante Expressionssysteme verwendet werden. In einer Ausführungsform umfasst die Expression des hTRT-Proteins oder eines Fragments davon die Insertion der codierenden Sequenz in einen geeigneten Expressionsvektor (d.h. ein Vektor, der die erforderlichen Elemente für die Transkription und Translation der inserierten codierenden Sequenz enthält).
Somit betrifft ein Aspekt der Erfindung die Bereitstellung eines Polynucleotids, das in der Sequenz im wesentlichen identisch ist zu einer ein hTRT-Gen codierenden Sequenz von mindestens 25 Nucleotiden und vorzugsweise für viele Anwendungsmöglichkeiten 50 bis 100 Nucleotiden oder mehr der erfindungsgemässen hTRT-cDNAs oder Gene, das zur Bildung einer Transkriptionseinheit, die ein hTRT-Polypeptid exprimieren kann, mit einem Promotor funktionell verknüpft ist. Zur Konstruktion der Expressionsvektoren, die eine durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte hTRTSequenz und geeignete Transkriptionskontrollen oder Translationskontrollen enthalten, können dem Fachmann gut bekannte Verfahren angewandt werden (siehe beispielsweise Sambrook et al., a.a.O., Ausubel et al., a.a.o. und die vorliegende Beschreibung).
Zu den erfindungsgemässen hTRT-Polypeptiden zählen Fusionsproteine, die hTRT-Polypeptide oder Fragmente des hTRTProteins enthalten. Die Fusionsproteine werden typischerweise rekombinant hergestellt, sie können jedoch auch chemisch synthetisiert werden. Fusionsproteine können zur Erzielung einer erhöhten Expression der hTRT-Polypeptidkonstrukte von Nutzen sein oder zur Herstellung von hTRT-Polypeptiden mit anderen gewünschten Eigenschaften beispielsweise eine Markierung umfassen (z.B. eine enzymatische Reportergruppe), eine bindende Gruppe oder ein Antikörper-Epitop umfassen. Ein Beispiel für ein Fusionsprotein, das hTRT und "enhanced green fluorescent protein" (EGFP)-Sequenzen umfasst, ist nachstehend in Beispiel 15 beschrieben.
Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass die in Beispiel 15 und an anderen Stellen hier diskutierten Verwendungen und Anwendungsmöglichkeiten nicht auf die spezifischen Fusionsproteine beschränkt sind, sondern die Verwendungsmöglichkeiten für die verschiedenen Fusionskonstrukte veranschaulichen sollen.
Die erfindungsgemässen Fusionsproteinsysteme können auch zur Erleichterung der effizienten Herstellung und Isolierung von hTRT-Proteinen oder Peptiden verwendet werden. Beispielsweise umfasst in einigen Ausführungsformen der Nicht-hTRT-Sequenzanteil des Fusionsproteins ein kurzes Peptid, das an ein immobilisiertes Molekül spezifisch gebunden werden kann, so dass das Fusionsprotein von nicht-gebundenen Bestandteilen (wie nicht verwandte Proteine in einem Zellysat) abgetrennt werden kann. Ein Beispiel dafür ist eine Peptidsequenz, die von einem spezifischen Antikörper gebunden wurde. Ein weiteres Beispiel ist ein Peptid, das Polyhistidin-Spuren umfasst, beispielsweise (His)6 oder Histidin-Tryptophan-Sequenzen, die durch ein Harz gebunden werden können, das Nickeloder Kupferionen enthält (d.h. Metallchelat-Affinitätschro matographie).
Zu weiteren Beispielen zählen Protein A-Domänen oder Fragmente, die die Reinigung auf immobilisierten Immunglobulin erlauben, und die in dem "FLAGS"-Verlängerungs/-Affinitäts-Reinigungssystem verwendete Domäne (Immunex Corp., Seattle WA). In einigen Ausführungsformen enthält das Fusionsprotein eine Spaltstelle, so dass die hTRT-Sequenz oder eine andere TRT-Polypeptidsequenz von der Nicht-hTRT-Peptidsequenz oder Nicht-hTRT-Proteinsequenz leicht abgetrennt werden kann. In diesem Fall kann die Spaltung chemisch erfolgen (z.B. mit Bromcyan, 2-(2-Nitrophenylsulfonyl)-3-methyl-3 min -bromindolen, Hydroxylamin oder niedriger pH-Wert) oder enzymatisch (z.B. mit Faktor Xa, Enterokinase). Die Auswahl des Fusions- und Spaltsystems kann teilweise von dem Anteil (d.h. der Sequenz) des zu exprimierenden hTRT-Polypeptids abhängen.
Fusionsproteine sind allgemein beschrieben in Ausubel et al., a.a.O., Kapitel 16, Kroll et al., DNA Cell. Biol. 12 (1993), 441 und in dem Invitrogen-Katalog von 1997 (Invitrogen Inc., San Diego CA). Weitere Beispiele für erfindungsgemässe Fusionsproteine mit Epitop-"tags" oder "tags" und Spaltstellen werden nachstehend in Beispiel 6 bereitgestellt.
Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass sich die in diesem Abschnitt diskutierten Expressionssysteme zwar auf die Expression von hTRT-Polypeptiden konzentrieren, jedoch die gleichen oder ähnliche Zellen, Vektoren und Verfahren zur Expression von erfindungsgemässen hTRT-Polypeptiden verwendet werden können, dazu gehören auch "sense"- und "antisense"-Polynucleotide, wobei die Herstellung von hTRT-Polypeptiden nicht notwendigerweise erwünscht ist. Typischerweise erfordert die Expression eines Polypeptids ein geeignetes Initiationscodon (z.B. Methionin), einen offenen Leserahmen und Translationsregulationssignale (z.B. eine Ribosomenbindungsstelle, ein Terminationscodon), die fehlen können, wenn die Translation einer Nucleinsäuresequenz zur Herstellung eines Proteins nicht erwünscht ist.
Die Expression von hTRT-Polypeptiden und Polynucleotiden kann durchgeführt werden, um die Vorteile zu nutzen, die mit den der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Vorteilen einhergehen. Ein Beispiel eines solchen Vorteils ist die Expression von hTRT-Polypeptiden, die im Anschluss daran von der Zelle, in der sie exprimiert wurden, isoliert werden (z.B. zur Herstellung grosser Mengen von hTRT zur Verwendung als ein Vakzin). Ein zweites Beispiel für einen solchen Vorteil ist die Expression von hTRT in einer Zelle zur Veränderung des Phänotyps der Zelle (wie bei Anwendungen in der Gentherapie).
Nicht-Säugerzellen können für die Expression von hTRT zur Reinigung verwendet werden, während eukaryotische Zellen, insbesondere Säugerzellen (z.B. menschliche Zellen) nicht nur für die Isolation und Reinigung von hTRT verwendet werden können, sondern auch zur Expression von hTRT, wenn eine Veränderung im Phänotyp in einer Zelle erwünscht ist (z.B. um eine Änderung in der Fähigkeit zur Proliferation z.B. bei Anwendungen in der Gentherapie zu erreichen). hTRT-Polypeptide mit einer oder mehreren Telomerase-Aktivitäten (z.B. der katalytischen Aktivität von Telomerase) können beispielsweise, allerdings ohne Beschränkung darauf, in einer Wirtszelle exprimiert werden, um so die Fähigkeit einer Zelle zur Proliferation zu erhöhen (z.B. um eine Zelle zu immortalisieren).
Im Gegensatz dazu können hTRT-"antisense"-Polynucleotide oder hemmende Polypeptide typischerweise zur Herabsetzung der Fähigkeit einer Zelle zur Proliferation exprimiert werden (z.B. bei einer Telomerase-positiven malignen Tumorzelle). Zahlreiche spezifische Anwendungsmöglichkeiten werden hier beschrieben, beispielsweise bei der nachstehenden Diskussion der Verwendungen der erfindungsgemässen Reagenzien und Verfahren für therapeutische Anwendungen.
Zu den Beispielen von nützlichen erfindungsgemässen Expressionssystemen (Zellen, regulatorische Elemente, Vektoren und Expression) gehören eine Reihe von zell-freien Systemen, wie beispielsweise ein Retikulocytenlysat und Weizenkeim-Sy steme, die hTRT-Polynucleotide gemäss allgemeiner, auf dem Fachgebiet gut bekannter Verfahren verwenden (siehe beispielsweise Ausubel et al., a.a.O., Kapitel 10). In alternativen Ausführungsformen stellt die Erfindung Reagenzien und Verfahren zur Expression von hTRT in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt somit Nucleinsäuren bereit, die hTRT-Polynucleotide codieren, Proteine, Protein-Untersequenzen oder Fusionsproteine, die in Bakterien, Pilzen, Pflanzen, Insekten und Tieren, einschliesslich Menschen, auf dem Fachgebiet bekannten Zellexpressionssystemen einschliesslich isolierter Zellen, Zellinien, Zellkulturen, Geweben und ganzen Organismen exprimiert werden können. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass die in eine Wirtszelle oder ein zellfreies Expressionssystem eingeführten hTRT-Polynucleotide üblicherweise mit einer geeigneten Expressionskontrollsequenz für jeden Wirt oder jedes zellfreie System funktionell verknüpft sind.
Zu den nützlichen bakteriellen Expressionssystemen gehören E. coli, Bacilli (wie beispielsweise Bacillus subtilis), andere Enterobacteriaceae (wie Salmonella, Serratia und zahlreiche Pseudomonasarten) oder andere bakterielle Wirte (z.B. Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Leuconostoc citrovorum, Leuconostoc mesenteroides", Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus lactis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve und Bifidobacterium longum). Zu den in Prokaryoten nützlichen hTRT-Expressionskonstrukten gehören rekombinante Bakteriophagen, Plasmid- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren oder ähnliche und diese beinhalten typischerweise Promotorsequenzen.
Zu den Beispielen für Promotoren zählen induzierbare Promotoren, wie der lac-Promotor, der Hybrid-lacZ-Promotor des "Bluescript7"-Phagemids (Stratagene, La Jolla CA) oder pSport1 (Gibco BRL); Promotorsysteme vom Phagen lambda; ein Tryptophan (trp)-Promotorsystem; ptrp-lac-Hybride etc. Die bakteriellen Expressionskonstrukte enthalten gegebenenfalls eine Ribosomenbindungsstelle und regulatorische Signalse quenzen für die Termination der Transkription. Zu den veranschaulichenden Beispielen von spezifischen Vektoren, die für die Expression von Nutzen sind, zählen pTrcHis2 (Invitrogen, San Diego CA) , pThioHis A, B & C und zahlreiche andere auf dem Fachgebiet bekannte Vektoren oder solche, die entwickelt werden können (siehe beispielsweise Ausubel, a.a.O.). Zu den für Bakterien nützlichen Vektoren gehören solche, die die Herstellung von hTRT-Fusionsproteinen erleichtern.
Zu den für die Expression von Fusionsproteinen in bakteriellen Zellen mit hohem Niveau nützlichen Vektoren zählen, allerdings ohne Beschränkung darauf, die multifunktionalen Clonierungs- und Expressionsvektoren für E. coli, beispielsweise der vorstehend erwähnte Bluescript7 (Stratagene), bei dem die ein hTRT-Protein, ein hTRT-Fusionsprotein oder ein hTRT-Fragment codierende Sequenz im Leserahmen mit Sequenzen für das aminoterminale Met und die sich daran anschliessenden 7 Reste der beta -Galactosidase in den Vektor ligiert werden kann, so dass ein Hybridprotein hergestellt wird (z.B. pIN-Vektoren; van Heeke und Schuster, J. Biol. Chem. 264 (1989), 5503). Vektoren, wie beispielsweise pGEX-Vektoren (z.B. pGEX-2TK; Pharmacia Biotech) können auch zur Expression von Fremdpolypeptiden wie einem hTRT-Protein als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase (GST) verwendet werden.
Solche Fusionsproteine können von lysierten Zellen durch Adsorption an Glutathion-Agarose-Kügelchen und anschliessender Elution in Gegenwart von freiem Glutathion gereinigt werden. In solchen Systemen hergestellte Proteine enthalten oft Protease-Spaltstellen für Enterokinase, Thrombin oder Faktor Xa, so dass das erwünschte clonierte Polypeptid von der GST-Einheit, falls erwünscht, freigesetzt werden kann, was bei der Reinigung oder anderen Anwendungsmöglichkeiten von Nutzen ist. Weitere Beispiele sind Fusionsproteine, die hTRT und das Maltose-bindende Protein von E. coli (MBP) oder Thioredoxin von E. coli umfassen. Veranschaulichende Beispiele von in bakteriellen Zellen nützlichen hTRT-Expressionskonstrukten werden in dem nachstehenden Beispiel 6 bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner hTRT-Polypeptide zur Verfügung, die in Pilzsystemen wie beispielsweise Dictyostelium und vorzugsweise Hefe wie beispielsweise Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Torulopsi holmil, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces lactis, Hansenula polymorpha und Candida pseudotropicalis exprimiert wurden. Für die Expression von hTRT in Hefe stehen eine Reihe von geeigneten Vektoren zur Verfügung, zu denen Plasmid- und YACs-Vektoren gehören (YACs = künstliche Hefechromosomen). Die Vektoren enthalten typischerweise Expressionskontrollsequenzen, wie z.B. konstitutive oder induzierbare Promotoren (z.B. den alpha -Faktor, Alkoholoxidase, PGH und 3-Phosphoglyceratkinase oder andere glykolytische Enzyme), einen Replikationsursprung, Terminationssequenzen etc., je nachdem, was erwünscht ist.
Zu den zur Verwendung in Pichia geeigneten Vektoren gehören pPICZ, His6/pPICZB, pPICZalpha, pPIC3.5K, pPIC9K, pA0815, pGAP2A, B & C, pGAP2alpha A, B und C (Invitrogen, San Diego, CA) und zahlreiche weitere auf dem Fachgebiet bekannte oder noch zu entwickelnde Vektoren. In einer Ausführungsform wird der Vektor His6/pPICZB (Invitrogen, San Diego, CA) zur Expression eines His6-hTRT-Fusionsproteins in der Hefe Pichia pastoris verwendet. pYES2 (Invitrogen, San Diego, CA) ist ein Beispiel für einen in Saccharomyces nützlichen Vektor. Veranschaulichende Beispiele von in Hefe nützlichen hTRT-Expressionskonstrukten werden in dem nachstehenden Beispiel 6 bereitgestellt.
Die erfindungsgemässen hTRT-Polypeptide können auch in Pflanzenzellensystemen exprimiert werden, die mit Pflanzen- oder Pflanzenvirus-Expressionsvektoren (z.B. mit Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) transfiziert oder mit bakteriellen Expressionsvektoren (Ti oder dem Plasmid pBR322) transformiert wurden. In Fällen, bei den Pflanzenvirus-Expressionsvektoren verwendet werden, kann die Expression einer hTRT-codierenden Sequenz durch eine Reihe von Promotoren gesteuert werden. Beispielsweise können virale Promotoren wie die 35S und 19S-Promotoren von CaMV (Brisson et al. Nature 310 (1984) 511-514) allein oder in Kombination mit der Omega Leader-Sequenz von TMV verwendet werden (Takamatsu et al., EMBO J. 6 (1987) 307-311).
In einer alternativen Ausführungsform können Pflanzenpromotoren wie der Promotor von dem Gen für die kleine Untereinheit von RUBISCO (Coruzzi et al., EMBO J. 3 (1984) 1671 bis 1680 und Broglie et al., Science 224 (1984), 838-843) oder Hitzeschockpromotoren (Winter und Sinibaldi, Results Probl. Cell Differ. 17 (1991), 85) oder Promotoren von Genen für Speicherproteine verwendet werden. Diese Konstrukte können durch direkte DNATransformation oder pathogen-vermittelte Transfektion in Pflanzenzellen eingeführt werden (zum weiteren Studium dieser Verfahren sei verwiesen auf Hobbs oder Murry (1992) in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill New York NY, S. 191-196 (1992), oder Weissbach und Weissbach (1988), Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, New York NY, S. 421-463).
Ein weiteres, durch die vorliegende Erfindung bereitgestelltes Expressionssystem zur Expression eines hTRT-Proteins ist ein Insektensystem. Bei einem bevorzugten System wird ein Baculovirus-Polyhedrin-Promotor verwendet. In einem dieser Systeme wird der nucleäre Polyhedrosis-Virus von Autographa californica (AcNPV) als Vektor zur Expression von Fremdgenen in Spodoptera frugiperda-Zellen oder in Trichoplusia-Larven verwendet. Die das gewünschte Gen codierende Sequenz kann in einen nicht-essentiellen Bereich des Virus, beispielsweise das Polyhedringen, cloniert werden und unter die Kontrolle des Polyhedrinpromotors gestellt werden. Die erfolgreiche Insertion der Sequenz, die beispielsweise das hTRT-Protein codiert, führt zur Inaktivierung des Polyhedringens und es wird ein rekombinantes Virus hergestellt, dem das Hüllprotein fehlt.
Die rekombinanten Viren werden dann zur Infektion von S. frugiperda-Zellen oder Trichoplusia-Larven verwendet, in denen dann die hTRT-Sequenz exprimiert wird (siehe bezüglich allgemeiner Verfahren Smith et al., J. Virol. 46 (1983), 584 und Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91 (1994) 3224-7). Zu den für die BaculovirusExpression nützlichen Vektoren zählen pBlueBacHis2 A, B & C; pBlueBac4.5; pMelBacB und zahlreiche andere auf dem Fachgebiet bekannte Vektoren oder noch zu entwickelnde Vektoren. Veranschaulichende Beispiele von hTRT-Expressions-Konstrukten, die in Insektenzellen von Nutzen sind, werden in dem nachstehenden Beispiel 6 bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Expressionssysteme in Säugern und Säugerzellen bereit. Wie bereits vorstehend angemerkt, können hTRT-Polynucleotide in Säugerzellen (z.B. menschlichen Zellen) für die Herstellung von signifikanten Mengen von hTRT-Polypeptiden (z.B. zur Reinigung) oder zur Veränderung des Phänotyps einer Zielzelle (z.B. für Zwecke der Gentherapie, Zellimmortilisation etc.) exprimiert werden. Im letzteren Fall kann das exprimierte hTRT-Polynucleotid ein Polypeptid mit einer katalytischen Aktivität von Telomerase codieren oder auch nicht. Das heisst, es kann ein "sense"- oder "antisense"-Polynucleotid, ein hemmendes oder stimulierendes Polypeptid, ein Polypeptid mit null, einer oder mehreren Telomerase-Aktivitäten exprimiert werden. weitere Kombinationen und Varianten sind für den Fachmann nach Lesen dieser Beschreibung offensichtlich.
Zu den für die Expression der erfindungsgemässen Nucleinsäuren geeigneten Gewebekultur-Säugerzellen gehören jede normale sterbliche, normale oder abnorme unsterbliche tierische oder menschliche Zelle. Dazu gehören: die mit SV40 transformierte Affennierenlinie CV1 (COS-7, ATCC CRL 1651), die menschliche embrionale Nierenlinie (293) (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977), 59), die Babyhamsternierenzellen (BHK, ATCC CCL 10), CHO (ATCC CCL 61 und CRL 9618), Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol.
Reprod. 23 (1980) 243-251), Affennierenzellen (CV1, ATCC CCL 70), Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL 1587), menschliche Cervix-Karzinomzellen (HeLa, ATCC CCL 2), Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34), Büffelrattenleberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442), menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75), menschliche Leberzellen (HEP G2, HB 8065), Maus-Brusttumor (MMT 060562, ATCC CCL 51) und TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982), 44-46, MDCK (ATCC CCL 34 und CRL 6253), HEK 293 (ATCC CRL 1573), WI-38 (ATCC CCL 75) (ATCC: American Type Culture Collection Rockville, MD)). Die Verwendung von Säuger-Gewebezellkulturen zur Expression von Polypeptiden wird allgemein in Winnacker, FROM GENES TO CLONES (VCH-Verlag, N.Y., N.Y., 1987) erläutert.
Für Säugerwirtszellen werden auf Viren basierende und nichtvirale Expressionssysteme bereitgestellt. Zu den nicht-viralen Vektoren und Systemen gehören Plasmide, episomale Vektoren, typischerweise mit einer Expressionskassette für Expression eines Proteins oder einer RNA, und menschliche künstliche Chromosomen (siehe z.B. Harrington et al., Nat Genet 15 (1997), 345).
Zu den für die Expression von hTRT-Polynucleotiden und Polypeptiden in Säugerzellen (z.B. menschlichen Zellen) nützlichen nicht-viralen Vektoren gehören pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C (Invitrogen, San Diego CA), MPSV-Vektoren, andere in dem Invitrogen-Katalog von 1997 beschriebene Vektoren (Invitrogen Inc., San Diego CA), der aufgrund der Bezugnahme vollständig zum Offenbarungsgehalt der vorliegenden Beschreibung zählt, sowie bezüglich weiterer Proteine zahlreiche andere auf dem Fachgebiet bekannte Vektoren und Systeme. Veranschaulichende Beispiele von in Säugerzellen nützlichen hTRT-Expressionskonstrukten werden nachstehend in Beispiel 6 bereitgestellt.
Zu den nützlichen viralen Vektoren zählen Vektoren, die auf Retroviren basieren, Adenoviren, adeno-assoziierte Viren, Herpesviren, auf SV40 basierende Vektoren, Papilloma Viren, HBP-Epstein Barr Virus, Vaccinia Virus-Vektoren und "Semliki Forest"-Virus (SFV). SFV und Vacciniavektoren werden allgemein in Ausubel et al., a.a.O., Kapitel 16 diskutiert. Diese Vektoren sind oft aus zwei Komponenten aufgebaut, einem mo difizierten viralen Genom und einer dieses umgebenden Hüll-Struktur (siehe allgemein Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49 (1995), 807). Allerdings werden gelegentlich virale Vektoren in nackter Form oder umhüllt mit Proteinen, die nicht zu viralen Proteinen zählen, eingeführt. Die virale Nucleinsäure in einem Vektor kann jedoch auf vielfältige Weise verändert werden, beispielsweise wenn dies für die Gentherapie erwünscht ist.
Ziele dieser Veränderungen sind das Wachstum des Virus in Zielzellen zu verhindern und Beibehaltung seiner Fähigkeit in Vektorform in verfügbaren Pack- oder Helferzellen zu wachsen, um Raum innerhalb des viralen Genoms zur Insertion von exogenen DNA-Sequenzen bereitzustellen und um neue Sequenzen einzufügen, die das gewünschte Gen codieren und eine geeignete Expression ermöglichen. Somit umfassen Vektor-Nucleinsäuren im allgemeinen zwei Bestandteile: essentielle in cis wirkende Viralsequenzen zur Replikation und Verpackung in einer Helferlinie und die Transkriptionseinheit für das exogene Gen. Andere virale Funktionen werden in einer spezifischen Verpackungs- oder Helfer-Zellinie in trans exprimiert.
Adenovirus-Vektoren (z.B. zur Verwendung in der Gentherapie bei Menschen) sind beispielsweise in Rosenfeld et al., Cell 68 (1992), 143 und in den PCT-Veröffentlichungen Wo 94/12 650; 94/12 649 und 94/12 629 beschrieben. In Fällen, in denen als Expressionsvektor ein Adenovirus verwendet wird, kann eine hTRT codierende Sequenz in einen Adenovirus-Transkriptions/Translations-Komplex ligiert werden, der aus dem späten Promotor und der dreiteiligen Leadersequenz besteht. Die Insertion in einen nicht-essentiellen E1- oder E3-Bereich des viralen Genoms ergibt ein lebensfähiges Virus, das in infizierten Wirtszellen exprimieren kann (Logan und Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. 81 (1984), 3655). Replikations-defiziente retrovirale Vektoren, die eine therapeutische Polynucleotidsequenz als Teil des retroviralen Genoms enthalten, werden beispielsweise beschrieben in Miller et al., Mol. Cell.
Biol. 10 (1990) 4239; Kolberg, J. NIH Res. 4 (1992), 43 und Cornette et al., Hum. Gene Ther. 2 (1991), 215.
In Säuger-Zellsystemen sind oft Promotoren von Säugergenen oder Säugerviren geeignet. Geeignete Promotoren können konstitutiv sein, Zelltyp-spezifisch, Stadium-spezifisch und/oder modulierbar oder regulierbar (z.B. durch Hormone, wie beispielsweise Glucocorticoide). Zu nützlichen Promotoren zählen, jedoch ohne Beschränkung darauf, der Metallothionein-Promotor, der konstitutive "Major late"-Promotor von Adenovirus, der Dexamethason-induzierbare MMTV, der SV40-Promotor, der MRP polIII-Promotor, der konstitutive MPSV-Promotor, der Tetracyclin-induzierbare CMV-Promotor (wie beispielsweise der menschliche "immediate-early" CMV-Promotor), der konstitutive CMV-Promotor und auf dem Fachgebiet bekannte Promotor-Enhancer-Kombinationen.
Für eine effiziente Expression eines hTRT-Polynucleotids und/oder die Translation einer hTRT-Proteine codierenden Sequenz können auch weitere regulatorische Elemente erforderlich oder erwünscht sein. Für die Translation beinhalten diese Elemente typischerweise ein ATG-Initiationscodon und eine benachbarte Ribosomen-Bindungsstelle oder andere Sequenzen. Für das hTRT-Protein codierende Sequenzen sind, falls dessen Initiationscodon und stromaufwärts gelegene Promotorsequenzen in einen Expressionsvektor inseriert sind, keine zusätzlichen Translationssignale oder andere Kontrollsignale erforderlich. In Fällen jedoch, in denen nur eine codierende Sequenz oder ein Teil davon inseriert ist, müssen oft exogene Transkriptions- und/oder Translations-Kontrollsignale (z.B. der Promotor, die Ribosomenbindungsstelle und das ATG-Initiationscodon) bereitgestellt werden.
Darüber hinaus muss das Initiationscodon typischerweise im korrekten Leserahmen vorliegen, um die Translation des gewünschten Proteins zu gewährleisten. Exogene Transkriptionselemente und Initiationscodons können von zahlreichen Quellen, sowohl natürlichen als auch synthetischen, stammen. Zusätzlich kann die Effizienz der Expression durch die Einfügung von für das verwendete Zellsystem geeigneten Enhancern verstärkt werden (Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20 (1994), 125 und Bittner et al., Meth. Enzymol. 153 (1987), 516). Beispielsweise kann zur Steigerung der Expression in Säuger-Wirtszellen der SV40-Enhancer oder der CMV-Enhancer verwendet werden.
Die Expression von hTRT-Genprodukten kann auch durch Aktivierung eines hTRT-Promotors oder Enhancers in einer Zelle, wie beispielsweise einer menschlichen Zelle, z.B. einer Telomerase-negativen Zellinie, bewirkt (erhöht) werden. Die Aktivierung kann durch eine Reihe von unterschiedlichen Massnahmen erreicht werden. Dazu zählen die Verabreichung eines einen exogenen Promotor aktivierenden Agens oder die Hemmung eines zellulären Bestandteils, der die Expression des hTRT-Gens unterdrückt. Natürlich wird umgekehrt die Hemmung der Promotorfunktion, so wie dies nachstehend beschrieben ist, die hTRT-Genexpression herabsetzen.
Die Erfindung stellt die induzierbare und reprimierbare Expression von hTRT-Polypeptiden unter Verwendung solcher Systeme wie des Ecdyson-induzierbaren Expressionssystems (Invitrogen) und die "Tet-On and Tet-off" Tetracyclin-regulierten Systeme von Clontech bereit. Bei dem durch Ecdyson induzierbaren Expressionssystem wird ein Analogon des Steroidhormons Ecdyson, Muristeron A zur Aktivierung der Expression eines rekombinanten Proteins über einen heterodimären nucleären Rezeptor verwendet (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 3346). In einer Ausführungsform wird hTRT in den pIND-Vektor (Clontech) cloniert, der fünf modifizierte Ecdyson-Reaktionselemente (E/GREs) stromaufwärts eines minimalen Hitzeschockpromotors und der Mehrfachclonierungsstelle enthält. Dieses Konstrukt wird dann in den Ecdyson-Rezeptor stabil exprimierenden Zellinien transfiziert.
Nach der Transfektion werden die Zellen zur Induktion der intrazellulären Expression von pIND mit Muristeron A behandelt. In einer anderen Ausführungsform wird das hTRT-Polypeptid unter Verwendung der "Tet-on and Tet-off"-Expres sionssysteme (Clontech) neben den beschriebenen regulierten Hochniveau-Genexpressionssystemen exprimiert (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5547 und Gossen et al., Science 268 (1995), 1766).
Die erfindungsgemässen hTRT-Vektoren können in eine Zelle, ein Gewebe, Organ, einen Patienten oder ein Tier durch eine Reihe von Verfahren eingeführt werden. Die erfindungsgemässen Nucleinsäureexpressionsvektoren (typischerweise dsDNA) können in die gewählte Wirtszelle durch allgemein bekannte Verfahren wie die Calciumchlorid-Transformation (für bakterielle Systeme), Elektroporation, Calciumphosphat-Behandlung, Liposomen-vermittelte Transformation, Injektion und Mikroinjektion, ballistische Verfahren, Virosomen, Immunoliposomen, Polykation:Nucleinsäure-Konjugate, nackte DNA, künstliche Virione, Fusion an das Herpesvirus-Strukturprotein VP22 (Elliot und O'Hare, Cell 88, 223) durch Agens-verstärkte Aufnahme von DNA und ex-vivo-Transduktion transferiert werden.
Nützliche Liposomen-vermittelte DNA-Transferverfahren sind in den US-Patenten Nr. 5 049 386, 4 946 787 und 4 897 355, in den PCT-Veröffentlichungen WO 91/17 424 und WO 91/16 024 beschrieben sowie in Wang und Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 147 (1987), 980; Wang und Huang, Biochemistry 28 (1989), 9508; Litzinger und Huang, Biochem. Biophys. Acta 1113 (1992), 201; Gao und Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 179 (1991), 280. Immunliposomen als Träger für exogene Polynucleotide wurden ebenfalls beschrieben (Wang und Huang, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7851 und Trubetskoy et al., Biochem. Biophys. Acta 1131 (1992), 311). Diese dürften im Vergleich zu Liposomen eine verbesserte Zelltyp-Spezifität aufgrund des Einschlusses von spezifischen Antikörpern, die vermutlich an Oberflächenantigene auf spezifischen Zelltypen binden, verbesserte Zelltypenspezifität aufweisen.
Behr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 6982, berichten über die Verwendung von Lipopolyamin als ein Reagenz zur Vermittlung der Transfektion selbst" wobei es nicht nötig ist, zur Bildung von Liposomen irgendein zusätzliches Phospholipid zuzugeben. Geeignete Einführungsverfahren können vom Fachmann im Hinblick auf geeignete Praktiken und Erfordernisse bezüglich der Regulation (z.B. zur Gentherapie oder zur Herstellung von Zellinien zur Expression von rekombinanten Proteinen) ausgewählt werden. Natürlich können die oben aufgezählten Einführungsverfahren auch zum Transfer von Nucleinsäuren in Zellen für die Gentherapie, den Transfer in Gewebekulturzellen etc. verwendet werden.
Für die langfristige Herstellung von rekombinanten Proteinen mit hoher Ausbeute ist oft eine stabile Expression erwünscht. Beispielsweise können hTRT stabil exprimierende Zellinien unter Verwendung der erfindungsgemässen Expressionsvektoren hergestellt werden, die virale Replikationsursprünge oder endogene Expressionselemente und ein selektierbares Markergen enthalten. Nach der Einschleusung des Vektors kann man die Zellen 1 bis 2 Tage in angereicherten Medien wachsen lassen, bevor man zu Selektivmedien wechselt. Der selektierbare Marker dient dazu, zur Selektion eine Resistenz zu verleihen. Seine Gegenwart erlaubt das Wachstum von Zellen, die die eingeschleusten Sequenzen in Selektivmedien erfolgreich exprimieren. Resistente und stabil transfizierte Zellen können unter Verwendung von für den entsprechenden Zelltyp geeigneten Gewebekulturverfahren vermehrt werden.
Ein Amplifikationsschritt kann eingefügt werden, beispielsweise durch Verabreichung von Methyltrexat an mit einem DHFR-Gen transfizierten Zellen gemäss auf dem Fachgebiet allgemein bekannter Verfahren.
Zusätzlich kann ein Wirtszellstamm gewählt werden hinsichtlich seiner Fähigkeit, die Expression der inserierten Sequenzen zu modulieren oder das exprimierte Protein auf die gewünschte Weise zu prozessieren. Zu solchen Modifikationen des Polypeptids zählen, allerdings ohne Beschränkung darauf, Acetylierung, Carboxylierung, Phosphorylierung, Lipidierung und Acylierung. Die post-translationale Prozessierung kann auch für die korrekte Insertion, Faltung und/oder Funktion wichtig sein. Die verschiedenen Wirtszellen verfügen über eine zelluläre Maschinerie und charakteristische Mechanismen für solche post-translationale Aktivitäten, die für jede Zelle spezifisch sind. Somit kann eine bestimmte Zelle zur Gewährleistung der korrekten Modifikation und Prozessierung des eingeschleusten Fremdproteins gewählt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch transgene Tiere (d.h. Säuger, die bezüglich einer menschlichen oder anderen TRT-Gensequenz transgen sind), bereit, die ein hTRT- oder ein anderes TRT-Polynucleotid oder Polypeptid exprimieren. In einer Ausführungsform wird hTRT in der Milch eines transgenen Säugers, wie beispielsweise eines transgenen Rinds, einer Ziege oder eines Kaninchens, sezerniert. Verfahren zur Herstellung solcher Tiere können beispielsweise in Heyneker et al., PCT WO 91/08 216 gefunden werden.
Die erfindungsgemässen hTRT-Proteine und Komplexe, zu denen die durch die vorstehend beschriebenen Expressionssysteme hergestellten zählen, könnnen unter Verwendung einer Reihe von allgemeinen, auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren in Übereinstimmung mit den durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten spezifischen Verfahren (wie beispielsweise nachstehend beschrieben) gereinigt werden. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass nach chemischer Synthese, biologischer Expression oder Reinigung das hTRT-Protein eine Konformation besitzen kann, die sich von der nativen Konformation von natürlich vorkommender Telomerase unterscheidet.
In einigen Fällen mag es hilfreich oder sogar nötig sein, das Polypeptid zu denaturieren (was beispielsweise die Reduktion von Disulfid- oder anderen Bindungen beinhalten kann) und danach das Polypeptid zu einer Rückfaltung in die bevorzugte Konformation zu bringen. Eine korrekte Rückfaltung kann auch die Gegenwart von hTR (oder hTR-Fragmenten) erforderlich machen. Verfahren zur Reduktion und Denaturierung von Proteinen und zur Induktion der Rückfaltung sind dem Fachmann bekannt (siehe beispielsweise Debinski et al. J. Biol. Chem. 268 (1993), 14065; Kreitman und Pastan, Bioconjug. Chem. 4 (1993), 581; und Buchner et al. Anal Biochem. 205 (1992), 263 und McCaman et al., J. Biotech. 2 (1985), 177). (Siehe auch USSN 08/478 352, eingereicht am 7. Juni 1995, a.a.O.).
D.
Komplexe aus menschlicher TRT und menschlicher Telomeplase-RNA, Telomerase-assoziierten
Proteinen und anderen Biomolekülen, die durch Coexpression und andere Mittel hergestellt werden
Erfindungsgemässe hTRT-Polypeptide können in vivo und in vitro mit anderen Biomolekülen assoziieren, wozu RNAs (z.B. hTR), Proteine (z.B. Telomerase-assoziierte Proteine), DNA (z.B. Telomer-DNA, [T2AG3]N) und Nucleotide wie (Desoxy)ribonucleotid-triphosphate gehören. Diese Assoziationen können dazu verwendet werden, um die Anwesenheit oder Funktion von hTRT nachzuweisen, um hTRT oder Telomerase-assoziierte Moleküle zu identifizieren oder zu reinigen und um die Struktur oder Funktion von hTRT oder Telomerase gemäss den erfindungsgemässen Verfahren zu analysieren.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung hTRT bereit, das mit einer Nucleinsäure, üblicherweise einer RNA einen Komplex bildet (z.B. damit assoziiert oder daran gebunden ist). In einer Ausführungsform kann die gebundene RNA als eine Matrize für eine Telomerase-vermittelte DNA-Synthese fungieren. Zu den Beispielen für RNAs, die mit dem hTRT-Polypeptid einen Komplex bilden können, zählen eine natürlich vorkommende Wirtszell-Telomerase-RNA, eine menschliche Telomerase-RNA (z.B. hTR; US-Patent Nr. 5 583 016), eine hTR-Untersequenz oder -Domäne, eine synthetische RNA oder andere RNAs. Der RNA-hTRT-Proteinkomplex (ein RNP) weist typischerweise eine oder mehrere Telomerase-Aktivitäten auf, beispielsweise katalytische Aktivitäten von Telomerase.
Diese hTRT-hTR-RNPs (oder andere hTRT-RNA-Komplexe) können mittels einer Reihe von Verfahren, wie sie nachstehend zur Veranschaulichung beschrieben sind, hergestellt werden, dazu gehören in vitro-Rekonstitution und Coexpression von hTRT und hTR (und einer anderen RNA) in vitro (d.h. in einem zellfreien System) in vivo oder ex vivo.
Somit stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform einen hTRT-hTR-Komplex (oder einen anderen hTRT-RNAKomplex) bereit, der in vitro durch Mischen getrennt gereinigter Bestandteile gebildet wurde ("in vitro-Rekonstitution"; siehe beispielsweise US-Patent Nr 5 583 016 bezüglich einer Beschreibung der Rekonstitution und USSN 08/478 352, eingereicht am 7. Juni 1995; siehe auch Autexier et al., EMBO J. 15; 5928).
In einer alternativen Ausführungsform stellt die Erfindung Telomerase-RNPs bereit, die duch Coexpression des hTRT-Polypeptids und einer RNA (z.B. hTR) in vitro in einem zellfreien Transkriptions/Translations-System (z.B. Weizenkeimlysat oder Kaninchen-Reticulocytenlysat) hergestellt wurden. Wie in Beispiel 7 gezeigt, führt die Coexpression eines rekombinanten hTRT-Polypeptids und von hTR in vitro zur Herstellung von katalytischer Aktivität von Telomerase (gemessen durch einen TRAP-Assay).
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus Telomerase-RNPs bereit, die durch Expression des hTRT-Polypeptids in einer Zelle, beispielsweise einer Säugerzelle, hergestellt werden, in der hTR natürlicherweise exprimiert wird, oder in die hTR (oder eine andere RNA, die mit dem hTRT-Protein einen Komplex bilden kann) eingeführt wird, oder durch Rekombination exprimiert wird. Somit wird in einer Ausführungsform hTRT in einer Telomerase-negativen menschlichen Zelle, in der hTR vorhanden ist (z.B. BJ- oder IMP90-Zellen) exprimiert, was die Assemblierung beider Moleküle zu einem RNP erlaubt. In einer weiteren Ausführungsform wird hTRT in einer menschlichen oder nicht-menschlichen Zelle, in der hTR rekombinant exprimiert wird, exprimiert. Verfahren zur Expression von hTR in einer Zelle können in dem US-Patent 5,583,016 gefunden werden.
Der Clon pGRN33, der eine die RNA-Komponente von Telomerase codierende cDNA enthält, wurde ferner hinterlegt (ATCC 75926). Die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase codierenden genomischen Sequenzen wurden als 15 kb SauIIIA1 bis HindIII-Insertion des Clons 28-1 hinterlegt (ATCC 75925). Zur Expression in eukaryotischen Zellen wird die hTRT-Sequenz typischerweise mit einer Transkriptions-Initiationssequenz (RNA-Polymerase-Bindungsstelle) und Transkriptions-Terminationssequenzen funktionell verknüpft (siehe beispielsweise PCT-Veröffentlichung WO 96/01 835; Feng et al., Science 269 (1995), 1236).
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus rekombinant hergestellte oder im wesentlichen gereinigte hTRT-Polypeptide bereit, die mit sogenannten "Telomerase-assoziierten Proteinen" coexprimiert und/oder assoziiert sind. Somit stellt die vorliegende Erfindung hTRT bereit, das mit anderen Proteinen (z.B. Telomerase-assoziierten Proteinen) coexprimiert wird oder mit diesen einen Komplex bildet. Unter Telomerase-assoziierten Proteinen versteht man solche Proteine, die mit menschlicher Telomerase mit aufgereinigt werden und/oder eine Rolle bei der Modulation der Telomerasefunktion oder -Aktivität spielen können, beispielsweise dadurch, dass sie an der Assoziation von Telomerase mit Telomer-DNA beteiligt sind.
Zu den Beispielen für Telomerase-assoziierte Proteine gehören (jedoch ohne Beschränkung darauf) die folgenden Proteine und/oder ihre menschlichen Homologe: Nucleolin (siehe die parallele US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/833 377 und Srivastava et al., FEBS Letts. 250 (1989), 99); EF2H (das Homolog zum Elongationsfaktor 2; siehe die parallele US-Patentanmeldung Nr. 08/833 377 und Nomura et al., DNA Res. (Japan) 1 (1994), 27, GENBANK Zugangsnummer #D21163), TP1/TLP1 (Harrington et al., Science 275 (1997), 973); Nakayama et al., Cell 88 (1997), 875; das menschliche Homolog zu Tetrahymena p95 (Collins et al., Cell 81 (1995) 677); TPC2 (ein die Telomer länge regulierendes Protein; ATCC-Zugangsnummer 97708 (siehe USSN 08/710 249 und 08/713 922, beide am 13.
September 1996 eingereicht)), TPC3 (ebenfalls ein die Telomerlänge regulierendes Protein; ATCC-Zugangsnummer 97707 (siehe USSN 08/710 249 und 08/713 922, beide eingereicht am 13. September 1996)), DNA-bindendes Protein B (dbpB; Horwitz et al., J. Biol. Chem. 269 (1994), 14130) und der die Telomer-Wiederholungseinheit bindende Faktor (TRF 1 & 2; Chang et al., Science 270 (1995), 1663; Chong et al., Hum. Mol. Genet. 6 (1997), 69; EST1, 3 und 4 (Lendvay et al., Genetics 144 (1996), 1399; Nugent et al., Science 274 (1996), 249 und Lundblad et al., Cell 57 (1989), 633) und der "End-capping"-Faktor (Cardenas et al., Genes Dev. 7 (1993), 883).
Telomerase-assoziierte Proteine können auf der Basis der Mitaufreinigung mit oder der Bindung an hTRT-Protein oder das hTRT-hTR-RNP identifziert werden. In einer alternativen Ausführungsform können sie auf der Basis der Bindung an ein hTRT-Fusionsprotein, beispielsweise ein GST-hTRT-Fusionsprotein etc. identifiziert werden, wie dies durch Affinitätsreinigung erfolgen kann (siehe Ausubel et al., Kapitel 20). Ein besonders nützliches Verfahren zur Bestimmung von Protein/Protein-Interaktionen und zur Identifizierung von hTR-T-assoziierten Proteinen ist das "two hybrid screen"-Verfahren von Chien et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 9578; siehe auch Ausubel et al., a.a.O., Kapitel 20).
Durch dieses Screenen können Protein/Protein-Interaktionen in vivo durch Rekonstitution eines Transkriptionsaktivators, dem Hefe-Ga14-Transkriptionsprotein identifiziert werden (siehe Fields und Song, Nature 340 (1989), 245). Dieses Verfahren basiert auf den Eigenschaften des Hefe-Ga14-Proteins, das aus trennbaren Domänen besteht, die für die DNA-Bindung und transkriptionelle Aktivierung verantwortlich sind. "Two hybrid"-Proteine codierende Polynucleotide, üblicherweise Expressionsvektoren, werden konstruiert. Ein Polynucleotid umfasst die Hefe-Ga14-DNA-bindende Domäne, die an eine Polypeptidsequenz eines auf eine hTRT-Interaktion zu testenden Proteins fusioniert ist (z.B. Nucleolin oder EF2H).
In einer alternativen Ausführungsform ist die Hefe-Ga14-DNA-bindende Domäne an cDNAs aus einer menschlichen Zelle fusioniert, wodurch eine Bank von menschlichen Proteinen, die an die Ga14DNA-bindende Domäne fusioniert sind, zum Screenen nach Telomerase-assoziierten Proteinen hergestellt wird. Die anderen Polynucleotide umfassen die Ga14-Aktivierungsdomäne, die an eine hTRT-Polypeptidsequenz fusioniert ist. Die Konstrukte werden in eine Hefewirtszelle eingeführt. Nach Expression kann die intermolekulare Bindung zwischen hTRT und dem Testprotein die Ga14-DNA-bindende Domäne mit der Ga14-aktivierenden Domäne rekonstituieren. Dies führt zu der transkriptionellen Aktivierung eines Reportergens (z.B. lacZ, His3), das mit einer Ga14-Bindungsstelle funktionell verknüpft ist.
Durch Auswählen oder Untersuchung können Reportergen-Zellkolonien identifiziert werden, die ein mit hTRT interagierendes Protein oder ein Telomerase-assoziiertes Protein enthalten. Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass es zahlreiche Variationen des "2-hybrid-screen"-Systems gibt, beispielsweise das LexA-System (Bartel et al., in Cellular Interactions in Development: A Pratical Approach, Hartley (Herausg.), D.A. (Oxford Univ. Press (1993), S. 153-179)).
Ein weiteres nützliches Verfahren zum Identifizieren von Telomerase-assoziierten Proteinen ist ein "three-hybrid"-System (siehe beispielsweise Zhang et al., Anal. Biochem. 242 (1996), 68 und Licitra et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 12817). Die Telomerase-RNA-Komponente kann in diesem System mit der TRT oder dem hTRT-Protein und einem Testprotein verwendet werden. Ein weiteres nützliches Verfahren zur Identifizierung von interagierenden Proteinen (d.h. von Proteinen, die heterodimerisieren oder Heteromultimere höherer Ordnung bilden) ist insbesondere das E.coli/BCCP "interaktive Screening"-System (siehe Germino et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 933 und Guarente, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 90 (1993), 1639).
Die vorliegende Erfindung stellt auch Komplexe aus Telomerbindenden Proteinen bereit (bei denen es sich um Telomeraseassoziierte Proteine handeln kann oder nicht) und hTRT (die mit hTR, anderen RNAs oder einem oder mehreren Telomeraseassoziierten Proteinen komplexiert sein kann oder nicht). Zu den Beispielen von Telomer-bindenden Proteinen gehören TRF1 und TRF2 (a.a.O.) rnpA1, rnpA2, RAP1 (Buchman et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988), 210, Buchman et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988), 5086), SIR3 und SIR4 (Aparicio et al., Cell 66 (1991), 1279), TEL1 (Greenwell et al., Cell 82 (1995), 823; Morrow et al., Cell 82 (1995), 831); ATM (Savitsky et al., Science 268 (1995), 1749), "end-capping"-Faktor (Cardenas et al., Genes Dev. 7 (1993), 883) und die entsprechenden menschlichen Homologe.
Die vorstehend erwähnten Komplexe können allgemein, so wie es vorstehend für Komplexe aus hTRT und hTR oder Telomerase-assoziierten Proteinen beschrieben wurde, hergestellt werden, beispielsweise durch Vermischen oder Coexpression in vitro oder in vivo.
V. Antikörper und andere bindende Agenzien
Ein verwandter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Antikörper, die mit hTRT spezifisch immunreaktiv sind. Dazu gehören polyclonale und monoclonale Antikörper, Antikörperfragmente, Antikörper mit einer einzelnen Kette, menschliche und chimäre Antikörper, einschliesslich Antikörper oder Antikörper-Fragmente, die an Phagenhüll- oder Zelloberflächenproteine fusioniert sind und weitere auf dem Fachgebiet bekannte und hier beschriebene. Die erfindungsgemässen Antikörper können Polypeptide spezifisch erkennen und binden, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mit der Aminosäuresequenz von SEQ. ID. Nr. 2 im wesentlichen identisch ist, oder ein immunogenes Fragment davon, oder ein Epitop auf dem dadurch definierten Protein. Die erfindungsgemässen Antikörper können eine spezifische Bindungsaffinität für hTRT von mindestens etwa 10<7>, 10<8>, 10<9> oder 10<1><0> M<-><1> aufweisen.
Sie können polyclonal oder monoclonal sein, rekombinant oder auf andere Weise hergestellt. Die Erfindung stellt auch anti-hTRT-Antikörper bereit, die ein Konformationsepitop vonh TRT erkennen (beispielsweise ein Epitop auf der Oberfläche des hTRT-Proteins oder eines Telomerase-RNPs). Wahrscheinliche Konformationsepitope können, falls erwünscht, durch computergestützte Analyse der hTRT-Proteinsequenz identifiziert werden, durch Vergleich mit der Konformation von verwandten reversen Transkriptasen, wie beispielsweise der p66-Untereinheit von HIF-1 (siehe beispielsweise Fig. 3) oder empirisch. Anti-hTRT-Antikörper, die Konformationsepitope erkennen, sind unter anderem bei dem Nachweis und der Reinigung von menschlicher Telomerase und bei der Diagnose und der Behandlung von menschlichen Erkrankungen von Nutzen.
Für die Herstellung von anti-hTRT-Antikörpern können Wirte wie beispielsweise Ziegen, Schafe, Kühe, Meerschweinchen, Kaninchen, Ratten oder Mäuse durch Injektion mit einem hTRT-Protein oder einem beliebigen Anteil, einem Fragment oder Oligopeptid davon, der immunogene Eigenschaften beibehalten hat, immunisiert werden. Für die Auswahl von hTRT-Polypeptiden zur Antikörperinduktion ist es nicht nötig, dass diese biologische Aktivität beibehalten wird, das Proteinfragment oder Oligopeptid muss jedoch immunogen und vorzugsweise antigen sein.
Die Immunogenität kann durch Injektion eines Polypeptids und eines Adjuvans in ein Tier (z.B. ein Kaninchen) und durch Untersuchung des Auftretens von Antikörpern, die gegen das injizierte Polypeptid gerichtet sind, nachgewiesen werden (siehe beispielsweise Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988), beispielsweise Kapitel 5, und dieses Dokument ist durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit und für alle Zwecke Bestandteil dieser Beschreibung). Zur Induktion spezifischer Antikörper verwendete Peptide weisen typischerweise eine Aminosäuresequenz auf, die aus mindestens fünf Aminosäuren besteht, vorzugsweise mindestens 8 Aminosäuren und mehr bevorzugt mindestens 10 Aminosäuren. Üblicherweise nehmen sie die gesamte Aminosäuresequenz des Proteins mit SEQ. ID.
Nr. 2 oder einen Teil davon auf, oder besitzen eine dazu im wesentlichen identische Sequenz. Kurze Strecken der Aminosäure des hTRT-Proteins können mit denen anderer Proteine fusioniert werden, wie beispielsweise das "Keyhole limpet"-Hemocyanin und einen anti-hTRT-Antikörper, der gegen das chimäre Molekül hergestellt wurde. In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtsart können verschiedene Adjuvantien zur Steigerung der Immunantwort verwendet werden.
Das Antigen wird dem Immunsystem auf eine Weise präsentiert, die durch für das Tier geeignete Verfahren ermittelt wurde. Diese sowie andere Parameter sind dem Immunologen im allgemeinen gut bekannt. Typischerweise werden die Injektionen in die Fussballen, intramuskulär, intradermal, in die Perilymphknoten oder intraperitoneal verabreicht. Die durch den Wirt hergestellten Immunglobuline können präzipitiert, isoliert und gemäss Routineverfahren, zu denen Affinitätsreinigung zählt, gereinigt werden.
Veranschaulichende Beispiele von immunogenen hTRT-Peptiden werden in Beispiel 8 bereitgestellt.- Zusätzlich beschreibt Beispiel 8 die Herstellung und die Verwendung von polyclonalen anti-hTRT-Antikörpern.
A) Monoclonale Antikörper
Monoclonale Antikörper gegen hTRT-Proteine und Peptide können in Übereinstimmung mit den erfindungsgemässen Verfahren unter Verwendung jedes Verfahrens, das für die Herstellung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zellinien in Kultur geeignet ist, hergestellt werden. Zu diesen Verfahren zählen, jedoch ohne Beschränkung darauf, das ursprünglich beschriebene Hybridom-Verfahren von Koehler und Milstein (Nature 256 (1975), 495), das Hybridom-Verfahren mit menschlichen B-Zellen (Kosbor et al., Immunol. Today 4 (1983), 72 und Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 2026), und das EBV-Hybridom-Verfahren (Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc. New York NY, S. 77-96 (1985)).
In einer Ausführungsform werden geeignete Tiere ausgewählt und das geeignete anzuwendende Immunisierungsprotokoll. Die Herstellung von nicht-menschlichen monoclonalen Antikörpern, beispielsweise von der Maus, von Lagomorpha und vom Pferd ist allgemein bekannt und kann beispielsweise durch Immunisierung eines Tiers mit einer hTRT oder Fragmente davon enthaltenden Präparation erfolgen. In einem Verfahren wird nach einem geeigneten Zeitraum die Milz der Tiere herausgeschnitten und einzelne Milzzellen werden typischerweise mit immortalisierten Myelomzellen unter geeigneten Selektionsbedingungen fusioniert. Danach werden die Zellen clonal getrennt und die Überstände von jedem Clon (z.B. Hybridom) bezüglich der Herstellung eines geeigneten Antikörpers, der für den gewünschten Bereich des Antigens spezifisch ist, getestet.
Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Siehe beispielsweise Goding et al., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2. Ausgabe), Acad. Press, N.Y., und Harlow und Lane, a.a.O., wobei beide Veröffentlichungen durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen sind. Zu anderen geeigneten Verfahren zählen die in vitro-Exposition von Lymphocyten gegenüber den antigenen Polypetiden oder, alternativ, eine Auswahl von Antikörperbanken in Phagenvektoren oder ähnlichen Vektoren (siehe die nachstehende Beschreibung).
B) Menschliche Antikörper
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung von menschlichen Antikörpern gegen ein hTRT- Polypeptid. Menschliche monoclonale Antikörper gegen ein bekanntes Antigen können auch unter Verwendung von transgenen Tieren hergestellt werden, die Elemente eines menschlichen Immunsystems besitzen (siehe beispielsweise USPatent Nr. 5 569 825 und 5 545 806, wobei beide Dokumente durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen sind) oder unter Verwendung von menschlichen peripheren Blutzellen (Casali et al., Science 234 (1986), 476). Einige menschliche Antikörper werden durch kompetitive Bindungsexperimente ausgewählt oder so, dass sie dieselbe Epitop-Spezifität aufweisen wie ein spezieller Mausantikörper.
In einer weiteren Ausführungsform können menschliche Antikörper gegen ein hTRT-Polypeptid durch Screenen einer DNA-Bank aus menschlichen B-Zellen gemäss dem von Huse et al., Science 246 (1989), 1275 beschriebenen allgemeinen Protokoll hergestellt werden. Dieses Dokument ist aufgrund der Bezugnahme ebenfalls als Teil der vorliegenden Beschreibung anzusehen. An das hTRT-Polypeptid bindende Antikörper werden ausgewählt. Diese Antikörper (oder ein bindendes Fragment) codierenden Sequenzen werden dann cloniert und amplifiziert. Das von Huse beschriebene Protokoll wird oft mit der "phage-display"-Technologie verwendet.
C. Humanisierte oder chimäre Antikörper
Die Erfindung stellt auch anti-hTRT-Antikörper bereit, die als chimäre, menschlichen Antikörper ähnelnden oder humanisierte Antikörper hergestellt wurden, um so ihre potentielle Antigenität jedoch nicht ihre Affinität gegenüber dem Ziel herabzusetzen. Die Herstellung von chimären und humanisierten Antikörpern bzw. von den menschlichen Antikörpern ähnelnden Antikörpern wurde auf dem Fachgebiet beschrieben (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5 585 089 und 5 530 101; Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 10029 und Verhoeyan et al., Science 239 (1988), 1534, wobei diese Dokumente aufgrund der Bezugnahme in ihrer Gesamtheit und für alle Zwecke als Gegenstand dieser Beschreibung anzusehen sind).
Humanisierte Immunglobuline weisen variable Grundgerüstbereiche auf, die im wesentlichen von einem humanen Immunglobulin stammen (mit der Bezeichnung Akzeptor-Immunglobulin) und die Komplementarität der determinierenden Bereiche, die im wesentlichen von einem nicht-menschlichen Immunglobulin (z.B. von der Maus) stammen (mit der Bezeichnung Donor-Immunglobulin). Die (Der) konstante(n) Bereich(e) stammt/stammen, falls vorhanden, auch im wesentlichen von einem menschlichen Immunglobulin.
Bei einigen Anwendungen, beispielsweise bei der Verabreichung an menschliche Patienten, bieten die erfindungsgemässen humanisierten (sowie die menschlichen) anti-hTRT-Antikörper eine Reihe von Vorteilen gegenüber Antikörpern von Mäusen oder anderen Spezies: (1) das menschliche Immunsystem sollte das Grundgerüst oder den konstanten Bereich des humanisierten Antikörpers nicht als fremd erkennen und daher sollte die Antikörper-Antwort gegen einen solchen injizierten Antikörper geringer ausfallen als gegen einen vollständig fremden Maus-Antikörper oder einen partiell fremden chimären Antikörper;
(2) da der Effektorbereich des humanisierten Antikörpers menschlich ist, dürfte er mit anderen Teilen des menschlichen Immunsystems besser interagieren, und (3) injizierte humanisierte Antikörper weisen eine Halbwertszeit auf, die im wesentlichen zu der von natürlich vorkommenden menschlichen Antikörpern äquivalent ist, was es erlaubt, kleinere und weniger häufige Dosen im Vergleich zu Antikörpern anderer Spezies zu verabreichen.
D) "Phage Display"
Die vorliegende Erfindung stellt auch anti-hTRT-Antikörper (oder bindende Zusammensetzung) bereit, die durch "phage display"-Verfahren hergestellt wurden (siehe beispielsweise Dower et al.1 WO 91/17 271 und McCafferty et al., WO 92/01 047 sowie Vaughan et al., Nature Biotechnology 14 (1996), 309, wobei diese Dokumente aufgrund der Bezugnahme in ihrer Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen sind). Bei diesen Verfahren werden Phagenbanken hergestellt, in denen Mitglieder auf ihren äusseren Oberflächen unterschiedliche Antikörper präsentieren. Antikörper werden gewöhnlich als Fv- oder Fab-Fragmente präsentiert. Phagen, die Antikörper mit einer gewünschten Spezifität präsentieren, werden durch Affinitätsanreicherung mit einem hTRT-Polypeptid ausgewählt.
Bei einer Variation des "phage-display"-Verfahrens können humanisierte Antikörper mit der Bindungsspezifität eines ausgewählten Maus-Antikörpers hergestellt werden. Bei diesem Verfahren wird der variable Bereich entweder der schweren oder der leichten Kette des ausgewählten Maus-Antikörpers als Ausgangsmaterial verwendet. Wenn beispielsweise der variable Bereich einer leichten Kette als Ausgangsmaterial ausgewählt wird, wird eine Phagenbank hergestellt, in der Mitglieder den variablen Bereich derselben leichten Kette (d.h. des Ausgangsmaterials von der Maus) und einen variablen Bereich einer unterschiedlichen schweren Kette präsentieren. Die variablen Bereiche der schweren Kette werden von einer Bank mit menschlichen rearrangierten variablen Bereichen der schweren Kette erhalten.
Ein Phage, der eine starke spezifische Bindung an das hTRT-Polypeptid zeigt (z.B. mindestens 10<8> und vorzugsweise mindestens 10<9> M<-><1>) wird ausgewählt. Der variable Bereich der menschlichen schweren Kette von diesem Phagen dient dann als Ausgangsmaterial für die Herstellung einer weiteren Phagenbank. In dieser Bank präsentiert jeder Phage denselben variablen Bereich der schweren Kette, d.h. den von der ersten Präsentationsbank identifizierte Bereich, und einen unterschiedlichen Bereich der leichten Kette. Die variablen Bereiche der leichten Kette werden von einer Bank aus menschlichen rearrangierten variablen Regionen der leichten Kette erhalten. Wieder wird ein Phage, der eine starke spezifische Bindung zeigt, ausgewählt. Diese Phagen präsentieren die variablen Bereiche von vollständig menschlichen anti-hTRT-Antikörpern.
Diese Antikörper weisen üblicherweise die gleiche oder eine ähnliche Epitopspezifität auf, wie das von der Maus stammende Ausgangsmaterial.
E) Hybrid-Antikörper
Die Erfindung stellt auch Hybrid-Antikörper bereit, die die Spezifität mit Antikörpern gegen ein hTRT-Polypeptid gemeinsam haben, jedoch auch eine zweite Einheit spezifisch binden können. In diesen Hybrid-Antikörpern stammt normalerweise ein Paar aus einer schweren und leichten Kette von einem anti-hTRT-Antikörper und das andere Paar von einem Antikörper, der gegen ein anderes Epitop oder Protein gerichtet ist. Dies führt zu der Eigenschaft einer multifunktionellen Valenz, d.h. der Fähigkeit, mindestens zwei verschiedene Epitope gleichzeitig binden zu können, wobei mindestens ein Epitop das Epitop ist, an das der anti-Komplex-Antikörper bindet. Solche Hybride können durch Fusion der entsprechenden Bestandteilsantikörpern herstellenden Hybridome gebildet werden oder durch Kombinationsverfahren.
Erfindungsgemässe Immunglobuline können auch mit funktionellen Bereichen von anderen Genen (z.B. Enzymen) zur Herstellung von Fusionsproteinen (z.B. Immuntoxinen) mit nützlichen Eigenschaften fusioniert werden.
F) Anti-idiotypische Antikörper
Auch anti-idiotypische Antikörper, die mittels der vorstehend beschriebenen Verfahren isoliert werden können, sind von Nutzen. Anti-idiotypische Antikörper können beispielsweise durch Immunisierung eines Tiers mit dem primären Antikörper (d.h. anti-hTRT-Antikörpern oder hTRT-bindenden Fragmenten davon) präpariert werden. Für anti-hTRT-Antikörper werden anti-idiotypische Antikörper ausgewählt, deren Bindung an den primären Antikörper durch ein hTRT-Polypeptid oder Fragmente davon gehemmt wird. Da sowohl der anti-idiotypische Antikörper als auch das hTRT-Polypeptid oder Fragmente davon, das primäre Immunglobulin binden, kann das anti-idiotypische Immunglobulin das "interne Bild" eines Epitops repräsentieren und somit in Assays das hTRT-Polypeptid ersetzen, oder es kann dazu verwendet werden, anti-hTRT-Antikörper, beispielsweise in einem Patienten, zu binden (d.h. zu inaktivieren).
Anti-idiotypische Antikörper können auch mit Telomeraseassoziierten Proteinen interagieren. Die Verabreichung solcher Antikörper könnte eine Telomerase-Funktion durch Austitrieren hTRT-assoziierter Proteine beeinflussen.
G) Allgemeines
Die erfindungsgemässen Antikörper können zu einem beliebigen Isotyp gehören, beispielsweise IgM, IgD, IgG, IgA und IgE, wobei IgG, IgA und IgM oft bevorzugt sind. Humanisierte Antikörper können auch Sequenzen von mehr als einer Klasse oder eines Isotyps umfassen.
In einer weiteren erfindungsgemässen Ausführungsform werden Fragmente der intakten vorstehend beschriebenen Antikörper bereitgestellt. Typischerweise können diese Fragmente mit dem intakten Antikörper, von dem sie abstammen, um die spezifische Bindung an das hTRT-Polypeptid konkurrieren und sie binden mit einer Affinität von 10<7>, 10<8>, 10<9> M<-><1>, oder 10<1><0> M<-><1>. Zu den Antikörperfragmenten zählen getrennte schwere Ketten, leichte Ketten, Fab, Fab min F(ab min )2, Fabc und Fv. Fragmente können durch enzymatische oder chemische Trennung von intakten Immunglobulinen hergestellt werden. Beispielsweise kann ein F(ab min )2-Fragment aus einem IgG-Molekül durch proteolytische Spaltung mit Pepsin bei einem pH-Wert von 3,0-3,5 mit Standardverfahren, wie sie beispielsweise in Harlow und Lane, a.a.O., beschrieben sind, erhalten werden.
Fab-Fragmente können aus F(ab min )2-Fragmenten durch limitierte Reduktion aus einem ganzen Antikörper durch Spaltung mit Papain in Gegenwart von Reduktionsmitteln erhalten werden (siehe allgemein Paul, W. (Herausg.) Fundamental Immunology 2nd Raven Press, N.Y., 1989, Kapitel 7, wobei dieses Dokument durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden kann). Fragmente können auch durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden. Nucleinsäuresegmente, die ausgewählte Fragmente codieren, werden durch Spaltung codierender Sequenzen vollständiger Länge mit Restriktionsenzymen hergestellt oder durch de novo-Synthese. Oft werden Fragmente in Form eines Phagen-Fusionshüllproteins exprimiert.
Viele der vorstehend beschriebenen Immunglobuline können unkritische Aminosäuresubstitutionen, Additionen oder Deletionen sowohl in den variablen als auch in den konstanten Bereichen ohne Verlust von Bindungsspezifität oder Effektorfunktionen oder nicht tolerierbare Herabsetzung der Bindungsaktivität (d.h. unter etwa 10<7> M<-><1>) durchlaufen. Üblicherweise zeigen Immunglobuline mit solchen Änderungen eine im wesentlichen identische Sequenz, verglichen mit einem Referenzimmunglobulin von dem sie abstammen. Ein mutiertes Immunglobulin kann ausgewählt werden, das die gleiche Spezifität und eine erhöhte Affinität aufweist im Vergleich zu einem Referenzimmunglobulin, von dem es abstammt. Die "phage-display"-Technologie bietet nützliche Verfahren zur Selektion solcher Immunglobuline.
Siehe beispielsweise Dower et al., WO 91/17 271, McCafferty et al., WO 92/01 047 und Huse, WO 92/06 204.
Die erfindungsgemässen Antikörper können mit oder ohne Modifikation verwendet werden. Häufig werden die Antikörper durch entweder kovalente oder nicht-kovalente Anfügung einer nachweisbaren Markierung markiert. Als markierte Bindungseinheiten sind die erfindungsgemässen Antikörper bei diagnostischen Anwendungen von besonderem Nutzen.
Die erfindungsgemässen anti-hTRT-Antikörper können unter Verwendung allgemein bekannter Verfahren gereinigt werden. Die vollständigen Antikörper, ihre Dimere, individuellen leichten und schweren Ketten oder andere erfindungsgemässen Immunglobulinformen können unter Verwendung der erfindungsgemässen Verfahren und Reagenzien in Übereinstimmung mit auf dem Fachgebiet üblichen Standardverfahren, zu denen Ammoniumsulfatpräzipitation, Affinitätssäulen, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese etc. gehören, gereinigt werden (siehe allgemein Scopes, Protein Purification: Principiesand Practice, 3. Ausgabe (Springer-Verlag, N.Y.; 1993). Bevorzugt sind im wesentlichen reine Immunglobuline mit mindestens etwa 90 bis 95% oder sogar 98 bis 99% oder darüber liegender Homogenität.
VI. Reinigung von menschlicher Telomerase
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte menschliche Telomerase mit bisher nicht erreichter Reinheit bereit. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung bereit: gereinigte hTRT rekombinanten oder nicht-rekombinanten Ursprungs; gereinigte hTRT-hTR-Komplexe (d.h. RNPs), rekombinanten, nicht-rekombinanten oder gemischten Ursprungs, die gegebenenfalls ein oder mehrere Telomeraseassoziierte Proteine umfassen; gereinigte natürlich vorkommende menschliche Telomerase; etc. Darüber hinaus stellt die Erfindung Verfahren und Reagenzien bereit, um die vorstehend beschriebenen Moleküle und Komplexe einschliesslich von Varianten, Fusionsproteinen, natürlich vorkommenden Proteinen etc. (die kollektiv als "hTRT und/oder hTRT-Komplexe" bezeichnet werden) in partiell gereinigter, im wesentlich gereinigter oder hochgereinigter Form gewinnen zu können.
Bevor diese Erfindung gemacht wurde, wurden Versuche unternommen, den Telomerase-Enzym-Komplex bis zur Homogenität zu reinigen, jedoch mit begrenztem Erfolg (siehe beispielsweise die parallele US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/833 377, eingereicht am 4. April 1997 und 08/510 736, eingereicht am 4. August 1995 sowie die PCT-Anmeldung Nr. 97/06 012, eingereicht am 4. April 1997. Diese Dokumente sind aufgrund der Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung hinsichtlich nützlicher Reinigungsverfahren anzusehen). Die in den vorstehend aufgeführten Anmeldungen bereitgestellten Verfahren erlauben es, Telomerase bis etwa 60 000fach oder höher im Vergleich zu Zellrohextrakten zu reinigen.
Die vorliegende Erfindung stellt hTRT und hTRT-Komplexe mit sogar noch höherer Reinheit bereit, teilweise dank der neuen erfindungsgemässen Immunoaffinitätsreagenzien, (z.B. anti-hTRT-Antikörper) und/oder der hier für die rekombinante Expression von hTRT zur Verfügung gestellten Reagenzien, Zellen und Verfahren. Die rekombinante Expression von hTRT und hTRT-Komplexen erleichtert die Reinigung, da die gewünschten Moleküle in wesentlich höherer Konzentration im Vergleich zu den meisten in der Natur vorkommenden exprimierenden Zellen hergestellt werden und/oder weil die rekombinanten hTRT-Moleküle so modifiziert werden können (z.B. durch Fusion mit einem Epitop-"tag"), dass sie leicht gereinigt werden können.
Es ist offensichtlich, dass natürlich vorkommende Telomerase aus einer Telomerase-positiven Zelle gereinigt werden kann. Rekombinante hTRT und hTRT-Komplexe können u.a. unter Verwendung beliebiger in vitro, in vivo, ex vivo, pflanzlichen oder tierischen Expressionssystemen, die vorstehend beschrieben wurden, oder andere auf dem Fachgebiet bekannte Systeme exprimiert und gereinigt werden.
In einer Ausführungsform werden die hTRT, Telomerase und andere erfindungsgemässen Zusammensetzungen mittels eines Immunoaffinitätsschritts gereinigt, wobei entweder nur dieser Schritt oder eine Kombination mit weiteren Reinigungsschritten durchgeführt wird. Typischerweise wird ein immobilisierter oder immobilisierbarer anti-hTRT-Antikörper, sowie er von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, mit einer Probe, beispielsweise einem Zellysat, das die gewünschte hTRT oder den hTRT-enthaltenden Komplex enthält, unter Bedingungen in Kontakt gebracht, bei denen ein anti-hTRT-Antikörper das hTRT-Antigen bindet. Nach Entfernung von nichtgebundenen Bestandteilen der Probe durch auf dem Fachgebiet allgemein bekannte Verfahren kann die hTRT-Zusammensetzung, falls erwünscht, von dem Antikörper in im wesentlichen reiner Form eluiert werden.
In einer Ausführungsform werden auf dem Fachgebiet gut bekannte Immunoaffinitätschromatographieverfahren verwendet (siehe beispielsweise Harlow und Lane, a.a.O., Ausubel, a.a.O., und Hermansanetal., 1992, Immobilized Affinity Ligand Techniques(AcademicPress,SanDiego"in Übereinstimmung mit den erfindungsgemässen Verfahren. In einer weiteren veranschaulichenden Ausführungsform wird eine Immunpräzipitation von anti-hTRT-Immunglobulin-hTRT-Komplexen unter Verwendung von immobilisiertem Protein A durchgeführt. Dem Fachmann sind zahlreiche Variationen und alternative Immunoaffinitätsreinigungsprotokolle, die zur Verwendung in Übereinstimmung mit den erfindungsgemässen Verfahren und Reagenzien geeignet sind, gut bekannt.
In einer weiteren Ausführungsform können rekombinante hTRT-Proteine als Folge ihrer Expression mit hohem Niveau mittels Routine-Proteinreinigungsverfahren gereinigt werden, beispielsweise durch Ammoniumsulfatpräzipitation, Affinitätssäulen (z.B. Immunoaffinität), Ausschluss nach Grösse ("size-exclusion"), Anionen- und Kationen Austauschchromatographie, Gelelektrophorese etc. (siehe allgemein R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982) und Deutscher, Methods in Enzymology 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990)) anstelle von Immunoaffinitätsverfahren oder zusätzlich dazu. Kationenaustauschverfahren können aufgrund des basischen pI-Werts des hTRT-Proteins besonders nützlich sein. Beispielsweise kann immobilisiertes Phosphat als eine funktionelle Kationenaustauschgruppe (z.B.
P-11 Phosphocellulose, Whatman-Katalog #4071 oder Cellulosephosphat, Sigma-Katalog #C 3145) verwendet werden. Immobilisiertes Phosphat hat bezüglich der hTRT-Reinigung zwei vorteilhafte Merkmale - es ist ein Kationenaustauschharz und es zeigt physikalisch eine Ähnlichkeit mit dem Phosphatrückgrat von Nucleinsäuren. Daher kann auch die "Pseudo"-Affinitätschromatophie verwendet werden, da hTRT hTR und Telomer-DNA bindet. Andere nicht-spezifische Nucleinsäure-Affinitätschromatographieverfahren sind zur Reinigung ebenfalls von Nutzen (siehe beispielsweise die parellele US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/833 377; Albers et al., Methods Enzymol. 21 (1971), 198; Arnt-Jovin et al., Eur. J. Biochem. 54(1975), 411 und den Pharmacia-Katalog #27-5575-02). Die weitere Nutzung dieser wahrscheinlichen Bindungsfunktion von hTRT würde die Verwendung von spezifischen Nucleinsäuren (z.B.
Primer oder hTR) bei AffinitätschrSteigerung der Expression oder Aktivität von Aktivatoren der hTRT-Transkription sowie weitere Massnahmen, die für den Fachmann nach Lesen dieser Beschreibung offensichtlich sind.
E) Mittel für die Intervention
1) TRT-Proteine und Peptide
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Telomerasemodulierende Polypeptide (d.h. Proteine, Polypeptide und Peptide) bereit, die Telomerase-Aktivität steigern oder herabsetzen. Diese können in eine Zielzelle direkt (z.B. durch Injektion, Liposomen-vermittelte Fusion, Applikation eines Hydrogels auf die Tumoroberfläche (z.B. bei einem Melanom, Fusion oder Anheftung des Strukturproteins VP22 des Herpes-Virus und weitere hier beschriebene und auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren) eingeführt werden. In einer zweiten Ausführungsform werden erfindungsgemässe Telomerasemodulierenden Proteine und Peptide in einer Zelle durch Einführung einer Nucleinsäure (z.B. eines DNA-Expressionsvektors oder mRNA), die das gewünschte Protein oder Peptid in der Zelle codiert, in einer Zelle exprimiert.
Die Expression kann entweder konstitutiv oder induzierbar sein, was von dem Vektor und der Wahl des Promotors (siehe die nachstehende Diskussion) abhängt. Präparationen von Messenger-RNA, die hTRT codieren, sind besonders dann von Nutzen, wenn lediglich eine transiente Expression (z.B. die transiente Aktivierung von Telomerase) erwünscht ist. Verfahren zur Einführung und Expression von Nucleinsäuren in eine Zelle sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt (siehe darüber hinaus andere Stellen in dieser Beschreibung, beispielsweise die Abschnitte über Oligonucleotide und Gentherapieverfahren).
Ein Aspekt dieser Erfindung betrifft ein Telomerasemodulierendes Polypeptid, das Telomerase-Aktivität in einer Zelle erhöht. In einer Ausführungsform ist das Polypeptid ein katalytisch aktives hTRT-Polypeptid, das die Synthese von menschlicher Telomer-DNA (in Verbindung mit einer RNA-Matrize, wie beispielsweise hTR) steuern kann. Diese Aktivität kann wie vorstehend diskutiert gemessen werden, beispielsweise unter Verwendung eines Telomerase-Aktivitätsassays, wie beispielsweise einem TRAP-Assay. In einer Ausführungsform ist das Polypeptid ein hTRT-Protein mit vollständiger Länge und einer Sequenz, die der Sequenz von 1132 Resten von SEQ. ID. Nr. 2 entspricht oder im wesentlichen identisch dazu ist. In einer weiteren Ausführungsform ist das Polypeptid eine Variante des hTRT-Proteins von SEQ. ID.
Nr. 2, beispielsweise ein Fusionspolypeptid, derivatisiertes Polypeptid, verkürztes Polypeptid, Polypeptid mit konservativen Substitutionen etc. Ein Fusions- oder derivatisiertes Protein kann eine "targeting"-Einheit enthalten, die die Fähigkeit des Polypeptids die Zellmembran zu durchdringen steigert, oder bewirkt, dass das Polypeptid einem spezifischen Zelltyp (z.B. Leberzellen oder Tumorzellen) oder Zellkompartimenten (z.B. dem nucleären Kompartiment) bevorzugt zugeführt wird. Zu den Beispielen für solche "Zielsetzungs"-Einheiten gehören Lipidschwänze, Aminosäuresequenzen, wie beispielsweise das "antennapediall-Peptid (siehe USSN 08/838,545, eingereicht am 9. April 1997) oder ein nucleäres Lokalisationssignal (NLS; z.B. Xenopus-Nucloplasmin; Robbins et al., Cell 64 (1991), 615). Natürlich vorkommendes hTRT-Protein (z.B. mit einer Sequenz, die SEQ. ID.
Nr. 2 entspricht oder dazu im wesentlichen identisch ist) wirkt im Zellnucleus. Daher ist es wahrscheinlich, dass eine oder mehrere Untersequenzen von SEQ. ID. Nr. 2, beispielsweise die Reste 193 bis 196 (PRRR) und die Reste 235-240 (PKRPRR) als nucleäres Lokalisationssignal wirken. Die kleinen Bereiche sind wahrscheinlich NLSs. Dies beruht auf der Beobachtung, dass viele NLSs ein Muster mit vier Resten umfassen, das aus basischen Aminosäuren (K oder R) oder drei basischen Aminosäuren (K oder R) und H oder P zusammengesetzt ist; einem Muster, das mit P beginnt, woran sich innerhalb dreier Reste ein basisches Segment anschliesst, das 3 K- oder R-Reste von vier Resten enthält (siehe beispielsweise Nakai et al., Genomics 14 (1992) 897).
Es wird davon ausgegangen, dass die Deletion einer dieser sequenzen oder beider und/oder zusätzlicher Lokalisationssequenzen den hTRT-Transport in den Nucleus stört und/oder den hTRT-Umsatz steigert und somit zur Verhinderung des Zugangs von Telomerase zu seinen nucleären Substraten der Herabsetzung des proliferativen Potentials von Nutzen ist. Darüber hinaus könnte eine hTRT-Variante, der das NLS fehlt, sich zu einem RNP assemblieren, das nicht mehr die Telomer-Länge aufrechterhalten kann, da das daraus hervorgehende Enzym nicht in den Nucleus hineingelangen kann.
Die erfindungsgemässen hTRT-Polypeptide sind typischerweise in der Zielzelle mit einer Telomerase-RNA, wie beispielsweise hTR, assoziiert, wenn sie zur Steigerung von Telomerase-Aktivität in einer Zelle verwendet werden. In einer Ausführungsform assoziiert ein eingeführtes hTRT-Polypeptid mit einer endogenen hTR zur Bildung eines katalytisch aktiven RNP (z.B. eines RNPs, das die hTR und ein Polypeptid mit vollständiger Länge und einer Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2 umfasst). Das so gebildete RNP kann auch mit weiteren, beispielsweise Telomerase-assoziierten, Proteinen assoziieren. In weiteren Ausführungsformen wird das Telomerase-RNP (das hTRT-Protein, hTR und gegebenenfalls weitere Bestandteile enthält) als Komplex in die Zielzelle eingeführt.
In einer ähnlichen Ausführungsform wird ein hTRT- Expressionsvektor in eine Zelle (oder die Nachkommenschaft einer Zelle) eingeführt, in die ein Telomerase-RNA (z.B. hTR)-Expressionsvektor gleichzeitig, danach oder vorher eingeführt wird. In dieser Ausführungsform werden hTRT-Protein und Telomerase-RNA in der Zelle coexprimiert und sie assemblieren zur Bildung eines Telomerase-RNPs. Eine bevorzugte Telomerase-RNA ist hTR zusammen. Ein für die Expression von hTR in einer Zelle nützlicher Expressionsvektor wurde vorstehend beschrieben (siehe US-Patent 5 583 016). In einer weiteren Ausführungsform sind das hTRT-Polypeptid und die hTR-RNA (oder ein Äquivalent) zur Bildung eines Komplexes, der dann in die Zielzellen eingeführt wird, in vitro assoziiert.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung von hTRT-Polypeptiden, die zur Herabsetzung der Telomerase-Aktivität in einer Zelle nützlich sind.
Wie vorstehend beschrieben, können diese "hemmenden" Polypeptide entweder direkt in die Zelle eingeführt werden oder durch Expression von rekombinanten Nucleinsäuren in der Zelle erzeugt werden. Peptid-"Imitatoren" oder Polypeptide, die Nicht-Standard-Aminosäuren umfassen (d.h. Aminosäuren, die nicht den durch den genetischen Code codierten 20 Aminosäuren oder deren normalen Derivaten entsprechen) werden normalerweise direkt eingeführt.
In einer Ausführungsform führt die Hemmung der Telomerase-Aktivität zu der Sequestrierung eines Bestandteils, der für die genaue Telomerverlängerung erforderlich ist. Beispiele für solche Bestandteile sind hTRT und hTR. Somit kann die Verabreichung eines Polypeptids, das hTR bindet, jedoch keine katalytische Aktivität von Telomerase aufweist, die endogene Telomerase-Aktivität in der Zelle herabsetzen. In einer verwandten Ausführungsform kann das hTRT-Polypeptid einen Zellbestandteil binden, bei dem es sich nicht um hTR handelt, beispielsweise ein Telomerase-assoziiertes Protein (oder mehrere), wodurch die Telomerase-Aktivität in der Zelle gestört wird.
In einer anderen Ausführungsform stören die erfindungsgemässen hTRT-Polypeptide die Interaktion von endogen exprimiertem hTRT-Protein und einer anderen für die Telomerase-Funktion erforderlichen zellulären Komponente, beispielsweise hTR, Telomer-DNA, Telomerase-assoziierte Proteine, Telomer-assoziierte Proteine, Telomere, den Zellcyclus kontrollierende Proteine, DNA-Reparaturenzyme, Histone oder nicht-Histon-chromosomale Proteine etc. (beispielsweise durch Kompetition).
Durch Auswahl von erfindungsgemässen Molekülen (Z.B. Polypeptiden), die sich auf die Interaktion von endogen exprimiertem hTRT-Protein und weiteren zellulären Bestandteilen auswirken, kann man Moleküle bevorzugen, die, wie hier beschrieben, eines oder mehrere der konservierten Motive des hTRT-Proteins enthalten. Die evolutionäre Konservierung dieser Bereiche zeigt, dass diese Motive eine wichtige Funktion in dem korrekten Arbeiten der menschlichen Telomerase beisteuern. Diese Motive sind somit allgemein nützliche Bereiche, um die Funktion des hTRT-Proteins zur Erzeugung von erfindungsgemässen hTRT-Proteinvarianten zu verwenden. somit sind hTRT-Polypeptidvarianten mit Mutationen in konservierten Motiven von besonderem Nutzen.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Expression des endogenen hTRT-Gens durch Einführung einer grossen Menge an hTRT-Polypeptid in die Zelle (z.B. typischerweise mindestens etwa mehr als 2fach im Vergleich zu dem endogenen Spiegel, vorzugsweise etwa mindestens 10- bis etwa 100fach) reprimiert. Dieses wirkt über eine Prüfkopplungsschleife und hemmt so die Transkription des hTRT-Gens, die Prozessierung der hTRT-prä-m-PNA, die Translation der hTRT-mRNA oder die Assemblierung und den Transport des Telomerase-RNPs.
2) Oligonucleotide
a) "Antisense"-Konstrukte
Die Erfindung stellt Verfahren und "antisense"-Oligonucleotide oder Polynucleotidreagenzien zur Verfügung, die zur Herabsetzung der Expression von hTRT-Genprodukten in vitro oder in vivo verwendet werden können. Die Verabreichung der erfindungsgemässen "antisense"-Reagenzien an eine Zielzelle führt zu einer herabgesetzten TelomeraseAktivität und ist für die Behandlung von Erkrankungen besonders nützlich, die durch eine hohe Telomerase-Aktivität gekennzeichnet sind (z.B. bei Krebserkrankungen). Es wird davon ausgegangen, wobei hier keine Einschränkung auf einen bestimmten Mechanismus beabsichtigt ist, dass "antisense"-Oligonucleotide an die "sense"-hTRT-mRNA binden und deren Translation stören.
Alternativ können die "antisense"-Moleküle die hTRT-mRNA für eine Spaltung mit Nuclease empfindlich machen, die Transkription, Prozessierung oder Lokalisierung stören oder auf andere Weise RNA-Vorläufer ("prä-mRNA") stören, die Transkription von mRNA des hTRT-Gens reprimieren oder über einige andere Mechanismen wirken. Der bestimmte Mechanismus, durch den die "antisense"-Moleküle die hTRT-Expression herabsetzen, ist jedoch nicht kritisch.
Die erfindungsgemässen "antisense"-Polynucleotide umfassen eine "antisense"-Sequenz mit mindestens 7 bis 10 oder mehr Nucleotiden, die mit eine Sequenz von mRNA, die humane TRT codiert, oder mRNA, die von dem hTRT-Gen transkribiert wird, spezifisch hybridisieren. Vorzugsweise weist das erfindungsgemässe "antisense"-Polynucleotid eine Länge von etwa 10 bis etwa 50 Nucleotiden oder von etwa 14 bis etwa 35 Nucleotiden auf. In weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei den "antisense"-Polynucleotiden um Polynucleotide, die kürzer als etwa 100 Nucleotide oder kürzer als etwa 200 Nucleotide sind. Im allgemeinen sollten die "antisense"- Polynucleotide lang genug sein, um eine stabile Doppelhelix zu bilden, jedoch kurz genug (in Abhängigkeit von der Art der Zuführung) um, falls erwünscht, in vivo verabreicht werden zu können.
Die minimale Länge eines Polynucleotids, die für eine spezifische Hybridisierung mit einer Zielsequenz erforderlich ist, hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise vom G/C-Gehalt, der Lage von fehlgepaarten Basen (falls vorhanden), dem Ausmass der Einzigartigkeit der Sequenz im Vergleich zu der Population von Ziel-Polynucleotiden, der chemischen Natur des Polynucleotids (z.B. kann es sich um ein Methylphosphonat-Rückgrat handeln, eine Peptid-Nucleinsäure, ein Phosphorothioat) etc. Im allgemeinen ist die "antisense"-Sequenz zur Gewährleistung einer spezifischen Hybridisierung zu der Ziel-hTRT-mRNA-Sequenz im wesentlichen komplementär. In bestimmten Ausführungsformen ist die "antisense"-Sequenz genau komplementär zu der Zielsequenz.
Die "antisense"-Polynucleotide können jedoch auch Nucleotid-Substitutionen, Additionen, Deletionen, Transitionen, Transpositionen oder Modifikationen enthalten, solange die spezifische Bindung an die relevante Zielsequenz, die hTRT-RNA oder deren Gen entspricht, als eine funktionelle Eigenschaft des Polynucleotids beibehalten wird.
In einer Ausführungsform ist die "antisense"-Sequenz zu relativ zugänglichen Sequenzen der hTRT-mRNA (z.B. Sequenzen, die relativ wenig Sekundärstrukturen aufweisen) komplementär. Dies kann durch Analyse der vorhergesagten RNA-Sekundärstrukturen bestimmt werden, beispielsweise mittels des MFOLD-Programms (Genetics Computer Group, Madison WI) und durch auf dem Fachgebiet bekannte in vitro- oder in vivo-Tests. Beispiele für Oligonucleotide, die hinsichtlich einer "antisense"-Suppression der hTRT-Funktion getestet werden können, sind Oligonucleotide, die mit den folgenden Positionen von SEQ. ID. Nr. 1 hybridisieren können (d.h. im wesentlichen komplementär sind): SEQ. ID. Nr. 1: 40-60; 260-280; 500-520; 770-790, 885-905; 1000-1020; 1300- 1320; 1520-1540; 2110-2130; 2295-2315; 2450-2470, 2670-2690; 3080-3110; 3140-3160; und 3690-3710.
Bei einem weiteren nützlichen Verfahren zur Identifizierung von effektiven "antisense"-Zusammensetzungen werden kombinatorische Arrays von Oligonucleotiden verwendet (siehe beispielsweise Milner et al., Nature Biotechnology 15 (1997), 537).
Die Erfindung stellt auch ein "antisense"-Polynucleotid bereit, das Sequenzen zusätzlich zu der "antisense"-Sequenz aufweist (z.B. zusätzlich zu der anti-hTRT-"sense"-Sequenz). In diesem Fall ist die "antisense"-Sequenz in einem Polynucleotid mit einer längeren Sequenz enthalten. In einer weiteren Ausführungsform besteht die Sequenz des Polynucleotids im wesentlichen aus der "antisense"-Sequenz oder sie stellt diese dar.
Die "antisense"-Nucleinsäuren (DNA, RNA, modifizierte DNA oder RNA-Analoge etc.) können unter Verwendung jedes zur Herstellung von Nucleinsäuren geeigneten Verfahrens, beispielsweise den hier beschriebenen Verfahren, hergestellt werden. In einer Ausführungsform können erfindungsgemässe "antisense"-RNA-Moleküle beispielsweise durch chemische Synthese de novo oder durch Clonierung hergestellt werden. Beispielsweise kann eine "antisense"-RNA, die mit hTRT-mRNA hybridisiert, dadurch hergestellt werden, dass eine hTRT-DNA-Sequenz (z.B. SEQ. ID. Nr. 1 oder ein Fragment davon) in umgekehrter Orientierung funktionell mit einem Promotor verknüpft in einen Vektor (z.B. ein Plasmid) inseriert (ligiert) wird.
Unter der Voraussetzung, dass der Promotor und vorzugsweise Terminations- und Polyadenylierungssignale korrekt positioniert sind, wird der Strang der inserierten Sequenz, der dem nicht-codierenden Strang entspricht, transkribiert, und dieser wirkt als ein erfindungsgemässes "antisense"-Oligonucleotid.
Die erfindungsgemässen "antisense"-Oligonucleotide können zur Hemmung der Telomerase-Aktivität in zellfreien Extrakten, Zellen und Tieren, einschliesslich Säugern und Menschen, verwendet werden. Die Phosphorothioat-"antisense"-Oligonucleotide:
EMI128.1
können beispielsweise zur Hemmung von Telomerase-Aktivität verwendet werden. Bei einer Konzentration von 10 mu M hemmte(n) jedes Oligonucleotid; Gemische der Oligonucleotide A und B; A, B, C und D; und A, C und D die Telomerase Aktivität in 293-Zellen, wenn diese 7 Tage einmal pro Tag behandelt wurden. Eine Hemmung wurde auch mit einem "antisense"-hTR-Molekül (5 min -GCTCTAGAATGAAGGGTG-3 min ) beobachtet, wenn dies mit den Oligonucleotiden A,B und C; A, B und D; und A und C kombiniert war. Zu den für solche Experimente nützlichen Kontroll- und Oligonucleotiden zählen:
EMI128.2
Um für die für eine bestimmte gewünschte Anwendung optimalen erfindungsgemässen "antisense"-Oligonucleotide bestimmen zu können, kann man ein Scanning unter Verwendung eines Satzes von erfindungsgemässen "antisense"-Oligonucleotiden durchführen. Ein Beispiel für einen solchen Satz ist der Satz von 30-mer Oligonucleotiden, die die hTRT-mRNA umspannen und wobei eines von dem nächsten um 15 Nucleotide versetzt ist, (d.h. ON1 entspricht den Positionen 1-30 und ist TCCCACGTGCGCAGCAGGACGCAGCGCTGC, ON2 entspricht Positionen 16-45 und ist GCCGGGGCCAGGGCTTCCCACGTGCGCAGC, und ON3 entspricht den Positionen 31-60 und ist GGCATCGCGGGGGTGGCCGGGGCCAGGGCT usw. bis zum Ende der mRNA). Jedes Mitglied dieses Satzes kann hinsichtlich seiner hemmenden Aktivität, wie hier beschrieben, getestet werden.
Jene Oligonucleotide, die unter den gewünschten Bedingungen eine hemmende Aktivität zeigen, kennzeichnen dann einen gewünschten Bereich. Weitere erfindungsgemässe Oligonucleotide, die dem gewünschten Bereich entsprechen (d.h. 8-mere, 10-mere, 15-mere etc.) können zur Identifikation des Oligonucleotids mit der für die Anwendung bevorzugten Aktivität getestet werden.
Bezüglich allgemeiner Verfahren, die sich auf antisense-Polynucleotide beziehen, siehe Antisense RNA and DNA (1988), D.A. Melton, (Herausg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) und Dagle et al., Nucleic Acids Research 19 (1991), 1805. Bezüglich eines Übersichtsartikels der die "antisense"-Therapie betrifft, siehe beispielsweise Uhlmann et al., Chem. Reviews 90 (1990) 543-584.
b) Triplex-Oligo- und Polynucleotide
Die vorliegende Erfindung stellt Oligo- und Polynucleotide (z.B. DNA, RNA oder PNA) bereit, die an doppelsträngige oder Duplex-hTRT-Nucleinsäuren binden, (z.B. in einem gefalteten Bereich der hTRT-RNA oder im hTRT-Gen), wobei eine Nucleinsäure gebildet wird, die eine Dreifach-Helix enthält oder eine "triplex"-Nucleinsäure. Die Bildung einer Dreifach-Helix führt zur Hemmung der hTRT-Expression, beispielsweise durch die Verhinderung der Transkription des hTRT-Gens, wodurch Telomerase-Aktivität in einer Zelle herabgesetzt oder eliminiert wird. Es wird davon ausgegangen (wobei jedoch nicht beabsichtigt ist, an einen bestimmten Mechanismus gebunden zu sein), dass die Dreifach-Helixpaarung die Fähigkeit der Doppelhelix sich für die Bindung von Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder regulatorischen Molekülen ausreichend zu öffnen, stört.
Erfindungsgemässe Triplex-Oligo- und Polynucleotide werden unter Anwendung der Basenpaarungsregeln für die Bildung von Dreifach-Helices konstruiert (siehe beispielsweise Cheng et al., i. Biol. Chem. 263 (1988), 15110; Ferrin und Camerini Otero, Science 354 (1991), 1494; Ramdas et al., J.Biol. Chem. 264 (1989), 17395; Strobel et al., Science 254 (1991), 1639 und Rigas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 9591, wobei durch Bezugnahme jedes dieser Dokumente als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen ist) und den hTRT-mRNA- und/oder Gensequenzen.
Typischerweise umfassen die erfindungsgemässen Triplex-formenden Oligonucleotide eine spezifische Sequenz von etwa 10 bis mindestens etwa 25 Nucleotiden oder eine längere Sequenz, die zu einer spezifischen Sequenz in der hTRT-RNA oder dem Gen "komplementär" ist (d.h. lang genug, um eine stabile Dreifach-Helix bilden zu können, jedoch kurz genug, in Abhängigkeit von der Art der Zulieferung, um, falls gewünscht, in vivo verabreicht werden zu können). In diesem Zusammenhang bedeutet "komplementär" die Fähigkeit zur Bildung einer stabilen Dreifach-Helix. In einer Ausführungsform werden Oligonucleotide so entworfen, dass sie spezifisch an die regulatorischen Bereiche des hTRT-Gens (z.B. die hTRT-5 min -flankierende Sequenz, Promotoren und Enhancer) oder die Transkriptions-Initiationsstelle (z.B. zwischen -10 und +10 von der Transkriptionsinitiationsstelle) spezifisch binden.
Bezüglich eines Übersichtsartikels neuerer therapeutischer Fortschritte, bei denen Triplex-DNA verwendet wird, siehe Gee et al.. in Huber und Carr, 1994, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco NY und Rininsland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 5854, wobei beide Dokumente durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen sind.
c) Ribozyme
Die vorliegende Erfindung stellt auch Ribozyme bereit, die zur Hemmung von Telomerase-Aktivität von Nutzen sind. Die erfindungsgemässen Ribozyme binden, spalten spezifisch und inaktivieren hTRT-mRNA. Nützliche Ribozyme können 5 min - und 3 min -terminale Sequenzen umfassen, die zu der hTRT-mRNA komplementär sind, und diese können vom Fachmann auf der Basis der hier beschriebenen hTRT-mRNA-Sequenz konstruiert werden (siehe PCT-Veröffentlichung WO 93/23 572, a.a.O.). Zu den erfindungsgemässen Ribozymen gehören Ribozyme mit den Merkmalen der Gruppe I-Intron-Ribozyme (Cech, Biotechnology 13 (1995), 323) und "hammerhead"-Ribozyme (Edgington, Biotechnology 10 (1992), 256).
Zu den erfindungsgemässen Ribozymen zählen Ribozyme mit Spaltstellen wie GUA, GUU und GUC. Zu weiteren optimalen Spaltstellen für die Ribozym-vermittelte Hemmung von Telomerase-Aktivität gemäss der vorliegenden Erfindung gehören jene, die in den PCT-Veröffentlichungen WO 94/02 595 und WO 93/23 569 beschrieben sind, wobei beide Dokumente durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen sind. Kurze RNA-Oligonucleotide mit einer Länge von 15 und 20 Ribonucleotiden, die einem Bereich des Ziel-hTRT-Gens entsprechen, der eine Spaltstelle enthält, können bezüglich Sekundärstrukturmerkmalen, die zu wünschenswerteren Oligonucleotiden führen, bewertet werden.
Die Eignung der Spaltstellen kann auch durch Testen der Zugänglichkeit zur Hybridisierung mit komplementären Oligonucleotiden bewertet werden, wobei "Ribonuclease-Protection"-Assays angewandt werden, oder indem die Ribozym-Aktivität in vitro gemäss auf dem Fachgebiet bekannter Standardverfahren getestet wird.
Wie von Hu et al., PCT-Veröffentlichung WO 94/03 596 beschrieben, können "antisense"- und Ribozym-Funktionen in einem einzigen Oligonucleotid kombiniert werden. Dieses Dokument ist hier ebenfalls durch Bezugnahme als Gegenstand dieser Beschreibung anzusehen. Darüber hinaus können Ribozyme eine oder mehrere modifizierte Nucleotide oder modifizierte Bindungen zwischen Nucleotiden umfassen, wie dies vorstehend im Zusammenhang mit der Beschreibung von veranschaulichenden erfindungsgemässen Oligonucleotiden beschrieben ist.
In einer Ausführungsform werden die erfindungsgemässen Ribozyme in vitro erzeugt und in eine Zelle oder einen Patienten eingeführt. In einer anderen Ausführungsform werden Gentherapieverfahren zur Expression von Ribozymen in einer Zielzelle ex vivo oder in vivo angewandt.
d) Verabreichung von Oligonucleotiden
Typischerweise gehört zu den erfindungsgemässen therapeutischen Verfahren die Verabreichung eines Oligonucleotids das so wirkt, dass es unter physiologischen Bedingungen in vivo Telomerase-Aktivität hemmen oder stimulieren kann und das unter diesen Bedingungen für einen Zeitraum, der für eine therapeutische Wirkung ausreicht, relativ stabil ist. Wie bereits vorstehend angegeben, können modifizierte Nucleinsäuren bei der Verleihung einer solchen Stabilität von Nutzen sein, aber auch für die gezielte Zulieferung des Oligonucleotids an das gewünschte Gewebe, Organ oder die gewünschte Zelle.
Oligo- und Polynucleotide können direkt als Arzneimittel in einer geeigneten pharmazeutischen Formulierung zugeliefert werden, oder indirekt durch Mittel zur Einführung einer Nucleinsäure in eine Zelle, wozu Liposome, Immunliposome, ballistische Verfahren, die direkte Aufnahme in Zellen etc., so wie dies hier beschrieben ist, gehören. Zur Behandlung einer Erkrankung werden die erfindungsgemässen Oligonucleotide an den Patienten in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Eine therapeutisch wirksame Menge ist die Menge, die ausreicht, um die Krankheitssymptome zu lindern oder die Telomerase-Aktivität in der Zielzelle zu modulieren, wie dies beispielsweise unter Verwendung eines TRAP-Assays oder anderer geeigneter Assays bezüglich der biologischen Funktion von Telomerase bestimmt werden kann.
Für die Zulieferung von Oligonucleotiden für therapeutische Zwecke geeignete Verfahren sind in dem US-Patent 5 272 065, das hiermit durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen ist, beschrieben. Weitere Details bezüglich der Verabreichung von pharmazeutisch aktiven Verbindungen sind nachstehend beschrieben. In einer weiteren Ausführungsform können Oligo- und Polynucleotide unter Verwendung von Gentherapie und der erfindungsgemässen rekombinanten DNA-Expressionsplasmide zugeliefert werden.
3) Gentherapie
Gentherapie bezieht sich auf die Einführung eines ansonsten exogenen Polynucleotids, das auf die (typischerweise) Säuger-Zelle(n), in das (die) es überführt wird, eine medizinisch nützliche phänotypische Auswirkung hat. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung von Gentherapieverfahren und Zusammensetzungen für die Behandlung von Telomerase assoziierten Zuständen. In veranschaulichenden Ausführungsformen gehört zu der Gentherapie die Einführung eines Vektors in eine Zelle, der ein hTRT-Genprodukt exprimiert (z.B.ein hTRT-Protein, das im wesentlichen dem hTRT-Polypeptid mit einer Sequenz von SEQ. ID.
Nr. 2 gleicht, beispielsweise um Telomerase-Aktivität zu steigern, oder ein inhibitorisches hTRT-Polypeptid zur Herabsetzung der Aktivität), die Expression einer Nucleinsäure mit einer Sequenz eines hTRT-Gens oder einer hTRT-mRNA (z.B. einer "antisense"-RNA, um beispielsweise Telomerase-Aktivität herabzusetzen), die Expression eines Polypeptids oder Polynucleotids, das auf andere Weise die Expression von hTRT-Genprodukten beeinflusst (z.B. ein Ribozym, das zur Herabsetzung von Telomerase-Aktivität gegen hTRT-MRNA gerichtet ist) oder den Austausch, oder das Unterbrechen einer endogenen hTRT-Sequenz (z. B. "gene replacement" und "gene knockout"). Für den Fachmann sind nach Lesen dieser Beschreibung zahlreiche weitere Ausführungsformen offensichtlich. In einer Ausführungsform wird auch ein hTR-codierender Vektor eingeführt.
In einer weiteren Ausführungsform werden auch Telomerase-assoziierte Proteine codierende Vektoren mit oder ohne einen Vektor für hTR eingeführt.
Für die hTRT-Gentherapie nützliche Vektoren können viral oder nicht-viral sein. Dazu zählen die im Zusammenhang mit den erfindungsgemässen hTRT-Expressionssystemen vorstehend beschriebenen Vektoren. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass Gentherapie-Vektoren Promotoren und andere regulatorische oder für die Prozessierung benötigte Sequenzen umfassen können, beispielsweise die hier beschriebenen. Üblicherweise umfassen die Vektoren einen Promotor und gegebenenfalls einen Enhancer (unabhängig von einem Enhancer, der innerhalb der Promotorsequenzen bereits vorhanden ist), die zur Steuerung der Transkription eines Oligoribonucleotids dienen, sowie weitere regulatorische Elemente, die für die Beibehaltung des Vektors als Episom oder für die chromosomale Integration und Transkription auf hohem Niveau sorgen, falls erwünscht.
Ein für die Gentherapie nützliches Plasmid kann weitere funktionelle Elemente umfassen, beispielsweise selektierbare Marker, Identifizierungsbereiche und weitere Sequenzen. Zusätzliche Sequenzen können eine Rolle dabei spielen, sowohl ausserhalb als auch innerhalb der Zelle Stabilität zu verleihen, um für die zielgerichtete Zulieferung von hTRT-Nucleotidsequenzen ("sense" oder "antisense") zu einem gewünschten Organ, Gewebe oder einer Zellpopulation zu bewirken, oder den Eintritt in eine Zelle, in den Nucleus einer Zelle und/oder die Integration innerhalb nucleärer DNA zu vermitteln.
Beispielsweise können Aptamer-ähnliche DNA-Strukturen oder andere Stellen der Einheiten, die Proteine binden, dazu verwendet werden, um die Bindung eines Vektors an Zelloberflächenrezeptoren oder an Serumproteine zu vermitteln, die an einen Rezeptor binden, wodurch die Effizienz des DNA-Transfers in die Zelle erhöht wird. Andere DNA-Stellen und Strukturen können direkt oder indirekt an Rezeptoren in der nucleären Membran oder an andere Proteine, die in den Nucleus wandern, binden, wodurch die nucleäre Aufnahme eines Vektors erleichtert wird. Andere DNA-Sequenzen können direkt oder indirekt die Effizienz der Integration beeinflussen.
Geeignete Vektoren für die Gentherapie können einen Replikationsursprung besitzen oder auch nicht. Beispielsweise ist es nützlich für die Vermehrung des Vektors vor der Verabreichung an einen Patienten einen Replikationsursprung in einen Vektor einzubauen. Der Replikationsursprung kann jedoch oft vor der Verabreichung entfernt werden, wenn der Vektor so entworfen ist, dass er sich in die chromosomale DNA des Wirts integrieren soll oder an die mRNA oder DNA des Wirts binden soll. In einigen Situationen (z.B. bei Tumorzellen) mag es nicht notwendig sein, dass sich die exogene DNA in die transduzierte Zelle stabil integriert, da eine transiente Expression ausreichen kann, um Zellen abzutöten.
Wie bereits erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung auch Verfahren und Reagenzien für die "gene replacement"-Therapie zur Verfügung (d.h. der Austausch eines endogenen hTRT-Gens gegen ein rekombinantes Gen durch homologe Rekombinaton). Es können dafür speziell für eine Integration durch homologe Rekombination entworfene Vektoren verwendet werden. Zu den für die Optimierung der homologen Rekombination wichtige Faktoren zählen das Ausmass der Sequenzidentität und die Länge der Homologie zu chromosomalen Sequenzen. Die spezifische, die homologe Rekombination vermittelnde Sequenz ist ebenfalls wichtig, da eine Integration in transkriptionell aktive DNA wesentlich leichter stattfindet.
Verfahren und Substanzen zur Konstruktion von Konstrukten für eine zielgerichtete homologe Rekombination sind beispielsweise beschrieben in Mansour et al., Nature 336 (1988), 348; Bradley et al., Bio/Technology 10 (1992), 534 und darüber hinaus in US-Patent Nr. 5 627 059; 5 487 992, 5 631 153 und 5 464 764. In einer Ausführungsform umfasst die "gene replacement"-Therapie die Änderung oder den Austausch aller regulatorischen Sequenzen oder eines Teils davon, die die Expression des zu regulierenden hTRT-Gens kontrollieren. Beispielsweise können die hTRT-Promotorsequenzen (z.B. solche, die in SEQ. ID. Nr. 6 (Fig. 21) vorkommen) unterbrochen werden (um so die hTRT-Expression zu verringern oder eine Kontrollstelle für die Transkription zu eliminieren) oder gegen einen exogenen Promotor ausgetauscht sein, beispielsweise um die hTRT-Expression zu erhöhen.
Die Erfindung stellt auch Verfahren und Reagenzien für den hTRT-"gene knockout" bereit (d.h. die Deletion oder Unterbrechung eines endogenen hTRT-Gens durch homologe Rekombination unter Verwendung eines rekombinant hergestellten Vektors). Bei diesem "gene knockout" können die als Ziel in Betracht gezogenen Sequenzen regulatorische Sequenzen sein (z.B. der hTRT-Promotor) oder RNA- oder Protein-codierende Sequenzen. Die Veränderung der Expression von endogenen Genen durch homologe Rekombination ist ausführlich beschrieben in dem US-Patent Nr. 5 272 071 (und den vorstehend zitierten US-Patenten), WO 91/09 955, wo 93/09 222, WO 96/29 411, WO 95/31 560 und WO 91/12 650. Siehe auch Moynahan et al., Hum. Mol. Genet. 5 (1996) 875.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zur spezifischen Abtötung Telomerase-positiver Zellen oder zur Verhinderung der Transformation von Telomerase-negativen Zellen zu einem Telomerase-positiven Status bereit, wobei der hTRT-Genpromotor zur Regulation der Expression eines für die Zelle toxischen Proteins verwendet wird. Wie in Beispiel 14 gezeigt, kann eine hTRT-Promotorsequenz mit einem Reportergen funktionell verknüpft sein, so dass die Aktivierung des Promotors zur Expression des von dem Reportergen codierten Proteins führt. Falls anstelle eines Reporterproteins das codierte Protein für die Zelle toxisch ist, führt die Aktivierung des Promotors zur Zellmorbidität oder zum Tod der Zelle.
Bei einer erfindungsgemässen Ausführungsform wird ein Vektor, der ein ein toxisches Protein codierendes Gen umfasst, das mit einem hTRT-Promotor funktionell verknüpft ist in Zellen, wie menschliche Zellen, beispielsweise Zellen in einem menschlichen Patienten, eingeführt, was zum Zelltod bei denjenigen Zellen führt, in denen hTRT-Promotor aktivierende Faktoren exprimiert werden, wie beispielsweise Krebszellen. Bei einer verwandten Ausführungsform ist das codierte Protein selbst nicht toxisch für eine Zelle, codiert jedoch eine Aktivität, die die Zelle gegenüber einem ansonsten nicht-toxischen Wirkstoff empfindlich macht. Tumore können beispielsweise durch Einführung eines hTRT-Promotor-Herpes-Thymidinkinase (TK)-Genfusionskonstrukts in Tumorzellen und die Verabreichung von Gangcyclovir oder des Äquivalents behandelt werden (siehe beispielsweise Moolton und Wells, J. Natl. Canc.
Inst. 82 (1990), 297). Auf dem Fachgebiet sind auch zahlreiche weitere geeignete toxische oder potentiell toxische Proteine und Systeme bekannt (wobei sich von hTRT unterscheidende Promotorsequenzen verwendet werden), die vom Fachmann nach Lesen dieser Beschreibung gemäss der vorliegenden Erfindung modifiziert und verabreicht werden können.
Vektoren für die Gentherapie können in Zellen oder Gewebe in vivo, in vitro oder ex vivo eingeführt werden. Für die ex vivo-Therapie können Vektoren in von dem Patienten entnommene Stammzellen eingeführt werden und für die autologe Rücktransplantation in den selben Patienten clonal propagiert werden (siehe beispielsweise die US-Patente 5 399 493 und 5 437 994, wobei durch Bezugnahme diese Dokumente als Bestandteil der Beschreibung angesehen werden können).
Zu den Zellen, die als Ziel für die hTRT-Gentherapie mit dem Ziel der Steigerung der Telomerase-Aktivität in einer Zielzelle in Betracht kommen, zählen, allerdings ohne Beschränkung darauf, Embryonalzellen oder Keimzellen, insbesondere Primatenzellen oder menschliche Zellen, wie vorstehend angemerkt, hematopoetische Stammzellen (AIDS und nach der Chemotherapie), vaskuläre Endothelialzellen, (Erkrankungen der Herzgefässe und zerebralen Gefässe), Hautfibroblasten und Unterhautkeratinocyten (Wundheilung und Verbrennungen) Chondrocyten (Arthritis), Hirnastrocyten und Microglialzellen (Alzheimer Krankheit), Osteoblasten (Osteoporose) Retinazellen (Augenerkrankungen) und Pankreas-Inselzellen (Typ I Diabetes) sowie die in der nachstehenden Auflistung 1 aufgezählten Zellen.
In einer erfindungsgemässen Ausführungsform wird ein mit einer TRT-codierenden Sequenz (oder einer Variante davon) funktionell verknüpfter induzierbarer Promotor zur Modulation der Proliferationsfähigkeit von Zellen in vivo oder in vitro verwendet. In einer besonderen Ausführungsform werden beispielsweise Insulin-produzierende Pankreaszellen, die mit einem hTRT-Expressionsvektor unter der Kontolle eines induzierbaren Promotors transfiziert sind, in einen Patienten eingeführt. Die Proliferationsfähigkeit der Zellen kann dann durch Verabreichung des den Promotor aktivierenden Mittels (z.B. Tetracyclin) an den Patienten kontrolliert werden, wobei dadurch sich die Zellen stärker vermehren können, als dies ansonsten möglich gewesen wäre.
Die Zellproliferation kann dann, je nach dem, wie es von dem behandelnden Arzt gewünscht wird, beendet, fortgesetzt oder erneut initiiert werden.
4) Vakzine und Antikörper
Immunogene Peptide oder Polypeptide mit einer hTRT-Sequenz können dazu verwendet werden, um eine anti-hTRT-Immunantwort in einem Patienten hervorzurufen (d.h. sie können als Vakzin wirken). Beispiele für immunogene hTRT-Peptide und Polypeptide sind nachstehend in den Beispielen 6 und 8 beschrieben. Eine Immunantwort kann auch durch Zulieferung von Plasmidvektoren, die das gewünschte Polypeptid codieren (d.h. die Verabreichung von "nackter DNA") ausgelöst werden. Die gewünschten Nucleinsäuren können durch Injektion, Liposome oder andere Verabreichungsmassnahmen zugeliefert werden. In einer Ausführungsform werden Immunosierungsarten ausgewählt, die in der Versuchsperson bzw. dem Patienten eine auf die MHC Klasse I restringierte Antwort cytotoxischer Lymphocyten gegen Telomerase exprimierende Zellen auslösen.
Nach der Immunisierung wird in der Person oder dem Tier eine erhöhte Immunantwort gegen Zellen hervorgerufen, die hohe Konzentrationen von Telomerase exprimieren (z.B. maligne Zellen).
Anti-hTRT-Antikörper, beispielsweise von der Maus, vom Menschen, oder humanisierte monoclonale Antikörper können ebenfalls zur Erzielung einer Immunantwort gegen Telomeraseexprimierende Zellen verabreicht werden (z.B. passive Immunisierung).
F) Arzneimittel
Verwandte Aspekte der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf die Bereitstellung von Arzneimitteln, die hTRT-Oligo- und -Polynucleotide, -Polypeptide und -Antikörper, -Agonisten, -Antagonisten oder -Hemmstoffe, allein oder in Kombination mit mindestens einem weiteren Mittel, wie beispielsweise einer stabilisierenden Verbindung, einem Verdünnungsmittel, einem Träger oder einem anderen aktiven Bestandteil oder Agens, umfassen.
Die erfindungsgemässen Arzneimittel können in einem sterilen, biokompatiblen pharmazeutischen Träger, zu dem beispielsweise, jedoch ohne Beschränkung darauf, eine Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose und Wasser gehören, verabreicht werden. Jedes dieser Moleküle kann dem Patienten allein verabreicht werden oder in Kombination mit anderen Mitteln, Arzneimitteln oder Hormonen, in Arzneimitteln, wo es mit einem oder mehreren geeigneten Exzipienten, Hilfsstoffen und/oder pharmazeutisch verträglichen Trägern vermischt ist. In einer erfindungsgemässen Ausführung ist der pharmazeutisch verträgliche Träger pharmazeutisch inert.
Die Verabreichung der Arzneimittel kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle (z.B. direkt zu dem Tumor), intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Zusätzlich zu den aktiven Bestandteilen können diese Arzneimittel geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen, die Exzipienten und andere Verbindungen umfassen, die die Verarbeitung der aktiven Bestandteile zu Zubereitungen erleichtern, die pharmazeutisch verwendet werden können. Weitere Details bezüglich Verfahren zur Formulierung und Verabreichung können in der neuesten Ausgabe von "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Maack Publishing Co., Easton PA) gefunden werden.
Arzneimittel für die orale Verabreichung können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet gut bekannten pharmazeutisch verträglichen Trägern in Dosen, die für eine orale Verabreichung geeignet sind, formuliert werden. solche Träger erlauben die Formulierung der Arzneimittel als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirups, Aufschlämmungen, Suspensionen etc., die für die Aufnahme durch den Patienten geeignet sind. Siehe PCT-Veröffentlichung WO 93/23 572.
Arzneimittel für die orale Verwendung können durch die Kombination von aktiven Bestandteilen mit einem festen Exzipienten, gegebenenfalls durch Mahlen eines erhaltenen Gemischs, erhalten werden und Weiterverarbeitung des Granulatgemisches nach Zugabe geeigneter zusätzlichen Verbindung, umso, falls erwünscht, Tabletten oder Drageekerne zu erhalten. Geeignete Exzipienten sind Kohlenhydrat- oder Proteinfüllstoffe, dazu zählen, allerdings ohne Beschränkung darauf, Zucker, einschliesslich Lactose, Saccharose, Mannit oder Sorbit; Stärke aus Mais, Weizen, Reis, Kartoffel oder anderen Pflanzen; Cellulose, wie beispielsweise Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose oder Natriumcarboxymethylcellulose und Gummis, zu denen Gummi arabicum und Tragacanthharz zählen, sowie Proteine, wie beispielsweise Gelatine und Collagen.
Falls erwünscht, können den Zerfall bewirkende oder solubisierende Agenzien zugegeben werden, beispielsweise quer vernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar, Alginsäure oder ein Salz davon, beispielsweise Natriumalginat.
Drageekerne werden mit geeigneten Überzügen versehen, beispielsweise konzentrierten Zuckerlösungen, sie können auch Gummi arabicum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, "Carbopol"-Gel, Polyethylenglykol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsgemische enthalten. Zu den Überzügen für die Tabletten oder Dragees können Farbstoffe oder Pigmente zugefügt werden, um das Produkt zu kennzeichnen oder die Menge an aktivem Wirkstoff (d.h. die Dosierung) zu kennzeichnen.
Zu den oral zu verwendenden Arzneimitteln gehören aus Gelatine hergestellte Steckkapseln sowie weiche verschlossene Kapseln, die aus Gelatine und einem Überzug aus Glycerin oder Sorbit hergestellt sind. Steckkapseln können die aktiven Bestandteile, vermischt mit einem Füllstoff oder Bindemitteln enthalten, dazu gehören Lactose oder Stärken, Gleitmittel, wie Talg oder Magnesiumstearat, und gegebenenfalls Stabilisatoren. In weichen Kapseln können die aktiven Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten gelöst oder suspendiert sein, beispielsweise in Fettsäuren, flüssigem Paraffin oder flüssigem Polyethylenglykol mit oder ohne Stabilisatoren. Zu den Arzneimitteln für die parenterale Verabreichung gehören wässrige Lösungen mit aktiven Verbindungen.
Für die Injektion kann das erfindungsgemässe Arzneimittel in wässrige Lösungen formuliert werden, vorzugsweise in physiologisch kompatible Puffer, wie beispielsweise Hank's-Lösung, Ringer-Lösung oder in physiologisch gepufferter Kochsalzlösung. Wässrige Suspensionen für die Injektion können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit oder Dextran. Zusätzlich können Suspensionen der aktiven Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Zu den geeigneten lipophilen Lösungsmitteln oder Vehikeln gehören Fettsäuren, wie beispielsweise Sesamöl oder synthetische Fettsäureester, wie beispielsweise Ethyloleat oder Triglyceride oder Liposome.
Gegebenenfalls können die Suspensionen auch geeignete Stabilisatoren enthalten, oder Mittel, die die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um so die Herstellung von hochkonzentrierten Lösungen zu gestatten.
Für die topische oder nasale Verabreichung werden in der Formulierung Penetrantien verwendet, die für die spezifische zu durchdringenden Barrieren geeignet sind. Solche Penetrantien sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt.
Die erfindungsgemässen Arzneimittel können durch Verfahren, die den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren gleichen, hergestellt werden (z.B. durch übliche Vermischungs-, Lösungs-, Granulierungs-, Drageeherstellungs-, Pulverisierungs-, Emulgierungs-, Einkapselungs-, Einschluss- oder Lyophilisierungsverfahren).
Die Arzneimittel können als ein Salz bereitgestellt werden und können mit vielen Säuren hergestellt werden, dazu zählen, allerdings ohne Beschränkung darauf, Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Milchsäure, Weinsäure, Apfelsäure, Bernsteinsäure etc. Salze neigen dazu, in wässrigen oder anderen protonischen Lösungsmitteln löslicher zu sein als die entsprechende Form der freien Base. In anderen Fällen kann die bevorzugte Zubereitung ein lyophilisiertes Pulver in 1 mM-50 mM Histidin, 0,1% bis 2% Saccharose, und 2% bis 7% Mannit bei einem pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 5,5 sein, das vor der Verwendung mit einem Puffer kombiniert wird.
Nach der Herstellung der Arzneimittel, die eine in einem verträglichen Träger formulierte erfindungsgemässe Verbindung umfassen, können sie in einen geeigneten Behälter gegeben und entsprechend der Behandlung eines angegebenen Krankheitszustands markiert werden. Bei der Verabreichung von menschlichen Telomerase-Proteinen und -Nucleinsäuren würde zu einer solchen Markierung die Angabe der Menge und Häufigkeit der Verabreichung sowie des Verabreichungsverfahrens zählen.
Zu den für die erfindungsgemässe Verwendung geeigneten Arzneimitteln zählen Zusammensetzungen, bei denen die aktiven Bestandteile zur Erzielung des gewünschten Zwecks in einer wirksamen Menge enthalten sind. "Therapeutisch wirksame Menge" oder "pharmakologisch wirksame Menge" sind allgemein gebräuchliche Ausdrücke und beziehen sich auf die Menge eines Agens, der das gewünschte pharmakologische Ergebnis wirksam hervorrufen kann. Somit ist eine therapeutisch wirksame Menge eine Menge, die ausreicht, um die Symptome der zu behandelnden Erkrankung zu verbessern.
Ein nützliches Assay zur Bestimmung einer wirksamen Menge für eine vorgegebene Anwendung (z.B. einer therapeutisch wirksamen Menge) besteht in der Messung des Effekts auf Telomerase-Aktivität in einer Zielzelle. Die tatsächlich verabreichte Menge hängt von der zu behandelnden Person ab und stellt vorzugsweise eine so optimierte Menge dar, dass der gewünschte Effekt ohne wesentliche Nebenwirkungen erzielt wird. Die Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Dosis liegt im Bereich der Fähigkeiten des Fachmanns.
Für jede beliebige Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis anfänglich entweder in Zellkulturassays oder mittels eines geeigneten Tiermodells bestimmt werden. Das Tiermodell wird auch dazu verwendet, um einen geeigneten Konzentrationsbereich und einen geeigneten Verabreichungsweg zu ermitteln. So gewonnene Informationen können dann dazu verwendet werden, nützliche Dosen und Verabreichungswege im Menschen zu bestimmen.
Eine therapeutisch wirksame Menge bezieht sich auf die Menge an Protein, Polypeptid, Peptid, Antikörper, Oligo- oder Polynucleotid, Agonist oder Antagonist, die die Symptome oder den Zustand bessert. Die therapeutische Wirksamkeit und Toxizität solcher Verbindungen kann durch pharmazeutische Standardprozeduren in Zellkulturen oder an Versuchstieren bestimmt werden (z.B. ED50, die in 50% der Population therapeutisch wirksame Dosis; und LD50, die in 50% der Population tödliche Dosis). Der therapeutische Index bezeichnet das Dosisverhältnis zwischen therapeutischen und toxischen Wirkungen und es kann als das Verhältnis ED5O/LD50 ausgedrückt werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen grossen therapeutischen Index aufweisen, sind bevorzugt.
Die von Zellkulturassays und Tierstudien gewonnenen Daten werden zur Bestimmung des Dosierungsbereichs für die Anwendung beim Menschen verwendet. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von Umlaufkonzentrationen, die die ED50 einschliessen, mit einer geringen oder keiner Toxizität. Die Dosierung variiert innerhalb dieses Bereichs in Abhängigkeit von der angewandten Dosierungsform, der Empfindlichkeit des Patienten und des Verabreichungswegs.
Die exakte Dosierung wird von dem jeweiligen Arzt indivduell für den zu behandelnden Patienten ausgewählt. Die Dosierung und Verabreichung werden so eingestellt, dass sie einen ausreichenden Spiegel der aktiven Einheit bereitstellen, oder den gewünschten Effekt aufrechterhalten.
Zu den zusätzlichen Faktoren, die beachtet werden müssen, zählen die Schwere des Krankheitszustands (beispielsweise die Tumorgrösse und -Lage; das Alter, das Gewicht und Geschlecht des Patienten; die Ernährung sowie der Zeitpunkt und die Häufigkeit der Verabreichung, die Kombination(en) von Arzneimittel, Reaktionsempfindlichkeit und Toleranz gegenüber bzw. Ansprechen auf die Therapie). Langwirkende Arzneimittel können alle 3 bis 4 Tage verabreicht werden, jede Woche, oder einmal alle 2 Wochen in Abhängigkeit von der Halbwertszeit und der "clearance"-Rate der speziellen Formulierung. Eine Anleitung bezüglich spezieller Dosierungen und Darreichungsverfahren ist in der Literatur zu finden (siehe US-Patent Nr. 4 657 760, 5 206 344 und 5 225 212, wobei diese Dokumente durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden können).
Der Fachmann wird für Nucleotide andere Formulierungen verwenden als für Proteine oder ihre Inhibitoren. Genauso ist die Verabreichung von Polynucleotiden oder Polypeptiden spezifisch für bestimmte Zellen, Zustände, Lagen etc.
VIII. Die Steigerung der Proliferationsfähigkeit und die Herstellung von immortalisierten Zellen,
Zellinien und Tieren
Wie bereits vorstehend diskutiert, zeigen die meisten Vertebratenzellen nach einer begrenzten Anzahl von Teilungen in der Kultur (z.B. 50 bis 100 Teilungen) Seneszenz. Bestimmte Zellvarianten können sich jedoch in Kultur unbegrenzt teilen (z.B. HeLa-Zellen, 293-Zellen) und sind aus diesem Grund von Nutzen für die Forschung und industrielle Anwendung. Gewöhnlich werden solche unsterblichen Zellinien von spontan entstehenden Tumoren oder nach Transformation durch Exposition gegenüber Strahlung oder einem Tumor-induzierenden Virus oder einer Tumor-induzierenden Chemikalie erhalten. Leider steht nur eine begrenzte Auswahl von Zellinien, insbesondere von menschlichen Zellinien, die differenzierte Zellfunktion zeigen, zur Verfügung. Darüber hinaus sind die zur Zeit verfügbaren unsterblichen Zellinien durch chromosomale Anomalien gekennzeichnet (z.B.
Aneuploidie, Gen-Rearrangements oder Mutationen). Ferner sind viele der bereits lang etablierten Zellinien relativ undifferenziert (z.B. stellen sie nicht solch hochspezialisierte Produkte her, die für bestimmte Gewebe oder Organe einzigartig sind). Es besteht somit ein Bedarf an neuen Verfahren zur Erzeugung unsterblicher Zellen, insbesondere menschlicher Zellen. Eine Verwendung von immortalisierten Zellen bezieht sich auf die Herstellung von natürlichen Proteinen und rekombinanten Proteinen (z.B. therapeutische Polypeptide) oder Antikörper, für die eine stabile genetisch normale Zellinie bevorzugt wird. Für die Herstellung einiger rekombinanter Proteine können auch spezialisierte Zelltypen bevorzugt werden (z.B. Pankreaszellen für die Herstellung von menschlichem Insulin).
Eine weitere Verwendungsmöglichkeit für immortalisierte Zellen ist die Einführung in einen Patienten für eine Gentherapie oder für den Austausch von erkrankten oder beschädigten Zellen oder Gewebe. Beispielsweise können autologe Immunzellen, die beispielsweise ein erfindungsgemässes rekombinantes hTRT-Gen oder Polypeptid enthalten oder exprimieren für einen Zellaustausch in einem Patienten nach einer aggressiven Krebstherapie, beispielsweise nach der Bestrahlung des gesamten Körpers, verwendet werden. Eine weitere Verwendungsmöglichkeit für immortalisierte Zellen besteht in der ex vivo-Herstellung von "künstlichen" Geweben oder Organen (z.B. Haut) für eine therapeutische Anwendung.
Eine weitere Verwendung solcher Zellen besteht im Screenen nach Wirkstoffen oder der Bestätigung der Wirkung von Wirkstoffen, beispielsweise Telomerase-hemmenden Wirkstoffen, oder bei der Herstellung von Vakzinen. Für den Fachmann sind weitere Verwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemässen Zellen offensichtlich.
Die erfindungsgemässen immortalisierten Zellen und Zellinien sowie solche mit lediglich erhöhter Replikationsfähigkeit werden durch Steigerung von Telomerase-Aktivität in der Zelle erzeugt. Es kann dabei jedes hier beschriebene Verfahren zur Steigerung von Telomerase-Aktivität angewendet werden. Somit werden in einer Ausführungsform Zellen durch Steigerung der Menge an hTRT-Polypeptid in der Zelle immortalisiert. In einer Ausführungsform wird der hTRT-Spiegel durch Einführung eines hTRT-Expressionsvektors in die Zelle (wobei gelegentlich eine stabile Transfektion bevorzugt wird) erhöht. Wie bereits vorstehend diskutiert ist die hTRT-codierende Sequenz normalerweise mit einem Promotor funktionell verknüpft, der in der Zelle induzierbar oder konstitutiv aktiv sein kann.
*In einer Ausführungsform umfasst ein Polynucleotid eine Sequenz, die ein Polypeptid der SEQ. ID. Nr. 2 umfasst, wobei die Sequenz mit einem Promotor (z.B. einem konstitutiv exprimierten Promotor, z.B. eine Sequenz von SEQ. ID. Nr. 6 (Fig. 6)) funktionell verknüpft ist und wobei das Polynucleotid in die Zelle eingeführt wird. In einer Ausführungsform umfasst das Polynucleotid eine Sequenz von SEQ. ID. Nr. 1. Vorzugsweise enthält das Polynucleotid Polyadenylierungs- und Terminationssignale. In weiteren Ausführungsformen sind zusätzliche Elemente, wie Enhancer oder solche wie sie vorstehend diskutiert wurden, enthalten.
In einer alternativen Ausführungsform enthält das Polynucleotid keine Promotorsequenz, wobei dann eine solche Sequenz durch das endogene Genom der Zielzelle nach Integration (z.B. durch Rekombination, z.B. homologe Rekombination) des eingeführten Polynucleotids bereitgestellt wird. Das Polynucleotid kann durch jedes beliebige Verfahren in die Zielzelle eingeführt werden, dazu zählen die hier beschriebenen Verfahren (wie beispielsweise Lipofektion, Elektroporation, Virosome, Liposome, Immunliposome, Polykation/Nucleinsäure-Konjugate, nackte DNA).
Unter Verwendung der erfindungsgemässen Verfahren kann eine beliebige Vertebraten-Zelle dazu gebracht werden, eine gesteigerte Proliferationsfähigkeit zu zeigen oder sogar immortalisiert zu sein und in Kultur unbegrenzt erhalten zu bleiben. In einer Ausführungsform sind die Zellen Säugerzellen, wobei für viele Anwendungen menschliche Zellen bevorzugt sind. Zu den menschlichen Zellen, die immortalisiert werden können, gehören die in Auflistung 1 aufgezählten Zellen.
Natürlich können die nachstehend beschriebenen erfindungsgemässen "diagnostischen" Assays dazu verwendet werden, um die erfindungsgemässen immortalisierten Zellen zu identifizieren und zu charakterisieren.
Auflistung 1
Menschliche Zellen, in denen die hTRT-Expression gesteigert werden kann
Hornbildende Epithel-Zellen
Keratinocyten der Epidermis (sich differenzierende Epidermiszellen)
Basalzellen der Epidermis (Stammzellen)
Keratinocyten der Fingernägel und Zehennägel
Basalzellen des Nagelbetts (Stammzellen)
Zellen des Haarschafts
medulläre, kortikale, kutikuläre Zellen; Zellen der Haarwurzelscheide, kutikuläre Zellen, Zellen der Huxley-Schicht, externe Zellen der Henle-Schicht; Haarkeimzellen (Stammzellen)
Zellen der feuchten mehrschichtigen Grenzepithele
Oberflächen-Epithelzellen des mehrschichtigen Plattenepithels der Zunge, der Mundhöhle, der Speiseröhre, des Analkanals, der distalen Harnröhre, der Vagina
Basalzellen dieser Epithele (Stammzellen)
Zellen des äusseren Hornhautepithels
Zellen des Harnepithels (das die Blase und die Harnleiter auskleidet)
Epithelzellen, die auf die exokrine Sekretion spezialisiert sind
Zellen der Speicheldrüsen
schleimsezernierende Zellen (Sekret reich an Polysacchariden)
seröse Drüsenzellen (Sekret reich an Glycoproteinenzymen)
Zellen der von Ebner-Drüsen in der Zunge (Sekret umspült die Geschmacksknospen)
Zellen der Brustdrüse, sezernieren Milch
Zellen der Tränendrüse, sezernieren Tränen
Zellen der Zeruminaldrüse des Ohres, sezernieren Zerumen
Zellen der ekkrinen Schweissdrüsen, sezernieren Glycoproteine (dunkle Zellen)
Zellen der ekkrinen Schweissdrüsen, sezernieren kleine Moleküle (helle Zellen)
Zellen der apokrinenSchweissdrüsen (Duftsekret, Geschlechtshormon-sensitiv)
Zellen der Moll-Drüsen im Augenlid (spezialisierte Schweissdrüse)
Zellen der Talgdrüsen, sezernieren Lipid-reiches Sebum
Zellen der Bowman-Drüsen in der Nase (Sekret umspült das Riechepithel)
Zellen der Brunner-Drüsen im Duodenum,
sezernieren alkalische Lösung bestehend aus Schleim und Enzymen
Zellen der Samenblase, sezernieren Bestandteile der Samenflüssigkeit einschliesslich Fructose (als Treibstoff für darin schwimmende Spermien)
Zellen der Vorsteherdrüse, sezernieren andere Bestandteile der Samenflüssigkeit
Zellen der Bulbourethraldrüse, sezernieren Schleim
Zellen der Bartholin-Drüse, sezernieren Vaginalsekret
Zellen der Littré-Drüse, sezernieren Schleim
Zellen der Uterusschleimhaut, sezernieren vornehmlich Kohlenhydrate
isolierte Becherzellen des Atmungs- und Verdauungstrakts,
sezernieren Schleim
schleimsezernierende Zellen der Magenschleimhaut
Hauptzellen der Magendrüsen, sezernieren Pepsinogen
Parietalzellen der Magendrüsen, sezernieren HCl
Acinuszellen der Bauchspeicheldrüse, sezernieren Verdauungsenzyme und Bicarbonat
Paneth-Zellen des Dünndarms,
sezernieren Lysozym
Typ-II-Alveolarzellen der Lunge, sezernieren Surfactant Clara-Zellen der Lunge
Zellen, die auf die Sekretion von Hormonenspezialisiert sind
Zellen des Hypophysenvorderlappens, sezernieren Wachstumshormon, Follikel-stimulierendes Hormon, luteinisierendes Hormon, Prolactin, adrenocorticotropes Hormon und thyreotropes Hormon
Zellen des Hypophysenmittellappens, sezernieren melanocytenstimulierendes Hormon
Zellen des Hypophysenhinterlappens, sezernieren Oxytocin, Vasopressin
Zellen des Intestinums, sezernieren Serotonin, Endorphin, Somatostatin, Gastrin, Sekretin, Cholecystokinin, Insulin und Glucagon
Zellen der Schilddrüse, sezernieren Schilddrüsenhormon, Calcitonin
Zellen der Nebenschilddrüse, sezernieren Parathormon, oxyphile Zellen
Zellen der Nebenniere, sezernieren Epinephrin, Norepinephrin und Steroidhormone
Mineralocorticoide
Glucocorticoide
Zellen der Gonaden, sezernieren Testosteron (Leydig-Zellen der Hoden) \strogen (innere Thekazellen des Eifollikels)
Progesteron (Gelbkörperzellen des geborstenen Eifollikels)
Zellen des juxtaglomerulären Apparats der Niere juxtaglomeruläre Zellen (sezernieren Renin)
Macula-densa-Zellen
peripolare Zellen
Mesangialzellen
Absorbierende Epithelzellen im Intestinum, den exokrinen Drüsen und dem Urogenitaltrakt
Bürstensaumzellen des Intestinums (mit Kleinzotten)
mehrschichtige Ductuszellen exokriner Drüsen
Gallenblasen-Epithelzellen
Bürstensaumzellen des proximalen Tubulus der Niere
distale Tubuluszellen der Niere
nicht-bewimperte Zellen des Ductulus efferens
Nebenhoden-Hauptzellen
Nebenhoden-Basalzellen
Auf Stoffwechsel und Speicherung spezialisierte Zellen
Hepatocyten (Leberzellen)
Fettzellen
weisse Fettzellen
braune Fettzellen
Lipocyten der Leber
Epithelzellen,die vornehmlich eine schützende Funktion haben und die die Lunge, das Intestinum, die exokrinen Drüsen und den Urogenitaltrakt auskleiden
Typ-I-Pneumocyten (kleiden den Luftraum der Lunge aus)
Pankreasgangzellen (zentroazinäre Zellen)
nicht-mehrschichtige Ductuszellen der Schweissdrüse, der Speicheldrüse, der Brustdrüse
Parietalzellen des Nierenglomerulus
Podocyten des Nierenglomerulus
Zellen des dünnen Segments der Henle-Schleife (in der Niere)
Sammelrohrzellen (in der Niere)
Ductuszellen der Samenblase, Vorsteherdrüse
Epithelzellen, die geschlossene innere Körperhöhlen auskleiden
vasculäre Endothelzellen der Blutgefässe und der Lymphgefässe
fenestrierte Zellen
kontinuierliche Zellen
Milzzellen
Synovialzellen (kleiden die Gelenkhöhlen aus, sezernieren vornehmlich Hyaluronsäure)
Serosazellen (kleiden die Peritoneal-, Pleura- und Perikardhöhle aus)
Plattenepithelzellen, die den perilymphatischen Raum des Ohrs auskleiden
Zellen, die den endolymphatischen Raum des Ohrs auskleiden
Plattenepithelzellen
hochprismatische Epithelzellen des Saccus endolymphaticus
mit Kleinzotten
ohne Kleinzotten
"dunkle" Zellen
Zellen der Reissner-Membran (die den Zellen des Plexus choroideus ähneln)
vaskuläre Stria-Basalzellen
vaskuläre Stria-von-Ebner-Halbmond-Zellen
Claudius-Zellen
Böttcher-Zellen
Plexus-choroideus-Zellen (sezernieren Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit)
Plattenepithelzellen der weichen Hirn- und Rückenmarkshaut
Ziliarepithelzellen des Auges
pigmenthaltige Zellen nicht-pigmenthaltige Zellen
Zellen des inneren Korneaepithels
Zilientragende Zellen mit propulsiver Funktion
des Atmungstrakts
der Eileiter und der Gebärmutterschleimhaut (bei der Frau)
des Haller-Netzes und des Ductulus efferens (beim Mann)
des zentralen Nervensystems (Ependymzellen, die die Hirnhöhle auskleiden)
Zellen, die auf die Sekretion extrazellulärer matrix spezialisiert sind
Epithelzellen:
Ameloblasten (sezernieren den Zahnschmelz)
Ebner-Halbmondzellen des Gleichgewichtsorgans des Ohrs (sezernieren Proteoglycan)
Interdentalzellen des Corti-Organs (sezernieren Membrana tectoria, die die Haarzellen des Corti-Organs bedeckt)
Nichtepithelzellen (Bindegewebe)
Fibroblasten (verschiedene Fibroblasten des lockeren Bindegewebes, der Kornea, der Sehnen, des retikulären Bindegewebes des Knochenmarks etc.)
Pericyten der Blutkapillaren
Nucleus-pulposus-Zellen der Bandscheibe
Cementoblasten/Cementocyten (sezernieren knochenartigen Zementum der Zahnwurzel)
Odontoblasten/Odontocyten (sezernieren das Zahndentin)
Chondrocyten
Hyalinknorpel, Faserknorpel, elastische Knorpel
Osteoblasten/Osteocyten
Osteoprogenitorzellen (Stammzellen der osteoblasten)
Hyalocyten des Glaskörpers des Auges Sternzellen deg perilymphatischen Raums des Ohres
Kontraktionsfähige Zellen
Skelettmuskelzellen
rote Zellen (langsam)
weisse Zellen (schnell)
intermediäre Zellen
Kernhaufenzellen der Muskelspindel
Kernkettenzellen der Muskelspindel
Satellitenzellen (Stammzellen)
Herzmuskelzellen
normale Zellen
Knotenzellen
Purkinje-Faserzellen
Zellen der glatten Muskulatur
Myoepithelzellen
der Iris
der exokrinen Drüsen
Zellen des Blut- und Immunsystems
rote Blutkörperchen
Megakaryocyten
Makrophagen
Monocyten
Makrophagen des Bindegewebes (verschiedene Arten)
Langerhans-Zellen (in der Epidermis)
Osteoklasten (im Knochen)
dendritische Zellen (im Lymphgewebe)
Mikrogliazellen (im zentralen Nervensystem)
Neutrophile
Eosinophile
Basophile
Mastzellen
T-Lymphocyten
T-Helferzellen
T-Suppressorzellen
zytotoxische T-Zellen
B-Lymphocyten
Igm
IgG
IgA
IgE
Killerzellen
Stammzellen für das Blut- und Immunsystem (verschiedene Arten)
Sinneszellen
Photorezeptorzellen
Stäbchenzellen
Zapfenzellen
blau-empfindliche Zellen
grün-empfindliche Zellen
rot-empfindliche Zellen
Zellen des Hörorgans
innere Haarzelle des Corti-Organs
äussere Haarzelle des Corti-Organs
Zellen zur Wahrnehmung von Beschleunigung und Schwerkraft
Typ-I-Haarzellen des Gleichgewichtsorgans des Ohrs
Typ-II-Haarzellen des Gleichgewichtsorgans des Ohrs
Geschmackszellen
Typ-II-Geschmacksknospenzellen
Zellen zur Wahrnehmung von Gerüchen
Riechneuronen
Basalzellen des Riechepithels (Stammzellen für Riechneuronen)
Zellen zur Bestimmung des pH-Wertes des Bluts Karotiskörperzellen
Typ-I-Zellen
Typ-II-Zellen
Zellen zur Wahrnehmung von Berührungen
Merkelzellen der Epidermis
primäre sensible Neuronen, auf Wahrnehmung von Berührungen spezialisiert
Zellen zur Wahrnehmung von Temperatur
primäre sensible Neuronen,
auf Wahrnehmung von Temperatur spezialisiert
Kälte-empfindliche Zellen
Wärme-empfindliche Zellen
Zellen zur Wahrnehmung von Schmerz
primäre sensible Neuronen, auf Wahrnehmung von Schmerz spezialisiert
Strukturen und Kräfte im Bewegungsapparat
proprioceptive primäre sensible Neuronen
Autonome Neuronen
cholinerge Neuronen
adrenerge Neuronen
peptiderge Neuronen
Zellen, die die Sinnesorgane und die peripheren Neuronen unterstützen
Stützzellen des Corti-Organs
innere Pfeilerzellen
äussere Pfeilerzellen
innere Phalangealzellen
äussere Phalangealzellen
Grenzzellen
Hensen-Zellen
Stützzellen des Gleichgewichtsorgans
Stützzellen der Geschmacksknospen (Typ-I-Geschmacksknospenzellen)
Stützzellen des Riechepithels
Schwann-Zellen
Satellitenzellen (umschliessen die peripheren Nervenzellen)
Darm-Gliazellen
Neuronen und Gliazellen des zentralen Nervensystems
Neuronen
Gliazellen
Astrocyten
Oligodendrocyten
Zellen der Linse
Epithelzellen der Vorderlinse
Linsenfaserzellen (Kristallin-enthaltende Zellen)
Pigmentzellen
Melanocyten
pigmenthaltige Epithelzellen der Netzhaut
Keimzellen
Oogonium, Oocyten
Spermatocyten
Spermatogonium (Stammzellen für Spermatocyten)
Ammenzellen
Eifollikelzellen
Sertolizellen (in den Hoden)
Thymus-Epithelzellen
Stammzellen
embryonale Stammzellen
embryonale Keimzellen
Stammzellen des Erwachsenen
fötale Stammzellen
IX. Diagnostische Assays
A. Einführung
1)TRT-Assays
Die vorliegende Erfindung stellt eine grosse Anzahl von Assays für TRT, vorzugsweise hTRT, und Telomerase bereit. Diese Assays liefern unter anderem die Basis für empfindliche, preiswerte, leicht zu handhabende und in einem weiten Bereich anwendbare Assays für die Diagnose und Prognose einer Reihe von menschlichen Erkrankungen, zu denen als veranschaulichendes Beispiel Krebs zählt. Wie bereits vorstehend angemerkt, ist die Menge an hTRT-Genprodukten (Protein und mRNA) in unsterblichen menschlichen Zellen im Vergleich zu den meisten normalen sterblichen Zellen (d.h. Telomerase-negative Zellen und die meisten Telomerasepositiven normalen somatischen Zellen von Erwachsenen) gewöhnlich erhöht.
Somit besteht ein Aspekt der Einfügung in der Bereitstellung von Assays, die zum Nachweis unter der Bestimmung der Anwesenheit, des Fehlens oder der Menge eines hTRT-Genprodukts in einer Probe, um so die Zellen als unsterblich (beispielsweise eine maligne Tumorzelle), sterblich (wie beispielsweise die meisten somatischen Zellen in Erwachsenen), als Telomerase-positiv oder Telomerase-negativ charakterisieren zu können, wobei die Probe von menschlichen oder anderen Säugerzellen oder eukaryotischen Zellen stammt oder diese enthält.
Jeder Zustand, der durch die Anwesenheit oder das Fehlen eines hTRT-Genprodukts (d.h. Protein oder RNA) gekennzeichnet ist, kann unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren und Substanzen diagnostiziert werden. Zu diesen gehören, so wie dies ausführlicher nachstehend beschrieben wird, Krebserkrankungen, andere mit beschleunigter Zellproliferation einhergehende Erkrankungen, immunologische Funktionsstörungen, Fruchtbarkeit, Unfruchtbarkeit etc. Da das Ausmass, in dem Telomerase Aktivität in Krebszellen erhöht ist, mit den Merkmalen des Tumors, beispielsweise dem Potential zur Metastasenbildung, korreliert, kann durch Überwachung der hTRT-, mRNA- oder Protein-Spiegel die wahrscheinliche zukünftige Entwicklung eines Tumors abgeschätzt und vorhergesagt werden.
In einem Aspekt gehört zu den erfindungsgemässen diagnostischen und prognostischen Verfahren die Bestimmung, ob ein menschliches TRT-Genprodukt in einer biologischen Probe (z.B. von einem Patienten) vorhanden ist. Ein zweiter Aspekt betrifft die Bestimmung der Menge eines hTRT-Genprodukts in einer biologischen Probe (z.B. von einem Patienten) und den Vergleich mit der Menge in einer Kontrollprobe (z.B. normale Zellen oder Gewebe). Ein dritter Aspekt betrifft die Bestimmung der zellulären oder intrazellulären Lokalisierung eines hTRT-Genprodukts in einer Zell- oder Gewebeprobe.
Ein vierter Aspekt betrifft die Untersuchung von Wirtszellen (z.B. eines Patienten) zur Identifizierung von Nucleinsäuren mit Sequenzen, die charakteristisch für eine vererbbare Neigung für eine anormale hTRT-Genexpression sind (anormale Menge, Regulation oder anormales Produkt), wobei dies von Nutzen ist beim genetischen Screenen oder bei einer genetischen Beratung. Ein fünfter Aspekt betrifft die Verwendung der erfindungsgemässen Assays zum Nachweis des Vorhandenseins von anti-hTRT-Antikörpern (z.B. in Patientenserum). Die ausführlicher nachstehend beschriebenen Verfahren stellen nützliche Assays dar, die unter Verwendung der hier beschriebenen Sequenzen und Zusammenhänge ausgeführt werden können. Für den Fachmann sind natürlich zahlreiche Variationen oder weitere Anwendungsmöglichkeiten dieser Assays offensichtlich.
Zwar sind die vorstehend beschriebenen Assays im Zusammenhang mit diagnostischen und prognostischen Verfahren beschrieben, sie können jedoch immer dann verwendet werden, wenn ein hTRT-Gen, Genprodukt oder eine Variante nachgewiesen, quantifiziert oder charakterisiert werden soll. Somit sind beispielsweise die nachstehend beschriebenen "diagnostischen" Verfahren zur Untersuchung von hTRT oder Telomerase während der Herstellung und Reinigung von hTRT oder menschlicher Telomerase, für die Charakterisierung von Zellinien, die von menschlichen Zellen stammen (z.B. zur Identifizierung unsterblicher Linien), für die Charakterisierung von Zellen, Tieren, Pflanzen, Pilzen, Bakterien oder anderen Organismen, die ein menschliches TRTGen oder Genprodukt (oder Fragmente davon) enthalten, von Nutzen.
Der hier verwendete Ausdruck "diagnostisch" besitzt seine normale Bedeutung, nämlich die Identifizierung der Anwesenheit oder der Natur der Erkrankung (beispielsweise Krebs), eines Zustands (z.B. unfruchtbar, aktiviert), eines Status (z.B. fruchtbar) und der Ausdruck "prognostisch" hat ebenfalls seine übliche Bedeutung, nämlich die Prognose der wahrscheinlichen Entwicklung und/oder des Ausgangs einer Erkrankung oder eines Zustands. Zwar werden diese beiden Bezeichnungen in einem klinischen Umfeld gelegentlich auf unterschiedliche Weise verwendet.
Jeder der nachstehend beschriebenen Assays oder Assayformate im Bezug auf "Diagnose" ist gleichermassen geeignet für das Stellen einer Prognose, da es inzwischen klar ist, dass höhere Spiegel an Telomerase-Aktivität mit einer schlechteren Prognose für Krebspatienten in Zusammenhang stehen und da die vorliegende Erfindung Nachweisverfahren bereitstellt, die für hTRT spezifisch sind, das mit Konzentrationen exprimiert wird, die mit Telomerase-Aktivität in einer Zelle eng korrelieren.
2) Diagnose und Prognose von Krebs
Die Bestimmung eines hTRT-Gens-, -mRNA- oder- Protein-Spiegels der über dem normalen oder Standardbereich liegt, zeigt die Anwesenheit von Telomerase-positiven Zellen oder unsterblichen Zellen an, zu denen beispielsweise bestimmte Tumorzellen zählen. Da bestimmte embryonale und fötale Zellen sowie bestimmte "erwachsene" Stammzellen Telomerase exprimieren, stellt die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Bestimmung anderer Zustände wie z.B. Schwangerschaft, durch den Nachweis oder die Isolierung von Telomerase positiven fötalen Zellen aus dem Blut der Mutter. Diese Werte können dazu verwendet werden, eine Diagnose zu erstellen oder sie können bei der Erstellung einer Diagnose hilfreich sein, selbst wenn die Zellen unter Verwendung traditioneller Methoden nicht als krebsartig hätten klassifiziert werden oder anderweitig nachgewiesen oder klassifiziert werden können.
Somit erlauben die erfindungsgemässen Verfahren den Nachweis oder die Verifikation von krebsartigen oder anderen Zuständen, die mit Telomerase assoziiert sind, mit erhöhter Zuverlässigkeit und möglicherweise in einem früheren Stadium. Die erfindungsgemässen Assays erlauben die Unterscheidung zwischen Klassen und Stadien von menschlichen Tumoren oder anderen mit der Zellproliferation in Zusammenhang stehenden Erkrankungen, dadurch, dass sie quantative Assays für das hTRT-Gen und -Genprodukte bereitstellen und damit die Wahl geeigneter Behandlungsvorgehensweisen sowie genaue Diagnosen erleichtern. Da der Spiegel an Telomerase-Aktivität dazu verwendet werden kann, um zwischen gutartigen und malignen Tumoren zu unterscheiden (z.B. US-Patent Nr. 5 489 508 und Hiyama et al., Proc. Am Ass. Cancer Res. 38 (1997), 637), um das Bevorstehen einer Invasion vorherzusagen (z.B.
US-Patent Nr. 5 639 613 und Yashima et al., Proc. Am. Ass. Cancer Res. 38 (1997), 326) und um eine Korrelation mit dem Potential zur Metastasenbildung herzustellen (z.B. US-Patent Nr. 5 648 215 und Pandita et al., Proc. Am Ass. Cancer Res. 37 (1996), 559), werden diese Assays darüber hinaus für die Prophylaxe, den Nachweis und die Behandlung einer grossen Anzahl von menschlichen Krebsarten von Nutzen sein.
Für die Prognose von Krebserkrankungen (oder anderer Erkrankungen oder Zustände, die durch eine erhöhte Telomerase-Konzentration gekennzeichnet sind) wird ein prognostischer Wert für ein hTRT-Genprodukt (mRNA oder Protein) oder die Aktivität für einen bestimmten Tumortyp, Tumorklasse oder ein Tumorstadium, wie nachstehend beschrieben, bestimmt. Der Spiegel an hTRT-Protein oder -mRNA oder Telomerase-Aktivität in einem Patienten, kann beispielsweise unter Verwendung der hier beschriebenen Assays bestimmt und mit dem prognostischen Spiegel verglichen werden.
In Abhängigkeit von dem verwendeten Assay wird in einigen Fällen die Häufigkeit eines hTRT-Genprodukts in einer Probe als erhöht angesehen werden, wann immer es durch den Assay nachweisbar ist. Aufgrund der geringen Menge von hTRT-mRNA und Protein selbst in Telomerase-positiven Zellen und der Seltenheit oder des Fehlens dieser Genprodukte in normalen oder Telomerase-negativen Zellen sind empfindliche Assays erforderlich, um nachweisen zu können, ob die hTRT-Genprodukte überhaupt in normalen Zellen vorhanden sind. Wenn weniger empfindliche Assays ausgewählt werden, werden zwar hTRT-Genprodukte in gesundem Gewebe nicht nachweisbar sein, jedoch in Telomerase-positivem Krebs- oder bei anderen Telomerase-positiven Zellen.
Typischerweise beträgt die Menge eines hTRT-Genprodukts in einer Probe mit einer erhöhten Konzentration mindestens etwa das 5fache, häufiger mindestens etwa das 10fache, noch häufiger mindestens das 50fache und sehr oft mindestens das etwa 100 bis 1000fache im Vergleich zum Spiegel von Telomerase-negativen Kontrollzellen oder Zellen von gesunden Geweben eines Erwachsenen, wobei der Prozentsatz von Telomerase-positiv normalen Zellen sehr gering ist.
Die erfindungsgemässen diagnostischen und prognostischen Verfahren können bei jeder Zelle oder jedem Gewebetyp jeden Ursprungs verwendet werden und sie können zum Nachweis einer unsterblichen oder neoplastischen Zelle, eines Tumorgewebes oder eines Krebses jeden Ursprungs verwendet werden. Zu den Krebsarten, die nachgewiesen werden können, zählen, jedoch ohne Beschränkung darauf, all jene, die hinsichtlich der Diskussion der therapeutischen Anwendung von hTRT vorstehend aufgezählt wurden.
Die erfindungsgemässen Assays sind darüber hinaus zur Überwachung der Wirksamkeit einer therapeutischen Intervention in Patienten, die wegen eimer Krebserkrankung behandelt werden, von Nutzen. Zu den Behandlungen von Krebs, die überwacht werden können, gehören alle gegenwärtig empfohlenen Therapieformen (einschliesslich Chemotherapie, Bestrahlungstherapie und chirurgische Massnahmen) und dazu zählen auch zukünftige Behandlungen, beispielsweise die hier beschriebenen Therapien, die sich auf die Hemmung oder Aktivierung von Telomerase beziehen (siehe beispielsweise PCT-Veröffentlichung Nr. 96/01 835 und 96/40 868 und US-Patent Nr. 5 583 016; sowie auch US-Patentanmeldungen mit der Serien Nr. 08/472 802 und 08/482 115, die beide am 7. Juni 1995 eingereicht wurden; 08/521 634, eingereicht am 1. August 1995; 08/714 482, eingereicht am 16.
September 1996 und 08/770 564 und 08/770 565, die beide am 20. Dezember 1996 eingereicht wurden, wobei all diese Dokumente aufgrund der Bezugnahme in ihrer Gesamtheit als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden können).
In einem weiteren Aspekt sind die nachstehend beschriebenen Assays für den Nachweis bestimmter Variationen in der hTRT-Gensequenz (Mutationen und vererbbare hTRT-Allele) von Nutzen, die eine Prädisposition für Krebserkrankungen oder andere Zustände anzeigt, die mit einer anormalen Regulation der Telomerase-Aktivität assoziiert sind (Unfruchtbarkeit, vorzeitiges Altern).
3) Diagnose von Zuständen, bei denen es sich nicht um Krebs handelt
Zusätzlich zu der Diagnose von Krebserkrankungen haben die erfindungsgemässen Assays zahlreiche weitere Anwendungsmöglichkeiten. Die vorliegende Erfindung stellt Reagenzien und Verfahren zur Diagnose von Zuständen oder Erkrankungen bereit, die durch eine Unter- oder Überexpression von Telomerase oder hTRT-Genprodukten in Zellen charakterisiert sind. In Erwachsenen wird ein niedriger Spiegel an Telomerase-Aktivität normalerweise bei einer begrenzten Art von normalen menschlichen somatischen Zellen gefunden, beispielsweise Stammzellen, aktivierten Lymphocyten und Keimzellen. Die Telomerase-Aktivität fehlt bei anderen somatischen Zellen.
Somit ist der Nachweis von hTRT oder Telomerase-Aktivität in Zellen, in denen diese normalerweise fehlen oder inaktiv sind, oder der Nachweis eines anormalen Spiegels (d.h. eines höheren oder niedrigeren im Vergleich zum normalen) in Zellen, in denen hTRT normalerweise nur mit einem niedrigen Spiegel vorhanden ist (wie beispielsweise Stammzellen, aktivierte Lymphocyten und Keimzellen) ein diagnostisches Anzeichen für eine mit Telomerase in Zusammenhang stehende Erkrankung oder einen Zustand. Dieser Nachweis kann auch zur Identifizierung oder Isolierung spezifischer Zelltypen verwendet werden. Zu den Beispielen für solche Erkrankungen und Zustände gehören: Erkrankungen bezüglich der Zellproliferation, immunologische Funktionsstörungen, Unfruchtbarkeit, Erkrankungen hinsichtlich der Immunzellfunktion, Schwangerschaft, fötale Anormalität, vorzeitige Alterung etc.
Darüber hinaus sind die erfindungsgemässen Assays zur Überwachung der Wirksamkeit einer therapeutischen Intervention (wozu, ohne Beschränkung darauf, Wirkstoffe gehören, die Telomerase-Aktivität modulieren) bei einem Patienten oder in einem Assay, der auf Zellen oder einem Tier basiert. Ein Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung von Assays, die zur Diagnose von Unfruchtbarkeit von Nutzen sind. Menschliche Keimzellen (z.B. Stammsamenzellen, Vorläufer oder Nachkommen) können unbegrenzt proliferieren und sind durch eine hohe Telomerase-Aktivität gekennzeichnet. Anormale oder verringerte Spiegel an hTRT-Genprodukten oder anormale Produkte können zu einer unzulänglichen oder anormalen Produktion von Spermatozoen führen, was zu Unfruchtbarkeit oder Funktionsstörungen hinsichtlich der Reproduktion führt.
Somit stellt die Erfindung Assays (Verfahren und Reagenzien) zur Diagnose und Behandlung von auf "Telomerase-basierenden" Funktionsstörungen bezüglich der Produktion bereit. Bei einer ähnlichen Anwendung können die Assays zur Überwachung der Wirksamkeit von Empfängnisverhütungsmitteln (z.B. Empfängnisverhütungsmittel für Männer bzw. männliche Tiere) verwendet werden, die gegen die Spermaproduktion als Ziel gerichtet sind oder diese indirekt beeinflussen (und die den hTRT-Spiegel oder Telomerase-Aktivität reduzieren sollen).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung webe oder Tumor entnommen. Es kann gelegentlich wünschenswert sein, eine biologische Probe für die spätere Analyse einzufrieren (z.B. wenn die Wirksamkeit von Behandlungen mit Wirkstoffen überwacht wird).
In einigen Fällen können die Zellen oder Gewebe vor der Analyse fraktioniert werden. Beispielsweise kann bei einer Gewebebiopsie von einem Patienten ein Zellsortierer (z.B. ein Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer) verwendet werden, um Zellen nach Merkmalen, wie beispielsweise der Expression eines Oberflächenantigens (z.B. eines tumorspezifischen Antigens) gemäss allgemein bekannter Verfahren zu sortieren.
Zwar wird die Probe üblicherweise von einem menschlichen Patienten oder Zellinie entnommen, die Assays können jedoch auch zum Nachweis von homologen hTRT-Genen oder entsprechenden Genprodukten in Proben von Tieren verwendet werden. Alternativ können hTRT-Gene und -Genprodukte in transgenen Tieren oder Organismen, die ein menschliches TRT-Protein oder entsprechende Nucleinsäuresequenz exprimieren, untersucht werden.
Die Probe kann, falls nötig, durch Verdünnung in einer geeigneten Pufferlösung vorbehandelt werden oder konzentriert werden, falls dies erwünscht ist. Es kann eine Reihe von wässrigen Standardpufferlösungen bei physiologischem pH-Wert verwendet werden, wobei eine Reihe von Puffern angewandt werden kann, beispielsweise Phosphat, Tris-Puffer etc.
Der Ausdruck "biologische Probe", die von einem Patienten erhalten wurde, kann entweder als "biologische Probe" oder "Patientenprobe" bezeichnet werden. Bei einer Analyse einer "Patientenprobe" müssen nicht unbedingt Zellen oder Gewebe von dem Patienten entnommen werden. Beispielsweise können geeignet markierte hTRT-bindende Agenzien (z.B. Antikörper oder Nucleinsäuren) in den Patienten injiziert und (nach Bindung an das Ziel) unter Verwendung von Standard-Bildgebungstechniken (z.B. CAT, NMR etc.) sichtbar gemacht werden.
E) Nucleinsäure-Assays
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren zum Nachweis und/oder der Quantifizierung der Expression von hTRT-mRNAs (einschliesslich Spleiss-Varianten oder Sequenzvarianten und alternative Allele) bereit. In einer alternativen Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren zum Nachweis und der Analyse normaler oder anormaler hTRT-Gene (oder eines Fragmentsdavon) bereit. Zu den Formaten solcher qualitativer oder quantitativer Assays gehören, allerdings ohne Beschränkung darauf, auf Amplifikation basierende Assays mit oder ohne Signalamplifikation, auf Hybridisierung basierende Assays und auf der Kombination Amplifikation/Hybridisierung basierende Assays.
Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass die Unterscheidung zwischen Hybridisierung und Amplifikation nur aus Zweckmässigkeitsgründen durchgeführt wird: Wie in den nachstehenden Beispielen veranschaulicht, beinhalten viele Assayformate sowohl Elemente der Hybridisierung als auch Amplifikation, so dass in einigen Fällen die Kategorisierung etwas willkürlich ist.
1) Herstellung von Nucleinsäuren
In einigen Ausführungsformen werden Nucleinsäure-Assays mit einer Nucleinsäureprobe, die aus der zu untersuchenden Zelle, oder Zellinie oder dem zu untersuchenden Gewebe oder Organismus isoliert wurde. Die Nucleinsäure (z.B. genomische DNA, RNA oder cDNA) kann aus einer Probe gemäss einer Reihe von dem Fachmann bekannten Verfahren "isoliert" werden. In diesem Zusammenhang bezieht sich der Ausdruck "isoliert" auf jede Abtrennung der Spezies oder des Ziels, das nachgewiesen werden soll, von jeder anderen Substanz in dem Gemisch, dies bezeichnet jedoch nicht unbedingt einen wesentlichen Reinheitsgrad des Ziels. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass bei dem Nachweis von Änderungen in der Kopienanzahl des hTRT-Gens das nachzuweisende Ziel genomische DNA ist.
Umgekehrt ist in einem auf einer Nucleinsäure basierenden Assay RNA das nachzuweisende Ziel, wenn Expressionsspiegel eines Gens oder von Genen nachgewiesen werden sollen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nucleinsäureprobe Gesamt-mRNA (d.h. poly(A)<+>RNA) in einer biologischen Probe. Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren sind dem Fachmann gut bekannt und beispielsweise beschrieben in Tijssen, P. (Herausg.) in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Elsevier, N.Y. (1993), Kapitel 3, wobei dieses Dokument durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen ist.
In einer Ausführungsform wird Gesamt-Nucleinsäure aus einer Probe unter Verwendung eines sauren Guanidin/Phenol/Chloroform-Extraktionsverfahrens isoliert und poly(A)<+>mRNA durch oligo-dT-Säulenchromatographie oder durch die Verwendung von magnetischen (dT)n Kügelchen (siehe z.B. Sambrook et al., und Ausubel et al., a.a.O.).
In alternativen Ausführungsformen ist die Isolation von Nucleinsäuren (z.B. Gesamt-RNA oder poly-A<+>RNA) aus der biologischen Probe vor der Durchführung von Amplikation, Hybridisierung oder anderen Assays nicht erforderlich. Diese Ausführungsformen haben bestimmte Vorteile im Fall, dass hTRT-RNA gemessen werden soll, da sie die Wahrscheinlichkeit verringern, dass hTRT-mRNA während der Isolation und der Handhabung verlorengeht. Beispielsweise können viele Amplifikationsverfahren, wie beispielsweise PCR und RT-PCR (reverse Transkriptase-PCR) unter Verwendung permeabilisierter Zellen (histologische Proben und FACS-Analysen) lysierter Gesamtzellen oder hoher Zellfraktionen, wie beispielsweise bestimmter Zellextrakte, durchgeführt werden.
Vorzugsweise werden Schritte unternommen, um die Integrität der Zielnucleinsäure (z.B. mRNA), falls erforderlich, zu bewahren (z.B. durch Zugabe von RNAase-Inhibitoren). Amplifikations- und Hybridisierungs-Assays können auch in situ durchgeführt werden, beispielsweise in dünnen Gewebeabschnitten einer Biopsieprobe oder einer einlagigen Zellschicht (z.B. Blutzellen oder von einander getrennte Zellen einer Gewebekultur). Die Amplifikation kann auch in intakten ganzen Zellen oder fixierten Zellen durchgeführt werden.
Beispielsweise können PCR-, RT-PCR-, oder LCR-Amplifikationsverfahren, so wie dies auf dem Fachgebiet bekannt ist, in situ durchgeführt werden, beispielsweise unter Verwendung einer Polymerase oder Ligase, eines Primers oder von Primern und (Desoxy)-Ribonucleosid-Triphosphaten (wenn eine Polymerase verwendet wird) und reverser Transkriptase und einem Primer (wenn RNA transkribiert und die cDNA nachgewiesen werden soll) an fixierten, permeabilisierten oder mikroinjizierten Zellen, um so die Ziel-hTRT-RNA oder -DNA zu amplifizieren. hTRT-RNA enthaltende Zellen (z.B. Telomerase-positive Zellen) oder eine gewünschte hTRT-DNA-Sequenz können dann nachgewiesen werden.
Dieses Verfahren ist oft dann zweckmässig, wenn Fluoreszenz-markierte dNTPs, Primer oder andere Bestandteile in Verbindung mit Mikroskopie, einer FACS-Analyse oder äquivalenten Verfahren verwendet werden.
2) Auf Amplifikation basierende Assays
In einer Ausführungsform sind die erfindungsgemässen Assays zum Nachweis eines hTRT-Gens oder -Genprodukts auf Amplifikation basierende Assays. In einem auf Amplifikation basierenden Assay wird ein gesamtes hTRT-Gen oder -Transkript oder ein Teil davon (z.B. mRNA oder cDNA, nachstehend als "Ziel" bezeichnet) amplifiziert und das amplifizierte Produkt wird anschliessend direkt oder indirekt nachgewiesen. Falls kein Gen oder Genprodukt vorhanden ist, das als Matrize wirken kann, wird kein Amplifikationsprodukt hergestellt (z.B. mit der erwarteten Grösse) oder die Amplifikation ist unspezifisch und es entsteht üblicherweise kein einzelnes Amplifikationsprodukt. Im Gegensatz dazu wird die Zielsequenz amplifiziert, wenn das fragliche Gen oder Genprodukt vorhanden ist, was somit die Anwesenheit und/oder die Menge an entsprechendem Gen oder an entsprechender mRNA anzeigt.
Auf Amplifikation basierende Assays sind dem Fachmann gut bekannt.
Die vorliegende Erfindung stellt eine grosse Vielzahl an Primern und Sonden zum Nachweis von hTRT-Genen und Genprodukten bereit. Solche Primer und Proben sind zu dem hTRT-Gen oder Genprodukt ausreichend komplementär, um an die Zielnucleinsäure hybridisieren zu können. Primer weisen üblicherweise eine Länge von mindestens 6 Basen auf, vorzugsweise von etwa 10 bis etwa 100 Basen, mehr bevorzugt von etwa 12 bis etwa 50 Basen und am meisten bevorzugt zwischen etwa 14 und etwa 25 Basen. Der Fachmann wird nach Lesen dieser Beschreibung in der Lage sein, unter Verwendung von Routineverfahren Primer auszuwählen, mit denen das gesamte hTRT-Gen oder -Genprodukt oder ein Anteil davon amplifiziert werden kann oder mit denen zwischen Genprodukt-Varianten, hTRT-Allelen etc. unterschieden werden kann.
In Tabelle 2 sind Beispiele von Primern aufgezählt, die für eine PCR-Amplifikation der hTRT oder spezifischer hTRT-Genprodukte oder -Bereiche von Nutzen sind. Es ist auf dem Fachgebiet bekannt, dass einzelne Oligomere (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5 545 522) "nested sets" von Oligomeren oder sogar ein Pool von degenerierten Oligomeren für die Amplifikation verwendet werden kann, beispielsweise, wie dies für die nachstehend beschriebene Amplifikation der Tetrahymena TRT-cDNA veranschaulicht wird.
Die Erfindung stellt eine Vielzahl von Verfahren zur Amplifikation und zum Nachweis eines hTRT-Gens oder -Genprodukts bereit. Dazu gehören die Polymerase-Kettenreaktion (einschliesslich aller Varianten, beispielsweise die Reverse-Transkriptase-PCR; das "Sunrise Amplification System" (Oncor, Inc., Gaithersburg MD) und zahlreiche weitere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren.
In einer veranschaulichenden Ausführung wird die PCR-Amplifikation in einer Lösung von 50 mu l durchgeführt, die die Nucleinsäureprobe enthält (z.B. eine durch reverse Transkription von hTRT-RNA erhaltene cDNA), jeweils 100 mu M dNTP (dATP, dCTP, dGTP und dTTP; Pharmacia LKB Biotechnology, NJ) der (die) hTRT-spezifischen PCR-Primer, 1 Einheit Taq-Polymerase (Perkin Elmer, Norwalk CT), 1 x PCR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris, pH-Wert 8,3 bei Raumtemperatur, 1,5 mM M9Cl2 und 0,01% Gelatine), wobei die Amplifikation mit etwa 30 Cyclen durchgeführt wird, jeweils 45 Sekunden bei 94 DEG C, 45 Sekunden bei 45 DEG C und 90 Sekunden bei 72 DEG C. Es können jedoch natürlich für bestimmte Reaktionen zur Optimierung der PCR-Amplifikation zahlreiche Variationen eingeführt werden.
Zu weiteren geeigneten Zielamplifikationsverfahren gehören die Ligase-Kettenreaktion (LCR) (siehe z.B. Wu und Wallace, Genomics 4 (1989), 560; Landegren etal., Science 241 (1988), 1077, Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 (1991), 189 und Barringer et al., Gene 89 (1990), 117), die Strangverdrängungs-Amplifikation (SDA) (siehe z.B. Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 (1992) 392-396); die Transkriptions-Amplifikation (siehe z.B. Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 1173), "self-sustained-sequence"-Replikation (3SR) (siehe z.B. Fahyet al., PCR Methods Appl. 1 (1992) 2 und Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874); die Nucleinsäuresequenz basierte Amplifikation (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario; siehe z.B.
Compton, Nature 350 (1991) 91); das Transkriptions-basierte Amplifikationssystem (TAS); und das "self-sustained-sequence"-Replikationssystem (SSR). Jede der vorstehenden Veröffentlichungen ist aufgrund der Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen. Eine zweckmässige PCR-Variante ist der PCR-ELISA (z.B. Boehringer Mannheim Kat. Nr. 1 636 111), wobei Digoxigenin-dUTP in das PCR-Produkt eingebaut wird. Das PCR-Reaktionsgemisch wird denaturiert und mit einem Biotin-markierten Oligonucleotid hybridisiert, das so entworfen wurde, dass es an eine interne Sequenz des PCR-Produkts binden kann. Die Hybridisierungsprodukte werden an mit Streptavid in überzogenen Trägern immobilisiert und unter Verwendung von anti-Digoxigenin-Antikörpern nachgewiesen.
Beispiele für in vitro-Amplifikationsverfahren, die dem Fachmann ausreichend Anleitung geben, können in folgenden Veröffentlichungen gefunden werden: PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich (Herausg.) Freeman Press, New York, NY (1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Herausg. Innis, Gelfland, Snisky, und White, Academic Press, San Diego, CA (1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19 (1991), 4967; Eckert und Kunkel, PCR Methods and Applications 1 (1991), 17; PCR, Herausg. McPherson, Quirkes und Taylor, IRL Press, Oxford; U.S.Patent Nr. 4 683 195, 4 683 202 und 4 965 188; Barringer et al., Gene 89 (1990), 117; Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 1173; Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874; Lomell et al., J. Clin. Chem. 35 (1989), 1826.
Jedes dieser Dokumente ist durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen.
Amplifizierte Produkte können direkt analysiert werden (z.B. anhand der durch Gelelektrophorese bestimmten Grösse), durch Hybridisierung an einer Zielnucleinsäure, die an einem festen Träger immobilisiert ist, beispielsweise einem Kügelchen, einer Membran, einer Scheibe oder einem Chip; durch Sequenzierung; immunologisch (z.B. durch PCR-ELISA), durch Nachweis eines fluoreszierenden phosphoreszierenden oder radioaktiven Signals oder durch eine Reihe weiterer allgemein bekannter Massnahmen.
In einem veranschaulichenden Beispiel für ein Nachweisverfahren werden beispielsweise PCR-Primer verwendet, die mit Hilfe von Haarnadelschleifen ("hairpin loops") vergrössert wurden, die mit Fluorescein verknüpft sind und einem Benzoesäure-Derivat, das als quenchende Verbindung dient, so dass nur dann eine Fluoreszenz emittiert wird, wenn sich die Primer zur Bindung ihrer Ziele entfalten und Replikation stattfindet.
Da hTRT-mRNA normalerweise als ein äusserst seltenes Transkript exprimiert wird, das selbst in Telomerasepositiven Zellen nur in sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden ist, ist es oft wünschenswert, das durch einen Amplifikationsschritt erhaltene Signal zu optimieren oder zu verstärken. Eine Möglichkeit dafür besteht in der Erhöhung der Anzahl von Amplifikationszyklen. Beispielsweise sind zwar 20 bis 25 Cyclen für die Amplifikation der meisten mRNAs mittels der Polymerasekettenreaktion unter Standardreaktionsbedingungen ausreichend, der Nachweis von hTRT-mRNA kann jedoch in vielen Proben in Abhängigkeit von dem Nachweisformat 30 bis 35 Amplifikationszyklen benötigen.
Durch sorgfältige Auswahl der Amplifikationsbedingung einschliesslich der Anzahl von Amplifikationszyklen kann ein Assay entworfen werden, der nur dann zu einem Amplifikationsprodukt führt, wenn eine Schwellenwertmenge des Ziels in der Testprobe vorhanden ist (d.h. so dass nur Proben mit einem hohen Spiegel an hTRT-mRNA ein "positives" Ergebnis zeigen). Darüber hinaus sind Verfahren bekannt, um das durch Amplifikation der Zielsequenz erzeugte Signal zu verstärken. Zu den Verfahren zur Verbesserung der Fähigkeit ein amplifiziertes Ziel nachzuweisen, gehören Signalamplifikationssysteme, beispielsweise: Signalamplifikation mit verzweigter DNA "branched DNA signal amplification" (s. z.B.
US-Patent Nr. 5 124 246 und Urdea, Bio/Tech. 12 (1994), 926); das "tyramide"-Signalamplifikationssystem (TSA, DuPont); Amplifikation mit einem katalytischen Signal ("catalytic signal amplification" (CSA) (Dako); Q Beta-Replicase-Systeme (Tyagi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93 (1996), 5395) etc.
Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass unabhängig von dem verwendeten Amplifikationsverfahren eine Vielzahl von auf dem Fachgebiet bekannten quantitativen Verfahren zur Quantifizierung verwendet werden kann, falls dies erwünscht ist. Beispielsweise können, falls erwünscht, zwei oder mehr Polynucleotide in einer einzigen Probe gemeinsam amplifiziert werden. Dieses Verfahren kann als ein zweckmässiges Verfahren zur Quantifizierung der hTRT-mRNA-Menge in einer Probe verwendet werden, da sowohl die reverse Transkription als auch Amplifikationsreaktionen im gleichen Reaktionsgemisch für ein Ziel- und Kontroll-Polynucleotid durchgeführt werden.
Die gemeinsame Amplifikation mit dem Kontrollpolynucleotid (das normalerweise in einer bekannten Konzentration oder einer bekannten Kopienanzahl vorhanden ist) kann zur Normalisierung der Anzahl von Zellen in der Probe im Vergleich zu der Menge an hTRT in der Probe verwendet werden. Zu den geeigneten Kontroll-Polynucleotiden für Coamplifikationsreaktionen gehören DNA von "housekeeping"-Genen exprimierte RNA, konstitutiv exprimierte Gene und in vitro synthetisierte RNAs oder DNAs, die zu dem Reaktionsgemisch gegeben werden. Zu den endogenen Kontroll-Polynucleotiden zählen solche, die bereits in der Probe vorhanden sind, während exogene Kontroll-Polynucleotide einer Probe zugegeben werden, wodurch eine Reaktion "mit Schuss" ("spiked") erzeugt wird.
Zu den Beispielen für Kontroll-RNAs zählen beta -Actin-RNA, GAPDH RNA, snRNAs, hTR und endogen exprimierte 28S rRNA (siehe Khan et al., Neuro sci. Lett. 147 (1992), 114. Zu exogenen Kontroll-Polynucleotiden gehören eine synthetische AW106-cRNA, die von pAW106 als "sense"-Strang mittels T7-Polymerase synthetisiert werden kann. Damit das Coamplifikationsverfahren für eine Quantifizierung verwendet werden kann, müssen sowohl die Kontroll-Nucleotide als auch die Ziel-Polynucleotide üblicherweise in einem linearen Bereich amplifiziert werden. Ausführliche Protokolle für eine quantitative PCR können gefunden werden in PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. N.Y. (1990) und Ausubelet al., a.a.O. (Einheit 15) und Diaco, R. (1995) Practical Considerations for the Design of Quantitative PCR Assays, in PCR Strategies, S. 84-108, Innis et al.
Herausg. Academic Press, New York.
In Abhängigkeit von der Sequenz des endogenen oder exogenen Standards können unterschiedliche Primersätze für die Coamplifikationsreaktion verwendet werden. Bei einem Verfahren, der sogenannten kompetitiven Amplifikation, beinhaltet die quantitative PCR die gleichzeitige Coamplifikation mit einer bekannten Menge einer Kontrollsequenz, wobei die gleichen Primer, die für die Zielnucleinsäure verwendet werden, benutzt werden (ein Paar mit zwei Primern). In einer alternativen Ausführungsform, die als nicht-kompetitive Amplifikation bekannt ist, werden die Kontrollsequenz und die Zielsequenz (z.B. hTRT-cDNA) unter Verwendung unterschiedlicher Primer (d.h. 2 Paare von 2 Primern) amplifiziert.
In einer weiteren alternativen Ausführungsform, der sogenannten semi-kompetitiven Amplifikation, werden drei Primer verwendet, wobei einer hTRT-spezifisch, einer kontroll-spezifisch und einer in der Lage ist, sich sowohl an Zielsequenzen als auch Kontrollsequenzen anzulagern. Semi-kompetitive Amplifikation wird in dem US-Patent Nr. 5 629 154 beschrieben, das hiermit durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden kann.
3) Auf Hybridisierung basierende Assays
a) Allgemeines
Eine Vielzahl von Verfahren für die spezifische Messung von DNA und RNA mit Hilfe von Nucleinsäure-Hybridisierungsverfahren sind dem Fachmann bekannt (siehe Sambrook et al., a.a.O.). Auf Hybridisierung basierende Assays betreffen Assays, bei denen eine Nucleinsäuresonde an eine Zielnucleinsäure hybridisiert wird. Üblicherweise sind die erfindungsgemässen Nucleinsäure-Hybridisierungssonden vollständig oder im wesentlichen identisch zu einer zusammenhängenden Sequenz des hTRT-Gens oder der entsprechenden RNA-Sequenz. Vorzugsweise sind die Nucleinsäuresonden mindestens etwa 10 Basen lang, mehr bevorzugt mindestens etwa 20 Basen und am meisten bevorzugt etwa 200 Basen oder länger. Verfahren zur Auswahl von Nucleinsäuresondensequenzen zur Verwendung bei der Nucleinsäurehybridisierung werden in Sambrook et al., a.a.O. diskutiert.
In einigen Formaten sind entweder das Ziel oder die Sonde oder beide immobilisiert. Bei der immobilisierten Nucleinsäure kann es sich um eine DNA, RNA oder ein anderes Oligo- oder Polynucleotid handeln. Diese können natürlich oder nicht natürlich vorkommende Nucleotide, Nucleotidanaloga oder Rückgrate umfassen. Solche Assays können in verschiedenen Formaten verwendet werden, beispielsweise: Southern, Northern "dot" und "slot" Blots, Polynucleotid- oder Oligonucleotid-Arrays mit hoher Dichte (z.B. GeneChipsÖAffymetrix), Messstäbchen, Messnadeln ("pins"), Chips oder Kügelchen. All diese Verfahren sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt und sie stellen die Basis vieler im Handel erhältlicher diagnostischer Kits dar. Hybridisierungstechniken werden allgemein beschrieben in Hames et al., Herausg.
Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach IRL Press (1985); Gall und Pardue, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63 (1969), 378-383und John et al., Nature, 223 (1969) 582-587.
Dem Fachmann sind eine Vielzahl von Formaten für die Nucleinsäurehybridisierung bekannt. Beispielsweise stellt die direkte Hybridisierung ein übliches Format dar, wobei eine Zielnucleinsäure mit einer markierten komplementären Sonde hybridisiert wird. Gewöhnlich werden markierte Nucleinsäuren für die Hybridisierung verwendet, wobei die Markierung das nachweisbare Signal liefert. Ein Verfahren zur Beurteilung der Anwesenheit, des Fehlens oder der Menge an hTRT-mRNA besteht in der Durchführung eines Northern-Transfers von RNA aus einer Probe und der Hybridisierung mit einer markierten hTRT-spezifischen Nucleinsäuresonde, so wie dies in Beispiel 2 veranschaulicht ist. Wie bereits vorstehend angemerkt, ist hTRT-mRNA, wenn überhaupt, in den meisten Zellen nur in sehr geringen Mengen vorhanden.
Somit ist es bei der Verwendung einer Northern-Hybridisierung oft wünschenswert, einen Amplifikationsschritt oder alternativ grosse Mengen an Ausgangs-RNA zu verwenden. Ein zweckmässiges Verfahren zur Beurteilung der Anwesenheit, des Fehlens oder der Menge von hTRT-Proteine codierender DNA in einer Probe umfasst einen Southern-Transfer von DNA aus einer Probe und die Hybridisierung mit einer markierten hTRT-spezifischen Nucleinsäuresonde.
Zu weiteren üblichen Hybridisierungsformaten gehören "Sandwich"-Assays und Kompetitions- oder Verdrängungs-Assays. Bei den "Sandwich"-Assays handelt es sich um im Handel erhältliche zweckmässige Hybridisierungsassays zum Nachweis und zur Isolierung von Nucleinsäuresequenzen. In solchen Assays werden eine "Einfang"-Nucleinsäure, die kovalent an einen festen Träger immobilisiert ist, und eine markierte "Signal"-Nucleinsäure in Lösung verwendet. Die biologische oder klinische Probe liefert die Zielnucleinsäure. Die "Einfang"-Nucleinsäure- und die "Signal"-Nucleinsäuresonde hybridisieren mit der Zielnucleinsäure, wobei ein "Sandwich"-Hybridisierungskomplex gebildet wird. Für die Wirksamkeit ist es erforderlich, dass die Signalnucleinsäure mit der "Einfang"-Nucleinsäure hybridisieren kann.
b) Auf einem Chip und auf einer Scheibe basierende Assays
Die vorliegende Erfindung stellt ferner auf einer Sonde basierende Hybridisierungsassays für hTRT-Genprodukte bereit, wobei Arrays von immobilisierten Oligonucleotiden oder Oligonucleotiden verwendet werden, an die eine hTRT-Nucleinsäure hybridisieren kann (d.h. an einige, jedoch normalerweise nicht an alle, oder nicht einmal an die meisten der immobilisierten Oligo- oder Polynucleotide). Oligonucleotid-Arrays mit hoher Dichte oder Polynucleotid-Arrays stellen ein Mittel für den effizienten Nachweis des Vorhandenseins und der Merkmale (z.B. der Sequenz) einer Zielnucleinsäure (z.B. ein hTRT-Gen, -mRNA oder -cDNA) dar.
Es sind Techniken bekannt, mit denen sich Arrays herstellen lassen, die Tausende von zu definierten Sequenzen komplementäre Oligonucleotide an definierten Positionen auf einer Oberfläche enthalten, wobei für die Synthese in situ photolithographische Verfahren verwendet werden (siehe z.B. US-Patent Nr.5 578 832, 5 556 752 und 5 510 270; F odor et al., Science 251 (1991), 767; Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 5022 und Lockhart et al., Nature Biotech 14 (1996); 1675) oder andere Verfahren zur schnellen Synthese und Anlagerung von definierten Oligonucleotiden (Blanchard etal., Biosensors & Bioelectronics 11 (1996), 687). Bei Anwendung dieser Verfahren werden Oligonucleotide (z.B. 20-mere) mit bekannter Sequenz direkt auf einer Oberfläche, beispielsweise auf einer Scheibe mit derivatisiertem Glas synthetisiert.
Normalerweise ist das hergestellte Array redundant mit einigen Oligonucleotidsonden auf dem Chip, die für das nachzuweisendeh TRT-Polynucleotid spezifisch sind.
Kombinationen von Oligonucleotidsonden können so entworfen werden, dass alternativ gespleisste mRNAs nachgewiesen werden können oder um festzustellen, welches von verschiedenen hTRT-Allelen in einer bestimmten Probe exprimiert wird.
In einer veranschaulichenden Ausführungsform wird durch reverse Transkription von Gesamt-RNA von einer Testzelle präparierte cDNA amplifiziert (z.B. mittels PCR). Normalerweise ist das amplifizierte Produkt markiert, beispielsweise durch Einbau eines fluoreszenzmarkierten dNTPs. Die markierten cDNAs werden dann mit einem Chip hybridisiert, der Oligonucleotidsonden umfasst, die zu verschiedenen Untersequenzen des hTRT-Gens komplementär sind. Die Hybridisierungspositionen werden bestimmt (z.B. gemäss den allgemeinen Verfahren von Shalon et al., Genome Research 6 (1996), 639 oder Schena et al., Genome Res. 6 (1996) 639) und aus dem Hybridisierungsmuster die Sequenz (oder eine andere Information) durch auf diesem Fachgebiet gut bekannte Verfahren abgeleitet.
In einer Ausführungsform werden zwei cDNA-Proben mit dem gleichen Chip hybridisiert, wobei jede mit einer unterschiedlichen Fluoreszenzgruppe markiert ist. Das Verhältnis der Hybridisierung jeder markierten Probe zu Stellen, die komplementär zu dem hTRT-Gen sind, wird dann untersucht. Falls beide Proben die gleiche Menge an hTRT-mRNA enthalten, beträgt das Verhältnis der beiden Fluoreszenzsignale 1:1. Dabei muss das Signal der Fluoreszenzen nicht so eingestellt werden, dass jedem Unterschied in der molaren Empfindlichkeit der Fluoreszenzsignale Rechnung getragen wird.
Im Gegensatz dazu wird das in der zweiten Probe verwendete Fluoreszenzsignal vorherrschen, falls die erste Probe von einem gesunden (oder Kontroll)-Gewebe stammt, und die zweite Probe von einem kanzerösen Gewebe.
c) In situ-Hybridisierung
Ein alternatives Verfahren zum Nachweis der Expression eines ein hTRT-Protein codierenden Gens ist in situ-Hybridisierung. In situ-Hybridisierungsassays sind gut bekannt und allgemein beschrieben in Angerer et al., Methods Enzymol. 152 (1987), 649-660 und Ausubel et al., a.a.O. In einem in situ-Hybridisierungsassay sind Zellen oder Gewebeproben an einem festen Träger fixiert, der sich typischerweise in einem permeabilisierten Zustand befindet, typischerweise auf einer Glasscheibe. Die Zellen werden dann mit einer Hybridisierungslösung bei einer moderaten Temperatur hybridisiert, um so die Anlagerung von markierten Nucleinsäuresonden zu gestatten (z.B. <3><5>S-markierte Ribosonden, Fluoreszenz-markierte Sonden), die komplementär oder im wesentlichen komplementär zu hTRT sind.
Freie Sonde wird durch Waschen und/oder Spaltung mit Nuclease entfernt und die gebundene Sonde wird direkt auf der Scheibe durch Autoradiographie oder ein geeignetes bildgebendes Verfahren, sowie dies auf dem Fachgebiet bekannt ist, sichtbar gemacht.
4) Spezifischer Nachweis von Varianten
Wie bereits vorstehend angemerkt und in den Beispielen (z.B. Beispiel 9) veranschaulicht, können Amplifikations-Primer oder -Sonden ausgewählt werden, um Amplifikationsprodukte zu liefern, die spezifische Deletion, Verkürzungen und Insertionen umspannen, wodurch der Nachweis von spezifischen Varianten oder Anormalitäten in der hTRT-mRNA erleichtert wird. Ein Beispiel eines Genprodukts einer hTRT-Variante, das nachgewiesen werden kann, ist eine hTRT-RNA, wie beispielsweise ein vorstehend und in Beispiel 9 beschriebenes Produkt (SEQ. ID. Nr. 4). Die biologische Funktion der 182-Variante(n) ist nicht bekannt, falls überhaupt eine vorhanden ist.
Das von der Variante vermutlich codierte verkürzte hTRT-Protein könnte jedoch an einer Regulation von Telomerase-Aktivität beteiligt sein, beispielsweise durch Assemblierung eines nicht-funktionellen Telomerase-RNPs, der Telomerase-Bestandteile titriert. Alternativ könnte- eine negative Regulation von Telomerase-Aktivität durch Steuerung der hTRT-prä-mRNA (naszierende mRNA) auf eine Weise erzielt werden, die zu einer Eliminierung der mRNA und der Herabsetzung des hTRT-mRNA-Spiegels führt. Aus diesen und weiteren Gründen ist die Möglichkeit 182-Varianten entdecken zu können von Nutzen. Zusätzlich mag es gelegentlich wünschenswert sein, in Proben, in denen zwei Spezies von hTRT-RNA vorhanden sind (z.B. eine 182-hTRT-RNA und eine das hTRT-Protein mit vollständiger Länge codierende hTRT-RNA), deren relative und/oder absolute Häufigkeit zu vergleichen.
Die Erfindung stellt eine Vielzahl von Verfahren zum Nachweis von 182-Varianten bereit. Beispielsweise führt eine Amplifikation unter Verwendung von Primerpaaren, die die 182-Basenpaardeletion umspannen, zu Produkten unterschiedlicher Grösse, die den deletierten und undeletierten hTRT-RNAs (falls beide vorhanden sind) entsprechen und diese können auf Grund ihrer Grösse (z.B. durch Gelelektrophorese) unterschieden werden. Zu den Beispielen für Primerpaare, die zur Amplifikation des Bereichs" der die 182 bp-Deletion umspannt, nützlich sind, gehören TCP1.14 und TCP1.15 (Primersatz 1) oder TCP1.25 und bTCP6 (Primersatz 2) (siehe Tabelle 2). Diese Primerpaare können getrennt verwendet werden oder in einem PCR-Experiment mit "nested"-Primern, wobei der Primersatz 1 zuerst benutzt wird. Es ist für den Fachmann auch offensichtlich, dass Hybridisierungsverfahren (z.B.
NorthernHybridisierung) oder RNAse-Schutzassays zum Nachweis von hTRT-RNA-Varianten oder um solche Varianten unterscheiden zu können, unter Verwendung der erfindungsgemässen hTRTNucleinsäuresonde verwendet werden können.
Ein weiteres geeignetes Verfahren umfasst PCR-Amplifikation (oder ein äquivalentes Verfahren)mit drei Primern. Ein Primer ist spezifisch zu jeder hTRT-RNA-Spezies (z.B. wie in Tabelle 4 veranschaulicht) und ein Primer ist komplementär zu beiden Spezies (z.B. TCP1.25 (2270-2288)) - analog zu dem semi-kompetitiven quantitativen PCR-Verfahren, das ausführlicher vorstehend beschrieben ist. Ein Beispiel eines Primers, der spezifisch zu SEQ. ID.Nr. 1 ist, ist ein Primer, der sich innerhalb der Sequenz von 182 Nucleotiden (d.h. Nucleotide 2345 bis 2526 von SEQ. ID. Nr. 1) anlagert, z.B. TCP1.73 (2465-2445). Ein Primer, der zu SEQ. ID. Nr. 4 (eine DELTA 182-Variante) spezifisch ist, ist beispielsweise ein Primer, der an die Nucleotide 2358-2339 von SEQ. ID. Nr. 4 anlagert (d.h. der Stelle, die der Insertion von 182 Nucleotiden in SEQ. ID. Nr. 1 entspricht).
Die absolute Häufigkeit der DELTA 182-hTRT-mRNA-Spezies oder deren relative Häufigkeit im Vergleich zu der Spezies, die das hTRT-Protein mit vollständiger Länge codiert, kann bezüglich einer Korrelation mit dem Zellstatus (z.B. der Fähigkeit zur unbegrenzten Proliferation) analysiert werden. Zahlreiche weitere Primer können ausgehend von der vorliegenden Beschreibung ausgewählt werden.
EMI189.1
Zu der weiteren hTRT-Genen von Varianten oder den entsprechenden Genprodukten, die nachgewiesen werden können, gehören solche, die durch Codons, die zu einem vorzeitigen Stop führen, Deletionen, Substitutionen oder Insertionen charakterisiert sind. Deletionen können anhand der verringerten Grösse des Gens, des mRNA-Transkripts oder der cDNA nachgewiesen werden. Auf ähnliche Weise können Insertionen anhand der gesteigerten Grösse des Gens, des mRNA-Transkripts oder der cDNA nachgewiesen werden. Insertionen und Deletionen können auch eine Verschiebung des Leserahmens hervorrufen, was zur Entstehung von Codons für einen frühzeitigen Stop oder längerer offener Leserahmen führt. Substitutionen können durch Hybridisierung mit einer Sonde nachgewiesen werden.
Diese Veränderungen werden dadurch nachgewiesen, dass Veränderungen der Grösse der hTRT-Polypeptid-Variante untersucht werden (z.B. durch Western-Analyse) oder durch Hybridisierung oder spezifische Amplifikation, je nach dem, wie es zweckmässig erscheint. Alternativ können Mutationen durch Sequenzierung des Gens oder des Genprodukts gemäss Standardverfahren bestimmt werden. Darüber hinaus und wie bereits vorstehend angemerkt, können Amplifikationsassays und Hybridisierungssonden ausgewählt werden, um auf bestimmte Anormalitäten spezifisch abzielen zu können. Beispielsweise können Nucleinsäuresonden oder Amplifikationsprimer ausgewählt werden, die spezifisch mit der Region hybridisieren, die die Deletion, Substitution oder Insertion enthält bzw. diese spezifisch amplifiziert.
An der Stelle, wo das hTRT-Gen eine solche Mutation enthält (1) hybridisiert die Sonde entweder nicht, oder die Amplifikationsreaktion liefert keine spezifische Amplifikation oder wird zu einer Veränderung der Grösse des Amplifikationsprodukts oder des Hybridisierungssignals führen; oder (2) die Sonde oder Amplifikationsreaktion umfasst die gesamte Deletion oder beide Enden der Deletion (Deletionsverbindungspunkt) oder (3) ähnlicherweise können Sonden und Amplifikationsprimer ausgewählt werden, die spezifisch auf Punktmutationen oder Insertionen abzielen.
5) Nachweis von HTRT-Mutantenallelen
Mutationen im hTRT-Gen könnten für die Entstehung einer Erkrankung verantwortlich sein oder könnten zu einem Krankheitszustand beitragen. Veränderungen der genomischen DNA von hTRT könnten die Spiegel der Gentranskription beeinflussen, zu Veränderungen von Aminosäureresten im hTRT-Protein führen, dazu führen, dass verkürzte hTRT-Polypeptide hergestellt werden, die Prozessierungswege der prä-mRNA ändern (was die hTRT-mRNA-Spiegel verändern kann) und auch weitere Konsequenzen zur Folge haben.
Änderungen der genomischen DNA in Nicht-hTRT-Loci können auch die Expression von hTRT oder Telomerase durch Veränderung der Enzyme oder zellulären Prozesse beeinflussen, die für die Regulation der Expression von hTRT, hTR und Telomerase-assoziierten Proteinen verantwortlich sind, sowie für die Prozessierung und die RNP-Assemblierung und den Transport. Änderungen, die die hTRT-Expression, die Prozessierung oder RNP-Assemblierung betrefffen, könnten auch für den Verlauf einer Krebserkrankung, für Alterserkrankungen, für Krankheiten hinsichtlich eines DNA-Schadens etc. wichtig sein.
Der Nachweis von Mutationen in hTRT-mRNA oder dem entsprechenden Gen und Genkontrollelementen kann auf vielfältige Weise gemäss den hier beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Dazu gehören folgende veranschaulichende Beispiele: Es kann ein Verfahren, das als "Primer-Screening" bezeichnet wird, verwendet werden; es werden PCR-Primer entworfen, deren 3 min -Enden sich an Nucleotide in einer Proben-DNA (oder RNA), die möglicherweise mutiert sind, anlagern. Falls die DNA (oder RNA) durch die Primer amplifiziert wird, paaren die 3 min -Enden mit den Nucleotiden im Gen, falls die DNA nicht amplifiziert wird, dann paaren entweder eines oder beide Enden nicht mit den Nucleotiden im Gen, was die Anwesenheit einer Mutation anzeigt.
Auf ähnliche Weise können Primer so entworfen werden, dass Punktmutationen unter Verwendung der Ligase-Kettenreaktion (LCR, vorstehend beschrieben) nachgewiesen werden können. Eine weitere Technik, die bei dem vorliegenden Verfahren angewandt werden kann, basiert auf Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus, RFLP (Pourzand, C., Cerutti, P. Mutat. Res. 288 (1993), 113-121). Dabei wird ein Southern-Blot menschlicher genomischer DNA, die mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten wurde, mit einer hTRT-spezifischen Sonde hybridisiert. Unterschiede hinsichtlich der Fragmentanzahl oder Fragmentgrössen zwischen der Probe und einer Kontrolle zeigen eine Veränderung der experimentellen Probe an, normalerweise eine Insertion oder Deletion.
Einzelstrang-Konformationspolymorphismus, SSCP, (Orrita, M. et. al., PNAS USA 86 (1989), 2766-70) ist eine weitere Technik, die für das vorliegende Verfahren angewandt werden kann. SSCP basiert auf der unterschiedlichen Wanderung von denaturierten einzelsträngigen DNAs des Wildtyps bzw. einer Mutante (die normalerweise durch PCR erzeugt wurden). Einzelsträngige DNA nimmt eine dreidimensionale Konformation ein, die sequenzspezifisch ist. Auch Sequenzunterschiede, die lediglich eine einzelne Base betreffen, können zu einer Mobilitätsverschiebung in einem nicht-denaturierenden Gel führen. SSCP ist aufgrund seiner Einfachheit eines der am häufigsten verwendeten Verfahren zum Mutations-Screenen.
Eine weitere Technik, die bei dem vorliegenden Verfahren angewandt werden kann, ist die denaturierende Gradientengelelektrophorese, DGGE (Myers et al., Methods in Enzymology 155 (1987), 501-527). Mittels DGGE können Mutationen aufgrund des Schmelzverhaltens doppelsträngiger DNA identifiziert werden. Zur Analyse des Schmelzprofils von experimenteller DNA und Kontroll-DNA wird eine spezielle Ausrüstung für denaturierende Elektrophorese verwendet: Eine eine Mutation enthaltende DNA besitzt eine unterschiedliche Mobilität in diesen Gelsystemen im Vergleich zur Kontrolle. Die diskutierten Beispiele veranschaulichen allgemein angewandte Verfahren, darüber hinaus gibt es zahlreiche andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind.
F. Analyse des Karyotyps
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren und Reagenzien zur Analyse des Karyotyps oder für andere Chromosomen-Analysen bereit, wobei hTRT-Sequenzsonden verwendet werden und/oder der Nachweis oder die Lokalisierung von hTRT-Gensequenzen in Chromosomen eines Patienten, einer menschlichen Zellinie oder einer nichtmenschlichen Zelle. In einer Ausführungsform kann die Amplifikation (d.h. eine Veränderung in der Kopienanzahl), Deletion (d.h. partielle Deletion), Insertion, Substitution oder Veränderungen in der chromosomalen Lokalisierung (z.B. Translokation) eines hTRT-Gens mit dem Vorhandensein eines pathologischen Zustands oder einer Prädisposition für die Entwicklung eines pathologischen Zustands (z.B. Krebs) korreliert sein.
Es wurde in der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass in normalen menschlichen Zellen das hTRT-Gen nahe dem Telomer von Chromosom 5p kartiert (siehe das nachstehende Beispiel 5). Der am nächsten benachbarte STS-Marker ist D5S678. Dessen Lage kann zur Identifizierung von Markern verwendet werden, die mit dem hTRT-Gen eng gekoppelt sind. Diese Marker können zur Identifizierung von YACs, STSs, Cosmiden, BACs, lambda-Phagen oder P1-Phagen oder anderen Clonen verwendet werden, die genomische hTRT-Sequenzen oder -Kontrollelemente enthalten. Die Marker oder die Lage des Gens können verwendet werden, um menschliche Gewebeproben hinsichtlich Veränderungen in der normalen Lage des hTRT Gens, dessen Organisation oder Sequenz, die mit dem Auftreten eines Krebstyps oder einer Krankheit assoziiert sind, zu untersuchen.
Diese Information kann dann für die Diagnose oder Prognose hinsichtlich der beteiligten Krankheit oder des Krebses verwendet werden. Darüber hinaus kann die Art jeder Veränderung des hTRT-Gens eine Information über die Ursachen liefern, durch die Zellen unsterblich werden. Beispielsweise könnte ein Translokationsereignis anzeigen, dass die Aktivierung der hTRT-Expression in manchen Fällen durch Austausch des hTRT-Promotors gegen einen anderen Promotor geschieht, der die hTRT-Transkription auf ungünstige Weise steuert. Erfindungsgemässe Verfahren und Reagenzien dieses Typs können zur Entwicklung von Strategien verwendet werden, mit denen hTRT-Aktivierungsprozesse bekämpft werden können.
Die Lage ist auch für die Bestimmung der Natur der hTRT-Genrepression in normalen somatischen Zellen von Nutzen, beispielsweise bei der Untersuchung, ob die Lage innerhalb eines Teils von nicht-exprimierendem Heterochromatin ist. Assays, die auf einer Nuclease-Überempfindlichkeit basieren, zur Unterscheidung zwischen Heterochromatin und Euchromatin sind beispielsweise beschrieben in Wu et al., Cell 16 (1979), 797; Groudine und Weintraub, Cell 30 (1982), 131 und Gross und Garrard, Ann. Rev. Biochem. 57 (1988), 159.
In einer Ausführungsform werden Veränderungen des hTRT-Gens durch Analyse des Karyotyps identifiziert, wobei zahlreiche auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren verwendet werden können. Ein zweckmässiges Verfahren ist die in situ-Hybridisierung (ISH). Wenn in situ-Hybridisierungsverfahren für die Karyotyp-Analyse verwendet werden, wird normalerweise eine nachweisbare oder nachweisbar markierte Probe mit einer chromosomalen Probe in situ zur Lokalisierung einer hTRT-Gensequenz hybridisiert. Im allgemeinen umfasst ISH einen oder mehrere der folgenden Schritte: (1) Fixierung des Gewebes, der Zelle oder der anderen zu analysierenden biologischen Struktur; (2) Vorhybridisierungsbehandlung der biologischen Struktur zur Steigerung der Zugänglichkeit der Ziel-DNA (z.B.
Denaturierung mit Hitze oder Alkali) und zur Verringerung einer unspezifischen Bindung (z.B. durch Blockierung des Hybridisierungsvermögens repetitiver Sequenzen (z.B. mittels menschlicher genomischer DNA); (3) Hybridisierung von einer oder mehreren Nucleinsäuresonden (z.B. übliche Nucleinsäuren, PNAs oder andere Nucleinsäure-Analoge) mit der Nucleinsäure in der biologischen Struktur oder dem Gewebe; (4) Waschschritte nach der Hybridisierung zur Entfernung von Nucleinsäurefragmenten, die während der Hybridisierung nicht gebunden waren und (5) Nachweis der hybridisierten Nucleinsäurefragmente. Die in jedem dieser Schritte verwendeten Reagenzien und anzuwendenden Bedingungen hängen von der jeweiligen Anwendung ab. Natürlich können diese Schritte auf vielfältige Weise modifiziert werden, wie dies dem Fachmann bekannt ist.
In einer Ausführungsform der ISH wird die hTRT-Sonde mit einem Fluoreszenzmarker markiert (in situ Fluoreszenzhybridisierung; "FISH"). Normalerweise ist es wünschenswert, eine "zwei-Farben"-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung anzuwenden, bei denen zwei mit einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff markierte Sonden verwendet werden. Eine Testsonde, die mit der gewünschten hTRT-Sequenz hybridisiert, wird mit einem Farbstoff markiert, und eine Kontrollsonde, die mit einem anderen Bereich hybridisiert wird, wird mit einem zweiten Farbstoff markiert. Als Kontrollsonde kann eine Nucleinsäure verwendet werden, die mit einem stabilen Bereich des gewünschten Chromosoms, beispielsweise dem Zentromerbereich, hybridisiert. Auf diese Weise kann Unterschieden in der Effizienz der Hybridisierung, die von Probe zu Probe schwanken kann, Rechnung getragen werden.
Die ISH-Verfahren zum Nachweis chromosomaler Anomalien (z.B. FISH) können an Nanogrammengen der fraglichen Nucleinsäuren durchgeführt werden. Es können in Paraffin eingebettete normale Gewebe oder Tumorsektionen verwendet werden, aber auch frisches oder gefrorenes Material, Gewebe oder Sektionen. Da FISH bei diesem begrenzten Material angewandt werden kann, können auch Präparationen von nichtkultivierten primären Tumoren, die nur in Spuren hergestellt werden können ("touch"-Präparationen) verwendet werden (siehe z.B. Kallioniemi et al., Cytogenet. Cell Genet. 60 (1992) 190). Beispielsweise können kleine Biopsie-Gewebeproben von Tumoren für "touch"-Präparationen verwendet werden (siehe z.B. Kallioniemi et al., a.a.O.). Es können auch kleine Anzahlen von Zellen analysiert werden, die durch Saugbiopsie erhalten wurden oder Zellen in Körperflüssigkeiten (z.B.
Blut, Urin, Sputum etc.) analysiert werden. Für eine pränatale Diagnose zählen Amnionflüssigkeit, Blut der Mütter etc. zu den geeigneten Proben. Zweckmässige für die hier beschriebenen Verfahren und Reagenzien anwendbare Hybridisierungsprotokolle sind beschrieben in Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 9138; EP-A1 0 430 402; Choo (Herausg. Methods in Molecular Biology Vol. 33: In Situ Hybridization Protocols, Humana Press-Totowa, New Jersey (1994) und Kallioniemi et al., a.a.O.
Zu weiteren für die Karyotyp-Analyse nützlichen Verfahren zählen beispielsweise Verfahren wie quantitatives Southern-Blotting, quantitative PCR oder vergleichende genomische Hybridisierung (Kallioniemi et al., Science 258 (1992), 818), wobei die erfindungsgemässen hTRT-Sonden und -Primer zur Identifikation einer Amplifikation, Deletion, Insertion, Substitution von hTRT-Sequenzen in Chromosomen in einer biologischen Probe oder andere Rearrangements von hTRT-Sequenzen verwendet werden können.
G. TRT-Polypeptid-Assays
1) Allgemeines
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Reagenzien zum Nachweis und zur Quantifizierung von hTRT-Polypeptidenbereit. Zu diesen Verfahren zählen analytische biochemische Verfahren, beispielsweise Elektrophorese, Massenspektroskopie, "Gelshift", Kapillarelektrophorese, chromatographische Verfahren, beispielsweise Grössenausschluss, Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), (TLC), Hyperdiffusionschromatographie etc., oder verschiedene immunologische Verfahren, beispielsweise Flüssigkeits- oder Gel-Präzipitin-Reaktion, Immundiffusion (Einzel- oder Doppel-), Immunelektrophorese, Radioimmunassay (RIA), enzymverbundene Immunabsorptionsbestimmungen (ELISAs), Immunfluoreszenz-Assays, Western-Blotting, Massenspektrometrie und weitere Verfahren, die nachstehend beschrieben werden und für den Fachmann nach Lesen dieser Beschreibung offensichtlich sind.
2) Elektrophoretische Assays
In einer Ausführungsform werden die hTRT-Polypeptide durch elektrophoretische Proteinauftrennung nachgewiesen. Ein Aspekt betrifft ein zweidimensionales Elektrophoresesystem.
Mittel zum Nachweis von Proteinen unter Verwendung von Elektrophoreseverfahren sind dem Fachmann gut bekannt (siehe allgemein R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182 (1990): Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y.).
In einer ähnlichen Ausführungsform wird ein "mobility shift"-Assay verwendet (siehe z.B. Ausubel et al., a.a.O.). Beispielsweise assoziiert markierte hTR mit hTRT und wandert mit veränderter Mobilität bei der Elektrophorese in einem nicht-denaturierten Polyacrylamidgel etc. Somit führt beispielsweise dann, wenn eine markierte hTR-Sonde oder ein markierter Telomerase-Primer mit einer hTRT enthaltenden Probe vermischt wird oder mit hTRT coexprimiert wird, (z.B. in einem zellfreien Expressionssystem) das Vorhandensein von hTRT-Protein (oder eines hTRT codierenden Polynucleotids) in der Probe zu einer nachweisbaren Änderung der hTRT-Mobilität.
3) Immunassays
A) Allgemeines
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Nachweis von hTRT-Polypeptiden bereit, wobei eine oder mehrere erfindungsgemässe Antikörperreagenzien verwendet werden (d.h. Immunassays). Wie hier verwendet, bezeichnet ein Immunassay einen Assay, bei dem ein Antikörper (wie hier ausführlich definiert gehören dazu auch Fragmente, chimäre und andere bindende Agenzien) verwendet wird, der spezifisch an ein hTRT-Polypeptid oder -Epitop bindet. Erfindungsgemässe Antikörper können durch eine Vielzahl von dem Fachmann bekannten Verfahren, beispielsweise den vorstehend beschriebenen, hergestellt werden.
Es ist eine Anzahl von gut etablierten immunologischen Bindungs-Assayformaten bekannt, die für die Durchführung der Erfindung geeignet sind (siehe z.B. US-Patente 4 366 241, 4 376 110, 4 517 288 und 4 837 168 und Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, Herausg. Academic Press, Inc. New York (1993); Basic and Clinical Immunology, 7. Ausgabe, Stites & Terr Herausg. (1991) Harlow und Lane, a.a.O.) z.B. Kapitel 14) und Ausubel et al., a.a.O. (z.B. Kapitel 11), wobei jedes dieser Dokumente durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden kann. Typischerweise wird in immunologischen Bindungsassays (oder Immunassays) ein "Einfang"-Agens zur spezifischen Bindung an den Analyten und oft auch dessen Immobilisierung verwendet.
In einer Ausführungsform ist das "Einfang"-Agens eine Einheit, die an ein hTRT-Polypeptid oder eine Untersequenz spezifisch bindet, beispielsweise ein antihTRT-Antikörper. In einer alternativen Ausführungsform kann das "Einfang"-Agens unter solchen Bedingungen an hTRT assoziiertes Protein oder -RNA binden, bei denen das hTRT-assoziierte Molekül an die hTRT gebunden bleibt (so dass, falls das hTRT-assoziierte Molekül immobilisiert ist, das hTRT-Protein ähnlich immobilisiert ist). In Assays, bei denen ein hTRT-assoziiertes Molekül eingefangen wird, wird normalerweise das assoziierte hTRT-Protein, beispielsweise mittels eines anti-hTRT-Antikörpers oder ähnlichem nachgewiesen werden. Immunassays zum Nachweis von Proteinkomplexen sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z.B. Harlow und Lane, a.a.O., S. 583).
Normalerweise wird das zu untersuchenden hTRT-Genprodukt direkt oder indirekt mittels einer nachweisbaren Markierung nachgewiesen. Die in dem Assay verwendete spezielle Markierung bzw. die nachweisbare Gruppe ist normalerweise kein kritischer Aspekt der Erfindung solange diese nicht die spezifische Bindung des in dem Assay verwendeten Antikörpers oder den Antikörper wesentlich stört.
Die Markierung kann mit dem "Einfang"-Agens kovalent verknüpft sein (z.B. ein anti-TRT-Antikörper) oder er kann an eine dritte Einheit angeknüpft sein, beispielsweise einem anderen Antikörper, der beispielsweise an das hTRT-Polypeptid spezifisch bindet (an ein anderes Epitop als das, das von dem "Einfang"-Agens erkannt wird, das "Einfang"-Agens (z.B. ein anti-(erster Antikörper) Immunglobulin); ein anti-TRT-Antikörper; ein Antikörper, der an einen anti-TRT-Antikörper bindet oder ein Antikörper/Telomerase-Komplex (z.B. über die Bindung an ein assoziiertes Molekül, beispielsweise ein Telomeraseassoziiertes Protein). Andere Proteine, die an dem in dem Assay verwendeten Antikörper binden können, z.B. Protein A oder Protein G, können auch markiert sein.
In einigen Ausführungsformen kann es zweckmässig sein, mehr als ein markiertes Molekül zu verwenden (d.h. solche, die voneinander unterschieden werden können). Zusätzlich kann ein markierter Antikörper, der das Protein oder die RNA, die mit dem hTRT-Protein assoziiert ist, erkennt, verwendet werden, wenn das durch das "Einfang"-Agens (z.B. ein anti-hTRT-Antikörper) gebundene (beispielsweise immobilisierte) Ziel ein Komplex ist (d.h. ein Komplex aus hTRT und einem TRT-assoziierten Protein, hTR oder einem anderen TRT-assoziierten Molekül. Wenn es sich bei dem Komplex um einen Protein/Nucleinsäure-Komplex (z.B. TRT-hTR) handelt, kann das Reportermolekül ein Polynucleotid oder ein anderes Molekül (z.B. ein Enzym) sein, das die RNA-Komponente des Komplexes erkennt.
Bei einigen Immunassayformaten ist die Verwendung von markierten Bestandteilen nicht erforderlich. Beispielsweise können Agglutinationsassays zum Nachweis des Vorhandenseins der Ziel-Antikörper verwendet werden. In diesem Fall werden Antigen-geschichtete Partikel durch die Zielantikörper enthaltenden Proben agglutiniert. Bei diesem Assay-Format müssen die Bestandteile nicht markiert sein und die Anwesenheit des Ziel-Antikörpers kann durch einfache visuelle Überprüfung nachgewiesen werden.
b) Nicht-kompetitive Assayformate
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Reagenzien für kompetitive und nicht-kompetitive Immunassays zum Nachweis von hTRT-Polypeptiden bereit. Bei nichtkompetitiven Immunassays handelt es sich um Assays, bei denen die Menge des eingefangenen Analyten (in diesem Fall hTRT) direkt gemessen wird. Ein Beispiel für einen solchen Assay ist ein auf monoclonalen Antikörpern basierender "twosite"-Immunassay, bei dem monoclonale Antikörper verwendet werden, die mit zwei nicht-interferierenden Epitopen auf dem hTRT-Protein reaktionsfähig sind. Siehe beispielsweise Maddox et al, i. Exp. Med. 158 (1983), 1211 bezüglich Hintergrundinformation. In einem bevorzugten "Sandwich"-Assay wird das "Einfang"-Agens (z.B. ein anti-TRT-Antikörper) direkt an ein festes Substrat gebunden, wo es immobilisiert wird.
Diese immobilisierten Antikörper fangen dann jedes in der Testprobe vorhandene hTRT-Protein ein. Das so immobilisierte hTRT kann dann markiert werden, d.h. durch Bindung an einen zweiten, eine Markierung tragenden anti-hTRT-Antikörper. In einer alternativen Ausführungsform kann der zweite anti-hTRT-Antikörper zwar keine Markierung aufweisen, jedoch durch einen markierten dritten Antikörper gebunden werden, der spezifisch für Antikörper der Spezies ist, von der der zweite Antikörper stammt. In einer weiteren alternativen Ausführungsform kann der zweite Antikörper mit einer nachweisbaren Einheit modifiziert sein, beispielsweise Biotin, die ein drittes markiertes Molekül spezifisch binden kann, beispielsweise Enzym-markiertes Streptavidin.
c) Kompetitive Assayformate
In kompetitiven Assays wird die Menge des in einer Probe vorhandenen hTRT-Proteins indirekt durch Messung der Menge an zugegebenen (exogenen) hTRT bestimmt, das durch das in der Probe vorhandene hTRT-Protein von einem "Einfang"-Agens (z.B. einem anti-TRT-Antikörper) verdrängt, oder wegkompetitiert wurde. In einem dieser kompetitiven Assays wird eine bekannte Menge eines markierten hTRT-Proteins zu der Probe gegeben und danach die Probe mit einem "Einfang"-Agens (z.B. einem Antikörper, der hTRT-Protein spezifisch bindet) in Kontakt gebracht. Die Menge an exogenem (markiertem) an dem Antikörper gebundenem hTRT-Protein ist umgekehrt proportional zu der Konzentration an in der Probe vorhandenem hTRT-Protein. In einer Ausführungsform ist der Antikörper auf einem festen Substrat immobilisiert.
Die Menge an hTRT-Protein, das an den Antikörper gebunden ist, kann entweder durch Messung der Menge an hTRT-Protein, die in einem TRT-Antikörper-Komplex vorhanden ist, bestimmt werden oder alternativ durch Bestimmung der Menge an übrigbleibendem nicht-komplexierten TRT-Protein. Die Menge an hTRT-Protein kann durch die Bereitstellung eines markierten hTRT-Moleküls nachgewiesen werden.
Ein Hapten-Hemmungsassay stellt ein weiteres Beispiel für einen kompetitiven Assay dar. In diesem Assay ist hTRT-Protein auf einem festen Substrat immobilisiert. Eine bekannte Menge an anti-TRT-Antikörper wird zu der Probe gegeben und danach die Probe mit dem immobilisierten hTRT-Protein in Kontakt gebracht. In diesem Fall ist die Menge an anti-TRT-Antikörper, der an das immobilisierte hTRT-Protein gebunden ist, umgekehrt proportional zu der Menge an hTRT-Protein, das in der Probe vorhanden ist. Die Menge an immobilisiertem Antikörper kann entweder durch Nachweis der immobilisierten Antikörperfraktion bestimmt werden, oder der Antikörperfraktion, die in Lösung bleibt.
Dabei kann der Nachweis direkt sein, im Falle, wenn der Antikörper markiert ist, oder indirekt, im Falle, dass die Markierung an ein Molekül gebunden ist, das an den vorstehend beschriebenen Antikörper spezifisch bindet.
d) Andere Assayformate
Die Erfindung stellt auch Reagenzien und Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung des Vorhandenseins von hTRT in der Probe mittels eines Immunblots (Westernblot)-Formats bereit. In diesem Format werden hTRT-Polypeptide in einer Probe von anderen Bestandteilen der Probe durch Gelelektrophorese (z.B. auf der Basis des Molekulargewichts), die abgetrennten Proteine auf einen geeigneten festen Träger überführt (z.B. ein Nitrocellulosefilter, ein Nylonfilter, ein derivatisierter Nylonfilter etc.) und der Träger wird mit erfindungsgemässen anti-TRT-Antikörpern inkubiert. Die anti-TRT-Antikörper binden spezifisch an hTRT oder anderem TRT auf dem festen Träger.
Diese Antikörper können entweder direkt markiert sein oder sie können alternativ anschliessend unter Verwendung markierter Antikörper (z.B. markierten Schaf-anti-Maus-Antikörpern) nachgewiesen werden oder mittels anderer markierter Reagenzien, die spezifisch an den anti-TRT-Antikörper binden.
Zu weiteren Assayformaten zählen Liposom-Immunassays (LIA), bei denen Liposome verwendet werden, die so konstruiert wurden, dass sie spezifische Moleküle (z.B. Antikörper) binden und eingekapselte Reagenzien oder Marker freisetzen. Die freigesetzten Chemikalien können im Anschluss daran gemäss Standardverfahren nachgewiesen werden (siehe Monroe et al., Amer. Clin. Prod. Rev. 4 (1986), 34).
Wie bereits vorstehend erwähnt, besitzen Assay-Formate, die FACS (und äquivalente Instrumente oder Verfahren) verwenden, Vorteile, wenn hTRT-Genprodukte in einer heterogenen Probe (z.B. einer sowohl normale als auch maligne Zellen enthaltenden Biopsieprobe) gemessen werden.
e) Substrate, feste Träger, Membrane und Filter
Wie bereits vorstehend angemerkt, können in Abhängigkeit von dem Assay verschiedene Bestandteile, einschliesslich dem Antigen, Zielantikörper oder anti-hTRT-Antikörper, an eine feste Oberfläche oder einen festen Träger (d.h. ein Substrat, eine Membran oder Filterpapier) gebunden sein. Viele Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen an eine Vielzahl von festen Oberflächen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Die feste Oberfläche kann beispielsweise eine Membran sein (z.B. Nitrocellulose), eine Mikrotiterplatte (z.B. PVC, Polypropylen oder Polystyrol), ein Teströhrchen (Glas oder Plastik), ein Teststreifen (z.B. Glas, PVC, Polypropylen, Polystyrol, Latex etc.), ein Gefäss für eine Mikrozentrifuge oder ein Glas- oder Plastikkügelchen. Der gewünschte Bestandteil kann kovalent gebunden sein oder durch unspezifische Bindung nicht-kovalent angeknüpft sein.
Eine grosse Anzahl verschiedener organischer und anorganischer Polymere, die sowohl natürlich als auch synthetisch sein können, können als Material für die feste Obefläche verwendet werden. Zu solchen Polymeren zählen Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Rayon, Nylon, Poly(vinylbutyrat), Polyvinylidendifluorid (PVDF), Silikone, Polyformaldehyd, Cellulose, Celluloseacetat, Nitrocellulose etc. Zu den weiteren Materialien, die verwendet werden können, zählen Papier, Gläser, Keramiken, Metalle, Metalloide, Materialien mit Halbleitereigenschaften, Zemente etc. Zusätzlich können gelbildende Substanzen verwendet werden, beispielsweise Proteine (z.B. Gelatinen), Lipopolysaccharide, Silikate, Agarose und Polyacrylamide.
Geeignet sind auch Polymere, die mehrere wässrige Phasen bilden, beispielsweise Dextrane, Polyalkylenglykole oder Tenside, beispielsweise Phospholipide, langkettige (12 bis 24 Kohlenstoffatome) Alkylammoniumsalze etc. Bei porösen festen Oberflächen können in Abhängigkeit von der Art des Systems verschiedene Porengrössen verwendet werden.
Zur Herstellung der Oberfläche kann eine Vielfalt von verschiedenen Substanzen zum Erhalt verschiedener Eigenschaften verwendet werden, insbesondere als Laminate. Beispielsweise können zur Vermeidung einer unspezifischen Bindung, zur Vereinfachung einer kovalenten Konjugation, zur Verstärkung des Signalnachweises etc. Proteinbeschichtungen wie Gelatine verwendet werden.
Wenn eine kovalente Bindung zwischen einer Verbindung und der Oberfläche erwünscht ist, ist die Oberfläche normalerweise polyfunktionell oder sie kann polyfunktionell gemacht werden. Zu den funktionellen Gruppen, die auf der Oberfläche vorhanden und für eine Verknüpfung verwendet werden können, gehören Carboxylsäuren, Aldehyde, Aminogruppen, Cyangruppen, Ethylengruppen, Hydroxylgruppen, Mercaptogruppen etc. Die Art und Weise, wie solche Verknüpfungen durchgeführt werden können, ist für eine grosse Anzahl von Verbindungen an verschiedene Oberflächen allgemein bekannt und in der Literatur ausführlich beschrieben. siehe beispielsweise Immobilized Enzymes, Ichiro Chibata, Halsted Press, New York, 1978 und Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245 (1970) 3059.
Zusätzlich zur kovalenten Bindung können verschiedene Verfahren zur nicht-kovalenten Bindung eines Assaybestandteils verwendet werden. Eine nicht-kovalente Bindung ist typischerweise die unspezifische Absorption einer Verbindung an die Oberfläche.
Natürlich ist die Herabsetzung einer unspezifischen Bindung in Immunassays wünschenswert. Insbesondere dann, wenn der Assay ein Antigen oder einen Antikörper beinhaltet, der auf einem festen Substrat immobilisiert ist, ist die Minimierung der Menge an unspezifischer Bindung an das Substrat wünschenswert. Mittel zur Herabsetzung einer solchen unspezifischen Bindung sind dem Fachmann gut bekannt. Dies beinhaltet typischerweise die Beschichtung des Substrats mit einer Proteinzusammensetzung. Insbesondere Proteinzusammensetzungen, die beispielsweise Rinderserumalbumin (BSA), fettfreies Milchpulver und Gelatine werden häufig verwendet, wobei gelegentlich Milchpulver bevorzugt wird. In einer alternativen Ausführungsform kann die Oberfläche so gestaltet sein, dass sie einen Bestandteil unspezifisch bindet, einen anderen jedoch nicht wesentlich bindet.
Beispielsweise bindet eine ein Lectin, wie beispielsweise Concanavalin A, tragende Oberfläche eine Kohlenhydrat enthaltende Verbindung, jedoch nicht ein unglykosyliertes markiertes Protein. Die US-Patente Nr. 4 447 576 und 4 254 082 geben einen Überblick über verschiedene feste Oberflächen zur Verwendung bei der nicht-kovalenten Verknüpfung von Assay-Bestandteilen.
H. Assays für Anti-TRT-Antikörper
Die vorliegende Erfindung stellt auch Reagenzien und Assays zum Nachweis von-hTRT-spezifischen Immunglobulinen bereit. In einer Ausführungsform wird immobilisierte hTRT (z.B. rekombinante hTRT, die an die Vertiefung einer Mikrotiterplatte gebunden ist) mit Serum von einem Patienten unter Bedingungen inkubiert, bei denen anti-hTRT-Antikörper, wenn sie vorhanden sind, die immobilisierte hTRT binden. Nach dem Waschen zur Entfernung von unspezifisch gebundenem Immunglobulin können gebundene Serumantikörper, falls sie vorhanden sind, durch Zugabe von nachweisbar markierten anti-(menschliches Ig)-Antikörpern nachgewiesen werden (alternative Ausführungsform oder Variationen sind dem Fachmann gut bekannt; siehe beispielsweise Harlow, a.a.O., Kapitel 14).
Diese Assays sind für den Nachweis von anti-hTRT-Antikörpern in beliebigen Quellen einschliesslich tierischem oder menschlichem Serum oder einem Träger, wie beispielsweise Kochsalzlösung, von Nutzen. In einer Ausführungsform werden die Assays zum Nachweis oder zur Überwachung einer Immunantwort auf hTRT-Proteine in einem Patienten verwendet, insbesondere einer Autoimmunantwort (z.B. anti-Telomerase). Anti-hTRT-Antikörper können im Serum, an den Geweben oder Flüssigkeiten von einem Patienten vorhanden sein, der an einer Autoimmunkrankheit oder einem anderen Zustand leidet.
I) Assaykombinationen
Die hier beschriebenen diagnostischen und prognostischen Assays können in verschiedenen Kombinationen und auch in Verbindung mit anderen diagnostischen oder prognostischen Tests durchgeführt werden. Wenn beispielsweise die vorliegenden Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von Krebszellen in einer Patientenprobe verwendet werden, kann die Anwesenheit von hTRT dazu benutzt werden, um das Krankheitsstadium zu bestimmen, ob es wahrscheinlich ist, dass ein bestimmter Tumor in angrenzendes Gewebe eindringt oder zu einem entfernten Standort metastasiert und ob ein erneutes Auftreten des Krebses wahrscheinlich ist. Zu den Tests, die zusätzliche Informationen liefern können, gehören die mikroskopische Analyse von Biopsieproben, der Nachweis von Antigenen (z.B.
Zelloberflächenmarkern), die mit einer möglichen Tumorentstehung assoziiert sind (z.B. mittels Histocytochemie, FACS etc.), bildgebende Verfahren (z.B. nach Verabreichung eines markierten anti-Tumor-Antikörpers an einen Patienten), Telomerase-Aktivitätsassays, Telomerase-Längenassays, hTR-Assays etc. Solche kombinierten Tests können bezüglich des Fortschreitens einer Krankheit nützliche Information liefern.
Die Kombination von Assays kann auch nützliche Information liefern. Beispielsweise können, wie bereits vorstehend angemerkt, Assays für hTRT-mRNA mit Assays für hTR (RNA) oder Telomerase-Aktivität (d.h. TRAP) kombiniert werden, um so Informationen über Telomerase-Assemblierung und -Funktion zu liefern.
J) Kits
Die vorliegende Erfindung stellt auch Kits bereit, die das Screenen, die Überwachung, Diagnose und Prognose bei Patienten mit einem mit Telomerase in Zusammenhang stehenden Zustand von Nutzen sind oder zur Bestimmung des Expressionsspiegels von hTRT in Zellen oder Zellinien. Die Kits enthalten eines oder mehrere Reagenzien zur Bestimmung des Vorhandenseins oder des Fehlens eines hTRT-Genprodukts (RNA oder Protein) oder zur Quantifizierung der Expression des hTRT-Gens. Zu den bevorzugten Reagenzien gehören Nucleinsäureprimer und Sonden, die an das hTRT-Gen, -RNA, -cDNA oder Anteile davon binden, aber auch Proteine, Peptide, Antikörper und Kontroll-Primer, -Sonden, -Oligonucleotide, -Proteine, -Peptide und -Antikörper.
Weitere Substanzen können aufgenommen werden, dazu gehören Enzyme (Z.B. reverse Transkriptasen, DNA-Polymerasen, Ligasen), Puffer und Reagenzien (Markierungen, dNTPs).
Die Kits können alternativ oder in Kombination mit irgendwelchen anderen hier beschriebenen Bestandteilen einen Antikörper enthalten, der spezifisch an hTRT-Polypeptide oder Untersequenzen davon bindet. Es kann ein monoclonaler oder polyclonaler Antikörper sein. Der Antikörper kann an eine weitere Einheit konjugiert sein, beispielsweise eine Markierung und/oder er kann auf einem festen Träger (Substrat) immobilisiert sein. Der (die) Kit(s) kann (können) auch einen zweiten Antikörper zum Nachweis von hTRT-Polypeptid/Antikörper-Komplexen oder zum Nachweis von hybridisierten Nucleinsäuresonden enthalten, sowie ein oder mehrere hTRT-Peptide oder -Proteine zur Kontrolle oder andere Reagenzien.
Der Antikörper oder die Hybridisierungssonde kann frei vorliegen oder an einen festen Träger immobilisiert sein, beispielsweise ein Teströhrchen, eine Mikrotiterplatte, ein Teststäbchen etc. Der Kit kann auch Anleitungen enthalten, die die Verwendung des Antikörpers oder der Hybridisierungssonde in einem Assay zum Nachweis einer Prädisposition für TRT beschreiben. Der Kit kann geeignete Reagenzien zum Nachweis von Markierungen oder zur Markierung positiver und negativer Kontrollen, Waschlösungen, Verdünnungspuffer etc. enthalten.
In einer Ausführungsform enthält der Kit ein Primerpaar zur Amplifikation von hTRT-mRNA. Ein solcher Kit kann auch eine Sonde für amplifizierte hTRT-DNA und/oder eine Polymerase, Puffer, dNTPs etc. enthalten. In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Kit eine Sonde, gegebenenfalls eine markierte Sonde. In einer anderen Ausführungsform umfasst der Kit einen Antikörper.
X. Identifizierung von Modulatoren von Telomerase-Aktivität
A. Allgemeines
Die Erfindung stellt Verbindungen und Behandlungen bereit, die die Aktivität oder Expression einer Telomerase oder eines Telomerase-Bestandteils (z.B. hTRT-Protein) modulieren. Die Erfindung stellt auch Assays und Screening Verfahren (einschliesslich Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz) zur Identifizierung von Verbindungen und Behandlungen bereit, die Telomerase-Aktivität oder -Expression modulieren. Zu diesen Modulatoren von Telomerase-Aktivität und -Expression (die nachstehend als "Modulatoren" bezeichnet werden) gehören Telomerase-Agonisten (die Telomerase-Aktivität und/oder -Expression steigern) und Telomerase-Antagonisten (die Telomerase-Aktivität und/oder -Expression herabsetzen).
Die erfindungsgemässen Modulatoren haben eine grosse Anzahl von Anwendungsmöglichkeiten. Beispielsweise wird davon ausgegangen, dass Telomerase-Modulatoren wirksame therapeutische Mittel zur Behandlung von menschlichen Krankheiten sind. Das Screenen nach agonistischer Aktivität und Aktivatoren der Transkription oder Translation erlaubt die Bereitstellung von Zusammensetzungen, die eine Telomerase-Aktivität in einer Zelle (einschliesslich einer Telomer-abhängigen Replikationsfähigkeit oder einer "partiellen" Telomerase-Aktivität) steigern können. Solche agonistischen Zusammensetzungen erlauben auch die Bereitstellung von Verfahren zur Immortalisierung von ansonsten normalen untransformierten Zellen, wozu Zellen gehören, die nützliche Proteine exprimieren können. Solche Agonisten erlauben auch die Bereitstellung von Verfahren zur Regulierung zellulärer Seneszenz.
Umgekehrt erlaubt das Screenen nach antagonistischer Aktivität die Bereitstellung von Zusammensetzungen, die eine Telomer-abhängige Replikationsfähigkeit herabsetzen und dadurch Zellen mortalisieren, die ansonsten unsterblich sind, beispielsweise Krebszellen. Das Screenen nach antagonistischer Aktivität erlaubt die Bereitstellung von Zusammensetzungen, die Telomerase-Aktivität herabsetzen und dadurch eine unbegrenzte Zellteilung von Zellen, die ein unreguliertes Zellwachstum zeigen, beispielsweise Krebszellen, verhindern. Beispiele von Erkrankungen und Zuständen, die mittels der Modulatoren behandelt werden können, sind hier aufgezählt, beispielsweise in den vorstehenden Abschnitten VII und IX.
Im allgemeinen können die erfindungsgemässen Modulatoren immer dann verwendet werden, wenn eine Steigerung oder eine Herabsetzung einer Telomerase-Aktivität in einer Zelle oder einem Organismus erwünscht ist. Somit kann ein Modulator, der hTRT-Expressionsspiegel steigert, zusätzlich zur Verwendung bei der Krankheitsbehandlung zur Herstellung einer kultivierten menschlichen Zellinie verwendet werden, die Eigenschaften aufweist, wie sie allgemein in dem vorstehenden Abschnitt VIII beschrieben sind und er weist zahlreiche andere Anwendungsmöglichkeiten auf, die für den Fachmann offensichtlich sind.
Eine Verbindung oder Behandlung moduliert die "Expression" von Telomerase oder eines Telomerase-Bestandteils, wenn die Verabreichung der Verbindung oder der Behandlung die Transkriptionsrate oder den Transkriptionsspiegel des einen Telomerase-Bestandteil codierenden Gens (z.B. hTRT-mRNA codierenden Gens) verändert, beeinflusst die Stabilität oder die posttranskriptionale Prozessierung von einen Telomerase-Bestandteil codierende RNA (z.B. Transport, Spleissen, Polyadenylierung oder eine andere Modifizierung), beeinflusst Translation, Stabilität, posttranslationale Prozessierung oder die Modifizierung eines codierten Proteins (z.B. hTRT) oder verändert auf andere Art und Weise den Spiegel an funktionellem (z.B. katalytisch aktivem) Telomerase-RNP.
Eine Verbindung oder Behandlung beeinflusst dann eineTelomerase-"Aktivität", wenn die Verabreichung der Verbindung oder Behandlung eine Telomerase verändert, beispielsweise jene, die in dem vorstehenden Abschnitt IV (B) beschrieben sind (z.B. gehören dazu eine prozessive oder nicht-prozessive katalytische Aktivität von Telomerase; Telomerase-Prozessivität, konventionelle reverse Transkriptase-Aktivität; nucleolytische Aktivität; Primer- oder Substrat-bindende Aktivität; dNTP-bindende Aktivität; RNA-bindende Aktivität; Beeinflussung der Telomerase-RNP-Assemblierung und Protein-bindende Aktivität). Es gibt nicht unbedingt eine scharfe Abgrenzung zwischen Änderung in der "Aktivität" und Veränderungen in der "Expression". Diese Ausdrücke werden zur Erleichterung der Diskussion, jedoch nicht zur Einschränkung verwendet.
Die erfindungsgemässen Modulatoren sollten Telomerase-Aktivität oder -Expression beeinflussen (z.B. ohne allgemein die Expression von "housekeeping"-Proteinen, wie Actin, ändern) und nicht beispielsweise die Expression eines Telomerase-Bestandteils durch unspezifische Vergiftung einer Zielzelle herabsetzen.
B. Assays zur Identifizierung von Telomerase-Modulatoren
Die Erfindung stellt Verfahren und Reagenzien zum Screenen nach Zusammensetzungen oder Verbindungen bereit, die die Expression einer Telomerase oder eines Telomerase-Bestandteils beeinflussen können, die Replikationsfähigkeit von Telomerase bezüglich DNA modifizieren können oder anderweitig die Fähigkeit des Telomerase-Enzyms und des TRT-Proteins Telomer-DNA synthetisieren zu können ("volle Aktivität") modifizieren. Die Erfindung stellt auch Screening-Verfahren für Modulatoren einer beliebigen "partiellen Aktivität" von hTRT oder allen dieser Aktivitäten bereit.
Somit stellt die vorliegende Erfindung Assays bereit, die zum Screenen nach Agensien verwendet werden können, die die Aktivität von Telomerase steigern, beispielsweise dadurch, dass sie dazu führen, dass hTRT-Protein oder Telomerase in einer Zelle exprimiert wird, in der diese normalerweise nicht exprimiert wird, oder durch Steigerung der Spiegel an Telomerase-Aktivität in Telomerase-positiven Zellen.
Telomerase oder Proteine einer Telomerase-Untereinheit, deren katalytische oder immunogene Fragmente oder Oligopeptide davon können zum Screenen nach therapeutischen Verbindungen in einer Vielzahl von Verfahren zum Screenen von Wirkstoffen verwendet werden. Das in einem solchen Test verwendete Fragment kann frei in Lösung vorliegen, an einen festen Träger fixiert sein, von einer Zelloberfläche getragen, oder intrazellulär lokalisiert sein. Die Bildung von Bindungskomplexen zwischen Telomerase oder dem Untereinheitenprotein und dem zu testenden Agens kann gemessen werden.
In verschiedenen Ausführungsformen zählen zu der Erfindung Verfahren zum Screenen nach Antagonisten, die an das aktive Zentrum des Enzyms binden; die Assoziierung seiner RNA- Einheit, von Telomerase-assoziierten Proteinen, Nucleotiden oder Telomer-DNA an Telomerase oder hTRT-Protein hemmen; die Dissoziierung des Enzymkomplexes fördern; die Transkription der Telomerase-RNA-Einheit (z.B. hTR) stören oder eine der hier beschriebenen "partiellen Aktivitäten" hemmen.
Die Erfindung betrifft auch das Screenen nach Zusammensetzungen, die die Assoziierung von Nucleinsäure und/oder Telomerase-assoziierten Zusammensetzungen mit hTRT, z.B. die Assoziierung von hTR mit hTRT oder die Assoziierung von hTRT mit dem menschlichen Homolog von p80 oder einem anderen assoziierten Protein oder die Assoziierung von hTRT mit einem Telomer oder einem Nucleotid hemmen; das Screenen nach Zusammensetzung, die die Dissoziierung oder Assoziierung (d.h. Assemblierung) des Enzymkomplexes fördern, beispielsweise ein Antikörper, der gegen hTR oder hTRT gerichtet ist; das Screenen nach Agensien, die die Prozessivität des Enzyms beeinflussen und das Screenen nach Nucleinsäuren und anderen Zusammensetzungen, die Telomerase binden, wie beispielsweise eine zu hTR komplementäre Nucleinsäure.
Die Erfindung zieht darüber hinaus auch das Screenen nach Zusammensetzungen in Betracht, die die Transkription des hTRT-Gens und/oder die Translation des hTRT-Genprodukts erhöhen oder herabsetzen. Die Erfindung zieht auch ein Screening-Verfahren in Betracht, TelomeraseModulatoren in Tieren, in einer Ausführungsform durch die Rekonstitution einer Telomerase-Aktivität oder einer anti-Telomerase-Aktivität in ein Tier, beispielsweise in einem transgenen Tier. Die Erfindung stellt auch in vivoAssaysysteme bereit, zu denen "knockout"-Modelle gehören, bei denen eine oder verschiedene Einheiten der endogenen Telomerase, der Telomerase-RNA-Einheit und/oder Telomeraseassoziierte Proteine deletiert oder gehemmt wurden. Dabei kann die endogene Telomerase-Aktivität vollständig oder partielle erhalten geblieben sein.
In einer Ausführungsform wird eine exogene Telomerase-Aktivität voll oder partiell rekonstituiert.
In einer erfindungsgemässen Ausführungsform wird eine Reihe von Assays hinsichtlich einer partiellen Telomerase Aktivität bereitgestellt, die die Identifizierung einer Vielfalt verschiedener Klassen von Modulatoren von Telomerase-Aktivität erlauben. Die erfindungsgemässen "Teilaktivitäts"-Assays erlauben die Identifizierung von Modulatorklassen von Telomerase-Aktivität, die ansonsten in einem "Vollaktivitäts"-Telomerase-Assay nicht hätten nachgewiesen werden können. Bei einem Teilaktivitäts-Assay ist die nicht-prozessive Aktivität von TRT und Telomerase beteiligt. Die prozessive Natur der Telomerase wird von Morin, Cell 59 (1989), 521-529 beschrieben; siehe auch Prowse "Identification of a nonprocessive telomerase-activity from mouse cells" Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 (1993), 1493-1497.
Bei einem weiteren erfindungsgemässen Teilaktivitäts-Assay wird die "Reverse Transpriptase-ähnliche"-Aktivität von Telomerase genutzt. Bei diesen Assays wird die reverse Transkriptase-Aktivität des hTRT-Proteins untersucht; siehe Lingner "Reverse transcriptase motifs in the catalytic subunit of telomerase", Science 276 (1997), 561-567. Bei einem weiteren erfindungsgemässen Teilaktivitäts-Assay wird die "nucleolytische Aktivität" von hTRT und Telomerase, zu der die Entfernung von mindestens einem Nucleotid vom 3 min -Strang, typischerweise Guanosin, durch das Enzym beinhaltet, genutzt. Diese nucleolytische Aktivität wurde in Tetrahymena-Telomerase von Collins "Tetrahymena telomerase catalyzes nucleolytic cleavage and nonprocessive elongation" Genes Dev. 7 (1993), 1364-1376 beobachtet.
Bei einem weiteren erfindungsgemässen Teilaktivitäts-Assay ist eine Analyse der Fähigkeit von hTRT und Telomerase als Teil deren Aktivität hinsichtlich der prozessiven DNA-Polymerisation bezeichnet. Ein weiterer erfindungsgemässer Teilaktivitäts-Assay beinhaltet die Analyse der Fähigkeit von hTRT oder Telomerase, deren RNA-Einheit zu binden, d.h. hTR menschliche Zellen, die als eine Matrize für die Telomer-Synthese verwendet wird. Weitere erfindungsgemässe Teilaktivitäts-Assays beinhalten die Analyse der Fähigkeit von hTRT und Telomerase-Chromosomen in vivo zu binden oder oligonucleotid-Primer in vitro oder in rekonstituierten Systemen zu binden oder Proteine zu binden, die mit chromosomalen Strukturen assoziiert sind (siehe bezüglich eines Beispiels für ein solches Protein Harrington, J. Biol. Chem. 270 (1995), 8893-8901).
Zu den chromosomalen Strukturen, die hTRT binden, gehören beispielsweise DNA der Telomer-Wiederholungseinheit, Telomer-Proteine, Histone, nucleäres Matrixprotein, Kontrollproteine für die Zellteilung oder den Zellcyclus etc.
In einer Ausführungsform umfasst ein Assay zur Identifizierung von Modulatoren das Inkontaktbringen von einer oder mehreren Zellen (d.h. "Testzellen") mit einer Testverbindung und die Bestimmung, ob die Testverbindung die Expression oder Aktivität einer Telomerase (oder eines Telomerase-Bestandteils) in der Zelle beeinflusst. Üblicherweise umfasst diese Bestimmung den Vergleich der Aktivität oder der Expression in der Testzelle mit einer ähnlichen Zelle oder Zellen (d.h. Kontrollzellen), die mit der Testverbindung nicht in Kontakt gebracht wurden. In einer alternativen Ausführungsform können anstelle von intakten Zellen Zellextrakte verwendet werden. In einer verwandten Ausführungsform wird die Testverbindung an einen multizellulären Organismus (z.B. eine Pflanze oder ein Tier) verabreicht.
Die Telomerase oder der Telomerase-Bestandteil kann für die Zelle oder den multizellulären Organismus vollständig endogen sein (d.h. von natürlich vorkommenden endogenen Genen codiert), es kann sich auch um eine rekoNA-Substrat bindet, und da die vorliegende Erfindung hTRT- und andere TRT-Proteine in gereinigter Form in grossen Mengen bereitstellt, kann der Fachmann unter Verwendung der erfindungsgemässen Verfahren leicht nach TRT-bindenden Aptameren screenen.
Oligonucleotide (z.B. RNA-Oligonucleotide), die Telomerase, hTRT, HTR oder Anteile davon binden, können mittels der SELEX-Verfahren erzeugt werden (Tuerk, Methods Mol. Biol. 67 (1997), 2190). Bei diesem Verfahren wird ein sehr grosser Pool (106-109) aus Nucleinsäuren mit Zufallssequenzen unter Bedingungen an das Ziel (z.B. hTRT) gebunden, die einer sehr starken Unterscheidung zwischen Molekülen mit hoher Affinität und niedriger Affinität bezüglich der Bindung des Ziels führen. Die gebundenen Moleküle werden von nichtgebundenen abgetrennt und die gebundenen Moleküle kraft einer spezifischen Nucleinsäuresequenz, die in ihren Enden enthalten ist, und mittels geeigneter Amplifikationsreagenzien amplifiziert. Dieser Prozess wird verschiedene Male solange wiederholt, bis eine relativ kleine Anzahl von Molekülen übrig bleibt, die eine hohe Bindungsaffinität für das Ziel aufweisen.
Diese Moleküle können im Anschluss daran auf ihre Fähigkeit Telomerase-Aktivität zu modulieren, wie hier beschrieben, getestet werden.
Antagonisten einer Telomerase-vermittelten DNA-Replikation können auch auf einer Hemmung von hTR (Norton, Nature Biotechnology 14 (1996) 615-619) über komplementäre Sequenz-Erkennung oder -Spaltung, wie dies bei Ribozymen der Fall ist, basieren.
Die erfindungsgemässen inhibitorischen Oligonucleotide können unter Verwendung einer Vielfalt von auf dem Fachgebiet gut bekannten Verfahren in die Zelle transferiert werden. Beispielsweise können Oligonucleotide spontan ohne spezifische Modifikation in das Plasma transportiert werden. In einer alternativen Ausführungsform können sie mittels Liposomen, die mit der zellulären Membran fusionieren oder durch Endocytose aufgenommen werden, zugeliefert werden, d.h. durch die Verwendung vorn an das Liposom angehefteten Liganden oder durch direkte Anheftung an das Oligonucleotid, wobei diese dann an Oberflächenmembran-Proteinrezeptoren der Zelle binden, was zu einer Endocytose führt. In einer alternativen Ausführungsform können die Zellen zur Steigerung des Transports der Oligonucleotide in die Zelle ohne Verletzung der Wirtszellen permeabilisiert werden.
Es kann auch ein DNA-bindendes Protein, beispielsweise HBGF-1, von dem bekannt ist, dass es ein Oligonucleotid in eine Zelle transportieren kann, verwendet werden.
5) Inhibitorische Ribozyme
Ribozyme wirken durch Bindung an eine Ziel-RNA über den die Ziel-RNA bindenden Anteil eines Ribozyms, der in enger Nachbarschaft zu einem enzymatischen Anteil der RNA gehalten wird, der die Ziel-RNA spaltet. Somit erkennt und spaltet das Ribozym eine Ziel-RNA normalerweise über Paarung mit komplementären Basen und nachdem es an der richtigen Stelle gebunden ist wirkt es als Enzym, wobei es die Ziel-RNA spaltet und inaktiviert. Die Spaltung einer Ziel-RNA auf eine solche Weise zerstört deren Fähigkeit, die Synthese eines codierten Proteins zu steuern, vorausgesetzt, die Spaltung geschieht in der codierenden Sequenz. Nachdem ein Ribozym sein RNA-Ziel gebunden und gespalten hat, wird es typischerweise von der RNA freigesetzt, so dass es wiederholt neue Ziele binden und spalten kann.
6) Die Identifizierung von Telomerase-Assoziierten Proteinen zur Verwendung als Modulatoren
In einer erfindungsgemässen Ausführungsform wird die Telomerase zur Identifizierung von Telomerase-assoziierten Proteinen verwendet, d.h. Telomerase-assoziierten Proteinen, die Telomerase-Aktivität modulieren oder ansonsten ergänzen. Wie bereits vorstehend angemerkt, können diese Proteine oder Fragmente davon eine Funktion dadurch modulieren, dass sie die Dissoziierung des Telomerase-Enzymkomplexes bewirken oder die Assoziierung verhindern, die Assemblierung des Telomerase-Komplexes verhindern, hTRT an deren Bindung an ihre, eine ergänzende Einheit darstellende Nucleinsäure hindern oder an ihre Bindung an ihre DNA-Matrize, hTRT an der Bindung von Nucleotiden hindern, oder eine oder mehrere oder alle der Teilaktivitäten des Telomerase-Enzyms oder des hTRT-Proteins, wie bereits vorstehend beschrieben, verhindern, steigern oder hemmen.
Der Fachmann kann die erfindungsgemässen Verfahren für den Nachweis dafür verwenden, welche Anteile (z.B. Domänen) dieser Telomerase-assoziierten Proteine mit Telomerase in Kontakt kommen. In einer erfindungsgemässen Ausführungsform werden diese Telomerase-assoziierten Proteine oder Fragmente davon als Modulatoren von Telomerase-Aktivität verwendet.
7) Telomerase-Assoziierte Proteine als Dominant-negative Mutanten
In einer erfindungsgemässen Ausführungsform werden Telomerase-assoziierte Proteine als Modulatoren von Telomerase-Aktivität verwendet. Zu Telomerase-assoziierten Proteinen zählen chromosomale Strukturen, beispielsweise Histone, Proteine der nucleären Matrix, Kontrollproteine der Zellteilung/des Zellcyclus etc. Zu weiteren Telomerase-assoziierten Proteinen, die für den erfindungsgemässen Zweck als Modulatoren verwendet werden können! zählen p80 und p95, das menschliche Protein und ihre menschlichen Homologe, beispielsweise TP1 und TRF-1 (Chong, Science 270 (1995), 1663-1667). Zusätzlich können Fragmente dieser Telomerase-assoziierten Proteine vom Fachmann gemäss den erfindungsgemässen Verfahren identifiziert und als Modulatoren von Telomerase-Aktivität verwendet werden.
8) Dominant-negative Mutanten
Acht hochkonservierte Motive wurden innerhalb der TRTs verschiedener nicht-menschlicher Spezies identifiziert, wie bereits vorstehend beschrieben (siehe auch Lingner, Science 276 (1997), 561-567). Fig. 4 zeigt ein Schema der menschlichen TRT (hTRT)-codierenden cDNA-Sequenz (von pGRN121) und von RT-Motiven im Vergleich zu S. pombe-Trt1p, Euplotes p123 und S. cerevisiae Est2p. Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante und synthetische Nucleinsäuren bereit, in denen die Codons für die konservierten Aminosäurereste in jedem der acht Motive gegen jedes der anderen Codons ausgetauscht wurden. Eine Vielzahl der erhaltenen codierten Sequenzen exprimieren eine nichtfunktionelle hTRT. Siehe beispielsweise Beispiel 16.
Somit stellt die vorliegende Erfindung beispielsweise eine grosse Anzahl von "mutierten" Telomerase-Enzymen und TRT-Proteinen zur Verfügung, die eine Teilaktivität von Telomerase aufweisen, jedoch nicht die gesamte Aktivität. Beispielsweise kann eine solche Polymerase telomere Strukturen binden, jedoch nicht Telomerase-assoziierte RNA (d.h. hTR). Solch eine Telomerase-Mutante kann, wenn sie in ausreichend hoher Konzentration exprimiert wird, zur Verarmung eines notwendigen Telomerase-Bestandteils (z.B. hTR) führen und dadurch als ein Inhibitor von WildtypTelomerase-Aktivität fungieren. Eine auf diese Weise wirkende mutierte Telomerase stellt einen Antagonisten dar oder eine sogenannte "dominant-negative" Mutante.
9) Antikörper
Die erfindungsgemässen Antikörper können allgemein zur Identifizierung, Reinigung oder Hemmung irgendeiner oder aller Aktivitäten eines Telomerase-Enzyms und hTRT-Proteins verwendet werden. Antikörper können als Antagonisten von Telomerase-Aktivität auf verschiedene Weise wirken, beispielsweise dadurch, dass sie verhindern, dass der Telomerase-Komplex oder das Nucleotid an deren DNA-Substrate bindet, dadurch, dass sie verhindern, dass die Telomerase-Bestandteile einen aktiven Komplex bilden, durch Aufrechterhaltung einer funktionellen (Telomerase-Komplex) quaternären Struktur oder durch Bindung an eine der aktiven Zentren des Enzyms oder an andere Stellen, die allosterische Auswirkungen auf Aktivität haben (die unterschiedlichen Teilaktivitäten von Telomerase sind ausführlich an anderer Stelle dieser Beschreibung beschrieben).
D) Das Entwerfen von Modulatoren
Die erfindungsgemässen Telomerase-Modulatoren können mittels Verfahren, die in der Pharmazie gut bekannt sind, entworfen oder hergestellt werden, dazu gehören kombinatorische Verfahren und "rational drug design"-Verfahren.
1) Methodik der kombinatorischen Chemie
Die Herstellung und das simultane Screenen von grossen Banken aus synthetischen Molekülen kann mittels gut bekannter Verfahren der kombinatorischen Chemie ausgeführt werden, siehe beispielsweise van Breemen, Anal. Chem. 69 (1997), 2159-2164 und Lam, Anticancer Drug Des. 12 (1997), 145-167.
Wie bereits vorstehend angemerkt, kann die Methodik der kombinatorischen Chemie dazu verwendet werden, eine riesige Anzahl von Oligonucleotiden zu erzeugen, die hinsichtlich spezifischer- Oligonucleotide, die geeignete Bindungsaffinitäten besitzen, sehr schnell gescreent werden können und Spezifitäten gegen ein beliebiges Ziel, wie die erfindungsgemässen TRT-Proteine, können genutzt werden (siehe für eine allgemeine Hintergrundinformation Gold, J. of Biol. Chem. 270 (1995), 13581-13584).
2) "Rational Drug Design"
"Rational drug design" beinhaltet einen integrierten Satz an Methoden, zu denen die Strukturanalyse von Zielmolekülen, synthetische Chemie und fortgeschrittene Computerverfahren zählen. Bei der Verwendung zum Entwurf von Modulatoren, beispielsweise Antagonisten/Inhibitoren von Proteinzielen, wie beispielsweise das Telomerase-Enzym und hTRT-Protein, besteht das Ziel von "rational drug design" in einem Verständnis der dreidimensionalen Gestalt und der Chemie eines Moleküls. "Rational drug design" wird unterstützt von Daten, die durch Röntgenstrukturanalyse oder NMR gewonnen wurden und die nun für das hTRT-Protein und Telomerase-Enzym gemäss den durch die Erfindung bereitgestellten Verfahren und unter Verwendung der erfindungsgemässen Reagenzien bestimmt werden können.
Hilfreich sind auch Berechnungen hinsichtlich elektrostatischer Eigenschaften, Hydrophobizitäten und der Lösungsmittelzugänglichkeit. Siehe beispielsweise Coldren, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 6635-6640.
D) Kits
Die Erfindung stellt auch Kits bereit, die zu einer Bestimmung dafür verwendet werden können, ob eine Testverbindung ein Modulator einer TRT-Aktivität ist. Der Kit beinhaltet typischerweise eine oder mehrere der folgenden Bestandteile: ein im wesentlichen gereinigtes TRT-Polypeptid oder Polynucleotid (einschliesslich Sonden und Primern), ein Plasmid, das eine TRT (z.B. hTRT) exprimieren kann, wenn es in eine Zelle oder ein zellfreies Expressionssystem eingeführt wird; ein Plasmid, das eine TR (z.B. hTR) exprimieren kann, wenn es in eine Zelle oder ein zellfreies Expressionssystem eingeführt wird;
Zellen oder Zellinien; eine Zusammensetzung zum Nachweis einer Veränderung in einer TRT-Aktivität und eine Anleitung die zeigt, wie eine Veränderung in der TRT-Aktivität nachgewiesen und gemessen werden kann, wobei angezeigt wird, dass eine Änderung in der Telomerase-Aktivität in Gegenwart der Testverbindung ein Indikator dafür ist, ob die Testverbindung die Telomerase-Aktivität moduliert und ein Behälter. Der Kit kann auch Mittel enthalten, wie beispielsweise ein TRAP-Assay oder ein Assay, der auf einer quantitativen Polymerase-Kettenrekation beruht, um so eine Änderung in einer TRT-Aktivität messen zu können.
Der Kit kann auch eine Anleitung dafür enthalten, wie eine Veränderung in der TRT-Aktivität nachgewiesen und gemessen werden kann, wobei angezeigt wird, dass eine Veränderung in der Telomerase-Aktivität in Anwesenheit der Testverbindung ein Indikator dafür ist, ob die Testverbindung die Telomerase-Aktivität moduliert.
XI. Transgene Organismen (Telomerase-"knockout"-Zellen und Tiermodelle)
Die Erfindung stellt auch transgene nicht-menschliche mehrzellige Organismen (z.B. Pflanzen und Tiere) oder einzellige Organismen (z.B. Hefe) bereit, die eine exogene TRT-Gensequenz enthalten, bei der es sich um eine codierende Sequenz oder eine regulatorische Sequenz (z.B. einen Promotor) handeln kann. In einer Ausführungsform exprimiert der Organismus ein exogenes TRT-Polypeptid mit einer Sequenz von einem menschlichen TRT-Protein. In einer verwandten Ausführungsform exprimiert der Organismus auch einen Telomerase-RNA-Bestandteil (z.B. hTR).
Die Erfindung stellt auch einzellige und mehrzellige Organismen (oder Zellen davon) bereit, bei denen mindestens ein, eine Telomerase-Untereinheit (z.B. TRT oder TR) oder ein Telomerase-assoziiertes Protein codierendes Gen mutiert oder deletiert ist (d.h. in einem codierenden oder regulatorischen Bereich), so dass keine native Telomerase exprimiert wird oder diese mit einem herabgesetzen Spiegel exprimiert oder im Vergleich zu Wildtypzellen oder Organismen mit unterschiedlichen Aktivitäten exprimiert wird. Solche Zellen und Organismen werden oft als "gene knock-out"-Zellen oder -Organismen bezeichnet.
Die Erfindung stellt ferner Zellen und Organismen bereit, bei denen ein endogenes Telomerase-Gen (z.B. Maus-TRT) mutiert oder deletiert ist und ein exogenes Telomerase-Gen (z.B. für menschliche TRT) eingeführt und exprimiert wird. Zellen und Organismen dieses Typs sind beispielsweise als Modellsysteme von Nutzen, um: Modulatoren von hTRT-Aktivität oder -Expression zu identifizieren; die Auswirkungen von Mutationen in Genen für Telomerase-Bestandteile bestimmen zu können und beispielsweise das Timing im Hinblick auf den Entwicklungszustand und die Gewebelokalisierung von Telomerase-Aktivität bestimmen zu können (um beurteilen zu können, wann ein Telomerase-Modulator verabreicht werden soll und um mögliche Nebenwirkungen feststellen zu können).
Zu den Beispielen für mehrzellige Organismen gehören Pflanzen, Insekten und Tiere, wie beispielsweise Mäuse, Ratten, Kaninchen, Affen, Menschenaffen, Schweine und andere Säuger. Ein Beispiel für einen einzelligen Organismus ist Hefe.
Verfahren zur Änderung oder Unterbrechung eines spezifischen Gens (z.B. endogener TRT-Gene) sind dem Fachmann gut bekannt, siehe beispielsweise Baudin et al., Nucl. Acids Res. 21 (1993) , 3329; Wach et al. , Yeast 10 (1994) 1793; Rothstein, Methods Enzymol. 194 (1991), 281; Anderson, Methods Cell Biol. 48 (1995), 31; Pettitt et al., Development 122 (1996), 4149-4157; Ramirez-Solis et al., Methods Enzymol. 225 (1993), 855 und Thomas et al., Cell 51 (1987), 503, wobei jedes dieser Dokumente durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil der Beschreibung anzusehen ist.
Zu den erfindungsgemässen "knockout"-Zellen und -Tieren gehören Zellen und Tiere, in denen eine oder mehrere Einheiten des endogenen Telomerase-Enzymkomplexes deletiert oder gehemmt sind. Die Rekonstitution von TelomeraseAktivität bewahrt die Zelle oder das Tier vor dem unvermeidlichen Zelltod, der durch dessen Unvermögen, Telomere zu bewahren, bedingt ist. Verfahren zur Änderung der Expression von endogenen Genen sind dem Fachmann gut bekannt. Typischerweise beinhalten solche Verfahren die Veränderung oder den Austausch aller regulatorischen Sequenzen, die die Expression eines bestimmten zu regulierenden Gens kontrollieren, oder eines Anteils davon. Die regulatorischen Sequenzen, beispielsweise der native Promotor, können verändert werden.
Das übliche Verfahren für eine zielgerichtete Mutation von Genen beinhaltet die Einfügung eines, das gewünschte Gen enthaltenden genomischen DNA-Fragments in einen Vektor, wonach sich die Clonierung von zwei genomischen Armen um eine selektierbare Neomycin-Resistenzkassette in einem Thymidinkinase enthaltenden Vektor anschliesst. Mit diesem "knock-out"-Konstrukt wird dann eine geeignete Zelle transfiziert, d.h. eine embryonale Stammzelle (ES) der Maus, wobei die Zellen danach einer positiven Selektion (mittels G418 und beispielsweise auf Neomycin-Resistenz zu selektieren) und einer negativen Selektion (wobei beispielsweise FIAU verwendet wird, um Zellen auszuschliessen, denen Thymidinkinase fehlt) unterworfen werden. Dies erlaubt die Selektion von Zellen, die mit dem "knockout"-Vektor eine homologe Rekombination eingegangen sind.
Dieses Vorgehen führt zur Inaktivierung des gewünschten Gens. Siehe beispielsweise die US-Patente 5 464 764; 5 631 153; 5 487 992 und 5 627 059.
"Knocking out"-Expression eines endogenen Gens kann auch erreicht werden mittels homologer Rekombination, die zur Einführung einer heterologen Nucleinsäure in die regulatorischen Sequenzen (z.B. einen Promotor) des gewünschten Gens verwendet wird. Um die Expression von funktionellem Enzym oder Produkt zu verhindern, sind einfache Mutationen geeignet, die entweder den Leserahmen ändern oder den Promotor unterbrechen. Zur Hochregulation der Expression kann ein nativer Promotor gegen einen heterologen Promotor ausgetauscht werden, der höhere Transkriptionsspiegel induziert. Es kann auch die "gene trap insertion" verwendet werden, um ein Wirtsgen zu unterbrechen. Embryonale Stammzellen (ES) der Maus können zur Herstellung von transgenen "knockout"-Tieren verwendet werdenf wie dies beispielsweise in Holzschu Transgenic Res. 6 (1997), 97-106 beschrieben ist.
Die Änderung der Expression von endogenen Genen durch homologe Rekombination kann auch unter Verwendung von Nucleinsäuresequenzen erreicht werden, die das fragliche Strukturen enthalten. Stromaufwärts gelegene Sequenzen werden dafür verwendet, um Konstrukte bezüglich einer heterologen Rekombination zum Ziel zu führen. Unter Verwendung der Information hinsichtlich des TRTStrukturgens, beispielsweise SEQ. ID. Nr. 1, kann der Fachmann Konstrukte für eine homologe Rekombination herstellen, was lediglich Routineexperimente erforderlich macht. Homologe Rekombination zur Änderung der Expression von endogenen Genen ist beschrieben in US-Patent Nr. 5,272,071 und WO 91/09 955, WO 93/09 222, WO 96/29 411, WO 95/31 560 und WO 91/12 650. Homologe Rekombination in Mycobakterien ist beschrieben in Azad Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 4787; Baulard, J.
Bacteriol. 178 (1996), 3091 und Pelicic, Mol. Microbiol. 20 (1996), 991. Homologe Rekombination in Tieren ist beschrieben von Moynahan, Hum. Mol. Genet. 5 (1996), 875 und in Pflanzen von Offringa, EMBO J. 9 (1990) 3077.
XI. Glossar
Die folgenden Bezeichnungen werden nachstehend definiert, um dem Fachmann bei der Ausführung der Erfindung eine zusätzliche Anleitung zu geben: Adjuvans, Allel (& Allelsequenz), Aminosäuren (einschliesslich hydrophobe, polare, geladene), konservative Substitution, Kontrollelemente (und regulatorische Sequenzen), derivatisiert, nachweisbare Markierung, erhöhter Spiegel, Epitop, günstige und ungünstige Prognose, Fusionsprotein, Genprodukt, hTR, unsterblich, Immunogen und immunogen, isoliert, Modulator, Motiv, Nucleinsäure (& Polynucleotid), Oligonucleotide (& Oligomere), funktionell verknüpft, Polypeptide, Sonde (einschliesslich Nucleinsäuresonden und Antikörpersonden), rekombinant, Selektionssystem, Sequenz, spezifische Bindung, stringente Hybridisierungsbedingungen (& Stringenz), wesentliche Identität (& wesentliche Ähnlichkeit), im wesentlichen rein (& im wesentlichen gereinigt),
Telomerase-negative und Telomerase-positive Zellen, katalytische Aktivität von Telomerase, Telomeraseverwandt und Testverbindung.
*Der hier verwendete Ausdruck "Adjuvans" betrifft in seiner normalen Bedeutung jede Substanz, die die Immunantwort gegenüber einem Antigen, mit dem es vermischt ist, erhöht. Zu den für die vorliegende Erfindung nützlichen Adjuvantien gehören, jedoch ohne Beschränkung darauf, Freund's Adjuvans, Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, und oberflächenaktive Substanzen, beispielsweise Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanionen, Peptide, \lemulsionen, "Keyhole limpet"-Hemocyanin und Dinitrophenol. BCG ("Bacillus Calmette-Guerin") und Corynebacterium parvum sind ebenfalls nützliche Adjuvantien.
Die hier verwendete Bezeichnung "Allel" oder "Allelsequenz" betrifft eine alternative Form einer Nucleinsäuresequenz (d.h. einer hTRT-Protein codierenden Nucleinsäure). Allele sind das Ergebnis von Mutationen (d.h. Änderungen in der Nucleinsäuresequenz) und es kommt dadurch im allgemeinen zur Herstellung veränderter und/oder unterschiedlich regulierter mRNAs oder Polypeptide, deren Struktur und/oder Funktion geändert sein kann oder nicht. Übliche auf Mutationen beruhende Änderungen, die zur Entstehung von Allelen führen, werden allgemein natürlichen Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Nucleotiden zugeschrieben, die die codierten Aminosäuren beeinflussen können oder auch nicht. Jede Art dieser Änderung kann allein vorkommen, in Kombination mit den anderen oder einmal oder öfter innerhalb eines gegebenen Gens, Chromosoms oder einer anderen zellulären Nucleinsäure.
Jedes gegebene Gen kann keine, eine oder viele allele Formen haben. Die hier verwendete Bezeichnung für "Allel" bezieht sich entweder auf ein Gen oder eine von dem Gen transkribierte mRNA oder beides.
Die hier beschriebenen "Aminosäuren" werden gelegentlich durch den Standard-Einbuchstabencode bezeichnet: Alanin (A), Serin (S), Threonin (T), Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E), Asparagin (N), Glutamin (Q), Arginin (R), Lysin (K), Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V), Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W), Prolin (P), Glycin (G), Histidin (H), Cystein (C). Dazu zählen auch synthetische und nicht-natürlich vorkommende Aminosäure-Analoge (und/oder Peptidverknüpfungen).
Der hier verwendete Ausdruck "hydrophobe Aminosäuren" bezieht sich auf A, L, I, V, P, F, W und M. Der hier verwendete Ausdruck "polare Aminosäuren" bezieht sich auf G, S, T, Y, C, N und Q. Der hier verwendete Ausdruck "geladene Aminosäuren" bezieht sich auf D, E, H, K und R.
Der hier verwendete Ausdruck "konservative Substitution" bezieht sich bei der Beschreibung eines Proteins auf eine Veränderung in der Aminosäurezusammensetzung des Proteins, die die Aktivität des Proteins nicht wesentlich verändert. Somit bezieht sich der Ausdruck "konservativ modifizierte Variationen" einer bestimmten Aminosäuresequenz auf Aminosäuresubstitutionen, bei denen Aminosäuren ausgetauscht sind, die für die Proteinaktivität nicht kritisch sind, oder auf die Substitution von Aminosäuren gegen andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (sauer, basisch, positiv oder negativ geladen, polar oder nicht-polar etc.), so dass die Substitutionen selbst von kritischen Aminosäuren die Aktivität nicht wesentlich ändern. Tabellen hinsichtlich konservativer Substitution, die funktionell ähnliche Aminosäuren aufzählen, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Die folgenden sechs Gruppen enthalten jeweils Aminosäuren, die gegenüber einander konservative Substitutionen darstellen: 1) Alanin (A), Serin (S), Threonin (T); 2) Asparaginsäure (D) Glutaminsäure (E) 3) Asparagin (N), Glutamin (Q); 4) Arginin (R), Lysin (K), 5) Isoleucin (I), Leucin (L) Methionin (M); Valin (V); und 6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W) (siehe auch Creighton, Proteins, (1984), W.H. Freeman and Company). Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass die vorstehend angegebenen Austausche nicht die einzigen möglichen konservativen Substitutionen darstellen. Beispielsweise könnte man den Austausch einer geladenen Aminosäure gegen eine andere geladene Aminosäure als konservative Substitution erachten, unabhängig davon, ob sie positiv oder negativ geladen ist.
Zusätzlich sind individuelle Substitutionen, Deletionen oder Additionen, die eine einzelne Aminosäure oder einen kleinen Prozentsatz von Aminosäuren in einer codierten Sequenz ändern, hinzufügen oder deletieren, ebenfalls "konservativ modifizierte Variationen". Eine "konservative Substitution" kann in ein rekombinantes Protein dadurch eingeführt werden, dass ein oder mehrere Codons verwendet werden, die sich von den Codons unterscheiden, die von dem nativen Gen oder Wildtyp-Gen verwendet werden. In diesem Fall beinhaltet eine konservative Substitution auch die Substitution eines Codons für eine Aminosäure gegen ein anderes Codon für dieselbe Aminosäure.
Die hier verwendeten Bezeichnungen "Kontrollelemente" oder "regulatorische Sequenzen" beinhalten Enhancer, Promotoren, Transkriptionsterminatoren, Replikationsursprünge, chromosomalintegrierte Sequenzen, 5 min - und 3 min - nicht translatierte Bereiche, mit denen Proteine oder andere Biomoleküle zur Durchführung von Transkription und Translation interagieren. Bei eukaryotischen Zellen enthalten die Kontrollsequenzen einen Promotor und vorzugsweise einen Enhancer, der beispielsweise von Immunglobulingenen, SV40, Cytomegalovirus stammt, und eine Polyadenylierungssequenz. Sie können auch Donor- und Akzeptor-Sequenzen für die Spleissung enthalten. Je nach verwendetem Vektorsystem und verwendetem Wirt kann eine beliebige Anzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen zu denen auch konstitutive und induzierbare Promotoren gehören, verwendet werden.
Die hier verwendete Bezeichnung "derivatisierte(s)" Polynucleotid, Oligonucleotid oder Nucleinsäure bezieht sich auf ein Oligo- oder Polynucleotid, das einen derivatisierten Substituenten umfasst. In einigen Ausführungsformen ist der Substituent im wesentlichen hinsichtlich der Hybridisierung mit komplentären Polynucleotiden nicht störend. Derivatisierte Oligo- oder Polynucleotide, die mit hinzugefügten chemischen Substituenten modifiziert wurden (z.B. durch Modifikation eines bereits synthetisierten Oligo- oder Polynucleotids oder durch Einbau einer modifizierten Base oder eines Rückgrat-Analogen während der Synthese) können in eine metabolisch aktive eukaryotische Zelle eingeführt werden, um mit einer hTRT-DNA, -RNA oder einem hTRT-Protein zu hybridisieren, wobei sie eine Veränderung oder chemische Modifikation an einer dortigen DNA, RNA oder einem dortigen Protein erzeugen.
In einer alternativen Ausführungsform können die derivatisierten Oligo- oder Polynucleotide mit hTRT-Polypeptiden, Telomerase-assoziierten Proteinen oder anderen Faktoren, die mit hTRT-DNA oder hTRT-Genprodukten interagieren, in Wechselwirkung treten und diese ändern, oder die Expression oder Funktion von hTRT-DNA oder -RNA oder -Proteinen ändern oder modulieren. Zu den Beispielen für angeknüpfte chemische Substituenten zählen: Europium (III) texaphyrin, quervernetzende Mittel, Psoralen, Metallchelate (z.B. Eisen/EDTA-Chelat für eine Eisen-katalysierte Spaltung), Topoisomerasen, Endonucleasen, Exonucleasen, Ligasen, Phosphodiesterasen, photodynamische Porphyrine, chemotherapeutische Wirkstoffe (z.B. Adriamycin, Doxirubicin), interkalierende Mittel, Basen-modifizierende Mittel, Immunglobulinketten und Oligonucleotide.
Eisen/EDTA-Chelate sind chemische Substituenten, die oft dann verwendet werden, wenn eine lokale Spaltung einer Polynucleotidsequenz erwünscht ist (Hertzberg et al., J. Am. Chem. Soc. 104 (1982), 313; Hertzberg und Dervan, Biochemistry 23 (1984), 3934; Taylor et al., Tetrahedron 40 (1984), 457 und Dervan, Science 232 (1986), 464). Zu Beispielen von chemischen Verfahren zur Anknüpfung zählen: direkte Verbindung z.B. über eine angehängte reaktive Aminogruppe (Corey und Schultz, Science 238 (1988), 1401, wobei dieses Dokument durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen ist) und andere chemische Verfahren für direkte Verbindungen, wobei allerdings auch Verbindungsverfahren für Streptavidin/Biotin und Digoxigenin/anti-Digoxigenin-Antikörper verwendet werden können.
Verfahren zur Kopplung chemischer Substituenten werden bereitgestellt in den US-Patenten 5 135 720, 5 093 245, und 5 055 556, die aufgrund der Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden können. Andere chemische Kopplungsverfahren liegen im Ermessen des Fachmanns.
Die hier verwendete Bezeichnung "nachweisbare Markierung" besitzt die auf dem Fachgebiet übliche Bedeutung und betrifft ein Atom (z.B. ein Radionuclid), Molekül (z.B. Fluorescein) oder einen Komplex, der dafür verwendet wird oder dafür verwendet werden kann, um die Anwesenheit eines Moleküls nachzuweisen (z.B. aufgrund einer physikalischen oder chemischen Eigenschaft) oder anzuzeigen, oder um die Bindung eines anderen Moleküls zu ermöglichen, an das es kovalent gebunden oder eng assoziiert ist. Die Bezeichung "Markierung" bezieht sich auch auf kovalent gebundene oder eng assoziierte Moleküle (z.B. ein Biomolekül, beispielsweise ein Enzym), das auf ein Substrat zur Erzeugung eines nachweisbaren Atoms, Moleküls oder Komplexes einwirkt.
Zu den für die erfindungsgemässe Verwendung geeigneten nachweisbaren Markierungen zählen alle Zusammensetzungen, die durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunchemische, elektrische, optische oder chemische Mittel nachweisbar sind. Zu den für die vorliegende Erfindung nützlichen Markierungen gehören Biotin zur Anfärbung mit markiertem Streptavidin-Konjugat, magnetische Kügelchen (z.B. DynabeadsÖ), Fluoreszenzfarbstoffe (z.B. Fluorescein,Texas-rot, Rhodamin, grün-fluoreszierendes Protein ("greenfluorescent protein"), verstärktes grün-fluoreszierendes Protein ("enhanced green fluorescent protein"), Lissamin, Phycoerythrin, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, "FluorX" (Amersham), "SyBR Green I & II" (Molecular Probes), etc.), radioaktive Markierungen (z.B. <3>H, <1><2><5>I, <3><5>S, <1><4>C oder <3><2>P), Enzyme (z.B.
Hydrolasen, insbesondere Phosphatasen, wie beispielsweise alkalische Phosphatase, Esterasen und Glycosidasen oder Oxidoreductasen, insbesondere Peroxidasen, wie beispielsweise Meerrettichperoxidase und andere üblicherweise in einem ELISA verwendete Enzyme), Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, chemiluminescente Gruppen, chromogene Mittel und colorimetrische Markierungen, wie beispielsweise kolloidales Gold oder gefärbte Glas- oder Plastik (z.B. Polystyrol, Polypropylen, Latexetc.) Kügelchen. Zu denen Patenten, deren Lehre die Verwendung solcher Markierungen betrifft, zählen US-Patent 3 817 837; 3 850 752; 3 939 350; 3 996 345; 4 277 437; 4 275 149 und 4 366 241. Mittel zum Nachweis solcher Markierungen sind dem Fachmann gut bekannt.
Somit können beispielsweise radioaktive Markierungen und chemilumineszente Markierungen mittels eines photographischen Films oder Szintillationszählern nachgewiesen werden und Fluoreszenzmarker können zum Nachweis von emitiertem Licht mit einem Photodetektor (z.B. bei der Fluoreszenz aktivierten Zellsortierung) nachgewiesen werden. Enzymatische Markierungen werden typischerweise dadurch nachgewiesen, dass das Enzym mit einem Substrat versehen wird und dass durch die Wirkung des Enzyms auf das Substrat das erzeugte Reaktionsprodukt nachgewiesen wird. Colorimetrischen Markierungen werden einfach durch Sichtbarmachung der gefärbten Markierung nachgewiesen. Somit ist eine Markierung jede Zusammensetzung, die durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunchemische, elektrische, optische oder chemische Mittel nachweisbar ist.
Die Markierung kann an den gewünschten Assay-Bestandteil gemäss auf dem Fachgebiet gut bekannter Verfahren direkt oder indirekt gekoppelt werden. Nicht radioaktive Markierungen werden oft durch indirekte Mittel angebracht. Im allgemeinen ist ein Ligandenmolekül (z.B. Biotin) kovalent an das Molekül gebunden. Der Ligand bindet dann ein anti-Ligandenmolekül (z.B. Streptavidin), das entweder inhärent nachweisbar ist oder an ein ein Signal erzeugendes System kovalent gebunden ist, wie beispielsweise ein nachweisbares Enzym, eine fluoreszierende Verbindung oder eine chemilumineszierende Verbindung. Es kann eine Reihe von Liganden und anti-Liganden verwendet werden. In den Fällen, in denen ein Ligand einen natürlichen anti-Liganden aufweist, beispielsweise Biotin, Thyroxin oder Cortison, kann er in Verbindung mit den markierten, natürlich vorkommenden anti-Liganden verwendet werden.
Alternativ kann jedes Hapten oder jede antigene Verbindung in Kombination mit einem Antikörper verwendet werden. Die Moleküle können auch direkt an signalerzeugende Verbindungen konjugiert sein, beispielsweise durch Konjugation mit einem Enzym oder Fluorophor. Mittel zum Nachweis von Markierungen sind dem Fachmann gut bekannt. Somit zählen beispielsweise dann, wenn die Markierung eine radioaktive Markierung ist, zu den Nachweismitteln ein Szintillationszähler, photographischer Film, wie bei der Autoradiographie, oder eine Bildgebung mittels gespeichertem Phosphor ("storage phosphor imaging"). Eine Fluoreszenzmarkierung kann durch Anregung des Fluorchroms mit Licht einer geeigneten Wellenlänge und dem Nachweis der erhaltenen Fluoreszenz nachgewiesen werden.
Die Fluoreszenz kann visuell nachgewiesen werden, mit Hilfe eines photographischen Films, mittels eines elektronischen Detektors, wie beispielsweise ladungsgekoppelte Vorrichtungen (CCDs) oder Sekundärelektronenvervielfacher etc. Auf ähnliche Weise können enzymatische Markierungen dadurch nachgewiesen werden, dass für das Enzym die geeigneten Substrate bereitgestellt werden, und das erhaltene Reaktionsprodukt nachgewiesen wird. Auch können einfache colorimetrische Markierungen durch die Beobachtung der mit der Markierung assoziierten Farbe nachgewiesen werden. Wenn Paare von Fluorophoren in einem Assay verwendet werden, wird es oft bevorzugt, dass diese unterschiedliche Emissionsmuster (Wellenlängen) besitzen, so dass sie leicht unterschieden werden können.
Die Bezeichnung "erhöhter Spiegel" bezieht sich auf eine Menge an hTRT-Genprodukt (oder einer anderen angegebenen Substanz oder Aktivität) in einer Zelle, die erhöht ist, oder höher im Vergleich mit dem Spiegel in einem Referenzstandard, zu dem Spiegel in normalen Telomerasenegativen Zellen in einer Person oder in anderen Personen, die nicht an dem entspechenden Zustand leiden, beispielsweise für eine Diagnose, und für eine Prognose, zum Spiegel in Tumorzellen von einer Reihe von Stadien, oder Klassen von beispielsweise Tumoren.
Der hier verwendete Ausdruck "Epitop" hat seine übliche Bedeutung, d.h. er bezieht sich auf eine Stelle auf einem Antigen, die von einem Antikörper erkannt wird. Epitope sind typische Abschnitte von Aminosäuren, die einen kleinen Anteil des Gesamtproteins darstellen. Epitope können die Konformation betreffen (d.h. diskontinuierlich). Das heisst, sie können durch Aminosäuren gebildet werden, die von nichtzusammenhängenden Teilen an Primersequenz codiert werden, und die aufgrund der Proteinfaltung nebeneinander zu liegen kommen.
Die Bezeichnungen "günstige Prognose" und "ungünstige Prognose" sind auf dem Fachgebiet bekannt. Im Zusammenhang mit Krebs bedeutet "günstige Prognose", dass sich ein Tumor wahrscheinlich zurückbilden wird, oder längere Überlebenschancen für Patienten mit einer günstigen Prognose bestehen im Vergleich zu denen mit einer ungünstigen Prognose, während der Ausdruck "ungünstige Prognose" bedeutet, dass der Tumor wahrscheinlich aggressiver ist, was zu einem schlechten Krankheitsverlauf für den Patienten führt oder einem schnellerem Fortschreiten der Krankheit.
Der hier verwendete Ausdruck "Fusionsprotein" bezieht sich auf ein zusammengesetztes Protein, d.h. eine einzelne zusammenhängende Aminosäuresequenz, die aus zwei (oder mehreren) unterschiedlichen heterologen Polypeptiden aufgebaut ist, die normalerweise nicht in einer einzigen Aminosäuresequenz zusammen fusioniert sind. Somit kann ein Fusionsprotein eine einzelne Aminosäuresequenz beinhalten, die zwei vollkommen verschiedene Aminosäuresequenzen enthält oder zwei ähnliche oder identische Polypeptidsequenzen, vorausgesetzt, dass diese Sequenzen normalerweise nicht zusammen in einer einzigen Aminosäuresequenz aufgefunden werden.
Fusionsproteine können allgemein unter Verwendung entweder von Nucleinsäure-Rekombinationsverfahren hergestellt werden, d.h. als das Ergebnis von Transkription und Translation eines rekombinanten Genfusionsprodukts, wobei die Fusion einen Abschnitt umfasst, der ein erfindungsgemässes Polypeptid codiert und einen Abschnitt, der ein heterologes Protein codiert, oder durch auf dem Fachgebiet allgemein bekannte chemische Syntheseverfahren. Der (Die) nicht-hTRT-Bereich(e) des Fusionsproteins können an den Aminoterminus des hTRT-Polypeptids, den Carboxy-Terminus oder beide fusioniert werden.
Der hier verwendete Ausdruck "Genprodukt" bezieht sich auf ein von einem Gen transkribiertes RNA-Molekül oder ein Protein, das von dem Gen codiert oder von der RNA translatiert wird.
Der hier verwendete Ausdruck "hTR" (menschliche Telomerase-RNA) bezieht sich auf den RNA-Bestandteil von menschlicher Telomerase und aller natürlich vorkommender Allele und Varianten oder rekombinate Varianten. hTR wird ausführlich in dem US-Patent Nr. 5 583 016 beschrieben, das durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden kann.
Der hier verwendete Ausdruck "unsterblich" hat, wenn er sich auf eine Zelle bezieht, seine normale Bedeutung auf dem Telomerase betreffenden Fachgebiet und bezieht sich auf Zellen, die ein offensichtlich unbegrenztes replikatives Potential besitzen. Der Ausdruck "unsterblich" kann sich auch auf Zellen mit erhöhter Proliferationsfähigkeit im Vergleich zu ihren unmodifizierten Gegenstücken beziehen. Beispiele für unsterbliche menschliche Zellen sind maligne Tumorzellen, Keimbahnzellen und bestimmte transformierte menschliche Zellinien, die in vitro kultiviert sind (z.B. Zellen, die nach Transformation durch virale Oncogene unsterblich wurden). Im Gegensatz dazu sind die meisten normalen menschlichen somatischen Zellen sterblich, d.h. sie besitzen ein begrenztes replikatives Potential und werden nach einer ähnlichen Zahl von Zellteilungen senescent.
Die hier verwendeten Ausdrücke "Immunogen" und "immunogen" haben die auf diesem Fachgebiet übliche Bedeutung, d.h. ein Immunogen ist ein Molekül, beispielsweise ein Protein oder ein anderes Antigen, das eine adaptive Immunantwort nach Injektion in eine Person oder ein Tier auslöst.
Der hier verwendete Ausdruck "isoliert" bedeutet, wenn er sich auf ein Molekül oder eine Zusammensetzung bezieht, beispielsweise auf ein RNP (z.B. mindestens ein Protein und mindestens eine RNA), dass das Molekül oder die Zusammensetzung von mindestens einer weiteren Verbindung (z.B. ein Protein, andere RNAs oder andere Verunreinigungen mit denen es in vivo oder in seinem natürlich vorkommenden Status assoziiert ist, abgetrennt wurde. Somit wird ein RNP dann als "isoliert" angesehen, wenn er beispielsweise von einer Zellmembran, beispielsweise aus einem Zellextrakt, isoliert wurde. Eine isolierte Zusammensetzung kann jedoch auch im wesentlichen rein sein.
Der hier verwendete Begriff "Modulator" bezieht sich auf jede synthetische oder natürliche Verbindung oder Zusammensetzung, die auf beliebige Weise sowohl die "volle" oder jede "Teilaktivität" einer Telomerase-reversen Transkriptase (TRT) verändern kann. Ein Modulator kann ein Agonist oder ein Antagonist sein. Ein Modulator kann, allerdings ohne Beschränkung darauf, eine beliebige organische oder anorganische Verbindung sein. Dazu gehören beispielsweise kleine Moleküle, Peptide, Proteine, Zucker, Nucleinsäure, Fettsäuren etc.
Die hier verwendete Bezeichnung "Motiv" bezieht sich auf eine Sequenz von aufeinanderfolgenden Aminosäuren (oder auf eine Nucleinsäuresequenz, die eine Sequenz von aufeinanderfolgenden Aminosäuren codiert), die ein Merkmal oder eine Struktur in einem Protein definiert, die allen Proteinen einer definierten Klasse oder eines definierten Typs gemeinsam ist, oder innerhalb dieser Proteine konserviert ist. Das Motiv oder die "Konsensus"-Sequenz können sowohl konservierte als auch nicht-konservierte Reste enthalten, die konservierten Reste in der Motivsequenz zeigen jedoch an, dass der konservierte Rest oder die Klasse von Resten (d.h. hydrophob, polar, nicht-polar oder eine andere Klasse) typischerweise an der angegebenen Position in jedem Protein (oder Gen oder mRNA) der Klasse von Proteinen, die durch das Motiv definiert sind, vorhanden ist.
Motive können sich entsprechend der Proteinklasse unterscheiden. Somit bilden beispielsweise die reverse Transkriptase-Enzyme eine Klasse von Proteinen, die durch eines oder mehrere Motive definiert sein kann und zu dieser Klasse gehören auch Telomerase-Enzyme. Die Telomerase-Enzyme können jedoch als die Klasse von Enzymen mit Motiven definiert werden, die für diese Klasse charakteristisch sind. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass die Identifizierung eines Restes als konservierter Rest in einem Motiv nicht bedeutet, dass jedes Mitglied der durch das Motiv definierten Klasse diesen angegebenen Rest (oder Klasse von Resten) an der angegebenen Position aufweist und dass eines oder mehrere Mitglieder der Klasse einen unterschiedlichen Rest an der konservierten Position besitzen kann (können).
Die hier verwendeten Ausdrücke "Nucleinsäure" und "Polynucleotid" werden gegenseitig austauschbar verwendet. Bei der Verwendung des Ausdrucks "Polynucleotid" ist der Ausschluss von Oligonucleotiden (d.h. kurzen Polynucleotiden) nicht beabsichtigt und dieser Ausdruck kann sich auch auf synthetische und/oder nicht-natürlich vorkommende Nucleinsäuren beziehen (d.h. Nucleinsäure-Analoge oder modifizierte Rückgratreste oder Bindungen umfassen).
Die hier verwendeten Ausdrücke "Oligonucleotide" oder "Oligomere" beziehen sich auf eine Nucleinsäuresequenz aus etwa 7 Nucleotiden oder mehr und bis zu etwa 700 Nucleotiden, die als eine Sonde oder "Amplimer" verwendet werden können. Oligonucleotide weisen vorzugsweise eine Länge von zwischen etwa 10 und etwa 50 Nucleotiden auf, mehr bevorzugt von etwa 14 bis etwa 35 Nucleotiden und am meisten bevorzugt von etwa 15 bis etwa 25 Nucleotiden und dieser Ausdruck kann sich auch auf synthetische und/oder nicht natürlich vorkommende Nucleinsäuren beziehen (d.h. Nucleinsäure-Analoge oder modifizierte Rückgratreste oder Bindungen umfassen).
Der hier verwendete Ausdruck "funktionell verknüpft" bezieht sich auf eine funktionelle Beziehung zwischen zwei oder mehr Nucleinsäuresegmenten (z.B. DNA): Beispielsweise ist ein Promotor oder Enhancer mit einer codierenden Sequenz funktionell verknüpft, wenn er die Transkription der Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle oder einem anderen Expressionssystem stimuliert. Sequenzen, die funktionell verknüpft sind, sind im allgemeinen aufeinanderfolgend und im Fall einer Signalsequenz sowohl aufeinanderfolgend und im Leserahmen. Enhancer müssen jedoch nicht in enger Nachbarschaft zu den codierenden Sequenzen, deren Transkription sie erhöhen sollen, gelegen sein.
Der hier verwendete Ausdruck "Polypeptid" und die Bezeichnung "Protein" werden gegenseitig austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Polymer, das aus Aminosäureresten zusammengesetzt ist, wozu synthetische, natürlich vorkommende und nicht natürlich vorkommende Analoge davon zählen. Peptide sind Beispiele für Polypeptide.
Der hier verwendete Ausdruck "Sonde" bezieht sich auf ein Molekül, das ein anderes Molekül spezifisch bindet. Ein Beispiel einer Sonde ist eine "Nucleinsäuresonde", die an eine im wesentlichen komplementäre Nucleinsäure spezifisch bindet (d.h. sich anlagert oder hybridisiert). Ein weiteres Beispiel einer Sonde ist eine "Antikörper-Sonde", die an ein entsprechendes Antigen oder Epitop spezifisch bindet.
Der hier verwendete Ausdruck "rekombinant" bezieht sich auf ein Polynucleotid, das in vitro synthetisiert oder auf andere weise manipuliert wurde (z.B. ein "rekombinantes Polynucleotid"), auf Verfahren, die sich auf die Verwendung rekombinanter Polynucleotide zur Herstellung von Genprodukten in Zellen oder anderen biologischen Systemen beziehen oder auf ein Polypeptid ("rekombinantes Protein"), das von einem rekombinanten Polynucleotid codiert wird.
Der hier verwendet Ausdruck "Selektionssystem" bezieht sich im Zusammenhang mit stabil transformierten Zellinien auf ein Verfahren zur Identifizierung und/oder Selektion von Zellen, die eine gewünschte rekombinante Nucleinsäure enthalten. Eine grosse Vielzahl von Selektionssystemen zur Identifizierung von transformierten Zellen ist bekannt und diese sind zur Anwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet.
Beispielsweise können durch Plasmide oder andere Vektoren transformierte Zellen durch die Resistenz gegen Antibiotika selektiert werden, die durch auf den Plasmiden enthaltene Gene verliehen wird, beispielsweise die gut bekannten Gene amp, gpt, neo und hyg oder andere Gene, wie beispielesweise die Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase-Gene (Wigler et al., Cell 11 (1977), 223-32 und das Adeninphosphoribosyltransferasegen (Lowy et al., Cell 22 (1980), 817), die in tk<->- bzw. aprt<->-Zellen verwendet werden können. Auch die Resistenz gegen einen Antimetaboliten, ein Antibiotikum oder Herbizid kann als Basis für eine Selektion verwendet werden; beispielsweise dhfr, das Resistenz gegen Metotrexat verleiht und auch für eine Genamplifikation von Nutzen ist (Wigler et al. Proc. Natl. Acad.
Sci., 77 (1980), 3567); npt, das Resistenz gegen die Aminoglykoside Neomycin und G-418 verleiht (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150 (1981), 1) und als oder pat, die Resistenz gegen Chlorsulfuron bzw. Phosphinotricin-Acetyltransferase verleihen (Murry, in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill, New York NY, Seiten 191-196 (1992)). Es werden weitere selektierbare Gene beschrieben, beispielsweise trpB, ein Gen das Hygromycin-Resistenz verleiht und Zellen erlaubt anstelle von Tryptophan Indol zu verwenden, oder hisD, das es Zellen erlaubt anstelle von Histidin Histinol zu verwenden (Hartman und Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci., 85 (1988), 8047).
Erst kürzlich hat dieVerwendung von sichtbaren Markern grosse Popularität erreicht, wobei solche Marker wie Anthocyanine, beta -Glucuronidase und dessen Substrat, GUS und Luciferase und dessen Substrat, Luciferin, nicht nur zur Identifizierung von Transformanten beide Verwendung finden sondern auch zur Quantifizierung der Menge von transienter oder stabiler Proteinexpression, die einem spezifischen Vektorsystem zugeschrieben werden kann (Rhodes et al., Meth. Mol. Biol 55 (1995), 121).
Der hier verwendete Ausdruck "Sequenz" eines Gens, einer Nucleinsäure, eines Proteins oder Peptids bezieht sich (falls nicht spezifisch anders angegeben) auf die Anordnung von Nucleotiden entweder in einem Strang oder beiden Strängen eines doppelsträngigen DNA-Moleküls, beispielsweise auf die Sequenz sowohl des codierenden Strangs als auch des dazu komplementären Strangs, oder in einem einzelsträngigen Nucleinsäuremolekül, oder auf die Anordnung von Aminosäuren in einem Peptid oder Protein.
Der hier verwendete Ausdruck "spezifisch bindend" bezieht sich auf die Fähigkeit eines Moleküls, typischerweise eines Antikörpers oder Polynucleotids, mit einem anderen spezifischen Molekül selbst in Gegenwart von vielen anderen unterschiedlichen Molekülen in Kontakt zu kommen und zu assoziieren. Beispielsweise kann ein einzelsträngiges Polynucleotid spezifisch an ein einzelsträngiges Polynucleotid, das in seiner Sequenz komplementär ist, spezifisch binden, und ein Antikörper bindet spezifisch an sein korrespondierendes Antigen (oder "ist spezifisch immunreaktiv damit").
Der hier verwendete Ausdruck "stringente Hybridisierungsbedingungen" oder "Stringenz" bezieht sich auf Bedingungen im Bereich von etwa 5 DEG C bis etwa 20 DEG C oder 25 DEG C unter der Schmelztemperatur (Tm) der Zielsequenz und einer Sonde mit einer exakten oder fast exakten Komplementarität zum Ziel. Der hier verwendete Ausdruck "Schmelztemperatur" bezieht sich auf die Temperatur, bei der eine Population von doppelsträngigen Nucleinsäuremolekülen halb in Einzelstränge dissoziiert. Verfahren zur Berechnung des Tm von Nucleinsäuren sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt (siehe z.B. Berger und Kimmel (1987) Methods in Enzymology, Bd. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc. und Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.
Ausgabe, Bände 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (nachstehend als "Sambrook" bezeichnet), wobei beide Dokumente aufgrund der Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden können). Wie in Standardreferenzen angegeben, kann eine einfache Bestimmung des Tm-Wertes anhand der Gleichung: Tm = 81,5 + 0,41 (% G + C) berechnet werden, wenn eine Nucleinsäure sich in wässriger Lösung bei 1 M NaCl befindet (siehe z.B. Anderson und Young, Quantitative Filter Hybridization in: Nucleic Acid Hybridization (1985)). Andere Referenzen enthalten verfeinerte Berechnungen, wobei sowohl strukturellen Merkmalen als auch Sequenzmerkmalen bei der Berechnung des Tm Rechnung getragen wird.
Die Schmelztemperatur eines Hybrids (und somit die Bedingungen für eine stringente Hybridisierung) werden durch verschiedene Faktoren beeinflusst, beispielsweise die Länge und Art (DNA, RNA, Basenzusammensetzung) der Sonde und der Art des Ziels (DNA, RNA, Basenzusammensetzung, in Lösung vorhanden oder immobilisiert etc.) und der Konzentration von Salzen und anderen Bestandteilen (z.B. das Vorhandensein oder Fehlen von Formamid, Dextransulfat, Polyethylenglykol). Die Auswirkungen dieser Faktoren sind allgemein bekannt und werden in Standardreferenzen bezüglich dieses Fachgebiets diskutiert; siehe z.B. Sambrook, a.a.O., und Ausubel et al., a.a.O.
Typischerweise entsprechen stringente Hybridisierungsbedingungen Salzkonzentrationen unter etwa 1,0 M Natriumionen, typischerweise etwa 0,01 bis 1,0 M Natriumionen bei einem pH-Wert von 7,0 bis 8,3 und Temperaturen von mindestens etwa 30 DEG C für kurze Sonden (z.B. 10 bis 50 Nucleotide) und mindestens etwa 60 DEG C für lange Sonden (z.B. über 50 Nucleotide). Wie bereits angemerkt, können stringente Bedingungen auch durch die Zugabe von destabilisierenden Mitteln wie beispielsweise Formamid erreicht werden, wobei in diesem Fall niedrigere Temperaturen angewandt werden können.
Der hier verwendete Ausdruck "wesentliche Sequenzidentität" im Zusammenhang mit Nucleinsäuren bezieht sich auf das Ausmass von Sequenzähnlichkeit zwischen zwei Polynucleotiden. Wesentliche Sequenzidentität kann durch Hybridisierung unter stringenten Bedingungen, durch direkten Vergleich oder andere Massnahmen bestimmt werden. Beispielsweise können zwei Polynucleotide als wesentliche Sequenzidentität aufweisend identifiziert werden, wenn sie miteinander unter stringenten Hybridisierungsbedingungen spezifisch hybridisieren können. Andere Grade an Sequenzidentität (z.B. weniger als "wesentlich" können durch Hybridisierung unter unterschiedlichen Stringenz-Bedingungen charakterisiert werden. Alternativ kann wesentliche Sequenzidentität als ein Prozentsatz an Identität zwischen zwei Nucleotidsequenzen (oder Polypeptidsequenzen) beschrieben werden.
Zwei Sequenzen werden dann als wesentlich identisch erachtet, wenn sie zu mindestens etwa 60% identisch sind, bevorzugt mindestens etwa 70%, mindestens etwa 80%, mindestens etwa 90% oder mindestens etwa 95 oder 98 bis 100%. Die prozentuale Sequenzidentität (Nucleotid oder Aminosäure) wird typischerweise durch Bestimmung der optimalen Ausrichtung zwischen zwei Sequenzen oder durch Vergleichen der zwei Sequenzen berechnet. Beispielsweise kann ein für eine "sense"-Suppression verwendetes exogenes Transkript als ein bestimmter Prozentsatz an Identität oder Ähnlichkeit im Vergleich zu einer Referenzsequenz (z.B. der korrespondierenden endogenen Sequenz) aufweisen, beschrieben werden. Die optimale Ausrichtung von Sequenzen kann unter Verwendung des Algorithmus von Smith und Waterman, Adv. Appl.
Math. 2 (1981), 482, der sich auf die lokale Homologie bezieht ("local homology algorithm") durchgeführt werden, durch den Algorithmus, der sich auf die Homologie-Ausrichtung bezieht, ("homology alignment algorithm") von Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48 (1970), 443, durch das "search for similarity"-Verfahren von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 2444, durch Ausführung dieser Algorithmen mittels Computer (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA in dem Software-Paket von Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch Betrachtung. Die beste Ausrichtung (die den höchsten Prozentsatz an Identität ergibt), die durch die verschiedenen Verfahren erzeugt wurde, wird ausgewählt.
Typischerweise vergleichen diese Algorithmen zwei Sequenzen über ein "Vergleichsfenster" (normalerweise mit einer Länge von mindestens 18 Nucleotiden) um so lokale Bereiche an Sequenzähnlichkeit identifizieren und vergleichen zu können, wobei kleine Additionen oder Deletionen (d.h. Lücken) erlaubt sind. Additionen und Deletionen betragen typischerweise 20% oder weniger der Länge der Sequenz relativ zu der Referenzsequenz, die keine Additionen oder Deletionen enthält. Es ist gelegentlich wünschenswert, Sequenzidentität zwischen zwei Sequenzen im Bezug auf eine bestimmte Länge oder einen bestimmten Bereich zu beschreiben (z.B. können zwei Sequenzen als mindestens 95% Identität über eine Länge von mindestens 500 Basenpaaren aufweisend beschrieben werden). Normalerweise beträgt die Länge mindestens etwa 50, 100, 200, 300, 400 oder 500 Basenpaare, Aminosäuren oder andere Reste.
Der Prozentsatz an Sequenzidentität wird durch Vergleich zweier optimal ausgerichteter Sequenzen über den Vergleichsbereich berechnet, die Bestimmung der Anzahl an Positionen, an denen die identischen Nucleinsäurebase (z.B. A, T, C, G oder U) in beiden Sequenzen vorkommt, um so die Anzahl an gepaarten Positionen zu ermitteln, und durch Bestimmung der Anzahl (oder des Prozentsatzes) an gepaarten Positionen im Vergleich zu der Gesamtanzahl von Basen in der Referenzsequenz oder der Vergleichsregion. Ein zusätzlicher Algorithmus, der für die Bestimmung von Sequenzähnlichkeit geeignet ist, ist der BLAST-Algorithmus, der beschrieben ist in Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410 und Shpaer, Genomics 38 (1996), 179-191. Software zur Durchführung von BLAST-Analysen ist öffentlich erhältlich bei National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Dieser Algorithmus beinhaltet zuerst die Identifizierung von Sequenzpaaren mit denen viele Treffer erreicht werden ("high scoring sequence pairs, HSPs)") durch die Identifizierung kurzer Wörter mit der Länge W in der Abfragesequenz, die mit einem positiv bewerteten Punkt T übereinstimmen oder diesen erfüllen, wenn sie gegen ein Wort derselben Länge in einer Datenbanksequenz ausgerichtet werden. T bezieht sich auf die "neighborhood word score threshold" (Altschul et al., a.a.O.). Diese anfänglichen Treffer des Nachbarschaftsworts wirken als Ausgangspunkte für die Initiierung von Suchvorgängen, die zur Auffindung von längeren, diese enthaltenden HSPs führen sollen. Die Worttreffer werden in beiden Richtungen entlang jeder Sequenz verlängert, soweit der Treffer bezüglich der kumulativen Ausrichtung erhöht werden kann.
Die Verlängerung der Worttreffer in jeder Richtung kommt zum Stillstand, wenn: der Treffer bezüglich der kumulativen Ausrichtung verringert sich um die Menge X von dem maximal erreichbaren Wert; der kumulative Treffer geht gegen 0 oder darunter aufgrund der Akkumulation von einer oder mehreren Ausrichtungen von negative Treffer erzielenden Resten; oder das Ende jeder Sequenz ist erreicht. Die Parameter W, T und X des BLAST-Algorithmus bestimmen die Empfindlichkeit und die Schnelligkeit der Ausrichtung. Das BLAST-Programm verwendet als Voreinstellung eine Wortlänge (W) von 11, die "BLOSUM62 scoring matrix" (siehe Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 10915-10919), Ausrichtungen (B) von 50, Erwartung (E) von 10, M = 5, N = -4, und eines Vergleichs beider Stränge.
Der Ausdruck BLAST bezieht sich auf den BLAST-Algorithmus, der eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durchführt; siehe beispielsweise Karlin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 5873-5787. Eine durch den BLAST-Algorithmus gelieferte Ähnlichkeitsmessung ist die kleinste Wahrscheinlichkeit der Summe ("smallest sum probability") (P(N)), die die Wahrscheinlichkeit anzeigt, mit der eine Paarung zwischen zwei Nucleotiden oder Aminosäuresequenzen zufällig vorkommen würde. Beispielsweise kann eine Nucleinsäure als zu einer TRT-Nucleinsäure ähnlich erachtet werden, wenn die kleinste Wahrscheinlichkeit der Summe ("smallest sum probability") beim Vergleich der Test-Nucleinsäure mit einer TRT-Nucleinsäure weniger als etwa 0,5, 0,2, 0,1, 0,01 oder 0,001 ist.
Alternativ ist ein anderes Anzeichen dafür, dass zwei Nucleinsäuresequenzen ähnlich sind, dass das Polynucleotid, das die erste Nucleinsäure codiert, mit dem von der zweiten Nucleinsäure codierten Polypeptid immunologisch kreuzreagiert.
Die hier verwendeten Ausdrücke "wesentliche Identität" oder "wesentliche Ähnlichkeit" im Zusammenhang mit einem Polypeptid bezieht sich auf den Grad an Ähnlichkeit zwischen zwei Polypeptiden, bei denen ein Polypeptid eine Sequenz mit mindestens 70%, 80%, 85% oder bis zu 100% Sequenzidentität umfasst, bezogen auf eine Referenzsequenz oder am meisten bevorzugt 90% Identität über ein Vergleichsfenster von etwa 10 bis 20 Aminosäureresten. Aminosäuresequenzähnlichkeit oder Sequenzidentität wird durch Optimierung der Paarung der Reste bestimmt, falls nötig durch die Einführung von Lücken, soweit dies erforderlich ist. Siehe Needleham et al., J. Mol. Biol 48 (1970), 443-453; Sankoff et al.
(1983) Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequenze Comparison, Kapitel Eins, Addison-Wesley, Reading, MA; und Software-Pakete von IntelliGenetics, Mountain View, CA und der University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass die Bezeichnungen "wesentliche Identität", "wesentliche Ähnlichkeit" und "wesentliche Sequenzidentität" bezüglich Polypeptiden oder Polynucleotiden gegenseitig austauschbar verwendet werden können.
Der hier verwendete Ausdruck "wesentlich rein" oder "wesentlich gereinigt" bedeutet dann, wenn er sich auf eine Zusammensetzung bezieht, die ein angegebenes Reagens enthält, beispielsweise einen Antikörper (z.B. einen anti-hTRT-Antikörper), dass das angegebene Reagens mindestens etwa 75%, mindestens etwa 90%, mindestens etwa 95%, mindestens etwa 99% oder mehr der Zusammensetzung (ohne beispielsweise Puffer) darstellt. Somit ist beispielsweise eine bevorzugte erfindungsgemässe Immunglobulin-Präparation, die spezifisch ein hTRT-Polypeptid bindet, im wesentlichen gereinigt.
Wie hier verwendet, ist eine "Telomerase-negative" Zelle eine Zelle, in der Telomerase nicht exprimiert wird, d.h. es kann keine katalytische Aktivität von Telomerase unter Verwendung eines üblichen Assays oder eines TRAP-Assays für katalytische Aktivität von Telomerase nachgewiesen werden. Wie hier verwendet, ist eine "Telomerase-positive" Zelle eine Zelle, in der Telomerase exprimiert wird (d.h. Telomerase-Aktivität kann nachgewiesen werden).
Wie hier verwendet, ist eine "mit Telomerase in Zusammenhang stehende" Krankheit oder ein Zustand eine Krankheit oder ein Zustand in einem Versuchsobjekt, die (der) mit einem anormal hohen Spiegel an Telomerase-Aktivität in Zellen des Versuchsobjekts korreliert, wobei dies jede Telomerase Aktivität für die meisten normalen somatischen Zellen umfassen kann, oder die (der) mit einem niedrigen Spiegel an Telomerase-Aktivität korreliert, der zu einer Beeinträchtigung einer normalen Zellfunktion führt. Zu den Beispielen für mit Telomerase in Zusammenhang stehende Zustände gehören beispielsweise Krebs (hohe Telomerase-Aktivität in malignen Zellen) und Unfruchtbarkeit (geringe Telomerase-Aktivität in Keimbahnzellen).
Der hier verwendete Ausdruck "Testverbindung" bezieht sich auf jede synthetische oder natürliche Verbindung oder Zusammensetzung. Zu diesem Ausdruck zählen alle organischen und anorganischen Verbindungen einschliesslich beispielsweise kleine Moleküle, Peptide, Proteine, Zucker, Nucleinsäuren, Fettsäuren etc.
XII. Beispiele
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung und sollen keine Einschränkung darstellen.
In den folgenden Abschnitten werden die folgenden Abkürzungen verwendet: eq (Äquivalente); M (Molar); mu M (Mikromolar); N (Normal), Mol (Mole), mMol (Millimole) mu Mol (Mikromole); nMol (Nanomole); g (Gramm), mg (Milligramm); mu g (Mikrogramm), ng (Nanogramm); l oder L (Liter), ml (Milliliter), mu l (Mikroliter); cm (Zentimeter); mm (Millimeter); mu m (Mikrometer), nm (Nanometer); DEG C (Grad Celsius); RPN (Ribonucleoprotein); remN(2 min -O-Methylribonucleotide); dNTP (Desoxyribonucleotid); dH2O (destilliertes Wasser); DDT (Dithiothreitol); PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid); TE (10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH-Wert etwa 7,2); KGlu (Kaliumglutamat); SSC (Salz- und Natriumcitratpuffer); SDS (Natriumdodecylsulfat); PAGE (Polyacrylamidgelelektrophorese); Novex (Novex, San Diego, CA);
BioRad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), Pharmacia (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), Boehringer-Mannheim (Boehringer-Mannheim Corp., Concord, CA); Amersham (Amersham, Inc., Chicago, IL); Stratagene (Strategene Cloning Systems, La Jolla, CA); NEB (New England Biolabs, Beverly, MA); Pierce (Pierce Chemical Co., Rockford IL); Beckman (Beckman Instruments, Fullerton, CA), Lab Industries (Lab Industries, Inc., Berkeley, CA), Eppendorf (Eppendorf Scientific, Madison, WI); und Molecular Dynamics (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Beispiel 1
Isolierung von Telomerase-Proteinen und -Clonen
Das folgende Beispiel beschreibt ausführlich die Isolierung von Telomerase-Proteinen und -Clonen von verschiedenen Organismen, einschliesslich der hTRT- und S. pombe-Telomerasec-DNA-Clone
A. Hintergrund
i) Einführung
Der Abschnitt gibt einen Überblick über die Reinigung und Clonierung, die in nachfolgenden Abschnitten dieses Beispiels ausführlicher beschrieben werden. Telomerase-RNA-Untereinheiten wurden zwar in Ciliaten, Hefe und Säugern identifiziert, vor der vorliegenden Erfindung wurden jedoch Protein-Untereinheiten des Enzyms als solche nicht identifiziert. Die Reinigung von Telomerase von dem Protozoan Euplotes aediculatus ergab zwei Proteine, die mit p123 und p43 bezeichnet werden (siehe nachstehend; Lingner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 10712). Euplotes aediculatus ist ein hypotricher Ciliat mit einem Macronucleus, der etwa 8 x 10<7> Telomere und etwa 3 x 10<5> Telomerasemoleküle enthält.
Nach der Reinigung zeigte der aktive Telomerase-Komplex ein Molekulargewicht von etwa 230 kD, was einer RNA-Untereinheit von 66 kD und zwei Proteinen von etwa 123 kD und 43 kD entspricht (siehe vorstehend Lingner (1996)). Experimente mit Photo-Quervernetzung zeigten an, dass das grössere p123-Protein an der spezifischen Bindung des Telomer-DNA-Substrats beteiligt war (Lingner (1996), a.a.O.).
Die p123- und p43-Proteine wurden sequenziert und die diese Proteine codierenden cDNA-Clone isoliert. Es stellte sich heraus, dass diese Euplotes-Sequenzen mit den Telomerase-assoziierten Proteinen von Tetrahymena p80 und p95 nicht ver wandt sind. Die Sequenzanalyse des Euplotes-p123 ergab die Anwesenheit von Motiven von reverser Transkriptase (RT). Weiterhin wurde durch die Sequenzanalyse des Euplotes p123 ein homologes Hefeprotein gefunden, das als Est2-Protein bezeichnet wird (Lingner, Science 276 (1997), 561). Es konnte kürzlich gezeigt werden, dass das Hefe-Est2 für die Aufrechterhaltung von Telomeren in vivo essentiell ist (Lendvay, Genetics 144 (1996), 1399), es wurde jedoch nicht als ein katalytisches Telomerase-Protein identifiziert.
Ortsgerichtete Mutagenese zeigte, dass die RT-Motive von Hefe-Est2 für die Synthese von Telomer-DNA in vivo und in vitro essentiell sind (Lingner (1997) a.a.O.).
ii) Identifizierung und Charakterisierung von S. pombe-Telomerase
Die PCR-Amplifikation von S. pombe-DNA wurde mit degenerierten Sequenzprimern, die nach den Euplotes-p123-RT-Motiven, wie nachstehend beschrieben, entworfen wurden, durchgeführt. Eines der erzeugten vier Haupt-PCR-Produkte war eine Bande von 120 Basenpaaren, die eine zu p123 und Est2 homologe Peptidsequenz codierte. Dieses PCR-Produkt wurde als Sonde bei Koloniehybridisierung verwendet und damit konnten zwei überlappende Clone aus einer genomischen Bank von S. pombe und drei von einer cDNA-Bank von S. pombe identifiziert werden. Die Sequenzanalyse ergab, dass keiner der drei S. pombe-cDNAClone eine vollständige Länge auswies, deshalb wurde zum Erhalt von Sequenzen, die den N-Terminus des Proteins codieren, reverse Transkriptase (RT)-PCR verwendet.
Die vollständige Sequenzierung dieser Clone zeigte ein vermutliches S. pombe-Telomerase-RT-Gen, trt1. Die vollständige Nucleotidsequenz von trt1 wurde bei GenBank mit der Zugangsnummer AF015783 hinterlegt. Die Analyse der Sequenz ergab, dass trt1 ein basisches Protein mit einem geschätzten Molekulargewicht von 116 kD codiert. Es zeigte sich, dass die Homologie zu p123 und Est2 in den sieben reverse Transkriptase- Motiven aussergewöhnlich hoch war. Diese Motive sind unterstrichen und als Motive 1, 2, A, B, C, D und E bezeichnet (siehe Fig. 1). Es wurde ein zusätzliches Telomerase-spezifisches Motiv gefunden, das als das T-Motiv bezeichnet wurde. 15 Introns im Grössenbereich von 36 bis 71 Basenpaaren unterbrachen die codierende Sequenz.
Um S. pombe-trt1 als eine katalytische Untereinheit zu testen, wurden zwei Deletionskonstrukte erzeugt. Bei einem wurden nur die Motive B bis D in den RT-Domänen entfernt. Bei dem zweiten wurden 99% des offenen Leserahmens entfernt.
Haploide Zellen, die aus S. pombe-Sporen von beiden Mutanten gewachsen waren, zeigten fortschreitende Telomer-Kürzung bis zu dem Punkt, an dem eine Hybridisierung an Telomer-Wiederholungseinheiten praktisch nicht mehr nachweisbar war. Ein trt1<+>/trt1<->-Diploid wurde sporulieren gelassen und die erhaltenen Tetraden wurden gegliedert und auf einem Hefeextrakt-Medium, das mit Aminosäure supplementiert war, auskeimen gelassen (eine YES-Platte, Alfa, (1993) Experiments with Fission Yeast, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Die von jeder Spore erhaltenen Kolonien wurden 3 Tage bei 32 DEG C gezüchtet und alle drei Tage auf frischen YES-Platten ausgestrichen. Eine Kolonie aus jeder Runde wurde bei 32 DEG C in 6 ml einer YES-Flüssigkultur gegeben und bis zur stationären Phase gezüchtet. Es wurde genomische DNA präpariert.
Nach der Spaltung mit ApaI wurde die DNA auf einem 2,3%igem Agarosegel elektrophoretisiert, zur Bestätigung, dass in jeder Spur etwa gleiche Mengen gegeben wurden, mit Ethidiumbromid angefärbt, danach auf eine Nylon-Membran transferiert und mit einer Telomer-DNA-Sonde hybridisiert.
Seneszenz wurde angezeigt durch den verzögerten Beginn der Unfähigkeit auf Agar wachsen zu können (typischerweise beim vierten Ausstreichen nach der Keimung), durch Kolonien mit Rändern, die in zunehmendem Masse ausgefranst waren (die Ko loniemorphologie ist in Fig. 22B gezeigt) und durch eine hohe Anzahl von Fraktionen verlängerter Zellen, die immer mehr zunahmen (wie in Fig. 22C gezeigt). Zellen wurden auf Minimalmedium (Alfa, (1993), a.a.O.), wobei Glutaminsäure gegen Ammoniumchlorid ausgetauscht war, 2 Tage bei 32 DEG C vor dem Photographieren ausplattiert.
Bei der Trennung einzelner vergrösserter Zellen unter dem Dissektions-Mikroskop zeigte sich, dass die Mehrheit der Zellen keiner weiteren Teilung unterlag. Die gleiche Telomerase-negative (trt1<->) Zellpopulation enthielt immer Zellen mit normaler Grösse, die fortfuhren sich zu teilen, jedoch häufig sich nicht teilende Nachkommen hervorbrachten. Die Telomerase-negativen überlebenden Zellen könnten einen Rekombinationsmodus der Telomer-Bewahrung verwenden, wie dies für knospende Hefestämme dokumentiert wurde, mit denen verschiedene Gene für die Telomer-Replikation deletiert sind (Lendvay (1996) a.a.O. und Lundblad Cell 73 (1993), 347.
iii) Die Identifizierung und Charakterisierung von menschlicher Telomerase
Ein von menschlicher Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-cDNA stammendes EST (exprimerte Sequenz-"tag") wurde durch eine BLAST-Suche der dbEST (exprimierte Sequenz-"tag") Gen-Bank-Datenbank identifiziert und als Genbank AA28196 bezeichnet, wobei die Euplotes-123 kD Peptid und die entsprechenden Nucleinsäuresequenzen sowie das Schizosaccharomyces-Protein und korrespondierende cDNA (tez1)-Sequenzen verwendet wurden. Das AA281296 EST weist eine Länge von 389 Nucleotiden auf und die Positionen seiner Reste in dem hTRTcDNA-Clon (Fig. 16) liegen zwischen den Resten 1679 bis 2076. Ein die EST-Sequenz enthaltender Clon, der die Bezeichnung Clon #712562 (Fig. 18) trägt, wurde von dem I.M.A.G.E.-Consortium (Human Genome Center, DOE, Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA) erhalten.
Dieser Clon wurde aus einer cDNA-Bank von aufkeimenden B-Zellen erhalten, die aus einer Fliesssortierung ("flow sorting") von Mandelzellen stammten. Die vollständige Sequenzierung dieses hTRT-cDNA-Clons ergab die Anwesenheit aller acht Telomerase-RT(TRT)-Motive, wie dies in Fig. 1 gezeigt ist. Dieser hTRT-Clon codierte keinen aneinandergrenzenden Bereich von TRT, da die RT-Motive B min , C, D und E im Vergleich zu den mehr N-terminal gelegenen RT-Motiven in einem anderen offenen Leserahmen enthalten waren. Zusätzlich war die Entfernung zwischen den RT-Motiven A und B wesentlich geringer als die der drei bereits bekannten (nicht-menschlichen) TRTs.
Um einen cDNA-Clon mit vollständiger Länge isolieren zu können, wurde eine cDNA-Bank, die von der menschlichen Zellinie 293 (die vorstehend beschrieben wurde) stammt, die hohe Spiegel an Telomerase-Aktivität exprimiert, gescreent. Eine lambda-cDNA-Bank von der Zellinie 293 wurde in 25 Pools aufgeteilt, die jeweils etwa 200 000 Plaques enthielten. Jeder Pool wurde mittels PCR mit den Primerparen 5 min -CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3 min und 5 min -GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3 min gescreent. Sechs Sub-Pools eines positiven primären Pools wurden mittels PCR unter Verwendung desselben Primerpaars weiter gescreent. Sowohl bei dem Screenen des primären Pools und des sekundären Sub-Pools wurde hTRT mit insgesamt 31 Cyclen amplifiziert, 45 Sekunden bei 94 DEG C, 45 Sekunden bei 60 DEG C und 90 Sekunden bei 72 DEG C.
Als Kontrolle wurde RNA des "house-keeping"-Enzyms GAPDH mittels der Primerpaare 5 min -CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3 min und 5 min -ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3 min mit insgesamt 16 Cyclen amplifiziert, jeweils 45 Sekunden bei 94 DEG C, 45 Sekunden bei 55 DEG C und 90 Sekunden bei 72 DEG C.
Ein hTRT-positiver Sub-Pool aus dem sekundären Screenen wurde dann mittels Plaque-Hybridisierung mit einer Sonde von dem 5 min -Bereich von Clon #712562 gescreent. Ein Phage konnte als positiv identifiziert werden (mit der Bezeichnung Lambda-Phage 25-1.1, ATCC 209024, hinterlegt am 12. Mai 1997). Er enthielt eine Insertion von etwa 4 Kilobasen, diese wurde ausgeschnitten und in die EcoRI-Stelle des "Bluescript II SK+"-Vektors (Stratagene, San Diego, CA) als ein EcoRI-Fragment subcloniert. Dieses den cDNA-Clon enthaltende Plasmid erhielt die Bezeichnung pGRN121. Die cDNA-Insertion weist insgesamt eine Länge von etwa 4 Kilobasenpaaren auf. Die vollständige Nucleotidsequenz der menschlichen hTRT-cDNA (pGRN121) wurde bei Genbank hinterlegt (Zugangsnummer AF015950) und bei der ATCC mit der Zugangsnummer ATCC 209016 am 6. Mai 1997.
B. Züchtung von Euplotes aediculatus
Die in diesem Beispiel verwendeten Kulturen von E. aediculatus wurden von Dr. David Prescott, MCDB, University of Colorado, erhalten. Dr. Prescott isolierte diese Kultur ursprünglich aus Wasser eines Teichs, dieser Organismus ist aber auch von der ATCC erhältlich (ATCC #30859). Kulturen wurden wie von Swanton et al., (Swanton et al., Chromosoma 77 (1980), 203) in 15-Liter-Glasbehältern gezüchtet, die Chlorogonium als eine Nahrungsquelle enthielten. Die Organismen wurden nach Erreichen einer Dichte von etwa 10<4>Zellen/ml von den Kulturen geerntet.
C. Präparation von nucleären Extrakten
In diesem Beispiel wurden nucleäre Extrakte von E. aediculatus mittels des Verfahrens von Lingner et al., (Lingner et al., Genes Develop. 8 (1994) 1984) mit den nachstehend beschriebenen geringen Modifikationen präpariert. Zusammengefasst wurden Zellen, die wie in Teil B beschrieben gezüchtet wurden, mit 15 mu m Nytex-Filtern konzentriert und auf Eis gekühlt. Das Zellpellet wurde zu einem Endvolumen von 110 ml TMS/PMSF/Spermidinphosphat-Puffer resuspendiert. Der TMS/PMSF/Spermidinphosphat-Vorratspuffer wurde durch Zugabe von 0,075 g Spermidinphosphat (USB) und 0,75 ml PMSF (aus einer in Ethanol hergestellten 100 mM Vorratslösung) zu 150 ml TMS hergestellt. TMS enthielt 10 mM Tris-Acetat, 10 mM MgCl2, 85,5752 g Saccharose/Liter und 0,33297 g CaCl2/Liter, pH-Wert 7,5.
Nach Resuspendierung in TMS/PMSF/Spermidinphosphat-Puffer wurden 8,8 ml 10% NP-40 und 94,1 g Saccharose zugegeben. Das Gemisch wurde in einen silikonisierten Glasbecher mit einem Rührstab aus rostfreiem Stahl, der an einem darüber befindlichen Motor angebracht war, gegeben. Das Gemisch wurde gerührt, bis die Zellen vollständig lysiert waren (etwa 20 Minuten). Das Gemisch wurde dann 10 Minuten bei 7500 UpM (8950 x g) bei 4 DEG C mittels eines Beckman JS-13-Ausschwingrotors zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet aus Nuclei in TMS/PMSF/Spermidinphosphat-Puffer resuspendiert, danach erneut 5 Minuten bei 7500 UpM (8950 x g) bei 4 DEG C mittels eines Beckman JI-D-13-Ausschwingrotors zentrifugiert.
Der Überstand wurde entfernt und das Pellet aus Nuclei in einem Puffer resuspendiert, der 50 mM Tris-Acetat, 10 mM MgCl2, 10% Glycerin, 0,1% NP-40, 0,4 M KGlu, 0,5 mM PMSF, pH-Wert 7,5 enthielt, wobei ein Puffervolumen von 0,5 ml pro 10 g geernteter Zellen verwendet wurde. Die resuspendierten Nuclei wurden danach in einem "dounced"-Glashomogenisator mit etwa 50 Auf- und Abbewegungen homogenisiert und danach 25 Minuten mit 14 000 UpM bei 4 DEG C in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Der den nucleären Extrakt enthaltene Überstand wurde gesammelt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zu seiner Verwendung bei -80 DEG C aufbewahrt.
D. Reinigung von Telomerase
In diesem Beispiel wurden wie in Teil C beschrieben, präparierte nucleäre Extrakte zur Reinigung von E. aediculatus-Telomerase verwendet. Bei diesem Reinigungsprotokoll wurde Telomerase zuerst durch Chromatographie auf einer Affi-Gel-Heparinsäule angereichert und danach ausgiebig durch Affinitätsreinigung mit einem "antisense"-Oligonucleotid gereinigt. Da der Matrizenbereich von Telomerase-RNA in dem Telomerase RNP-Partikel einer Hybridisierung zugänglich ist, wurde ein "antisense"-Oligonucleotid (d.h. das "Affinitätsoligonucleotid") als ein "Affinitätsköder" für die Telomerase synthetisiert, wobei dieses Oligonucleotid zu diesem Matrizenbereich komplementär war. Ein Biotinrest wurde an das 5 min -Ende des Oligonucleotids angefügt, damit dieses an einer Avidinsäule immoblisiert werden konnte.
Nach der Bindung der Telomerase an das Oligonucleotid und gründlichem Waschen wurde die Telomerase mittels eines Verdrängungsoligonucleotids eluiert. Das Affinitätsoligonucleotid enthielt DNA-Basen, die zu der 5 min zu der Telomerase-spezifischen Sequenz gelegenen Telomerase-RNA nicht komplementär war. Da das Verdrängungs-Oligonucleotid zu dem Affinitäts-Oligonucleotid über seine gesamte Länge komplementar war, konnte es eine thermodynamisch stabilere Duplex bilden als die Telomerase, die an das Affinitäts-Oligonucleotid gebunden war. Somit führte die Zugabe des Verdrängungs-Oligonucleotids zu der Elution der Telomerase von der Säule.
In diesem Beispiel wurden aus 45 Liter-Kulturen präparierte nucleäre Extrakt gefroren, bis eine Gesamtmenge von 34 ml an nucleärem Extrakt gewonnen werden konnte. Dies entsprach 630 Liter Kultur (etwa 4 x 10<9> Zellen). Der nucleäre Extrakt wurde mit einem Puffer auf 410 ml verdünnt, wobei Endkonzentrationen von 20 mM Tris-Acetat, 1 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 33 mM KGlu, 10% (Vol./Vol.) Glycerin, 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) bei einem pH-Wert von 7,5 erhalten wurden.
Der verdünnte nucleäre Extrakt wurde auf eine Affi-Gel-Heparin-Gelsäule (Bio-Rad) mit einem Endvolumen von 230 ml und einem Durchmesser von 5 cm gegeben, mit dem gleichen Puffer äquilibriert und mit einem 2 Liter-Gradienten von 33 bis 450 mM KGlu eluiert. Die Säule wurde mit einer Fliessgeschwindigkeit von einem Säulenvolumen/Stunde bei 4 DEG C betrieben. Fraktionen von jeweils 50 ml wurden gesammelt und nach einer Telomerase-Aktivität wie in Teil D beschrieben, untersucht.
Telomerase eluierte von der Säule bei etwa 170 mM KGlu. Telomerase enthaltende Fraktionen (etwa 440 ml) wurden vereinigt und eingestellt auf 20 mM Tris-Acetat, 10 mM M9Cl2, 1 mM EDTA, 300 mM KGlu, 10% Glycerin, 1 mM DTT und 1% Nonidet P-40. Dieser Puffer wurde mit "WB" bezeichnet.
Zu dieser Präparation wurden jeweils 1,5 mMol der zwei kompetitorischen DNA-Oligonucleotide (5 min -TAGACCTGTTAGTGTACATTTGAATTGAAGC-3 min ) und
(5 min -TAGACCTGTTAGGTTGGATTTGTGGCATCA-3 min ), 50 mu g Hefe-RNA (Sigma) und 0,3 nMol Biotin-markiertes Telomerase-spezifisches Oligonucleotid
(5 min -Biotin-TAGACCTGTTTA-(rmeG)2-(rmeU)4-(rmeG)4-rmeG-3 min )) pro ml des Pools gegeben. Die 2-O-Methylribonucleotide der Telomerase-spezifischen Oligonucleotide waren zu dem Matrizenbereich der Telomerase-RNA komplementär; die Desoxyribonucleotide waren nicht komplementär.
Der Einschluss von kompetitorischen, nicht-spezifischen DNA-Oligonucleotiden erhöhte die Wirksamkeit der Reinigung, da die Auswirkungen von Nucleinsäure-bindenden Proteinen und anderen Bestandteilen in dem Gemisch, die entweder an das Affinitätsnucleotid binden oder die Telomerase aus dem Gemisch entfernen würden, minimiert wurden.
Dieses Material wurde dann zu einem "Ultralink"-immobilisierten "Neutravidin plus" (Pierce)-Säulenmaterial bei einem Volumen von 60 mu l Suspension pro ml Pool gegeben. Das Säulenmaterial wurde zweimal jeweils 15 Minuten vorblockiert, wobei eine Präparation von WB verwendet wurde, die 0,01% Nonidet P-40, 0,5 mg BSA, 0,5 mg/ml Lysozym, 0,05 mg/ml Glycogen und 0,1 mg/ml Hefe-RNA enthielt. Die Blockierung wurde mittels einer sich drehenden Scheibe durchgeführt, um so das Säulenmaterial gründlich zu blockieren. Nach dem ersten und vor dem zweiten Blockierungsschritt wurde das Säulenmaterial 2 Minuten bei 200 x g zur Pelletierung der Matrix zentrifugiert.
Das Gemisch aus Pool und Säule wurde auf einer rotierenden Scheibe (etwa 10 UpM; Labindustries) 8 Minuten bei 30 DEG C und im Anschluss daran nochmals 2 Stunden bei 4 DEG C inkubiert, um so die Bindung zu erlauben. Das Gemisch aus Pool und Säule wurde dann 2 Minuten bei 200 x g zentrifugiert und der ungebundenes Material enthaltende Überstand wurde entfernt. Das Gemisch aus Pool und Säule wurde danach gewaschen. Dieser Waschprozess umfasste folgende Schritte: Spülen des Gemischs aus Pool und Säule bei 4 DEG C mit WB, 15 Minuten Waschen des Gemisches bei 4 DEG C mit WB, Spülen mit WB, 5 Minuten Waschen bei 30 DEG C mit 0,6 M KGlu und kein Nonidet P-40 enthaltendem WB, 5 Minuten Waschen bei 25 DEG C mit WB und zuletzt wiederum Spülen mit WB. Das nach dem letzre Belichtung der Spuren 25-30 von Fig. 31.
Die geringere Belichtung von Fig. 33 wurde deshalb durchgeführt, um die Sichtbarmachung der Nucleotide zu erlauben, die zugegeben wurden, und der Verzögerungspositionen in verlängertem Produkten. Der Prozentsatz an verlängerten Substrat wurde für jede dritte Linie eines Satzes auf einem "PhosphorImager", wie dies in der Fig. 31 unten gezeigt ist, quantifiziert.
Die Wirksamkeit dieser Haarnadelstrukturen als Substrat wurde mit doppelsträngigen Telomer-ähnlichen Strukturen mit Überhängen unterschiedlicher Länge verglichen. Ein Modellsubstrat, das mit vier G-Resten endete (siehe die Spuren 1 bis 15 von Fig. 31), wurde dann nicht verlängert, wenn es ein glattes Ende enthielt (siehe Spuren 1-3). Es wurde jedoch eine leichte Verlängerung mit einer Überhanglänge von zwei Basen beobachtet. Die Verlängerung wurde jedoch effizient, wenn der Überhang etwa 4 Basen lang war. Die Telomerase wirkte auf ähnliche Weise mit einem doppelsträngigen Substrat, das mit vier T-Resten endete, wobei ein Überhang von 6 Basen für eine hocheffiziente Verlängerung erforderlich war. Die schwachen Banden unter den Primern in den Spuren 10-15 von Fig. 31, die unabhängig von Telomerase sind, stellen kürzere Oligonucleotide in den Primerpräparationen dar.
Durch die schwächere Belichtung der Spuren 25-30 in Fig. 33 zeigt sich eine Leiter von verlängerten Produkten, wobei die dunkelsten Banden mit der vermutlichen 5 min -Grenze der Matrize korrelieren (wie von Lingner et al., Genes Develop. 8 (1994), 1984 beschrieben). Das häufige Auftreten von Produkten, die anderen Positionen in der Matrize entsprechen, legte nahe, dass ein "Innehalten" und/oder eine "Dissoziierung" mit der gereinigten Polymerase an Stellen vorkommt, die nicht der Translokationsstelle entsprechen.
Wie in Fig. 31 gezeigt, waren doppelsträngige, mit glatten Enden versehene Oligonucleotide keine Substrate für Telomerase. Um herauszufinden, ob diese Moleküle an Telomerase binden können, wurde ein Kompetitionsexperiment durchge führt. In diesem Experiment wurden 2 nM 5 min -endmarkiertes Substrat mit der Sequenz (G4T4)2 bzw. ein Haarnadelsubstrat mit einem Überhang von sechs Basen mit 0,125 mM Telomerase verlängert (Fig. 31, Spuren 25-27). Obwohl die gleichen unmarkierten Oligonucleotidsubstrate effizient mit dem markierten Substrat bezüglich der Verlängerung konkurrierten, wurde keine Herabsetzung an Aktivität beobachtet, wenn die doppelsträngigen, mit glatten Enden versehenen Haarnadel-Oligonucleotide als Kompetitoren verwendet wurden, selbst in Gegenwart eines 100fachen Überschusses von Haarnadelstrukturen.
Diese Ergebnisse zeigten an, dass doppelsträngige, mit glatten Enden versehene Oligonucleotide bei dem in diesem Beispiel getesteten Konzentrationen Telomerase nicht binden können, d.h. ein einzelsträngiges 3 min -Ende ist für eine Bindung erforderlich. Wahrscheinlich wird dieses 3 min -Ende für eine Basenpaarung mit der Telomerase-RNA-Matrize benötigt.
J. Clonierung & Sequenzierung des 123 kD-Polypeptids
In diesem Beispiel wird die Clonierung des 123 kD-Polypeptids von Telomerase, (d.h. die 123 kD-Protein-Untereinheit) beschrieben. In dieser Untersuchung wurde ein internes Fragment des Telomerasegens mittels PCR amplifiziert. Es wurden Oligonucleotid-Primer verwendet, die so konstruiert waren, dass sie mit den von dem im vorstehenden Teil D erhaltenen gereinigten Polypeptid erhaltenen Peptidsequenzen übereinstimmten. Die Polypeptidsequenz wurde mittels des "nanoES-Tandem"-Massenspektroskopieverfahrens bestimmt, das auf dem Fachgebiet bekannt und von Calvio et al., RNA 1 (1995), 724-733 beschrieben ist. Die in diesem Beispiel verwendeten Oligonucleotidprimer hatten die folgenden Sequenzen, wobei degenerierte Positionen in Klammern gezeigt sind:
EMI280.1
Eine 50 mu l-Reaktion enthielt 0,2 mM dNTPs, 0,15 mu g E. aediculatus chromosomale DNA, 0,5 mu l Taq (Boehringer Mannheim), jeweils 0,8 mu g Primer und 1 x Reaktionspuffer (Boehringer Mannheim). Die Reaktion wurde in einem "Thermocycler" (Perkin-Elmer) inkubiert, wobei 5 Minuten bei 95 DEG C inkubiert wurde, danach folgten 30 Cyclen von jeweils 1 Minute bei 94 DEG C, 1 Minute bei 52 DEG C und 2 Minuten bei 72 DEG C. Die Reaktion wurde durch 10minütige Inkubation bei 72 DEG C vervollständigt.
Eine genomische DNA-Bank wurde aus der chromosomalen DNA von E. aediculatus durch Clonierung von DNA mit glatten Enden in die SmaI genannte Stelle des "pCR-Script"-Plasmidvektors (Stratagene) präpariert. Diese Bank wurde durch Koloniehybridisierung mit dem radioaktiv markierten gel-gereinigten PCR-Produkt gescreent. Die Plasmid-DNA von positiven Clonen wurde präpariert und gemäss dem Didesoxy-Verfahren sequenziert (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74 (1977), 5463) oder manuell mittels eines automatischen Sequenziergeräts (ABI). Die DNA-Sequenz des Gens, das dieses Polypeptid codiert, ist in Fig. 13 gezeigt. Das von der DNA-Sequenz abgeleitete Startcodon liegt in dieser Sequenz bei dem Nucleotid an der Position 101 und der offene Leserahmen endet an Position 3193.
Der genetische Code von Euplotes unterscheidet sich von anderen Organismen dadurch, dass das "UGA"-Codon einen Cystein-Rest codiert. Die von der DNA-Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz des Polypeptids ist in Fig. 14 gezeigt. Dabei wurde angenommen, dass keine ungewöhnlichen Aminosäuren während der Translation eingebaut werden und keine posttranslationalen Modifizierungen vorkommen.
K. Clonierung und Sequenzierung des 43 kD-Polypeptids
In diesem Beispiel wird die Clonierung des 43 kD-Polypeptids von Telomerase (d.h. der 43 kD-Protein-Untereinheit) beschrieben. Bei dieser Untersuchung wurde ein internes Fragment des Telomerase-Gens mittels PCR amplifiziert, wobei Oligonucleotidprimer verwendet wurden, die so entworfen wurden, dass sie zu den Peptidsequenzen passen, die von dem im vorstehenden Teil D erhaltenen gereinigten Polypeptid erhalten wurden. Die Polypeptidsequenz wurde mittels der auf dem Fachgebiet bekannten und von Calvio et al., RNA 1 (1995), 724-733 beschriebenen "nanoES-Tandem"-Massenspektroskopieverfahren bestimmt. Die in diesem Beispiel verwendeten oligonucleotidprimer hatten die folgenden Sequenzen:
5 min -NNNGTNAC(C/T/A)GG(C/T/A)AT(C/T/A)AA(C/T)AA-3 min und
5 min -(T/G/A)GC(T/G/A)GT(C/T)TC(T/C)TG(G/A)TC(G/A)TT(G/A)TA-3 min .
In dieser Sequenz bedeutet "N" die Anwesenheit eines von vier Nucleotiden (d.h. A, T, G oder C).
Eine 50 mu l-Reaktion enthielt 0,2 mM dNTPs, 0,2 mu g E. aediculatus chromosomale DNA, 0,5 mu l Taq (Boehringer Mannheim), jeweils 0,8 mu g Primer und 1 x Reaktionspuffer (Boehringer Mannheim). Die Reaktion wurde in einem "Thermocycler" (Perkin-Elmer) inkubiert, wobei 5 Minuten bei 95 DEG C inkubiert wurde, danach folgten 30 Cyclen von jeweils 1 Minute bei 94 DEG C, 1 Minute bei 52 DEG C und 1 Minute bei 72 DEG C. Die Reaktion wurde durch 10minütige Inkubation bei 72 DEG C vervollständigt.
Eine genomische DNA-Bank wurde aus der chromosomalen DNA von E. aediculatus durch Clonierung von DNA mit glatten Enden in die SmaI genannte Stelle des "pCR-Script"-Plasmidvektors (Stratagene) präpariert. Diese Bank wurde durch Koloniehybridisierung mit den radioaktiv markierten gel-gereinigten PCR-Produkten gescreent. Die Plasmid-DNA von positiven Clonen wurde präpariert und gemäss dem Didesoxy-Verfahren sequenziert (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74 (1977), 5463) oder manuell mittels eines automatischen Sequenziergeräts (ABI). Die DNA-Sequenz des Gens, das dieses Polypeptid codiert, ist in Fig. 34 gezeigt. Drei mögliche Leserahmen sind für diese Sequenz gezeigt, wie dies in Fig. 35 dargestellt ist. Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist die Aminosäuresequenz unter der Nucleotidsequenz für alle drei Leserahmen angegeben.
Diese Leserahmen tragen die Bezeichnungen "a", "b" und "c". Ein mögliches Startcodon wird an der Nucleotidposition 84 im Lesenrahmen "c" codiert. Der codierende Bereich könnte an Position 1501 in Leserahmen "b" enden. Codons für einen vorzeitigen Stop, die in dieser Figur mit Sternchen bezeichnet sind, kommen in allen drei Leserahmen zwischen den Nucleotidpositionen 337-350 vor.
Die "La-Domäne" ist durch fette Buchstaben gekennzeichnet. Weiter stromabwärts scheint die Proteinsequenz durch unterschiedliche Leserahmen codiert zu sein, da keiner dieser Leserahmen durch Stopcodons unterbrochen ist. Darüber hinaus sind Peptidsequenzen von dem gereinigten Protein in allen drei Leserahmen codiert. Somit scheint dieses Gen Intronsequenzen zu enthalten, oder, alternativ, die RNA wird editiert. Zu weiteren Möglichkeiten zählen ribosomale Leserahmenverschiebung oder Sequenzierungsfehler. Die Homologie zu der Sequenz des La-Proteins bleibt jedoch von grossem Interesse. Es soll nochmals angemerkt werden, dass in Euplotes das "UGA"-Codon einen Cystein-Rest codiert.
L. Vergleiche von Aminosäuren und Nucleinsäuren
In diesem Beispiel werden Vergleiche zwischen veröffentlichten Sequenzen und den Sequenzen der 123 kD- und 43 kD-Telomerase-Polypeptid-Untereinheiten durchgeführt.
i) Vergleiche mit der 123 kD-Telomerase-Untereinheit von E. aediculatus
Die Aminosäuresequenz des 123 kD-Polypeptids von Euplotes aediculatus wurde mit der Sequenz der 80 kD-Telomerase-Protein-Untereinheit von Tetrahymena thermophila (GenBank-Zugangsnummer #U25641) zur Untersuchung ihrer Ähnlichkeit verglichen. Die dieses Protein codierende Nucleotidsequenz, die von GenBank erhalten wurde ist in Fig. 42 gezeigt. Die Aminosäuresequenz dieses Proteins, so wie es von GenBank erhalten wurde, ist in Fig. 43 gezeigt. Der Sequenzvergleich zwischen dem 123 kD-Protein von E. aediculatus und dem 80 kD-Protein von T. thermophila ist in Fig. 36 gezeigt. In dieser Figur stellt die Sequenz von E. aediculatus die obere Sequenz dar und die Sequenz von T. thermophila die untere Sequenz.
In dieser sowie in den Fig. 37-39 sind Identitäten durch vertikale Balken angezeigt, während einzelne Punkte zwischen den Sequenzen Aminosäuren mit etwas Ähnlichkeit anzeigen und Doppelpunkte zwischen den Sequenzen Aminosäuren mit grösserer Ähnlichkeit anzeigen. Die nachgewiesene Identität lag bei etwa 19%, während der Prozentsatz an Ähnlichkeit etwa 45% betrug. Diese Werte ähneln denen, die mit einer beliebigen Zufallsproteinsequenz beobachtet werden.
Die Aminosäuresequenz des 123 kD-Polypeptids von Euplotes aediculatus wurde auch mit der Sequenz der 95 kD-TelomeraseProtein-Untereinheit von Tetrahymena thermophila (GenBank-Zugangsnummer #U25642) zur Untersuchung der Ähnlichkeiten verglichen. Die von GenBank erhaltene, dieses Protein codierende Nucleotidsequenz ist in Fig. 44 gezeigt. Die Aminosäuresequenz des von Gen-Bank erhaltenen Proteins erhaltenen Proteins ist in Fig. 45 gezeigt, und der Sequenzvergleich in Fig. 37. In dieser Figur ist die Sequenz von E. aediculatus die obere Sequenz und die Sequenz von T. thermophila die untere Sequenz. Identitäten sind durch vertikale Balken angezeigt. Die beobachtete Identität betrug etwa 20%, während der Prozentsatz an Ähnlichkeit etwa 43% betrug. Diese Werte ähneln den Werten, die man mit einer beliebigen Zufallsproteinsequenz beobachtet.
Es ist auffallend, dass die Aminosäuresequenz des 123 kD-Proteins von E. aediculatus die fünf Motive enthält, die charakteristisch für reverse Transkriptasen sind. Das 123 kDPolypeptid wurde auch mit den Polymerase-Domänen von verschiedenen reversen Transkriptasen verglichen. Fig. 40 zeigt die Ausrichtung des 123 kD-Polypeptids mit dem vermutlichen Hefe-Homologen (L8543.12 oder ESTp) . Die Aminosäuresequenz von L8543.12 (oder ESTp), die von GenBank erhalten wurde, ist in Fig. 46 gezeigt.
Vier Motive (A, B, C und D) waren Bestandteil dieses Vergleichs. In Fig. 40 sind hochkonservierte Reste durch weisse Buchstaben auf schwarzem Hintergrund gekennzeichnet. Reste der Sequenzen von E. aediculatus, die in der anderen Sequenz konserviert sind, sind durch Fettdruck gekennzeichnet. Das "h" bezeichnet das Vorhandensein einer hydrophoben Aminosäure. Die Ziffern zwischen den Aminosäureresten der Motive bezeichnen die Menge von Lücken innerhalb der Sequenzen. Beispielsweise betrifft die "100" zwischen den Motiven A und B eine Lücke von 100 Aminosäuren in der Sequenz zwischen den Motiven.
Durch das Absuchen der Genbank konnte ein Hefeprotein (GenBank Zugangsnummer #u20618) und das Gen "L8543.12" (Est2) identifiziert werden, das etwas Homologie zu der 123 kD-Telomerase-Untereinheit von E. aediculatus zeigt. Anhand der Beobachtung, dass beide Proteine reverse TranskriptaseMotive in ihren C-terminalen Bereichen enthalten; dass beiden Proteinen gemeinsam ist, dass sie Ähnlichkeit in Bereichen ausserhalb des reverse Transkriptase-Motivs zeigen; dass die Proteine ähnlich basisch sind (pI = 10,1 für E. aediculatus und pI = 10,0 für Hefe) ; und beide Proteine gross sind (123 kD für E. aediculatus und 103 kD für Hefe) kann gefolgert werden, dass diese Sequenzen den katalytischen Kern ihrer entsprechenden Telomerasen umfassen.
Aufgrund dieser Beobachtung bezüglich der Homologie zwischen zwei phylogenetisch entfernten Organismen wie E. aediculatus und Hefe wird davon ausgegangen, dass menschliche Telomerase ein Protein enthält, das dieselben Merkmale aufweist (d.h. reverse Transkriptase-Motive aufweist, basisch ist und gross (> 100 kD)).
ii) Vergleiche mit der 43 kD-Telomerase-Untereinheit von E. aediculatus
Die Aminosäuresequenz der "La-Domäne" des 43-kD-Polypeptids von Euplotes aediculatus wurde mit der Sequenz der 95 kD-Telomerase-Protein-Untereinheit von Tetrahymena thermophila (vorstehend beschrieben) zur Untersuchung deren Ähnlichkeit verglichen. Der Sequenzvergleich ist in Fig. 38 gezeigt. In dieser Figur ist die E. aediculatus-Sequenz die obere Sequenz und die Sequenz von T. thermophila ist die untere Sequenz. Identitäten sind mit vertikalen Balken gekennzeichnet. Die beobachtete Identität betrug etwa 23%, während der Prozentsatz an Ähnlichkeit etwa 46% betrug. Diese Werte ähneln denen, die man mit beliebigen Zufallsproteinsequenzen beobachten würde.
Die Aminosäuresequenz der "La-Domäne" des 43 kD-Polypeptids von Euplotes aediculatus wurde mit der Sequenz der 80 kD-Telomerase-Protein-Untereinheit von Tretrahymena thermophila (vorstehend beschrieben) zur Untersuchung deren Ähnlichkeit verglichen. Der Sequenzvergleich ist in Fig. 39 gezeigt. In dieser Figur ist die Sequenz von E. aediculatus die obere Sequenz und die Sequenz von T. thermophila die untere Sequenz. Identitäten sind mit vertikalen Balken gekennzeichnet. Die beobachtete Identität betrug etwa 26%, während der Prozentsatz an Ähnlichkeit etwa 49% betrug. Diese Werte ähneln denen, die man mit beliebigen Zufallsroteinsequenzen beobachten würde.
Die Aminosäuresequenz einer Domäne des 43 kD-Polypeptids von E. aediculatus wurde auch mit La-Proteinen von zahlreichen anderen Organismen verglichen. Diese Vergleiche sind in Fig. 41 gezeigt. In dieser Figur sind hochkonservierte Reste durch weisse Buchstaben auf schwarzem Hintergrund gekennzeichnet. Reste der Sequenzen von E. aediculatus, die in der anderen Sequenz konserviert sind, sind durch Fettdruck gekennzeichnet.
M. Identifizierung von Telomerase-Protein-Untereinheiten in einem anderen Organismus
In diesem Beispiel wurden die in den vorstehenden Beispielen identifizierten Sequenzen zur Identifizierung der Telomerase-Protein-Untereinheiten von Oxytricha trifallax verwendet. Dies ist ein Ciliat, der mit E. aediculatus nur sehr entfernt verwandt ist. In diesem Beispiel wurden basierend auf dem konservierten Bereich des 123 kD-Polypeptids von E. aediculatus Primer ausgewählt, die die Motive der reversen Transkriptase-Domäne umfassten. Geeignete Primer wurden synthetisiert und in einer PCR-Reaktion mit Gesamt-DNA von Oxytricha verwendet. Oxytricha-DNA wurde gemäss auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren präpariert. Die PCR-Produkte wurden danach unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren cloniert und sequenziert.
Die für die Primer verwendeten Oligonucleotidsequenzen waren:
EMI287.1
Positionen, die degeneriert waren, sind in Klammern gezeigt, wobei die alternativen Basen in den Klammern gezeigt sind. "N" entspricht einem beliebigen Nucleotid aus den vier Nucleotiden.
Die PCR-Reaktion (50 mu l) enthielt 0,2 mM dNTPs, 0,3 mu g chromosomale DNA von Oxytricha trifallax, 1 mu l Taq-Polymerase (Boehringer Mannheim), jeweils 2 mu M Primer, 1 x Reaktionspuffer (Boehringer Mannheim). Das Reaktionsgemisch wurde in einem "Thermocycler" (Perkin-Elmer) unter den folgenden Bedingungen inkubiert: 1 x 5 Minuten bei 95 DEG C, 30 Cyclen jeweils 1 Minute bei 94 DEG C, 1 Minute bei 53 DEG C und 1 Minute bei 72 DEG C, danach 1 x 10 Minuten bei 72 DEG C. Das PCR-Produkt wurde gelgereinigt und mittels des Didesoxy-Verfahrens (siehe z.B. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (1977), 5463-5467) oder anderer auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren sequenziert.
Von dem PCR-Produkt wurde die Aminosäuresequenz abgeleitet und mit der Sequenz von E. aediculatus verglichen. Fig. 47 zeigt die Ausrichtung dieser Sequenzen, wobei die Sequenz von 0. trifallax in der oberen Reihe gezeigt ist und die E. aediculatus-Sequenz in der unteren Reihe gezeigt ist. Wie aus dieser Figur ersichtlich ist, besteht ein grosser Grad an Homologie zwischen der in diesem Beispiel identifizierten 0. trifallax Polypeptidsequenz und der Polypeptidsequenz von E. aediculatus. Somit ist es klar, dass die in der vorliegenden Erfindung identifizierten Sequenzen für die Identifizierung von homologen Telomerase-Protein-Untereinheiten in anderen eukaryotischen Organismen von Nutzen sind. Tatsächlich konnten aufgrund der erfindungsgemässen Entwicklung homologe Telomerase-Sequenzen in zahlreichen unterschiedlichen Spezies identifiziert werden.
N.
Identifizierung von Telomerase-Sequenzen von Tetrahymena
In diesem Beispiel wurde ein Tetrahymena-Clon erzeugt, der Homologie mit den Euplotes-Sequenzen und EST2p aufweist.
Bei diesem Experiment wurde eine PCR mit degenerierten Oligonucleotidprimern verwendet, die gegen konservierte Motive gerichtet waren, um so Homologiebereiche zwischen Tetra hymena-, Euplotes- und EST2p-Sequenzen identifizieren zu können. Das in diesem Beispiel verwendete PCR-Verfahren stellt ein neues Verfahren dar, das zur spezifischen Amplifikation von seltenen DNA-Sequenzen aus komplexen Gemischen entworfen wurde. Bei diesem Verfahren wird das Problem der Amplifikation von DNA-Produkten mit dem gleichen PCR-Primer an beiden Enden (d.h. Produkte, eines einzelnen Primers), dem man in PCR-Clonierungsverfahren üblicherweise begegnet, vermieden. Durch diese Produkte eines einzelnen Primers wird ein unerwünschter Hintergrund erzeugt und dies kann oft die Amplifikation und den Nachweis des gewünschten Produkts von zwei Primern erschweren.
Bei diesem in diesen Experimenten verwendeten Verfahren wird bevorzugt auf Produkte von zwei Primern selektiert. Das Besondere ist, dass ein Primer biotinyliert ist und der andere nicht. Nach mehreren PCR-Amplifikationsrunden werden die Produkte unter Verwendung von magnetischen Streptavidin-Kügelchen gereinigt und Produkte von zwei Primern werden mittels Hitzedenaturierung spezifisch eluiert. Dieses Verfahren findet auch im Rahmen anderer Experimente, die in diesen Beispielen nicht beschrieben wurden, seine Verwendung. Tatsächlich ist dieses Verfahren bei Anwendungen in Gebrauch, bei denen es wünschenswert ist, seltene DNA-Sequenzen zu amplifizieren, wozu die einleitenden Schritte bei Clonierungsverfahren, beispielsweise 5 min und 3, gehören, RACE und jedes Verfahren, das in der PCR degenerierte Primer verwendet.
Ein erster PCR-Lauf wurde unter Verwendung von macronucleärer DNA von Tetrahymena als Matrize durchgeführt, die gemäss auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren isoliert wurde. Es wurde ein 24-mer-Vorwärts-Primer verwendet mit der Sequenz
5 min -Biotin-GCCTATTT(TC)TT(TC)TA(TC)(GATC)(GATC)(GATC)AC(GATC)GA-3 min , die als "K231" bezeichnet wird, und dem FFYXTE-Bereich entspricht und der 23-mer-Rückwärts-Primer mit der Sequenz
5 min -CCAGATAT(GATC)A(TGA)(GATC)A(AG)(AG)AA(AG)TC(AG)TC-3 min , der als "K220" bezeichnet wird und dem DDFL(FIL)I-Bereich ent spricht. Diese PCR-Reaktion enthielt 2,5 mu l DNA (50 ng), jeweils 4 mu l Primer (20 mu M), 3 mu l 10 x PCR-Puffer, 3 mu l 10 x dNTPs, 2 mu l Mg, 0,3 mu l Taq und 11,2 mu l dH2O. Mit dem Gemisch wurden 8 Cyclen durchgeführt, jeweils 45 Sekunden bei 94 DEG C 45 Sekunden bei 37 DEG C und 1 Minute bei 72 DEG C.
Das Gemisch der PCR-Reaktion wurde an 200 mu l magnetische Streptavidin-Kügelchen gebunden, mit 200 mu l TE gewaschen, in 20 mu l dH2O resuspendiert und danach durch 2minütiges Kochen bei 100 DEG C hitzedenaturiert. Die Kügelchen wurden heruntergezogen und das Eluat wurde entfernt. Danach wurden 2,5 mu l dieses Eluats erneut unter den vorstehenden Bedingungen amplifiziert, mit der Ausnahme, dass 0,3 mu l alpha -<3><2>P dATP enthalten war und 33 PCR-Cyclen durchgeführt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde auf einem denaturierendem 5%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und der geeignete Bereich aus dem Gel ausgeschnitten. Diese Produkte wurden mit weiteren 34 Cyclen unter den vorstehend aufgezählten Bedingungen erneut amplifiziert, ausser, dass die Anlagerungstemperatur 42 DEG C betrug.
Ein zweiter PCR-Lauf wurde unter Verwendung von makronucleärer DNA von Tetrahymena, die unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren isoliert wurde, als Matrize durchgeführt, wobei der 23-mer-Vorwärts-Primer mit der Sequenz 5 min
EMI290.1
mit der Bezeichnung "228" verwendet wurde, der nach dem Bereich R(LI) (LI)PKK entspricht und eines reversen Primers mit der Sequenz 5 min =
EMI290.2
mit der Bezeichnung "K224", der dem CYDSIPR-Bereich entspricht. Diese PCR-Reaktion enthielt 2,5 mu l DNA (50 ng), jeweils 4 mu l Primer (20 mu M) , 3 mu l 10 x PCR-Puffer, 3 mu l 10 x dNTPs, 2 mu l Mg, 0,3 mu l alpha -<3><2>P-dATP, 0,3 mu l Taq und 10,9 mu l dH2O. Das Reaktionsgemisch wurde auf einem denaturierendem 5%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und der geeignete Bereich aus dem Gel ausgeschnitten. Diese Produkte wurden mit 34 zusätzlichen Cyclen erneut unter den vorstehend angegebenen Bedingungen amplifiziert, ausser dass die Anlagerungstemperatur 42 DEG C betrug.
10 mu l des Reaktionsprodukts aus Lauf 1 wurden an magnetische Streptavidin-beschichtete Kügelchen in 200 mu l TE gebunden. Die Kügelchen wurden mit 200 mu l TE gewaschen und danach in 20 mu l dH2O resuspendiert, hitzedenaturiert und das Eluat wurde entfernt. Das Reaktionsprodukt aus Lauf 2 wurde danach zu den Kügelchen gegeben und mit 30 mu l 0,5 x SSC verdünnt. Das Gemisch wurde auf 94 DEG C erhitzt und auf 50 DEG C abkühlen gelassen. Das Eluat wurde entfernt und die Kügelchen wurden dreimal in 0,5 x SSC bei 55 DEG C gewaschen. Die Kügelchen wurden danach in 20 mu l dH2O resuspendiert, hitzedenaturiert, und das Eluat mit der Bezeichnung "Runde 1-Eluat" entfernt und aufbewahrt.
Zur Isolierung der Tetrahymena-Bande wurde das Runde 1-Eluat mit dem Vorwärts-Primer K228 und den reversen Primer K227 mit der Sequenz 5 min =
EMI291.1
was dem DIKSCYD-Bereich entspricht, erneut amplifiziert. Die PCR-Reaktionen wurden wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 5%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt, die etwa 295 Nucleotide entsprechende Bande aus dem Gel ausgeschnitten und sequenziert.
Der Clon mit der Bezeichnung 168-3 wurde sequenziert. Es wurde folgende DNA-Sequenz (einschliesslich der Primersequenzen) gefunden:
EMI292.1
Eine zusätzliche Sequenz dieses Gens wurde mittels PCR erhalten, wobei ein neuer Primer verwendet wurde, der so konstruiert war, dass er mit der Sequenz von 168-3 ("K2-97" mit der Sequenz 5 min -GAGTGACATAATATACGTGA-3 min ; paart und der Primer K231 (FFYXTE). Die Sequenz des aus dieser Reaktion erhaltenen Fragments, zusammen mit 1683 ist wie folgt (ohne die Primersequenzen):
EMI292.2
Die diesem DNA-Fragment entsprechende Aminosäuresequenz ist:
EMI292.3
Diese Aminosäuresequenz wurde gegen andere Telomerase-Gene (EST2p und Euplotes) ausgerichtet. Die Ausrichtung ist in Fig. 53 gezeigt. Eine "Consensus"-Sequenz ist in dieser Figur ebenfalls gezeigt.
P. Identifizierung von Telomerase-Sequenzen von Schizosaccharomyces pombe
In diesem Beispiel wurde die tez1-Sequenz von S. pombe als ein Homologes von p123 von E. aediculatus und Est2p von S. cerevisiae identifiziert.
Fig. 55 zeigt eine Zusammenfassung dieser Experimente. In dieser Figur zeigt der obere Bereich (Teil A) die Beziehung zwischen den beiden überlappenden genomischen Clonen und den Bereich von 5825 bp, der sequenziert wurde. Die mit "tez1" bezeichnete Region entspricht dem Protein codierenden Bereich, wobei auch die flankierenden Sequenzen gezeigt sind. Die Box unterhalb des Bereichs von 5825 bp ist ein HindIII-Fragment von etwa 2 kb, das zur Herstellung des tez1-Disruptionskonstrukts, wie nachstehend beschrieben, verwendet wurde.
Die untere Hälfte von Fig. 55 (Teil B) ist ein "aufgeschlüsseltes" Schema des gleichen DNA-Bereichs. Die als "Original-PCR" bezeichnete Sequenz ist das ursprüngliche degenerierte PCR-Fragment, das mit dem degenerierten Oligonucleotid-Primerpaar erzeugt wurde, das auf der Basis der Sequenz von Motiv 4 (B min ) und Motiv 5 (C) von Euplotes, wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben, entworfen worden war.
i) PCR mit degenerierten Primern
Eine PCR unter Verwendung der genetischen Primer wurde verwendet, um in S. pombe das zu p123 von E. aediculatus homo loge Protein zu finden. Fig. 56 zeigt die Sequenzen der in dieser Reaktion verwendeten degenerierten Primer (bezeichnet als "poly 4" und "poly 1"). Die PCR-Läufe wurden unter den gleichen Pufferbedingungen wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben durchgeführt (siehe beispielsweise den vorstehendenTeil K) mit einer 5minütigen "ramp"-Zeit von 94 DEG C,wonach sich Cyclen für jeweils 30 Sekunden bei 94 DEG C, 45 Sekunden bei 50 DEG C und Sekunden bei 72 DEG C anschlossen, dann 7 Minuten bei 72 DEG C, und anschliessend wurde das Reaktionsgemisch bei 4 DEG C aufbewahrt. Die PCR-Läufe wurden unterunterschiedlichen Bedingungen durchgeführt (d.h. verschiedene Konzentrationen an DNA von S. pombe und verschiedene MgCl2-Konzentrationen).
Die PCR-Produkte wurden auf Agarosegelen aufgetrennt und mit Ethidiumbromid wie vorstehend beschrieben angefärbt. Verschiedene PCR-Läufe ergaben die Produktion von 3 Banden (mit "T", "M1" und "B") bezeichnet). Diese Banden wurden unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben erneut amplifiziert und auf Gelen aufgetrennt. Nach dieser erneuten Amplifikation wurden vier Banden beobachtet ("T", "M1", "M2" und "B"), wie in Fig. 57 gezeigt. Diese vier Banden wurden dann unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben erneut amplifiziert. Die dritte Bande von dem oberen Bereich der Spur in Fig. 57 wurde als eine Bande identifiziert, die die richtige Sequenz für ein Telomerase-Protein enthielt. Es zeigte sich, dass das mit M2 bezeichnete PCR-Produkt zu anderen Telomerase-Proteinen relativ gut passt, wie dies in Fig. 58 gezeigt ist.
Zusätzlich zu der gezeigten Ausrichtung zeigt diese Figur auch die tatsächliche Sequenz von tez1. In dieser Figur bezeichnen Sternchen Reste, die alle vier Sequenzen gemeinsam haben (Oxytricha "OT"; E. aediculatus "Ea_p123", S. cerevisiae "Sc_p103" und M2), und die Kreise (d.h. Punkte) kennzeichnen ähnliche Aminosäurereste.
ii) 3 min -RT-PCR
Um eine zusätzliche Sequenzinformation zu erhalten, wurden 3 min - und 5 min -RT-PCR an dem in Fig. 58 angegebenen Telomerase-Kandidaten durchgeführt. Fig. 59 zeigt ein Schema der verwendeten 3 min -RT-PCR-Strategie. Zuerst wurde mittels des Oligonucleotidprimers "QT" (5 min -CCA GTG AGC AGA GTG ACG AGG ACT CGA GCT CAA GCT TTT TTT TTT TTT TT-3 min ; aus mRNA cDNA präpariert, danach diese cDNA als eine Matrize für OCR mit "QO" (5 min -CCA GTG AGC AGA GTG ACG-3 min ; verwendet und ein Primer auf der Basis der ursprünglichen degenerierten PCRReaktion entworfene, (d.h. "M2-T" mit der Sequenz 5 min -G TGT CAT TTC TAT ATG GAA GAT TTG ATT GAT G-3 min ).
Die zweite PCR-Reaktion (d.h. "nested" PCR) wurde mit "QI" (5 min -GAG GAC TCG AGC TCA AGC-3 min ); und einem weiteren PCR-Primer, der mit einer Sequenz entworfen wurde, die von der ursprünglichen degenerierten PCR-Reaktion stammte oder "M2-T2" mit der Sequenz 5 min -AC CTA TCG TTT ACG AAA AAG AAA GGA TCA GTG-3 min ; durchgeführt. Die in dieser PCR verwendeten Puffer entsprachen den vorstehend beschriebenen, wobei die durchgeführte Amplifikation mit einem 5minütigem "ramp up" bei 94 DEG C begann, wonach sich 30 Cyclen von jeweils 30 Sekunden bei 94 DEG C, 30 Sekunden bei 55 DEG C und 3 Minuten bei 72 DEG C anschlossen, danach wurde 7 Minuten bei 72 DEG C inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden bis zu ihrer Verwendung bei 4 DEG C aufbewahrt.
iii) Screenen von genomischen und cDNA-Banken
Nach Erhalt dieser zusätzlichen Sequenzinformation wurden verschiedene genomische und cDNA-Banken gescreent, um somit alle Banken identifizieren zu können, die diesen Kandidaten für das Telomerase-Gen enthielten. Die verwendete Vorgehensweise sowie die Genbanken und Ergebnisse sind in Fig. 60 gezeigt. In dieser Figur werden in Teil A die in diesem Experiment getesteten Genbanken aufgezählt; Teil B zeigt die verwendeten Bereiche; die Teile C und D zeigen die mit die sen Banken erhaltenen Ergebnisse der Dot-Blot-Hybridisierung. Positive Banken wurden dann zum Erhalt des genomischen tez1-Gens und einer cDNA-Version des tez1-Gens durch Koloniehybridisierung gescreent. In diesem Experiment wurden etwa 3 x 10<4> Kolonien von der genomischen HindIII-Bank gescreent und es konnten sechs positive Clone identifiziert werden (etwa 0,01%).
Danach wurde DNA von zwei unabhängigen Clonen (A5 und B2) präpariert. Fig. 61 zeigt die mit den HindIII-gespaltenen positiven genomischen Clone A5 und B2 erhaltenen Ergebnisse.
Zusätzlich wurden cDNA-REP-Banken verwendet. Es wurden etwa 3 x 10<5> Kolonien gescreent und es konnten 5 positive Clone (0,002%) identifiziert werden. Von drei unabhängigen Clonen (2-3, 4-1 und 5-20) wurde DNA präpariert. In späteren Experimenten wurde herausgefunden, dass 2-3 und 5-20 identische Insertionen enthielten.
iv) 5 min -RT-PCR
Da die cDNA-Version des Genprodukts bis zu diesem Punkt nicht vollständig war, wurde zum Erhalt eines Clons vollständiger Länge eine 5 min -RT-PCR durchgeführt. Die Strategie ist schematisch in Fig. 62 gezeigt. Bei diesem Experiment wurde cDNA präpariert mittels des DNA-Oligonucleotid-Primers "M2-B" (5 min -CAC TGA TCC TTT CTT TTT CGT AAA CGA TAG GT-3 min ); und "M2-B2" (5 min -C ATC AAT CAA ATC TTC CAT ATA GAA ATG ACA3 min ); die anhand von bekannten und bereits früher identifizierten Bereichen von tez1 entworfen worden waren. Ein Oligonucleotid-Linker "PCR Adapt SfiI" mit einem phosphorylierten 5 min -Ende ("P") (p-GGG CCG TGT TGG CCT AGT TCT CTG CTC3 min ); wurde danach mit dem 3 min -Ende dieser cDNA ligiert und dieses Konstrukt wurde als die Matrize für eine "nested"-PCR verwendet. In der ersten PCR-Runde wurden PCR Adapt SFI und M2-B als Primer verwendet.
In der zweiten Runde wurde PCR Adapt SfiII (5-GAG GAG GAG AAG AGC AGA GAA CTA GGC CAA CAC GCC CC-3 min ); und M2-B2 (5 min -ATC AAT CAA ATC TTC CAT ATA GAA ATG ACA-3 min ); als Primer verwendet. "Nested"-PCR wurde zur Steigerung der Spezifität der Reaktion verwendet.
v) Sequenzausrichtungen
Nachdem die Sequenz von tez1 bestimmt war, wurde sie mit bereits früher beschriebenen Sequenzen verglichen. Fig. 63 zeigt die Ausrichtung von reverser Transkriptase (RT)-Domänen von katalytischen Telomerase-Untereinheiten von S. pombe ("S.p. Tez1p"), S. cerevisiae "S.c. Est2p"), und E. aediculatus p123 (E.a. p123"). In dieser Figur bezeichnet "h" hydrophobe Reste, "p" kleine polare Reste und "c" geladene Reste. Die über der Ausrichtung angegebenen Aminosäurereste zeigen das "Consensus"-RT-Motiv von Y. Xiong und T.H. Eickbush (Y. Xiong und T.H. Eickbush, EMBO J. 9 (1990) 3353-3362). Die Sternchen bezeichnen die Reste, die in allen drei Proteinen konserviert sind. "Motiv 0" wurde hier als ein Motiv identifiziert, das spezifisch für diese Telomerase-Untereinheit ist und im allgemeinen in reversen Transkriptasen nicht gefunden wird.
Es ist somit wertvoll, um andere Aminosäuresequenzen als gute Kandidaten für katalytische Telomerase-Untereinheiten identifizieren zu können.
Fig. 64 zeigt die Ausrichtung der gesamten Sequenzen von Euplotes ("Ea_P123"), S. cerevisiae ("Sc_Est2P") und S. pombe ("Sp_Tez1p"). In Teil A kennzeichnen schattierte Bereiche Reste, die beide Sequenzen gemeinsam haben. In Teil B bezeichnen schattierte Bereiche Reste, die alle drei Sequenzen gemeinsam haben.
vi) Genetische Disruption von tez1
In diesem Beispiel wurden die Auswirkungen einer Disruption von tez1 untersucht. Da Telomerase an der Telomer-Beibehaltung beteiligt ist, wurde davon ausgegangen, dass, falls tez1 tatsächlich ein Telomerase-Bestandteil ist, die Disruption von tez1 zu einer graduellen Telomer-Verkürzung führen sollte.
In diesen Experimenten wurde zur spezifischen Disruption des tez1-Gens in S. pombe homologe Rekombination verwendet. Diese Vorgehensweise ist schematisch in Fig. 65 gezeigt. Wie in Fig. 65 angegeben, wurde Wild-Typ-tez1 gegen ein Fragment, das den ura4- oder LEU2-Marker enthielt, ausgetauscht.
Die Disruption des tez1-Gens wurde durch PCR bestätigt (Fig. 66) und ein Southern-Blot wurde zur Überprüfung der Telomer-Länge durchgeführt. Fig. 67 zeigt die Southern-Blot-Ergebnisse dieses Experiments. Da eine ApaI-Restriktionsenzymstelle im unmittelbaren Anschluss zu einer Telomer-Sequenz in S. pombe vorhanden ist, erlaubt die Spaltung von genomischen DNA-Präparationen von S. pombe die Analyse der Telomer-Länge. Somit wurde DNA von S. pombe mit ApaI geschnitten, die Spaltprodukte wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt und diese dann mit einer für eine Telomer-Sequenz spezifischen Sonde hybridisiert, um so herauszufinden, ob die Telomere der disruptierten S. pombe-Zellen verkürzt waren. Die Ergebnisse sind in Fig. 67 gezeigt. Aus diesen Ergebnissen konnte geschlossen werden, dass eine Disruption des tez1-Gens eine Verkürzung der Telomere bewirkte.
Q.
Clonierung und Charakterisierung von menschlichem Telomerase-Protein und -cDNA
In diesem Beispiel wurde die Information bezüglich der Nucleinsäuresequenz und Aminosäuresequenz für menschliche Telomerase ermittelt. Partiell homologe Sequenzen wurden zuerst mittels einer BLAST-Suche identifiziert, die mittels der Euplotes 123 kD-Peptid- und Nucleinsäuresequenzen sowie der Sequenzen des Schizosaccharomyces-Proteins und der korrespondierenden cDNA (tez1)-Sequenz. Die menschlichen Sequenzen (auch mit "hTCP1.1" bezeichnet) wurden von einem partiellen cDNA-Clon ermittelt (Clon 712562). Sequenzen von diesem Clon wurden gegen die wie in vorherigen Beispielen beschrieben bestimmten Sequenzen ausgerichtet.
Fig. 1 zeigt die Sequenzausrichtung von Euplotes ("p123") Schizosaccharomyces ("tez1"), Est2p (d.h. das von der Est2-Nucleinsäuresequenz codierte Protein von S. cerevisiae, das hier auch mit "L8543.12" bezeichnet wird) und dem in dieser Vergleichssuche identifizierten menschlichen Homologen. Fig. 51 zeigt die Aminosäuresequenz von tez1 und Fig. 52 die DNA-Sequenz von tez1. In Fig. 52 sind die Introns und andere nicht codierende Bereiche mit kleinen Buchstaben dargestellt und die Exons (d.h. codierenden Bereiche) in Grossbuchstaben.
Wie in Fig. 75 gezeigt, gibt es Bereiche, die unter diesen Proteinen hochkonserviert sind. Beispielsweise zeigt sich in dieser Figur, dass es Identitätsbereiche "Motiv 0", "Motiv 1", "Motiv 2" und "Motiv 3" gibt. Die identischen Aminosäuren sind durch ein Sternchen (*) gekennzeichnet und die ähnlichen Aminosäurereste durch einen Kreis ( &cirf& ). Dies zeigt, dass es Bereiche innerhalb der Telomerase-Motive gibt, die innerhalb einer grossen Anzahl von Eukaryoten, die von der Hefe über Ciliate bis zum Menschen reichen, konserviert sind. Es wird davon ausgegangen, dass weitere Organismen ebenso solche konservierten Sequenzbereiche enthalten. Fig. 49 zeigt die partielle Aminosäuresequenz des Clons, der menschliche Telomerase-Motive codiert und Fig. 50 die korrespondierende DNA-Sequenz des Genbank-Clons #AA281296.
Um die Information über die Sequenz des Genbank-Clons #AA281296 zu vervollständigen wurden die Sanger-Didesoxy-Sequenzierung und andere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren angewandt. Einige der bei der Sequenzierung verwendeten Primer sind in Tabelle 7 gezeigt. Diese Primer wurden so entworfen, dass sie mit dem Clon (GenBank-Zugangsnummer #AA281296) hybridisieren; dies basierte auf Sequenzkomple mentarität entweder zu der Sequenz des Plasmidrückgrats oder der Sequenz der Insertion der menschlichen cDNA im Clon.
EMI300.1
Anhand dieser Experimente wurde herausgefunden, dass die EcoRI-NotI-Insertion des Genbank-Clons #AA281296 nur einen partiellen offenen Leserahmen für das menschliche Telomerase-Protein enthält, allerdings könnte er ein aktives Fragment dieses Proteins codieren. Der offene Leserahmen im Clon codiert ein Protein von etwa 63 kD. Die Sequenz des längsten ermittelten offenen Leserahmens ist in Fig. 68 gezeigt. Der offene Leserahmen (ORF) beginnt an dem ATG-Codon mit dem in der Figur gekennzeichneten "met". Der poly-A-Schwanz am 3 min -Ende der Sequenz ist ebenfalls gezeigt. Fig. 69 zeigt eine vorläufige Ausrichtung von reverser Transkriptase-Proteinen von Telomerase von der menschlichen Sequenz (menschliches Telomerase "Core Protein 1", "HS TCP1"), E. aediculatus p123 ("Ep p123"), S. pombe tez1 ("Sp Tez1"), S. cerevisiae EST2 ("Sc Est2") und der "Consensus"-Sequenz.
In dieser Figur sind verschiedene Motive angegeben.
Um einen vollständigen Clon zu erhalten, wurden die Hybridisierung einer cDNA-Bank und 5 min -RACE durchgeführt, um so Clone zu erhalten, die Bereiche von bisher nicht clonierten Bereichen codieren. In diesen Experimenten wurde zur Erzeugung von Material für eine Sequenzanalyse RACE angewandt (schnelle Amplifikation von cDNA-Enden, "Rapid Amplification of cDNA Ends"; siehe z.B. M. A. Frohman, "RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends", in Innis et al. (Herausg.) PCR-Protocols: A Guide to Methods and Applications (1990) S. 2838, und Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85 (1988) 8998-9002). Vier solcher Clone wurden erzeugt und zur Bereitstellung zusätzlicher 5 min -Sequenzinformation (pFWRP5, 6, 19 und 20) verwendet.
Zusätzlich wurden menschliche cDNA-Banken (in lambda inseriert) mit dem EcoRI-NotI-Fragment des Clons (#AA281296) hybridisiert. Ein lambda-Clon mit der Bezeichnung "lambda 25-1.1" (ATCC-Zugangsnummer #209024) wurde gefunden, der komplementäre Sequenzen enthielt. Fig. 75 zeigt eine Restriktionskarte dieses lambda-Clons. Die Insertion von humaner cDNA wurde von diesem Clon als ein EcoRI-Restriktionsfragment in die EcoRI-Stelle des im Handel erhältlichen "phagemids" pBluescriptIISK+ (Stratagene) subcloniert, wodurch das Plasmid "pGRN121" erzeugt wurde, das bei der ATCC hinterlegt wurde (ATCC-Zugangsnummer #209016). Vorläufige Ergebnisse zeigten, dass das Plasmid pGRN121 die vollständige Sequenz des offenen Leserahmens (ORF) enthält, der das menschliche Telomerase-Protein codiert.
Die cDNA-Insertion von Plasmid pGRN121 wurde unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren sequenziert. Fig. 70 zeigt eine Karte des Plasmids pGRN121 bezüglich Restriktionsstellen und Funktion, deren Bestimmung auf dieser vorläufigen Arbeit basiert. Die Ergebnisse dieser vorläufi gen Sequenzanalyse sind in Fig. 71 gezeigt. Aufgrund dieser Analyse, und wie in Fig. 70 gezeigt, wurde eine vermutliche Startstelle für den codierenden Bereich bei einer Position, die etwa 50 Nucleotide von der EcoRI-Stelle entfernt liegt, gefunden (bei Position 707 gelegen) und die Lage der Telomerase-spezifischen Motive "FFYVTE", "PKP", "AYD", "QG" und "DD". Zusätzlich wurde eine vermutliche Stopstelle bei Nucleotid #3571 gefunden (siehe Fig. 72). Fig. 72 zeigt die DNA-Sequenzen und entsprechenden Aminosäuresequenzen für die offenen Leserahmen in der Sequenz ("a", "b" und "c").
Aufgrund der vorläufigen Natur dieser frühen Sequenzierungsarbeiten stellte sich jedoch heraus, dass die Leserahmen für die verschiedenen Motive nicht richtig ausgerichtet sind.
Eine zusätzliche mit pGRN121 durchgeführte Analyse ergab, dass das Plasmid signifikante Bereiche des 5 min -Endes der codierenden Sequenzen enthielt, die auf dem Genbank-Clon mit der Zugangsnummer #AA281296 nicht vorhanden sind. Es stellte sich weiterhin heraus, dass pGRN121 eine Variante der codierenden Sequenz enthält, die eine Insertion von etwa 182 Nucleotiden enthält. Es zeigte sich, dass diese Insertion in dem Genbank-Clon mit der Zugangsnummer #AA281296 fehlt. Solche Varianten können wie die E. aediculatus-Sequenzen in funktionellen Assays getestet werden, beispielsweise Telomerase-Assays, um so das Vorhandensein einer funktionellen Telomerase in einer Probe nachweisen zu können.
Durch eine weitere Sequenzanalyse konnte die cDNA-Sequenz von pGRN121 bestimmt werden, wobei ein zusammenhängender offener Leserahmen gefunden wurde, der ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 127 000 Dalton und 1132 Aminosäuren, wie in Fig. 74 gezeigt, codiert. Eine auf dieser Analyse basierende verbesserte Karte von pGRN121 ist in Fig. 73 gezeigt. Die Ergebnisse der zusätzlichen Sequenzanalyse der hTRT-cDNA sind in Fig. 16 gezeigt.
Beispiel 2
Die Korrelation von hTRT-Häufigkeit und Zellunsterblichkeit
Die relative Häufigkeit von hTRT-mRNA wurde in sechs Stämmen von Telomerase-negativen sterblichen Zellen und sechs Zellinien von Telomerase-positiven unsterblichen Zellen bewertet (Fig. 5). Der Fliessgleichgewicht kleinere Spiegel von hTRT-mRNA war in unsterblichen Zellen, für die früher gezeigt werden konnte, dass sie aktive Telomerase besitzen, signifikant erhöht. Niedrigere Spiegel der hTRT-mRNA wurden in einigen Stämmen Telomerase-negativer Zellen entdeckt.
Es wurde RT-PCR für hTRT, hTR, TP1 (Telomerase-assoziiertes Protein, das mit Tetrahymena p80 verwandt ist (Harrington et al., Science 275 (1997) 973 und Nakayama et al., Cell 88 (1997), 875)) und GAPDH (um für gleiche Mengen an RNA-Matrize zu normalisieren) mit RNA ausgeführt, die von den folgenden Zellen stammte: (1) Menschliche fötale Lungenfibroblasten GFL, (2) menschliche fötale Hautfibroblasten GFS, (3) erwachsene Prostata Stromal-Fibroblasten 31 YO, (4) menschliche fötale Kniesynovial-Fibroblasten HSF, (5) neonatale Vorhaut-Fibroblasten Bi, (6) menschliche fötale Lungenfibroblasten IMR90 und die immortalisierten Zellinien: (7) Melanom LOX IMVI, (8) Leukämie U251, (9) Lungenkrebs NCI H23, (10) Colon-Adenocarcinom SW620, (11) Brusttumor MCF7, (12) 293 Adenovirus-E1-transformierte menschliche embryonale Nierenzellinie.
hTRT-Nucleinsäure wurde von cDNA mittels der Oligonucleotid-primer LT5 und LT6 amplifiziert (Tabelle 2) mit insgesamt 31 Cyclen (94 DEG C 45 s, 60 DEG C 45 s, 72 DEG C 90 s). GAPDH wurde mittels des Primers K136 (CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA) und K137 (ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA) mit insgesamt 16 Cyclen amplifi ziert (94 DEG C 45 s, 55 DEG C 45 s, 72 DEG C 90 s). hTR wurde mit den Primern F3B (TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG) und R3c (GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG) mit insgesamt 22 Cyclen amplifiziert (94 DEG C 45 s, 55 DEG C 45 s, 72 DEG C 90 s). TP1-mRNA wurde mit den Primern TP1.1 und TP1.2 in 28 Cyclen (die Cyclen waren die gleichen wie für hTRT) amplifiziert. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 8%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt, mit "SYBR Green" (Molecular Probes) angefärbt und durch Scannen auf einem "Storm 860" (Molecular Dynamics) sichtbar gemacht.
Die in Fig. 5 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass hTRT-mRNA-Spiegel direkt mit den Spiegeln an Telomerase-Aktivität in den getesteten Zellen korrelieren.
Beispiel 3
Charakterisierung einer hTRT-Intron-Sequenz
Ein vermutetes Intron wurde zuerst durch PCR-Amplifikation menschlicher genomischer DNA, wie in diesem Beispiel beschrieben, identifiziert und das Ergebnis wurde im Anschluss daran durch Sequenzierung des genomischen Clons lambda G PHI 5 (siehe Beispiel 4) bestätigt. PCR-Amplifikation wurde mittels des Vorwärts-Primers TCP1.57 durchgeführt, der in Kombination mit den einzelnen reversen Primern TCP1.46, TCP1.48, TCP1.50, TCP1.52, TCP1.54, TCP1.56 und TCP1.58 kombiniert wurde (siehe Tabelle 2). Die Produkte von genomischer DNA der Amplifikation mit TCP1.57/TCP1.46, TCP1.48, TCP1.50, TCP1.52, TCP1.54 oder TCP1.56 waren etwa 100 Basenpaare länger als die Produkte der pGRN121-Amplifikationen. Die Amplifikation mit TCP1.57/TCP1.58 war bei Verwendung genomischer DNA und pGRN121-DNA gleich.
Dies zeigte, dass die genomische DNA eine Insertion zwischen den Stellen für TCP1.58 und TCP1.50 enthielt. Die PCR-Produkte von TCP1.57/TCP1.50 und TCP1.57/TCP1.52 wurden ohne Subclonierung mit den Primern TCP1.39, TCP1.57 und TCP1.49 direkt sequenziert.
Wie nachstehend gezeigt, ist die Intron-Sequenz von 104 Basen (SEQ. ID. Nr. 7) (Fig. 12) in der hTRT-mRNA (in Fettdruck gezeigt) an der Verbindung, die den Basen 274 und 275 von SEQ. ID. Nr. 1 entspricht, inseriert:
EMI305.1
"/" kennzeichnet die Spleisspunkte, die Sequenz zeigt gute Übereinstimmungen mit den "Consensus"-5 min - und 3 min -Spleisspunktsequenzen, die typisch für menschliche Introns sind.
Dieses Intron enthält Motive, die charakteristisch für eine Spaltstelle für Topoisomerase II sind und eine NFKB-Bindungsstelle (siehe Fig. 21). Diese Motive sind teilweise deshalb von Interesse, da die Expression von Topoisomerase II in den meisten Tumoren hoch reguliert ist. Topoisomerase II bewirkt eine Relaxierung von DNA durch Schneiden und erneutes Auffinden der DNA, wodurch die Expression bestimmter Gene erhöht wird. Es konnte gezeigt werden, dass Inhibitoren von Topoisomerase II als anti-Tumor-Agenzien wirken. Im Falle von NFKB könnte dieser Transkriptionsfaktor eine Rolle bei der Regulation von Telomerase während der terminalen Differenzierung spielen.
NFKB könnte eine Rolle spielen bei der frühen Repression von Telomerase während der Entwicklung und stellt somit ein weiteres Ziel für eine therapeutische Intervention hinsichtlich der Regulierung von Telomerase-Aktivität in Zellen dar.
Beispiel 4
Clonierung des Lambda-phagen G PHI 5 und Charakterisierung von genomischen hTRT-Sequenzen
a) Lambda G PHI 5
Eine menschliche genomische DNA-Bank wurde mittels PCR und Hybridisierung gescreent, wobei ein hTRT-RNA codierende Sequenzen enthaltender genomischer Clon gefunden wurde. Bei der Bank handelt es sich um eine genomische Bank von menschlichen Fibroblasten, die mittels DNA von W138 Lungenfibroblastenzellen hergestellt wurde (Stratagene, Katalog #946204). In dieser Bank sind partielle Sau3AI-Fragmente in die XhoI-Stelle des Lambda-Vektors FIXRII (Stratagene) mit einer Insertionsgrösse von 9-22 kb inseriert.
Diese genomische Bank wurde in Pools von jeweils 150 000 Phagen aufgeteilt und jeder Pool durch "nested" PCR gescreent (äusseres Primerpaar TCP1.52 & TCP1.57; inneres Primerpaar TCP1.49 & TCP1.50, siehe Tabelle 1). Diese Primerpaare umspannen ein vermutetes Intron (siehe das vorstehende Beispiel 3) in der genomischen DNA von hTRT und sie gewährleisten, dass das PCR-Produkt von einer genomischen Quelle stammte und nicht von einer Verunreinigung durch den hTRTcDNA-Clon. Positive Pools wurden weiter aufgeteilt, bis ein Pool von 2000 Phagen erhalten wurde. Dieser Pool wurde mit niedriger Dichte ausplattiert und durch Hybridisierung mit einem DNA-Fragment, das die Basenpaare 1552-2108 von SEQ. ID. Nr. 1 umfasst (Restriktionsstellen SphI bzw. EcoRV) gescreent.
Zwei positive Clone wurden isoliert und erneut über "nested" PCR wie vorstehend beschrieben gescreent. Beide Clone waren am Rande der PCR positiv. Einer der Clone ( lambda G PHI 5) wurde mit NotI gespalten, wobei sich eine Insertionsgrösse von etwa 20 kb zeigte. Die nachfolgende Kartierung (siehe unten) ergab eine Insertionsgrösse von 15 kb und zeigte, dass der Phage G PHI 5 etwa 13 kb an DNA stromaufwärts von der Startstelle der cDNA-Sequenz enthält.
Der Phage G PHI 5 wurde mittels Restriktionsenzymspaltung und DNA-Sequenzierung kartiert. Die erhaltene Karte ist in Fig. 7 gezeigt. Die Phagen-DNA wurde mit NcoI gespalten und die Fragmente in pBBS167 cloniert. Die erhaltenen Subclone wurden durch PCR gescreent, um jene zu identifizieren, die Sequenzen enthalten, die dem 5 min -Bereich der hTRT-cDNA entspre chen. Ein Subclon (pGRN140), der ein NcoI-Fragment von 9 kb (mit der hTRT-Gensequenz und 4 bis 5 kb der lambda-Vektor-Sequenz) enthielt, wurde partiell sequenziert, um die Orientierung der Insertion zu bestimmen. pGRN 140 wurde zur Entfernung von lambda-Vektor-Sequenzen mit SalI geschnitten, wobei pGRN144 erhalten wurde. pGRN144 wurde danach sequenziert. Vorläufige Ergebnisse der Sequenzierung sind in Fig. 76 gezeigt und die Ergebnisse einer weiteren Sequenzierung sind in SEQ. ID. Nr. 6 (Fig. 21) bereitgestellt.
Das 5 min -Ende der hTRT-mRNA entspricht der Base 2441 von SEQ. ID. Nr. 6 (Fig. 21). Wie in Fig. 7 gezeigt, liegen zwei Alu-Sequenzelemente 1700 Basenpaare stromaufwärts von dem 5 min -Ende der hTRT-cDNA und diese liefern wahrscheinlich die stromaufwärts gelegene Grenze hinsichtlich des Promotorbereichs von hTRT. Die Sequenz besitzt auch ein Intron, das bei der Base 4173 (SEQ. ID. Nr. 6) (Fig. 21) liegt, 3 min gelegen zu dem in dem vorstehenden Beispiel 3 beschriebenen Intron.
b) Zusätzliche genomische Clone
Zusätzlich zu dem vorstehend beschriebenen genomischen Clon werden zwei P1-Bacteriophagenclone und ein menschlicher BAC-Clon als veranschaulichende erfindungsgemässe Ausführungsformen bereitgestellt. Die P1-Insertionen haben gewöhnlich eine Länge von 75 bis 100 kb und die BAC-Insertionen üblicherweise von mehr als 100 kb.
Die P1-Clone (DMPC-HFF#1-477(F6) -GS#15371 und DMPC-HEF#1-1103(H6) -GS#15372) wurden durch PCR-Screenen einer menschlichen P1-Bank erhalten, die von menschlichen Vorhaut-Fibroblastenzellen stammte (Shepherd et al., PNAS USA 91 (1994) 2629) wobei die Primer TCP1.12 und UTR2 verwendet wurden, die das 3 min -Ende von hTRT amplifizieren. Diese Clone waren beide negativ mit Primern, die das 5 min -Ende von hTRT amplifizieren (d.h. es fand keine Amplifikation statt).
Der menschliche BAC-Clon (326 E 20) wurde mittels eines Hybridisierungs-Screenings einer menschlichen genomischen BAC-Bank mittels eines 1143 bp SphI/XmnI-Fragments von SEQ. ID. Nr. 1 (Basen 1552-2695) erhalten, das den RT-Motivbereich umfasst. Es wird davon ausgegangen, dass dieser Clon das 5 min enthält. Es wird davon ausgegangen, dass die genomischen hTRT-Clone in diesem Beispiel das gesamte hTRT-Gen umfassen.
Beispiel 5
Chromosomale Lage des hTRT-Gens
Das hTRT-Gen wurde auf dem Chromosom 5p durch "radiation hybrid"-Kartierung lokalisiert (Boehnke et al., Am. J. Hum. Genet. 49 (1991) 1174 und Walter et al., Nature Genet. 7 (1994) 22) unter Verwendung des "medium resolution Stanford G3 panel" von 83 RH-Clonen des gesamten menschlichen Genoms (erzeugt am Stanford Human Genome Center). Eine menschliche Lymphoblastoid-Zellinie (Donor; rM) wurde gegen 10 000 rad Röntgenstrahlen exponiert und dann mit nicht bestrahlten Hamster-Rezipientenzellen (A3) fusioniert. 83 unabhängige Hybridclone aus somatischen Zellen wurden isoliert, wobei jeder Clon ein Fusionsereignis zwischen einer bestrahlten Donorzelle und einer Hamster-Rezipientenzelle darstellt. Die DNA von Tafel G3 wurde zum Ordnen von Markern in dem gewünschten Bereich sowie zur Etablierung der Entfernung zwischen diesen Markern verwendet.
Die für die RH-Kartierung verwendeten Primer waren TCP1.12 und UTR2, wobei 45 Cyclen mit Taq-Puffern von Boehringer Mannheim und Taq-Polymerase von Perkin-Elmer verwendet wurden, jeweils 45 Sekunden 94 DEG C, 45 Sekunden 55 DEG C und 45 Sekunden 72 DEG C. Die 83 Pools wurden unabhängig voneinander amplifiziert und 14 (17%) waren positiv hinsichtlich hTRT (durch Auftreten einer Bande von 346 bp). Die Amplifikationsergebnisse wurden dem "Stanford RH server" eingegeben, der dann die Kartenposition 5p und den nächsten Marker, STS D5S678 lieferte.
Durch Abfragen der "Genethon genom mapping" - web site konnte bei der Kartierung ein YAC identifiziert werden, das den STS-Marker D5S678 enthält: CEPH YAC 780_C_3, Grösse: 390 660 kb. Dieses YAC enthielt auch Marker für das Chromosom 17. Dieses Ergebnis zeigte an, dass sich das hTRT-Gen auf Chromosom 5 befindet, nahe dem Telomer-Ende. In einer Reihe von Tumoren gibt es erhöhte Kopienanzahlen für 5p. Das Katzenschrei-Syndrom wurde auch zu Deletionen in diesem Bereich kartiert.
Beispiel 6
Entwurf und Konstruktion von Vektoren zur Expression von hTRT-Proteinen und -Polynucleotiden
Expression von hTRT in Bakterien
Das folgende Beispiel beschreibt ausführlich den Entwurf von hTRT-exprimierenden bakteriellen Expressionsvektoren, mit denen grosse Mengen an biologisch aktivem hTRT mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2) hergestellt werden können. Die Erzeugung von biologisch aktivem hTRT-Protein auf diese Weise ist von Nutzen für die Telomerase-Rekonstitutionsassays, für die Untersuchung von Modulatoren von Telomerase-Aktivität, für die Analyse der Aktivität von neu isolierten Spezies von hTRT, zur Identifizierung und Isolierung von Verbindungen, die spezifisch mit hTRT assoziieren, für die Analyse der Aktivität einer hTRT-Proteinvariante, die, wie vorstehend beschrieben, ortsspezifisch mutiert wurde, und als ein Immunogen, um nur einige Beispiele zu nennen.
Der bakterielle Expressionsvektor pThioHis A/hTRT
Um grosse Mengen an hTRT (SEQ. ID. Nr. 2) mit vollständiger Länge herstellen zu können, wurde der bakterielle Expressionsvektor pThioHis A (Invitrogen, San Diego, CA) als Expressionssystem ausgewählt. Die hTRT-codierende Insertion enthält die Nucleotide 707 bis 4776 der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1). Diese Nucleotidsequenz enthält die vollständige codierende Sequenz des hTRT-Proteins (SEQ. ID. Nr. 2).
Dieser erfindungsgemässe Expressionsvektor kann für induzierbare Expressionen in Bakterien entworfen werden. Die Induktion der Expression kann erfolgen, um in E. coli hohe Spiegel eines Fusionsproteins zu codieren, das aus einer spaltbaren, "HIS-tagged" Thioredoxineinheit und dem hTRT-Protein mit vollständiger Länge zusammengesetzt ist. Die Verwendung des Expressionssystems erfolgte im wesentlichen gemäss den Anleitungen des Herstellers. Die Aminosäuresequenz des von dem erfindungsgemässen erhaltenen Vektor-codierten Fusionsproteins wird nachfolgend gezeigt: (-*-) kennzeichnet eine Spaltstelle für Enterokinase;
EMI310.1
EMI311.1
pGEX-2TK mit den hTRT-Nucleotiden 3272 bis 4177 von pGRN121
Dieses erfindungsgemässe Konstrukt wird für die Herstellung von Fusionsprotein verwendet, beispielsweise um polyclonale und monoclonale Antikörper gegen das hTRT-Protein erhalten zu können. Fragmente von hTRT können auch für andere Zwecke verwendet verwendet werden, beispielsweise zur Modulation von Telomerase-Aktivität, z.B. als eine dominant-negative Mutante oder um die Assoziierung von Telomerase mit anderen Proteinen oder Nucleinsäuren zu verhindern.
Zur Produktion grosser Mengen eines hTRT-Proteinfragments wurde der E. coli-Expressionsvektor pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.) ausgewählt und im wesentlichen nach den Anleitungen des Herstellers verwendet. Damit wurde ein erfindungsgemässes Expressionssystem hergestellt. Das erhaltene Konstrukt enthält eine Insertion, die von den Nucleotiden 3272 bis 4177 der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121 stammt. Der Vektor steuert die Expression von hohen Spiegeln eines Fusionsproteins in E. coli, das aus der Glutathion-S-Transferase-Sequenz (nachstehend unterstrichen), der Spalt-Sequenz für Thrombin (doppelt unterstrichen), der Erkennungssequenz für Herzmuskel-Proteinkinase (kursiv), durch Clonierung eingeführte Reste (in Klammern, GSVTK) und dem hTRT-Proteinfragment (in Fettdruck) (SEQ. ID. Nr. 38) wie nachfolgend gezeigt, zusammengesetzt ist:
EMI312.1
Bei der Expression dieses Fusionsproteins wurden unlösliche Aggregate gebildet. Es wurde allgemein wie vorstehend im Abschnitt "Reinigung von Proteinen aus Einschlusskörperchen" behandelt. Dabei wurden induzierte Zellen in PBS (20 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,4 und 150 mM NACl) suspendiert und durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen. NP-40 wurde bis zu 0,1% zugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei 4 DEG C unter leichtem Mischen inkubiert. Das unlösliche Material wurde durch 30minütige Zentrifugation mit 25 000 g bei 4 DEG C gewon nen. Das unlösliche Material wurde einmal in 4 M Harnstoff in PBS gewaschen, durch Zentrifugation gewonnen und dann erneut in PBS gewaschen. Es wurde geschätzt, dass das gewonnene Pellet mehr als 75% Fusionsprotein enthielt.
Dieses Material wurde in einem Vakuum schnell getrocknet, danach für die Injektion in Mäuse und Kaninchen zur Erzeugung von Antikörpern in einem Adjuvans suspendiert. Die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Glutathion-S-Transferase-Einheit wird durch ortsspezifische Proteolyse mittels Thrombin gemäss den Anleitungen des Herstellers durchgeführt.
pGEX-2TK mit den Nucleotiden 2426 bis 3274 von pGRN121 mit einem "HIS-8-Tag"
Zur Herstellung grosser Mengen eines Fragments von hTRT wurde ein weiteres E. coli-Expressionsvektor pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.)-Konstrukt hergestellt. Dieses Konstrukt enthält eine Insertion, die von den Nucleotiden 2426 bis 3274 der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) und eine Sequenz, die acht aufeinanderfolgende Histidinreste codiert (HIS-8-Tag). Um dieses "HIS-8-Tag" zu inserieren, wurde der Vektor pGEX-2TK mit den hTRT-Nucleotiden 2426 bis 3274 von pGRN121 mit BamHI linearisiert. Dadurch wird das Plasmid an der Verbindung zwischen GST-Thrombin-Herzmuskelproteinase und der hTRT codierenden Sequenz geöffnet.
Zu dem linearisierten Plasmid wurde ein doppelsträngiges Oligonucleotid mit BamHI-kompatiblen Enden, wie dies in der nachstehend gezeigten Sequenz zu sehen ist, ligiert, was die Einführung von acht Histidin-Resten stromaufwärts der hTRT-Sequenz im Leserahmen ergab.
Der Vektor steuert in E. coli die Expression von hohen Spiegeln eines Fusionsproteins, das zusammengesetzt ist aus der Glutathion-S-Transferase-Sequenz (unterstrichen); der Spaltsequenz für Thrombin (doppelt unterstrichen); der Erkennungssequenz für Herzmuskel-Proteinkinase (kursiv); einem Satz von drei und einem Satz von fünf Resten, die durch Clo nierung eingeführt wurden (GSV und GSVTK) acht auf einanderfolgenden Histidinen (auch doppelt unterstrichen) und dem hTRT-Proteinfragment (in Fettdruck) (SEQ. ID. Nr. 39):
EMI314.1
Dieser Vektor kann zur Herstellung von Fusionsprotein zur Erzeugung von polyclonalen und monoclonalen Antikörpern gegen ein hTRT-Protein verwendet werden. Dieses Fusionsprotein kann ausserdem dazu verwendet werden, um gegen hTRT-Peptide, die innerhalb des Fusionsproteins enthalten sind, gerichtete Antikörper einer Affinitätsreinigung zu unterwerfen. Die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Glutathion-S-Transferase-Einheit kann durch ortsspezifische Proteolyse mittels Thrombin gemäss den Anweisungen des Herstellers erzielt werden.
pGEX-2TK mit den hTRT-Nucleotiden 2426 bis 3274 von pGRN121 ohne "HIS-8-TAG"
Zur Herstellung grosser Mengen eines hTRT-Fragments wurde ein anderes E. coli-Expressionsvektor pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.)-Konstrukt hergestellt. Dieses Vektorkonstrukt kann zur Herstellung von Fusionsprotein für die Erzeugung von polyclonalen und monoclonalen Antikörpern gegen das hTRT-Protein verwendet werden. Dieses Fusionsprotein kann ausserdem dazu verwendet werden, gegen hTRT-Peptide, die in dem Fusionsprotein enthalten sind, gerichtete Antikörper einer Affinitätsreinigung zu unterwerfen.
Dieses Konstrukt enthält eine Insertion, die von den Nucleotiden 2426 bis 3274 der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) stammt, jedoch ohne das "His-8-tag". Der Vektor steuert in E. coli die Expression von hohen Spiegeln eines Fusionsproteins, das zusammengesetzt ist aus Glutathion-S-Transferase (unterstrichen), einer Spaltsequenz für Thrombin (doppelt unterstrichen), einer Erkennungssequenz für die Herzmuskel-Proteinkinase (kursiv), durch Clonierung eingeführte Reste (in Klammern, GSVTK) und das hTRT-Proteinfragment (in Fettdruck) (SEQ. ID. Nr. 40):
EMI315.1
Die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Glutathion-S-Transferase-Einheit kann durch ortsspezifische Proteolyse mittels Thrombin gemäss den Angaben des Herstellers erzielt werden.
pGEX-2TK mit den hTRT-Nucleotiden 1625 bis 2458 von gPRN121
Zur Herstellung grosser Mengen eines hTRT-Proteinfragments wurde ein weiteres E. coli-Expressionsvektor pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.)-Konstrukt hergestellt. Dieses Vektorkonstrukt kann zur Herstellung von Fusionsprotein zur Erzeugung polyclonaler und monoclonaler Antikörper gegen ein hTRT-Protein verwendet werden. Darüber hinaus kann dieses Fusionsprotein dazu verwendet werden, gegen hTRT-Pep tide, die in dem Fusionsprotein enthalten sind, gerichtete Antikörper einer Affinitätsreinigung zu unterwerfen.
Dieses Konstrukt enthält eine Insertion, die von den Nucleotiden 1625 bis 2458 der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) stammt. Der Vektor steuert in E. coli die Expression von hohen Spiegeln eines Fusionsproteins, das zusammengesetzt ist aus Glutathion-S-Transferase (unterstrichen), einer Spaltsequenz für Thrombin (doppelt unterstrichen), einer Erkennungssequenz für Herzmuskel-Proteinkinase (kursiv), durch Clonierung eingeführte Reste (in Klammern, GSVTK) und dem hTRT-Proteinfragment (in Fettdruck) (SEQ. ID. Nr. 41):
EMI316.1
Die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Glutathion-S-Transferase-Einheit wird durch ortsgerichtete Proteolyse mittels Thrombin gemäss den Anweisungen des Herstellers erzielt.
pGEX-2TK mit den hTRT-Nucleotiden 782 bis 1636 von pGRN121
Zur Herstellung grosser Mengen eines hTRT-Proteinfragments wurde ein weiteres E. coli-Expressionsvektor pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.)-Konstrukt hergestellt. Dieses Vektorkonstrukt kann zur Herstellung von Fusionsprotein zur Erzeugung polyclonaler und monoclonaler Antikörper gegen ein hTRT-Protein verwendet werden. Darüber hinaus kann dieses Fusionsprotein dazu verwendet werden, gegen hTRT-Pep tide, die in dem Fusionsprotein enthalten sind, gerichtete Antikörper einer Affinitätsreinigung zu unterwerfen.
Dieses Konstrukt enthält eine Insertion, die von den Nucleotiden 782 bis 1636 der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) stammt. Der Vektor steuert in E. coli die Expression von hohen Spiegeln eines Fusionsproteins, das zusammengesetzt ist aus Glutathion-S-Transferase (unterstrichen), einer Spaltsequenz für Thrombin (doppelt unterstrichen), einer Erkennungssequenz für Herzmuskel-Proteinkinase (kursiv), durch Clonierung eingeführte Reste (in Klammern, GSVTK) und einem hTRT-Proteinfragment (in Fettdruck) (SEQ. ID. Nr. 42):
EMI317.1
Die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Glutathion-S-Transferase-Einheit wird durch ortsspezifische Proteolyse mittels Thrombin gemäss den Anleitungen des Herstellers erzielt.
pT7FLhTRT mit hTRT-cDNA, der die 5 min -nicht-codierende Sequenz fehlt
Wie bereits vorstehend beschrieben, stellt die Erfindung in einer Ausführungsform ein hTRT bereit, das zur Erleichterung der Clonierung in bakterielle, Säuger-, Hefe- und Insekten-Expressionsvektoren auf ortsgerichtete Weise modifiziert ist und keine 5 min -untranslatierte hTRT-Sequenz enthält. Unter manchen Umständen erlaubt die Minimierung der Menge an nicht-Protein-codierender Sequenz die verbesserte Proteinherstellung (Ausbeute) und führt zu einer erhöhten mRNA-Stabilität. In dieser erfindungsgemässen Ausführungsform wurde vor der Clonierung in dem bakteriellen Expressionsvektor der 5 min -nicht-codierende Bereich von hTRT entfernt.
Dies wurde durch Erzeugung einer zusätzlichen Restriktionsschnittstelle unmittelbar stromaufwärts (5 min ) von dem Startcodon (ATG) der hTRT-codierenden Sequenz (Fig. 16) bewirkt. Die Erzeugung einer Restriktionsschnittstelle unmittelbar 5 min zum codierenden Bereich des Proteins gestattet die effiziente Herstellung einer grossen Anzahl von Vektoren, die Fusionsproteine codieren, beispielsweise Fusionsproteine, die Markierungen und Peptid-"TAGs" enthalten zum Immunnachweis und zur Reinigung.
In diesem Fall wurde das Oligonucleotid 5 min -CCGGCCACCCCCCATATGCCGCGCGCTCCC-3 min , wie oben beschrieben, zur Modifikation der hTRT-cDNA-Nucleotide 779 bis 781 der hTRT-cDNA (Fig. 16) von GCG zu CAT verwendet. Diese 3 Nucleotide sind die letzten Nucleotide vor dem ATG-Startcodon, somit führt diese Änderung nicht zur Modifikation der Proteinsequenz. Die Sequenzänderung führt zur Erzeugung einer einzigen NdeI-Restriktionsstelle in der hTRT-cDNA. Einzelsträngige hTRT-DNA wurde als eine DNA-Quelle für die ortsgerichtete Mutagenese verwendet. Das erhaltene Plasmid wurde zur Bestätigung einer erfolgreichen Mutagenese sequenziert.
*Diese Modifikation erlaubte die Konstruktion des nachfolgend beschriebenen erfindungsgemässen Plasmids mit der Bezeichnung pT7FLhTRT. Die ortsspezifisch modifizierte hTRT-Sequenz (Hinzufügung der NdeI-Restriktionsstelle) wurde mit NdeI und NotI gespalten, wobei ein hTRT-Fragment erzeugt wurde. Dieses Fragment wurde danach in ein pSL3418-Plasmid cloniert, das vorher mit NdeI und SmaI (auch ein Restriktionsenzym bei dessen Spaltung glatte Enden entstehen) geschnitten worden war, cloniert. pSL 3418 ist ein modifziertes paED4-Plasmid, in das eine FLAG-Sequenz (Immunex Corp. Seattle WA) und eine Enterokinase-Sequenz unmittelbar stromaufwärts von der vorstehend erwähnten NdeI-Stelle inseriert wurden.
Dieses Plasmid mit der Bezeichnung pT7FLhTR erlaubt die Expression von hTRT mit vollständiger Länge (mit einem "Flag-Tag" an ihrem 5 min -Ende) in einem E. coli Stamm, der T7-RNA-Polymerase exprimiert.
Vektor, in dem eine hTRT-codierende Sequenz durch den MPSV-Promotor gesteuert wird
Die Erfindung stellt auch einen Säuger-Expressionsvektor bereit, in dem hTRT so orientiert ist, dass die hTRT-codierende Sequenz durch den MPSV-Promotor (nachstehend beschrieben) gesteuert wird. Ein EcoRI-Restriktionsfragment von pGRN137, das den hTRT-ORF enthält, wurde in die EcoRI-Stelle von pBBS212 (siehe nachstehend) cloniert, wodurch der 5 min -untranslatierte Bereich (5 min -UTR) von hTRT entfernt wurde (pGRN137 wurde durch Ausschneiden eines SalI-Sse8387 I-Fragments von pGRN130 (nachstehend beschrieben), das die Kozak-Mutation von hTRT.
In den SalI-SSE 83871-Stellen von pGRN136 enthält, konstruiert, wodurch ein Säuger-Expressionsplasmid entsteht, das hTRT (eine "Kozak-Consensus"-Sequenz enthält) von dem MPSV-Promotor exprimiert) (pGRN136 wurde durch Ausschneiden eines HindIII-SalI-Fragments von pGRN126 konstruiert, das den hTRT-ORF enthält und Clonierung in die HindIII-SalI-Stellen von pBBS242. Dadurch entsteht ein Säugerexpressionsplasmid, das hTRT vom MPSV-Promotor exprimiert). Dadurch wurde ein Säuger-Expressionsplasmid mit der Bezeichnung pGRN145 erhalten, das hTRT mit einer "Kozak-Consensus"-Sequenz unter Verwendung des MPSV-Promotors exprimiert. Siehe auch den pGRN152-MPSV-Promotor gesteuerten Säuger-Expressionsvektor, der nachstehend beschrieben wird.
Plasmide mit hTRT-cDNA, der die 3 min -nicht-codierende Sequenz fehlt
Wie bereits vorstehend diskutiert, stellt die Erfindung TRTcodierende Nucleinsäuren enthaltende Expresionsvektoren bereit, in denen einige oder alle nicht-codierenden Sequenzen deletiert wurden. Unter manchen Umständen erlaubt die Minimierung der Menge an nicht-Protein-codierender Sequenz die verbesserte Proteinproduktion (Ausbeute) und sie erhöht die mRNA-Stabilität. In dieser erfindungsgemässen Ausführungsform wurde vor der Clonierung in das bakterielle Expressionsplasmid der 3 min -nicht-translatierte Bereich von hTRT deletiert.
Das Plasmid pGRN121, das hTRT-cDNA mit vollständiger Länge, wie vorstehend diskutiert, enthält, wurde zuerst hinsichtlich aller APAI-Stellen deletiert. Danach folgte die Deletion des MscI-HincII-hTRT-Restriktionsfragments, das den 3- min UTR enthält. Das NcoI-XbaI-Fragment, das das Stopcodon von hTRT enthält, wurde dann in die NcoI-XbaI-Stelle von pGRN121 inseriert, wobei ein Plasmid mit der Bezeichnung pGRN124 erhalten wurde, das äquivalent zu pGRN121 ist, ausser dass ihm der 3 min -UTR fehlt.
Bakterielle Expressionsvektoren mit Antibiotika-Selektionsmarkern
Die Erfindung stellt auch bakterielle Expressionsvektoren bereit, die Selektionsmarker zur Verleihung eines selektierbaren Phänotyps in transformierten Zellen enthält, und Sequenzen, die für die Beibehaltung des Vektors als Episom und Replikation codieren, so dass die Integration in das Wirtsgenom nicht erforderlich ist. Beispielsweise kann der Marker die Biotikaresistenz codieren, beispielsweise Resistenz gegen Chloramphenicol (siehe Harrod, Nucleic Acids Res. 25 (1997), 1720-1726), Kanamycin, G418, Bleomycin und Hygromycin, was die Selektion der Zellen erlaubt, die mit den gewünschten DNA-Sequenzen transformiert wurden; siehe bei spielsweise Blondelet-Rouault, Gene 190 (1997), 315-317 und Mahan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 669-673.
In einer erfindungsgemässen Ausführungsform wurde die hTRT mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 1) in einen modifizierten "BlueScript"-Plasmidvektor (Stratagene, San Diego, CA) cloniert, der die Bezeichnung pBBS235 trägt, und in dem ein Resistenzgen für das Antibiotikum Chloramphenicol inseriert worden war. Das NotI-Fragment von pGRN124 (vorstehend diskutiert), das den hTRT-ORF enthält, wurde in die NotI-Stelle von pBBS235 cloniert, so dass der TRT-ORF in der umgekehrten Richtung bezogen auf den lac-Promotor des Vektors vorliegt. Dadurch entsteht ein Plasmid, das für die Mutagenese von Plasmidinsertionen geeignet ist, beispielsweise den erfindungsgemässen TRT-Nucleinsäuren. Dieses Plasmidkonstrukt mit der Bezeichnung pGPN125 wird in den erfindungsgemässen Verfahren verwendet, die Mutagenese von Telomerase-Enzym und TRT-Protein codierenden Sequenzen beinhalten.
Es kann auch für die in vitro-Transkription von hTRT mittels des T7-Promotors und die in vitro-Transkription von "antisense"-hTRT mittels des T3-Promotors verwendet werden.
In einer weiteren erfindungsgemässen Ausführungsform wurden die hTRT-ORF enthaltenden NotI-Restriktionsfragmente von pGRN124 in die NotI-Stelle von pBBS235 (nachstehend beschrieben) subcloniert, so dass der TRT-ORF die gleiche Orientierung hat wie der lac-Promotor des Vektors. Dadurch entsteht ein Plasmid mit der Bezeichnung pGRN126, das zur Expression von hTRT mit vollständiger Länge in E. coli verwendet werden kann. Das exprimierte Produkt enthält 29 Aminosäuren, die von dem Vektor pBBS235 codiert werden, woran sich 18 Aminosäuren anschliessen, die von dem 5 min -UTR von hTRT codiert werden und danach folgt das hTRT-Protein mit vollständiger Länge.
In einer weiteren erfindungsgemässen Ausführungsform wurde zur Konvertierung des ATG-Initiationscodons von hTRT in einem "Kozak-Consensus"-Sequenz und zur Erzeugung von EcoRI- und BglII-Restriktionsschnittstellen zur Erleichterung der Clonierung in die bakteriellen Expressionsvektoren eine in vitro-Mutagenese von pGRN125 durchgeführt.
Bei dieser Mutagenese-Prozedur wurde das Oligonucleotid
EMI322.1
(SEQ. ID. Nr. 43) verwendet. Dieser neue Expressionsvektor erhielt die Bezeichnung pGRN127.
In einer weiteren erfindungsgemässen Ausführungsform wurde das zweite Asp des TRT-"DD-Motivs" (vorstehend beschrieben) zu einem Alanin umgewandelt, um ein nicht-funktionelles Telomerase-Enzym zu erzeugen und damit ein Mutanten-TRT-Protein zur Verwendung in Experimenten mit dominant/negativen Mutanten. hTRT (SEQ. ID. Nr. 1) wurde in vitro mutagenisiert mit dem Oligonucleotid
EMI322.2
(SEQ. ID. Nr. 44), um das Asparagin bei dem Rest 869 (Asp869) (von SEQ. ID. Nr. 2) zu einem Alanin (Ala)-Codon umzuwandeln. Dadurch wurde auch eine MluI-Restriktionsschnittstelle erzeugt. Dieses Expressionsplasmid erhielt die Bezeichnung pGRN130 und enthält auch die "Kozak-Consensus"-Sequenz wie für pGRN127 beschrieben.
Die Erfindung stellt auch einen Vektor bereit, der zur Expression eines "antisense"-Sequenzfragments von hTRT entworfen wurde. Das Plasmid pGRN126 wurde mit den Restriktionsenzymen MscI und SmaI vollständig gespalten und erneut ligiert, wobei über 95% des hTRT-ORF in Säugerzellen deletiert wurden. Ein SmaI-MscI-Fragment wurde während dieses Prozesses, um wieder CAT-Aktivität zu erzeugen, erneut inse riert. Dieses ungereinigte Plasmid wurde dann erneut mit SalI und EcoRI geschnitten und das Initiationscodon von hTRT enthaltende Fragment in die SalI-EcoRI-Schnittstellen von pBBS212 (vorstehend beschrieben) inseriert. Dadurch entstand ein "antisense"-Expressionsplasmid, das die "antisense"-Sequenz exprimiert, die den 5 min -UTR und 73 Basenpaarreste des hTRT-ORF umspannt. Dieses Plasmid erhielt die Bezeichnung pGRN135.
Expression von hTRT-Telomerase in Hefe
Im folgenden Beispiel wird im Detail die Konstruktion der erfindungsgemässen hTRT-exprimierenden Hefe-Expressionsvektoren zur Produktion grosser Mengen an biologisch aktiver hTRT (SEQ. ID. Nr. 2) mit vollständiger Länge dargestellt. Die Verwendung von biologisch aktiver hTRT in vielen erfindungsgemässen Ausführungen ist vorstehend beschrieben.
Pichia pastoris-Expressionsvektor pPICZ B und hTRT mit vollständiger Länge
Zur Produktion grosser Mengen an biologisch aktivem hTRT wurde der Pichia pastoris-Expressionsvektor PPICZ B (Invitrogen, San Diego, CA) ausgewählt. Die Insertion für die hTRT-codierende Sequenz stammte von den Nucleotiden 659 bis 4801 der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1). Diese Nucleotidsequenz enthält die hTRT codierende Sequenz in voller Länge (SEQ. ID. Nr. 2). Dieser Expressionsvektor wurde für die induzierbare Expression von hohen Mengen an unmodifiziertem hTRT-Protein (SEQ. ID. Nr. 2) mit vollständiger Länge in P. pastoris entworfen. Die Expression wird von einem Hefepromotor gesteuert, die exprimierte Sequenz verwendet jedoch die hTRT-Initiations- und Terminationscodons. Keine exogenen Codons wurden durch die Clonierung eingeführt.
Der erhaltene Vektor PPICZ B/hTRT (Invitrogen, San Diego, CA) wurde zur Transformation der Hefe verwendet.
Pichia pastoris-Expressionsvektor hTRT-His6/pPICZ B
Ein zweiter erfindungsgemässer Pichia pastoris-Expressionsvektor, der von pPICZ B (Invitrogen, San Diego, CA) abgeleitet war, enthält auch die hTRT codierende Sequenz mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2), die von den Nucleotiden 659 bis 4801 der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) stammt. Dieser Expressionsvektor hTRT-His6/pPICZ B codiert das hTRT-Protein (SEQ. ID. Nr. 2) mit vollständiger Länge und fusioniert mit dem Myc-Epitop- und His6-Reportersequenzen an seinem C-Terminus. Das hTRT-Stopcodon wurde entfernt und durch Vektorsequenzen ersetzt, die das Myc-Epitop und das His6-Reporter-"tag" sowie ein Stopcodon codieren.
Dieser Vektor wurde zur Steuerung der induzierbaren Expression des nachfolgenden Fusionsproteins mit hohen Spiegeln in Hefe entworfen, wobei dieses Fusionsprotein aus hTRT-Sequenz (unterstrichen), Vektorsequenzen (in Klammern L und NSAVD) dem Myc-Epitop (doppelt unterstrichen) und dem His6-"tag" (kursiv) (SEQ. ID. Nr. 45) besteht:
EMI324.1
Expression von hTRT in Insektenzellen
Im folgenden Beispiel ist ausführlich die Konstruktion von hTRT-Telomerase exprimierenden Expressionsvektoren für Insektenzellen zur Herstellung grosser Mengen an biologisch aktivem hTRT mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2 und SEQ. ID. Nr. 4) beschrieben.
Baculovirus-Expressionsvektor pVL1393 und hTRT mit vollständiger Länge
Die gewünschte Telomerase codierende Sequenz wurde in den Baculovirus-Expressionsvektor pVL1393 (Invitrogen, San Diego, CA) cloniert. Dieses Konstrukt wurde danach in Spodoptera fungupeida (sf-9)-Zellen mit linearisierter DNA des Autograph California-nucleäre-Polyhedrosis-Virus (Baculogold-AcMNPV) cotransfiziert. Die erhaltenen rekombinanten Baculoviren wurden im Anschluss daran plaque-gereinigt und gemäss veröffentlichter Protokolle expandiert.
Dieser Expressionsvektor erlaubt die Expression von hohen Spiegeln an hTRT-Protein mit vollständiger Länge in Insektenzellen. Die Expression wird von einem Baculovirus-Polyhedrin-Genpromotor gesteuert. Keine exogenen Codons wurden durch die Clonierung eingeführt.
Baculovirus-Expressionsvektor pBlueBacHis2 B und hTRT mit vollständiger Länge
Zur Herstellung grosser Mengen an biologisch aktivem hTRT mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2) wurde der Baculovirus-Expressionsvektor pBlueBacHis2 B (Invitrogen, San Diego, CA) als eine Quelle für Kontrollelemente ausgewählt. Die hTRT-codierende Insertion bestand aus den Nucleotiden 707 bis 4776 von der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1), die die hTRT codierende Sequenz mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2) enthält.
Ein hTRT mit vollständiger Länge mit einem His6- und "anti-Xpress tags" (Invitrogen) wurde ebenfalls konstruiert. Dieser Vektor enthält eine Insertion, die aus den Nucleotiden 707 bis 4776 der hTRT-Insertion von Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) besteht. Dieser Vektor steuert die Expression von hohen Spiegeln an hTRT-Protein mit vollständiger Länge, das an ein spaltbares 6-Histidin und "anti-Xpress tags" fusioniert ist in Insektenzellen. Die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins ist nachstehend gezeigt; (-*-) kennzeichnet eine Spaltstelle für Enterokinase:
EMI326.1
Baculovirus-Expressionsvektor pBlueBac4.5 und hTRT-Protein mit HE1>
Das NotI-Fragment von pGRN121, das die den hTRT-ORF (offenen Leserahmen) codierende Sequenz enthält, inseriert in die NotI-Stelle von pEBVHisA, so dass die codierende Sequenz mit dem RSV-Promotor funktionell verknüpft ist. Dieses Plasmid exprimiert ein Fusionsprotein, das aus einem mit dem N-Terminus des hTRT-Proteins fusionierten "His6-flag" zusammengesetzt ist. Der verwendbare Marker, der mit diesem Vektor verwendet wird, ist Ampicillin oder Hygromycin.
pGRN123
Das NotI-Fragment von pGRN121, das die den hTRT-ORF (offener Leserahmen) codierende Sequenz enthält, inseriert in die NotI-Stelle von pEBVHisA, so dass die codierende Sequenz im Vergleich zu dem RSV-Promotor in der entgegengesetzten Richtung orientiert ist, so dass "antisense"-hTRT exprimiert wird.
pGRN124
Alle APAI-Stellen in pGRN121 deletiert und danach erfolgte die Deletion des den 3 min -UTR ("untranslatierten Bereich") enthaltenden MscI-HincII-Fragments. Das das Stopcodon der hTRT codierenden Sequenz enthaltende Nco-XbaI-Fragment wurde danach in die Nco-XbaI-Stellen von pGRN121 inseriert, wodurch ein Plasmid entstand, das äquivalent zu pGRN121 ist, ausser dass ihm der 3 min -UTR fehlt. Dieses Plasmid kann vorzugsweise für gesteigerte Expressionsspiegel in einigen Zellen verwendet werden.
pGRN125
Das die hTRT codierende Sequenz enthaltende NotI-Fragment von pGRN124 inseriert in die NotI-Stelle von pBBS235, so dass der offene Leserahmen im Vergleich zu dem lac-Promotor in der gegenläufigen Orientierung ist. Der nachweisbare Marker, der mit diesem Vektor verwendet wird, ist Chloramphenicol.
pGRN126
Das die hTRT codierende Sequenz enthaltende NotI-Fragment von pGRN124, inseriert in die NotI-Stelle von pBBS235, so dass die hTRT codierende Sequenz in der gleichen Orientierung wie der lac-Promotor inseriert ist.
pGRN127
Das Oligonucleotid
EMI339.1
wurde für die in vitro-Mutagenese von pGRN125 zur Umwandlung des Initiationscodons ATG der hTRT codierenden Sequenz in eine "Kozak-Consensus"-Sequenz verwendet und zur Erzeugung von EcoRI- und BglII-Stellen für die Clonierung. COD2866 wurde auch zur Umwandlung von AmpS zu AmpR (Ampicillin-Resistenz) verwendet und COD1941 wurde zur Umwandlung von CatR (Chloramphenicol-Resistenz, zu CatS (Chloramphenicol-Empfindlichkeit) umgewandelt.
pGRN128
Das Oligonucleotid
EMI339.2
wurde für die in vitro-Mutagenese verwendet, um so das Initiationscodon ATG von hTRT in einem "Kozak-Consensus"-Sequenz umzuwandeln und EcoRI und BglII-Stellen für die Clonierung zu erzeugen. Es wurde auch das Oligonucleotid
EMI339.3
zur Insertion des "IBI Flag" (International Biotechnolgies Inc. (IBI) Kodak, New Haven, CT) am C-Terminus verwendet und zur Erzeugung von EcoRI- und BglII-Stellen für die Clonierung. COD2866 wurde auch zur Umwandlung von AmpS zu AmpR verwendet und COD1941 zur Umwandlung von CatR zu CatS.
pGRN129
Das Oligonucleotid
EMI340.1
wurde zur in vitro-Mutagenese zur Umwandlung von Asp869 in ein Ala-Codon verwendet (d.h. das zweite Asp des DD-Motivs wurde für dominant/negative Experimente in ein Alanin umgewandelt). Dadurch wurde auch eine MluI-Stelle erzeugt. Auch das Oligonucleotid
EMI340.2
wurde zur Insertion des "IBI Flag" (IBI, New Haven, CT) am C-Terminus verwendet und zur Erzeugung von EcoRI- und BglII-Stellen für die Clonierung. Auch COD2866 wurde zur Umwandlung von AmpS zu AmpR verwendet und COD1941 zur Umwandlung von CatR zu CatS.
pGRN130
Das Oligonucleotid
EMI340.3
wurde bei einer in vitro-Mutagenese zur Umwandlung des Asp869-Codons in ein Ala-Codon verwendet (d.h. das zweite Asp des DD-Motivs wurde zur Erzeugung einer dominant/negativen Proteinvariante in ein Alanin umgewandelt). Dadurch wurde auch eine MluI-Stelle erzeugt. Auch das Oligonucleotid
EMI340.4
wurde bei einer in vitro-Mutagenese zur Umwandlung des Initiationscodons ATG der hTRT-codierenden Sequenz in eine "Kozak-Consensus"-Sequenz verwendet und zur Erzeugung von EcoRI und BglII-Stellen für die Clonierung. Auch COD2866 wurde zur Umwandlung von AmpS zu AmpR (Ampicillin-Resistenz) verwendet und COD1941 zur Umwandlung von CatR (Chloramphenicol-Resistenz) zu CatS (Chloramphenicol-Empfindlichkeit).
pGRN131
Das EcoRI-Fragment von pGRN128, das die hTRT-ORF mit einer "Kozak"-Sequenz und "IBI Flag" (IBI, New Haven, CT)-Mutationen enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212, so dass der hTRT-ORF von dem MPSV-Promotor exprimiert wird.
pGRN132
Das EcoRI-Fragment von pGRN128, das den hTRT-ORF mit einer "Kozak"-Sequenz und "IBI Flag" (IBI, New Haven, CT)-Mutationen enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212, so dass die "antisense"-Sequenz des hTRT-ORF vom MPSV-Promotor exprimiert wird.
pGRN133
Das EcoRI-Fragment von pGRN121, das die hTRT-codierende Sequenz enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212, so dass das hTRT-Protein unter der Kontrolle des MPSV-Promotors exprimiert wird.
pGRN134
Das EcoRI-Fragment von pGRN121, das die hTRT-codierende Sequenz enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212, so dass die "antisense"-Sequenz der hTRT codierenden Sequenz unter der Kontrolle des MPSV-Promotors exprimiert wird. Die mit diesem Vektor verwendeten selektierbaren Marker sind Chlor/HygB/PAC.
pGRN135
pGRN126 wurde vollständig mit MscI und SmaI geschnitten und zur Deletion von mehr als 95% der inserierten hTRT codierenden Sequenz erneut ligiert. Ein SmaI-MscI-Fragment wurde während dieses Prozesses erneut inseriert, um so für die Selektion die Cat-Aktivität wieder zu erzeugen. Dieses ungereinigte Plasmid wurde dann erneut mit SalI und EcoRI geschnitten und das das Initiationscodon der hTRT codierenden Sequenz enthaltende Fragment in die SalI-EcoRI-Stellen von pBBS212 inseriert. Danach entstand ein "antisense"-Expressionsplasmid, das die "antisense"-Sequenz des 5 min -UTR und von 73 Basen der codierenden Sequenz exprimiert. Die mit diesem Vektor verwendbaren selektierbaren Marker sind Chlor/HygB/PAC.
pGRN136
Das HindIII-SalI-Fragment von pGRN126, das die hTRT codierende Sequenz enthält, inseriert in die HindIII-SalI-Stellen von pBBS242.
pGRN137
Das SalI-Sse8387I-Fragment von pGRN130, das die "Kozak"-Sequenz enthält, inseriert in die SalI-Sse8387I-Stellen von pGRN136.
pGRN138
Das EcoRI-Fragment von pGRN124, das hTRT ohne den 3 min -UTR enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pEGFP-C2, so dass die Orientierung von hTRT dieselbe ist wie für die EGFP-Domäne.
pGRN139
Das Oligonucleotid
EMI343.1
wurde zur Insertion des "IBI Flag" (IBI, New Haven, CT) am C-Terminus von hTRT in pGRN125 mittels in-vitro-Mutagenese verwendet und zur Erzeugung von EcoRI- und BglII-Stellen für die Clonierung. Auch COD2866 wurde zur Umwandlung von AmpS zu AmpR (Ampicillin-Resistenz) verwendet und COD1941 zur Umwandlung von CatR (Chloramphenicol-Resistenz) zu Cats (Chloramphenicol-Empfindlichkeit).
pGRN140
Das NcoI-Fragment, das die stromaufwärts gelegene Sequenz von genomischer hTRT und das erste Intron von hTRT von lambdaG55 enthält, inseriert in die NcoI-Stelle von pBBS167. Das Fragment ist so orientiert, dass hTRT sich in derselben Richtung befindet wie der lac-Promotor.
pGRN141
Das NcoI-Fragment, das die stromaufwärts gelegenen Sequenzen der genomischen hTRT und das erste Intron von hTRT von lambdaG55 enthält, inseriert in die NcoI-Stelle von pBBS167. Dieses Fragment ist so orientiert, dass hTRT im Vergleich zu dem lac-Promotor in der gegenläufigen Richtung ist.
pGRN142
Das NotI-Fragment vom lambdaG45, das die vollständige genomische &tilde& 15 kbp-Insertion, einschliesslich des hTRTGenpromotorbereichs enthält, wurde in die NotI-Stelle von Plasmid pBBS185 inseriert. Das Fragment ist so orientiert, dass der hTRT-ORF sich in einer zu dem lac-Promotor gegensätzlichen Orientierung befindet.
pGRN143
Das NotI-Fragment vom lambdaG45, das die vollständige genomische &tilde& 15 kbp-Insertion, einschliesslich des hTRTGenpromotorbereichs enthält, wurde in die NotI-Stelle von Plasmid pBBS185 inseriert. Das Fragment ist so orientiert, dass der hTRT-ORF sich in einer zu dem lac-Promotor selben Orientierung befindet.
pGRN144
SalI-Deletion von pGRN140 zur Entfernung von lambda-Sequenzen.
pGRN145
Dieser Vektor wurde zur Expression von hTRT-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Das EcoRI-Fragment von pGRN137, das die hTRT-codierende Sequenz enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212 zur Entfernung des Anteils der Sequenz, der dem 5 min -UTR von hTRT-mRNA entspricht. Die hTRT codierende Sequenz ist so orientiert, dass sie unter der Kontrolle des MPSV-Promotors exprimiert wird. Die mit diesem Vektor verwendeten selektierbaren Marker sind Chlor/HygB/PAC.
pGRN146
Dieser Vektor wurde für die Expression von hTRT-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Das Sse8387I-NotI-Fragment von pGRN130, das die D869A-Mutation von hTRT enthält, inseriert in die Sse8387I-NotI-Stellen von pGRN137. Die mit diesem Vektor verwendeten selektierbaren Marker sind Ampicillin/HygB/PAC.
pGRN147
Das Sse8387I-NotI-Fragment von pGRN139, das das "IBI Flag" (IBI, New Haven, CT) enthält, inseriert in die Sse8387I-NotI-Stellen von pGRN137.
pGRN148
Das BglII-Eco47III-Fragment von pGRN144, das den Promotorbereich von hTRT enthält, inseriert in BglII-NruI-Stellen von pSEAP2, wobei ein hTRT-Promotor/Reporter-Konstrukt entstand.
pGRN149
Dieser Vektor ist ein Zwischenvektor für die Konstruktion eines Expressionsvektors für ein hTRT-Fusionsprotein. Das mutagene Oligonucleotid
3 min wurde zur Anfügung einer Csp45I-Stelle an den C-Terminus von hTRT durch in vitro-Mutagenese von pGRN125 verwendet. Das "Stop"-Codon von hTRT wurde deletiert und gegen eine Csp451-Stelle ausgetauscht.
Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Ampicillin.
pGRN150
Das GblII-FspI-Fragment von pGRN144, das den Promotorbereich von hTRT enthält, inseriert in die BglII-NruI-Stellen von pSEAP2, wodurch ein hTRT-Promotor/Reporter-Konstrukt entstand.
pGRN151
Dieser Vektor wurde zur Expression von hTRT-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Das EcoRI-Fragment von pGRN147, das die hTRT codierende Sequenz enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212, um so den Anteil der Sequenz zu entfernen, der dem 5 min -UTR der hTRT-mRNA entspricht. Die hTRT codierende Sequenz ist so orientiert, dass sie unter der Kontrolle des MPSV-Promotors exprimiert wird. Die mit diesem Vektor verwendeten Marker sind Chlor/HygB/PAC.
pGRN152
Das EcoRI-Fragment von pGRN146, das die hTRT codierende Sequenz enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212 zur Entfernung des Anteils der Sequenz, der dem 5 min -UTR von hTRT entspricht. Die hTRT codierende Sequenz ist so orientiert, dass sie unter der Kontrolle des MPSV-Promotors exprimiert wird.
pGRN153
Das StyI-Fragment von pGRN130, das die D869->A-Mutation von hTRT enthält (eine hTRT-Variante codierende Sequenz) wurde in die StyI-Stellen von pGRN158 inseriert, wodurch ein Plasmid erhalten wurde, das die hTRT codierende Sequenz mit einer "Kozak-Consensus"-Sequenz an seinem 5 min -Ende, eine "IBI FLAG"-Sequenz an seinem 3 min -Ende der den C-Terminus codierende Bereich und die D869->A-Mutation enthält.
pGRN154
Das das hTRT-Gen enthaltende EcoRI-Fragment von pGRN153, wurde in die EcoRI-Stelle von Plasmid pBS212 so inseriert, dass der hTRT-ORF sich in derselben Orientierung befindet wie der MPSV-Promotor. Dadurch ensteht ein MPSV-gesteuertes Expressionsplasmid, das das hTRT-Protein mit einer "Kozak-Con sensus"-Sequenz an seinem aminoterminalen Ende eine "IBI FLAG" an seinem C-Terminus und die D869->A-Mutation exprimiert.
pGRN155
Dieser Vektor wurde zur Expression von hTRT-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Die Insertion enthielt cDNA von hTRT in vollständiger Länge ohne 5 min - und 3 min -UTR und "Kozak"-Sequenzen. Das EcoRI-Fragment von pGRN145, das die hTRT-cDNA mit der "Kozak-Consensus"-Sequenz jedoch keine 3 min - oder 5 min -UTR enthält, wurde in die EcoRI-Stelle von p91023(B) inseriert, so dass das hTRT in derselben Orientierung ist wie der DHFR-ORF. Dadurch entsteht ein Expressionsvektor für die transiente Expression von hTRT. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Tetracyclin.
pGRN156
Dieser Vektor wurde zur Expression von hTRT-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Das EcoRI-Fragment von pGRN146, das die D869A-Mutation der hTRT-cDNA mit der "Kozak-Consensus"-Sequenz ohne 3 min - oder 5 min -UTR enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von p91023(B), so dass hTRT in der gleichen Orientierung ist wie der DHFR-ORF. Dadurch entsteht ein Expressionsvektor für die transiente Expression von hTRT. Die Insertion enthielt cDNA von hTRT mit vollständiger Länge ohne 5 min - und 3 min -UTR, D869A und "Kozak"-Sequenzen. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Tetracyclin.
pGRN157
Dieser Vektor wurde für die Expression von hTRT-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Das EcoRI-Fragment von pGRN147, das die hTRT-cDNA mit dem "Kodak flag" am C-Terminus enthält, und die "Kozak-Consensus"-Sequenz ohne 3 min - oder 5 min -UTR, inseriert in die EcoRI-Stelle von p91023(B), so dass hTRT in der gleichen Orientierung ist wie der DHFR-ORF. Dadurch entsteht ein Expressionsvektor für die transiente Expression von hTRT. Die Insertion enthielt cDNA von hTRT mit vollständiger Länge ohne 5 min - und 3 min -UTR eine "FLAG"-Sequenz (Immunex Corp., Seattle, WA) und "Kozak"-Sequenzen. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Tetracyclin.
pGRN158
Dieser Vektor wurde für die Expression und Mutagenese von TRT-Sequenzen in E. coli konstruiert. Das EcoRI-Fragment von pGRN151, das den hTRT-ORF enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS183, so dass der hTRT-ORF im Vergleich zu dem lac-Promotor in der gegenläufigen Orientierung vorliegt. Die Insertion enthielt cDNA von hTRT mit vollständiger Länge ohne 5 min - und 3 min -UTR, eine "FLAG"-Sequenz (Immunex Corp., Seattle, WA) und "Kozak"-Sequenzen. Die codierende Sequenz wird von einem T7-Promotor gesteuert. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Ampicillin.
pGRN159
Dieser Vektor wurde zur Expression und Mutagenese von TRT-Sequenzen in E. coli konstruiert. Das HeI-KpnI-Fragment von pGRN138, das die Fusion von EGFP an hTRT enthält, inseriert in die XbaI-KpnI-Stellen von pBlueScriptIIKS+. Dies ergibt einen T7-Expressionsvektor für das Fusionsprotein (die codierende Sequenz wird von einem T7-Promotor gesteuert). Diese Insertion enthält hTRT-cDNA mit vollständiger Länge ohne den 3 min -UTR als ein Fusionsprotein mit EGFP. Der mit diesem Vektor verwendete selektive Marker ist Ampicillin.
pGRN160
Dieser Vektor wurde zur Expression von "antisense"-hTR-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Die codierende Sequenz wird von einem MPSV-Promotor gesteuert. Das XhoI-NsiI-Fragment von pGRN90, das hTR mit vollständiger Länge enthält inseriert in die SalI-SSE/8387I-Stellen von pBBS295. Dies ergibt einen transienten stabilen Vektor, der hTR in der "antisense"-Orientierung exprimiert. Ein GPT-Marker wurde in den Vektor eingebaut. Die mit diesem Vektor verwendeten selektierbaren Marker sind Chlor/gpt/PAC.
pGRN161
Dieser Vektor wurde zur Expression von "sense"-HT-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Ein XhoI-NsiI-Fragment von pGRN89, das hTR mit vollständiger Länge enthält, inseriert in die SalI-SSE8387I-Stellen von pBBS295. Dies ergibt einen transienten/stabilen Vektor, der hTR in der "sense"-Orientierung exprimiert. Die codierende Sequenz wird von einem MPSV-Promotor gesteuert. Ein GPT-Marker wurde in den Vektor eingebaut. Die mit diesem Vektor verwendeten Marker sind Chlor/gpt/PAC.
pGRN162
Ein XhoI-NsiI-Fragment von pGRN87, das hTR mit vollständiger Länge enthält, inseriert in die SalI-SSE8387I-Stellen von pBBS295. Dies ergibt einen transienten/stabilen Vektor, der verkürzte hTR (von Position +108 bis +435) in der "sense"-Orientierung exprimiert.
pGRN163
Dieser Vektor wurde zur Expression und Mutagenese von TRT-Sequenzen in E. coli konstruiert. Die codierende Sequenz wird von einem T7-Promotor gesteuert. RA45
EMI349.1
wird in einer in vitro-Mutagenese zur Überführung des Initiations-Met in hTRT zu Leu verwendet und zur Einführung einer XhoI-Stelle in den beiden nächsten Codons nach dem Leu. Auch COD 1941 wurde zur Überführung von CatR nach CatS und Einführung einer BSPHI-Stelle verwendet und COD 2866 zur Überführung vom AmpS zu AmpR, wobei eine FspI-Stelle eingeführt wurde. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Ampicillin.
pGRN164
Dieser Vektor wurde für die Expression von hTR-Sequenzen in E. coli konstruiert. Die Primer hTR+1
EMI350.1
wurden zur Amplifikation eines Fragments von pGRN33 mittels PCR verwendet, das hTR mit vollständiger Länge und dem T7-Promotor an seinem 5 min -Ende (wie in hTR+l) enthält. Eine BamHI-HindIII-Spaltung des PCR-Produkts wurde in die BamHI-HindIII-Stellen von pUC119 inseriert. Die codierende Sequenz wird von einem T7-Promotor gesteuert. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Ampicillin.
pGRN165
Dieser Vektor wurde für die Expression und Mutagenese von hTRT-Sequenzen in E. coli verwendet. Die codierende Sequenz wird von einem T7-Promotor gesteuert. Ein EcoRI-Fragment von pGRN145, das den hTRT-orf mit einer "Kozak"-Sequenz am vorderen Ende enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBluescriptIISK+, so dass hTRT in derselben Orientierung vorliegt wie der T7-Promotor. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Ampicillin.
pGRN166
Dieser Vektor wurde zur Expression und Mutagenese von TRTSequenzen in Säugerzellen konstruiert. Die codierende Sequenz wird von einem T7-Promotor gesteuert. Das EcoRI-Fragment von pGRN151, das den hTRT-ORF mit einer "Kozak"-Sequenz am vorderen Ende enthält und ein "IBI flag" am hinteren Ende, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBluescriptIISK<+> so dass hTRT in der gleichen Orientierung vorliegt wie der T7-Promotor. Die Insertion enthielt hTRT-cDNA mit vollständiger Länge ohne 5 min - und 3 min -UTR, eine "FLAG"-Sequenz (Immunex Corp. Seattle, WA) und "Kozak"-Sequenzen. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Ampicillin.
pGRN167
Ein AvrII-StuI-Fragment von pGRN144, das das 5 min -Ende des hTRT-ORF enthält, inseriert in die XbaI-StuI-Stellen von pBES161.
pGRN168
Das die optimierte hTRT-Expressionskassette enthaltende EcoRI-Fragment von pGRN145 wurde in die EcoRI-Stelle von pIND so inseriert, dass die hTRT codierende Sequenz in derselben Orientierung ist wie der miniCMV-Promotor.
pGRN169
Das die optimierte hTRT-Expressionskassette enthaltende EcoRI-Fragment von pGRN145 wurde so in die EcoRI-Stelle von pIND inseriert, dass das hTRT in der umgekehrten Orientierung ist, bezogen auf den miniCMV-Promotor.
pGRN170
Das die optimierte hTRT-Expressionskassette enthaltende EcoRI-Fragment von pGRN145 wurde so in die EcoRI-Stelle von pIND(sp1) inseriert, dass das hTRT in der gegenläufigen Orientierung vorliegt, bezogen auf den miniCMV-Promotor.
pGRN171
Das Eco47II-NarI-Fragment von pGRN163 inseriert in die Eco47111-NarI-Stellen von pGRN167. Damit wird die M1L-Mutation in ein Fragment der genomischen hTRT-DNA eingeführt.
pGRN172
Das BamHI-StuI-Fragment von pGRN171, das in hTRT die Mutation Met zu Leu enthält, inseriert in die BglII-NruI-Stellen von pSEAP2-"Basic".
pGRN173
Das EcoRV-Eco47III-Fragment von pGRN144, das das 5 min -Ende des hTRT-Promotorbereichs enthält, wurde in die SrfI-Eco47III-Stellen von pGRN172 inseriert. Dadurch entstand ein Promotor/Reporter-Plasmid, das den Promotorbereich von hTRT von etwa 2,3 kb stromaufwärts des Starts des hTRT-ORF bis unmittelbar nach dem ersten Intron im codierenden Bereich mit der Met1->Leu-Mutation enthält.
pGTN174
Das die "optimierte" hTRT-Expressionskassette enthaltende EcoRI-Fragment von pGRN145 wurde in die EcoRI-Stelle von pIND(sp1) so inseriert, dass das hTRT dieselbe Orientierung hat wie der miniCMV-Promotor.
Beispiel 7
Rekonstitution von Telomerase-Aktivität
a) Co-Expression von hTRT und hTR in vitro
In diesem Beispiel wird die Co-Expression von hTRT und hTR mittels eines zellfreien in vitro-Expressionssystems beschrieben. Die Ergebnisse zeigen, dass das von pGRN121 codierte hTRT-Polypeptid ein katalytisch aktives Telomerase-Protein codiert, und dass die in vitro-Rekonstitution (IVR) des Telomerase-RNPs unter Verwendung rekombinant exprimierter hTRT und hTR erzielt werden kann.
Telomerase-Aktivität wurde durch Zugabe linearisierter Plasmide mit hTRT (pGRN121; 1 mu g DNA, gespalten mit XbaI) und hTR (pHTR+1; 1 mu g, gespalten mit FspI) zu einem gekoppelten Transpriptions/Translations-Reticulocyten-Lysat (Promega TNT< TM >) rekonstituiert. pHTR+1 ist ein Plasmid, das nach Linearisierung mit FspI und anschliessender Transkription durch T7-RNA-Polymerase ein Transkript mit 445 Nucleotiden erzeugt, das mit dem Nucleotid +1 beginnt und sich bis zu dem Nucleotid 446 von hTR erstreckt (Autexier et al., EMBO J. 15 (1996), 5928). Für eine 50 mu l-Reaktion wurden die folgenden Bestandteile zugegeben: 2 mu gl TNT< TM >-Puffer, 1 mu l TNT< TM >-T7-RNA-Polymerase, 1 mu l 1 mM Aminosäuregemisch, 40 Einheiten Rnasin< TM > RNase-Inhibitor, jeweils 1 mu g linearisierte Matrizen-DNA und 25 mu l TNT< TM >-Reticulocytenlysat.
Die Bestandteile wurden in dem vom Hersteller empfohlenen Verhältnis zugefügt und 90 Minuten bei 30 DEG C inkubiert. Die Transkription wurde durch den T7-Promotor gesteuert und sie konnte auch vor der Zugabe von Reticulocytenlysat mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt werden. Nach der Inkubation wurden 5 und 10 mu l der programmierten Transkriptions/Translations-Reaktion hinsichtlich Telomerase-Aktivität mittels des vorstehend beschriebenen TRAP-Assays (Autexier et al., a.a.O.) unter Ver wendung von 20 PCR-Cyclen zur Signalamplifikation untersucht.
Die Ergebnisse der Rekonstitution sind in Fig. 10 gezeigt. Für jede Transkriptions-Translations-Reaktion gibt es drei Spuren. Die ersten zwei Spuren sind Duplikat-Assays und die dritte Spur ist eine zum Ausschluss PCR-erzeugter Artefacte vor der TRAP-Phase hitzedenaturierte (95 DEG C, 5 Minuten) Duplikatprobe.
Wie in Fig. 10 gezeigt, hat das Reticulocytenlysat keine nachweisbare Telomerase-Aktivität (Spur 6). In ähnlicher Weise wird keine nachweisbare Aktivität beobachtet, wenn entweder hTR allein (Spur 1) oder das hTRT-Gen mit vollständiger Länge (Spur 4) zu dem Lysat gegeben werden. Wenn beide Komponenten zugegeben werden (Spur 2), wird Telomerase-Aktivität erzeugt, wie dies anhand des charakteristischen Musters von Wiederholungsleitern gezeigt wird. Wenn der carboxyterminale Bereich des hTRT-Gens durch Spaltung des Vektors mit NcoI entfernt wird ("verkürztes hTRT") wird Telomerase-Aktivität aufgehoben (Spur 3). Spur 5 zeigt, dass die Translation der verkürzten hTRT allein keine Telomerase-Aktivität erzeugt.
Spur "R8" zeigt eine positive Kontrolle für eine Telomerase-Produktleiter, die durch "TRAP" von TSR8 (einem synthetischen Telomerase-Produkt mit einer Nucleotidsequenz des Standards für Quantifizierung) erzeugt wird
EMI354.1
B) Mischen von hTRT und hTR in vitro
Die in vitro-Rekonstitution von Telomerase-Aktivität wurde auch durch Vermischen erzielt. hTRT wurde, wie vorstehend beschrieben, transkribiert und translatiert, jedoch ohne die Zugabe des hTR-Plasmids. Die Rekonstitution des TelomeraseRNP wurde dann durch Vermischen des hTRT-Translationsgemisches mit hTR (vorher durch die Transkription mit T7-RNA-Polymerase von phTR+1-Fsp erzeugt) im Verhältnis von 2 Al hTRT-Translationsgemisch zu 2 mu l hTR (1 mu g) und anschliessen der 90minütiger Inkubation bei 30 DEG C erzielt. Dieses Verfahren der hTRT-hTR-Rekonstitution wird als "verbundene Rekonstitution" oder "verbundene IVR" bezeichnet. In diesem Gemisch ist Telomerase-Aktivität vorhanden (d.h. kann nachgewiesen werden). Ein verbessertes Signal wurde nach partieller Reinigung der Aktivität durch DEAE-Chromatographie beobachtet.
In diesem Fall wurde eine "Millipore Ultrafree- MC DEAE Zentralfilter"-Vorrichtungen gemäss Standardverfahren (d.h. gemäss den Anweisungen des Herstellers) verwendet. Die verwendeten Puffer waren: hypo0.1, hypo0.2 und hypo1.0, wobei hypo 20 mM Hepes-KOH, pH-Wert 7,9, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10% Glycerin, 0,1% NP-40, 1 mM DTT, 1 mM Natriummetabisulfit, 1 mM Benzamidin und 0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) ist und wobei sich 0.1, 0.2 und 1.0 auf 0,1, 0,2 oder 1,0 M KCl beziehen. Die Filter wurden mit hpyo1.0 vorkonditioniert, mit hypo0.1 gewaschen, danach wurde die rekonstituierte Telomerase aufgeladen, die Säule mit hypoo.1 und im Anschluss daran hypo0.2 gewaschen und die rekonstituierte Telomerase wurde mit hypo 1.0 mit dem halben Volumen im Vergleich zu dem Aufladvolumen eluiert.
Diese Zubereitung konnte bei -70 DEG C in gefrorenem Zustand aufbewahrt werden und sie behält Aktivität.
Telomerase-Aktivität wurde in einem zweistufigen Verfahren untersucht. Im ersten Schritt wurde ein üblicher TelomeraseAssay wie von Morin, Cell 59 (1989), 521 beschrieben durchgeführt, ausser dass keine radioaktive Markierung verwendet wurde. Bei dem zweiten Schritt wurde ein Aliquot mittels des "TRAP"-Verfahrens für 20 bis 30 Cyclen (wie vorstehend beschrieben) untersucht. Der übliche Telomerase-Assay wurde so durchgeführt, dass 1 bis 10 mu l rekonstituierte Telomerase untersucht wurden in 25 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3, 50 mM Kaliumacetat, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 2 mM DATP, 2 mM TTP, 10 mu M dGTP und 1 mu M Primer (üblicherweise M2, AATCCGTCGAGCAGAGTT) in einem Endvolumen von 40 bis 50 mu l bei 30 DEG C und für 60 bis 180 Minuten.
Die Reaktion wurde durch 5minütiges Erhitzen auf 95 DEG C gestoppt und mit 1-10 mu l des Gemisches des ersten Schritts wurde der zweite Schritt, die "TRAP"-Reaktion (50 mu l) durchgeführt.
In zusätzlichen Experimenten wurde die Synthese von hTRT und hTR während einer in vitro-Rekonstitution anhand des Einbaus von 35S-Methionin bzw. Northern blotting überwacht. Proteine mit etwa der vorhergesagten Grösse wurden für hTRT (127 kD), hTRT-Nco (85 kD) und pro90hTRT (90 kD) in etwa äquimolaren Mengen (relativ zueinander) synthetisiert. Die Northern-Analyse zeigte, dass die hTR-Synthese die korrekte Grösse (445 Nucleotide) aufwies und vorherrschend intakt war.
Für den Fachmann sind Variationen des oben beschriebenen Rekonstitutionsprotokolls offensichtlich. Beispielsweise können folgende Parameter variiert werden: Rekonstitutionszeit und Temperatur, das Vorhandensein oder die Konzentration von Bestandteilen wie monovalente Salze (z.B. NaCl, KCl, Kaliumacetat, Kaliumglutamat etc.), divalente Salze (MgCl2, MnCl2, MgSO4, etc.), Denaturierungsmittel (Harnstoff, Formamid etc.), Detergenzien (NP-40, Tween, CHAPS, etc.). Es können auch alternative verbesserte Reinigungsverfahren (z.B. Immunpräzipitation, Affinitätschromatographie oder Standardchromatographie) angewandt werden. Diese und andere Parameter können auf systematische Weise variiert werden, um so die Bedingungen für bestimmte Assays oder andere Rekonstitutionsprotokolle zu optimieren.
C) Die Rekonstitution mittels hTRT-Varianten und Fusionsproteinen
Rekonstitution von katalytischer Telomerase-Aktivität trat auf, wenn EGFP-hTRT eine Fusion des "enhanced green fluorescent-Protein an hTRT (siehe Beispiel 15) oder "Epitop-tagged" hTRT (IBI FLAG, siehe Beispiels 6) mit hTR coexprimiert wurden, wobei beide Telomerase-Aktivität auf ungefähr Wildtyp-Spiegel rekonstituierten.
Im Gegensatz dazu wurde Telomerase-Aktivität nicht rekonstituiert, wenn die hTRT-Variante pro90hTRT (der die RT-Motive B min , C, D und E fehlen) verwendet wurde. Dies zeigt, dass pro90hTRT keine katalytische Telomerase-Aktivität besitzt, wobei diese andere Aktivitäten besitzen könnte (z.B. die Fähigkeit zur RNA (d.h. hTR)-Bindung und sie könnte auch als dominant-negativer Regulator von Telomerase in vivo, wie vorstehend beschrieben, wirken.
D) Die Untersuchung von in vitro-rekonstituierter Telomerase-Aktivität mittels des Gel-Blots und des üblichen Telomerase-Assays
Das folgende Beispiel zeigt, dass in vitro-rekonstituierte Telomerase (IVR) zusätzlich zu auf Amplifikation basierenden Assays, (d.h. TRAP) mittels üblicher Telomerase-Assays untersucht werden kann. Telomerase wurde in vitro rekonstituiert (IVR) wie in Teil (B) vostehend beschrieben (das "verbundene Rekonstitutions"-Verfahren) wonach sich eine DEAE-Reinigung, wie vorstehend beschrieben, anschloss. Die IVR-Telomerase wurde mittels des Gel-Blot-Assays unter den folgenden Reaktionsbedingungen untersucht: 1 bis 10 mu l IVR-Telomerase in 25 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3, 50 mM Kaliumacetat, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 0,8 mM dATP, 0,8 mM TTP, 1,0 mM dGTP und 1 mu M Primer (M2, AATCCGTCGAGCAGAGTT; oder H3.03, TTAGGGTTAGGGTTAGGG) für 180 Minuten bei 30 DEG C und einem Endvolumen von 40 mu l.
Die synthetisierte Telomer-DNA wurde anhand von Standard-Verfahren isoliert, auf einem Gel mit 8%igem Polyacrylamid und 8 M Harnstoff aufgetrennt, auf eine Nylon-Membran transferiert und unter Verwendung der in dem Dot-Blot-Assay verwendeten <3><2>P-(CCCTAA)n-Ribonucleotidsonde abgesucht. Mittels dieser Sonde konnte eine Leiter von sechs Nucleotiden in der Spur identifiziert werden, die 10 mu l IVR-Telomerase repräsentiert, was äquivalent war zu der Leiter, die für 5 mu l nativer nucleärer, mit "mono Q" und Heparinchromatographie gereinigter Telomerase beobachtet wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass IVR-Telomerase äquivalent zu nativer Telomerase eine prozessive katalytische Telomerase-Aktivität aufweist.
Die IVR-Telomerase ("verbundene Rekonstitution") wurde auch anhand des üblichen, auf dem Einbau von <3><2>P-dGTP basierenden Telomerase-Assays untersucht. Die so rekonstituierte Telomerase, die danach über DEAE-Reinigung, wie vorstehend beschrieben, gereinigt wurde, wurde sowohl unter prozessiven als auch nicht-prozessiven Reaktionsbedingungen untersucht. Die Assay-Bedingungen waren: 5-10 mu l rekonstituierte Telomerase ("verbundene Rekonstitution") in 25 mM Tris-HCl, pHWert 8,3, 50 mM Kaliumacetat, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 2 mM dATP, 2 mM TTP mit 10 mu M <3><2>P-dGTP (72 Ci/mMol) (für den Assay hinsichtlich prozessiver Bedingungen) oder 1 mu M <3><2>P-dGTP (720 Ci/mMol) (für nicht-prozessive Bedingungen) und 1 mu M Primer (d.h.
H3.03 TTAGGGTTAGGGTTAGGG) bei 30 DEG C (für die prozessive Reaktion) oder 37 DEG C für die nicht-prozessive Reaktion für 180 Minuten in einem Endvolumen von 40 mu l. Die synthetisierte Telomer-DNA wurde mittels Standardverfahren isoliert und auf einem Sequenzierungsgel mit 8%igem Polyacrylamid und 8 M Harnstoff aufgetrennt.
Die prozessive Reaktion zeigte eine schwächere Leiter von sechs Nucleotiden, was mit einer prozessiven Telomerase-Reaktion übereinstimmt und bei der nicht-prozessiven Reaktion wurde eine Wiederholungseinheit hinzugefügt, ein Muster, das äquivalent zu der Kontrollreaktion mit einer Präparation nativer Telomerase ist. Übliche Assays unter Verwendung von Telomerase "verbundene Rekonstitution" sind bei der Suche nach Telomerase-Modulatoren, wie hier beschrieben, nützlich, sowie auch bei anderen Anwendungen, wie beispielsweise der Aufklärung von strukturellen und funktionellen Eigenschaften von Telomerase.
E) In vitro rekonstituierte Telomerase erkennt 3 min -Enden von Primern
Dieses Experiment zeigt, dass durch "verbundene Rekonstitution" hergestellte Telomerase 3 min -Enden von Primern erkennt, äquivalent zu nativer (gereinigter) Telomerase. Telomerase bildet eine Basen-gepaarte Duplex zwischen dem 3 min -Ende eines Primers und dem Matrizenbereich von hTR und fügt das nächste vorgesehene Nucleotid an (Morin, 1989, a.a.O.). Um zu verifizieren, dass (rekombinante) IVR-Telomerase ("verbundene Rekonstitution") die gleiche Eigenschaft aufweist, wurden die Reaktionen von Primern mit ---GGG oder ---TAG-3 min -Enden (AATCCGTCGAGCAGAGGG bzw.
AATCCGTCGAGCAGATAG) mit einem Primer verglichen mit einem ---GTT 3 min -Terminus (M2;
AATCCGTCGAGCAGAGTT; der Standard-"TRAP"-Primer), wobei in vitro rekonstituierte und native Telomerase verwendet wurden, die durch den Zwei-Stufen Assay (üblich/TRAP), der vorstehend ausführlich beschrieben wurde, untersucht wurden.
Die Produktleitern der Primer ---GGG und ---TAG verschoben sich um +4 bzw. +2 im Vergleich zu dem Standardprimer (--GTT 3 min -Ende); derselbe Effekt wurde mit nativer Telomerase beobachtet. Dieses Experiment zeigt, dass in vitro-rekonstituierte ("verbundene Rekonstitution") und native Telomerase Primerenden auf die gleiche Weise erkennen.
Diese Ergebnisse (zusammen mit den vorstehenden Ergebnissen, die zeigen, dass IVR-Telomerase sowohl prozessive als auch nicht-prozessive katalytische Aktivität besitzt) zeigen an, dass IVR-Telomerase eine ähnliche Struktur und ähnliche Eigenschaften im Vergleich zu nativer oder gereinigter Telomerase besitzt.
Beispiel 8
Herstellung von Anti-hTRT-Antikörpern
A) Die Herstellung von anti-hTRT-Antikörpern gegen hTRT-Peptide
Zur Herstellung von anti-hTRT-Antikörpern wurden die folgenden Peptide von hTRT mit der Hinzufügung von C (Cystein) als der Amino-terminale Rest (siehe Fig. 54) synthetisiert:
EMI360.1
Die Cystein-Einheit wurde zur Immobilisierung (d.h. kovalente Verknüpfung) der Peptide an BSA- und KLH- ("Keyhole limpet" Hämocyanin)-Trägerproteine verwendet. Die KLH-Peptide wurden als Antigen verwendet. Die BSA-Peptidkonjugate dienten als Material für ELISAs zum Testen der Spezifität von Immunantiseren.
Die KLH-Peptidkonjugate wurden in "New Zealand White"-Kaninchen injiziert. Die einleitenden Injektionen wurden proximal zu den Lymphknoten der Achselhöhle und der Leisten verabreicht. Nachfolgende Injektionen wurden intramuskulär gegeben. Für einleitende Injektionen war das Antigen mit vollständigem Freund'schen Adjuvans emulgiert, für nachfolgende Injektionen wurde unvollständiges Freund'sches Adjuvans verwendet. Bei den Kaninchen folgte ein Auffrischungs-Impfcyclus von 3 Wochen, wobei 50 ml Blut, die 20 bis 25 ml Serum lieferten, 10 Tage nach jeder Auffrischungsimpfung entnommen wurden. Antiseren gegen jedes der vier Peptide erkannten die hTRT-Einheit von rekombinantem hTRT-Fusionsprotein (GST-HIS8-hTRT-Fragment 2426 bis 3274) auf WesternBlots (siehe Beispiel 6).
Unter Verwendung einer partiell gereinigten Telomerase-Fraktion von menschlichen 293-Zellen (eine etwa 1000fache Reinigung im Vergleich zum nucleären Rohextrakt), die gemäss der Beschreibung in der parallelen US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/833,37 (siehe auch PCT-Anmeldung Nr. 97/06012) hergestellt und mit anti-S-2-Antikörpern affinitätsgereinigt worden war, konnte auf einem Western-Blot eine 130 kD-Proteindublette nachgewiesen werden. Es wurde ein empfindliches Chemilumineszenz-Nachweisverfahren angewandt ("SuperSignal"-Chemilumineszenzsubstrate, Pierce), das Signal auf dem Blot war jedoch schwach, was darauf hindeutet, dass hTRT in diesen unsterblichen Zellen in geringer oder sehr geringer Häufigkeit vorhanden ist. Das Auftreten einer Dublette ist konsistent mit einer posttranslationalen Modifizierung von hTRT, d.h. Phosphorylierung oder Glykosylierung.
Zur Affinitätsreinigung wurde das S-2-Peptid an "SulfoLink" (Pierce, Rockford, IL) über seinen N-terminalen Cysteinrest gemäss dem Protokoll des Herstellers immobilisiert. Erstes Blutserum von einem mit dem KLH-S-2-Peptid an die genimmunisierten Kaninchen wurde über eine S-2-"SulfoLink" geladen und spezifisch an das S-2-Peptid gebundene Antikörper wurden eluiert.
B) Herstellung von anti-hTRT-Antikörpern gegen hTRT-Fusionsproteine
GST-hTRT-Fusionsproteine wurden in E. coli als das GST-hTRT-Fragment #4 (Nucleotide 3272-4177) und das GST-His8-hTRTFragment #3 (Nucleotide 2426 bis 3274), wie in Beispiel 6 beschrieben, exprimiert. Die Fusionsproteine wurde als unlösliches Protein gereinigt und die Reinheit des Antigens wurde über SDS-Polyacrylamidgele untersucht und auf etwa 75% Reinheit bezüglich des rekombinanten Proteins GST-hTRTFragment #4 und über 75% Reinheit für das rekombinante Protein GST-His8-hTRT-Fragment #3 geschätzt. (Routineverfahren können zur Gewinnung dieser und anderer Fusionsproteine mit einer Reinheit über 90% verwendet werden). Diese rekombinanten Proteine wurden zur Immunisierung sowohl von "New Zealand White"-Kaninchen als auch weiblichen Balb/c-Mäusen verwendet.
Für einleitende Injektionen wurde das Antigen mit vollständigen Freund'schem Adjuvans emulgiert, für nachfolgende Injektionen wurde unvollständiges Freund'sches Adjuvans verwendet. Für die Kaninchen und Mäuse erfolgte ein 3-wöchiger Auffrischungsimpfcyclus, wobei Blut 10 Tage nach jeder Auffrischungsimpfung entnommen wurde.
Die erste und zweite Blutentnahme sowohl von den Mäusen als auch den Kaninchen wurde hinsichtlich der Anwesenheit von anti-hTRT-Antikörpern nach Entfernung von anti-GST-Antikörpern unter Verwendung einer immobilisiertes GST enthaltenden Matrix getestet. Die Antiseren wurden auf anti-hTRT-Antikörpern durch Western-Blots unter Verwendung eines immobilisierten rekombinanten GST-hTRT-Fusionsproteins getestet und mittels Immunpräzipitation unter Verwendung des partiell gereinigten nativen Telomeraseenzyms. Bei diesen frühen Blutentnahmen konnte kein Signal beobachtet werden; es wird davon ausgegangen, dass sich die Titer von anti-hTRT-Antikörpern bei nachfolgenden Blutentnahmen erhöhen.
Beispiel 9
Nachweis einer HTRT-MRNA die der RNA der DELTA 182-Variante entspricht
Poly-A<+>-RNA von menschlichen Hoden und der 293-Zellinie wurde hinsichtlich hTRT-mRNA mittels RT-PCR und "nested"-Primern analysiert. Der erste Primersatz war TCP1.1 und TCP1.15, der zweite Primersatz TCP1.14 und billTCP6. Die Amplifikation mit beiden Primersätzen ergab zwei Produkte, die sich um 182 bp unterschieden. Die grösseren und kleineren Produkte von RNA aus Hoden wurde sequenziert und es stellte sich heraus, dass sie genau pGRN121 (Fig. 16) bzw. dem Clon 712562 (Fig. 18) entsprachen. Das hTRT-RNA-Produkt der Variante wurde in mRNA von SW39i, OVCAR4, 293 und Hoden beobachtet.
Zusätzliche Experimente wurden durchgeführt, um zu zeigen, dass die DELTA 182 cDNA nicht ein Artefact der reversen Transkription war. Kurz zusammengefasst, hTRT-RNA (d.h. ohne Deletion) wurde durch in vitro-Transkription von pGRN121 zur Verwendung als Matrize für RT-PCR hergestellt. Getrennt davon wurden cDNA-Synthese-Reaktionen mittels der "Superscript< TM >" reverser Transkriptase (Bethesda Research Laboratories, Bethesda MD) bei 42 DEG C oder 50 DEG C mit Zufallsprimern oder einem spezifischen Primer durchgeführt. Nach 15 PCR-Cyclen war das längere Produkt nachweisbar, jedoch nicht das kleinere Produkt (d.h. das der Deletion entsprechende, selbst nicht nach 30 oder mehr Cyclen. Dieses zeigt an, dass das RTPCR-Produkt kein Artefact ist.
Beispiel 10
Sequenzierung von Hoden-hTRT-mRNA
Die Sequenz der in Hoden vorzufindenden Form von hTRT-RNA wurde durch direkte Manuell-Sequenzierung von DNA-Fragmenten bestimmt, die mittels PCR von Hoden-cDNA ("Marathon"-Hoden- cDNA, Clontech, San Diego, CA) unter Verwendung eines "ThermoSequenase radiolabeled terminator cycle"-Sequenzierungskits (Amersham Life Science) erzeugt. Die PCR-Reaktionen wurden mittels "nested"-PCR, wie in Tabelle 7 gezeigt, durchgeführt, soweit nicht anders angegeben. In allen Fällen wurde eine negative Kontrollreaktion mit Primern, jedoch ohne cDNA durchgeführt. Das Fehlen eines Produkts in der Kontrollreaktion zeigte, dass die von der Reaktion mit cDNA stammenden Produkte nicht aufgrund einer Kontamination mit hTRT von pGRN121 oder anderen Zellquellen (z.B. 293-Zellen) vorhanden waren. Die DNA-Fragmente wurden zur Reinigung der DNA vor der Sequenzierung aus Agarosegelen ausgeschnitten.
Die Sequenz der Hoden-mRNA, die den Basen 27 bis 3553 der Insertionssequenz von pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) entspricht und den gesamten hTRT-ORF (Basen S6 bis 3451) wurde erhalten. In diesem Bereich zeigten sich keine Unterschiede zwischen den Hoden- und pGRN121-Sequenzen.
EMI365.1
Beispiel 11
Nachweis von hTRT-mRNA durch RNase-Schutzreaktion
RNase-Schutzassays können zum Nachweis, zur Überwachung oder zur Diagnose hinsichtlich der Anwesenheit einer hTRT-mRNA oder der mRNA einer Variante verwendet werden. Eine veranschaulichende Sonde für einen solchen Assay ist eine in vitro-synthetisierte RNA, die Sequenzen umfasst, die komplementär zu hTRT-mRNA-Sequenzen sind, und zusätzliche, nicht komplementäre Sequenzen. Die letzteren Sequenzen sind deshalb von Vorteil, um die Sonde mit vollständiger Länge von dem Fragment der Sonde unterscheiden zu können, das von einem positiven Ergebnis in dem Assay herrührt. In einem positiven Assay werden die komplementären Sequenzen der Sonde vor einer Spaltung mit RNase geschützt, da sie mit der hTRTmRNA hybridisiert sind. Die nicht-komplementären Sequenzen werden von der Sonde in Gegenwart von RNase und komplementärer Zielnucleinsäure abgespalten.
Zwei Sonden für die RNase-Schutzassays sind zur Veranschaulichung beschrieben, wobei jede in dem Assay verwendet werden kann. Die Sonden unterscheiden sich in ihren zu hTRT komplementären Sequenzen, enthalten jedoch identische nichtkomplementäre Sequenzen, die in dieser Ausführungsform von der späten Leadersequenz der mRNA von SV40 stammen. In 5 min -3 min -Richtung umfasst die erste Sonde 33 Nucleotide einer nicht-komplementären Sequenz und 194 Nucleotide einer Sequenz, die komplementär zu den hTRT-Nucleotiden 2513 bis 2707 ist für eine Grösse der Sonde mit vollständiger Länge von 227 Nucleotiden. In 5 min -3 min -Richtung umfasst die zweite Sonde 33 Nucleotide einer nicht komplementären Sequenz und 198 Nucleotide einer Sequenz, die komplementär zu den hTRT-Nucleotiden 2837 bis 3035 ist für eine Grösse der Sonde mit vollständiger Länge von 231 Nucleotiden.
Zur Durchführung des Assays kann jede der beiden Sonden mit RNA d.h. PolyA<+>-RNA von einer Testprobe hybridisiert werden und im Anschluss daran werden T1-Ribonuclease und RNase A zugegeben. Nach der Spaltung wird die Sonden-RNA gereinigt und durch Gelelektrophorese analysiert. Der Nachweis eines 194 Nucleotide langen Fragments der Nucleotidsonde mit einer Länge von 227 Nucleotiden oder eines 198 Nucleotide langen Fragments der Sonde mit einer Länge von 231 Nucleotiden ist ein Zeichen für die Anwesenheit von hTRT-mRNA in der Probe.
Die in diesem Beispiel beschriebenen veranschaulichenden Sonden für den RNase-Schutzassay können durch in vitro-Transkription mittels T7-RNA-Polymerase erzeugt werden. Radioaktive oder anderweitig markierte Ribonucleotide können für die Synthese von markierten Sonden eingeschlossen werden. Die Matrizen für die in vitro-Transkriptionsreaktion zur Herstellung der RNA-Sonden sind PCR-Produkte. Diese illustrativen Sonden können nach PCR-Amplifikation von pGRN121-DNA mittels Primern, die den entsprechenden komplementären Bereich des hTRT-Gens oder der hTRT-mRNA umspannen, mit T7-Polymerase synthetisiert werden. Ausserdem enthält der Stromabwärts-Primer T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenzen und die nicht-komplementären Sequenzen.
Für die Erzeugung der ersten Sonde für den RNase-Schutzassay wird das PCR-Produkt von dem folgenden Primer-Paar T701 und reverse 01) verwendet:
EMI367.1
und reverse 01
EMI367.2
Zur Erzeugung der zweiten Sonde für den RNase-Schutzassay wird das PCR-Produkt von dem folgenden Primerpaar (T702 und reverse 02) verwendet:
EMI367.3
und reverse 02
EMI368.1
Beispiel 12
Konstruktion eines phylogenetischen Stammbaums durch Vergleich von hTRT mit anderen reversen Transkriptasen
Ein phylogenetischer Stammbaum (Fig. 6) wurde durch Vergleich der sieben von Xiong und Eickbush (EMBO J. 9 (1990), 3353) RT-Domänen konstruiert. Nach Sequenzausrichtung der Motive 1, 2 und A-E von 4 TRTs, 67 RTs und 3 RNA-Polymerasen wurde der Stammbaum unter Verwendung des "NJ ("Neighbor joining")-Verfahrens (Saitou und Nei, Mol. Biol. Evol. 4 (1987), 4406) konstruiert. Elemente von der gleichen Klasse, die auf dem gleichen Zweig des Stammbaums lokalisiert sind, sind vereinfacht als Kästchen wiedergegeben. Die Länge jedes Kästchens entspricht dem am meisten divergenten Element innerhalb des Kästchens.
Die TRTs scheinen mit den RTs, die mit msDNA, Gruppe II-Introns und nicht-LTR (lange terminale Wiederholungseinheiten)-Retrotransposons enger verwandt zu sein als mit dem LTR-Retrotransposon und viralen RTs. Die Verwandtschaft der Telomerase-RTs zu dem nicht-LTR-Zweig von Retroelementen ist sehr interessant, geht man davon aus, dass diese letzteren Elemente Telomerase für die Telomer-Beibehaltung in Drosophila ausgetauscht haben. Die auffallendste Beobachtung ist jedoch, dass die TRTs eine diskrete Untergruppe bilden, die mit den RNA-abhängigen RNA-Polymerasen von +-strängigen RNA-Viren, wie beispielsweise Poliovirus, beinahe genau so eng verwandt ist wie mit einem der bereits bekannten RTs.
Wenn man in Erwägung zieht, dass die vier Telomerasegene von evolutionär entfernten Organismen stammen, - Protozoen, Pilze und Säuger - kann diese getrennte Gruppierung nicht durch das Fehlen von phylogenetischer Vielfalt in dem Daten satz erklärt werden. Diese frühzeitige Aufgabelung legt statt dessen nahe, dass die Telomerase-RTs eine sehr alte Gruppe sind, die vielleicht mit dem ersten Eukaryoten entstand.
GenBank-Protein-Identifizierungsnummern oder Zugangsnummern, die für phylogenetische Analyse verwendet wurden, sind:
msDNAs (94535, 134069, 134074, 134075, 134078), Gruppe II Introns (483039, 101880, 1332208, 1334433, 1334435, 133345, 1353081), mitochondriales Plasmid/RTL (903835, 134084), nicht-LTR Retrotransposons (140023, 84806, 103221, 103353, 134083, 435415, 103015, 1335673, 85020, 141475, 106903, 130402, U0551, 903695, 940390, 2055276, L08889), LTR-Retrotransposons (74599, 85105, 130582, 99712, 83589, 84126, 479443, 224319, 130398, 130583, 1335652, 173088, 226407, 101042, 1078824), Hepadnaviren (1 18876, 1706510, 118894), Caulimoviren (331554, 130600, 130593, 93553), Retroviren (130601, 325465, 74601, 130587, 130671, 130607, 130629, 130589, 130631, 1346746, 130651, 130635, 1780973, 130646). Die Ausrichtung wurde mittels "ClustalW 1.5" (J.D. Thompson, D.G. Higgins, T.J.Gibson, Nucleic Acids Res. 22, (1994), 4673) und "PHYLIP.3.5" (J.
Felsenstein, Cladisfics 5 (1989), 164) analysiert.
Beispiel 13
Transfektion von kultivierten menschlichen Fibroblasten (BJ) mit einem Kontrollplasmid und einem hTRT codierenden Plasmid
Dieses Beispiel zeigt, dass die Expression eines rekombinanten hTRT-Proteins in einer Säugerzelle zur Erzeugung einer aktiven Telomerase führt.
Subkonfluente Bi-Fibroblasten wurden trypsinisiert und in frischem Medium (DMEM/199, 10% fötales Kälberserum enthaltend) bei einer Konzentration von 4 x 10<6> Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden mittels Elektroporation mit dem "Gene Pulser<TM>"-Elektroporator von BioRad transfiziert. Gegebenenfalls kann man auch Zellen unter Verwendung des "Superfect<TM>"-Reagenz (Quiagen) gemäss den Anleitungen des Herstellers transfizieren. Für die Elektroporation wurden 500 mu l Zellsuspension in eine Elektroporationsküvette (BioRad, 0,4 cm Elektrodenabstand) gegeben. Plasmid-DNA (2 mu g) wurden zu den Küvetten gegeben und die Suspension vorsichtig gemischt und auf Eis 5 Minuten inkubiert. Das Kontrollplasmid (pBBS212) enthielt keine Insertion hinter dem MPSV-Promotor und das experimentelle Plasmid (pGRN133) exprimierte hTRT vom MPSV-Promotor.
Die Zellen wurden bei 300 V und 960 mu FD einer Elektroporation unterworfen. Nach Abgabe des Impulses wurden die Küvetten vor der Plattierung auf 100 mm-Gewebekulturplatten in Medium etwa 5 Minuten auf Eis gehalten. Nach 6 Stunden wurde das Medium gegen neues Medium ausgetauscht. 72 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert, einmal mit PBS gewaschen, pelletiert und in gefrorenem Zustand bei -80 DEG C aufbewahrt. Zellextrakte wurden bei einer Konzentration von 25 000 Zellen/ mu l durch ein modifiziertes Lyseverfahren mittels Detergentien präpariert (siehe Bodnar et al., Exp.
Cell Res. 228 (1996), 58 und Kim et al., Science 266 (1994) 2011 und die Beschreibung in Patenten und Publikationen, die sich auf den vorstehenden TRAP-Assay beziehen) und Telomerase-Aktivität in den Zellextrakten wurde mittels eines modifizierten auf PCR basierenden TRAP-Assays bestimmt (Kim et al., 1994, Bodnar et al., 1996). Kurz zusammengefasst, 5 x 10<4> Zelläquivalente wurden für den Telomerase-Primer Verlängerungsteil der Reaktion verwendet. Während der Extrakt typischerweise direkt von der Telomerase-Verlängerungsreaktion zu der PCR-Amplifikation gegeben wird, kann man auch einmal mit Phenol/Chloroform und einmal mit Chloroform vor der PCR-Amplifikation extrahieren. Ein Fünftel des Materials wurde in dem PCR-Amplifikationsanteil der TRAP-Reaktion verwendet (etwa 10 000 Zelläquivalente).
Die Hälfte der TRAP-Reaktion wurde zur Analyse auf ein Gel geladen, so dass jede Spur in Fig. 25 Reaktionsprodukte von 5000 Zelläquivalenten repräsentiert. Extrakte von mit pGRN133 transfizierten Zellen waren hinsichtlich Telomerase-Aktivität positiv, während Extrakte von nicht-transfizierten Zellen (nicht gezeigt) oder mit dem Kontrollplasmid transfizierten Zellen keine Telomerase-Aktivität zeigten. Ähnliche Experimente mit RPE-Zellen ergaben das gleiche Ergebnis.
Rekonstitution in BJ-Zellen wurde auch mittels anderer hTRT-Konstrukte durchgeführt (d.h. pGRN145, pGRN155 und pGRN138). Die Rekonstitution unter Verwendung dieser Konstrukte schien zu einer stärkeren Telomerase-Aktivität zu führen im Vergleich zu mit pGRN133 transfizierten Zellen.
Der höchste Spiegel an Telomerase-Aktivität wurde mit pGRN155 erzielt. Wie bereits vorstehend diskutiert ist pGRN155 ein Vektor, der den späten Hauptpromotor von Adenovirus als ein Kontrollelement für die Expression von hTRT enthält und es zeigte sich, dass damit Telomerase-Aktivität rekonstituiert werden konnte bei Transfektion in BJ-Zellen. Bemerkenswerterweise ergab die Rekonstitution unter Verwendung mit dem hTRT-GFP-Fusionsprotein pGRN138 (das im Nucleus lokalisiert wird, siehe das nachstehende Beispiel 15) entweder in vitro (siehe Beispiel 7) oder mit in vivo-Rekonstitutionssystemen (Transfektion in Bi-Zellen), ergab Telomerase-Aktivität. Wenn in BJ-Zellen, wie beispielsweise vorstehend beschrieben, transfiziert wurde, war die Telomerase-Aktivität mit der vergleichbar, die sich aus der Rekonstitution mit pGRN133 oder pGRN145 ergab.
Ähnliche Ergebnisse wurden nach Transfektion von normalen menschlichen pigmenthaltigen retinalen Epithelzellen (RPE) mit den erfindungsgemässen hTRT-Expressionsvektoren erhalten. Es wird davon ausgegangen, dass die Seneszenz von RPE-Zellen zu der Erkrankung der mit dem Alter zusammenhängenden Macula-Degeneration führt oder dazu beiträgt. Gemäss den erfindungsgemässen Verfahren mit den erfindungsgemässen hTRT-Expressionsvektoren behandelte RPE-Zellen sollten eine verzö gerte Seneszenz aufweisen im Vergleich zu unbehandelten Zellen und so von Nutzen sein bei Transplantationstherapien zur Behandlung oder zur Verhinderung der mit dem Alter zusammenhängenden Macula-Degeneration.
Beispiel 14
Promotor-Reporter-Konstrukt
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von Plasmiden, bei denen Reportergene mit stromaufwärts gelegenen hTRT-Sequenzen, die Promotorelemente enthalten, funktionell verknüpft sind. Diese Vektoren weisen zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten auf, wozu die Identifizierung von in cis und trans wirkenden Regulationsfaktoren der Transkription in vivo und das Screening nach Agenzien, die die hTRT-Expression modulieren können (z.B. Aktivierung oder Hemmung) zählen (beispielsweise das Screenen von Wirkstoffen). Es können zwar eine Reihe von Reportergenen verwendet werden (beispielsweise Leuchtkörperchen-Luciferase, beta -Glucuronidase, beta -Galactosidase, Chloramphinicolacetyltransferase und GFP), für einleitende Experimente wurde jedoch die sezernierte menschliche alkalische Phosphatase (SEAP; CloneTech) verwendet.
Das SEAP-Reportergen codiert eine verkürzte Form des Enzym aus Plazenta, dem die Domäne für die Membran-Verankerung fehlt, wodurch die effiziente Sekretion des Proteins aus transfizierten Zellen ermöglicht wird. Es konnte gezeigt werden, dass die Spiegel an SEAP-Aktivität, die in dem Kulturmedium nachgewiesen werden, direkt proportional zu Veränderungen in intrazellulären Konzentrationen von SEAP-mRNA und -Protein sind (Berger et al., Gene 66 (1988), 1 und Cullen et al., Meth. Enzymol 216 (1992), 362).
Vier Konstrukte (pGRN148, pGRN150, "pSEAP2 basic" (keine Promotorsequenz = negative Kontrolle) und "pSEAP2 control" (das den frühen SV40-Promotor und Enhancer enthält) wurden in dreifacher Ausfertigung in sterblichen und unsterblichen Zellen transfiziert.
Plasmid pGRN148 wurde wie in Fig. 9 veranschaulicht konstruiert. Kurz zusammengefasst wurde ein BglII-Eco47III-Fragment von pGRN144 gespalten und in die BglII-NruI-Stelle von pSEAp2Basic (Clontech, San Diego, CA) cloniert. Ein zweiter Reporterpromotor, das Plasmid pGRN150, enthält die Sequenzen von dem in Beispiel 3 beschriebenen hTRT-Intron, um so regulatorische Sequenzen, die in dem Intron vorhanden sein können, verwenden zu können. Das Initiationscodon Met ist zu Leu mutiert, so dass das zweite dem Promotorbereich folgende ATG das Initiations-ATG des SEAP-ORF ist.
Die Konstrukte pGRN148 und pGRN150, die den hTRT-Promotor enthalten, wurden in sterbliche (BJ-Zellen) und unsterbliche (293)-Zellen transfiziert. Alle Transfektionen wurden parallel mit zwei Kontrollplasmiden durchgeführt. Ein Plasmid als negative Kontrolle (pSEAP basic) und ein Plasmid als positive Kontrolle ("pSEAP control", das den frühen SV40-Promotor und den SV4O-Enhancer enthält).
In unsterblichen Zellen scheinen die Konstrukte pGRN148 und pGRN150 die SEAP-Expression genauso effizient zu steuern, wie die positive "pSEAP2 control" (die den frühen SV40-Promotor und -Enhancer enthält). Im Gegensatz dazu ergab in sterblichen Zellen nur die "pSEAP2 control" nachweisbare Aktivität. Diese Ergebnisse zeigen, dass, wie erwartet, hTRT-Promotorsequenzen in Tumorzellen-aktiv sind, jedoch nicht in sterblichen Zellen.
Ähnliche Ergebnisse wurden mit einer weiteren normalen Zellinie (RPE), (pigmenthaltige, retinale Epithelzellinie) erhalten. In RPE-Zellen, die mit pGRN150 (das 2,2 kb an stromaufwärts gelegener genomischer Sequenz enthält) transfiziert sind, war der hTRT-Promotorbereich inaktiv, während das Plasmid "pSEAP2 control" aktiv war.
Wie bereits vorstehend angemerkt, sind Plasmide, bei denen Reportergene zur stromaufwärts gelegenen hTRT-Sequenz, die Promotorelemente enthalten, funktionell verknüpft sind, ausgesprochen nützlich für die Identifizierung und das Screening von Telomerase-Aktivität modulierende Agenzien, wobei sowohl Verfahren der transienten als auch der stabilen Transfektion verwendet werden können. Bei einer Vorgehensweise werden beispielsweise stabile Transformanten von pGRN148 in Telomerase-negativen und Telomerase-positiven Zellen durch Cotransfektion mit einem eukariotischen selektierbaren Marker (wie z.B. neo) gemäss Ausubel et al., 1997, a.a.O.) hergestellt.
Die erhaltenen Zellinien werden dann für das Screenen von vermuteten Telomerase-modulierenden Agenzien verwendet, beispielsweise durch Vergleich der hTRTPromotor-gesteuerten Expression in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung.
Die erfindungsgemässen Promotor-Reporter-Vektoren (und andere) werden auch zur Identifizierung von in trans und in cis wirkenden Regulationselementen für die Transkription und Translation verwendet. Zu den Beispielen für in cis wirkenden regulatorischen Elementen der Transkription zählen Promotoren und Enhancer des Telomerasegens. Die Identifizierung und Isolierung von in cis und in trans wirkenden regulatorischen Agenzien führt zur Bereitstellung weiterer Verfahren und Reagenzien zur Identifizierung von Agenzien, die die Transkription und Translation von Telomerase modulieren.
Beispiel 15
Subzelluläre Lokalisation von hTRT
Ein Fusionsprotein mit hTRT und "enhanced green fluorescent protein" (EGFP; Cormack et al., Gene 173 (1996), 33)-Bereichen wurde wie nachstehend beschrieben konstruiert. Die EGFP-Einheit liefert ein nachweisbares "tag" oder Signal, womit das Vorhandensein oder die Lage des Fusionsproteins leicht bestimmt werden kann. Da EGFP-Fusionsproteine in den korrekten zellulären Kompartimenten lokalisiert sind, kann dieses Konstrukt zur Bestimmung der subzellulären Lage des hTRT-Proteins verwendet werden.
A. Konstruktion von pGRN138
Ein Vektor zur Expression eines hTRT-EGFP-Fusionsproteins in Säugerzellen wurde konstruiert durch Integration der EcoRI-Insertion von pGRN124 (siehe Beispiel 6) in die EcoRI-Stelle von pEGFP-C2 (Clontech, San Diego, CA). Die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins ist nachstehend gezeigt. EGFP-Reste sind in Fettdruck, durch den 5 min -untranslatierten Bereich von hTRT-mRNA codierte Reste sind unterstrichen und die hTRT-Proteinsequenz ist in normaler Schrift angegeben.
EMI375.1
Weitere EGFP-Fusionskonstrukte wurden unter Verwendung einer partiellen (z.B. verkürzten) hTRT codierenden Sequenz hergestellt, und, wie nachstehend beschrieben, zur Identifizierung von Aktivitäten bestimmter Bereiche des hTRT-Polypeptids verwendet.
B. Nucleäre Lokalisierung und Verwendungsmöglichkeiten für DGRN138
Die Transfektion von NIH 293- und BJ-Zellen mit pGRN138 erlaubte die Bestätigung der nucleären Lokalisation von rekombinant exprimierter hTRT. Zellen wurden mit pGRN138 (EGFPhTRT) und einem Kontrollkonstrukt (nur EGFP exprimiert) transfiziert. Die nucleäre Lokalisation der EGFP-hTRT ist in beiden Zelltypen offensichtlich (bestimmt durch Fluoreszenzmikroskopie). Wie bereits vorstehend angemerkt, unterstützt das pGRN138 hTRT-GFP-Fusionsprotein die Rekonstitution von Telomerase-Aktivität sowohl in einem in vitro-Transkriptions/Translationssystem als auch in vivo, wenn es in BJ-Zellen transfiziert wird.
hTRT-EGFP-Fusionsproteine (oder ähnliche nachweisbare Fusionsproteine) werden für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet. Beispielsweise wird das in diesem Beispiel beschriebene Fusionskonstrukt oder ein EGFP-Konstrukt und eine verkürzte Form von hTRT zur Beurteilung der Fähigkeit von hTRT und Varianten, in einen Zellnucleus einzutreten und/oder an die Chromosomenenden anlagern zu können, verwendet. Ausserdem werden stabil oder transient mit pGRN138 transfizierte Zellen für das Screenen nach vermuteten Telomerase-modulierenden Wirkstoffen oder Verbindungen verwendet. Agenzien, die die nucleäre Lokalisation oder Telomer-Lokalisation stören, werden als Telomerase-Inhibitoren identifiziert. Für diesen Zweck sind Tumorzellinien, die EGFP-hTRT stabil exprimieren, verwendet.
Potentielle Modulatoren von Telomerase werden diesen transfizierten Zellen verabreicht und die Lokalisation der EGFP-hTRT kann bewertet werden. Ausserdem werden FACS oder andere auf Fluoreszenz basierende Verfahren verwendet, um hTRT exprimierende Zellen selektieren zu können, womit homogene Populationen für das Screenen von Wirkstoffen bereitgestellt werden, insbesondere wenn die transiente Transfektion von Zellen angewandt wird.
Bei anderen Anwendungen können Bereiche der hTRT zur Identifikation von Bereichen (z.B. Reste 193-196 (PRRR) und Reste 235-240 (PKRRRR)) mutagenisiert werden, die für die nucleäre Lokalisation erforderlich sind, wobei diese Bereiche Ziele für anti-Telomerase-Wirkstoffe (Modulatoren von Telomerase-Aktivität) sind. Zu den weiteren Anwendungen gehören:
Verwendung des Fusionsproteins als Fluoreszenzmarker für die effiziente Zelltransfektion, sowohl für Experimente hinsichtlich transienter Transfektion als auch für die Etablierung EGFP-hTRT-exprimierender stabiler Zellinien;
Expression eines hTRT-EGFP-Fusionsproteins mit mutierten Signalen für nucleäre Lokalisation (defizient für nucleäre Lokalisation) in unsterblichen Zellen, damit das hTRT-Mutanten-EGFP alle hTR der unsterblichen Zellen einfängt, sie im Cytoplasma zurückhält und die Telomer-Aufrechterhaltung verhindert;
Das GFP kann auch als ein "tag" für Immunpräzipitation verwendet werden.
Beispiel 16
Die Auswirkung einer Mutation auf eine katalytische Aktivität von Telomerase
Dieses Beispiel beschreibt Experimente hinsichtlich der Veränderung von hTRT-Aminosäuren, sowie die Auswirkung von Aminosäureaustauschen in hTRT auf katalytische Aktivität von Telomerase. Der Austausch von Aminosäuren und im Anschluss daran die funktionelle Analyse ist ein Standardverfahren zur Bewertung der Bedeutung und Funktion einer Polypeptidsequenz. Dieses Beispiel zeigt, dass Veränderungen in den reverse-Transkriptase (RT)- und Telomerase-T-Motiven katalytische Aktivität von Telomerase beeinflussen und es liefert eine zusätzliche Bestätigung der katalytischen Natur des hTRT-Polypeptids.
Die übliche Nomenklatur wird zur Beschreibung der Mutanten verwendet: Der Zielrest im nativen Molekül (hTRT) wird durch den Ein-Buchstaben-Code und die Position angegeben, und der entsprechende Rest in dem Mutantenprotein ist durch den Ein-Buchstaben-Code angegeben. Somit kennzeichnet beispielsweise der Ausdruck "K626A" eine Mutante, bei der das Lysin an Position 626 (d.h. im Motiv 1) voh hTRT gegen ein Alanin ausgetauscht ist.
A) Mutagenese des FFYxTE-Motivs von hTRT
In einleitenden Experimenten wurde ein mutiertes hTRT-Protein codierender Vektor, "F560A" hergestellt, bei dem die Aminosäure 560 von SEQ. ID. Nr. 2 von Phenylalanin (F) zu Alanin (A) durch ortsgerichtete Mutagenese von pGRN121 mittels Standardverfahren geändert wurde. Diese Mutation unterbricht das TRT FFYxTE-Motiv. Es konnte gezeigt werden, dass das erhaltene mutierte F560A-Polynucleotid die Synthese eines hTRT-Proteins mit vollständiger Länge steuert, wie dies unter Verwendung eines zellfreien Reticulocytenlysat-Transkriptions/Translationssystem in Gegenwart von <3><5>S-Methionin bestimmt werden konnte.
Bei Translation des mutierten Polypeptids zusammen mit hTRT, wie in Beispiel 7 beschrieben, wurde mittels des TRAP-Assays unter Verwendung von 20 PCR-Cyclen keine Telomerase-Aktivität entdeckt, während die Kontroll-Cotranslation von hTRT-hTR-Aktivität rekonstituierte. Bei Verwendung von 30 PCR-Cyclen im TRAP-Assay war Telomerase-Aktivität mit der mu tierten hTRT nachweisbar, sie war jedoch beträchtlich geringer im Vergleich zu der Kontroll (Wildtyp)-hTRT.
B) Zusätzliche ortsgerichtete Mutagenese von hTRT-Aminosäureresten
Konservierte Aminosäuren in sechs RT-Motiven wurden zu Alanin abgeändert, um ihren Beitrag zur katalytischen Aktivität zu beurteilen, wobei Standardverfahren für die ortsgerichtete Mutagenese verwendet wurden (siehe beispielsweise Ausubel, a.a.0.). Die Mutanten wurden mittels IVR-Telomerase untersucht, wobei der in Beispiel 7 ausführlich beschriebene Zwei-Schritt-Assay (üblich/TRAP) verwendet wurde.
Die Mutanten K626A (Motiv 1), R631A (Motiv 2), D712A (Motiv A), Y717A (Motiv A) und D868A (Motiv C) zeigten stark herabgesetzte oder nicht-nachweisbare Telomerase-Aktivität, während die Mutanten Q833A (Motiv B) und G932A (Motiv E) mittlere Aktivitätsspiegel aufwiesen. Zwei Mutationen ausserhalb der RT-Motive (R688A und D897A) zeigten Aktivität, die äquivalent zu der Aktivität von Wildtyp-hTRT war. Diese Ergebnisse waren konsistent mit analogen Mutationen in reverser Transkriptase (Joyce et al., Ann. Rev. Biochem. 63 (1994), 777), und ähnlich zu dem mit Est2P erhaltenen Ergebnissen (siehe Lingner, Science 276 (1997), 561). Durch diese Experimente konnten Reste in den RT-Motiven identifiziert werden, die für enzymatische Aktivität kritisch sind. Diese Experimente zeigen auch das hTRT, das das katalytische Protein von menschlicher Telomerase ist.
Durch die Mutationen werden hTRT-Polypeptidvarianten erzeugt, die als dominant-negative Regulatoren von Telomerase-Aktivität verwendet werden können.
Durch Aminosäureausrichtung der bekannten TRTs konnte das Telomerase-spezifische Motiv T (siehe vorstehend) identifiziert werden. Um die katalytische Rolle dieses Motivs in hTRT zu bestimmen, wurde eine Deletion von sechs Aminosäuren in diesem Motiv ( DELTA 560-565; FFYxTE) unter Verwendung von Standardverfahren für die ortsgerichtete Mutagenese konstruiert (Ausubel, a.a.O.). Die Deletion wurde unter Verwendung von IVR-Telomerase mittels in Beispiel 7 ausführlich beschriebener Zwei-Schritt-Assays (üblich/TRAP) untersucht. Die Mutante DELTA 560-565 zeigte keine nachweisbare Telomerase-Aktivität nach 25 PCR-Cyclen, während Wildtyp-hTRT-IVR-Telomerase ein starkes Signal erzeugte. Jeder Aminosäurerest in Motiv T wurde auf ähnliche Weise unabhängig untersucht.
Die Mutanen FS6OA, Y562A, TS64 und E565A behielten mittlere Spiegel an Telomerase-Aktivität bei, während die Kontrollmutante F487A eine minimale Auswirkung auf die Aktivität hatte. Bemerkenswerterweise zeigte die Mutante F561A eine stark herabgesetzte oder nicht nachweisbare Telomerase-Aktivität, während in ihrer "Revertante" F561A561P Aktivität voll wiederhergestellt war. Bei der F561A561F befindet sich an der mutierten Position wieder das ursprüngliche Phenylalanin. Dies stellt eine Kontrolle dar, die zeigt, dass keine weiteren Aminosäureaustausche in dem Plasmid vorkamen, die die beobachtete verringerte Aktivität hätten erklären können. Somit ist das T-Motiv das erste Nicht-RT-Motiv, für das gezeigt werden konnte, dass es für Telomerase-Aktivität erforderlich ist.
Motiv T ist von Nutzen für die Identifizierung von TRTs von anderen Organismen und als ein potentieller dominant/negativ-Regulator von Telomerase-Aktivität. Im Gegensatz zu den meisten anderen RTs assoziierte Telomerase stabil mit einem kleinen Anteil einer einzelnen RNA (d.h. hTR) und kopiert diesen prozessiv, somit könnte das Motiv T an der Vermittlung der hTR-Bindung, der Prozessivität der Reaktion oder anderen Funktionen beteiligt sein, die für die Telomerase-RT einzigartig sind.
Beispiel 17
Screenen nach Modulatoren von Telomerase-Aktivität mittels rekombinant exprimierter Telomerase-Bestandteile
In diesem Beispiel wird die Verwendung von in vitro-rekonstituierter Telomerase zum Screenen und zur Identifizierung von Modulatoren von Telomerase-Aktivität beschrieben. Der beschriebene Assay kann leicht für Verfahren mit hohem Durchsatz adaptiert werden (z.B. mittels Platten mit vielfachen Vertiefungen und/oder Robotertechniksystem). Für den Fachmann sind die zahlreichen Variationsmöglichkeiten hinsichtlich der Assayschritte offensichtlich.
Rekombinante Clone für Telomerase-Bestandteile (z.B. hTRT und hTRR) werden in einer in vitro-Reaktion wie folgt und in dem vorstehend beschriebenen Beispiel 7 mittels des TNT< TM > T7gekoppelten Reticulocytenlysat-Systems (Promega; das in US-Patent Nr. 5 324 637 beschrieben ist und gemäss den Angaben des Herstellers verwendet wurde) transkribiert und translatiert (nur hTRT):
<tb><TABLE> Columns=2
<tb>Head Col 1: Reagenz
<tb>Head Col 2: Mengepro Reaktion
( mu l)
<tb><SEP>TNT-Kaninchen-Reticulocytenlysat<SEP>25
<tb><SEP>TNT-Reaktionspuffer<SEP>2
<tb><SEP>TNT T7-RNA-Polymerase<SEP>1
<tb><SEP>AA-Gemisch (vollständig)<SEP>1
<tb><SEP>"Prime" RNase-Inhibitor<CEL AL=L>1
<tb><SEP>Nuclease-freies Wasser<SEP>16
<tb><SEP>XbaI-geschnittenes pGRN121 (hTRT, 0,5 mu g)<CEL AL=L>2
<tb><CEL AL=L>FspI-geschnittenes pGRN164 (hTR, 0,5 mu g)<SEP>2
<tb></TABLE>
Die Reaktion wird 2 Stunden bei 30 DEG C inkubiert. Danach wird das Produkt auf einem "ultrafree-MC" DEAE-Filter (Millipore) gereinigt.
Das rekombinante Telomerase-Produkt (IVRP) wird in Gegenwart oder Abwesenheit vielfacher Konzentrationen an Testverbindungen, die in DMSO (z.B. 10 mu M bis 100 mu M) solubilisiert wurden, untersucht. Die Testverbindungen werden 30 Minuten bei Raumtemperatur in einem Gesamtvolumen von 25 mu l vorinkubiert, in der Gegenwart von 2, 5 mu l IVRP, 2,5% DMSO und 1 x TRAP-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3, 1,5 mM MgCl2, 63 mM KCl, 0,05% Tween 20, 1,0 mM EGTA und 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin) vorinkubiert. Nach der Vorinkubation werden zu jeder Probe 25 mu l TRAP-Assay-Reaktionsgemisch zugegeben. Das TRAP-Assay-Reaktionsgemisch besteht aus 1 x TRAP-Puffer, 50 mu l dNTP, 2,0 mu g/ml Primer ACX, 4 mu g/ml Primer U2, 0,8 Attomol/ml TSU2, 2 Einheiten 50 mu l Taq-Polymerase (Perkin Elmer) und 2 mu g/ml [<3><2>P]5 min -endmarkierter Primer TS (3000 Ci/mMol).
Die Röhrchen mit dem Reaktionsgemisch werden dann in den PCR-Thermocycler (MJ Research) gestellt und die PCR wird wie folgt durchgeführt: 60 Minuten bei 30 DEG C, 20 Cyclen von jeweils 30 Sekunden bei 94 DEG C, 30 Sekunden bei 60 DEG C und 30 Sekunden bei 72 DEG C, dann 1 Minute bei 72 DEG C und Abkühlen auf 10 DEG C. Der TRAP-Assay ist, wie bereits vorstehend erwähnt, in dem US-Patent Nr. 5 629 154 beschrieben. Die verwendeten Primer und Substrate haben die Sequenzen:
EMI382.1
Nach Beendigung des PCR-Schritts werden zu jedem Reaktionsröhrchen 4 mu l 10 x Bromphenolblau enthaltender Auftragspuffer zugegeben und die Produkte (20 mu l) auf einem 12,5%igen nicht-denaturierenden PAGE-Gel in 0,5 x TBE bei 400 V laufen gelassen. Nach Beendigung des Gellaufs wird das Gel getrocknet und die TRAP-Produkte werden mittels des "Phosphorimager" oder durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Telomerase-Aktivität in Gegenwart der Testverbindung wird dadurch gemessen, dass der Einbau der Markierung in das Reaktionsprodukt mit einer Parallelreaktion ohne das Agens verglichen wird.
Die folgenden in den Beispielen beschriebenen Clone wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD20852, USA hinterlegt.
<tb><TABLE> Columns=2
<tb><SEP>Lambda-Phage lambda 25-1.1<SEP>ATCC-Zugangsnummer 209024
<tb><SEP>pGRN121<SEP>ATCC-Zugangsnummer 209016
<tb><SEP>Lambda-Phage lambda G PHI 5<SEP>ATCC-Zugangsnummer 98505
<tb></TABLE>
Diese Hinterlegungen unter dem Budapester Vertrag erfolgten für ATCC 209024 am 12. Mai 1997, für ATCC 209016 am 6. Mai 1997 und für ATCC 98505 am 14. August 1997.
Die vorliegende Erfindung stellt neue Verfahren und Substanzen zur Diagnose und der Behandlung von mit Telomerase in Zusammenhang stehenden Krankheiten bereit. Es wurden spezifische Beispiele bereitgestellt, die vorstehende Beschreibung dient jedoch nur zur Veranschaulichung und soll keine Einschränkung darstellen. Für den Fachmann sind nach Lesen der Beschreibung viele Variationsmöglichkeiten hinsichtlich der Erfindung offensichtlich. Der Umfang der Erfindung wird somit nicht durch die vorstehende Beschreibung bestimmt, sondern soll durch die nachstehenden Patentansprüche zusammen mit dem vollen Umfang ihrer Äquivalente bestimmt werden.
Alle in dieser Anmeldung zitierten Publikationen und Patentdokumente sind aufgrund der Bezugnahme und für alle Zwecke als Bestandteil der Beschreibung anzusehen und zwar in dem gleichen Ausmass als wenn jede einzelne Veröffentlichung oder jedes einzelne Patentdokument individuell bezeichnet worden wäre.
The present invention relates to novel nucleic acids and polypeptides that encode the catalytic subunit of telomerase. In particular, the present invention relates to the catalytic subunit of human telomerase. The invention provides methods and compositions related to medicine, molecular biology, chemistry, pharmacology, and medical, diagnostic, and prognostic methods.
The following discussion is intended to introduce the reader to the field to which the present invention relates. The citation of various references in this section should not be understood as an admission of anticipation of the invention.
It has long been known that the complete replication of the ends of eukaryotic chromosomes requires specialized cell components (Watson, Nature New. Biol. 239 (1972), 197 and Olovnikov, J. Theor. Biol. 41 (1973), 181). The replication of a linear DNA strand by conventional DNA polymerases requires an RNA primer and it can only proceed in the 5 min -3 min direction. When the RNA bound to the outer 5 min end of chromosomal eukaryotic DNA strands is removed, a gap is introduced, which leads to a progressive shortening of the daughter strands with each round of replication. This shortening of telomeres, which represent the protein / DNA structures physically located at the ends of chromosomes, appears to be the reason for the phenomenon of cellular senescence or aging (see, for example, Goldstein, Science 249 (1990), 1129; Martin et al., Lab.
Invest. 23: 86 (1979); Goldstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 64 (1969), 155 and Schneider and Mitsui, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73 (1976), 3584) of normal human somatic cells in vitro and in vivo.
The length and integrity of telomeres is thus related to the entry of a cell into a senescent status (i.e. the loss of its ability to proliferate). Furthermore, the ability of a cell to maintain (or increase) the telomere length may allow the cell to escape senescence, i.e. to become immortal.
The structure of telomeres and telomeric DNA has been studied in numerous systems (see e.g. Harley and Villeponteau, Curr. Opin. Genet. Dev. 5 (1995), 249). In most organisms, telomeric DNA consists of a tandem array of very simple sequences; in humans and other vertebrates, telomeric DNA consists of hundreds to thousands of tandem repeat units of the TTAGGG sequence. Methods for determining and modulating the telomer length in cells are described in PCT publications WO 93/23 572 and WO 96/41 016.
Telomer preservation is a function of a telomer-specific DNA polymerase known as telomerase. Telomerase is a ribonucleoprotein (RNP) that uses a portion of its RNA unit as a template for the synthesis of the DNA telomer repeat units (Morin, Eur. J. Cancer 33 (1997), 750; Yu et al., Nature 344 (1990) 126; Singer and Gottschling, Science 266 (1994), 404; Autexier and Greider, Genes Develop. 8 (1994), 563; Gilley et al., Genes Develop. 9 (1995), 2214; Mc Eachern and Blackburn , Nature 367 (1995), 403; Blackburn, Ann. Rev. Biochem. 61 (1992), 113; Greider, Ann. Rev. Biochem. 65 (1996), 337). The RNA components of human and other telomerases have been cloned and characterized (see PCT publication WO 96/01835 and Feng et al., Science 269 (1995), 1236).
However, the characterization of the protein components of telomerase was difficult. This is due in part to the fact that it has proven difficult to purify telomerase RNP, which is only present in extremely low concentrations in cells in which it is expressed. For example, it has been thought that human cells, which are known to express high levels of telomerase activity, have only about 100 enzyme molecules per cell.
Consistent with the relationship of telomeres and telomerase to a cell's ability to proliferate (i.e., the ability of a cell to divide indefinitely), telomerase activity has been demonstrated in immortal cell lines and in distinctly different types of tumor tissues, but has not been found in normal somatic cell cultures or normal tissues in the vicinity of a tumor (see U.S. Pat. Nos. 5,629,154; 5,489, 508; 5,648,215 and 5,639,613; see also Morin, Cell 59 (1989) 521; Shay and Bacchetti, Eur. J. Cancer 33 (1997), 78 7; Kim et al., Science 266 (1994), 2011; Counter et al., EMBO J. 11 (1992), 1921; Counter et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91 (1994), 2900 and Counter et al., J. Virol. 68 (1994), 3410) (ie was not present or was below the detection limit of the assay).
A relationship between the level of telomerase activity in a tumor and the likely clinical course of the patient's disease has also been reported (e.g., U.S. Patent No. 5,639,613, supra, and Langford et al., Hum. Pathol. 28 (1997), 416). Telomerase activity has also been demonstrated in human gametes, proliferating stem cells or progeny thereof and activated lymphocytes. In somatic stem cells or their progeny and in activated lymphocytes, telomerase activity is typically either very low or only transiently expressed (see Chiu et al., Stem Cells 14 (1996), 239, Bodnar et., Exp. Cell Res. 228 (1996), 58 and Taylor et al., J. Invest. Dermatology 106 (1996), 759).
Human telomerase is an ideal target for the diagnosis and treatment of human diseases related to cellular proliferation and senescence, such as cancer. Methods for diagnosing and treating cancer and other telomerase-related diseases in humans are described in U.S. Patent Nos. 5,489,508, 5,639,613 and 5,645,986. Methods of predicting tumor progression by observation of telomerase are described in U.S. Patent No. 5,639,613. Finding and characterizing the catalytic protein subunit of human telomerase would provide additional useful assays for telomerase and for the diagnosis and therapy of diseases.
In addition, cloning and determination of the primary sequence of the catalytic protein subunit would allow more effective therapies for human cancer and other diseases related to cell proliferation and senescence to be provided.
The present invention provides an isolated, substantially pure or recombinant protein preparation of a telomerase reverse transcriptase protein or a variant or a fragment thereof. In one embodiment, the protein has the following amino acid sequence:
EMI5.1
where X is any amino acid and a subscript refers to the number of successive residues, R1 is leucine or isoleucine, R2 glutamine or arginine, R3 phenylalanine or tyrosine and R4 lysine or histidine. In one embodiment, the protein has a sequence from human TRT. In other embodiments, the invention relates to peptides and polypeptides which essentially have sequence identity in common with a sub-sequence of such proteins.
In a related embodiment, the invention provides an isolated, substantially pure or recombinant nucleic acid encoding a telomerase reverse transcriptase protein. In one embodiment, the protein has the following amino acid sequence:
EMI5.2
In one embodiment, the nucleic acid has a sequence of human TRT. In further embodiments, the invention relates to oligonucleotides and polynucleotides which have essential sequence identity in common with a subunit of such nucleic acids.
One aspect of the invention relates to human telomerase reverse transcriptase (hTRT). Thus, in one embodiment, the invention provides an isolated, substantially pure or recombinant protein preparation of a human telomerase reverse transcriptase (hTRT) protein or a variant or fragment thereof.
In one embodiment, the protein is characterized by an amino acid with at least about 75% or at least about 80% sequence identity to the hTRT protein from SEQ. ID. No. 2 (Fig. 17) or a variant or a fragment thereof. In a related embodiment, the hTRT protein has the sequence of SEQ. ID. # 2. In some embodiments, the protein has one or more telomerase activities, such as catalytic activity. In one embodiment, the hTRT protein fragment has at least 6 amino acid residues.
The invention also provides a composition comprising an hTRT protein and an RNA. The RNA can be a telomerase RNA, for example an RNA of human telomerase. In one embodiment, the hTRT protein and the human telomerase RNA form a ribonucleoprotein complex with telomerase activity.
One aspect of the invention relates to the provision of isolated human telomerase, for example an essentially pure human telomerase, which comprises human telomerase reverse transcriptase (hTRT) and human telomerase RNA (hTR). In one embodiment, the telomerase is at least about 95% pure. The telomerase can be isolated from a cell.
Another aspect of the invention relates to the provision of an isolated, synthetic, essentially pure or recombinant polynucleotide, which comprises a nucleic acid sequence encoding an hTRT protein. In one embodiment, the polynucleotide has a nucleotide sequence encoding an hTRT protein that contains one in SEQ. ID. No. 2 amino acid sequence indicated, or a sequence that includes one or more conservative substitutions in that amino acid sequence. A related aspect relates to the provision of a polynucleotide that is under stringent conditions with a polynucleotide having the sequence of SEQ. ID. No. 1 hybridizes. In another related embodiment, the nucleotide sequence of the polynucleotide has a lowest sum probability of less than about 0.5 compared to that in SEQ. ID.
No. 1 specified nucleotide sequence using the BLAST algorithm using preset parameters.
Another aspect of the invention relates to the provision of a polynucleotide with a promoter sequence which is functionally linked to the sequence encoding the hTRT protein. The promoter can be a promoter that does not correspond to the naturally occurring hTRT promoter. A related aspect of the invention relates to the provision of an expression vector comprising the hTRT polynucleotide.
The invention also provides an isolated, synthetic, substantially pure or recombinant polynucleotide that is at least 10 nucleotides in length and comprises a sequential sequence of at least 10 nucleotides that results in a sequential sequence in a naturally occurring hTRT gene or hTRT- mRNA is identical or exactly complementary. In some embodiments, the polynucleotide is an RNA, a DNA, or it contains one or more non-naturally occurring synthetic nucleotides. In one embodiment, the polynucleotide is identical or exactly complementary to the sequential sequence of at least 10 consecutive nucleotides in a naturally occurring hTRT gene or hTRT mRNA. For example, the polynucleotide can be an "antisense" polynucleotide.
In another embodiment, the antisense polynucleotide comprises at least about 20 nucleotides.
The invention also provides a method for producing recombinant telomerase by contacting a recombinant hTRT protein with a telomerase RNA component under conditions such that the recombinant protein and the telomerase RNA component combine to form a telomerase enzyme which the Can catalyze addition of nucleotides to a telomerase substrate. In one embodiment, the hTRT protein has the sequence of SEQ. ID. No. 2. The hTRT protein can be produced in an in vitro expression system and mixed with a telomerase RNA; in another embodiment, the telomerase RNA is co-expressed in the in vitro expression system. In one embodiment, the telomerase RNA is human telomerase RNA.
In an alternative embodiment, the contacting takes place in a cell, for example a human cell. In one embodiment, the cell has no telomerase activity prior to contacting hTRT and the RNA of an hTRT polynucleotide (or introduction, e.g., by transfection). In one embodiment, the telomerase RNA is naturally expressed by the cell.
The invention also provides a cell, for example a human cell, mouse cell or yeast cell, which contains the recombinant polynucleotides according to the invention, for example a polynucleotide with a sequence which is functionally linked to a promoter and encodes an hTRT protein. In certain aspects, the cell is a vertebrate cell, e.g. a mammalian cell, e.g. of a human, and has an increased proliferation ability relative to the cell that is otherwise identical but does not include the recombinant polynucleotide, or has an increased level of telomerase activity relative to a cell that is otherwise identical but does not include recombinant polynucleotides . In some embodiments, the cell is immortal.
Related embodiments of the invention relate to the provision of organisms and cells comprising a polynucleotide that is a human telomerase reverse transcriptase polypeptide. These include a transgenic non-human organism, such as yeast, a plant or bacterium, or an animal, such as a mouse. The invention also provides transgenic animals and cells in which an hTRT gene has been knocked out or mutated so that the gene does not express a naturally occurring hTRT gene product.
Thus, in alternative embodiments, the transgenic animal has a mutated telomerase gene, is an animal deficient in telomerase activity, is an animal whose TRT deficiency is the result of a mutated gene that compares a TRT with a reduced level of telomerase activity owns a wild-type TRT or an animal with a mutated TRT gene with one or more mutations, including "missense" mutations, "nonsense" mutations, insertions and deletions.
The invention also provides an isolated or recombinant antibody or fragment thereof that specifically binds to hTRT protein. In one embodiment, the antibody binds with an affinity of at least about 10 <8> M <-> <1>. The antibody can be a monoclonal or polyclonal composition, for example a polyclonal antiserum. A related aspect of the invention relates to the provision of a cell that can secrete the antibody, for example a hybridoma.
The invention also provides a method of detecting whether a compound or treatment is a modulator of telomerase reverse transcriptase activity or hTRT expression by detecting or monitoring a change in activity or expression in a cell, a Animal or a composition comprising an hTRT protein or corresponding polynucleotide after administration of the compound or treatment. In one embodiment, the method includes the following steps: providing a TRT composition, contacting the TRT with the test compound, and measuring the activity of the TRT, a change in the TRT activity in the presence of the test compound being an indicator of whether the test compound is TRT Activity modulated.
In certain embodiments, the composition is a cell, an organism, a transgenic organism or an in vitro system, for example an expression system, which contains a recombinant polynucleotide encoding an hTRT polypeptide. Thus, the human telomerase reverse transcriptase of this method can be a product of in vitro expression.
In various embodiments, detection of telomerase activity or expression can be accomplished by detecting a change in the frequency of an hTRT gene product by monitoring the incorporation of a nucleotide label into a substrate for telomerase, the hybridization of a probe with an extended one Telomerase substrate, the amplification of an elongated telomerase substrate, the telomer length of a cell exposed to the test compound and the loss of the ability of the telomerase to bind to a chromosome or by measuring the accumulation or loss of a telomer structure.
One aspect of the invention relates to the provision of a method for the detection of a human telomerase reverse transcriptase (hTRT) gene product in a biological sample by contacting the biological sample with a probe which specifically binds the gene product, the probe and the gene product forming a complex, and by detection of the complex, the presence of the complex correlating with the presence of the hTRT gene product in the biological sample. The gene product can be RNA, DNA or a polypeptide. Examples of probes that can be used for detection include, but are not limited to, nucleic acids and antibodies.
In one embodiment, the gene product is a nucleic acid that is detected by amplifying the gene and detecting the amplification product, the presence of the complex or the amplification product correlating with the presence of the hTRT gene product in the biological sample.
In one embodiment, the biological sample from a patient is, for example, a human patient. In a further embodiment, the biological sample contains at least one cell from an in vitro cell culture, for example a culture of human cells.
The invention further provides a method for detecting the presence of at least one immortal or telomerase-positive human cell in a biological sample comprising human cells, wherein the biological sample comprising human cells is obtained and the presence of a cell with a high level of an hTRT gene product is detected in the sample, the presence of a cell with a high level of the hTRT gene product correlating with the presence of immortal or telomerase positive cells in the biological sample.
The invention also provides a method for diagnosing a telomerase-related condition in a patient by obtaining a cell or tissue sample from the patient, determining the amount of a human telomerase reverse transcriptase (hTRT) gene product in the cell or tissue and comparing the amount of the hTRT gene product in the cell or tissue with the amount in a healthy cell or tissue of the same type, with a different amount of the hTRT gene product in the sample from the patient compared to the healthy cell or is a diagnostic sign of a condition related to telomerase in healthy tissue. In one embodiment, the telomerase-related condition is cancer.
The invention further provides a method for diagnosing cancer in a patient by obtaining a sample from the patient and detecting a human telomerase reverse transcriptase (hTRT) gene product in the sample from the patient, wherein the detection of the hTRT- Gene product in the sample correlated with a diagnosis of cancer.
The invention also provides a method of diagnosing cancer in a patient by obtaining a patient sample, determining the amount of human telomerase reverse transcriptase (hTRT) gene product in the patient sample, and comparing the amount of the hTRT gene product to a normal value or Control value, where an amount of the hTRT gene product in the patient that is larger compared to the normal or control value is a diagnostic sign of cancer.
The invention also provides a method for diagnosing cancer in a patient by obtaining a patient sample containing at least one cell, determining the amount of the hTRT gene product in a cell in the sample and comparing the amount of the hTRT gene product in the Cell with a normal value for the cells, with an amount of the hTRT gene product which is above the normal value being a diagnostic sign of cancer. In one embodiment, it is assumed that the sample contains at least one malignant cell.
The invention also provides a method of providing a prognosis for a cancer patient wherein the amount of the hTRT gene product in a cancer cell obtained from the patient is determined and the amount of hTRT in the cancer cell with a prognostic value for hTRT per cancer cell consistent with is a cancer prognosis, with an amount of hTRT per cell in the sample that is at the prognostic value providing the particular prognosis.
The invention also provides a method for monitoring the effectiveness of anti-cancer treatment to decrease the proliferation capacity of cancer cells in a patient by first measuring the amount of an hTRT gene product in at least one cancer cell by the patient, a second measurement for that Level of hTRT gene product is carried out in at least one cancer cell of the patient, the anti-cancer treatment being administered to the patient before or at the same time and by comparing the first with the second measurement, with a low level of hTRT gene product in the second measurement correlated with the effectiveness of anti-cancer treatment to reduce the proliferation capacity of cancer cells in the patient.
The invention also provides kits for the detection of an hTRT gene or gene product. In one embodiment, the kit contains a container comprising a molecule selected from an hTRT nucleic acid or a sub-sequence thereof, an hTRT polypeptide or a sub-sequence thereof and an anti-hTRT antibody. The invention also provides methods of treating human diseases. One aspect of the invention relates to the provision of a method for increasing the proliferation capacity of a vertebrate cell, for example a mammalian cell, by introducing a recombinant polynucleotide into the cell, the polynucleotide comprising a sequence which comprises a human telomerase reverse transcriptase (hTRT) polypeptide. In one embodiment, the hTRT polypeptide has a sequence of SEQ. ID. No. 2 (Fig. 17).
In one embodiment, the sequence is functionally linked to a promoter. In one embodiment, the hTRT has catalytic activity of telomerase. In one embodiment, the cell is human, for example a cell in a human patient.
In an alternative embodiment, the cell is cultivated in vitro. In a related embodiment, the cell is introduced into a human patient.
The invention further provides a method of treating a human disease by introducing a recombinant hTRT polynucleotide into at least one cell in a patient. In one embodiment, a vector is used for gene therapy. In a related embodiment, the method further involves introducing into the cell a polynucleotide that comprises a sequence encoding a human telomerase RNA, for example an hTRT polynucleotide that is operably linked to a promoter.
The invention also provides a method of increasing the ability of a vertebrate cell to proliferate, the method comprising introducing an effective amount of a human telomerase reverse transcriptase (hTRT) polypeptide into the cell. In one embodiment, the hTRT polypeptide has catalytic activity from telomerase. The invention further provides cells and progeny of the cells with increased proliferation capacity.
The invention also provides pharmaceutical compositions containing a pharmaceutically acceptable carrier and a molecule selected from: an hTRT polypeptide, a polynucleotide encoding an hTRT polypeptide and an hTRT nucleic acid or a sub-sequence thereof.
The invention also provides a method of treating a condition associated with an increased level of telomerase activity within a cell, the method comprising introducing into the cell a therapeutically effective amount of an inhibitor of telomerase activity, the inhibitor is an hTRT polypeptide or an hTRT polynucleotide. In one embodiment, the inhibitor is a polypeptide that comprises the sequence of SEQ. ID. No. 2 or 4 or a sub-sequence thereof. In further embodiments, the polypeptide inhibits TRT activity, for example the binding of endogenous TRT to telomerase RNA.
The invention also provides a vaccine comprising an hTRT polypeptide and an adjuvant.
Description of the figures
Fig. 1
shows highly preserved residues in TRT motifs of humans, S. pombe (tez1), S. cerevisiae (EST2) and Euplotes aediculatus (p123). Identical amino acids are marked with an asterisk (*), while similar amino acid residues are marked with a dot (& cirf &). Motif "0" in the figure is also called Motif T; Motif "3" is also called motif A.
Fig. 2
shows the location of telomerase-specific motifs and RT-specific sequence motifs of telomerase proteins and other reverse transcriptases. The location of the telomerase-specific motif T and the conserved RT motifs 1, 2 and A-E are indicated by filled boxes. The HIV-1 RT marked with an open rectangle marks the portion of this protein shown in FIG. 3.
Fig. 3
shows the crystal structure of the p66 subunit of HIV-1 reverse transcriptase ("Brookhaven code" 1HNV). The view is shown from the back of the right hand, so that all motifs are recognizable.
Fig. 4
shows several sequence orientations of telomerase RTs (Sp_Trt1p, S. pombe TRT (also referred to here as "tez1p"); bTRT, human TRT; Ea_p123, Euplotes p123; Sc_Est2p, S. cerevisiae Est2P) and members of other RT families (S_a1, Cytochrome oxidase group II intron I-encoded protein from S. cerevisiae mitochondria, Dm_TART, reverse transcriptase from Drosophila melanogaster TART non-LTR retrotransposon element); HIV-1, reverse transcriptase from human HIV). TRT con and RT con represent "consensus" sequences for telomerase RTs and non-telomerase RTs. Amino acids are marked with an h, hydrophobic; p, polar; c, loaded. Triangles indicate residues that are conserved within the telomerase proteins, but are different in other RTs. The thick line under motif E denotes the "primer grip" area.
Fig. 5
shows the expression of hTRT-RNA in telomerase-negative mortal cell strains and telomerase-positive immortal cell lines, as described in Example 2.
Fig. 6
shows a possible phylogenetic family tree of telomerases and retro elements with RNA-dependent RNA polymerases as the root.
Fig. 7
shows a restriction map of the lambda clone G. PHI 5.
Fig. 8
shows a map of chromosome Sp with the location of the STS marker D5S678 (located near the hTRT gene).
Fig. 9
shows the construction of an hTRT promoter reporter plasmid.
Fig. 10
(two pages) shows the in vitro coexpression of hTRT and hTR for the production of catalytically active human telomerase.
Fig. 11
(two pages) shows the alignment of sequences of four TRT proteins and interesting motifs are marked. TRT con denotes a TRT "consensus" sequence. RT con denotes "consensus" residues in other reverse transcriptases. "Consensus" remains with capital letters indicate absolute preservation in TRT proteins.
Fig. 12
shows a topoisomerase II cleavage site and NF kappa B binding site motifs in an hTRT intron, the sequence shown being SEQ. ID. No. 7 (Fig. 12) corresponds.
Fig. 13
(two pages) shows the sequence of the DNA encoding the Euplotes 123 kD telomerase protein subunit (Euplotes TRT protein).
Fig. 14
shows the amino acid sequence of the Euplotes 123 kD telomerase protein subunit (Euplotes TRT protein).
Fig. 15
(fourteen pages) shows the DNA and amino acid sequences of the catalytic subunit of S. pombe telomerase (S. pombe-TRT).
Fig. 16
(two pages) shows the hTRT cDNA sequence, the sequence shown SEQ. ID. No. 1 corresponds.
Fig. 17
shows the hTRT protein encoded by the cDNA of Fig. 16. The protein sequence shown corresponds to SEQ. ID. No. 2.
Fig. 18
shows the sequence of clone 712562, the sequence shown SEQ. ID. No. 3 corresponds.
Fig. 19
Figure 25 shows a 259 residue protein encoded by clone 712562, the sequence shown being SEQ. ID. No. 10 corresponds.
Fig. 20
(seven pages) shows the sequence of an open reading frame nucleic acid encoding a DELTA 182 polypeptide variant, the sequence shown being SEQ. ID. No. 4 corresponds. This figure also shows the amino acid sequence of this DELTA 182 polypeptide variant, the amino acid sequence shown SEQ. ID. No. 5 corresponds.
Fig. 21
(six pages) shows the sequence of a genomic hTRT clone, the sequence shown SEQ. ID. No. 6 corresponds. "Consensus" motifs and elements are given, including sequences which are characteristic of a topoisomerase II cleavage site, NF kappa B binding sites, an Alu sequence and other sequence elements.
Fig. 22
Figure 4 shows the effect of mutating the TRT gene in yeast as described in Example 1.
Fig. 23
shows the sequence of EST AA281296 SEQ. ID. No. 8 corresponds.
Fig. 24
shows the sequence of the 182 base pairs deleted in clone 712562, the sequence shown SEQ. ID. No. 9 corresponds.
Fig. 25
shows the results of an assay for telomerase activity from BJ cells transfected with an expression vector encoding an hTRT protein (pGRN133) or a control plasmid (pBBS212) as described in Example 13.
Fig. 26
Figure 12 is a schematic diagram of affinity purification of telomerase showing the binding steps and elution steps by displacement.
Fig. 27
is a photo of a Northern blot of telomerase preparations obtained during the purification protocol described in Example 1. Lane 1 contained 1.5 fMol telomerase RNA, lane 2 4.6 fMol, lane 3 14 fMol, lane 4 41 fMol, lane 5 nuclear extract (42 fMol telomerase), lane 6 Affi-gel heparin-purified telomerase (47 fmol telomerase), lane 7 affinity-purified telomerase (68 fMol) and lane 8 via glycerol gradient purified telomerase (35 fMol).
Fig. 28
shows telomerase activity during a cleaning protocol.
Fig. 29
is a photo of an SDS-PAGE gel showing the presence of an approximately 123 kD polypeptide and an approximately 43 kD doublet from Euplotes aediculatus.
Fig. 30
is a graph showing the sedimentation coefficient of Euplotes aediculatus telomerase.
Fig. 31
is a photo of a polyacrylamide / urea gel with 36% formamide, which shows the substrate utilization of Euplotes-Telomerase.
Fig. 32
shows the suspected alignments of telomerase RNA template and hairpin structure primers with telomerase RNA.
Fig. 33
Fig. 16 is a photograph of traces 25 through 30 of the gel shown in Fig. 31 with lower exposure.
Fig. 34
shows the DNA sequence of the gene encoding the 43 kD telomerase protein subunit of Euplotes.
Fig. 35
(four pages) shows the DNA sequence and the amino acid sequences of all three open reading frames of the 43 kD telomerase protein subunit from Euplotes.
Fig. 36
shows a sequence comparison between the 123 kD telomerase protein subunit from Euplotes (upper sequence) and the 80 kD polypeptide subunit from T. thermophila (lower sequence).
Fig. 37
shows a sequence comparison between the 123 kD telomerase protein subunit from E. aediculatus (upper sequence) and the 95 kD telomerase polypeptide from T. thermophila (lower sequence).
Fig. 38
shows the "best fit" alignment between a portion of the "La domain" of the 43 kD telomerase protein subunit from E. aediculatus (upper sequence) and a portion of the 95 kD polypeptide subunit from T. thermophila (lower sequence).
Fig. 39
shows the "best fit" alignment between a part. the "La domain" of the 43 kD telomerase protein subunit from E. aediculatus (upper sequence) and part of the 80 kD polypeptide subunit from T. thermophila (lower sequence).
Fig. 40
shows the alignment and motifs of the polymerase domain of the 123 kD telomerase protein subunit from E. aediculatus and the polymerase domains of various reverse transcriptases, including a cytochrome oxidase group II intron 1-encoded protein from S. cerevisiae- Mitochondria (al Sc (group II)) count, dong (LINE) and yeast ESTp (L8543.12).
Fig. 41
shows the alignment of a domain of the 43 kD telamerase protein subunit with different La proteins.
Fig. 42
shows the nucleotide sequence encoding T. thermophila 80 kD protein subunit.
Fig. 43
shows the amino acid sequence of the T. thermophila 80 kD protein subunit.
Fig. 44
shows the nucleotide sequence encoding the T. thermophila 95 kD protein subunit.
Fig. 45
shows the amino acid sequence of the T. thermophila 95 kD protein subunit.
Fig. 46
shows the amino acid sequence of L8543.12 ("Est2p").
Fig. 47
shows the alignment of the amino acid sequence encoded by the Oxytricha PCR product with the Euplotes p123 sequence.
Fig. 48
shows the DNA sequence of Est2.
Fig. 49
shows the partial amino acid sequence of a cDNA clone encoding human telomerase peptide motifs.
Fig. 50
shows the partial DNA sequence of a cDNA clone encoding human telomerase peptide motifs.
Fig. 51
shows the amino acid sequence of tez1, also known as S. pombe trt.
Fig. 52
(two pages) shows the DNA sequence of tez1. Intron areas and other non-coding areas are shown in lower case and exons (i.e. coding area) are shown in upper case.
Fig. 53
shows the alignment of EST2p, Euplotes and Tetrahymena sequences, as well as "consensus" sequences.
Fig. 54
shows the sequences of peptides useful for the production of anti-hTRT antibodies.
Fig. 55
is a schematic summary of tez1 <+> - sequencing experiments.
Fig. 56
shows two degenerate primers used in PCR to identify the S. pombe homologues to the E. aediculatus p123 sequences were used.
Fig. 57
shows the four main bands used in PCR with the degenerate primers to identify the S. pombe homologues, to the E. aediculatus p123 sequences were used.
Fig. 58
shows the alignment of the M2-PCR product with E. aediculatus p123, p. cerevisiae and oxytricha telomerase protein sequences.
Fig. 59
is a schematic showing the 3 min RT-PCR strategy for the identification of S. pombe homologues to the E. aediculatus p123 shows.
Fig. 60
shows characteristics of banks that were used to post pombe to screen telomerase protein sequence and the results of the screening.
Fig. 61
shows the positive results obtained with the HindIII-cleaved positive genomic clones that the S. pombe telomerase sequence included.
Fig. 62
Fig. 3 is a schematic showing the 5 min RT-PCR strategy required to obtain the S. pombe full length TRT clones were used.
Fig. 63
shows the alignment of RT domains of catalytic subunits of telomerase for S. pombe (p. p. ), S. cerevisiae (p. c. ) and E. aediculatus (E. a. ).
Fig. 64
shows the alignment of sequences from Euplotes ("Ea_P123"), S. cerevisiae ("Sc_Est2P") and S. pombe ("Sp_Tez1p"). In part A, the shaded areas indicate residues that both sequences have in common. In Part B, the shaded areas indicate residues that all three sequences have in common.
Fig. 65
shows those for the telomerase genes in S. pombe used disruption strategy.
Fig. 66
shows the experimental results that confirm tez1's disruption.
Fig. 67
shows the progressive shortening of telomeres in S. pombe due to tez1's disruption.
Fig. 68
(four pages) shows the DNA sequence and amino acid sequence of the ORF encoding a telomerase protein of approximately 63 kD or a fragment thereof encoded by the EcoRI-NotI insert of the Genbank clone # AA281296.
Fig. 69
shows an alignment of reverse transcriptase motifs from different sources.
Fig. 70
is a restriction map and a functional map of plasmid pGRN121.
Fig. 71
(two pages) shows the results of preliminary analyzes of nucleic acid sequencing of an hTRTcDNA sequence.
Fig. 72
(10 pages) shows the preliminary nucleic acid of hTRT and the derived ORF sequences in the three reading frames.
Fig. 73
is a restriction map and a functional map of plasmid pGRN121.
Fig. 74
(8 pages) shows the improved nucleic acid sequence and derived ORF sequences from hTRT.
Fig. 75
shows a restriction map of the lambda clone 25-1. 1.
Fig. 76
shows a map of the restriction sites and regions of DNA pGRN144. 4th
I. introduction
Telomerase is a ribonucleoprotein complex (RNP) that comprises an RNA component and a catalytic protein component. The present invention relates to the cloning and characterization of the catalytic protein component of telomerase, hereinafter referred to as "TRT" (telomerase reverse transcriptase). This protein is referred to as TRT because it works as an RNA-dependent DNA polymerase, the RNA component of telomerase (hereinafter referred to as "TR") being used to control the synthesis of the telomer DNA repeat sequences. In addition, TRT is evolutionarily related to other reverse transcriptases (see Example 12).
One aspect of the present invention relates to the cloning and characterization of the catalytic protein component of human telomerase, hereinafter referred to as "hTRT". Human TRT is of exceptional interest and value because, as noted below, telomerase activity in humans (and other mammalian cells) correlates with the property of cell proliferation, cell immortality and the development of a neoplastic phenotype. For example, in immortal human cells (e.g. B. malignant tumor cells and immortal cell lines) the telomerase activity and, as shown in Example 2 below, the amount of gene products of human TRT versus mortal cells (e.g. B. most human somatic cells).
The present invention further provides methods and compositions of value for the diagnosis, prognosis, and treatment of human diseases and conditions, as will be described in detail below. In addition, methods and reagents are provided which are useful for immortalizing cells (in vivo and ex vivo), producing transgenic animals with desired features, as well as numerous other uses, the majority of which are described below. The invention also provides methods and agents useful for the production, cloning and re-cloning of TRT genes and proteins from ciliates, fungi, vertebrates, for example mammals, and other organisms.
As described in detail below, TRT was first characterized after purification of telomerase from the ciliate Euplotes aediculatus. The comprehensive cleaning of E. aediculatus telomerase using RNA affinity chromatography and other methods provided the protein "p123". Surprisingly, it was found that p123 with proteins previously thought to be protein subunits of the telomerase holoenzyme (i.e. H. the p80 and p95 proteins from Tetrahymena thermophila) is not related. Analysis of the sequences of the p123 DNA and the protein (Genbank accession number U95964; Fig. 13 and 14) revealed the presence of reverse transcriptase (RT) motifs, which is consistent with the role of p123 as a catalytic subunit of telomerase (see e.g. B. Fig. 11).
In addition, p123 is linked to the Est1p protein from S. cerevisiae (yeast) related, which was known to play a role in the maintenance of telomeres in S. cerevisiae plays (Genbank accession number S5396). However, it was not recognized before the present invention that it encodes a telomerase catalytic subunit protein (see, for example, Lendvay et al. , Genetics 144 (1996), 1399).
One aspect of the present invention relates to reagents and methods for identifying and cloning new TRTs using: nucleic acid probes and primers that are generated or derived from the disclosed TRT polynucleotides (e.g. B. for cloning TRT genes and cDNAs); Antibodies that specifically recognize motifs, motif sequences or other TRT epitopes (e.g. B. for expression cloning of TRT genes or for the purification of TRT proteins); the screening of computer databases or other aids. For example, the PCR amplification (polymerase chain reaction) described in Example 1 of DNA from S. pombe with primers with degenerate sequences, which were designed using the Euplotes p123 RT motifs B min and C, selected.
Of the four main products generated, one encoded a peptide sequence that is homologous to Euplotes p123 and S. cerevisiae Est2p. The complete sequence of the S. pombe TRT homologous protein was probed using this PCR product by screening cDNA and genomic libraries of S. pombe and amplification of S. pombe RNA obtained by reverse transcription and PCR (RT-PCR). The full sequence of the S. pombe gene (trt1 min min; Genbank accession number AF015783; Fig. 15) showed that the homology between p123 and Est2p was particularly high in the motifs for reverse transcriptase.
Amplification using degenerate primers derived from the Telomerase RT motifs was also used to obtain TRT gene sequences from Oxytricha trifallax and Tretrahymena thermophila as described in Example 1.
The sequences according to the invention Euplotes p123, S. pombe trt1 and S. cerevisiae Est2p were searched in computerized databases of human expressed sequences "tags" (ESTs) using the program "BLAST" (Altschul et al. , J. Mol. Biol. 215 (1990), 403). The search in this database with the Est2p sequence gave no match, a human EST (Genbank accession number AA281296; see SEQ. ID. No. 8) however, as described in Example 1, could be identified by searching with p123 and trt1 sequences. This human EST is believed to encode a homologous protein. Complete sequencing of the cDNA clone containing the EST (hereinafter referred to as "clone 712562"; see SEQ. ID. No. 3) showed the presence of seven RT motifs.
However, this clone could not encode a coherent human TRT, since the motifs B min, C, D and E were contained in a different open reading frame (ORF) compared to the more NH2-terminal motifs. In addition, the distance between motifs A and B min was significantly smaller than for the TRTs already characterized. (Clone 712562 was M. A. G. E. -Consortium received; Lennon et al. , Genomics 33 (1996), 151).
The cDNA clone pGRN121, which encodes a functional hTRT (SEQ. ID. No. 1) was isolated from a cDNA library which originated from the human cell line 293 (see Example 1). Comparison of clone 712562 with pGRN121 showed that clone 712562 had a deletion of 182 base pairs between motifs A and B min (SEQ. ID. No. 9). The additional 182 base pairs in pGRN121 mean that all TRT motifs are present in a single open reading frame and that the distance between the areas of motif A and motif B min increases so that this is consistent with the distance at other known TRTs. As described below in the examples (e.g. B. Example 7) encodes SEQ. ID. No. 1 shows a catalytically active telomerase protein with the sequence of SEQ. ID. No. 2nd The polypeptide from SEQ. ID.
No. 2 has 1132 amino acids and an estimated molecular weight of about 127 kilodaltons (kD).
As discussed below and described in Example 9, the 182 base pair deletion of TRT cDNAs characteristic of clone 712562 are performed following reverse transcription of mRNA from telomerase positive cells (e.g. B. Testes and 293 cells) detected. hTRT RNAs lacking this 182 base pair sequence are commonly referred to as "DELTA 182 variants" and can represent one, two or more species. The hTRT variants to which the pGRN121 cDNA (SEQ. ID.
No. 1) found sequence of 182 base pairs is absent, most likely do not encode a telomerase enzyme with complete catalytic activity, but they can play a role in telomerase regulation as described below and / or have partial telomerase activity, for example an activity for telomeric binding or hTR binding, as discussed below.
One aspect of the present invention is thus to provide an isolated polynucleotide with a sequence of a naturally occurring human TRT gene or an mRNA, a polynucleotide with the sequence of SEQ. ID. No. 1 is included, but is not limited to this. A related aspect of the present invention relates to the provision of a polynucleotide encoding an hTRT protein, a fragment, a variant or a derivative. Another related aspect of the present invention relates to the provision of "sense" and "antisense" nucleic acids that bind to an hTRT gene or mRNA.
The present invention further provides hTRT proteins that are either synthesized or purified from natural sources, as well as antibodies and other agents that specifically bind an hTRT protein or a fragment thereof. The present invention also provides many new methods, including methods using the above-mentioned compositions, for example by providing diagnostic and prognostic assays for human diseases, methods of drug development and therapeutic methods, of identification of telomerase-associated proteins and methods of screening for agents that can activate or inhibit telomerase activity. Numerous other aspects and embodiments of the present invention are provided below.
One aspect of the invention is the use of a polynucleotide that is approximately 10 kb or more in length and comprises a sequential sequence of at least 10 nucleotides that is identical or identical to a sequential sequence in a naturally occurring hTRT gene or hTRT mRNA is exactly complementary to examining or screening (for) an hTRT gene sequence or an hTRT mRNA or for producing a recombinant host cell. Another aspect of the invention is the use of an agent that increases expression of hTRT in the manufacture of a medicament for treating a condition that is treated by increasing the proliferation capacity of a vertebrate cell, optionally using the medicament to inhibit the effects of aging .
Another aspect of the invention relates to the use of an inhibitor of telomerase activity in the manufacture of a medicament for the treatment of a condition associated with an increased level of telomerase activity within a human cell. The proteins, variants and fragments according to the invention and the coding polynucleotides or fragments are also provided in a further aspect of this invention for use as a medicament.
The invention further relates to the use of a protein, a variant or a fragment thereof or a polynucleotide or fragment, as defined here, in the manufacture of a medicament, for example in the manufacture of a medicament for inhibiting an effect of aging or cancer.
In certain embodiments of the invention, the hTRT polynucleotides are not the 389 nucleotide polynucleotide of SEQ. ID. No. 8 and / or not clone 712562, the plasmid containing an insert with the sequence of SEQ. ID. No. 3 in Fig. 18th
The description below is organized by topic. Part II describes further amino acid motifs characteristic of TRT proteins. Parts III to VI describe, among other things, nucleic acids, proteins, antibodies and purified compositions of the invention, with a focus on compositions related to human TRT. Part VII describes, among other things, methods and compositions of the invention that are useful for the treatment of human diseases. Part VIII describes the production and identification of immortalized human cell lines. Part IX describes, among other things, the use of the nucleic acids, polynucleotides and other compositions according to the invention for the diagnosis of human diseases. Part X is a glossary of terms used in Parts I to IX.
Part XI describes examples which relate to specific embodiments according to the invention. The description of the invention is structured according to topics and subtopics in order to make the subject more understandable, but is in no way a limitation.
II. TRT genes and proteins
The present invention provides isolated and / or recombinant genes and proteins that comprise a sequence of a catalytic subunit of the telomerase protein (i.e. H. Telomerase reverse transcriptase) have, including, but not limited to, the naturally occurring forms of such genes and proteins in isolated or recombinant form. Typically, TRTs are large, basic proteins with amino acid motifs specific for reverse transcriptase (RT) and telomerase, as disclosed herein. Since these motifs are conserved within different organisms, TRT genes can be obtained from numerous organisms using the methods according to the invention or using primers, nucleic acid probes and antibodies according to the invention, for example those which are specific for one or more of the motif sequences.
The seven RT motifs found in TRTs are similar to those found in other reverse transcriptases, but have special characteristics. For example, within the TRT-RT motifs as in Fig. 4 shows a series of amino acid substitutions (marked with an arrow) in amino acid residues that are highly conserved within the other RTs. For example, there are two aspartic acid residues (DD) in motif C that coordinate the metal ions in the active center (see Kohlstaedt et al. , Science 256 (1992), 1783; Jacobo-Molina et al. , Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90 (1993), 6320; Patel et al. , Biochemistry 34 (1995), 5351) in the context hxDD (F / Y) in the RTs of telomerase, while these occur in the other RTs in the context (F / Y) xDDh, where h is a hydrophobic amino acid and "x "is any amino acid; see Xiong et al. , EMBO J. 9 (1990) 3353; Eickbush, in The Evolutionary Biology of Viruses (p. Morse Ed. Raven-Press, NY, S. 121 (1994 ".
Further systematic exchanges characteristic of the telomerase subgroups occur in motif E, in which WxGxSx represents a "consensus" sequence or is conserved within the telomerase proteins, while hLGxxh is characteristic of other RTs (Xiong et al. , a. a. 0; Eickbush, a. a. O. ) This motif E is referred to as the "primer grip" and it has been described that mutations in this area influence the "RNA priming", but not the "DNA priming" (Powell et al. , J. Biol. Chem. 272 (1997), 13262). Since telomerases are a DNA primer (e.g. B. that 3 min end of the chromosome), it is not surprising that telomerase differs from other RTs in the area of the "primer handle".
In addition, the distance between motifs A and B min is greater in the TRTs than is typically the case in the other RTs, which may represent an insertion within the "finger" region of the structure that resembles a right hand ( Fig. 3; see Kohlstaedt et al. , a. a. O. ; Jacobo-Molina et al. , a. a. O. ; and Patel et al. , a. a. O. ).
Furthermore, the T motif, as mentioned above, is an additional characteristic of TRT proteins. That for example in Fig. 4 shown T-motif (W-L-X-Y-X-X-h-h-X-h-h-X-p-F-F-Y-X-T-E-X-p-X-X-X-p-X-X-X-Y-X-R-K-X-X-W, where X is any amino acid, can be described using the following formula: h is hydrophobic and p polar) comprises a sequence,
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where X is any amino acid and the subscript refers to a number of consecutive residues, R1 is leucine or isoleucine, R2 is glutamine or arginine, R3 is phenylalanine or tyrosine and R4 is lysine or histidine.
The T-motif can also be described using the following formula:
EMI31. 2nd
where X is any amino acid and a subscript refers to a number of consecutive residues, R1 is leucine or isoleucine, R2 glutamine or arginine, R3 phenylalanine or tyrosine, R4 lysine or histidine, h a hydrophobic amino acid selected as Ala, Leu, Ile, Val, Pro, Phe, Trp, and Met and p is a polar amino acid selected as Gly, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn and Gln.
In a further embodiment, the present invention provides isolated, naturally occurring and recombinant TRT proteins that contain one or more of the proteins shown in FIG. 11 illustrated motifs include, for example,
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If the shown TRT protein contains more than one TRT motif, the order (NH2-> COOH) is as in Fig. 4 shown.
In another embodiment, the present invention provides isolated, naturally occurring TRT proteins that include the following super motif:
EMI32. 2nd
It will be apparent to those skilled in the art having the reagents disclosed herein, including the TRT sequences, that with these reagents and the methods and teachings provided herein (including specific procedures described below), TRT genes and proteins are obtained from those skilled in the art, isolated and can be produced in recombinant form. For example, primers (e.g. B. degenerate amplification primers) which hybridize with gene sequences which encode characteristic RT and T motifs for TRT.
For example, one or more primers or degenerate primers can be made that hybridize to sequences that encode the FFYXTE region of the T motif, other TRT motifs (as discussed below), or combinations of motifs or "consensus" sequences based on the codon usage of the target organism, and to amplify the TRT gene sequence from genomic DNA or cDNA produced by the target organism. The use of degenerate primers is well known in the art. This also includes primer sets that hybridize to the set of nucleic acid sequences that may encode the amino acids of the target. The preference and use of certain codons within the target organism must be considered. Amplification (e.g. B.
PCR) conditions applied, which are suitable to allow mismatches of bases in the addition steps of the PCR. Typically two primers are used, single primer amplification systems (or in this case a set with a single degenerate primer) are well known and can also be used to obtain TRT genes.
Table 1 shows examples of primers according to the invention which are used for the amplification of new TRT nucleic acids, in particular those from vertebrates (e.g. B. Mammals). "N" is an equimolar mixture of all four nucleotides and sequences in brackets represent equimolar mixtures of the specified nucleotides.
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In one embodiment, an amplified TRT nucleic acid is used as a hybridization probe for colony hybridization with a gene bank (e.g. B. a cDNA library), which was produced from the target organism, wherein a nucleic acid with which the sequence coding for all or a substantial part of the TRT protein is identified and isolated or cloned. Reagents and methods, such as those just described, are used in accordance with the methods described herein for obtaining TRT gene sequences from Oxytricha trifallax and Tetrahymena thermophila, as described in detail below.
Of course, following the cloning of a previously uncharacterized TRT gene, the sequence can be determined by routine methods and the encoded polypeptide synthesized and examined for TRT activity, for example the catalytic activity of telomerase (as described here and / or by means of the Field of known telomerase assays).
It is also obvious to the person skilled in the art that TRT genes can be cloned using a large number of cloning methods according to the invention, since the TRT motif sequences and the nucleic acids according to the invention comprising such sequences can be used in a large number of such methods. For example, hybridization using a probe based on the sequence of a known TRT with DNA or other nucleic acid libraries from the target organism as described in Example 1 can be used. Degenerate PCR primers or their amplification products, for example those described above, can themselves be labeled and used as hybridization probes. In a further embodiment, expression cloning methods are used.
For example, one or more antibodies that specifically bind peptides that span a TRT motif or other TRT epitope, such as the FFYXTE motif (where X represents any of the 20 standard amino acids) specifically bind to isolate a ribosomal Complex can be used, which comprises a TRT protein and the encoding mRNA. To produce the antibodies according to the invention, the peptide immunogens typically have a length of 6 to 30 amino acids, preferably 10 to 20 amino acids. The antibodies can also be used to screen a cDNA expression bank derived from the desired organism to identify a clone encoding a TRT sequence.
In a further embodiment, in order to identify a clone encoding a TRT sequence, DNA databases can be searched by computer for DNAs which contain conserved sequences within known TRTs.
Another aspect of the present invention relates to the provision of compositions comprising an isolated or recombinant polypeptide having the sequence of a naturally occurring TRT protein. Typically, the naturally occurring TRT has a molecular weight between about 80,000 daltons (d) and about 150,000 d, preferably between about 95,000 d and about 130,000 d. Typically, the naturally occurring TRT has a positive total charge at pH 7 (with the estimated pI typically being above 9). In one embodiment, the polypeptide has a telomerase activity as defined here. In a related embodiment, the polypeptide has a sequence for a TRT-specific region (T motif) and a telomerase activity. The invention also provides fragments of such polypeptides.
The present invention also provides isolated or recombinant polynucleotides with the sequence of a naturally occurring gene encoding a TRT protein. The invention also provides isolated TRT polynucleotides with a sequence of a non-vertebrate TRT (e.g. B. of yeast) and vertebrates, e.g. mammals (e.g. B. Mice or humans). The isolated polynucleotides can be associated with other naturally occurring or vector nucleic acid sequences. Typically, the length of the nucleic acid isolated is less than about 300 kb, preferably less than about 50 kb, more preferably less than about 20 kb, and most preferably less than about 10 kb. Occasionally the length is less than about 5 kb or 2 kb.
In some embodiments, the isolated TRT polynucleotide is even smaller, for example, a gene fragment, primer, or probe less than about 1 kb or 0.1 kb in length.
III. Nucleic acids
A) General
The present invention provides isolated and recombinant nucleic acids with a sequence of a polynucleotide encoding a catalytic subunit of the telomerase protein (TRT), for example a recombinant TRT gene from Euplotes, Tetrahymena, S. pombe or people. Examples of polynucleotides are shown in Fig. 13 (Euplotes), Fig. 15 (p. pombe) and Fig. 16 (human, gene bank accession number AF15950). The present invention provides "sense" and "anti-sense" polynucleotides with a TRT gene sequence, including probes, primers, TRT protein-encoding polynucleotides and the like.
B) Human TRT
The present invention provides nucleic acids with a sequence of a human telomerase catalytic subunit (i.e. H. hTRT).
One aspect of the invention relates to the provision of a polynucleotide with a sequence or sub-sequence of a human TRT gene or an RNA. In one embodiment, the polynucleotide according to the invention has a sequence of the SEQ. ID. No. 1 (Fig. 16) or a sub-sequence thereof. In a further embodiment, the polynucleotide has a sequence of the SEQ. ID. No. 3 (Fig. 18), SEQ. ID. No. 4 (Fig. 20) or sub-sequences thereof. The invention also provides polynucleotides with sequences substantially identical to the hTRT nucleic acid sequences disclosed herein, for example SEQ. ID. No. 1 and the other sequences disclosed (e.g. B. SEQ. ID. No. 4, 6 (Fig. 21) and 7 (Fig. 12)).
Thus, the invention provides naturally occurring alleles of the human TRT genes and variants of the polynucleotide sequences with one or more nucleotide deletions, insertions or substitutions based on an hTRT nucleic acid sequence disclosed herein. As described below, variants of the nucleic acids can be made using the recombination or synthetic methods described below, or by other means.
The invention also provides isolated and recombinant polynucleotides with a sequence of a flanking region of a human TRT gene. These polynucleotides include those derived from genomic sequences from untranslated regions of the hTRT mRNA. An example of a genomic sequence is SEQ. ID. No. 6 (Fig. 21). As described in Example 4, SEQ. ID. No. 6 obtained by sequencing the clone lambda G PHI 5 isolated from a human genome library. lambda G PHI 5 contains an insert with a length of 15 kilobase pairs (kbp), which include approximately 13,000 bases 5 minutes to the hTRT coding sequences. This clone contains hTRT promoter sequences and further regulatory sequences of the hTRT gene (e.g. B. Enhancer).
The invention also provides isolated and recombinant polynucleotides with a sequence from an intron region of a human TRT gene. An example of an intron sequence is SEQ. ID. No. 7 (see example 3 and Fig. 12). In some embodiments, hTRT introns are included in "minigenes" for enhanced expression of hTRT proteins in eukaryotic cells.
A related aspect of the present invention relates to the provision of polynucleotides encoding hTRT proteins or protein fragments, including modified and modified hTRT polypeptides and variants of the hTRT polypeptides. In one embodiment, the encoded hTRT protein or fragment has one as in SEQ. ID. No. 2 (Fig. 17) shown amino acid sequence or an amino acid sequence with conservative exchanges of the SEQ. ID. No. 2nd In one embodiment, the encoded hTRT protein or fragment has exchanges that indicate activity of the protein (e.g. B. have catalytic activity of telomerase).
Of course, due to the degeneracy of the genetic code, the nucleic acids encoding the hTRT protein need not have the sequence of a naturally occurring hTRT gene, i.e. H. a variety of polynucleotides can be an hTRT polypeptide having an amino acid sequence of SEQ. ID. No. 2 code. The present invention provides any possible variation of nucleotide sequences produced by the selection of combinations based on the selection of possible codons in accordance with the known triplet genetic code. All of these variations are hereby expressly disclosed.
Thus, in some cases, nucleotide sequences encoding hTRT polypeptides that can hybridize with the nucleotide sequences of the naturally occurring sequence (under suitably selected conditions of stringency) are preferred, but in other cases it may be advantageous to produce nucleotide sequences encoding hTRT that one have essentially different condon usage.
In certain embodiments, the invention provides hTRT oligo- and polynucleotides that comprise a sub-sequence of an hTRT nucleic acid disclosed herein (e.g. B. SEQ. ID. No. 1, 4, 6 and 7). The nucleic acids according to the invention typically comprise at least about 10, preferably at least about 12 or about 15 consecutive bases of the explained hTRT polynucleotide. The nucleic acids according to the invention often also comprise a longer sequence, for example a sequence with a length of at least about 25, about 50, about 100, about 200 or at least about 500 bases, for example if expression of a polypeptide is desired. In some embodiments of the present invention, the hTRT polynucleotide differs from a polynucleotide having the sequence of EST AA281296 (SEQ. ID. No. 8th).
Further embodiments of the present invention provide "DELTA 182hTRT" polynucleotides with a sequence encoding naturally occurring or non-naturally occurring hTRT polynucleotides, for example SEQ. ID. No. 3 or SEQ. ID. No. 4, which is not the 182 base pair sequence found in pGRN121 (SEQ. ID. No. 9 (Fig. 24)), which is also missing in clone 712562). These polynucleotides are of interest in part because they encode polypeptides containing combinations of TRT motifs derived from that found in full length hTRT polypeptide (SEQ. ID. No. 2), for example the polypeptide encoded by pGRN121.
As discussed below, it is believed that these polypeptides can play a biological role in nature (e.g. B. can be used to regulate the expression of telomerase in cells) and / or as a medicament (e.g. B. as dominant-negative products which inhibit the function of the wild-type protein) or that these polypeptides have further roles and uses, for example those described here.
For example, in contrast to clone pGRN121, clone 712562 encodes a protein with 259 amino acid residues and an estimated molecular weight of approximately 30 kD (hereinafter referred to as "712562 hTRT"). The 712562 hTRT polypeptide (SEQ. ID. No. 10 (Fig. 19)) contains motifs T, 1, 2 and A, but not motifs B min, C, D and E. Similarly, a variant of the hTRT polypeptide with therapeutic and other activities can be expressed from a nucleic acid that is similar to the pGRN121 cDNA but lacks the 182 base pairs that the clone 712562 does not have, for example with the sequence SEQ. ID. No. 4th
This nucleic acid (hereinafter referred to as "pro90hTRT"), which can be synthesized using routine synthetic methods or recombinant methods as described here, encodes a protein with 807 amino acid residues (estimated molecular weight about 90 kD) that has the same amino terminal sequences like that of SEQ. ID. No. 1 encoded hTRT protein, but deviates at the carboxy-terminal region (the first 763 amino acid residues have both proteins in common, the last 44 amino acid residues of pro90hTRT differ from the full-length hTRT). The pro90hTRT polypeptide contains the motifs T, 1, 2 and A, but not the motifs B, C, D and E and can therefore have some, but not all, telomerase activities.
C) Production of human TRT nucleic acids
There are numerous applications for the polynucleotides according to the invention. These include, but are not limited to, the expression of polypeptides encoding hTRT or fragments thereof, the use as "sense" or "antisense" probes or primers for the hybridization and / or amplification of naturally occurring hTRT genes or RNAs ( e.g. B. for diagnostic or prognostic applications) and as a medicine (e.g. B. in "antisense", triplex or ribozyme compositions). After reading this disclosure, it is apparent that these uses have a tremendous impact on the diagnosis and treatment of human diseases related to aging, cancer and fertility, and also on the growth, reproduction and manufacture of products based on them Cells.
As described in the sections below, the hTRT nucleic acids of the invention can be prepared using known techniques (e.g. B. by cloning, synthesis or amplification).
1) Cloning, amplification and recombinant production
In one embodiment, hTRT genes or cDNAs are cloned using a nucleic acid probe that hybridizes specifically to hTRT mRNA, cDNA or genomic DNA. A sample suitable for this purpose is a polynucleotide with the sequence set out in SEQ. ID. No. 1 is provided or a sub-sequence thereof. Typically, the genomic DNA or cDNA is ligated to the target hTRT in a vector (e.g. B. a plasmid, phage, virus, artificial yeast chromosome etc. ) and it can be in a genomic bank or cDNA bank (e.g. B. a human placenta cDNA library). After an hTRT nucleic acid is identified, it can be isolated according to standard procedures known to those skilled in the art.
An example illustrating the screening of a human cDNA library for the hTRT gene is Example 1; a similar example relating to the screening of a human genomic library is Example 4. Cloning methods are generally known and are described, for example, in Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. , Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); Berger and Kimmel, Methods In Enzymology, Vol. 152: Guide To Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc. (1987); Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York (1997); Cashion et al. , U.S. Patent No. 5,017,478; and Carr. EP-B1 0 246 864.
The invention also provides genomic hTRT nucleic acids or cDNA-hTRT nucleic acids available by amplification methods such as. B. the polymerase chain reaction (PCR) was isolated. In one embodiment, the sequence encoding the hTRT protein is amplified from an RNA sample or cDNA sample (e.g. B. double-stranded placenta cDNA (Clontech, Palo Alto CA "using the primers
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In some embodiments, a third primer or pair of primers can be used, for example, for "nested PCR" to increase specificity. An example of a second pair of primers is
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It will be apparent to those skilled in the art that numerous other primers and combinations of primers useful for the amplification of hTRT nucleic acids are provided by the present invention.
In addition, the invention provides primers which amplify any specific region (for example coding regions, promoter regions and / or introns) or a sub-sequence of genomic hTRTDNA, cDNA or RNA. For example, the hTRT intron at position 274/275 of SEQ. ID. No. 1 (see Example 3) are amplified (e.g. B. for the detection of genomic clones) using the primer TCP1. 57 and TCP1. 52 (primer pair 1) or the primer TCP1. 49 and TCP1. 50 (primer pair 2). (The designations for the primers refer to the primers listed in Table 2 below). The primer pairs can be used individually or in a "nested PCR" in which the primer set 1 is used first.
Another illustrative example relates to primers that specifically amplify and thus detect (e.g., the 5 min end of the hTRT mRNA or the exon encoding the 5 min end of the hTRT gene). B. to assess the size or completeness of a cDNA clone). The following primer pairs are useful for amplifying the 5 min end of hTRT: primers K320 and K321 (primer pair 3); Primers K320 and TCP1. 61 (primer pair 4); Primers K320 and K322 (primer pair 5). The primer sets can be used in a "nested PCR" in the order of set 5, then set 4 or set 3, or set 4 and then set 3.
Another illustrative example relates to primers selected for specific amplification or detection of the conserved hTRT-TRT motif region, which comprises approximately the middle third of the mRNA (e.g. B. for use as a hybridization probe to identify TRT clones from non-human organisms). The following primer pairs are useful for amplifying the TRT motif region of hTRT nucleic acids: primers K304 and TCP1. 8 (primer pair 6), or primers LT1 and TCP1. 15 (primer pair 7). The primer sets can be used in an experiment with "nested PCR" in the order set 6, then set 7.
Suitable conditions for PCR amplification are known to the person skilled in the art. These include (without limitation) 1 unit of Taq polymerase (Perkin Elmer, Norwalk CT), each 100 μM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 x PCR buffer (50 mM KCl, 10 mM Tris, pH -Value 8.3 at room temperature, 1.5 mM MgCl2, 0.01% gelatin) and 0.5 μM primer, the amplification being about 30 cycles at 94 ° C. for 45 seconds, 55 ° C. for 45 seconds and 72 DEG C covers for 90 seconds. It will be apparent to those skilled in the art that other thermostable DNA polymerases, reaction conditions and parameters related to the cycles also provide suitable amplification. Other suitable methods for in vitro amplification that can be used to obtain hTRT nucleic acids include, but are not limited to, the methods described below.
After amplification, the hTRT nucleic acids, if desired, can be cloned into a variety of vectors using routine molecular biology techniques, detected, or otherwise used in accordance with the methods of the invention.
It is known to the person skilled in the art that the cloned or amplified hTRT nucleic acids obtained as described above can be prepared or propagated using further methods, for example by chemical synthesis or replication by transformation into bacterial systems such as E. coli (see for example Ausubel et al. , a. a. O. ) or eukaryotic expression systems, for example mammalian expression systems.
Similarly, hTRT-RNA can be used in accordance with the in vitro methods according to the invention or in bacterial systems such as E. coli are expressed, for example, without using commercially available vectors containing promoters recognized by an RNA polymerase, such as T7, T3 or SP6, or by transcription of DNA generated by PCR amplification using Primers containing an RNA polymerase promoter.
The present invention further provides altered or modified hTRT nucleic acids. It will be apparent to those skilled in the art that the cloned or amplified hTRT nucleic acids obtained by well known methods (e.g. B. site-directed mutagenesis, "linker scanning" mutagenesis) can be modified (for example shortened, derivatized, modified), or simply synthesized de novo, as described below. The altered or modified hTRT nucleic acids are useful for a variety of uses, including, but not limited to, facilitating cloning, manipulating an hTRT gene or gene product, or expressing a variant of an hTRT gene product.
For example, in one embodiment, the hTRT gene sequence is altered to encode an hTRT polypeptide with altered properties or activities, as discussed in detail below, for example, by mutation in a conserved motif from hTRT. In another illustrative example, the mutations in the protein coding region of an hTRT nucleic acid can be used to change the glycosylation pattern, to change codon preferences, to produce splice variants, to remove protease-sensitive sites, to generate antigens Domains, to modify specific activity etc. be introduced.
In further embodiments, the sequence encoding hTRT and its derivatives is changed without changing the encoded amino acid sequences, for example to produce RNA transcripts with more desirable properties, such as, for example, increased translation efficiency or a longer or shorter half-life in comparison to transcripts that occur from the naturally occurring one Sequence were made. In a further embodiment, to increase the expression rate of the peptide in a special prokaryotic or eukaryotic expression host, modified codons are selected according to the frequency with which certain codons are used by the host.
Useful in vitro and in vivo recombination methods which can be used to produce the hTRT polynucleotide variants according to the invention can be found in Sambrook et al. and Ausubel et al. , a. a. O. , being found.
As previously mentioned, the present invention provides nucleic acids with flanking (5 min or 3 min) and intron sequences of the hTRT gene. The nucleic acids are u. a. of interest because they contain promoters and other regulatory elements that are involved in hTRT regulation and are useful for the expression of hTRT and other recombinant proteins or RNA gene products. It is obvious that in addition to those in SEQ. ID. No. 6 (Fig. 17) and 7 provided nucleic acid sequences additional hTRT intron sequences and flanking sequences can be easily obtained using routine methods of molecular biology. For example, an additional genomic hTRT sequence can be obtained by further sequencing of the lambda clone G PHI 5, which is described above and in Example 4.
In addition, other hTRT genomic clones and sequences can be screened by screening a human genomic library using an hTRT nucleic acid probe with a sequence or sub-sequence of SEQ. ID. No. 1 can be obtained. Other clones and sequences (e.g. B. even further upstream) can be obtained using labeled sequences or subclones derived from lambda G PHI 5 to search for suitable gene banks. Other useful methods for further characterizing flanking hTRT sequences are the general methods described by Gobinda et al. , PCR meth. Applic. 2 (1993), 318; Triglia et al. , Nucleic Acids Res. 16: 8186 (1988); Lagerstrom et al. , PCR Methods Applic. 1: 111 (1991); and Parker et al. , Nucleic Acids Res. 19 (1991), 3055.
Intron sequences can be identified by routine means, for example by comparing the genomic hTRT sequence with hTRT cDNA sequences (see for example Example 3), by S1 analysis (see Ausubel et al. , a. a. O. ; Chapter 4), or numerous other agents known in the art. Intron sequences can also be found in pre-mRNA (i.e. H. spliced or incompletely spliced mRNA precursors) can be found. These can be amplified or cloned after reverse transcription of cellular RNA.
If desired, the cloned, amplified, or otherwise synthesized hTRT nucleic acid or other TRT nucleic acid can be determined or verified using well known methods for DNA sequencing (see, for example, Ausubel et al. , a. a. O. ) The useful sequencing methods use enzymes such as the Klenow fragment of DNA polymerase I, Sequenase (US Biochemical Corp. , Cleveland OH), Taq DNA polymerase (Perkin Elmer, Norwalk CT), thermostable T7 polymerase (Amersham, Chicago IL), or combinations of recombinant polymerases and exonucleases with "proofreading" activity, for example the ELONGASE amplification system available from Gibco BRL (Gaithersburg MD). For sequencing or verifying the sequence of oligonucleotides (e.g. B.
Oligonucleotides made by de novo chemical synthesis), the method of Maxam and Gilbert is preferred (Maxam and Gilbert, Meth. Enz. 65: 499 (1980); Ausubel et al. , a. a. O. , Chapter 7).
The 5 min untranslated sequences of hTRT or other TRT mRNAs can be determined directly by cloning a "full length" hTRT or other cDNA using standard methods such as reverse transcription of mRNA and then by cloning and sequencing the obtained cDNA will. Preferred libraries obtained by oligo (dT) priming for screening or amplifying full-length cDNAs selected by size to include larger cDNAs are preferred. Genebanks obtained by "random priming" are also suitable. These often contain a large proportion of clones that contain 5 min regions of genes. Other generally known methods for obtaining 58 RNA sequences can be used, for example that of Frohman et al. , Proc. Nat. Acad.
Sci. , USA 85 (1988), 8998, described RACE protocol. If desired, the transcription start site of an hTRT or other TRTmRNA can be routinely used using the nucleic acids provided herein (e.g. B. those with the sequence of SEQ. ID. No. 1) can be determined. One method is the S1 nuclease analysis (Ausubel et al. , a. a. O. ), in which a labeled DNA with a sequence of the 5 min region of SEQ. ID no. 1 is used.
2) Chemical synthesis of nucleic acids
The present invention also provides hTRT polynucleotides (RNA, DNA or modified) made by direct chemical synthesis. Chemical synthesis is generally used for the production of oligonucleotides or of oligonucleotides and polynucleotides containing non-standard nucleotides (e.g. B. Probes, primers and "antisense" oligonucleotides) are preferred. The direct chemical synthesis of nucleic acids can be accomplished by methods known in the art, for example by the phosphotriester method of Narang et al. , Meth. Enzymol. 68: 90 (1979); the phosphodiester method of Brown et al. , Meth. Enzymol. 68: 109 (1979); the diethyl phosphoramidite method of Beaucage et al. , Tetra. Lett. 22: 1859 (1981); and the method of U.S. Patent No. 4,458,066 using a solid support.
Chemical synthesis typically produces a single-stranded oligonucleotide that can be converted to double-stranded DNA by hybridization with a complementary sequence or by polymerization with a DNA polymerase and an oligonucleotide primer using the single strand as a template. The person skilled in the art is aware that although the chemical synthesis of DNA is often limited to sequences of about 100 or 150 bases, longer sequences can be obtained by ligation of the shorter sequences or by more sophisticated synthetic methods.
The hTRT polynucleotides and oligonucleotides (or hTRT or other polynucleotides or oligonucleotides) according to the invention can be used using non-standard bases (e.g. B. those that differ from adenine, cytidine, guanine, thymine and uridine) or non-standard backbone structures to achieve desired properties (e.g. B. increased nuclease resistance, closer binding, stability or a desired TM) can be produced. The processes described in the PCT publication WO 94/12 633 are among those for the production of nuclease-resistant oligonucleotides.
A large number of useful modified oligonucleotides can be made, including oligonucleotides with a peptide nucleic acid (PNA) backbone (Nielsen et al. , Science 254 (1991), 1497) or the incorporation of 2 min -O-methylribonucleotides, phosphorothioate nucleotides, methylphosphonate nucleotides, phosphotriester nucleotides, phosphorothioate nucleotides and phosphoramidates.
Other useful oligonucleotides can contain alkyl and halogen-substituted sugar moieties that contain one of the following groups at the 2 min position: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3OCH3, OCH3O (CH2) nCH3, O (CH2) nNH2 or O (CH2) nCH3, where n is from 1 to about 10; C1 to C10 lower alkyl, substituted lower alkyl, alkaryl or aralkyl; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S-, or N-alkyl; O-, S-, or N-alkenyl; SOCH3, SO2CH3; ONO2; NO2; N3, NH2; Heterocycloalkyl; Heterocycloalkaryl; Aminoalkylamino; Polyalkylamino, substituted silyl; an RNA cleaving group, a cholesterol group, a folate group, a reporter group, an intercalator, a group for improving the pharmacokinetic properties of an oligonucleotide; or a group to improve the pharmacodynamic properties of an oligonucleotide and other substituents with similar properties.
Folate, cholesterol and other groups that facilitate the uptake of the oligonucleotide, such as lipid analogs, can be added directly or via a linker at the 2 min position of each nucleoside or at the 3 min or 5 min position of the 3 min terminal respectively. 5 min -terminal nucleoside. One or more such conjugates can be used. Oligonucleotides can also have sugar "mimetics", for example cyclobutyls instead of the pentofuranosyl group. Other embodiments may include at least one modified base form or a "universal base" such as inosine, or the inclusion of other non-standard bases such as queosine and wybutosine, as well as acetyl, methyl, thio and similarly modified forms of adenine, cytidine, guanine, thymine and Uridine, which are not easily recognized by endonucleases.
The invention further provides oligonucleotides with backbone analogs, including phosphodiester, phosphorothioate, phosphorodithioate, methylphosphonate, phosphoramidate, alkylphosphotiester, sulfamate, 3 min -thioacetyl, methylene (methylimino), 3min -N-carbamate, morpholine carbamate, chiral-methylphosphonate, N short chain alkyl or cycloalkyl linkages between the sugars, short chain links ("backbone links") between the sugars with different atoms or those which are heterocyclic or CH2-NH-OCH2, CH2-N (CH3) -OCH2, CH2 (-N (CH3) -CH2, CH2-N (CH3) -N (CH3) -CH2 and ON (CH3) -CH2-CH2 backbones (where phosphodiester is OPO-CH2), or mixtures of these compounds. Also useful are oligonucleotides with a morpholino backbone structure (U.S. Patent No. 5 034 506).
* Other useful literature includes: Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, F. Eckstein (ed. ) IRL Press at Oxford University Press (1991); Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Vol. 600, Baserga and Denhardt (ed. ) (NYAS 1992), Milligan et al. , J. Med. Chem. 36 (14) (9 July 1993), 1923-1937; Antisense Research and Applications (1993, CRC Press) the entire publication and specifically Chapter 15 of Sanghvi, entitled "Heterocyclic base modifications in nucleic acids and their applications in antisense oligonucleotides. "Antisense Therapeutics, Sudhir Agrawal (Editor (Humana Press, Totowa, New Jersey, 1996).
D) The labeling of nucleic acids
It is often useful to label the nucleic acids according to the invention, for example if the hTRT or other oligonucleotides or polynucleotides are to be used as nucleic acid probes. The markings (see below) can be incorporated by any means known to those skilled in the art. In one embodiment, an unamplified nucleic acid (e.g. B. mRNA, poly-A mRNA, cDNA). Agents for the production of labeled nucleic acids are generally known to the person skilled in the art. These include, for example, nick translation, marking using "random priming", end marking (e.g. B. using a kinase) and chemical conjugation (e.g. B. Photobiotinylation). In a further embodiment, the label is incorporated simultaneously during an amplification step in the preparation of the sample nucleic acids.
Thus, for example, the polymerase chain reaction (PCR) or other nucleic acid amplification methods with labeled primers or labeled nucleotides provide a labeled amplification product. In a further embodiment, transcription amplification using a labeled nucleotide (e.g. B. Fluorescein-labeled UTP and / or CTP) incorporated a label in the transcribed nucleic acids. An amplification product can also or alternatively be marked after completion of the amplification.
E) Examples of oligonucleotides
As noted above and discussed in detail below, oligonucleotides are used for a variety of uses, such as primers, probes, therapeutic or other "antisense" oligonucleotides, and triplex oligonucleotides. Numerous other possible uses result from the present description. Table 2 illustrates certain specific oligonucleotides that can be used in the practice of the invention. Of course, numerous other useful oligonucleotides according to the invention can be synthesized by the person skilled in the art on the basis of the teaching provided here.
In Table 2, "seq" means that the primer has been used or is useful for sequencing; "PCR" means that the primer has been used for, or is useful for, PCR; "AS" means that the primer has been used or useful for "antisense" inhibition of telomerase activity; "CL" means that the primer has been used or useful for cloning regions of hTRT genes or RNA; "mut" means that the primer has been used or useful for constructing mutants of hTRT genes or gene products. "UC" means "Upper case" and "lc" means "lower case". Mismatches and insertions (relative to SEQ. ID No. 1) are underlined; Deletions are indicated by a "-".
Of course, none of the information in Table 2 is intended to limit the use of a particular oligonucleotide to any single use or set of uses.
EMI54. 1
EMI55. 1
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IV. TRT proteins and peptides
A) General
The invention provides a wide variety of hTRT proteins that are useful, inter alia, for inhibiting telomerase activity in a cell, for inducing an anti-hTRT immune response, as a therapeutic reagent, as a standard, or as a control in a diagnostic assay , as a target in screening for activation or inhibition of an activity of hTRT or telomerase and numerous other possible uses are either described here or obvious to the person skilled in the art.
The hTRT proteins according to the invention include functionally active proteins (e.g. B. are useful for transferring telomerase activity into a telomerase negative cell) and variants, inactive variants (e.g. B. are useful for inhibiting telomerase activity in a cell), hTRT polypeptides, proteins and telomerase RNPs (e.g. B. the protein-containing ribonucleoprotein complexes) that have one, different, or all functional activities of naturally occurring hTRT and telomerase, as discussed further below for illustrative purposes.
In one embodiment, the hTRT protein according to the invention is a polypeptide with the sequence of SEQ. ID. No. 2 (Fig. 17) or a fragment thereof. In another embodiment, the hTRT polypeptide differs from SEQ. ID. No. 2 by internal deletion, insertion or conservative replacement of amino acid residues. In a related embodiment, the invention provides hTRT polypeptides that SEQ. ID. No. 2 essentially the same. The invention also provides hTRT polypeptides that are related to the amino acid sequence of SEQ. ID. No. 2 are modified, i. H. for example truncated, mutated, derivatized or fused to other sequences (for example to form a fusion protein).
In addition, the present invention provides telomerase RNPs comprising an hTRT protein of the invention which complexes with a template RNA (e.g. B. hTR). In further embodiments, one or more telomerase-associated proteins are associated with an hTRT protein and / or hTR.
The invention is enz and n is 8-20 or 60-30 and q is 1 to 4. In a further embodiment, the DNA primer has a 5 min end which is not complementary to the RNA template, so that the 5 min end remains unbound when attached. Additional modifications of standard reverse transcription assays that can be used in the methods of the invention are known in the art.
b) Nucleolytic activity
Nucleolytic activity of telomerase is described, for example, in Morin, 1997, a. a. 0. Collins and Grieder, Genes and development 7 (1993) 1364. Telomerase has a nucleolytic activity (Joyce and Steitz, Trends Biochem. Sci. 12 (1987), 288), but the telomerase activity has special features. Telomerase removes nucleotides, usually only one, from the 3 min end when the 3 min end of the DNA is positioned at the 5 min boundary of the DNA template. In humans and in Tetrahymena, this nucleotide is the first G of the telomer repeat unit (TTAGG in humans). Telomerase preferentially removes G residues, but has no nucleolytic activity towards other nucleotides. This activity can be monitored. Two different methods are described here for illustration.
One method involves a common telomerase reaction with a primer that binds the entire template sequence (i.e. H. ends at the die boundary; -TAGGGATTAG in humans). Nucleolytic activity is detected by monitoring the exchange of the last dG residue for a radiolabelled dGTP provided in the assay. The exchange is monitored by the appearance of a band with the size of the initial primer in gel electrophoresis and autoradiography.
In a preferred method, a DNA primer is used which has a "blocked" 3 min end that cannot be extended by telomerase. The 3 min blocked primer can be used in standard telomerase assays, but is not extended until the 3 min nucleotide is removed by the nucleolytic activity of telomerase. The advantage of this method is that telomerase activity can be monitored using various standard measures, and the signal is strong and easier to quantify. The 3 min end of the primer can be blocked in various ways. In one procedure, a 3 min deoxy dNTP residue is added to the 3 min end of the primer using standard oligonucleotide synthesis procedures.
This end has a 2 min OH, but not the 3 min OH required for telomerase. There are other ways to block the 3 min end, such as using a 3 min dideoxy end, a 3 min amine end, etc. An example of a primer for an assay for a nucleolytic activity of hTRT is 5 min -TTAGGGTTAGGGTTA (G3 min), the last residue corresponding to a 3 min -deoxy-guanosine residue (Glen Research, Sterling, VA). Numerous other variants relating to a small primer, which are based on the teaching provided here, are known to the person skilled in the art.
c) Primer (Telomer) binding activity
Primer (telomer) binding activity of telomerase is described, for example, by Morin, 1997, a. a. O. ; Collins et al. , Cell 81 (1995), 667 and Harrington et al. , J. Biol. Chem. 270 (1995), 8893. Telomerase is believed to have two sites that bind a telomeric DNA primer. The RT motifs associated with the primer binding show that hTRT and / or hTRT / hTR has DNA primer binding activity. There are several ways to determine primer binding activity. However, most methods have one step in common, namely the incubation of a labeled DNA primer with hTRT or hTRT / hTR or other TRT / TR combinations under suitable binding conditions. Most methods also use a means to separate unbound DNA from protein-bound DNA. These procedures include the following steps:
i) Gel "shift" assays (also referred to as "electrophoretic / mobility shift" assays) are assays in which unbound DNA primer is separated from protein-bound DNA primer by electrophoresis in a non-denaturing gel (Ausubel et al. , a. a. O).
ii) Matrix binding assays involve various variations in the basic procedure. This includes the binding of the hTRT or the hTRT / hTR complex to a matrix (e.g. B. Nitrocellulose) either before or after incubation with the labeled primer. By binding the hTRT to a matrix, the unbound primer can be mechanically separated from the bound primer. Residual unbound DNA can be removed by washing the membrane before quantification. It is obvious to the person skilled in the art that there are various possibilities for coupling proteins to such matrices, solid supports and membranes, these include for example chemical, photochemical and UV crosslinking, antibodies / epitope and non-covalent, hydrophobic, (electrostatic, etc. . ) Interactions.
Any DNA with an affinity for telomerase can be used as the DNA primer, for example a telomer DNA primer such as (TTAGGG) n, where n can be 1 to 10 and is typically 3 to 5. The 3 min and 5 min ends can end at any position in the repeat sequence. The primers can also have 5 min or 3 min extensions of non-telomeric DNA that can facilitate labeling or detection. The primers can also be derivatized, for example to facilitate detection or isolation.
d) dNTP binding activity
dNTP binding activity of telomerase is described, for example, in Morin, 1997, a. a. O. , and Spence et al. , a. a. O. described. Telomerase requires dNTPs for the synthesis of DNA. The hTRT protein has nucleotide binding activity and can be assayed for dNTP binding similarly to other nucleotide binding proteins (Kantrowitz et al. , Trends Biochem. Sci. 5 (1980), 124). Typically, the binding of a labeled dNTP or a dNTP analog is monitored, as is known in the art for non-telomerase RT proteins.
e) RNA (i.e. H. hTR) binding activity
RNA (i.e. H. hTR) binding activity of telomerase is described, for example, in Morin, 1997, a. a. O. , Harrington et al. , Science 275 (1997), 973 and Collins et al. , Cell 81 (1995), 677. The RNA binding activity of a TRT protein according to the invention can be detected in a manner similar to that described above with regard to the DNA primer binding assay using a labeled RNA probe. Methods for separating bound and unbound RNA and for detecting RNA are well known in the art. These can be used for the activity assays according to the invention in a manner similar to that described for the DNA primer binding assay. The RNA can be full-length hTR, fragments of hTR, or other RNAs that can be shown to have an affinity for telomerase or hTRT.
See U.S. Patent No. 5,583,016 and PCT Publication No. 96/40 868 (see also USSN 08/478 352, filed on July 7, June 1995).
3) Telomerase motifs as targets
As noted above, the present invention provides hTRT polypeptides that do not have the full set (as described above) of telomerase activities from naturally occurring telomerase, hTRT, or other TRTProteins. In view of the description of RT and telomerase-specific motifs of TRT, it is evident that changes or mutations in conserved amino acid residues that can be found in the motif sequences discussed above lead to the formation of mutants with loss of activity that are useful for therapeutic purposes, are useful for screening and characterizing drugs and for other applications.
For example, deletion of motifs B results in the RT domains of the endogenous TRT gene in s. pombe, as described in Example 1, to haploid cells in which progressive telomeric shortening to the point where hybridization with telomer repeat units was almost no longer detectable could be observed, indicating a loss of telomerase catalytic activity. Similarly, changes in the WxGxS site of motif E can affect DNA primer binding or telomerase function. In addition, changes in the amino acids in motifs A, B min and C can influence the catalytic activity of telomerase. The mutation of the DDM motif of hTRT can significantly reduce or cancel telomerase activity (see Example 16).
C) The synthesis of hTRT and other TRT polypeptides
The invention provides a number of methods for making the hTRT and other TRT polypeptides disclosed herein. The chemical synthesis and recombinant expression of hTRT proteins, including fusion proteins, is described in detail in the following sections.
1) Chemical synthesis
The invention provides hTRT polypeptides that have been synthesized in whole or in part using general chemical methods well known in the art (see, for example, Caruthers et al. , Nucleic Acids Res. Symp. Ser. (1980) 215-223 and Horn et al. , Nucleic Acids Res. Symp. Ser. (1980) 225-232). For example, peptide synthesis can be carried out using various solid phase methods (Roberge et al. , Science 269 (1995) 202), including automatic synthesis (e.g. B. using the Perkin Elmer ABI 431A peptide synthesizer according to the manufacturer's instructions). If a full length protein is desired, shorter polypeptides can be fused by condensing the amino terminus of one molecule with the carboxyl terminus of the other molecule to form a peptide bond.
The newly synthesized peptides can be substantially purified, for example by preparative HPLC (see for example Creighton Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co. , New York NY (1983). The composition of the synthetic peptides (or any other peptides or polypeptides according to the invention) can be determined by amino acid analysis or sequencing (e.g. B. the process of Edman mining; Creighton, a. a. O. ) beeing confirmed. It is important to note that the amino acid sequence of hTRT or any part thereof can be changed during synthesis and / or can be combined with sequences of other proteins using chemical methods.
This can also be carried out in another way and comprise any part of the amino acid sequences for any purpose for the production of a variant of the polypeptides according to the invention.
2) Recombinant expression of hTRT and other Trt proteins
The present invention provides methods, reagents, vectors and cells useful for expressing hTRT polypeptides and nucleic acids using in vitro (cell free), ex vivo or in vivo (cell or organism based) recombinant expression systems. In one embodiment, expression of the hTRT protein or a fragment thereof comprises inserting the coding sequence into a suitable expression vector (i.e. H. a vector which contains the elements required for the transcription and translation of the inserted coding sequence).
Thus, one aspect of the invention relates to the provision of a polynucleotide which is essentially identical in sequence to a sequence encoding an hTRT gene of at least 25 nucleotides and preferably for many applications 50 to 100 nucleotides or more of the hTRT cDNAs or genes according to the invention, that is operably linked to a promoter to form a transcription unit that can express an hTRT polypeptide. Methods well known to those skilled in the art can be used to construct the expression vectors containing an hTRT sequence provided by the present invention and suitable transcriptional or translational controls (see, for example, Sambrook et al. , a. a. O. , Ausubel et al. , a. a. O. and the present description).
The hTRT polypeptides according to the invention include fusion proteins which contain hTRT polypeptides or fragments of the hTRT protein. The fusion proteins are typically produced recombinantly, but they can also be synthesized chemically. Fusion proteins can be useful for achieving increased expression of the hTRT polypeptide constructs or can include, for example, labeling (e.g. B. an enzymatic reporter group), a binding group or an antibody epitope. An example of a fusion protein comprising hTRT and enhanced green fluorescent protein (EGFP) sequences is described in Example 15 below.
It is obvious to the person skilled in the art that the uses and possible uses discussed in Example 15 and elsewhere here are not restricted to the specific fusion proteins, but rather are intended to illustrate the possible uses for the different fusion constructs.
The fusion protein systems according to the invention can also be used to facilitate the efficient production and isolation of hTRT proteins or peptides. For example, in some embodiments, the non-hTRT sequence portion of the fusion protein comprises a short peptide that can be specifically bound to an immobilized molecule so that the fusion protein can be separated from unbound components (such as unrelated proteins in a cell lysate). An example of this is a peptide sequence that was bound by a specific antibody. Another example is a peptide comprising traces of polyhistidine, e.g. (His) 6 or histidine tryptophan sequences, which can be bound by a resin containing nickel or copper ions (i.e. H. Metal chelate affinity chromatography).
Other examples include protein A domains or fragments that allow purification on immobilized immunoglobulin and the domain used in the "FLAGS" extension / affinity purification system (Immunex Corp. , Seattle WA). In some embodiments, the fusion protein contains a cleavage site so that the hTRT sequence or other TRT polypeptide sequence can be easily separated from the non-hTRT peptide sequence or non-hTRT protein sequence. In this case, the cleavage can be done chemically (e.g. B. with cyanogen bromide, 2- (2-nitrophenylsulfonyl) -3-methyl-3 min -bromindoles, hydroxylamine or low pH) or enzymatically (e.g. B. with factor Xa, enterokinase). The selection of the fusion and fission system can partly depend on the proportion (i.e. H. the sequence) of the hTRT polypeptide to be expressed.
Fusion proteins are generally described in Ausubel et al. , a. a. O. , Chapter 16, Kroll et al. , DNA Cell. Biol. 12 (1993), 441 and in the 1997 Invitrogen catalog (Invitrogen Inc. , San Diego CA). Further examples of fusion proteins according to the invention with epitope "tags" or "tags" and cleavage sites are provided in Example 6 below.
It is obvious to the person skilled in the art that the expression systems discussed in this section concentrate on the expression of hTRT polypeptides, but the same or similar cells, vectors and methods for expressing hTRT polypeptides according to the invention can be used, including " sense "and" antisense "polynucleotides, wherein the production of hTRT polypeptides is not necessarily desirable. Typically, expression of a polypeptide requires a suitable initiation codon (e.g. B. Methionine), an open reading frame and translation regulatory signals (e.g. B. a ribosome binding site, a termination codon) which may be absent when translation of a nucleic acid sequence to produce a protein is not desired.
Expression of hTRT polypeptides and polynucleotides can be performed to take advantage of the benefits associated with the benefits provided by the present invention. An example of such an advantage is the expression of hTRT polypeptides, which are subsequently isolated from the cell in which they were expressed (e.g. B. for the production of large amounts of hTRT for use as a vaccine). A second example of such an advantage is the expression of hTRT in a cell to change the phenotype of the cell (as in applications in gene therapy).
Non-mammalian cells can be used for expression of hTRT for purification, while eukaryotic cells, particularly mammalian cells (e.g. B. human cells) can be used not only for the isolation and purification of hTRT, but also for the expression of hTRT when a change in the phenotype in a cell is desired (e.g. B. for a change in the ability to proliferate e.g. B. in applications in gene therapy). hTRT polypeptides with one or more telomerase activities (e.g. B. for example, but not limited to, the catalytic activity of telomerase) can be expressed in a host cell so as to increase a cell's ability to proliferate (e.g. B. to immortalize a cell).
In contrast, hTRT "antisense" polynucleotides or inhibitory polypeptides can typically be expressed to decrease a cell's ability to proliferate (e.g. B. in a telomerase-positive malignant tumor cell). Numerous specific applications are described here, for example in the discussion below of the uses of the reagents and methods according to the invention for therapeutic applications.
Examples of useful expression systems according to the invention (cells, regulatory elements, vectors and expression) include a number of cell-free systems, such as a reticulocyte lysate and wheat germ systems, which use hTRT polynucleotides according to general methods well known in the art (see for example Ausubel et al. , a. a. O. , Chapter 10). In alternative embodiments, the invention provides reagents and methods for expressing hTRT in prokaryotic or eukaryotic cells.
The present invention thus provides nucleic acids encoding hTRT polynucleotides, proteins, protein sub-sequences or fusion proteins that are found in bacteria, fungi, plants, insects and animals, including humans, cell expression systems known in the art including isolated cells, cell lines, cell cultures, Tissues and whole organisms can be expressed. It will be apparent to those skilled in the art that the hTRT polynucleotides introduced into a host cell or cell-free expression system are usually functionally linked to a suitable expression control sequence for each host or cell-free system.
Useful bacterial expression systems include E. coli, Bacilli (such as Bacillus subtilis), other Enterobacteriaceae (such as Salmonella, Serratia and numerous Pseudomonas species) or other bacterial hosts (e.g. B. Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Leuconostoc citrovorum, Leuconostoc mesenteroides ", Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus lactis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve and Bifidobacterium longum. The hTRT expression constructs useful in prokaryotes include recombinant bacteriophages, plasmid or cosmid DNA expression vectors, or the like, and these typically include promoter sequences.
Examples of promoters include inducible promoters such as the lac promoter, the hybrid lacZ promoter of the "Bluescript7" phagemid (Stratagene, La Jolla CA) or pSport1 (Gibco BRL); Phage lambda promoter systems; a tryptophan (trp) promoter system; ptrp-lac hybrids etc. The bacterial expression constructs optionally contain a ribosome binding site and regulatory signal sequences for the termination of the transcription. Illustrative examples of specific vectors useful for expression include pTrcHis2 (Invitrogen, San Diego CA), pThioHis A, B & C, and numerous other vectors known in the art or those that can be developed (see, for example Ausubel, a. a. O. ). Vectors useful for bacteria include those that facilitate the production of hTRT fusion proteins.
Vectors useful for expressing fusion proteins in high level bacterial cells include, but are not limited to, the multifunctional cloning and expression vectors for E. coli, for example the above-mentioned Bluescript7 (Stratagene), in which the sequence coding an hTRT protein, an hTRT fusion protein or an hTRT fragment in the reading frame with sequences for the amino-terminal Met and the subsequent 7 residues of the beta-galactosidase in the vector can be ligated to produce a hybrid protein (e.g. B. pIN vectors; van Heeke and Schuster, J. Biol. Chem. 1989, 264: 5503). Vectors such as pGEX vectors (e.g. B. pGEX-2TK; Pharmacia Biotech) can also be used to express foreign polypeptides such as an hTRT protein as fusion proteins with glutathione-S-transferase (GST).
Such fusion proteins can be purified from lysed cells by adsorption on glutathione-agarose beads and subsequent elution in the presence of free glutathione. Proteins made in such systems often contain protease cleavage sites for enterokinase, thrombin, or factor Xa so that the desired cloned polypeptide can be released from the GST unit, if desired, which is useful for purification or other uses. Other examples are fusion proteins, the hTRT and the maltose binding protein of E. coli (MBP) or thioredoxin from E. include coli. Illustrative examples of hTRT expression constructs useful in bacterial cells are provided in Example 6 below.
The present invention further provides hTRT polypeptides which have been expressed in fungal systems such as Dictyostelium and preferably yeast such as Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Torulopsi holmil, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces lactis, Hansenula polymorpha and Candida pseudotropicalis. A number of suitable vectors are available for the expression of hTRT in yeast, including plasmid and YACs vectors (YACs = artificial yeast chromosomes). The vectors typically contain expression control sequences, such as. B. constitutive or inducible promoters (e.g. B. the alpha factor, alcohol oxidase, PGH and 3-phosphoglycerate kinase or other glycolytic enzymes), an origin of replication, termination sequences etc. , whichever is desired.
Vectors suitable for use in Pichia include pPICZ, His6 / pPICZB, pPICZalpha, pPIC3. 5K, pPIC9K, pA0815, pGAP2A, B & C, pGAP2alpha A, B and C (Invitrogen, San Diego, CA) and numerous other vectors known or to be developed in the art. In one embodiment, the vector His6 / pPICZB (Invitrogen, San Diego, CA) is used to express a His6-hTRT fusion protein in the yeast Pichia pastoris. pYES2 (Invitrogen, San Diego, CA) is an example of a vector useful in Saccharomyces. Illustrative examples of hTRT expression constructs useful in yeast are provided in Example 6 below.
The hTRT polypeptides according to the invention can also be expressed in plant cell systems which are linked to plant or plant virus expression vectors (e.g. B. with cauliflower mosaic virus, CaMV; Tobacco Mosaic Virus, TMV) transfected or transformed with bacterial expression vectors (Ti or the plasmid pBR322). In cases where plant virus expression vectors are used, the expression of an hTRT coding sequence can be controlled by a number of promoters. For example, viral promoters such as the 35S and 19S promoters from CaMV (Brisson et al. Nature 310 (1984) 511-514) alone or in combination with the Omega Leader sequence of TMV (Takamatsu et al. , EMBO J. 6 (1987) 307-311).
In an alternative embodiment, plant promoters such as the promoter of the RUBISCO small subunit gene (Coruzzi et al. , EMBO J. 3 (1984) 1671 to 1680 and Broglie et al. , Science 224 (1984), 838-843) or heat shock promoters (Winter and Sinibaldi, Results Probl. Cell Differ. 17 (1991), 85) or promoters of genes for storage proteins. These constructs can be introduced into plant cells by direct DNA transformation or pathogen-mediated transfection (for further study of these methods, reference is made to Hobbs or Murry (1992) in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill New York NY, S. 191-196 (1992), or Weissbach and Weissbach (1988), Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, New York NY, S. 421-463).
Another expression system provided by the present invention for expressing an hTRT protein is an insect system. A preferred system uses a baculovirus polyhedrin promoter. In one of these systems, the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) is used as a vector for the expression of foreign genes in Spodoptera frugiperda cells or in Trichoplusia larvae. The sequence encoding the desired gene can be cloned into a non-essential region of the virus, for example the polyhedrin gene, and placed under the control of the polyhedrin promoter. The successful insertion of the sequence encoding, for example, the hTRT protein leads to the inactivation of the polyhedrogen wrestling and a recombinant virus is produced which lacks the coat protein.
The recombinant viruses are then used to infect S. frugiperda cells or Trichoplusia larvae, in which the hTRT sequence is then expressed (see Smith et al. for general procedures). , J. Virol. 46 (1983), 584 and Engelhard et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. 91 (1994) 3224-7). Vectors useful for baculovirus expression include pBlueBacHis2 A, B &C; pBlueBac4. 5; pMelBacB and numerous other vectors known in the art or vectors to be developed. Illustrative examples of hTRT expression constructs useful in insect cells are provided in Example 6 below.
The present invention also provides expression systems in mammals and mammalian cells. As noted above, hTRT polynucleotides can be found in mammalian cells (e.g. B. human cells) for the production of significant amounts of hTRT polypeptides (e.g. B. for cleaning) or to change the phenotype of a target cell (e.g. B. for the purposes of gene therapy, cell immortilization etc. ) are expressed. In the latter case, the expressed hTRT polynucleotide may or may not encode a polypeptide with a catalytic activity of telomerase. That is, a "sense" or "antisense" polynucleotide, an inhibitory or stimulating polypeptide, a polypeptide with zero, one or more telomerase activities can be expressed. further combinations and variants are obvious to the person skilled in the art after reading this description.
Tissue culture mammalian cells suitable for the expression of the nucleic acids according to the invention include any normal mortal, normal or abnormal immortal animal or human cell. These include: the CV1 monkey kidney line transformed with SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), the human embryonic kidney line (293) (Graham et al. , J. Gene. Virol. 36 (1977), 59), the baby hamster kidney cells (BHK, ATCC CCL 10), CHO (ATCC CCL 61 and CRL 9618), mouse sertoli cells (TM4, Mather, Biol.
Reprod. 23 (1980) 243-251), monkey kidney cells (CV1, ATCC CCL 70), African Green Monkey kidney cells (VERO-76, ATCC CRL 1587), human cervical carcinoma cells (HeLa, ATCC CCL 2), dog kidney cells (MDCK, ATCC CCL 34), buffalo rat liver cells (BRL 3A, ATCC CRL 1442), human lung cells (W138, ATCC CCL 75), human liver cells (HEP G2, HB 8065), mouse breast tumor (MMT 060562, ATCC CCL 51) and TRI cells ( Mather et al. , Annals N. Y. Acad. Sci. 383 (1982), 44-46, MDCK (ATCC CCL 34 and CRL 6253), HEK 293 (ATCC CRL 1573), WI-38 (ATCC CCL 75) (ATCC: American Type Culture Collection Rockville, MD)). The use of mammalian tissue cell cultures for the expression of polypeptides is generally described in Winnacker, FROM GENES TO CLONES (VCH-Verlag, N. Y. , N. Y. , 1987).
Virus-based and non-viral expression systems are provided for mammalian host cells. Non-viral vectors and systems include plasmids, episomal vectors, typically with an expression cassette for expression of a protein or an RNA, and human artificial chromosomes (see e.g. B. Harrington et al. , Nat Genet 15 (1997), 345).
For the expression of hTRT polynucleotides and polypeptides in mammalian cells (e.g. B. human cells) useful non-viral vectors include pcDNA3. 1 / His, pEBVHis A, B & C (Invitrogen, San Diego CA), MPSV vectors, other vectors described in the 1997 Invitrogen catalog (Invitrogen Inc. , San Diego CA), which is incorporated by reference in its entirety into the disclosure content of the present description, and numerous other vectors and systems known in the art with regard to other proteins. Illustrative examples of hTRT expression constructs useful in mammalian cells are provided in Example 6 below.
Useful viral vectors include vectors based on retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses, SV40 based vectors, papilloma viruses, HBP-Epstein Barr virus, vaccinia virus vectors and "Semliki Forest" virus (SFV) . SFV and vaccinia vectors are generally described in Ausubel et al. , a. a. O. , Chapter 16 discussed. These vectors are often made up of two components, a modified viral genome and an envelope structure surrounding it (see generally Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49 (1995), 807). However, viral vectors are sometimes introduced in the naked form or coated with proteins that are not viral proteins. However, the viral nucleic acid in a vector can be modified in a variety of ways, for example if this is desired for gene therapy.
The goals of these changes are to prevent the virus from growing in target cells and to maintain its ability to grow in vector form in available pack or helper cells to provide space within the viral genome for insertion of exogenous DNA sequences and to insert new sequences that are desired Encode gene and allow suitable expression. Thus vector nucleic acids generally comprise two components: essential cis viral sequences for replication and packaging in a helper line and the transcription unit for the exogenous gene. Other viral functions are expressed in trans in a specific packaging or helper cell line.
Adenovirus vectors (e.g. B. for use in gene therapy in humans) are described, for example, in Rosenfeld et al. , Cell 68 (1992), 143 and in PCT publications Wo 94/12 650; 94/12 649 and 94/12 629. In cases where an adenovirus is used as the expression vector, an hTRT coding sequence can be ligated into an adenovirus transcription / translation complex consisting of the late promoter and the three-part leader sequence. Insertion into a non-essential E1 or E3 region of the viral genome results in a viable virus that can express in infected host cells (Logan and Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655 (1984). Replication-deficient retroviral vectors that contain a therapeutic polynucleotide sequence as part of the retroviral genome are described, for example, in Miller et al. , Mol. Cell.
Biol. 10 (1990) 4239; Kolberg, J. NIH Res. 4 (1992), 43 and Cornette et al. , Hum. Gene Ther. 2: 215 (1991).
Promoters of mammalian genes or mammalian viruses are often suitable in mammalian cell systems. Suitable promoters can be constitutive, cell type-specific, stage-specific and / or modulatable or regulatable (e.g. B. by hormones such as glucocorticoids). Useful promoters include, but are not limited to, the metallothionein promoter, the constitutive major late promoter of adenovirus, the dexamethasone inducible MMTV, the SV40 promoter, the MRP polIII promoter, the constitutive MPSV promoter, the Tetracycline inducible CMV promoter (such as the human immediate early CMV promoter), the constitutive CMV promoter, and promoter-enhancer combinations known in the art.
Additional regulatory elements may also be required or desired for efficient expression of an hTRT polynucleotide and / or the translation of a sequence encoding hTRT proteins. For translation, these elements typically include an ATG initiation codon and an adjacent ribosome binding site or other sequences. If the initiation codon and upstream promoter sequences are inserted into an expression vector, no additional translation signals or other control signals are required for the hTRT protein coding sequences. However, in cases where only a coding sequence or a part thereof is inserted, exogenous transcription and / or translation control signals (e.g. B. the promoter, the ribosome binding site and the ATG initiation codon) are provided.
In addition, the initiation codon must typically be in the correct reading frame to ensure translation of the desired protein. Exogenous transcription elements and initiation codons can come from numerous sources, both natural and synthetic. In addition, the efficiency of expression can be increased by inserting enhancers suitable for the cell system used (Scharf et al. , Results Probl. Cell Differ. 20 (1994), 125 and Bittner et al. , Meth. Enzymol. 153: 516 (1987). For example, the SV40 enhancer or the CMV enhancer can be used to increase expression in mammalian host cells.
Expression of hTRT gene products can also be activated by activating an hTRT promoter or enhancer in a cell, such as a human cell, e.g. B. a telomerase-negative cell line. Activation can be achieved through a number of different measures. These include the administration of an exogenous promoter activating agent or the inhibition of a cellular component that suppresses the expression of the hTRT gene. Conversely, of course, inhibition of promoter function, as described below, will decrease hTRT gene expression.
The invention provides the inducible and repressible expression of hTRT polypeptides using such systems as the Ecdyson inducible expression system (Invitrogen) and the "Tet-On and Tet-off" tetracycline regulated systems from Clontech. In the expression system inducible by ecdyson, an analogue of the steroid hormone ecdysone, muristerone A, is used to activate the expression of a recombinant protein via a heterodimeric nuclear receptor (No et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 3346). In one embodiment, hTRT is cloned into the pIND vector (Clontech), which contains five modified Ecdyson reaction elements (E / GREs) upstream of a minimal heat shock promoter and the multiple cloning site. This construct is then transfected into the cell lines stably expressing the Ecdyson receptor.
After transfection, the cells are treated with Muristeron A to induce the intracellular expression of pIND. In another embodiment, the hTRT polypeptide is expressed using the "tet-on and tet-off" expression systems (Clontech) in addition to the regulated high-level gene expression systems described (Gossen et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5547 and Gossen et al. , Science 268 (1995), 1766).
The hTRT vectors according to the invention can be introduced into a cell, a tissue, organ, a patient or an animal by a number of methods. The nucleic acid expression vectors (typically dsDNA) according to the invention can be introduced into the selected host cell by generally known methods such as calcium chloride transformation (for bacterial systems), electroporation, calcium phosphate treatment, liposome-mediated transformation, injection and microinjection, ballistic methods, virosomes, immunoliposomes, polycation : Nucleic acid conjugates, naked DNA, artificial virions, fusion to the herpes virus structural protein VP22 (Elliot and O'Hare, Cell 88, 223) can be transferred by agent-enhanced uptake of DNA and ex vivo transduction.
Useful liposome-mediated DNA transfer procedures are described in U.S. Pat. 5,049,386, 4,946,787 and 4,897,355, described in PCT publications WO 91/17 424 and WO 91/16 024 and in Wang and Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 147: 980 (1987); Wang and Huang, 1989 Biochemistry 28: 9508; Litzinger and Huang, Biochem. Biophys. Acta 1113 (1992), 201; Gao and Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 179: 280 (1991). Immunoliposomes as carriers for exogenous polynucleotides have also been described (Wang and Huang, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7851 and Trubetskoy et al. , Biochem. Biophys. Acta 1131 (1992), 311). These should have improved cell type specificity compared to liposomes due to the inclusion of specific antibodies, which presumably bind to surface antigens on specific cell types, have improved cell type specificity.
Behr et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6982 (1989) report the use of lipopolyamine as a reagent to mediate transfection itself ", with no need to add any additional phospholipid to form liposomes. Suitable introductory procedures can be described by those skilled in the art with regard to appropriate practices and requirements related to regulation (e.g. B. for gene therapy or for the production of cell lines for the expression of recombinant proteins) can be selected. Of course, the introductory methods listed above can also be used to transfer nucleic acids into cells for gene therapy, transfer into tissue culture cells etc. be used.
Stable expression is often desirable for the long-term production of recombinant proteins with high yield. For example, cell lines stably expressing hTRT can be produced using the expression vectors according to the invention which contain viral origins of replication or endogenous expression elements and a selectable marker gene. After the vector has been introduced, the cells can be allowed to grow in enriched media for 1 to 2 days before switching to selective media. The selectable marker is used to confer resistance to the selection. Its presence allows the growth of cells that successfully express the inserted sequences in selective media. Resistant and stably transfected cells can be grown using tissue culture techniques appropriate for the cell type.
An amplification step can be included, for example, by administering methyl trexate to cells transfected with a DHFR gene according to methods well known in the art.
In addition, a host cell strain can be selected for its ability to modulate expression of the inserted sequences or to process the expressed protein in the desired manner. Such modifications of the polypeptide include, but are not limited to, acetylation, carboxylation, phosphorylation, lipidation, and acylation. Post-translational processing can also be important for correct insertion, folding and / or function. The different host cells have a cellular machinery and characteristic mechanisms for such post-translational activities that are specific to each cell. A specific cell can thus be selected to ensure the correct modification and processing of the introduced foreign protein.
The present invention also presents transgenic animals (i.e. H. Mammals transgenic to a human or other TRT gene sequence) that express an hTRT or other TRT polynucleotide or polypeptide. In one embodiment, hTRT is secreted in the milk of a transgenic mammal such as a transgenic bovine, a goat or a rabbit. Methods for producing such animals can be found, for example, in Heyneker et al. , PCT WO 91/08 216 can be found.
The hTRT proteins and complexes of the invention, including those produced by the expression systems described above, can be purified using a number of general methods known in the art in accordance with the specific methods provided by the present invention (such as described below) will. It is obvious to a person skilled in the art that after chemical synthesis, biological expression or purification, the hTRT protein can have a conformation that differs from the native conformation of naturally occurring telomerase.
In some cases it may be helpful or even necessary to denature the polypeptide (which may include, for example, reducing disulfide or other bonds) and then refolding the polypeptide into the preferred conformation. Correct refolding may also require the presence of hTR (or hTR fragments). Methods for reducing and denaturing proteins and for inducing refolding are known to the person skilled in the art (see, for example, Debinski et al. J. Biol. Chem. 268 (1993), 14065; Kreitman and Pastan, Bioconjug. Chem. 4: 581, 1993; and Buchner et al. Anal biochem. 205: 263 (1992) and McCaman et al. , J. Biotech. 2 (1985), 177). (See also USSN 08/478 352 filed on July 7, June 1995, a. a. O. ).
D.
Complexes of human TRT and human telomeplase RNA, telomerase-associated
Proteins and other biomolecules produced by coexpression and other means
HTRT polypeptides according to the invention can associate with other biomolecules in vivo and in vitro, for which purpose RNAs (e.g. B. hTR), proteins (e.g. B. Telomerase-associated proteins), DNA (e.g. B. Telomer DNA, [T2AG3] N) and nucleotides such as (deoxy) ribonucleotide triphosphate include. These associations can be used to detect the presence or function of hTRT, to identify or purify hTRT or telomerase-associated molecules and to analyze the structure or function of hTRT or telomerase according to the methods according to the invention.
In one embodiment, the present invention provides hTRT that complexes with a nucleic acid, usually an RNA (e.g. B. associated with or bound to it). In one embodiment, the bound RNA can act as a template for telomerase-mediated DNA synthesis. Examples of RNAs that can complex with the hTRT polypeptide include a naturally occurring host cell telomerase RNA, a human telomerase RNA (e.g. B. hTR; U.S. Patent No. 5,583,016), an hTR sub-sequence or domain, a synthetic RNA or other RNAs. The RNA-hTRT protein complex (an RNP) typically has one or more telomerase activities, for example, catalytic activities of telomerase.
These hTRT-hTR-RNPs (or other hTRT-RNA complexes) can be prepared by a number of methods as described below by way of illustration, including in vitro reconstitution and co-expression of hTRT and hTR (and another RNA ) in vitro (i.e. H. in a cell-free system) in vivo or ex vivo.
Thus, in one embodiment, the present invention provides an hTRT-hTR complex (or other hTRT-RNA complex) that was formed in vitro by mixing separately purified components ("in vitro reconstitution"; see, for example, U.S. Patent No. 5,583 016 for a description of the reconstitution and USSN 08/478 352 filed on July 7, June 1995; see also Autexier et al. , EMBO J. 15; 5928).
In an alternative embodiment, the invention provides telomerase RNPs that can be coexpressed by the hTRT polypeptide and an RNA (e.g. B. hTR) in vitro in a cell-free transcription / translation system (e.g. B. Wheat germ lysate or rabbit reticulocyte lysate). As shown in Example 7, coexpression of a recombinant hTRT polypeptide and hTR in vitro results in the production of catalytic activity of telomerase (as measured by a TRAP assay).
The present invention also provides telomerase RNPs made by expressing the hTRT polypeptide in a cell, such as a mammalian cell, in which hTR is naturally expressed, or in the hTR (or other RNA associated with the hTRT -Protein can form a complex) is introduced, or is expressed by recombination. Thus, in one embodiment, hTRT is used in a telomerase negative human cell in which hTR is present (e.g. B. BJ or IMP90 cells), which allows the assembly of both molecules into an RNP. In a further embodiment, hTRT is expressed in a human or non-human cell in which hTR is recombinantly expressed. Methods for expressing hTR in a cell can be found in US Patent 5,583,016.
The clone pGRN33, which contains a cDNA encoding the RNA component of telomerase, was also deposited (ATCC 75926). The RNA component of human telomerase-encoding genomic sequences were deposited as a 15 kb SauIIIA1 to HindIII insertion of the clone 28-1 (ATCC 75925). For expression in eukaryotic cells, the hTRT sequence is typically functionally linked to a transcription initiation sequence (RNA polymerase binding site) and transcription termination sequences (see, for example, PCT publication WO 96/01 835; Feng et al. , Science 269 (1995), 1236).
The present invention also provides recombinantly produced or substantially purified hTRT polypeptides which are co-expressed and / or associated with so-called "telomerase-associated proteins". Thus, the present invention provides hTRT that is compatible with other proteins (e.g. B. Telomerase-associated proteins) is co-expressed or forms a complex with them. Telomerase-associated proteins are understood to mean those proteins which are purified with human telomerase and / or which can play a role in modulating the telomerase function or activity, for example in that they are involved in the association of telomerase with telomer DNA.
Examples of telomerase-associated proteins include, but are not limited to, the following proteins and / or their human homologs: Nucleolin (see U.S. Patent Application Serial No. 08/833 377 and Srivastava et al. , FEBS Letts. 250: 99 (1989); EF2H (the homolog to elongation factor 2; see U.S. parallel application no. 08/833 377 and Nomura et al. , DNA Res. (Japan) 1 (1994), 27, GENBANK accession number # D21163), TP1 / TLP1 (Harrington et al. , Science 275 (1997), 973); Nakayama et al. , Cell 88 (1997), 875; the human homologue to Tetrahymena p95 (Collins et al. , Cell 81 (1995) 677); TPC2 (a telomer length regulating protein; ATCC accession number 97708 (see USSN 08/710 249 and 08/713 922, both on 13
September 1996)), TPC3 (also a telomere length regulating protein; ATCC accession number 97707 (see USSN 08/710 249 and 08/713 922, both filed on 13 September 1996)), DNA-binding protein B (dbpB; Horwitz et al. , J. Biol. Chem. 269 (1994), 14130) and the telomer repeat unit binding factor (TRF 1 &2; Chang et al. , Science 270 (1995), 1663; Chong et al. , Hum. Mol. Genet. 6 (1997), 69; EST1, 3 and 4 (Lendvay et al. , Genetics 144 (1996), 1399; Nugent et al. , Science 274 (1996), 249 and Lundblad et al. , Cell 57 (1989), 633) and the "end-capping" factor (Cardenas et al. , Genes Dev. 7 (1993), 883).
Telomerase-associated proteins can be identified based on the co-purification with or binding to hTRT protein or the hTRT-hTR-RNP. In an alternative embodiment, they can be based on binding to an hTRT fusion protein, for example a GST-hTRT fusion protein, etc. identified how this can be done by affinity purification (see Ausubel et al. , Chapter 20). A particularly useful method for determining protein / protein interactions and for identifying hTR-T-associated proteins is the "two hybrid screen" method by Chien et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9578; see also Ausubel et al. , a. a. O. , Chapter 20).
This screening allows protein / protein interactions to be identified in vivo by reconstitution of a transcription activator, the yeast Ga14 transcription protein (see Fields and Song, Nature 340 (1989), 245). This method is based on the properties of the yeast Ga14 protein, which consists of separable domains that are responsible for DNA binding and transcriptional activation. Polynucleotides encoding "two hybrid" proteins, usually expression vectors, are constructed. A polynucleotide comprises the yeast Ga14 DNA binding domain fused to a polypeptide sequence of a protein to be tested for hTRT interaction (e.g. B. Nucleolin or EF2H).
In an alternative embodiment, the yeast Ga14 DNA binding domain is fused to cDNAs from a human cell, thereby producing a library of human proteins fused to the Ga14DNA binding domain for screening for telomerase-associated proteins. The other polynucleotides include the Ga14 activation domain fused to an hTRT polypeptide sequence. The constructs are introduced into a yeast host cell. After expression, the intermolecular bond between hTRT and the test protein can reconstitute the Ga14 DNA-binding domain with the Ga14-activating domain. This leads to the transcriptional activation of a reporter gene (e.g. B. lacZ, His3), which is functionally linked to a Ga14 binding site.
Reporter gene cell colonies containing a protein interacting with hTRT or a telomerase-associated protein can be identified by selection or examination. It is obvious to a person skilled in the art that there are numerous variations of the "2-hybrid-screen" system, for example the LexA system (Bartel et al. , in Cellular Interactions in Development: A Pratical Approach, Hartley (Ed. ), D. A. (Oxford Univ. Press (1993), p. 153-179)).
Another useful method for identifying telomerase-associated proteins is a "three-hybrid" system (see for example Zhang et al. , Anal. Biochem. 242 (1996), 68 and Licitra et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 12817). The telomerase RNA component can be used in this system with the TRT or the hTRT protein and a test protein. Another useful method for identifying interacting proteins (i.e. H. of proteins that heterodimerize or form higher order heteromultimers) is especially the E. coli / BCCP "interactive screening" system (see Germino et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 933 and Guarente, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 90 (1993), 1639).
The present invention also provides complexes of telomere binding proteins (which may or may not be telomerase-associated proteins) and hTRT (which may or may not be complexed with hTR, other RNAs, or one or more telomerase-associated proteins). Examples of telomer binding proteins include TRF1 and TRF2 (a. a. O. ) rnpA1, rnpA2, RAP1 (Buchman et al. , Mol. Cell. Biol. 1988, 8: 210, Buchman et al. , Mol. Cell. Biol. 8 (1988), 5086), SIR3 and SIR4 (Aparicio et al. , Cell 66 (1991), 1279), TEL1 (Greenwell et al. 1995, Cell 82, 823; Morrow et al. , Cell 82: 831 (1995); ATM (Savitsky et al. , Science 268 (1995), 1749), "end-capping" factor (Cardenas et al. , Genes Dev. 7 (1993), 883) and the corresponding human homologs.
The above-mentioned complexes can generally be prepared as described above for complexes of hTRT and hTR or telomerase-associated proteins, for example by mixing or coexpression in vitro or in vivo.
V. Antibodies and other binding agents
A related aspect of the present invention relates to antibodies that are specifically immunoreactive with hTRT. These include polyclonal and monoclonal antibodies, antibody fragments, single chain antibodies, human and chimeric antibodies, including antibodies or antibody fragments fused to phage coat or cell surface proteins, and others known in the art and described herein. The antibodies according to the invention can specifically recognize and bind polypeptides that have an amino acid sequence that matches the amino acid sequence of SEQ. ID. No. 2 is substantially identical, or an immunogenic fragment thereof, or an epitope on the protein thereby defined. The antibodies according to the invention can have a specific binding affinity for hTRT of at least about 10 <7>, 10 <8>, 10 <9> or 10 <1> <0> M <-> Have <1>.
They can be polyclonal or monoclonal, recombinant or otherwise produced. The invention also provides anti-hTRT antibodies that recognize a conformational epitope of h TRT (e.g., an epitope on the surface of the hTRT protein or a telomerase RNP). Probable conformational epitopes, if desired, can be identified by computer-aided analysis of the hTRT protein sequence, by comparison to the conformation of related reverse transcriptases such as the p66 subunit of HIF-1 (see, for example, Figure 3), or empirically. Anti-hTRT antibodies that recognize conformation epitopes are useful, among other things, in the detection and purification of human telomerase and in the diagnosis and treatment of human diseases.
For the production of anti-hTRT antibodies, hosts such as goats, sheep, cows, guinea pigs, rabbits, rats or mice can be injected with an hTRT protein or any portion, fragment or oligopeptide thereof that has retained immunogenic properties, be immunized. It is not necessary to maintain this biological activity for the selection of hTRT polypeptides for antibody induction, but the protein fragment or oligopeptide must be immunogenic and preferably antigenic.
Immunogenicity can be demonstrated by injecting a polypeptide and an adjuvant into an animal (e.g. a rabbit) and by examining the presence of antibodies directed against the injected polypeptide (see e.g. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988) (e.g., Chapter 5, and this document is incorporated by reference in its entirety and for all purposes in this description). Peptides used to induce specific antibodies typically have an amino acid sequence consisting of at least five amino acids, preferably at least 8 amino acids, and more preferably at least 10 amino acids. They usually take the entire amino acid sequence of the protein with SEQ. ID.
No. 2 or a part thereof, or have an essentially identical sequence. Short stretches of the amino acid of the hTRT protein can be fused with those of other proteins, such as the "keyhole limpet" hemocyanin and an anti-hTRT antibody made against the chimeric molecule. Depending on the host type used, various adjuvants can be used to increase the immune response.
The antigen is presented to the immune system in a manner determined by animal procedures. These and other parameters are generally well known to the immunologist. Typically, the injections are administered into the balls of the foot, intramuscularly, intradermally, into the perilymph nodes or intraperitoneally. The immunoglobulins produced by the host can be precipitated, isolated and purified according to routine procedures, which include affinity purification.
Illustrative examples of immunogenic hTRT peptides are provided in Example 8. In addition, Example 8 describes the production and use of polyclonal anti-hTRT antibodies.
A) Monoclonal antibodies
Monoclonal antibodies to hTRT proteins and peptides can be prepared in accordance with the methods of the invention using any method suitable for the production of antibody molecules by continuous cell lines in culture. These methods include, but are not limited to, the originally described hybridoma method by Koehler and Milstein (Nature 256 (1975), 495), the hybridoma method using human B cells (Kosbor et al., Immunol. Today 4 ( 1983), 72 and Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 2026), and the EBV hybridoma method (Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc New York NY, pp. 77-96 (1985)).
In one embodiment, suitable animals are selected and the appropriate immunization protocol to be used. The production of non-human monoclonal antibodies, for example from the mouse, from Lagomorpha and from the horse, is generally known and can be carried out, for example, by immunizing an animal with a preparation containing hTRT or fragments thereof. In one method, the spleen of the animals is cut out after a suitable period of time and individual spleen cells are typically fused with immortalized myeloma cells under suitable selection conditions. The cells are then clonally separated and the supernatants from each clone (e.g. hybridoma) are tested for the production of a suitable antibody specific for the desired region of the antigen.
Methods for producing antibodies are well known in the art. See, for example, Goding et al., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2nd Edition), Acad. Press, N.Y., and Harlow and Lane, op. Cit., Both publications are incorporated by reference in their entirety and for all purposes, as a part of this description. Other suitable methods include in vitro exposure of lymphocytes to the antigenic polypeptides or, alternatively, a selection of antibody banks in phage vectors or similar vectors (see the description below).
B) Human antibodies
Another aspect of the invention relates to the provision of human antibodies against an hTRT polypeptide. Human monoclonal antibodies to a known antigen can also be made using transgenic animals that have elements of a human immune system (see, for example, US Patent Nos. 5,569,825 and 5,545,806, both documents being incorporated by reference in their entirety and for all purposes as Are part of this description) or using human peripheral blood cells (Casali et al., Science 234 (1986), 476). Some human antibodies are selected by competitive binding experiments or so that they have the same epitope specificity as a specific mouse antibody.
In a further embodiment, human antibodies against an hTRT polypeptide can be produced by screening a DNA bank from human B cells according to the general protocol described by Huse et al., Science 246 (1989), 1275. This document is also to be considered part of the present description by reference. Antibodies binding to the hTRT polypeptide are selected. Sequences encoding these antibodies (or a binding fragment) are then cloned and amplified. The protocol described by Huse is often used with "phage-display" technology.
C. Humanized or Chimeric Antibodies
The invention also provides anti-hTRT antibodies made as chimeric, human antibody-like or humanized antibodies so as not to lower their potential antigenicity to the target. The preparation of chimeric and humanized antibodies, or antibodies similar to human antibodies, has been described in the art (see, for example, U.S. Patent Nos. 5,585,089 and 5,530,101; Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 10029 and Verhoeyan et al., Science 239 (1988), 1534, which documents are to be considered in their entirety and for all purposes as the subject of this description by reference.
Humanized immunoglobulins have variable scaffold regions, which essentially come from a human immunoglobulin (with the name acceptor immunoglobulin) and the complementarity of the determining regions, which essentially come from a non-human immunoglobulin (e.g. from the mouse) (with the name Donor immunoglobulin). The constant region (s), if present, originate essentially from a human immunoglobulin.
In some applications, for example when administered to human patients, the humanized (as well as the human) anti-hTRT antibodies according to the invention offer a number of advantages over antibodies of mice or other species: (1) the human immune system should be the basic structure or the constant Do not recognize the area of the humanized antibody as foreign and therefore the antibody response against such an injected antibody should be lower than against a completely foreign mouse antibody or a partially foreign chimeric antibody;
(2) since the effector area of the humanized antibody is human, it is likely to interact better with other parts of the human immune system, and (3) injected humanized antibodies have a half-life that is essentially equivalent to that of naturally occurring human antibodies, which it is allows smaller and less frequent doses to be administered compared to antibodies from other species.
D) "phage display"
The present invention also provides anti-hTRT antibodies (or binding composition) made by "phage display" methods (see, for example, Dower et al. 1 WO 91/17 271 and McCafferty et al., WO 92/01 047 and Vaughan et al., Nature Biotechnology 14 (1996), 309, which documents are to be regarded in their entirety and for all purposes as a component of this description due to the reference). These processes produce phage banks in which members present different antibodies on their outer surfaces. Antibodies are usually presented as Fv or Fab fragments. Phages that present antibodies with a desired specificity are selected by affinity enrichment with an hTRT polypeptide.
In a variation of the "phage-display" method, humanized antibodies with the binding specificity of a selected mouse antibody can be produced. In this method, the variable region of either the heavy or the light chain of the selected mouse antibody is used as the starting material. For example, if the variable region of a light chain is selected as the starting material, a phage bank is created in which members present the variable region of the same light chain (i.e. the starting material from the mouse) and a variable region of a different heavy chain. The heavy chain variable regions are obtained from a bank with human rearranged heavy chain variable regions.
A phage that shows strong specific binding to the hTRT polypeptide (e.g. at least 10 <8> and preferably at least 10 <9> M <-> <1>) is selected. The variable region of the human heavy chain from this phage then serves as the starting material for the production of a further phage bank. In this bank, each phage presents the same variable region of the heavy chain, i.e. the area identified by the first presentation bench, and a different area of the light chain. The light chain variable regions are obtained from a bank of human rearranged light chain variable regions. Again, a phage that shows strong specific binding is selected. These phages present the variable regions of fully human anti-hTRT antibodies.
These antibodies usually have the same or a similar epitope specificity as the mouse-derived starting material.
E) Hybrid antibodies
The invention also provides hybrid antibodies that share specificity with antibodies to an hTRT polypeptide, but can also specifically bind a second entity. In these hybrid antibodies, usually one pair is from a heavy and light chain of an anti-hTRT antibody and the other pair is from an antibody directed against another epitope or protein. This leads to the property of multifunctional valence, i.e. the ability to bind at least two different epitopes simultaneously, at least one epitope being the epitope to which the anti-complex antibody binds. Such hybrids can be formed by fusion of the corresponding component antibodies producing hybridomas or by combination methods.
Immunoglobulins according to the invention can also be fused with functional areas of other genes (e.g. enzymes) for the production of fusion proteins (e.g. immunotoxins) with useful properties.
F) Anti-idiotypic antibodies
Anti-idiotypic antibodies that can be isolated using the methods described above are also useful. Anti-idiotypic antibodies can be prepared, for example, by immunizing an animal with the primary antibody (i.e. anti-hTRT antibodies or hTRT-binding fragments thereof). For anti-hTRT antibodies, anti-idiotypic antibodies are selected whose binding to the primary antibody is inhibited by an hTRT polypeptide or fragments thereof. Because both the anti-idiotypic antibody and the hTRT polypeptide, or fragments thereof, bind the primary immunoglobulin, the anti-idiotypic immunoglobulin can represent the "internal picture" of an epitope and thus replace the hTRT polypeptide in assays, or it can be used to bind (ie inactivate) anti-hTRT antibodies, for example in a patient.
Anti-idiotypic antibodies can also interact with telomerase-associated proteins. The administration of such antibodies could affect telomerase function by titrating out hTRT-associated proteins.
G) General
The antibodies according to the invention can belong to any isotype, for example IgM, IgD, IgG, IgA and IgE, with IgG, IgA and IgM being often preferred. Humanized antibodies can also include sequences from more than one class or isotype.
In a further embodiment according to the invention, fragments of the intact antibodies described above are provided. Typically, these fragments can compete with the intact antibody from which they are derived for specific binding to the hTRT polypeptide and bind with an affinity of 10 <7>, 10 <8>, 10 <9> M <-> <1>, or 10 <1> <0> M <-> <1>. Antibody fragments include separate heavy chains, light chains, Fab, Fab min F (min min) 2, Fabc and Fv. Fragments can be produced by enzymatic or chemical separation of intact immunoglobulins. For example, an F (min) min fragment from an IgG molecule by proteolytic cleavage with pepsin at a pH of 3.0-3.5 using standard methods, as described, for example, in Harlow and Lane, loc. Cit. be preserved.
Fab fragments can be obtained from F (min) min fragments by limited reduction from a whole antibody by cleavage with papain in the presence of reducing agents (see generally Paul, W. (ed.) Fundamental Immunology 2nd Raven Press, NY, 1989 , Chapter 7, this document being incorporated by reference in its entirety and for all purposes as part of this description). Fragments can also be made by recombinant DNA techniques. Nucleic acid segments encoding selected fragments are made by digesting full length coding sequences with restriction enzymes or by de novo synthesis. Fragments are often expressed in the form of a phage fusion coat protein.
Many of the immunoglobulins described above can have non-critical amino acid substitutions, additions or deletions in both the variable and constant ranges without loss of binding specificity or effector functions or intolerable reduction in binding activity (i.e. below about 10 <7> M <-> <1>) go through. Typically, immunoglobulins with such changes show a substantially identical sequence compared to a reference immunoglobulin from which they are derived. A mutant immunoglobulin can be selected that has the same specificity and increased affinity compared to a reference immunoglobulin from which it is derived. The "phage-display" technology offers useful methods for the selection of such immunoglobulins.
See, for example, Dower et al. , WO 91/17 271, McCafferty et al. , WO 92/01 047 and Huse, WO 92/06 204.
The antibodies according to the invention can be used with or without modification. The antibodies are often labeled by either covalent or non-covalent addition of a detectable label. The antibodies according to the invention are particularly useful as labeled binding units in diagnostic applications.
The anti-hTRT antibodies according to the invention can be purified using generally known methods. The complete antibodies, their dimers, individual light and heavy chains or other forms of immunoglobulin according to the invention can be prepared using the methods and reagents according to the invention in accordance with standard methods customary in the art, including ammonium sulfate precipitation, affinity columns, column chromatography, gel electrophoresis etc. belong, be cleaned (see general Scopes, Protein Purification: Principiesand Practice, 3. Edition (Springer-Verlag, N. Y. ; 1993). Essentially pure immunoglobulins with at least about 90 to 95% or even 98 to 99% or higher homogeneity are preferred.
VI. Purification of human telomerase
The present invention provides isolated human telomerase with unprecedented purity. In particular, the present invention provides: purified hTRT recombinant or non-recombinant in origin; purified hTRT-hTR complexes (i.e. H. RNPs), recombinant, non-recombinant or mixed origin, optionally comprising one or more telomerase associated proteins; purified naturally occurring human telomerase; Etc. In addition, the invention provides methods and reagents for the above-described molecules and complexes including variants, fusion proteins, naturally occurring proteins, etc. (collectively referred to as "hTRT and / or hTRT complexes") in partially purified, substantially purified or highly purified form.
Before this invention was made, attempts were made to purify the telomerase-enzyme complex to homogeneity, but with limited success (see, for example, the parallel U.S. patent application serial no. 08/833 377, filed on 4 April 1997 and 08/510 736, filed on April 4, August 1995 and PCT application no. 97/06 012, filed on April 4, April 1997. These documents are to be considered as part of this description for useful cleaning procedures due to the reference). The methods provided in the applications listed above make it possible to purify telomerase up to about 60,000 times or more compared to crude cell extracts.
The present invention provides hTRT and hTRT complexes of even higher purity, thanks in part to the new immunoaffinity reagents of the invention (e.g. B. anti-hTRT antibody) and / or the reagents, cells and methods provided here for the recombinant expression of hTRT. The recombinant expression of hTRT and hTRT complexes facilitates purification because the desired molecules are produced in a much higher concentration compared to most naturally occurring expressing cells and / or because the recombinant hTRT molecules can be modified in this way (e.g. B. by fusion with an epitope "tag" that they can be easily cleaned.
It is obvious that naturally occurring telomerase can be purified from a telomerase positive cell. Recombinant hTRT and hTRT complexes can u. a. expressed and purified using any of the in vitro, in vivo, ex vivo, plant or animal expression systems described above, or other systems known in the art.
In one embodiment, the hTRT, telomerase and other compositions according to the invention are purified by means of an immunoaffinity step, either only this step or a combination with further purification steps being carried out. Typically, an immobilized or immobilizable anti-hTRT antibody as provided by the present invention is contacted with a sample, for example a cell lysate, containing the desired hTRT or the hTRT-containing complex under conditions where a anti-hTRT antibody that binds hTRT antigen. After removal of unbound components of the sample by methods well known in the art, the hTRT composition can, if desired, be eluted from the antibody in substantially pure form.
In one embodiment, immunoaffinity chromatography methods well known in the art are used (see, for example, Harlow and Lane, a. a. O. , Ausubel, a. a. O. , and Hermansanetal. , 1992, Immobilized Affinity Ligand Techniques (AcademicPress, SanDiego "in accordance with the methods according to the invention. In another illustrative embodiment, immunoprecipitation of anti-hTRT-immunoglobulin-hTRT complexes is performed using immobilized Protein A. Numerous variations and alternative immunoaffinity purification protocols suitable for use in accordance with the methods and reagents of the invention are well known to those skilled in the art.
In a further embodiment, recombinant hTRT proteins can be purified as a result of their high level expression by routine protein purification methods, for example by ammonium sulfate precipitation, affinity columns (e.g. B. Immunoaffinity), size exclusion, anion and cation exchange chromatography, gel electrophoresis etc. (see generally R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y. (1982) and Deutscher, Methods in Enzymology 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N. Y. (1990)) instead of or in addition to immunoaffinity methods. Cation exchange methods can be particularly useful due to the basic pI of the hTRT protein. For example, immobilized phosphate can be used as a functional cation exchange group (e.g. B.
P-11 phosphocellulose, Whatman catalog # 4071 or cellulose phosphate, Sigma catalog #C 3145) can be used. Immobilized phosphate has two advantageous features in terms of hTRT purification - it is a cation exchange resin and it shows physically a similarity to the phosphate backbone of nucleic acids. Therefore, "pseudo" affinity chromatography can also be used because hTRT binds hTR and telomeric DNA. Other nonspecific nucleic acid affinity chromatography methods are also useful for purification (see, for example, U.S. parallel patent application serial no. 08/833 377; Albers et al. , Methods Enzymol. 197 (1971) 198; Arnt-Jovin et al. , Eur. J. Biochem. 54 (1975), 411 and Pharmacia Catalog # 27-5575-02). Further use of this likely binding function of hTRT would involve the use of specific nucleic acids (e.g. B.
Primer or hTR) in the event of an increase in the affinity of the expression or activity of activators of hTRT transcription and further measures which are obvious to the person skilled in the art after reading this description.
E) funds for intervention
1) TRT proteins and peptides
In one embodiment, the invention provides telomerase modulating polypeptides (i.e. H. Proteins, polypeptides and peptides) ready to increase or decrease telomerase activity. These can be sent directly to a target cell (e.g. B. by injection, liposome-mediated fusion, application of a hydrogel to the tumor surface (e.g. B. in the case of melanoma, fusion or attachment of the structural protein VP22 of the herpes virus and other methods described here and known in the art). In a second embodiment, telomerase-modulating proteins and peptides according to the invention are introduced into a cell by introducing a nucleic acid (e.g. B. of a DNA expression vector or mRNA), which encodes the desired protein or peptide in the cell, expressed in a cell.
Expression can be either constitutive or inducible, depending on the vector and choice of promoter (see discussion below). Messenger RNA preparations encoding hTRT are particularly useful when only transient expression (e.g. B. transient activation of telomerase) is desired. Methods for introducing and expressing nucleic acids into a cell are well known in the art (see also other places in this description, such as the sections on oligonucleotides and gene therapy methods).
One aspect of this invention relates to a telomerase-modulating polypeptide that increases telomerase activity in a cell. In one embodiment, the polypeptide is a catalytically active hTRT polypeptide that can direct the synthesis of human telomeric DNA (in conjunction with an RNA template, such as hTR). This activity can be measured as discussed above, for example using a telomerase activity assay such as a TRAP assay. In one embodiment, the polypeptide is a full-length hTRT protein with a sequence that corresponds to the sequence of 1132 residues of SEQ. ID. No. 2 corresponds or is essentially identical to it. In a further embodiment, the polypeptide is a variant of the hTRT protein from SEQ. ID.
No. 2, for example a fusion polypeptide, derivatized polypeptide, truncated polypeptide, polypeptide with conservative substitutions etc. A fusion or derivatized protein may contain a "targeting" moiety that increases the ability of the polypeptide to penetrate the cell membrane or causes the polypeptide to target a specific cell type (e.g. B. Liver cells or tumor cells) or cell compartments (e.g. B. the nuclear compartment) is preferably supplied. Examples of such "targeting" units include lipid tails, amino acid sequences such as the "antennapediall peptide (see USSN 08 / 838,545, filed 9 April 1997) or a nuclear localization signal (NLS; e.g. B. Xenopus nucloplasmin; Robbins et al. , Cell 64 (1991), 615). Naturally occurring hTRT protein (e.g. B. with a sequence that SEQ. ID.
No. 2 corresponds or is essentially identical to it) acts in the cell nucleus. Therefore, it is likely that one or more sub-sequences of SEQ. ID. No. 2, for example residues 193 to 196 (PRRR) and residues 235-240 (PKRPRR) act as a nuclear localization signal. The small areas are probably NLSs. This is based on the observation that many NLSs include a four-residue pattern composed of basic amino acids (K or R) or three basic amino acids (K or R) and H or P; a pattern starting with P, followed by a basic segment within three residues containing 3 K or R residues from four residues (see for example Nakai et al. , Genomics 14 (1992) 897).
Deletion of either or both and / or additional localization sequences is believed to interfere with hTRT transport into the nucleus and / or increase hTRT turnover, thus preventing telomerase from accessing its nuclear substrates and reducing proliferative activity Potential is useful. In addition, an hTRT variant that lacks the NLS could assemble into an RNP that can no longer maintain the telomeric length because the resulting enzyme cannot get into the nucleus.
The hTRT polypeptides according to the invention are typically associated in the target cell with a telomerase RNA, such as hTR, if they are used to increase telomerase activity in a cell. In one embodiment, an introduced hTRT polypeptide associates with an endogenous hTR to form a catalytically active RNP (e.g. B. an RNP that contains the hTR and a full length polypeptide and a sequence of SEQ. ID. No. 2 includes). The RNP formed in this way can also associate with other, for example telomerase-associated, proteins. In further embodiments, the telomerase RNP (which contains the hTRT protein, hTR and optionally further constituents) is introduced as a complex into the target cell.
In a similar embodiment, an hTRT expression vector is introduced into a cell (or the progeny of a cell) into which a telomerase RNA (e.g. B. hTR) expression vector is introduced simultaneously, after or before. In this embodiment, hTRT protein and telomerase RNA are co-expressed in the cell and they assemble to form a telomerase RNP. A preferred telomerase RNA is hTR together. An expression vector useful for the expression of hTR in a cell has been described above (see U.S. Patent 5,583,016). In a further embodiment, the hTRT polypeptide and the hTR-RNA (or an equivalent) are associated in vitro to form a complex which is then introduced into the target cells.
Another aspect of the invention relates to the provision of hTRT polypeptides which are useful for reducing telomerase activity in a cell.
As described above, these "inhibitory" polypeptides can either be introduced directly into the cell or generated by expression of recombinant nucleic acids in the cell. Peptide "mimics" or polypeptides comprising non-standard amino acids (i.e. H. Amino acids that do not correspond to the 20 amino acids encoded by the genetic code or their normal derivatives) are usually introduced directly.
In one embodiment, inhibition of telomerase activity results in the sequestration of an ingredient required for accurate telomere extension. Examples of such components are hTRT and hTR. Thus, administration of a polypeptide that binds hTR but has no catalytic activity of telomerase can decrease endogenous telomerase activity in the cell. In a related embodiment, the hTRT polypeptide can bind a cell component that is not hTR, for example a (or more) telomerase-associated protein, thereby disrupting telomerase activity in the cell.
In another embodiment, the hTRT polypeptides according to the invention disrupt the interaction of endogenously expressed hTRT protein and another cellular component required for the telomerase function, for example hTR, telomer DNA, telomerase-associated proteins, telomer-associated proteins, telomeres Cell cycle controlling proteins, DNA repair enzymes, histones or non-histone chromosomal proteins etc. (for example through competition).
By selecting molecules according to the invention (Z. B. Polypeptides) that affect the interaction of endogenously expressed hTRT protein and other cellular components, one may prefer molecules that, as described herein, contain one or more of the conserved motifs of the hTRT protein. The evolutionary conservation of these areas shows that these motifs play an important role in the correct functioning of human telomerase. These motifs are thus generally useful areas for using the function of the hTRT protein to generate hTRT protein variants according to the invention. thus hTRT polypeptide variants with mutations in conserved motifs are of particular use.
In another embodiment, expression of the endogenous hTRT gene is introduced by introducing a large amount of hTRT polypeptide into the cell (e.g. B. typically at least about more than 2-fold compared to the endogenous level, preferably about at least 10 to about 100-fold). This acts via a test coupling loop and thus inhibits the transcription of the hTRT gene, the processing of the hTRT pre-m PNA, the translation of the hTRT mRNA or the assembly and transport of the telomerase RNP.
2) Oligonucleotides
a) "Antisense" constructs
The invention provides methods and "antisense" oligonucleotides or polynucleotide reagents that can be used to decrease expression of hTRT gene products in vitro or in vivo. The administration of the "antisense" reagents according to the invention to a target cell leads to reduced telomerase activity and is particularly useful for the treatment of diseases which are characterized by high telomerase activity (e.g. B. in cancer). It is assumed that no limitation to a particular mechanism is intended here that "antisense" oligonucleotides bind to the "sense" hTRT mRNA and interfere with its translation.
Alternatively, the "antisense" molecules may make the hTRT mRNA sensitive to nuclease cleavage, interfere with transcription, processing or localization, or otherwise interfere with RNA precursors ("pre-mRNA"), the transcription of mRNA of the hTRT Repress gene or act through some other mechanism. However, the particular mechanism by which the "antisense" molecules decrease hTRT expression is not critical.
The "antisense" polynucleotides according to the invention comprise an "antisense" sequence with at least 7 to 10 or more nucleotides which hybridize specifically with a sequence of mRNA which encodes human TRT or mRNA which is transcribed by the hTRT gene. The "antisense" polynucleotide according to the invention preferably has a length of about 10 to about 50 nucleotides or of about 14 to about 35 nucleotides. In other embodiments, the "antisense" polynucleotides are polynucleotides that are shorter than about 100 nucleotides or shorter than about 200 nucleotides. In general, the "antisense" polynucleotides should be long enough to form a stable double helix, but short enough (depending on the type of delivery) to be administered in vivo if desired.
The minimum length of a polynucleotide required for a specific hybridization with a target sequence depends on various factors, for example the G / C content, the location of mismatched bases (if any), the extent of the uniqueness of the sequence compared to the population of target polynucleotides, the chemical nature of the polynucleotide (e.g. B. it can be a methylphosphonate backbone, a peptide nucleic acid, a phosphorothioate) etc. In general, the "antisense" sequence to ensure specific hybridization is essentially complementary to the target hTRT mRNA sequence. In certain embodiments, the "antisense" sequence is exactly complementary to the target sequence.
However, the "antisense" polynucleotides can also contain nucleotide substitutions, additions, deletions, transitions, transpositions or modifications, as long as the specific binding to the relevant target sequence, which corresponds to hTRT-RNA or its gene, is maintained as a functional property of the polynucleotide .
In one embodiment, the "antisense" sequence is relative to relatively accessible sequences of the hTRT mRNA (e.g. B. Sequences that have relatively few secondary structures) complementary. This can be determined by analyzing the predicted RNA secondary structures, for example by means of the MFOLD program (Genetics Computer Group, Madison WI) and by in vitro or in vivo tests known in the art. Examples of oligonucleotides that can be tested for "antisense" suppression of the hTRT function are oligonucleotides labeled with the following positions from SEQ. ID. No. 1 can hybridize (i.e. H. are essentially complementary): SEQ. ID. No. 1: 40-60; 260-280; 500-520; 770-790, 885-905; 1000-1020; 1300- 1320; 1520-1540; 2110-2130; 2295-2315; 2450-2470, 2670-2690; 3080-3110; 3140-3160; and 3690-3710.
Another useful method for identifying effective "antisense" compositions uses combinatorial arrays of oligonucleotides (see for example Milner et al. , Nature Biotechnology 15 (1997), 537).
The invention also provides an "antisense" polynucleotide that has sequences in addition to the "antisense" sequence (e.g. B. in addition to the anti-hTRT "sense" sequence). In this case the "antisense" sequence is contained in a polynucleotide with a longer sequence. In a further embodiment, the sequence of the polynucleotide consists essentially of or represents the "antisense" sequence.
The "antisense" nucleic acids (DNA, RNA, modified DNA or RNA analogs etc. ) can be prepared using any method suitable for the production of nucleic acids, for example the methods described here. In one embodiment, "antisense" RNA molecules according to the invention can be produced, for example, by chemical synthesis de novo or by cloning. For example, an "antisense" RNA that hybridizes with hTRT mRNA can be produced by an hTRT DNA sequence (e.g. B. SEQ. ID. No. 1 or a fragment thereof) in reverse orientation functionally linked to a promoter into a vector (e.g. B. a plasmid) is inserted (ligated).
Provided that the promoter and preferably termination and polyadenylation signals are correctly positioned, the strand of the inserted sequence corresponding to the non-coding strand is transcribed and this acts as an "antisense" oligonucleotide according to the invention.
The "antisense" oligonucleotides according to the invention can be used to inhibit telomerase activity in cell-free extracts, cells and animals, including mammals and humans. The phosphorothioate "antisense" oligonucleotides:
EMI128. 1
can be used, for example, to inhibit telomerase activity. At a concentration of 10 µM, each oligonucleotide inhibited; Mixtures of oligonucleotides A and B; A, B, C and D; and A, C and D the telomerase activity in 293 cells when treated once a day for 7 days. Inhibition was also observed with an "antisense" hTR molecule (5 min -GCTCTAGAATGAAGGGTG-3 min) when this was done with oligonucleotides A, B and C; A, B and D; and A and C was combined. Control and oligonucleotides useful for such experiments include:
EMI128. 2nd
In order to be able to determine the “antisense” oligonucleotides according to the invention that are optimal for a particular desired application, a scanning can be carried out using a set of “antisense” oligonucleotides according to the invention. An example of such a set is the set of 30-mer oligonucleotides that span the hTRT mRNA and one of which is offset by 15 nucleotides (i.e. H. ON1 corresponds to positions 1-30 and is TCCCACGTGCGCAGCAGGACGCAGCGCTGC, ON2 corresponds to positions 16-45 and is GCCGGGGCCAGGGCTTCCCACGTGCGCAGC, and ON3 corresponds to positions 31-60 and is GGCATCGCGGGGGTGGCCGCTGGGCCAGG until the end of the mRNA). Each member of this set can be tested for inhibitory activity as described here.
Those oligonucleotides that show inhibitory activity under the desired conditions then identify a desired region. Further oligonucleotides according to the invention which correspond to the desired region (i.e. H. 8-mers, 10-mers, 15-mers etc. ) can be tested to identify the oligonucleotide with the activity preferred for the application.
For general procedures relating to antisense polynucleotides, see Antisense RNA and DNA (1988), D. A. Melton, (ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. ) and Dagle et al. , Nucleic Acids Research 19 (1991), 1805. For an overview article relating to "antisense" therapy, see for example Uhlmann et al. , Chem. Reviews 90 (1990) 543-584.
b) triplex oligo- and polynucleotides
The present invention provides oligonucleotides and polynucleotides (e.g. B. DNA, RNA or PNA) ready to bind to double stranded or duplex hTRT nucleic acids, (e.g. B. in a folded region of the hTRT-RNA or in the hTRT gene), whereby a nucleic acid is formed which contains a triple helix or a "triplex" nucleic acid. The formation of a triple helix leads to the inhibition of hTRT expression, for example by preventing the transcription of the hTRT gene, as a result of which telomerase activity in a cell is reduced or eliminated. It is believed (but is not intended to be bound by any particular mechanism) that the triple helix pairing interferes with the ability of the double helix to open sufficiently for the binding of polymerases, transcription factors, or regulatory molecules.
Triplex oligo- and polynucleotides according to the invention are constructed using the base pairing rules for the formation of triple helices (see for example Cheng et al. , i. Biol. Chem. 1988, 263: 15110; Ferrin and Camerini Otero, Science 354 (1991), 1494; Ramdas et al. , J. Biol. Chem. 1989, 264: 17395; Strobel et al. , Science 254 (1991), 1639 and Rigas et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 9591, each of which is to be considered part of this description by reference) and the hTRT mRNA and / or gene sequences.
Typically, the triplex-forming oligonucleotides of the invention comprise a specific sequence from about 10 to at least about 25 nucleotides or a longer sequence that is "complementary" to a specific sequence in the hTRT-RNA or the gene (i.e. H. long enough to be able to form a stable triple helix, but short enough, depending on the type of delivery, to be administered in vivo if desired). In this context, "complementary" means the ability to form a stable triple helix. In one embodiment, oligonucleotides are designed to specifically target the regulatory regions of the hTRT gene (e.g. B. the hTRT-5 min flanking sequence, promoters and enhancers) or the transcription initiation site (e.g. B. specifically bind between -10 and +10 from the transcription initiation site).
For a review of recent therapeutic advances using triplex DNA, see Gee et al. . in Huber and Carr, 1994, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co. , Mt. Kisco NY and Rininsland et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 5854, both documents being incorporated by reference into this description.
c) Ribozymes
The present invention also provides ribozymes that are useful for inhibiting telomerase activity. The ribozymes according to the invention bind, cleave specifically and inactivate hTRT mRNA. Useful ribozymes can include 5 min and 3 min terminal sequences complementary to the hTRT mRNA, and these can be constructed by one of skill in the art based on the hTRT mRNA sequence described herein (see PCT publication WO 93/23 572, a. a. O. ). The ribozymes according to the invention include ribozymes with the features of the group I intron ribozymes (Cech, Biotechnology 13 (1995), 323) and "hammerhead" ribozymes (Edgington, Biotechnology 10 (1992), 256).
The ribozymes according to the invention include ribozymes with cleavage sites such as GUA, GUU and GUC. Other optimal cleavage sites for ribozyme-mediated inhibition of telomerase activity in accordance with the present invention include those described in PCT publications WO 94/02 595 and WO 93/23 569, both documents being incorporated by reference into this specification are to be seen. Short RNA oligonucleotides 15 and 20 ribonucleotides in length corresponding to a region of the target hTRT gene that contains a cleavage site can be evaluated for secondary structural features that lead to more desirable oligonucleotides.
The suitability of the cleavage sites can also be assessed by testing accessibility to hybridization with complementary oligonucleotides using "ribonuclease protection" assays, or by testing ribozyme activity in vitro according to standard procedures known in the art.
As described by Hu et al. , PCT publication WO 94/03 596, "antisense" and ribozyme functions can be combined in a single oligonucleotide. This document is also to be regarded as the subject of this description by reference. In addition, ribozymes can comprise one or more modified nucleotides or modified bonds between nucleotides, as described above in connection with the description of illustrative oligonucleotides according to the invention.
In one embodiment, the ribozymes according to the invention are generated in vitro and introduced into a cell or a patient. In another embodiment, gene therapy methods are used to express ribozymes in a target cell ex vivo or in vivo.
d) administration of oligonucleotides
Typically, the therapeutic methods according to the invention include the administration of an oligonucleotide which acts in such a way that it can inhibit or stimulate telomerase activity in vivo under physiological conditions and which is relatively stable under these conditions for a period of time which is sufficient for a therapeutic effect. As already stated above, modified nucleic acids can be useful in imparting such stability, but also for the targeted delivery of the oligonucleotide to the desired tissue, organ or cell.
Oligo- and polynucleotides can be supplied directly as drugs in a suitable pharmaceutical formulation, or indirectly by means of introducing a nucleic acid into a cell, including liposomes, immunoliposomes, ballistic methods, direct uptake in cells etc. as described here. To treat a disease, the oligonucleotides according to the invention are administered to the patient in a therapeutically effective amount. A therapeutically effective amount is the amount sufficient to alleviate disease symptoms or to modulate telomerase activity in the target cell, as can be determined, for example, using a TRAP assay or other suitable assay for the biological function of telomerase.
Methods suitable for the delivery of oligonucleotides for therapeutic purposes are described in US Pat. No. 5,272,065, which is hereby incorporated by reference into this description. Further details regarding the administration of pharmaceutically active compounds are described below. In a further embodiment, oligonucleotides and polynucleotides can be supplied using gene therapy and the recombinant DNA expression plasmids according to the invention.
3) gene therapy
Gene therapy refers to the introduction of an otherwise exogenous polynucleotide that has a medically useful phenotypic effect on the (typically) mammalian cell (s) into which it is transferred. One aspect of the present invention relates to the provision of gene therapy methods and compositions for the treatment of telomerase associated conditions. In illustrative embodiments, gene therapy involves introducing into a cell a vector that expresses an hTRT gene product (e.g. B. an hTRT protein that is essentially the hTRT polypeptide with a sequence of SEQ. ID.
No. 2 equals, for example, to increase telomerase activity or an inhibitory hTRT polypeptide to reduce the activity), the expression of a nucleic acid with a sequence of an hTRT gene or an hTRT mRNA (e.g. B. an "antisense" RNA, for example to decrease telomerase activity), the expression of a polypeptide or polynucleotide that otherwise affects the expression of hTRT gene products (e.g. B. a ribozyme that is directed to reduce telomerase activity against hTRT-MRNA) or to exchange, or to interrupt an endogenous hTRT sequence (e.g. B. "gene replacement" and "gene knockout"). Numerous other embodiments will be apparent to those skilled in the art after reading this description. In one embodiment, an vector encoding hTR is also introduced.
In a further embodiment, vectors encoding telomerase-associated proteins are also introduced with or without a vector for hTR.
Vectors useful for hTRT gene therapy can be viral or non-viral. These include the vectors described above in connection with the hTRT expression systems according to the invention. It will be apparent to those skilled in the art that gene therapy vectors can include promoters and other regulatory or processing sequences, such as those described herein. The vectors usually comprise a promoter and, if appropriate, an enhancer (independent of an enhancer which is already present within the promoter sequences) which serve to control the transcription of an oligoribonucleotide, and further regulatory elements which are necessary for the maintenance of the vector as an episome or for that Provide high level chromosomal integration and transcription if desired.
A plasmid useful for gene therapy can comprise further functional elements, for example selectable markers, identification regions and further sequences. Additional sequences can play a role in providing stability both outside and inside the cell in order to effect the targeted delivery of hTRT nucleotide sequences ("sense" or "antisense") to a desired organ, tissue or cell population, or to mediate entry into a cell, the nucleus of a cell and / or integration within nuclear DNA.
For example, aptamer-like DNA structures or other sites of the units that bind proteins can be used to mediate the binding of a vector to cell surface receptors or to serum proteins that bind to a receptor, thereby increasing the efficiency of DNA transfer into the Cell is increased. Other DNA sites and structures can bind directly or indirectly to receptors in the nuclear membrane or to other proteins that migrate to the nucleus, thereby facilitating the nuclear uptake of a vector. Other DNA sequences can directly or indirectly influence the efficiency of the integration.
Suitable vectors for gene therapy may or may not have an origin of replication. For example, it is useful for replication of the vector to incorporate an origin of replication into a vector prior to administration to a patient. However, the origin of replication can often be removed prior to administration if the vector is designed to integrate into the host's chromosomal DNA or to bind to the host's mRNA or DNA. In some situations (e.g. B. in tumor cells), it may not be necessary for the exogenous DNA to be integrated stably into the transduced cell, since transient expression can be sufficient to kill cells.
As already mentioned, the present invention also provides methods and reagents for gene replacement therapy (i.e. H. the exchange of an endogenous hTRT gene for a recombinant gene by homologous recombinaton). Vectors specially designed for integration by homologous recombination can be used for this. Factors important for optimizing homologous recombination include the extent of the sequence identity and the length of homology to chromosomal sequences. The specific sequence mediating the homologous recombination is also important, since integration into transcriptionally active DNA takes place much more easily.
Methods and substances for constructing constructs for targeted homologous recombination are described, for example, in Mansour et al. , Nature, 336: 348 (1988); Bradley et al. , Bio / Technology 10 (1992), 534 and beyond in U.S. Patent No. 5,627,059; 5,487,992, 5,631,153 and 5,464,764. In one embodiment, "gene replacement" therapy comprises the modification or replacement of all or part of a regulatory sequence which controls the expression of the hTRT gene to be regulated. For example, the hTRT promoter sequences (e.g. B. those in SEQ. ID. No. 6 (Fig. 21) can be interrupted (so as to reduce hTRT expression or to eliminate a control point for transcription) or be replaced by an exogenous promoter, for example to increase hTRT expression.
The invention also provides methods and reagents for hTRT "gene knockout" (i.e. H. deletion or disruption of an endogenous hTRT gene by homologous recombination using a recombinantly produced vector). With this "gene knockout", the sequences considered as targets can be regulatory sequences (e.g. B. the hTRT promoter) or RNA or protein coding sequences. The change in expression of endogenous genes by homologous recombination is described in detail in U.S. Patent No. 5,272,071 (and the U.S. patents cited above), WO 91/09 955, where 93/09 222, WO 96/29 411, WO 95/31 560 and WO 91/12 650. See also Moynahan et al. , Hum. Mol. Genet. 5 (1996) 875.
The present invention further provides methods for specifically killing telomerase-positive cells or preventing the transformation of telomerase-negative cells to a telomerase-positive status, using the hTRT gene promoter to regulate the expression of a protein toxic to the cell. As shown in Example 14, an hTRT promoter sequence can be operably linked to a reporter gene so that activation of the promoter leads to expression of the protein encoded by the reporter gene. If, instead of a reporter protein, the encoded protein is toxic to the cell, activation of the promoter leads to cell morbidity or cell death.
In one embodiment according to the invention, a vector which comprises a gene encoding a toxic protein which is functionally linked to an hTRT promoter is introduced into cells, such as human cells, for example cells in a human patient, which leads to cell death in those cells, in which hTRT promoter activating factors are expressed, such as cancer cells. In a related embodiment, the encoded protein itself is not toxic to a cell, but encodes an activity that makes the cell sensitive to an otherwise non-toxic agent. For example, tumors can be treated by introducing an hTRT promoter herpes thymidine kinase (TK) gene fusion construct into tumor cells and administering gangcyclovir or the equivalent (see, for example, Moolton and Wells, J. Natl. Canc.
Inst. 82: 297 (1990). Numerous other suitable toxic or potentially toxic proteins and systems are known in the art (using promoter sequences that differ from hTRT), which can be modified and administered by a person skilled in the art after reading this description in accordance with the present invention.
Vectors for gene therapy can be introduced into cells or tissues in vivo, in vitro or ex vivo. For ex vivo therapy, vectors can be introduced into stem cells taken from the patient and clonally propagated for autologous back transplantation in the same patient (see, for example, U.S. Patents 5,399,493 and 5,437,994, which are incorporated by reference into these documents the description can be viewed).
The cells that may be targeted for hTRT gene therapy with the goal of increasing telomerase activity in a target cell include, but are not limited to, embryonic or germ cells, particularly primate or human cells, as noted above, hematopoietic Stem cells (AIDS and after chemotherapy), vascular endothelial cells (diseases of the cardiovascular and cerebral vessels), skin fibroblasts and subcutaneous keratinocytes (wound healing and burns), chondrocytes (arthritis), brain astrocytes and microglial cells (Alzheimer's disease), osteoblasts (osteoporosis diseases), retinaceae and pancreatic islet cells (type I diabetes) and the cells listed in List 1 below.
In an embodiment according to the invention, an inducible promoter functionally linked to a TRT-coding sequence (or a variant thereof) is used to modulate the proliferation capacity of cells in vivo or in vitro. In a particular embodiment, for example, insulin-producing pancreatic cells, which are transfected with an hTRT expression vector under the control of an inducible promoter, are introduced into a patient. The proliferation ability of the cells can then be determined by administration of the promoter activating agent (e.g. B. Tetracycline) on the patient, whereby the cells can multiply more than would otherwise have been possible.
Cell proliferation can then be stopped, continued, or initiated again, as desired by the attending physician.
4) vaccine and antibodies
Immunogenic peptides or polypeptides with an hTRT sequence can be used to elicit an anti-hTRT immune response in a patient (i.e. H. they can act as a vaccine). Examples of immunogenic hTRT peptides and polypeptides are described in Examples 6 and 8 below. An immune response can also be achieved by delivering plasmid vectors encoding the desired polypeptide (i.e. H. the administration of "naked DNA") are triggered. The desired nucleic acids can be delivered by injection, liposomes or other administration measures. In one embodiment, types of immunization are selected which are in the test subject or trigger the patient to respond to the MHC class I response of cytotoxic lymphocytes to cells expressing telomerase.
After immunization, an increased immune response against cells expressing high levels of telomerase (e.g. B. malignant cells).
Anti-hTRT antibodies, e.g. from mouse, human, or humanized monoclonal antibodies can also be administered to achieve an immune response against telomerase-expressing cells (e.g. B. passive immunization).
F) Medicines
Related aspects of the present invention relate to the provision of drugs that contain hTRT oligo- and polynucleotides, polypeptides and antibodies, agonists, antagonists or inhibitors, alone or in combination with at least one other agent such as one stabilizing compound, diluent, carrier, or other active ingredient or agent.
The pharmaceuticals according to the invention can be administered in a sterile, biocompatible pharmaceutical carrier, which includes, for example, but not limited to, a saline solution, buffered saline solution, dextrose and water. Each of these molecules can be administered to the patient alone or in combination with other agents, drugs or hormones, in drugs where it is mixed with one or more suitable excipients, excipients and / or pharmaceutically acceptable carriers. In an embodiment according to the invention, the pharmaceutically acceptable carrier is pharmaceutically inert.
The drugs can be administered orally or parenterally. Methods for parenteral administration include topical, intra-arterial (e.g. B. directly to the tumor), intramuscular, subcutaneous, intramedullary, intrathecal, intraventricular, intravenous, intraperitoneal or intranasal administration. In addition to the active ingredients, these drugs can include suitable pharmaceutically acceptable carriers that include excipients and other compounds that facilitate the processing of the active ingredients into formulations that can be used pharmaceutically. Further details regarding formulation and administration procedures can be found in the latest issue of "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Maack Publishing Co. , Easton PA) can be found.
Drugs for oral administration can be formulated using pharmaceutically acceptable carriers well known in the art in doses suitable for oral administration. such carriers allow the formulation of the drugs as tablets, pills, dragées, capsules, liquids, gels, syrups, slurries, suspensions, etc. that are suitable for patient admission. See PCT publication WO 93/23 572.
Drugs for oral use can be obtained by combining active ingredients with a solid excipient, optionally by grinding a mixture obtained, and further processing the mixture of granules after adding suitable additional compound to obtain tablets or dragee cores if so desired. Suitable excipients are carbohydrate or protein fillers, including, but not limited to, sugars, including lactose, sucrose, mannitol, or sorbitol; Starch from corn, wheat, rice, potatoes or other plants; Cellulose such as methyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose or sodium carboxymethyl cellulose and gums, which include gum arabic and tragacanth resin, and proteins such as gelatin and collagen.
If desired, disintegrating or solubilizing agents can be added, for example cross-linked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid or a salt thereof, for example sodium alginate.
Drage cores are provided with suitable coatings, for example concentrated sugar solutions, they can also contain gum arabic, talc, polyvinylpyrrolidone, "Carbopol" gel, polyethylene glycol and / or titanium dioxide, lacquer solutions and suitable organic solvents or solution mixtures. Dyes or pigments can be added to the coatings for the tablets or dragees to identify the product or the amount of active ingredient (i.e. H. the dosage).
Oral drugs include plug-in capsules made from gelatin and soft sealed capsules made from gelatin and a coating of glycerin or sorbitol. Push-in capsules can contain the active ingredients mixed with a filler or binder, including lactose or starches, lubricants such as tallow or magnesium stearate, and optionally stabilizers. In soft capsules, the active compounds can be dissolved or suspended in suitable liquids, for example in fatty acids, liquid paraffin or liquid polyethylene glycol with or without stabilizers. Medicines for parenteral administration include aqueous solutions with active compounds.
For the injection, the medicament according to the invention can be formulated in aqueous solutions, preferably in physiologically compatible buffers, such as, for example, Hank's solution, Ringer's solution or in physiologically buffered saline. Aqueous suspensions for injection may contain substances that increase the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol or dextran. In addition, suspensions of the active compounds can be prepared as suitable oily injection suspensions. Suitable lipophilic solvents or vehicles include fatty acids such as sesame oil or synthetic fatty acid esters such as ethyl oleate or triglycerides or liposomes.
If appropriate, the suspensions may also contain suitable stabilizers or agents which increase the solubility of the compounds so as to allow the production of highly concentrated solutions.
For topical or nasal administration, penetrants are used in the formulation which are suitable for the specific barriers to be penetrated. Such penetrants are well known in the art.
The pharmaceutical compositions of the invention can be prepared by methods similar to those known in the art (e.g. B. by conventional mixing, dissolving, granulating, dragee making, pulverizing, emulsifying, encapsulating, encapsulating or lyophilizing processes).
The drugs can be provided as a salt and can be made with many acids, including, but not limited to, hydrochloric acid, sulfuric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, malic acid, succinic acid, etc. Salts tend to be more soluble in aqueous or other protonic solvents than the corresponding form of the free base. In other cases, the preferred preparation may be a lyophilized powder in 1mM-50mM histidine, 0.1% to 2% sucrose, and 2% to 7% mannitol at a pH in the range 4.5 to 5.5 which is combined with a buffer before use.
After the preparation of the medicaments, which comprise a compound according to the invention formulated in a compatible carrier, they can be placed in a suitable container and labeled according to the treatment of a specified disease state. When administering human telomerase proteins and nucleic acids, such a label would include an indication of the amount and frequency of administration and the method of administration.
Medicaments suitable for the use according to the invention include compositions in which the active constituents are contained in an effective amount in order to achieve the desired purpose. "Therapeutically effective amount" or "pharmacologically effective amount" are commonly used terms and refer to the amount of an agent that can effectively produce the desired pharmacological result. Thus, a therapeutically effective amount is an amount sufficient to improve the symptoms of the disease to be treated.
A useful assay for determining an effective amount for a given application (e.g. B. a therapeutically effective amount) is to measure the effect on telomerase activity in a target cell. The amount actually administered depends on the person to be treated and is preferably an amount optimized so that the desired effect is achieved without significant side effects. The determination of a therapeutically effective dose is within the skill of the person skilled in the art.
For any compound, the therapeutically effective dose can initially be determined either in cell culture assays or using a suitable animal model. The animal model is also used to determine an appropriate concentration range and route of administration. Information thus obtained can then be used to determine useful doses and routes of administration in humans.
A therapeutically effective amount refers to the amount of protein, polypeptide, peptide, antibody, oligo- or polynucleotide, agonist or antagonist that ameliorates the symptoms or condition. The therapeutic efficacy and toxicity of such compounds can be determined by standard pharmaceutical procedures in cell cultures or on experimental animals (e.g. B. ED50, the therapeutically effective dose in 50% of the population; and LD50, the lethal dose in 50% of the population). The therapeutic index denotes the dose ratio between therapeutic and toxic effects and it can be expressed as the ratio ED5O / LD50. Pharmaceutical compositions that have a large therapeutic index are preferred.
The data obtained from cell culture assays and animal studies are used to determine the dose range for human use. The dosage of such compounds is preferably within a range of circulating concentrations that include the ED50 with little or no toxicity. The dosage varies within this range depending on the dosage form used, the sensitivity of the patient and the route of administration.
The exact dosage is selected individually by the respective doctor for the patient to be treated. The dosage and administration are adjusted so that they provide a sufficient level of the active unit or maintain the desired effect.
Additional factors to consider include the severity of the condition (e.g., the size and location of the tumor; the age, weight, and sex of the patient; the diet and timing and frequency of administration, the combination (s) of Medicines, sensitivity to reactions and tolerance towards or Response to therapy). Long-acting drugs can be administered every 3 to 4 days, every week, or once every 2 weeks depending on the half-life and the "clearance" rate of the particular formulation. Instructions regarding specific dosages and delivery methods can be found in the literature (see U.S. Patent No. 4,657,760, 5,206,344 and 5,225,212, which documents may be incorporated by reference into this description).
Those skilled in the art will use different formulations for nucleotides than for proteins or their inhibitors. In the same way, the administration of polynucleotides or polypeptides is specific for certain cells, conditions, locations, etc.
VIII. The increase in the ability to proliferate and the production of immortalized cells,
Cell lines and animals
As discussed above, most vertebrate cells show a limited number of divisions in culture (e.g. B. 50 to 100 divisions) Senescence. However, certain cell variants can divide indefinitely in culture (e.g. B. HeLa cells, 293 cells) and are therefore useful for research and industrial use. Such immortal cell lines are usually obtained from spontaneously developing tumors or after transformation by exposure to radiation or a tumor-inducing virus or a tumor-inducing chemical. Unfortunately, there is only a limited selection of cell lines available, especially human cell lines that show differentiated cell function. In addition, the currently available immortal cell lines are characterized by chromosomal anomalies (e.g. B.
Aneuploidy, gene rearrangements or mutations). Furthermore, many of the long established cell lines are relatively undifferentiated (e.g. B. do not make such highly specialized products that are unique to certain tissues or organs). There is therefore a need for new methods for producing immortal cells, in particular human cells. Use of immortalized cells refers to the production of natural proteins and recombinant proteins (e.g. B. therapeutic polypeptides) or antibodies for which a stable genetically normal cell line is preferred. Specialized cell types may also be preferred for the production of some recombinant proteins (e.g. B. Pancreatic cells for the production of human insulin).
A further possible use for immortalized cells is the introduction into a patient for gene therapy or for the exchange of diseased or damaged cells or tissues. For example, autologous immune cells which, for example, contain or express a recombinant hTRT gene or polypeptide according to the invention can be used for cell exchange in a patient after aggressive cancer therapy, for example after irradiation of the entire body. Another use for immortalized cells is the ex vivo production of "artificial" tissues or organs (e.g. B. Skin) for therapeutic use.
Another use of such cells is screening for active substances or confirmation of the action of active substances, for example telomerase-inhibiting active substances, or in the production of vaccines. Further possible uses of the cells according to the invention are obvious to the person skilled in the art.
The immortalized cells and cell lines according to the invention, as well as those with only increased replication capacity, are generated in the cell by increasing telomerase activity. Any method described here for increasing telomerase activity can be used. Thus, in one embodiment, cells are immortalized by increasing the amount of hTRT polypeptide in the cell. In one embodiment, the hTRT level is increased by introducing an hTRT expression vector into the cell (with stable transfection sometimes preferred). As already discussed above, the hTRT coding sequence is normally functionally linked to a promoter that can be inducible or constitutively active in the cell.
* In one embodiment, a polynucleotide comprises a sequence that is a polypeptide of SEQ. ID. No. 2, wherein the sequence with a promoter (e.g. B. a constitutively expressed promoter, e.g. B. a sequence of SEQ. ID. No. 6 (Fig. 6)) is functionally linked and the polynucleotide is introduced into the cell. In one embodiment, the polynucleotide comprises a sequence of SEQ. ID. No. 1. Preferably the polynucleotide contains polyadenylation and termination signals. In other embodiments, additional elements such as enhancers or those discussed above are included.
In an alternative embodiment, the polynucleotide does not contain a promoter sequence, such a sequence then being passed through the endogenous genome of the target cell after integration (e.g. B. by recombination, e.g. B. homologous recombination) of the introduced polynucleotide is provided. The polynucleotide can be introduced into the target cell by any method, including the methods described herein (such as lipofection, electroporation, virosomes, liposomes, immunliposomes, polycation / nucleic acid conjugates, naked DNA).
Using the method according to the invention, any vertebrate cell can be made to show an increased ability to proliferate or even to be immortalized and to remain in culture indefinitely. In one embodiment, the cells are mammalian, with human cells being preferred for many applications. Human cells that can be immortalized include the cells listed in Listing 1.
Of course, the "diagnostic" assays according to the invention described below can be used to identify and characterize the immortalized cells according to the invention.
Listing 1
Human cells in which hTRT expression can be increased
Horn-forming epithelial cells
Keratinocytes of the epidermis (differentiating epidermal cells)
Basal cells of the epidermis (stem cells)
Keratinocytes of the fingernails and toenails
Basal cells of the nail bed (stem cells)
Hair shaft cells
medullary, cortical, cuticular cells; Hair root sheath cells, cuticular cells, Huxley layer cells, external Henle layer cells; Hair germ cells (stem cells)
Cells of the moist multilayered border epithelium
Surface epithelial cells of the multilayered squamous epithelium of the tongue, the oral cavity, the esophagus, the anal canal, the distal urethra, the vagina
Basal cells of these epithelium (stem cells)
Cells of the outer corneal epithelium
Cells of the urinary epithelium (which lines the bladder and ureters)
Epithelial cells that specialize in exocrine secretion
Cells of the salivary glands
mucus-secreting cells (secretion rich in polysaccharides)
serous gland cells (secretion rich in glycoprotein enzymes)
Cells of the von Ebner glands in the tongue (secretions wash around the taste buds)
Breast cells secrete milk
Lacrimal gland cells secrete tears
Cells of the ceruminal gland of the ear, secrete cerumen
Cells of the eccrine sweat glands, secrete glycoproteins (dark cells)
Cells of the eccrine sweat glands, secrete small molecules (bright cells)
Apocrine sweat gland cells (scent secretion, sex hormone sensitive)
Cells of the minor glands in the eyelid (specialized sweat gland)
Cells of the sebum glands secrete lipid-rich sebum
Bowman gland cells in the nose (secretions wash around the olfactory epithelium)
Cells of the Brunner glands in the duodenum,
secrete alkaline solution consisting of mucus and enzymes
Cells of the seminal vesicle, secrete components of the seminal fluid including fructose (as a fuel for sperm floating in it)
Cells of the prostate gland secrete other components of the seminal fluid
Bulbourethral gland cells secrete mucus
Bartholin gland cells secrete vaginal secretions
Littré gland cells secrete mucus
Uterine mucosal cells primarily secrete carbohydrates
isolated goblet cells of the respiratory and digestive tract,
secrete mucus
Mucus-secreting cells of the gastric mucosa
Main cells of the gastric glands secrete pepsinogen
Parietal cells of the gastric glands secrete HCl
Acinus cells of the pancreas secrete digestive enzymes and bicarbonate
Paneth cells of the small intestine,
secrete lysozyme
Type II alveolar cells of the lungs secrete surfactant clara cells of the lungs
Cells specializing in the secretion of hormones
Anterior pituitary lobe cells secrete growth hormone, follicle stimulating hormone, luteinizing hormone, prolactin, adrenocorticotropic hormone and thyreotropic hormone
Cells of the central pituitary lobe secrete melanocyte-stimulating hormone
Posterior lobe cells secrete oxytocin, vasopressin
Intestinal cells secrete serotonin, endorphin, somatostatin, gastrin, secretin, cholecystokinin, insulin and glucagon
Cells of the thyroid gland, secrete thyroid hormone, calcitonin
Parathyroid cells secrete parathyroid hormone, oxyphile cells
Adrenal gland cells secrete epinephrine, norepinephrine and steroid hormones
Mineralocorticoids
Glucocorticoids
Cells of the gonads, secrete testosterone (Leydig cells of the testes) \ estrogen (inner theca cells of the egg follicle)
Progesterone (yellow cell cells of the broken egg follicle)
Cells of the juxtaglomerular apparatus of the kidney juxtaglomerular cells (secrete renin)
Macula densa cells
peripolar cells
Mesangial cells
Absorbing epithelial cells in the intestine, exocrine glands and urogenital tract
Brush hem cells of the intestine (with small villi)
multilayered duct cells of exocrine glands
Gallbladder epithelial cells
Brush border cells of the proximal tubule of the kidney
distal tubular cells of the kidney
non-eyelashed cells of the efferens duct
Epididymis main cells
Epididymal basal cells
Cells specialized in metabolism and storage
Hepatocytes (liver cells)
Fat cells
white fat cells
brown fat cells
Lipocytes of the liver
Epithelial cells, which primarily have a protective function and which line the lungs, the intestine, the exocrine glands and the urogenital tract
Type I pneumocytes (lining the air space of the lungs)
Pancreatic duct cells (centroazine cells)
non-multilayered duct cells of the sweat gland, salivary gland, and mammary gland
Parietal cells of the renal glomerulus
Podocytes of the renal glomerulus
Henle Loop Thin Segment Cells (in the Kidney)
Manifold cells (in the kidney)
Ductal cells of the seminal vesicle, prostate
Epithelial cells that line closed internal body cavities
vascular endothelial cells of the blood vessels and lymphatic vessels
fenestrated cells
continuous cells
Spleen cells
Synovial cells (line the joint cavities, primarily secrete hyaluronic acid)
Serosa cells (line the peritoneal, pleural and pericardial cavity)
Squamous cells that line the perilymphatic space of the ear
Cells that line the endolymphatic space of the ear
Squamous cells
highly prismatic epithelial cells of the endolymphatic sac
with small villi
without small villi
"dark" cells
Reissner membrane cells (similar to choroid plexus cells)
vascular stria basal cells
vascular stria-von-ebner crescent cells
Claudius cells
Böttcher cells
Choroid plexus cells (secrete brain and spinal fluid)
Squamous cells of the soft brain and spinal cord skin
Ciliary epithelial cells of the eye
pigment-containing cells non-pigment-containing cells
Cells of the inner corneal epithelium
Cilia-bearing cells with propulsive function
of the respiratory tract
the fallopian tubes and uterine lining (in women)
of the Haller network and the duct efferens (in men)
of the central nervous system (ependymal cells that line the brain cavity)
Cells that specialize in the secretion of extracellular matrix
Epithelial cells:
Ameloblasts (secrete the tooth enamel)
Ebner crescent cells of the equilibrium organ of the ear (secrete proteoglycan)
Interdental cells of the Corti organ (secrete membrane tectoria, which covers the hair cells of the Corti organ)
Non-epithelial cells (connective tissue)
Fibroblasts (various fibroblasts of the loose connective tissue, the cornea, the tendons, the reticular connective tissue of the bone marrow etc. )
Pericytes of the blood capillaries
Disc nucleus pulposus cells
Cementoblasts / Cementocytes (secrete bone-like cementum of the tooth root)
Odontoblasts / Odontocytes (secrete the dentine)
Chondrocytes
Hyaline cartilage, fibrous cartilage, elastic cartilage
Osteoblasts / osteocytes
Osteoprogenitor cells (stem cells of the osteoblasts)
Hyalocytes of the vitreous body of the eye Star cells deg perilymphatic space of the ear
Contractive cells
Skeletal muscle cells
red cells (slow)
white cells (fast)
intermediate cells
Muscle spindle core cells
Core chain cells of the muscle spindle
Satellite cells (stem cells)
Cardiac muscle cells
normal cells
Node cells
Purkinje fiber cells
Smooth muscle cells
Myoepithelial cells
the iris
of the exocrine glands
Cells of the blood and immune system
Red blood cells
Megakaryocytes
Macrophages
Monocytes
Connective tissue macrophages (various types)
Langerhans cells (in the epidermis)
Osteoclasts (in the bone)
dendritic cells (in the lymphatic tissue)
Microglial cells (in the central nervous system)
Neutrophils
Eosinophils
Basophils
Mast cells
T lymphocytes
T helper cells
T suppressor cells
cytotoxic T cells
B lymphocytes
Igm
IgG
IgA
IgE
Killer cells
Stem cells for the blood and immune system (various types)
Sensory cells
Photoreceptor cells
Rod cells
Cone cells
blue-sensitive cells
green sensitive cells
red-sensitive cells
Cells of the hearing organ
inner hair cell of the Corti organ
outer hair cell of the Corti organ
Cells for the perception of acceleration and gravity
Type I hair cells of the equilibrium organ of the ear
Type II hair cells of the ear's equilibrium organ
Taste cells
Type II taste bud cells
Cells for smells
Olfactory neurons
Basal cells of the olfactory epithelium (stem cells for olfactory neurons)
Cells for determining the pH of the blood carotid body cells
Type I cells
Type II cells
Touch sensing cells
Merkel cells of the epidermis
primary sensitive neurons, specializing in touch sensing
Cells for the perception of temperature
primary sensitive neurons,
specialized in perception of temperature
Cold-sensitive cells
Heat-sensitive cells
Pain perception cells
primary sensitive neurons specializing in pain perception
Structures and forces in the musculoskeletal system
proprioceptive primary sensitive neurons
Autonomous neurons
cholinergic neurons
adrenergic neurons
peptide neurons
Cells that support the sensory organs and peripheral neurons
Supporting cells of the Corti organ
inner pillar cells
outer pillar cells
inner phalangeal cells
outer phalangeal cells
Border cells
Hensen cells
Support cells of the balance organ
Support cells of the taste buds (type I taste bud cells)
Supporting cells of the olfactory epithelium
Schwann cells
Satellite cells (enclose the peripheral nerve cells)
Gut glial cells
Central nervous system neurons and glial cells
Neurons
Glial cells
Astrocytes
Oligodendrocytes
Cells of the lens
Epithelial cells of the anterior lens
Lenticular fiber cells (crystalline-containing cells)
Pigment cells
Melanocytes
pigmented epithelial cells of the retina
Germ cells
Oogonium, oocytes
Spermatocytes
Spermatogonium (stem cells for spermatocytes)
Nurse cells
Egg follicle cells
Sertoli cells (in the testicles)
Thymic epithelial cells
Stem cells
embryonic stem cells
embryonic germ cells
Adult stem cells
fetal stem cells
IX. Diagnostic assays
A. introduction
1) TRT assays
The present invention provides a large number of assays for TRT, preferably hTRT, and telomerase. These assays provide, among other things, the basis for sensitive, inexpensive, easy-to-use and widely applicable assays for the diagnosis and prognosis of a number of human diseases, including cancer as an illustrative example. As noted above, the amount of hTRT gene products (protein and mRNA) in immortal human cells is compared to most normal mortal cells (i.e. H. Telomerase negative cells and most telomerase positive normal adult somatic cells) usually increased.
Thus, one aspect of the insertion is to provide assays for detection to determine the presence, absence or amount of an hTRT gene product in a sample, so as to make the cells as immortal (e.g., a malignant tumor cell), mortal (as for example, most somatic cells in adults) to be able to characterize as telomerase positive or telomerase negative, the sample being derived from or containing human or other mammalian cells or eukaryotic cells.
Any condition caused by the presence or absence of an hTRT gene product (i.e. H. Protein or RNA) can be diagnosed using the methods and substances described here. These include, as described in more detail below, cancer, other diseases associated with accelerated cell proliferation, immunological dysfunction, fertility, infertility, etc. Since the extent to which telomerase activity in cancer cells is increased correlates with the characteristics of the tumor, for example the potential for metastasis, the probable future development of a tumor can be estimated and predicted by monitoring the hTRT, mRNA or protein levels .
In one aspect, the diagnostic and prognostic methods according to the invention include determining whether a human TRT gene product is present in a biological sample (e.g. B. from a patient) is present. A second aspect relates to determining the amount of an hTRT gene product in a biological sample (e.g. B. from a patient) and comparison with the amount in a control sample (e.g. B. normal cells or tissues). A third aspect relates to the determination of the cellular or intracellular localization of an hTRT gene product in a cell or tissue sample.
A fourth aspect concerns the examination of host cells (e.g. B. patient) to identify nucleic acids with sequences characteristic of an inheritable tendency for abnormal hTRT gene expression (abnormal amount, regulation or abnormal product), which is useful in genetic screening or counseling. A fifth aspect relates to the use of the assays according to the invention for detecting the presence of anti-hTRT antibodies (e.g. B. in patient serum). The procedures described in more detail below are useful assays that can be performed using the sequences and relationships described herein. Numerous variations or other possible uses of these assays are of course obvious to the person skilled in the art.
Although the assays described above are described in connection with diagnostic and prognostic methods, they can always be used when an hTRT gene, gene product or a variant is to be detected, quantified or characterized. Thus, for example, the "diagnostic" methods described below for examining hTRT or telomerase during the manufacture and purification of hTRT or human telomerase, for characterizing cell lines derived from human cells (e.g. B. for the identification of immortal lines), for the characterization of cells, animals, plants, fungi, bacteria or other organisms which contain a human TRT gene or gene product (or fragments thereof).
The term "diagnostic" as used herein has its normal meaning, namely the identification of the presence or nature of the disease (e.g. cancer), a condition (e.g. B. sterile, activated), a status (e.g. B. fertile) and the term "prognostic" also has its usual meaning, namely the prognosis of the likely development and / or the outcome of a disease or condition. These two terms are sometimes used differently in a clinical setting.
Any of the "diagnosis" assays or assay formats described below are equally suitable for making a prognosis, since it is now clear that higher levels of telomerase activity are associated with a poorer prognosis for cancer patients, and because the present invention has detection methods provides that are specific for hTRT expressed at concentrations that closely correlate with telomerase activity in a cell.
2) Diagnosis and prognosis of cancer
The determination of an hTRT gene, mRNA or protein level which is above the normal or standard range indicates the presence of telomerase-positive cells or immortal cells, which include, for example, certain tumor cells. Because certain embryonic and fetal cells as well as certain "adult" stem cells express telomerase, the present invention also provides methods for determining other conditions such as: B. Pregnancy, by detecting or isolating telomerase positive fetal cells from the mother's blood. These values can be used to make a diagnosis, or can be helpful in making a diagnosis, even if the cells could not have been classified as cancerous or otherwise detected or classified using traditional methods.
Thus, the methods according to the invention allow the detection or verification of cancerous or other states associated with telomerase with increased reliability and possibly at an earlier stage. The assays according to the invention allow a distinction to be made between classes and stages of human tumors or other diseases associated with cell proliferation by providing quantitative assays for the hTRT gene and gene products and thus facilitating the selection of suitable treatment procedures and precise diagnoses. Because the level of telomerase activity can be used to distinguish between benign and malignant tumors (e.g. B. U.S. Patent No. 5,489,508 and Hiyama et al. , Proc. On the ace. Cancer Res. 38 (1997), 637) to predict the impending invasion (e.g. B.
U.S. Patent No. 5,639,613 and Yashima et al. , Proc. At the. Ace. Cancer Res. 38 (1997), 326) and to establish a correlation with the potential for metastasis formation (e.g. B. U.S. Patent No. 5,648,215 and Pandita et al. , Proc. On the ace. Cancer Res. 37 (1996), 559), these assays will also be useful for the prophylaxis, detection and treatment of a large number of human cancers.
A prognostic value for an hTRT gene product (mRNA or protein) or the activity for a specific tumor type, tumor class or tumor stage, such as., Is used for the prognosis of cancer diseases (or other diseases or conditions which are characterized by an increased telomerase concentration) described below. The level of hTRT protein or mRNA or telomerase activity in a patient can be determined, for example, using the assays described here and compared to the prognostic level.
Depending on the assay used, the frequency of an hTRT gene product in a sample will be considered increased in some cases whenever it can be detected by the assay. Due to the small amount of hTRT mRNA and protein even in telomerase-positive cells and the rarity or absence of these gene products in normal or telomerase-negative cells, sensitive assays are required in order to be able to detect whether the hTRT gene products are in normal cells at all available. If less sensitive assays are selected, hTRT gene products will not be detectable in healthy tissue, but in telomerase-positive cancer or other telomerase-positive cells.
Typically, the amount of an hTRT gene product in a sample with an increased concentration is at least about 5 times, more often at least about 10 times, more often at least 50 times and very often at least about 100 to 1000 times compared to the level of telomerase-negative control cells or Cells from healthy adult tissues, with the percentage of telomerase positive normal cells being very low.
The diagnostic and prognostic methods according to the invention can be used with any cell or tissue type of any origin and they can be used for the detection of an immortal or neoplastic cell, a tumor tissue or a cancer of any origin. The types of cancer that can be detected include, but are not limited to, all of those listed above for discussion of the therapeutic use of hTRT.
The assays according to the invention are also useful for monitoring the effectiveness of a therapeutic intervention in patients who are being treated for cancer. Treatments for cancer that can be monitored include all currently recommended forms of therapy (including chemotherapy, radiation therapy, and surgical measures), as well as future treatments, such as the therapies described here, that relate to the inhibition or activation of telomerase (see for example PCT publication no. 96/01 835 and 96/40 868 and U.S. Patent No. 5,583,016; as well as US patent applications with serial no. 08/472 802 and 08/482 115, both on 7. June 1995; 08/521 634, filed on 1 August 1995; 08/714 482, filed on 16
September 1996 and 08/770 564 and 08/770 565, both on 20. December 1996, all of which are incorporated by reference into their entirety as part of this description.
In a further aspect, the assays described below are useful for the detection of certain variations in the hTRT gene sequence (mutations and inheritable hTRT alleles) that indicate a predisposition to cancer or other conditions associated with abnormal regulation of telomerase activity are (infertility, premature aging).
3) Diagnosing conditions that are not cancer
In addition to the diagnosis of cancer, the assays according to the invention have numerous other possible uses. The present invention provides reagents and methods for diagnosing conditions or diseases which are characterized by under- or overexpression of telomerase or hTRT gene products in cells. In adults, a low level of telomerase activity is usually found in a limited type of normal human somatic cells, such as stem cells, activated lymphocytes and germ cells. Other somatic cells lack telomerase activity.
Thus, the detection of hTRT or telomerase activity in cells where they are normally absent or inactive, or the detection of an abnormal level (i.e. H. higher or lower compared to normal) in cells in which hTRT is normally only present at a low level (such as stem cells, activated lymphocytes and germ cells), a diagnostic sign of a telomerase-related disease or condition. This detection can also be used to identify or isolate specific cell types. Examples of such diseases and conditions include: diseases related to cell proliferation, immunological dysfunction, infertility, diseases related to immune cell function, pregnancy, fetal abnormality, premature aging, etc.
In addition, the assays of the invention are for monitoring the efficacy of a therapeutic intervention (including, but not limited to, agents that modulate telomerase activity) in a patient or in a cell or animal based assay. One aspect of the invention relates to the provision of assays useful for diagnosing infertility. Human gametes (e.g. B. Stem cells, progenitors or progeny) can proliferate indefinitely and are characterized by a high telomerase activity. Abnormal or decreased levels of hTRT gene products or abnormal products can lead to inadequate or abnormal sperm production, leading to infertility or reproductive dysfunction.
Thus, the invention provides assays (methods and reagents) for diagnosing and treating "telomerase-based" malfunctions in production. In a similar application, the assays to monitor the effectiveness of contraceptives (e.g. B. Contraceptives for men or male animals) that target or indirectly affect sperm production (and that are said to reduce hTRT levels or telomerase activity).
Another aspect of the invention is taken from the web or tumor. It may occasionally be desirable to freeze a biological sample for later analysis (e.g. B. if the effectiveness of treatments with active substances is monitored).
In some cases, the cells or tissues can be fractionated before analysis. For example, in a tissue biopsy from a patient, a cell sorter (e.g. B. a fluorescence-activated cell sorter) can be used to screen cells according to features such as the expression of a surface antigen (e.g. B. a tumor-specific antigen) according to generally known methods.
Although the sample is usually taken from a human patient or cell line, the assays can also be used to detect homologous hTRT genes or corresponding gene products in animal samples. Alternatively, hTRT genes and gene products can be investigated in transgenic animals or organisms which express a human TRT protein or corresponding nucleic acid sequence.
If necessary, the sample can be pretreated by dilution in a suitable buffer solution or concentrated if desired. A number of standard aqueous buffer solutions at physiological pH can be used, and a number of buffers can be used, for example phosphate, Tris buffer, etc.
The term "biological sample" obtained from a patient can be referred to as either "biological sample" or "patient sample". When analyzing a "patient sample", cells or tissues do not necessarily have to be removed from the patient. For example, appropriately labeled hTRT binding agents (e.g. B. Antibodies or nucleic acids) are injected into the patient and (after binding to the target) using standard imaging techniques (e.g. B. CAT, NMR etc. ) be made visible.
E) Nucleic acid assays
In one embodiment, the invention provides methods for detecting and / or quantifying the expression of hTRT mRNAs (including splice variants or sequence variants and alternative alleles). In an alternative embodiment, the invention provides methods for the detection and analysis of normal or abnormal hTRT genes (or a fragment thereof). Formats of such qualitative or quantitative assays include, but are not limited to, amplification-based assays with or without signal amplification, hybridization-based assays, and amplification / hybridization-based assays.
It will be apparent to those skilled in the art that the distinction between hybridization and amplification is made only for convenience: As illustrated in the examples below, many assay formats contain elements of hybridization as well as amplification, so that in some cases the categorization is somewhat arbitrary.
1) Production of nucleic acids
In some embodiments, nucleic acid assays are performed with a nucleic acid sample isolated from the cell or cell line or tissue or organism to be tested. The nucleic acid (e.g. B. genomic DNA, RNA or cDNA) can be "isolated" from a sample according to a number of methods known to those skilled in the art. In this context, the term "isolated" refers to any separation of the species or target to be detected from any other substance in the mixture, but this does not necessarily indicate a substantial degree of purity of the target. It will be apparent to those skilled in the art that when changes in the number of copies of the hTRT gene are detected, the target to be detected is genomic DNA.
Conversely, the target to be detected in a nucleic acid-based assay is RNA, if expression levels of a gene or of genes are to be detected. In a preferred embodiment, the nucleic acid sample is total mRNA (i.e. H. poly (A) <+> RNA) in a biological sample. Methods for isolating nucleic acids are well known to those skilled in the art and are described, for example, in Tijssen, P. (ed.) In Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Elsevier, N.Y. (1993), Chapter 3, which document is to be considered part of this description by reference.
In one embodiment, total nucleic acid is isolated from a sample using an acidic guanidine / phenol / chloroform extraction method and poly (A) <+> mRNA by oligo-dT column chromatography or by using magnetic (dT) n beads (see e.g. Sambrook et al., and Ausubel et al., op. cit.).
In alternative embodiments, the isolation of nucleic acids (e.g. total RNA or poly-A <+> RNA) from the biological sample is not required before performing amplification, hybridization or other assays. These embodiments have certain advantages in the event that hTRT-RNA is to be measured because they reduce the likelihood that hTRT-mRNA will be lost during isolation and handling. For example, many amplification methods such as PCR and RT-PCR (reverse transcriptase-PCR) can be carried out using permeabilized cells (histological samples and FACS analyzes) lysed whole cells or high cell fractions, such as certain cell extracts.
Preferably steps are taken to preserve the integrity of the target nucleic acid (e.g. mRNA) if necessary (e.g. by adding RNAase inhibitors). Amplification and hybridization assays can also be carried out in situ, for example in thin tissue sections of a biopsy sample or a single-layer cell layer (e.g. blood cells or separate cells of a tissue culture). The amplification can also be carried out in intact whole cells or fixed cells.
For example, PCR, RT-PCR, or LCR amplification methods, as is known in the art, can be carried out in situ, for example using a polymerase or ligase, a primer or primers and (deoxy) ribonucleoside triphosphates (when using a polymerase) and reverse transcriptase and a primer (when transcribing RNA and detecting the cDNA) on fixed, permeabilized or micro-injected cells so as to amplify the target hTRT RNA or DNA. Cells containing hTRT-RNA (e.g. telomerase positive cells) or a desired hTRT-DNA sequence can then be detected.
This method is often useful when fluorescence-labeled dNTPs, primers or other components are used in connection with microscopy, FACS analysis or equivalent methods.
2) Assays based on amplification
In one embodiment, the assays according to the invention for the detection of an hTRT gene or gene product are assays based on amplification. In an amplification-based assay, an entire hTRT gene or transcript or a part thereof (e.g. mRNA or cDNA, hereinafter referred to as "target") is amplified and the amplified product is then directly or indirectly detected. If there is no gene or gene product that can act as a template, no amplification product is produced (e.g. with the expected size) or the amplification is unspecific and usually no single amplification product is produced. In contrast, the target sequence is amplified when the gene or gene product in question is present, thus indicating the presence and / or the amount of the corresponding gene or mRNA.
Assays based on amplification are well known to those skilled in the art.
The present invention provides a wide variety of primers and probes for the detection of hTRT genes and gene products. Such primers and samples are sufficiently complementary to the hTRT gene or gene product to be able to hybridize to the target nucleic acid. Primers are usually at least 6 bases in length, preferably from about 10 to about 100 bases, more preferably from about 12 to about 50 bases, and most preferably between about 14 and about 25 bases. After reading this description, the person skilled in the art will be able, using routine methods, to select primers with which the entire hTRT gene or gene product or a portion thereof can be amplified or with which a distinction can be made between gene product variants, hTRT alleles, etc. can be.
Table 2 lists examples of primers that are useful for PCR amplification of the hTRT or specific hTRT gene products or regions. It is known in the art that single oligomers (see, for example, U.S. Patent No. 5,545,522) "nested sets" of oligomers, or even a pool of degenerate oligomers, can be used for amplification, for example, as described below Amplification of the Tetrahymena TRT cDNA is demonstrated.
The invention provides a variety of methods for amplifying and detecting an hTRT gene or gene product. These include the polymerase chain reaction (including all variants, for example reverse transcriptase PCR; the "Sunrise Amplification System" (Oncor, Inc., Gaithersburg MD) and numerous other methods known in the art.
In an illustrative embodiment, the PCR amplification is carried out in a solution of 50 μl which contains the nucleic acid sample (for example a cDNA obtained by reverse transcription of hTRT-RNA), in each case 100 μM M dNTP (dATP, dCTP, dGTP and dTTP; Pharmacia LKB Biotechnology, NJ) the hTRT-specific PCR primer (s), 1 unit Taq polymerase (Perkin Elmer, Norwalk CT), 1 x PCR buffer (50 mM KCl, 10 mM Tris, pH 8.3) at room temperature, 1.5 mM M9Cl2 and 0.01% gelatin), the amplification being carried out with about 30 cycles, in each case 45 seconds at 94 ° C., 45 seconds at 45 ° C. and 90 seconds at 72 ° C. however, of course, numerous variations are introduced for certain reactions to optimize the PCR amplification.
Other suitable target amplification methods include ligase chain reaction (LCR) (see, for example, Wu and Wallace, Genomics 4 (1989), 560; Landegren et al., Science 241 (1988), 1077, Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 189 and Barringer et al., Gene 89 (1990), 117), strand displacement amplification (SDA) (see e.g. Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 392-396 ); transcription amplification (see, for example, Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 1173), "self-sustained-sequence" replication (3SR) (see, for example, Fahy et al., PCR Methods Appl. 1 (1992) 2 and Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874); nucleic acid sequence based amplification (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario; see e.g.
Compton, Nature 350 (1991) 91); the transcription-based amplification system (TAS); and the "self-sustained-sequence" replication system (SSR). Each of the above publications is to be regarded as part of this description by reference. A convenient PCR variant is the PCR-ELISA (e.g. Boehringer Mannheim Cat. No. 1 636 111), whereby digoxigenin-dUTP is incorporated into the PCR product. The PCR reaction mixture is denatured and hybridized with a biotin-labeled oligonucleotide designed to bind to an internal sequence of the PCR product. The hybridization products are immobilized on coated with streptavid and detected using anti-digoxigenin antibodies.
Examples of in vitro amplification methods that give the person skilled in the art sufficient guidance can be found in the following publications: PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich (ed.) Freeman Press, New York, NY (1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Ed. Innis, Gelfland, Snisky, and White, Academic Press, San Diego, CA (1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19 (1991), 4967; Eckert and Kunkel, PCR Methods and Applications 1 (1991), 17; PCR, ed. McPherson, Quirkes and Taylor, IRL Press, Oxford; U.S. Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202 and 4,965,188; Barringer et al., 1990, Gene 89: 117; Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874; Lomell et al., J. Clin. Chem. 35 (1989), 1826.
Each of these documents is to be considered part of this description by reference.
Amplified products can be analyzed directly (e.g. based on the size determined by gel electrophoresis), by hybridization to a target nucleic acid immobilized on a solid support, e.g. a bead, membrane, disc or chip; by sequencing; immunologically (e.g. by PCR-ELISA), by detection of a fluorescent phosphorescent or radioactive signal or by a number of other generally known measures.
In an illustrative example of a detection method, for example, PCR primers are used which have been enlarged with the aid of hairpin loops which are linked to fluorescein and a benzoic acid derivative which serves as a quenching compound, so that only then Fluorescence is emitted when the primers unfold to bind their targets and replication takes place.
Since hTRT mRNA is usually expressed as an extremely rare transcript that is only present in very low concentrations even in telomerase positive cells, it is often desirable to optimize or amplify the signal obtained by an amplification step. One way to do this is to increase the number of amplification cycles. For example, although 20 to 25 cycles are sufficient for the amplification of most mRNAs by means of the polymerase chain reaction under standard reaction conditions, the detection of hTRT-mRNA can require 30 to 35 amplification cycles in many samples, depending on the detection format.
By carefully selecting the amplification condition, including the number of amplification cycles, an assay can be designed that will only result in an amplification product if a threshold amount of the target is present in the test sample (ie, so that only samples with a high level of hTRT mRNA are " show positive "result). In addition, methods are known for amplifying the signal generated by amplifying the target sequence. Methods for improving the ability to detect an amplified target include signal amplification systems, for example: branched DNA signal amplification (see e.g.
U.S. Patent No. 5,124,246 and Urdea, Bio / Tech. 12: 926 (1994); the "tyramid" signal amplification system (TSA, DuPont); Catalytic signal amplification (CSA) (Dako); Q beta replicase systems (Tyagi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93 (1996), 5395) etc.
It will be apparent to those skilled in the art that, regardless of the amplification method used, a variety of quantitative methods known in the art can be used for quantification if desired. For example, if desired, two or more polynucleotides can be amplified together in a single sample. This method can be used as a convenient method for quantifying the amount of hTRT mRNA in a sample since both reverse transcription and amplification reactions are carried out in the same reaction mixture for a target and control polynucleotide.
Common amplification with the control polynucleotide (which is normally present in a known concentration or number of copies) can be used to normalize the number of cells in the sample compared to the amount of hTRT in the sample. Suitable control polynucleotides for co-amplification reactions include DNA expressed from housekeeping genes, constitutively expressed genes, and in vitro synthesized RNAs or DNAs added to the reaction mixture. Endogenous control polynucleotides include those that are already present in the sample while exogenous control polynucleotides are added to a sample, creating a "spiked" response.
Examples of control RNAs include beta-actin RNA, GAPDH RNA, snRNAs, hTR and endogenously expressed 28S rRNA (see Khan et al., Neuro sci. Lett. 147 (1992), 114). Exogenous control polynucleotides include a synthetic AW106 cRNA that can be synthesized by pAW106 as a "sense" strand using T7 polymerase In order for the co-amplification method to be used for quantification, both the control nucleotides and the target polynucleotides usually have to be in a linear region Detailed protocols for quantitative PCR can be found in PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. NY (1990) and Ausubel et al., loc. cit. (Unit 15) and Diaco, R. (1995) Practical Considerations for the Design of Quantitative PCR Assays, in PCR Strategies, pp. 84-108, Innis et al.
Ed. Academic Press, New York.
Depending on the sequence of the endogenous or exogenous standard, different primer sets can be used for the coamplification reaction. In one method, so-called competitive amplification, quantitative PCR involves co-amplification with a known amount of a control sequence, using the same primers used for the target nucleic acid (a pair with two primers). In an alternative embodiment, known as non-competitive amplification, the control sequence and the target sequence (e.g. hTRT cDNA) are amplified using different primers (i.e. 2 pairs of 2 primers).
In a further alternative embodiment, the so-called semi-competitive amplification, three primers are used, one being hTRT-specific, one control-specific and one being able to attach to both target sequences and control sequences. Semi-competitive amplification is described in U.S. Patent No. 5,629,154, which is hereby incorporated by reference into this specification.
3) Assays based on hybridization
a) General
A large number of methods for the specific measurement of DNA and RNA using nucleic acid hybridization methods are known to the person skilled in the art (see Sambrook et al., Op. Cit.). Assays based on hybridization relate to assays in which a nucleic acid probe is hybridized to a target nucleic acid. The nucleic acid hybridization probes according to the invention are usually completely or essentially identical to a coherent sequence of the hTRT gene or the corresponding RNA sequence. Preferably, the nucleic acid probes are at least about 10 bases long, more preferably at least about 20 bases, and most preferably about 200 bases or longer. Methods for selecting nucleic acid probe sequences for use in nucleic acid hybridization are described in Sambrook et al., Supra. discussed.
In some formats, either the target or the probe or both are immobilized. The immobilized nucleic acid can be a DNA, RNA or another oligonucleotide or polynucleotide. These can include natural or non-naturally occurring nucleotides, nucleotide analogs or backbones. Such assays can be used in various formats, for example: Southern, Northern "dot" and "slot" blots, high-density polynucleotide or oligonucleotide arrays (e.g. GeneChipsÖAffymetrix), measuring sticks, measuring pins ("pins"), chips or beads. All of these methods are well known in the art and are the basis of many commercially available diagnostic kits. Hybridization techniques are generally described in Hames et al., Eds.
Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach IRL Press (1985); Gall and Pardue, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63 (1969), 378-383 and John et al., Nature, 223 (1969) 582-587.
A variety of formats for nucleic acid hybridization are known to those skilled in the art. For example, direct hybridization is a common format in which a target nucleic acid is hybridized with a labeled complementary probe. Labeled nucleic acids are usually used for hybridization, the label providing the detectable signal. One method of assessing the presence, absence, or amount of hTRT mRNA is to perform Northern transfer of RNA from a sample and hybridize with a labeled hTRT-specific nucleic acid probe, as illustrated in Example 2. As noted above, hTRT mRNA is present in very small amounts, if at all, in most cells.
Thus, when using Northern hybridization, it is often desirable to use an amplification step or, alternatively, large amounts of starting RNA. A convenient method for assessing the presence, absence, or amount of DNA encoding hTRT proteins in a sample involves Southern transfer of DNA from a sample and hybridization with a labeled hTRT-specific nucleic acid probe.
Other common hybridization formats include "sandwich" assays and competition or displacement assays. The "sandwich" assays are commercially available, convenient hybridization assays for the detection and isolation of nucleic acid sequences. In such assays, a "capture" nucleic acid covalently immobilized on a solid support and a labeled "signal" nucleic acid in solution are used. The biological or clinical sample provides the target nucleic acid. The "capture" nucleic acid and the "signal" nucleic acid probes hybridize to the target nucleic acid, forming a "sandwich" hybridization complex. Efficacy requires that the signal nucleic acid can hybridize to the "capture" nucleic acid.
b) Assays based on a chip and on a disk
The present invention further provides probe-based hybridization assays for hTRT gene products using arrays of immobilized oligonucleotides or oligonucleotides to which an hTRT nucleic acid can hybridize (ie to some, but not usually all, or not even all of them) most of the immobilized oligo- or polynucleotides). High density oligonucleotide arrays or polynucleotide arrays provide a means for efficiently detecting the presence and characteristics (e.g., sequence) of a target nucleic acid (e.g., an hTRT gene, mRNA, or cDNA).
Techniques are known with which arrays can be produced which contain thousands of oligonucleotides complementary to defined sequences at defined positions on a surface, photolithographic methods being used for the synthesis (see, for example, US Pat. No. 5,578,832, 5,556,752 and 5,510,270; F odor et al., Science 251 (1991), 767; Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 5022 and Lockhart et al., Nature Biotech 14 (1996); 1675) or other methods for the rapid synthesis and attachment of defined oligonucleotides (Blanchard et al., Biosensors & Bioelectronics 11 (1996), 687). Using these methods, oligonucleotides (e.g. 20-mers) with a known sequence are synthesized directly on a surface, for example on a disk with derivatized glass.
Typically, the array produced is redundant with some on-chip oligonucleotide probes specific for the TRT polynucleotide to be detected.
Combinations of oligonucleotide probes can be designed so that alternatively spliced mRNAs can be detected or to determine which of different hTRT alleles is expressed in a particular sample.
In an illustrative embodiment, reverse transcription of total RNA from a test cell prepares cDNA (e.g., using PCR). The amplified product is normally labeled, for example by incorporating a fluorescence-labeled dNTP. The labeled cDNAs are then hybridized to a chip that includes oligonucleotide probes that are complementary to various sub-sequences of the hTRT gene. The hybridization positions are determined (for example according to the general methods of Shalon et al., Genome Research 6 (1996), 639 or Schena et al., Genome Res. 6 (1996) 639) and the sequence (or other information) from the hybridization pattern ) derived by methods well known in the art.
In one embodiment, two cDNA samples are hybridized to the same chip, each labeled with a different fluorescent group. The ratio of hybridization of each labeled sample to sites complementary to the hTRT gene is then examined. If both samples contain the same amount of hTRT mRNA, the ratio of the two fluorescence signals is 1: 1. The signal of the fluorescence does not have to be set so that any difference in the molar sensitivity of the fluorescence signals is taken into account.
In contrast, if the first sample is from healthy (or control) tissue and the second sample from cancerous tissue, the fluorescence signal used in the second sample will prevail.
c) In situ hybridization
An alternative method for detecting the expression of a gene encoding an hTRT protein is in situ hybridization. In situ hybridization assays are well known and generally described in Angerer et al., Methods Enzymol. 152: 649-660 (1987) and Ausubel et al., Op. Cit. In an in situ hybridization assay, cells or tissue samples are fixed to a solid support, which is typically in a permeabilized state, typically on a glass sheet. The cells are then hybridized with a hybridization solution at a moderate temperature so as to allow the attachment of labeled nucleic acid probes (e.g. <3> <5> S-labeled riboprobes, fluorescence-labeled probes) which are complementary or essentially complementary to hTRT.
Free probe is removed by washing and / or cleaving with nuclease and the bound probe is visualized directly on the disc by autoradiography or an appropriate imaging technique as is known in the art.
4) Specific detection of variants
As noted above and in the examples (e.g. B. Example 9) illustrated, amplification primers or probes can be selected to provide amplification products that span specific deletion, truncations and insertions, thereby facilitating the detection of specific variants or abnormalities in the hTRT mRNA. An example of a gene product of an hTRT variant that can be detected is an hTRT-RNA, such as a product described above and in Example 9 (SEQ. ID. No. 4). The biological function of the 182 variant (s) is not known, if one is available at all.
The shortened hTRT protein presumably encoded by the variant could, however, be involved in regulating telomerase activity, for example by assembling a nonfunctional telomerase RNP which titrates telomerase components. Alternatively, negative regulation of telomerase activity could be achieved by controlling the hTRT pre-mRNA (nascent mRNA) in a manner that leads to elimination of the mRNA and a reduction in the hTRT mRNA level. For these and other reasons, it is useful to be able to discover 182 variants. In addition, it may occasionally be desirable to use in samples in which two species of hTRT-RNA are present (e.g. B. a 182-hTRT-RNA and an hTRT-RNA encoding the full-length hTRT protein) to compare their relative and / or absolute frequency.
The invention provides a variety of methods for the detection of 182 variants. For example, amplification using primer pairs spanning the 182 base pair deletion results in products of different sizes that correspond to the deleted and undeleted hTRT-RNAs (if both are present) and these can be differentiated based on their size (e.g. B. be distinguished by gel electrophoresis). Examples of primer pairs useful for amplifying the region spanning the 182 bp deletion include TCP1. 14 and TCP1. 15 (primer set 1) or TCP1. 25 and bTCP6 (primer set 2) (see Table 2). These primer pairs can be used separately or in a PCR experiment with "nested" primers, using primer set 1 first. It will also be apparent to those skilled in the art that hybridization methods (e.g. B.
Northern hybridization) or RNAse protection assays for the detection of hTRT-RNA variants or in order to be able to differentiate between such variants, can be used using the hTRT nucleic acid probe according to the invention.
Another suitable method involves PCR amplification (or an equivalent method) with three primers. A primer is specific to each hTRT RNA species (e.g. B. as illustrated in Table 4) and a primer is complementary to both species (e.g. B. TCP1. 25 (2270-2288)) - analogous to the semi-competitive quantitative PCR method described in more detail above. An example of a primer that is specific to SEQ. ID. No. 1 is a primer that is within the sequence of 182 nucleotides (i.e. H. Nucleotides 2345 to 2526 from SEQ. ID. No. 1) attaches, e.g. B. TCP1. 73 (2465-2445). A primer that goes to SEQ. ID. No. 4 (a DELTA 182 variant) is, for example, a primer attached to nucleotides 2358-2339 from SEQ. ID. No. 4 attaches (i.e. H. the site where the insertion of 182 nucleotides into SEQ. ID. No. 1 corresponds).
The absolute abundance of the DELTA 182 hTRT mRNA species or their relative abundance compared to the species encoding the full length hTRT protein can be correlated with cell status (e.g. B. of unlimited proliferation ability). Numerous other primers can be selected based on the present description.
EMI189. 1
The further hTRT genes of variants or the corresponding gene products which can be detected include those which are characterized by codons which lead to an early stop, deletions, substitutions or insertions. Deletions can be detected based on the reduced size of the gene, the mRNA transcript or the cDNA. In a similar manner, insertions can be detected based on the increased size of the gene, the mRNA transcript or the cDNA. Insertions and deletions can also cause a shift in the reading frame, which leads to the creation of codons for an early stop or longer open reading frames. Substitutions can be detected by hybridization with a probe.
These changes are demonstrated by examining changes in the size of the hTRT polypeptide variant (e.g. B. by Western analysis) or by hybridization or specific amplification, depending on what seems appropriate. Alternatively, mutations can be determined by sequencing the gene or gene product according to standard procedures. In addition, and as noted above, amplification assays and hybridization probes can be selected to target specific abnormalities. For example, nucleic acid probes or amplification primers can be selected which hybridize specifically with the region which contains the deletion, substitution or insertion or these specifically amplified.
Where the hTRT gene contains such a mutation (1) the probe either does not hybridize or the amplification reaction does not provide specific amplification or will result in a change in the size of the amplification product or the hybridization signal; or (2) the probe or amplification reaction comprises the entire deletion or both ends of the deletion (deletion connection point) or (3) similarly probes and amplification primers can be selected which specifically target point mutations or insertions.
5) Detection of HTRT mutant alleles
Mutations in the hTRT gene could be responsible for the development of a disease or could contribute to a disease state. Changes in the genomic DNA of hTRT could affect the level of gene transcription, lead to changes in amino acid residues in the hTRT protein, lead to the production of truncated hTRT polypeptides, change the processing pathways of the pre-mRNA (which changes the hTRT mRNA levels can) and also have other consequences.
Changes in genomic DNA in non-hTRT loci can also affect expression of hTRT or telomerase by altering the enzymes or cellular processes responsible for regulating expression of hTRT, hTR and telomerase-associated proteins, as well as processing and RNP assembly and transportation. Changes affecting hTRT expression, processing or RNP assembly could also affect the course of cancer, aging, diseases related to DNA damage, etc. be important.
The detection of mutations in hTRT mRNA or the corresponding gene and gene control elements can be carried out in a variety of ways in accordance with the methods described here. These include the following illustrative examples: a method called "primer screening" can be used; PCR primers are designed whose 3 min ends attach to nucleotides in a sample DNA (or RNA) that may be mutated. If the DNA (or RNA) is amplified by the primers, the 3 min ends will pair with the nucleotides in the gene, if the DNA is not amplified then either or both ends will not pair with the nucleotides in the gene, indicating the presence of one Mutation indicates.
Similarly, primers can be designed so that point mutations can be detected using the ligase chain reaction (LCR, described above). Another technique that can be used in the present method is based on restriction fragment length polymorphism, RFLP (Pourzand, C. , Cerutti, P. Mutat. Res. 288 (1993), 113-121). A Southern blot of human genomic DNA, which was cleaved with various restriction enzymes, is hybridized with an hTRT-specific probe. Differences in the number or size of fragments between the sample and a control indicate a change in the experimental sample, usually an insertion or deletion.
Single-strand conformation polymorphism, SSCP, (Orrita, M. et. al. , PNAS USA 86 (1989), 2766-70) is another technique that can be used for the present method. SSCP is based on the different migration of denatured single-stranded DNAs of the wild type or a mutant (usually generated by PCR). Single-stranded DNA adopts a three-dimensional conformation that is sequence-specific. Sequence differences that only affect a single base can also lead to a mobility shift in a non-denaturing gel. Because of its simplicity, SSCP is one of the most commonly used methods for mutation screening.
Another technique that can be used in the present method is denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE (Myers et al. , Methods in Enzymology 155 (1987), 501-527). Using DGGE, mutations can be identified based on the melting behavior of double-stranded DNA. Special equipment for denaturing electrophoresis is used to analyze the melting profile of experimental DNA and control DNA: A DNA containing a mutation has a different mobility in these gel systems compared to the control. The examples discussed illustrate common methods, and there are numerous other methods known to those skilled in the art.
F. Analysis of the karyotype
The present invention further provides methods and reagents for karyotype analysis or other chromosome analysis using hTRT sequence probes and / or the detection or localization of hTRT gene sequences in chromosomes of a patient, human cell line or non-human cell . In one embodiment, amplification (i.e. H. a change in the number of copies), deletion (i.e. H. partial deletion), insertion, substitution or changes in chromosomal localization (e.g. B. Translocation) of an hTRT gene with the presence of a pathological condition or a predisposition for the development of a pathological condition (e.g. B. Cancer) must be correlated.
It was found in the present invention that in normal human cells the hTRT gene was mapped near the telomer of chromosome 5p (see Example 5 below). The closest neighboring STS marker is D5S678. Its location can be used to identify markers that are closely linked to the hTRT gene. These markers can be used to identify YACs, STSs, cosmids, BACs, lambda phages or P1 phages, or other clones that contain hTRT genomic sequences or controls. The marker or location of the gene can be used to examine human tissue samples for changes in the normal location of the hTRT gene, its organization, or sequence associated with the occurrence of a cancer type or disease.
This information can then be used to diagnose or predict the disease or cancer involved. In addition, the nature of any change in the hTRT gene can provide information about the causes by which cells become immortal. For example, a translocation event could indicate that activation of hTRT expression occurs in some cases by exchanging the hTRT promoter for another promoter that controls hTRT transcription in an unfavorable manner. Methods and reagents of this type according to the invention can be used to develop strategies with which hTRT activation processes can be combated.
The location is also useful for determining the nature of hTRT gene repression in normal somatic cells, for example when examining whether the location is within a portion of non-expressing heterochromatin. Assays based on nuclease hypersensitivity to distinguish between heterochromatin and euchromatin are described, for example, in Wu et al. , 1979, Cell 16: 797; Groudine and Weintraub, Cell 30 (1982), 131 and Gross and Garrard, Ann. Rev. Biochem. 57: 159 (1988).
In one embodiment, changes in the hTRT gene are identified by analysis of the karyotype, and numerous methods known in the art can be used. A convenient method is in situ hybridization (ISH). When in situ hybridization methods are used for karyotype analysis, a detectable or detectably labeled sample is usually hybridized with a chromosomal sample in situ to locate an hTRT gene sequence. Generally, ISH comprises one or more of the following steps: (1) fixation of the tissue, cell or other biological structure to be analyzed; (2) Prehybridization treatment of the biological structure to increase the accessibility of the target DNA (e.g. B.
Denaturation with heat or alkali) and to reduce non-specific binding (e.g. B. by blocking the hybridization ability of repetitive sequences (e.g. B. using human genomic DNA); (3) Hybridization of one or more nucleic acid probes (e.g. B. usual nucleic acids, PNAs or other nucleic acid analogs) with the nucleic acid in the biological structure or the tissue; (4) post-hybridization wash steps to remove nucleic acid fragments that were not bound during hybridization; and (5) detection of the hybridized nucleic acid fragments. The reagents and conditions to be used in each of these steps depend on the application. Of course, these steps can be modified in a variety of ways, as is known to those skilled in the art.
In one embodiment of the ISH, the hTRT probe is labeled with a fluorescence marker (in situ fluorescence hybridization; "FISH"). Typically, it is desirable to use "two-color" fluorescence in-situ hybridization that uses two probes labeled with a different fluorescent dye. A test probe that hybridizes with the desired hTRT sequence is labeled with one dye, and a control probe that hybridizes with another region is labeled with a second dye. A nucleic acid which hybridizes with a stable region of the desired chromosome, for example the centromer region, can be used as the control probe. In this way, differences in the efficiency of hybridization, which can vary from sample to sample, can be taken into account.
The ISH method for the detection of chromosomal abnormalities (e.g. B. FISH) can be carried out on nanograms of the nucleic acids in question. Normal tissue or tumor sections embedded in paraffin can be used, but also fresh or frozen material, tissue or sections. Since FISH can be used with this limited material, preparations of uncultivated primary tumors that can only be produced in traces ("touch" preparations) can also be used (see e.g. B. Kallioniemi et al. , Cytogenet. Cell Genet. 60 (1992) 190). For example, small biopsy tissue samples from tumors can be used for "touch" preparations (see e.g. B. Kallioniemi et al. , a. a. O. ). Small numbers of cells obtained by suction biopsy or cells in body fluids (e.g. B.
Blood, urine, sputum etc. ) to be analyzed. For a prenatal diagnosis, amniotic fluid, maternal blood, etc. count. to the appropriate samples. Appropriate hybridization protocols that can be used for the methods and reagents described here are described in Pinkel et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9138 (1988); EP-A1 0 430 402; Choo (Ed. Methods in Molecular Biology Vol. 33: In Situ Hybridization Protocols, Humana Press-Totowa, New Jersey (1994) and Kallioniemi et al. , a. a. O.
Other methods useful for karyotype analysis include, for example, methods such as quantitative Southern blotting, quantitative PCR or comparative genomic hybridization (Kallioniemi et al. , Science 258 (1992), 818), wherein the hTRT probes and primers according to the invention can be used to identify an amplification, deletion, insertion, substitution of hTRT sequences in chromosomes in a biological sample or other rearrangements of hTRT sequences.
G. TRT polypeptide assays
1. General
The present invention provides methods and reagents for the detection and quantification of hTRT polypeptides. These methods include analytical biochemical methods, for example electrophoresis, mass spectroscopy, "gel shift", capillary electrophoresis, chromatographic methods, for example size exclusion, high pressure liquid chromatography (HPLC), (TLC), hyperdiffusion chromatography, etc. , or various immunological methods, for example liquid or gel-precipitin reaction, immunodiffusion (single or double), immunoelectrophoresis, radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent determinations (ELISAs), immunofluorescence assays, Western blotting, mass spectrometry and other methods , which are described below and will be apparent to those skilled in the art after reading this description.
2) Electrophoretic assays
In one embodiment, the hTRT polypeptides are detected by electrophoretic protein separation. One aspect relates to a two-dimensional electrophoresis system.
Agents for the detection of proteins using electrophoresis methods are well known to those skilled in the art (see generally R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y. ; Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182 (1990): Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. , N. Y. ).
In a similar embodiment, a "mobility shift" assay is used (see e.g. B. Ausubel et al. , a. a. O. ). For example, labeled hTR associates with hTRT and migrates with changed mobility in electrophoresis in a non-denatured polyacrylamide gel etc. Thus, for example, if a labeled hTR probe or a labeled telomerase primer is mixed with a sample containing hTRT or is co-expressed with hTRT, (e.g. B. in a cell-free expression system) the presence of hTRT protein (or an hTRT coding polynucleotide) in the sample for a detectable change in hTRT mobility.
3) Immunoassays
A) General
The present invention also provides methods for the detection of hTRT polypeptides using one or more antibody reagents of the invention (i.e. H. Immunoassays). As used herein, an immunoassay refers to an assay that uses an antibody (including fragments, chimeric, and other binding agents, as defined in detail herein) that specifically binds to an hTRT polypeptide or epitope. Antibodies according to the invention can be produced by a large number of methods known to the person skilled in the art, for example those described above.
A number of well-established immunological binding assay formats are known which are suitable for the practice of the invention (see e.g. B. U.S. Patents 4,366,241, 4,376,110, 4,517,288 and 4,837,168 and Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, eds. Academic Press, Inc. New York (1993); Basic and Clinical Immunology, 7. Edition, Stites & Terr Ed. (1991) Harlow and Lane, a. a. O. ) z. B. Chapter 14) and Ausubel et al. , a. a. O. (e.g. B. Chapter 11), each of which may be considered, by reference in its entirety and for all purposes, to be a part of this description. Typically, a "capture" agent is used in immunological binding assays (or immunoassays) for specific binding to the analyte and often also its immobilization.
In one embodiment, the "capture" agent is a moiety that specifically binds to an hTRT polypeptide or a sub-sequence, for example an antihTRT antibody. In an alternative embodiment, the "capture" agent can bind to hTRT-associated protein or RNA under conditions in which the hTRT-associated molecule remains bound to the hTRT (so that if the hTRT-associated molecule is immobilized, the hTRT -Protein is similarly immobilized). In assays in which an hTRT-associated molecule is captured, the associated hTRT protein will normally be detected, for example by means of an anti-hTRT antibody or the like. Immunoassays for the detection of protein complexes are known in the art (see e.g. B. Harlow and Lane, a. a. O. , S. 583).
Normally, the hTRT gene product to be examined is detected directly or indirectly by means of a detectable label. The specific label used in the assay the detectable group is normally not a critical aspect of the invention as long as it does not significantly interfere with the specific binding of the antibody used in the assay or the antibody.
The label can be covalently linked to the "capture" agent (e.g. B. an anti-TRT antibody) or it may be linked to a third entity, for example another antibody that specifically binds to, for example, the hTRT polypeptide (an epitope other than that recognized by the "capture" agent, the "capture" agent (e.g. B. an anti (first antibody) immunoglobulin); an anti-TRT antibody; an antibody that binds to an anti-TRT antibody or an antibody / telomerase complex (e.g. B. via the binding to an associated molecule, for example a telomerase-associated protein). Other proteins that can bind to the antibody used in the assay, e.g. B. Protein A or Protein G can also be labeled.
In some embodiments, it may be appropriate to use more than one labeled molecule (i.e. H. those that can be distinguished from each other). In addition, a labeled antibody that recognizes the protein or RNA associated with the hTRT protein can be used if this is by the "capture" agent (e.g. B. an anti-hTRT antibody) bound (e.g. immobilized) target is a complex (i.e. H. a complex of hTRT and a TRT-associated protein, hTR or another TRT-associated molecule. If the complex is a protein / nucleic acid complex (e.g. B. TRT-hTR), the reporter molecule can be a polynucleotide or another molecule (e.g. B. an enzyme) that recognizes the RNA component of the complex.
Some immunoassay formats do not require the use of labeled components. For example, agglutination assays can be used to detect the presence of the target antibody. In this case, antigen-coated particles are agglutinated by the samples containing target antibodies. In this assay format, the components need not be labeled and the presence of the target antibody can be verified by simple visual inspection.
b) Non-competitive assay formats
The present invention provides methods and reagents for competitive and non-competitive immunoassays for the detection of hTRT polypeptides. Non-competitive immunoassays are assays in which the amount of analyte captured (in this case hTRT) is measured directly. An example of such an assay is a monoclonal antibody-based "twosite" immunoassay using monoclonal antibodies that are reactive with two non-interfering epitopes on the hTRT protein. See, for example, Maddox et al, i. Exp. Med. 158 (1983), 1211 for background information. In a preferred "sandwich" assay, the "capture" agent (e.g. B. an anti-TRT antibody) bound directly to a solid substrate where it is immobilized.
These immobilized antibodies then capture any hTRT protein present in the test sample. The hTRT immobilized in this way can then be labeled, i. H. by binding to a second anti-hTRT antibody bearing a label. In an alternative embodiment, the second anti-hTRT antibody may not have a label, but may be bound by a labeled third antibody that is specific for antibodies of the species from which the second antibody is derived. In a further alternative embodiment, the second antibody can be modified with a detectable unit, for example biotin, which can specifically bind a third labeled molecule, for example enzyme-labeled streptavidin.
c) Competitive assay formats
In competitive assays, the amount of hTRT protein present in a sample is determined indirectly by measuring the amount of (exogenous) hTRT added by a "capture" agent (e.g. B. an anti-TRT antibody) or has been competed away. In one of these competitive assays, a known amount of a labeled hTRT protein is added to the sample and then the sample with a "capture" agent (e.g. B. an antibody that specifically binds hTRT protein). The amount of exogenous (labeled) hTRT protein bound to the antibody is inversely proportional to the concentration of hTRT protein present in the sample. In one embodiment, the antibody is immobilized on a solid substrate.
The amount of hTRT protein bound to the antibody can be determined either by measuring the amount of hTRT protein present in a TRT-antibody complex or, alternatively, by determining the amount of remaining uncomplexed TRT -Protein. The amount of hTRT protein can be detected by providing a labeled hTRT molecule.
A hapten inhibition assay is another example of a competitive assay. In this assay, hTRT protein is immobilized on a solid substrate. A known amount of anti-TRT antibody is added to the sample and then the sample is contacted with the immobilized hTRT protein. In this case, the amount of anti-TRT antibody bound to the immobilized hTRT protein is inversely proportional to the amount of hTRT protein present in the sample. The amount of immobilized antibody can be determined either by detection of the immobilized antibody fraction or the antibody fraction that remains in solution.
The detection can be direct, in the case when the antibody is labeled, or indirect, in the event that the label is bound to a molecule which specifically binds to the antibody described above.
d) Other assay formats
The invention also provides reagents and methods for detecting and quantifying the presence of hTRT in the sample using an immunoblot (Western blot) format. In this format, hTRT polypeptides in a sample are separated from other components of the sample by gel electrophoresis (e.g. B. based on the molecular weight), the separated proteins transferred to a suitable solid support (e.g. B. a nitrocellulose filter, a nylon filter, a derivatized nylon filter etc. ) and the carrier is incubated with anti-TRT antibodies according to the invention. The anti-TRT antibodies specifically bind to hTRT or other TRT on the solid support.
These antibodies can either be directly labeled or alternatively they can subsequently be used using labeled antibodies (e.g. B. labeled sheep anti-mouse antibodies) can be detected or by means of other labeled reagents that specifically bind to the anti-TRT antibody.
Other assay formats include liposome immunoassays (LIA) using liposomes that have been designed to target specific molecules (e.g. B. Bind antibodies) and release encapsulated reagents or markers. The chemicals released can then be detected using standard methods (see Monroe et al. , Amer. Clin. Prod. Rev. 4: 34 (1986).
As mentioned above, assay formats that use FACS (and equivalent instruments or methods) have advantages when hTRT gene products are in a heterogeneous sample (e.g. B. a biopsy sample containing both normal and malignant cells).
e) substrates, solid supports, membranes and filters
As noted above, depending on the assay, various components, including the antigen, target antibody or anti-hTRT antibody, can be attached to a solid surface or carrier (i.e. H. a substrate, a membrane or filter paper). Many methods for immobilizing biomolecules on a variety of solid surfaces are known in the art. The solid surface can be, for example, a membrane (e.g. B. Nitrocellulose), a microtiter plate (e.g. B. PVC, polypropylene or polystyrene), a test tube (glass or plastic), a test strip (e.g. B. Glass, PVC, polypropylene, polystyrene, latex etc. ), a microcentrifuge tube or a glass or plastic bead. The desired constituent can be bound covalently or linked non-covalently through non-specific binding.
A large number of different organic and inorganic polymers, which can be both natural and synthetic, can be used as the material for the solid surface. Such polymers include polyethylene, polypropylene, poly (4-methylbutene), polystyrene, polymethacrylate, poly (ethylene terephthalate), rayon, nylon, poly (vinyl butyrate), polyvinylidene difluoride (PVDF), silicones, polyformaldehyde, cellulose, cellulose acetate, nitrocellulose, etc. Other materials that can be used include paper, glasses, ceramics, metals, metalloids, materials with semiconductor properties, cements, etc. In addition, gel-forming substances can be used, for example proteins (e.g. B. Gelatins), lipopolysaccharides, silicates, agarose and polyacrylamides.
Polymers which form several aqueous phases, for example dextrans, polyalkylene glycols or surfactants, for example phospholipids, long-chain (12 to 24 carbon atoms) alkylammonium salts, etc., are also suitable. With porous solid surfaces, different pore sizes can be used depending on the type of system.
A variety of different substances can be used to obtain different properties to produce the surface, in particular as laminates. For example, to avoid unspecific binding, to simplify covalent conjugation, to strengthen signal detection, etc. Protein coatings such as gelatin can be used.
If a covalent bond between a compound and the surface is desired, the surface is usually polyfunctional or can be made polyfunctional. The functional groups that are present on the surface and that can be used for linkage include carboxylic acids, aldehydes, amino groups, cyano groups, ethylene groups, hydroxyl groups, mercapto groups, etc. The manner in which such connections can be carried out is generally known for a large number of connections to different surfaces and is described in detail in the literature. see for example Immobilized Enzymes, Ichiro Chibata, Halsted Press, New York, 1978 and Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245 (1970) 3059.
In addition to covalent binding, various methods for non-covalently binding an assay component can be used. A non-covalent bond is typically the non-specific absorption of a compound on the surface.
Of course, reducing non-specific binding in immunoassays is desirable. Particularly when the assay includes an antigen or an antibody immobilized on a solid substrate, minimizing the amount of non-specific binding to the substrate is desirable. Means to reduce such non-specific binding are well known to those skilled in the art. This typically involves coating the substrate with a protein composition. In particular, protein compositions such as bovine serum albumin (BSA), non-fat milk powder and gelatin are frequently used, with milk powder occasionally preferred. In an alternative embodiment, the surface can be designed such that it binds one component non-specifically, but does not essentially bind another.
For example, a surface bearing a lectin, such as Concanavalin A, binds a carbohydrate-containing compound, but not an unglycosylated labeled protein. U.S. Patents No. 4,447,576 and 4,254,082 provide an overview of various solid surfaces for use in the non-covalent linking of assay components.
H. Assays for anti-TRT antibodies
The present invention also provides reagents and assays for the detection of hTRT-specific immunoglobulins. In one embodiment, immobilized hTRT (e.g. B. recombinant hTRT bound to the well of a microtiter plate) incubated with serum from a patient under conditions where anti-hTRT antibodies, when present, bind the immobilized hTRT. After washing to remove nonspecifically bound immunoglobulin, bound serum antibodies, if present, can be detected by adding detectably labeled anti (human Ig) antibodies (alternative embodiments or variations are well known to those skilled in the art; see, for example, Harlow, a. a. O. , Chapter 14).
These assays are useful for the detection of anti-hTRT antibodies in any source, including animal or human serum or a vehicle such as saline. In one embodiment, the assays are used to detect or monitor an immune response to hTRT proteins in a patient, particularly an autoimmune response (e.g. B. anti-telomerase). Anti-hTRT antibodies can be present in the serum, tissues or fluids of a patient suffering from an autoimmune disease or other condition.
I) Assay combinations
The diagnostic and prognostic assays described here can be carried out in various combinations and also in conjunction with other diagnostic or prognostic tests. For example, if the present methods are used to detect the presence of cancer cells in a patient sample, the presence of hTRT can be used to determine the stage of the disease, whether a particular tumor is likely to invade adjacent tissue or to a remote location metastasized and whether cancer recurrence is likely. Tests that can provide additional information include microscopic analysis of biopsy samples, detection of antigens (e.g. B.
Cell surface markers) associated with possible tumorigenesis (e.g. B. using histocytochemistry, FACS etc. ), imaging processes (e.g. B. after administration of a labeled anti-tumor antibody to a patient), telomerase activity assays, telomerase length assays, hTR assays etc. Such combined tests can provide useful information regarding the progression of a disease.
The combination of assays can also provide useful information. For example, as noted above, assays for hTRT mRNA with assays for hTR (RNA) or telomerase activity (i.e. H. TRAP) can be combined to provide information about telomerase assembly and function.
J) kits
The present invention also provides kits that are useful in screening, monitoring, diagnosis and prognosis in patients with a telomerase-related condition or for determining the level of expression of hTRT in cells or cell lines. The kits contain one or more reagents for determining the presence or absence of an hTRT gene product (RNA or protein) or for quantifying the expression of the hTRT gene. Preferred reagents include nucleic acid primers and probes that bind to the hTRT gene, RNA, cDNA or portions thereof, but also proteins, peptides, antibodies and control primers, probes, oligonucleotides, proteins, peptides and -Antibody.
Other substances can be included, including enzymes (Z. B. reverse transcriptases, DNA polymerases, ligases), buffers and reagents (labels, dNTPs).
The kits may alternatively or in combination with any of the other ingredients described herein contain an antibody that specifically binds to hTRT polypeptides or sub-sequences thereof. It can be a monoclonal or polyclonal antibody. The antibody can be conjugated to a further unit, for example a label and / or it can be immobilized on a solid support (substrate). The kit (s) may also contain a second antibody for the detection of hTRT polypeptide / antibody complexes or for the detection of hybridized nucleic acid probes, as well as one or more hTRT peptides or proteins for control or other reagents.
The antibody or hybridization probe can be free or immobilized on a solid support, for example a test tube, a microtiter plate, a test stick, etc. The kit may also include instructions describing the use of the antibody or hybridization probe in an assay to detect a predisposition to TRT. The kit can contain suitable reagents for the detection of labels or for labeling positive and negative controls, washing solutions, dilution buffers etc. contain.
In one embodiment, the kit contains a pair of primers for the amplification of hTRT mRNA. Such a kit can also be a probe for amplified hTRT-DNA and / or a polymerase, buffer, dNTPs etc. contain. In a further embodiment, the kit comprises a probe, optionally a labeled probe. In another embodiment, the kit comprises an antibody.
X. Identification of modulators of telomerase activity
A. General
The invention provides compounds and treatments that increase the activity or expression of a telomerase or a telomerase component (e.g. B. modulate hTRT protein). The invention also provides assays and screening methods (including high throughput screening methods) for identifying compounds and treatments that modulate telomerase activity or expression. These modulators of telomerase activity and expression (hereinafter referred to as "modulators") include telomerase agonists (which increase telomerase activity and / or expression) and telomerase antagonists (which telomerase activity and / or expression reduce).
The modulators according to the invention have a large number of possible uses. For example, it is believed that telomerase modulators are effective therapeutic agents for the treatment of human diseases. Screening for agonist activity and transcription or translation activators allows compositions to be provided that can increase telomerase activity in a cell (including a telomer-dependent replication ability or a "partial" telomerase activity). Such agonistic compositions also allow methods to be provided for immortalizing otherwise normal untransformed cells, including cells that can express useful proteins. Such agonists also allow methods to regulate cellular senescence to be provided.
Conversely, screening for antagonistic activity allows compositions to be provided that reduce telomer-dependent replication ability and thereby mortalize cells that are otherwise immortal, such as cancer cells. Screening for antagonistic activity allows compositions to be provided that reduce telomerase activity and thereby prevent unlimited cell division from cells that show unregulated cell growth, such as cancer cells. Examples of diseases and conditions that can be treated by means of the modulators are listed here, for example in sections VII and IX above.
In general, the modulators according to the invention can be used whenever an increase or a decrease in a telomerase activity in a cell or an organism is desired. Thus, a modulator that increases hTRT expression levels, in addition to use in disease treatment, can be used to produce a cultured human cell line that has properties generally described in Section VIII above and has numerous other uses that are useful for are obvious to the expert.
A compound or treatment modulates the "expression" of telomerase or a telomerase component when the administration of the compound or treatment adjusts the transcription rate or level of the gene encoding a telomerase component (e.g. B. hTRT-mRNA coding gene) changes, affects the stability or the post-transcriptional processing of a telomerase component coding RNA (z. B. Transport, splicing, polyadenylation or other modification), affects translation, stability, post-translational processing or the modification of a coded protein (e.g. B. hTRT) or otherwise changes the level of functional (e.g. B. catalytically active) telomerase RNP.
A compound or treatment affects telomerase "activity" when the administration of the compound or treatment changes a telomerase, e.g., those described in Section IV (B) above (e.g. B. this includes a processive or non-processive catalytic activity of telomerase; Telomerase processivity, conventional reverse transcriptase activity; nucleolytic activity; Primer or substrate binding activity; dNTP binding activity; RNA binding activity; Influencing telomerase-RNP assembly and protein binding activity). There is not necessarily a clear distinction between changes in "activity" and changes in "expression". These terms are used to facilitate discussion, but not to limit it.
The modulators according to the invention should influence telomerase activity or expression (e.g. B. without generally changing the expression of "housekeeping" proteins such as actin) and not, for example, reducing the expression of a telomerase component by non-specific poisoning of a target cell.
B. Assays to identify telomerase modulators
The invention provides methods and reagents for screening compositions or compounds that can affect the expression of a telomerase or a telomerase component, modify the replication ability of telomerase with respect to DNA, or otherwise affect the ability of the telomerase enzyme and the TRT protein telomerase. To be able to synthesize DNA ("full activity"). The invention also provides screening methods for modulators of any "partial activity" of hTRT or all of these activities.
Thus, the present invention provides assays that can be used to screen for agents that increase telomerase activity, for example, by causing hTRT protein or telomerase to be expressed in a cell in which it does not normally express or by increasing levels of telomerase activity in telomerase positive cells.
Telomerase or proteins of a telomerase subunit, their catalytic or immunogenic fragments, or oligopeptides thereof, can be used to screen for therapeutic compounds in a variety of methods for screening drugs. The fragment used in such a test can be freely in solution, fixed to a solid support, carried by a cell surface, or located intracellularly. The formation of binding complexes between telomerase or the subunit protein and the agent to be tested can be measured.
In various embodiments, the invention includes methods of screening for antagonists that bind to the active site of the enzyme; inhibit the association of its RNA moiety, telomerase-associated proteins, nucleotides or telomer DNA with telomerase or hTRT protein; promote the dissociation of the enzyme complex; the transcription of the telomerase RNA unit (e.g. B. hTR) or inhibit one of the "partial activities" described here.
The invention also relates to screening for compositions that associate nucleic acid and / or telomerase-associated compositions with hTRT, e.g. B. inhibit the association of hTR with hTRT, or the association of hTRT with the human homologue of p80 or other associated protein, or the association of hTRT with a telomer or nucleotide; screening for composition that disassociation or association (i.e. H. Assemble) promote the enzyme complex, for example an antibody directed against hTR or hTRT; screening for agents that affect the processivity of the enzyme; and screening for nucleic acids and other compositions that bind telomerase, such as a nucleic acid complementary to hTR.
The invention also contemplates screening for compositions that increase or decrease the transcription of the hTRT gene and / or the translation of the hTRT gene product. The invention also contemplates a screening method for telomerase modulators in animals, in one embodiment by the reconstitution of a telomerase activity or an anti-telomerase activity in an animal, for example in a transgenic animal. The invention also provides in vivo assay systems that include knockout models in which one or different endogenous telomerase, telomerase RNA unit, and / or telomerase-associated proteins have been deleted or inhibited. The endogenous telomerase activity can be retained completely or partially.
In one embodiment, an exogenous telomerase activity is fully or partially reconstituted.
In one embodiment of the invention, a series of assays for partial telomerase activity are provided which allow the identification of a variety of different classes of modulators of telomerase activity. The "partial activity" assays according to the invention allow the identification of modulator classes of telomerase activity which otherwise could not have been detected in a "full activity" telomerase assay. In a partial activity assay, the non-processive activity of TRT and telomerase is involved. The processive nature of telomerase is described by Morin, Cell 59 (1989), 521-529; see also Prowse "Identification of a nonprocessive telomerase activity from mouse cells" Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 (1993), 1493-1497.
In a further partial activity assay according to the invention, the “reverse transcriptase-like” activity of telomerase is used. These assays examine the reverse transcriptase activity of the hTRT protein; see Lingner "Reverse transcriptase motifs in the catalytic subunit of telomerase", Science 276 (1997), 561-567. In a further partial activity assay according to the invention, the "nucleolytic activity" of hTRT and telomerase, to which the enzyme involves removal of at least one nucleotide from the 3 min strand, typically guanosine, is used. This nucleolytic activity was described in Tetrahymena telomerase by Collins "Tetrahymena telomerase catalyzes nucleolytic cleavage and nonprocessive elongation" Genes Dev. 7: 1364-1376 (1993).
In a further partial activity assay according to the invention, an analysis of the ability of hTRT and telomerase is designated as part of their activity with regard to processive DNA polymerization. Another partial activity assay according to the invention includes the analysis of the ability of hTRT or telomerase to bind their RNA unit, i. H. hTR human cells, which is used as a template for telomer synthesis. Further partial activity assays according to the invention include the analysis of the ability of hTRT and telomerase chromosomes to bind in vivo or to bind oligonucleotide primers in vitro or in reconstituted systems or to bind proteins which are associated with chromosomal structures (see for an example of a such protein Harrington, J. Biol. Chem. (1995) 270: 8893-8901).
The chromosomal structures that bind hTRT include, for example, DNA of the telomer repeat unit, telomer proteins, histones, nuclear matrix protein, control proteins for cell division or the cell cycle, etc.
In one embodiment, an assay for identifying modulators comprises contacting one or more cells (i.e. H. "Test cells") with a test compound and determining whether the test compound affects the expression or activity of a telomerase (or a telomerase component) in the cell. Typically, this determination involves comparing the activity or expression in the test cell with a similar cell or cells (i.e. H. Control cells) that were not contacted with the test compound. In an alternative embodiment, cell extracts can be used instead of intact cells. In a related embodiment, the test compound is delivered to a multicellular organism (e.g. B. a plant or an animal).
The telomerase or telomerase component can be completely endogenous to the cell or multicellular organism (i.e. H. encoded by naturally occurring endogenous genes), it can also bind to a rekoNA substrate, and since the present invention provides hTRT and other TRT proteins in purified form in large quantities, the person skilled in the art can easily use TRT to use the methods according to the invention screen binding aptamers.
Oligonucleotides (e.g. B. RNA oligonucleotides) that bind telomerase, hTRT, HTR or portions thereof can be generated using the SELEX method (Tuerk, Methods Mol. Biol. 67: 2190 (1997). In this method, a very large pool (106-109) of nucleic acids with random sequences is delivered to the target under conditions (e.g. B. hTRT), which result in a very strong distinction between molecules with high affinity and low affinity with regard to the binding of the target. The bound molecules are separated from unbound ones and the bound molecules are amplified by means of a specific nucleic acid sequence contained in their ends and by means of suitable amplification reagents. This process is repeated several times until a relatively small number of molecules remain that have a high binding affinity for the target.
These molecules can then be tested for their ability to modulate telomerase activity as described here.
Antagonists of telomerase-mediated DNA replication can also be based on inhibition of hTR (Norton, Nature Biotechnology 14 (1996) 615-619) via complementary sequence recognition or cleavage, as is the case with ribozymes.
The inhibitory oligonucleotides of the invention can be transferred into the cell using a variety of methods well known in the art. For example, oligonucleotides can be transported into the plasma spontaneously without specific modification. In an alternative embodiment, they can be delivered by means of liposomes that fuse with the cellular membrane or are taken up by endocytosis, i. H. by using ligands attached to the front of the liposome or by direct attachment to the oligonucleotide, which then bind to surface membrane protein receptors of the cell, resulting in endocytosis. In an alternative embodiment, the cells can be permeabilized to increase the transport of the oligonucleotides into the cell without damaging the host cells.
A DNA binding protein, for example HBGF-1, which is known to transport an oligonucleotide into a cell, can also be used.
5) Inhibitory ribozymes
Ribozymes act by binding to a target RNA via the target RNA-binding portion of a ribozyme that is kept in close proximity to an enzymatic portion of the RNA that cleaves the target RNA. Thus, the ribozyme normally recognizes and cleaves a target RNA via pairing with complementary bases and, once bound in the right place, acts as an enzyme, cleaving and inactivating the target RNA. Cleaving a target RNA in such a manner destroys its ability to direct the synthesis of a coded protein, provided that the cleavage occurs in the coding sequence. After a ribozyme has bound and cleaved its RNA target, it is typically released from the RNA so that it can repeatedly bind and cleave new targets.
6) The identification of telomerase-associated proteins for use as modulators
In an embodiment according to the invention, the telomerase is used to identify telomerase-associated proteins, i. H. Telomerase-associated proteins that modulate or otherwise complement telomerase activity. As noted above, these proteins or fragments thereof can modulate a function by causing the telomerase-enzyme complex to dissociate or prevent association, prevent assembly of the telomerase complex, hTRT from binding to its complementary nucleic acid prevent or prevent their binding to their DNA template, hTRT from binding nucleotides, or prevent, increase or inhibit one or more or all of the partial activities of the telomerase enzyme or the hTRT protein as already described above.
The person skilled in the art can use the methods according to the invention for the detection of which portions (e.g. B. Domains) of these telomerase-associated proteins come into contact with telomerase. In an embodiment according to the invention, these telomerase-associated proteins or fragments thereof are used as modulators of telomerase activity.
7) Telomerase-associated proteins as dominant-negative mutants
In an embodiment according to the invention, telomerase-associated proteins are used as modulators of telomerase activity. Proteins associated with telomerase include chromosomal structures, for example histones, proteins of the nuclear matrix, control proteins of cell division / cell cycle etc. To further telomerase-associated proteins that can be used as modulators for the purpose according to the invention! include p80 and p95, the human protein and their human homologs, for example TP1 and TRF-1 (Chong, Science 270 (1995), 1663-1667). In addition, fragments of these telomerase-associated proteins can be identified by the person skilled in the art in accordance with the methods according to the invention and used as modulators of telomerase activity.
8) Dominant-negative mutants
Eight highly conserved motifs were identified within the TRTs of various non-human species, as already described above (see also Lingner, Science 276 (1997), 561-567). Fig. Figure 4 shows a schematic of the human TRT (hTRT) coding cDNA sequence (from pGRN121) and RT motifs compared to S. pombe-Trt1p, Euplotes p123 and S. cerevisiae Est2p. The present invention provides recombinant and synthetic nucleic acids in which the codons for the conserved amino acid residues in each of the eight motifs have been exchanged for each of the other codons. A large number of the coded sequences obtained express a non-functional hTRT. See example 16.
Thus, for example, the present invention provides a large number of "mutated" telomerase enzymes and TRT proteins which have partial activity of telomerase but not all of the activity. For example, such a polymerase can bind telomeric structures, but not telomerase-associated RNA (i.e. H. hTR). Such a telomerase mutant, when expressed in a sufficiently high concentration, can deplete a necessary telomerase component (e.g. B. hTR) and thereby act as an inhibitor of wild-type telomerase activity. A mutant telomerase acting in this way represents an antagonist or a so-called "dominant-negative" mutant.
9) Antibodies
The antibodies according to the invention can generally be used to identify, purify or inhibit any or all of the activities of a telomerase enzyme and hTRT protein. Antibodies can act as antagonists of telomerase activity in various ways, for example, by preventing the telomerase complex or the nucleotide from binding to their DNA substrates, or by preventing the telomerase components from forming an active complex , by maintaining a functional (telomerase complex) quaternary structure or by binding to one of the active centers of the enzyme or to other sites which have allosteric effects on activity (the different partial activities of telomerase are described in detail elsewhere in this description).
D) Designing modulators
The telomerase modulators according to the invention can be designed or manufactured using methods that are well known in pharmacy, including combinatorial methods and "rational drug design" methods.
1) Methodology of combinatorial chemistry
The production and simultaneous screening of large banks of synthetic molecules can be carried out using well known combinatorial chemistry techniques, see for example van Breemen, Anal. Chem. 69: 2159-2164 (1997) and Lam, Anticancer Drug Des. 12: 145-167 (1997).
As noted above, combinatorial chemistry methodology can be used to generate a huge number of oligonucleotides that can be screened very quickly for specific oligonucleotides that have suitable binding affinities and specificities against any target, such as the inventive TRT -Proteins can be used (see for a general background information Gold, J. of Biol. Chem. 270: 13581-13584 (1995)).
2) "Rational Drug Design"
"Rational drug design" includes an integrated set of methods, which include structural analysis of target molecules, synthetic chemistry and advanced computer processes. When used to design modulators, such as antagonists / inhibitors of protein targets, such as the telomerase enzyme and hTRT protein, the goal of "rational drug design" is to understand the three-dimensional shape and chemistry of a molecule. "Rational drug design" is supported by data obtained by X-ray structure analysis or NMR and which can now be determined for the hTRT protein and telomerase enzyme in accordance with the methods provided by the invention and using the reagents according to the invention.
Calculations with regard to electrostatic properties, hydrophobicity and solvent access are also helpful. See, for example, Coldren, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6635-6640 (1997).
D) kits
The invention also provides kits that can be used to determine whether a test compound is a modulator of TRT activity. The kit typically includes one or more of the following: a substantially purified TRT polypeptide or polynucleotide (including probes and primers), a plasmid that contains a TRT (e.g. B. hTRT) when inserted into a cell or cell-free expression system; a plasmid that has a TR (e.g. B. hTR) when it is introduced into a cell or a cell-free expression system;
Cells or cell lines; a composition for detecting a change in TRT activity and a guide showing how to detect and measure a change in TRT activity, indicating that a change in telomerase activity in the presence of the test compound is an indicator of this is whether the test compound modulates telomerase activity and a container. The kit may also include agents such as a TRAP assay or a quantitative polymerase chain reaction based assay so as to measure a change in TRT activity.
The kit may also include instructions on how to detect and measure a change in TRT activity, indicating that a change in telomerase activity in the presence of the test compound is an indicator of whether the test compound is the telomerase Activity modulated.
XI. Transgenic organisms (telomerase "knockout" cells and animal models)
The invention also provides transgenic non-human multicellular organisms (e.g. B. Plants and animals) or unicellular organisms (e.g. B. Yeast) containing an exogenous TRT gene sequence that is a coding sequence or a regulatory sequence (e.g. B. a promoter) can act. In one embodiment, the organism expresses an exogenous TRT polypeptide with a sequence from a human TRT protein. In a related embodiment, the organism also expresses a telomerase RNA component (e.g. B. hTR).
The invention also provides unicellular and multicellular organisms (or cells thereof) in which at least one, a telomerase subunit (e.g. B. TRT or TR) or a gene encoding a telomerase-associated protein is mutated or deleted (i.e. H. in a coding or regulatory area) so that no native telomerase is expressed or that it is expressed with a reduced level or expressed in comparison to wild-type cells or organisms with different activities. Such cells and organisms are often referred to as "gene knock-out" cells or organisms.
The invention also provides cells and organisms in which an endogenous telomerase gene (e.g. B. Mouse TRT) is mutated or deleted and an exogenous telomerase gene (e.g. B. for human TRT) is introduced and expressed. For example, cells and organisms of this type are useful as model systems to: identify modulators of hTRT activity or expression; to be able to determine the effects of mutations in genes for telomerase components and, for example, to be able to determine the timing with regard to the state of development and the tissue localization of telomerase activity (in order to be able to assess when a telomerase modulator should be administered and possible side effects to be able to determine).
Examples of multicellular organisms include plants, insects and animals such as mice, rats, rabbits, monkeys, apes, pigs and other mammals. An example of a unicellular organism is yeast.
Procedure for changing or interrupting a specific gene (e.g. B. endogenous TRT genes) are well known to the person skilled in the art, see for example Baudin et al. , Nucl. Acids Res. 21: 3329 (1993); Wach et al. , Yeast 10 (1994) 1793; Rothstein, Methods Enzymol. 194: 281; Anderson, Methods Cell Biol. 48: 31 (1995); Pettitt et al. , Development 122 (1996), 4149-4157; Ramirez-Solis et al. , Methods Enzymol. 225 (1993), 855 and Thomas et al. , Cell 51 (1987), 503, each of which is to be considered part of the specification by reference in its entirety and for all purposes.
The "knockout" cells and animals according to the invention include cells and animals in which one or more units of the endogenous telomerase-enzyme complex have been deleted or inhibited. Reconstitution of telomerase activity prevents the cell or animal from inevitable cell death due to its inability to preserve telomeres. Methods for changing the expression of endogenous genes are well known to those skilled in the art. Typically, such methods involve the modification or replacement of all regulatory sequences that control the expression of a particular gene to be regulated, or a portion thereof. The regulatory sequences, for example the native promoter, can be changed.
The common method for targeted mutation of genes involves inserting a genomic DNA fragment containing the desired gene into a vector, followed by cloning two genomic arms around a selectable neomycin resistance cassette in a vector containing thymidine kinase. A suitable cell is then transfected with this "knock-out" construct; H. an embryonic stem cell (ES) of the mouse, the cells then being subjected to a positive selection (using G418 and, for example, for neomycin resistance) and a negative selection (using, for example, FIAU to exclude cells which lack thymidine kinase). This allows the selection of cells that have made a homologous recombination with the "knockout" vector.
This procedure leads to the inactivation of the desired gene. See, for example, U.S. Patents 5,464,764; 5,631,153; 5,487,992 and 5,627,059.
"Knocking out" expression of an endogenous gene can also be achieved by means of homologous recombination, which is used to introduce a heterologous nucleic acid into the regulatory sequences (e.g. B. a promoter) of the desired gene is used. In order to prevent the expression of functional enzyme or product, simple mutations are suitable which either change the reading frame or interrupt the promoter. To upregulate expression, a native promoter can be exchanged for a heterologous promoter that induces higher levels of transcription. Gene trap insertion can also be used to interrupt a host gene. Mouse embryonic stem cells (ES) can be used to produce transgenic "knockout" animals, as described, for example, in Holzschu Transgenic Res. 6 (1997), 97-106.
The change in expression of endogenous genes by homologous recombination can also be achieved using nucleic acid sequences that contain the structures in question. Upstream sequences are used to target constructs for heterologous recombination. Using the information regarding the TRT structural gene, for example SEQ. ID. No. 1, the person skilled in the art can produce constructs for homologous recombination, which only requires routine experiments. Homologous recombination to alter the expression of endogenous genes is described in U.S. Patent No. 5,272,071 and WO 91/09 955, WO 93/09 222, WO 96/29 411, WO 95/31 560 and WO 91/12 650. Homologous recombination in mycobacteria is described in Azad Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 4787; Baulard, J.
Bacteriol. 178 (1996), 3091 and Pelicic, Mol. Microbiol. 20: 991 (1996). Homologous recombination in animals is described by Moynahan, Hum. Mol. Genet. 5 (1996), 875 and in plants by Offringa, EMBO J. 9 (1990) 3077.
XI. glossary
The following terms are defined below to provide additional guidance to those skilled in the art when practicing the invention: adjuvant, allele (& allele sequence), amino acids (including hydrophobic, polar, charged), conservative substitution, control elements (and regulatory sequences) derivatized , detectable labeling, elevated level, epitope, favorable and unfavorable prognosis, fusion protein, gene product, hTR, immortal, immunogen and immunogenic, isolated, modulator, motif, nucleic acid (& polynucleotide), oligonucleotides (& oligomers), functionally linked, polypeptides, probe (including nucleic acid probes and antibody probes), recombinant, selection system, sequence, specific binding, stringent hybridization conditions (& stringency), essential identity (& essential similarity), essentially pure (& essentially purified),
Telomerase-negative and Telomerase-positive cells, catalytic activity of Telomerase, related to Telomerase and test compound.
* The term "adjuvant" used in its normal sense refers to any substance that increases the immune response to an antigen with which it is mixed. Adjuvants useful in the present invention include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, and surfactants such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, emulsions, keyhole limpet hemocyanin and dinitrophenol. BCG ("Bacillus Calmette-Guerin") and Corynebacterium parvum are also useful adjuvants.
The term "allele" or "allele sequence" as used herein refers to an alternative form of nucleic acid sequence (i.e. H. a nucleic acid encoding hTRT protein). Alleles are the result of mutations (i.e. H. Changes in the nucleic acid sequence) and this generally leads to the production of modified and / or differently regulated mRNAs or polypeptides, the structure and / or function of which may or may not have been changed. Common mutation-based changes that lead to the formation of alleles are generally attributed to natural deletions, additions, or substitutions of nucleotides that may or may not affect the encoded amino acids. Each type of change can occur alone, in combination with the others, or once or more within a given gene, chromosome, or other cellular nucleic acid.
Any given gene can have none, one, or many allelic forms. The term "allele" as used herein refers to either a gene or an mRNA transcribed from the gene, or both.
The "amino acids" described here are sometimes referred to by the standard one-letter code: alanine (A), serine (S), threonine (T), aspartic acid (D), glutamic acid (E), asparagine (N), glutamine (Q), Arginine (R), Lysine (K), Isoleucine (I), Leucine (L), Methionine (M), Valine (V), Phenylalanine (F), Tyrosine (Y), Tryptophan (W), Proline (P), Glycine (G), histidine (H), cysteine (C). This also includes synthetic and non-naturally occurring amino acid analogs (and / or peptide linkages).
The term "hydrophobic amino acids" as used herein refers to A, L, I, V, P, F, W and M. The term "polar amino acids" as used herein refers to G, S, T, Y, C, N, and Q. The term "charged amino acids" as used herein refers to D, E, H, K and R.
As used herein, the term "conservative substitution" refers to a change in the amino acid composition of the protein that does not significantly alter the activity of the protein. Thus, the term "conservatively modified variations" of a particular amino acid sequence refers to amino acid substitutions in which amino acids are exchanged that are not critical for protein activity, or to the substitution of amino acids for other amino acids with similar properties (acidic, basic, positive or negative charged, polar or non-polar etc. ), so that the substitutions even of critical amino acids do not significantly change the activity. Conservative substitution tables that list functionally similar amino acids are well known in the art.
The following six groups each contain amino acids that are conservative substitutions for one another: 1) alanine (A), serine (S), threonine (T); 2) aspartic acid (D) glutamic acid (E) 3) asparagine (N), glutamine (Q); 4) arginine (R), lysine (K), 5) isoleucine (I), leucine (L) methionine (M); Valine (V); and 6) phenylalanine (F), tyrosine (Y), tryptophan (W) (see also Creighton, Proteins, (1984), W. H. Freeman and Company). It will be apparent to those skilled in the art that the above exchanges are not the only possible conservative substitutions. For example, replacing a charged amino acid with another charged amino acid could be considered a conservative substitution, regardless of whether it is positively or negatively charged.
In addition, individual substitutions, deletions, or additions that change, add, or delete a single amino acid or a small percentage of amino acids in a coded sequence are also "conservatively modified variations". A "conservative substitution" can be introduced into a recombinant protein by using one or more codons that differ from the codons used by the native or wild-type gene. In this case, conservative substitution also includes the substitution of one codon for an amino acid against another codon for the same amino acid.
The terms "control elements" or "regulatory sequences" used here include enhancers, promoters, transcription terminators, origins of replication, chromosome-integrated sequences, 5 min - and 3 min - non-translated regions with which proteins or other biomolecules interact in order to carry out transcription and translation. In the case of eukaryotic cells, the control sequences contain a promoter and preferably an enhancer, which is derived, for example, from immunoglobulin genes, SV40, cytomegalovirus and a polyadenylation sequence. They can also contain donor and acceptor sequences for the splicing. Depending on the vector system used and the host used, any number of suitable transcription and translation elements, including constitutive and inducible promoters, can be used.
The term "derivatized" polynucleotide, oligonucleotide or nucleic acid as used herein refers to an oligo- or polynucleotide that includes a derivatized substituent. In some embodiments, the substituent is essentially non-interfering with hybridization with complementary polynucleotides. Derivatized oligonucleotides or polynucleotides modified with added chemical substituents (e.g. B. by modification of an already synthesized oligo- or polynucleotide or by incorporation of a modified base or a backbone analog during synthesis) can be introduced into a metabolically active eukaryotic cell in order to hybridize with an hTRT-DNA, -RNA or an hTRT-protein , producing a change or chemical modification to a DNA, RNA or protein there.
In an alternative embodiment, the derivatized oligo- or polynucleotides can interact and change with hTRT polypeptides, telomerase-associated proteins or other factors that interact with hTRT-DNA or hTRT gene products, or the expression or function of hTRT- Change or modulate DNA or RNA or proteins. Examples of attached chemical substituents include: Europium (III) texaphyrin, cross-linking agents, psoralen, metal chelates (e.g. B. Iron / EDTA chelate for iron-catalyzed cleavage), topoisomerases, endonucleases, exonucleases, ligases, phosphodiesterases, photodynamic porphyrins, chemotherapeutic agents (e.g. B. Adriamycin, Doxirubicin), intercalating agents, base modifying agents, immunoglobulin chains and oligonucleotides.
Iron / EDTA chelates are chemical substituents that are often used when local cleavage of a polynucleotide sequence is desired (Hertzberg et al. , J. At the. Chem. Soc. 104: 313 (1982); Hertzberg and Dervan, Biochemistry 23 (1984), 3934; Taylor et al. , Tetrahedron 40 (1984), 457 and Dervan, Science 232 (1986), 464). Examples of chemical methods for connection include: direct connection e.g. B. via an attached reactive amino group (Corey and Schultz, Science 238 (1988), 1401, which document is to be regarded as part of this description by reference) and other chemical methods for direct compounds, but also connecting methods for streptavidin / biotin and digoxigenin / anti -Digoxigenin antibodies can be used.
Methods for coupling chemical substituents are provided in U.S. Patents 5,135,720, 5,093,245, and 5,055,556, which are incorporated by reference into this specification. Other chemical coupling methods are at the discretion of those skilled in the art.
The term "detectable label" used here has the usual meaning in the art and relates to an atom (e.g. B. a radionuclide), molecule (e.g. B. Fluorescein) or a complex used or can be used to detect the presence of a molecule (e.g. B. due to a physical or chemical property) or to indicate, or to enable the binding of another molecule to which it is covalently bound or closely associated. The term "label" also refers to covalently bound or closely associated molecules (e.g. B. a biomolecule, for example an enzyme), which acts on a substrate for the production of a detectable atom, molecule or complex.
Detectable markings suitable for the use according to the invention include all compositions which can be detected by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, electrical, optical or chemical means. Labels useful for the present invention include biotin for labeling with labeled streptavidin conjugate, magnetic beads (e.g. B. DynabeadsÖ), fluorescent dyes (e.g. B. Fluorescein, Texas red, rhodamine, green fluorescent protein ("green fluorescent protein"), enhanced green fluorescent protein ("enhanced green fluorescent protein"), lissamine, phycoerythrin, Cy2, Cy3, Cy3. 5, Cy5, Cy5. 5, Cy7, "FluorX" (Amersham), "SyBR Green I & II" (Molecular Probes), etc. ), radioactive labels (e.g. B. <3> H, <1> <2> <5> I, <3> <5> S, <1> <4> C or <3> <2> P), enzymes (e.g.
Hydrolases, in particular phosphatases, such as, for example, alkaline phosphatase, esterases and glycosidases or oxidoreductases, in particular peroxidases, such as, for example, horseradish peroxidase and other enzymes usually used in an ELISA), substrates, cofactors, inhibitors, chemiluminescent groups, chromogenic agents and colorimetric labels, such as, for example, colloidal Gold or colored glass or plastic (e.g. polystyrene, polypropylene, latex etc.) beads. Patents whose teaching relates to the use of such markers include U.S. Patent 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 and 4,366,241. Means for detecting such markings are well known to those skilled in the art.
Thus, for example, radioactive labels and chemiluminescent labels can be detected using a photographic film or scintillation counters, and fluorescent markers can be detected to detect emitted light with a photodetector (e.g. cell sorting activated with fluorescence). Enzymatic labels are typically detected in that the enzyme is provided with a substrate and that the reaction product produced is detected by the action of the enzyme on the substrate. Colorimetric markings are detected simply by making the colored marking visible. Thus, a label is any composition that can be detected by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, electrical, optical or chemical means.
The label can be directly or indirectly coupled to the desired assay component according to methods well known in the art. Non-radioactive labels are often applied by indirect means. In general, a ligand molecule (e.g. biotin) is covalently attached to the molecule. The ligand then binds an anti-ligand molecule (e.g. streptavidin) that is either inherently detectable or is covalently bound to a signal generating system, such as a detectable enzyme, a fluorescent compound, or a chemiluminescent compound. A number of ligands and anti-ligands can be used. In cases where a ligand has a natural anti ligand, for example biotin, thyroxine or cortisone, it can be used in conjunction with the labeled, naturally occurring anti ligands.
Alternatively, any hapten or antigenic compound can be used in combination with an antibody. The molecules can also be conjugated directly to signal-generating compounds, for example by conjugation with an enzyme or fluorophore. Means for the detection of markings are well known to the person skilled in the art. Thus, for example, if the label is a radioactive label, the detection means include a scintillation counter, photographic film, such as in autoradiography, or imaging using stored phosphor ("storage phosphor imaging"). A fluorescent label can be detected by excitation of the fluorochrome with light of a suitable wavelength and the detection of the fluorescence obtained.
The fluorescence can be detected visually, using a photographic film, using an electronic detector, such as charge-coupled devices (CCDs) or secondary electron multipliers, etc. Similarly, enzymatic labels can be detected by providing the appropriate substrates for the enzyme, and the reaction product obtained is detected. Simple colorimetric markings can also be detected by observing the color associated with the marking. When pairs of fluorophores are used in an assay, it is often preferred that they have different emission patterns (wavelengths) so that they can be easily distinguished.
The term "elevated level" refers to an amount of hTRT gene product (or other specified substance or activity) in a cell that is elevated, or higher compared to the level in a reference standard, to the level in normal telomerase negative cells in a person or in other people who do not suffer from the corresponding condition, for example for a diagnosis and for a prognosis, for the level in tumor cells of a number of stages, or classes of for example tumors.
The term "epitope" as used herein has its usual meaning, i.e. it refers to a location on an antigen that is recognized by an antibody. Epitopes are typical sections of amino acids that represent a small fraction of the total protein. Epitopes can affect the conformation (i.e. discontinuously). This means that they can be formed by amino acids which are encoded by non-contiguous parts of the primer sequence and which come to lie side by side due to the protein folding.
The terms "favorable prognosis" and "unfavorable prognosis" are known in the art. In the context of cancer, "favorable prognosis" means that a tumor is likely to regress, or there is longer survival for patients with a favorable prognosis compared to those with an unfavorable prognosis, while the term "unfavorable prognosis" means that the tumor is likely is more aggressive, which leads to poor disease progression for the patient or faster progression of the disease.
The term "fusion protein" as used herein refers to a composite protein, i.e. a single contiguous amino acid sequence constructed from two (or more) different heterologous polypeptides that are normally not fused together in a single amino acid sequence. Thus, a fusion protein can include a single amino acid sequence that contains two completely different amino acid sequences or two similar or identical polypeptide sequences, provided that these sequences are not normally found together in a single amino acid sequence.
Fusion proteins can generally be made using either nucleic acid recombination techniques, i.e. as the result of transcription and translation of a recombinant gene fusion product, the fusion comprising a portion encoding a polypeptide of the invention and a portion encoding a heterologous protein, or by chemical synthesis methods well known in the art. The non-hTRT region (s) of the fusion protein can be fused to the amino terminus of the hTRT polypeptide, the carboxy terminus, or both.
The term "gene product" as used herein refers to an RNA molecule transcribed from a gene or a protein that is encoded by the gene or translated by the RNA.
The term "hTR" (human telomerase RNA) used here refers to the RNA component of human telomerase and all naturally occurring alleles and variants or recombinant variants. hTR is described in detail in U.S. Patent No. 5,583,016, which may be incorporated by reference in its entirety and for all purposes, as a part of this specification.
The term "immortal" as used herein, when referring to a cell, has its normal meaning in the field of telomerase and refers to cells which have an apparently unlimited replicative potential. The term "immortal" can also refer to cells with increased proliferation ability compared to their unmodified counterparts. Examples of immortal human cells are malignant tumor cells, germline cells and certain transformed human cell lines that are cultured in vitro (e.g. cells that became immortal after transformation by viral oncogenes). In contrast, most normal human somatic cells are mortal, i.e. they have limited replicative potential and become senescent after a similar number of cell divisions.
The terms "immunogen" and "immunogen" as used herein have the usual meaning in the art, i.e. an immunogen is a molecule, such as a protein or other antigen, that triggers an adaptive immune response after injection into a person or animal.
The term "isolated" as used herein, when referring to a molecule or composition, for example an RNP (e.g. at least one protein and at least one RNA), means that the molecule or composition of at least one other compound (e.g. a protein , other RNAs or other contaminants with which it is associated in vivo or in its naturally occurring state has been separated out, thus an RNP is considered "isolated" when it has been isolated from a cell membrane, for example from a cell extract, for example however, the isolated composition can also be substantially pure.
The term "modulator" as used herein refers to any synthetic or natural compound or composition that can arbitrarily alter both the "full" or any "partial activity" of a telomerase reverse transcriptase (TRT). A modulator can be an agonist or an antagonist. A modulator can be, but is not limited to, any organic or inorganic compound. These include, for example, small molecules, peptides, proteins, sugars, nucleic acids, fatty acids etc.
The term "motif" as used herein refers to a sequence of consecutive amino acids (or a nucleic acid sequence encoding a sequence of consecutive amino acids) that defines a feature or structure in a protein that defines all proteins of a defined class or one Type is common, or is conserved within these proteins. The motif or "consensus" sequence can contain both conserved and non-conserved residues, but the conserved residues in the motif sequence indicate that the conserved residue or class of residues (ie, hydrophobic, polar, non-polar or one other class) is typically present at the indicated position in each protein (or gene or mRNA) of the class of proteins defined by the motif.
Motifs can differ according to the protein class. Thus, for example, the reverse transcriptase enzymes form a class of proteins, which can be defined by one or more motifs, and telomerase enzymes also belong to this class. However, the telomerase enzymes can be defined as the class of enzymes with motifs that are characteristic of this class. It is obvious to a person skilled in the art that the identification of a residue as a conserved residue in a motif does not mean that every member of the class defined by the motif has this indicated residue (or class of residues) in the indicated position and that one or more members the class may have a different remainder at the conserved position.
The terms "nucleic acid" and "polynucleotide" used here are used interchangeably. The use of the term "polynucleotide" is not intended to exclude oligonucleotides (i.e., short polynucleotides) and this term may also refer to synthetic and / or non-naturally occurring nucleic acids (i.e., include nucleic acid analogs or modified backbone residues or bonds).
The terms "oligonucleotides" or "oligomers" as used herein refer to a nucleic acid sequence of about 7 nucleotides or more and up to about 700 nucleotides that can be used as a probe or "amplimer". Oligonucleotides are preferably between about 10 and about 50 nucleotides in length, more preferably from about 14 to about 35 nucleotides, and most preferably from about 15 to about 25 nucleotides, and this term can also refer to synthetic and / or non-naturally occurring nucleic acids refer (ie include nucleic acid analogs or modified backbone residues or bonds).
The term "functionally linked" as used herein refers to a functional relationship between two or more nucleic acid segments (eg DNA): For example, a promoter or enhancer is functionally linked to a coding sequence if it transcribes the sequence in a suitable host cell or another Expression system stimulated. Sequences that are functionally linked are generally sequential and in the case of a signal sequence both sequential and in the reading frame. However, enhancers do not have to be in close proximity to the coding sequences, the transcription of which they are intended to increase.
The term "polypeptide" and the term "protein" as used herein are used interchangeably and refer to a polymer composed of amino acid residues, including synthetic, naturally occurring and non-naturally occurring analogs thereof. Peptides are examples of polypeptides.
The term "probe" as used herein refers to a molecule that specifically binds another molecule. An example of a probe is a "nucleic acid probe" that specifically binds (i.e., attaches or hybridizes) to a substantially complementary nucleic acid. Another example of a probe is an "antibody probe" that specifically binds to a corresponding antigen or epitope.
The term "recombinant" as used herein refers to a polynucleotide that has been synthesized or otherwise manipulated in vitro (e.g., a "recombinant polynucleotide"), methods that relate to the use of recombinant polynucleotides to produce gene products in cells or others biological systems or to a polypeptide ("recombinant protein") encoded by a recombinant polynucleotide.
The term "selection system" used here, in connection with stably transformed cell lines, refers to a method for identifying and / or selecting cells which contain a desired recombinant nucleic acid. A wide variety of selection systems for the identification of transformed cells are known and these are suitable for use in the present invention.
For example, cells transformed by plasmids or other vectors can be selected by the resistance to antibiotics conferred by genes contained on the plasmids, for example the well-known genes amp, gpt, neo and hyg or other genes, such as the herpes simplex virus -Thymidine kinase genes (Wigler et al., Cell 11 (1977), 223-32 and the adenine phosphoribosyl transferase gene (Lowy et al., Cell 22 (1980), 817), which are described in tk <-> - or aprt <-> cells can be used. Resistance to an antimetabolite, an antibiotic or herbicide can also be used as the basis for a selection; for example dhfr, which confers resistance to metotrexate and is also useful for gene amplification (Wigler et al. Proc. Natl. Acad.
Sci., 77 (1980), 3567); npt which confers resistance to the aminoglycosides neomycin and G-418 (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150 (1981), 1) and as or pat which confers resistance to chlorosulfuron or phosphinotricin acetyltransferase ( Murry, in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill, New York NY, pages 191-196 (1992)). Other selectable genes are described, for example trpB, a gene which confers resistance to hygromycin and allows cells to use indole instead of tryptophan, or hisD, which allows cells to use histinol instead of histidine (Hartman and Mulligan, Proc. Natl. Acad Sci., 85: 8047 (1988).
Recently, the use of visible markers has become very popular, with markers such as anthocyanins, beta-glucuronidase and its substrate, GUS and luciferase and its substrate, luciferin, not only used to identify transformants, but also to quantify the amount of transient or stable protein expression, which can be ascribed to a specific vector system (Rhodes et al., Meth. Mol. Biol 55 (1995), 121).
The term "sequence" of a gene, nucleic acid, protein or peptide as used herein refers (unless specifically stated otherwise) to the arrangement of nucleotides in either one or both strands of a double-stranded DNA molecule, for example the sequence of both coding strand as well as the complementary strand, or in a single-stranded nucleic acid molecule, or on the arrangement of amino acids in a peptide or protein.
The term "specifically binding" as used herein refers to the ability of a molecule, typically an antibody or polynucleotide, to contact and associate with another specific molecule even in the presence of many other different molecules. For example, a single-stranded polynucleotide can specifically bind to a single-stranded polynucleotide that is complementary in sequence, and an antibody specifically binds (or "is specifically immunoreactive therewith") to its corresponding antigen.
The term "stringent hybridization conditions" or "stringency" as used herein refers to conditions in the range from about 5 ° C. to about 20 ° C. or 25 ° C. below the melting temperature (Tm) of the target sequence and a probe with an exact or almost exact complementarity to the goal. The term "melting temperature" as used herein refers to the temperature at which a population of double-stranded nucleic acid molecules half dissociates into single strands. Methods for calculating the Tm of nucleic acids are well known in the art (see, e.g., Berger and Kimmel (1987) Methods in Enzymology, Vol. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc. and Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.
Edition, Volumes 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (hereinafter referred to as "Sambrook"), both documents of which may be considered part of this description by reference). As indicated in standard references, a simple determination of the Tm value can be calculated using the equation: Tm = 81.5 + 0.41 (% G + C) when a nucleic acid is in aqueous solution at 1 M NaCl (see e.g. Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization in: Nucleic Acid Hybridization (1985)). Other references contain refined calculations, whereby both structural features and sequence features are taken into account when calculating the Tm.
The melting temperature of a hybrid (and thus the conditions for stringent hybridization) are influenced by various factors, e.g. the length and type (DNA, RNA, base composition) of the probe and the type of target (DNA, RNA, base composition, in solution or immobilized etc.) and the concentration of salts and other components (e.g. the presence or absence of formamide, dextran sulfate, polyethylene glycol). The effects of these factors are well known and are discussed in standard references related to this subject; see e.g. Sambrook, op. Cit., And Ausubel et al., Op. Cit.
Typically, stringent hybridization conditions correspond to salt concentrations below about 1.0 M sodium ions, typically about 0.01 to 1.0 M sodium ions at a pH of 7.0 to 8.3 and temperatures of at least about 30 ° C. for short probes (e.g. 10 to 50 nucleotides) and at least about 60 ° C for long probes (eg over 50 nucleotides). As already noted, stringent conditions can also be achieved by adding destabilizing agents such as formamide, in which case lower temperatures can be used.
The term "essential sequence identity" used here in connection with nucleic acids refers to the extent of sequence similarity between two polynucleotides. Significant sequence identity can be determined by hybridization under stringent conditions, by direct comparison or other measures. For example, two polynucleotides can be identified as having essential sequence identity if they can specifically hybridize with one another under stringent hybridization conditions. Other degrees of sequence identity (e.g., less than "essential" can be characterized by hybridization under different stringency conditions. Alternatively, essential sequence identity can be described as a percentage of identity between two nucleotide sequences (or polypeptide sequences).
Two sequences are considered substantially identical if they are at least about 60% identical, preferably at least about 70%, at least about 80%, at least about 90%, or at least about 95 or 98 to 100%. The percent sequence identity (nucleotide or amino acid) is typically calculated by determining the optimal alignment between two sequences or by comparing the two sequences. For example, an exogenous transcript used for "sense" suppression can be described as having a certain percentage of identity or similarity compared to a reference sequence (e.g., the corresponding endogenous sequence). The optimal alignment of sequences can be done using the algorithm of Smith and Waterman, Adv. Appl.
Math. 2 (1981), 482, which relates to local homology algorithm, by Needleman and Wunsch's homology alignment algorithm , J. Mol. Biol. 48 (1970), 443, by the "search for similarity" method of Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 2444, by executing these algorithms by computer (GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the software package from Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) or by viewing. The best targeting (which gives the highest percentage of identity) generated by the various methods is selected.
Typically, these algorithms compare two sequences over a "comparison window" (usually at least 18 nucleotides in length) to identify and compare local areas of sequence similarity, allowing small additions or deletions (i.e. gaps). Additions and deletions are typically 20% or less of the length of the sequence relative to the reference sequence that contains no additions or deletions. It is sometimes desirable to describe sequence identity between two sequences in terms of a particular length or range (e.g., two sequences can be described as having at least 95% identity over a length of at least 500 base pairs). Usually the length is at least about 50, 100, 200, 300, 400 or 500 base pairs, amino acids or other residues.
The percentage of sequence identity is calculated by comparing two optimally aligned sequences over the comparison range, determining the number of positions at which the identical nucleic acid base (e.g. A, T, C, G or U) occurs in both sequences, so the number determine paired positions, and by determining the number (or percentage) of paired positions compared to the total number of bases in the reference sequence or the comparison region. An additional algorithm that is suitable for determining sequence similarity is the BLAST algorithm, which is described in Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410 and Shpaer, Genomics 38 (1996), 179- 191. Software for performing BLAST analysis is available publicly from the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
This algorithm firstly identifies sequence pairs with which many hits are achieved ("high scoring sequence pairs (HSPs)") by identifying short words with the length W in the query sequence which match or meet a positively evaluated point T, if they are aligned against a word of the same length in a database sequence. T refers to the "neighborhood word score threshold" (Altschul et al., Op. Cit.). These initial hits of the neighborhood word act as starting points for initiating searches which are intended to find longer HSPs containing them. The word hits are lengthened in both directions along each sequence as far as the hit can be increased in terms of cumulative alignment.
The prolongation of the word hits in each direction comes to a standstill if: the hit with regard to the cumulative alignment decreases by the amount X of the maximum achievable value; the cumulative hit goes to 0 or below due to the accumulation of one or more alignments of remainder hits; or the end of each sequence has been reached. The parameters W, T and X of the BLAST algorithm determine the sensitivity and the speed of the alignment. The BLAST program uses a word length (W) of 11 by default, the "BLOSUM62 scoring matrix" (see Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 10915-10919), alignments (B) of 50 , Expectation (E) of 10, M = 5, N = -4, and a comparison of both strands.
The term BLAST refers to the BLAST algorithm, which performs a statistical analysis of the similarity between two sequences; see for example Karlin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993). A similarity measurement provided by the BLAST algorithm is the smallest sum probability (P (N)), which indicates the probability that a pairing between two nucleotides or amino acid sequences would happen accidentally. For example, a nucleic acid may be considered similar to a TRT nucleic acid if the smallest sum probability when comparing the test nucleic acid to a TRT nucleic acid is less than about 0.5, 0.2, 0 , 1, 0.01 or 0.001.
Alternatively, another indication that two nucleic acid sequences are similar is that the polynucleotide encoding the first nucleic acid cross-reacts immunologically with the polypeptide encoded by the second nucleic acid.
The terms "essential identity" or "essential similarity" as used in connection with a polypeptide refer to the degree of similarity between two polypeptides in which a polypeptide has a sequence of at least 70%, 80%, 85% or up to 100% Sequence identity includes, based on a reference sequence or most preferably 90% identity over a comparison window of about 10 to 20 amino acid residues. Amino acid sequence similarity or sequence identity is determined by optimizing the pairing of the residues, if necessary by introducing gaps, if necessary. See Needleham et al., J. Mol. Biol 48 (1970), 443-453; Sankoff et al.
(1983) Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison, Chapter One, Addison-Wesley, Reading, MA; and software packages from IntelliGenetics, Mountain View, CA and the University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI. It will be apparent to those skilled in the art that the terms "essential identity", "essential similarity" and "essential sequence identity" can be used interchangeably with respect to polypeptides or polynucleotides.
The term "substantially pure" or "substantially purified" as used herein, when referring to a composition containing a specified reagent, such as an antibody (e.g., an anti-hTRT antibody), means that the specified reagent is at least about 75 %, at least about 90%, at least about 95%, at least about 99% or more of the composition (without, for example, buffers). Thus, for example, a preferred immunoglobulin preparation according to the invention which specifically binds an hTRT polypeptide is essentially purified.
As used herein, a "telomerase negative" cell is a cell in which telomerase is not expressed, i.e. no catalytic activity of telomerase can be detected using a conventional assay or a TRAP assay for catalytic activity of telomerase. As used herein, a "telomerase positive" cell is a cell in which telomerase is expressed (i.e., telomerase activity can be detected).
As used herein, a "telomerase-related" disease or condition is a disease or condition in a subject that correlates with an abnormally high level of telomerase activity in the subject's cells, which is any telomerase activity for most normal somatic cells, or that correlates with a low level of telomerase activity that results in impairment of normal cell function. Examples of conditions related to telomerase include cancer (high telomerase activity in malignant cells) and infertility (low telomerase activity in germline cells).
The term "test compound" as used herein refers to any synthetic or natural compound or composition. This expression includes all organic and inorganic compounds including, for example, small molecules, peptides, proteins, sugars, nucleic acids, fatty acids etc.
XII. Examples
The following examples are intended to illustrate the present invention and are not intended to be limiting.
The following abbreviations are used in the following sections: eq (equivalents); M (molar); mu M (micromolar); N (normal), mole (mole), mmole (millimole) mole mole (micromole); nmoles (nanomoles); g (grams), mg (milligrams); mu g (microgram), ng (nanogram); l or L (liter), ml (milliliter), mu l (microliter); cm (centimeters); mm (millimeters); µm (microns), nm (nanometers); DEG C (degrees Celsius); RPN (ribonucleoprotein); remN (2 min -O-methylribonucleotides); dNTP (deoxyribonucleotide); dH2O (distilled water); DDT (dithiothreitol); PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride); TE (10mM Tris-HCl; 1mM EDTA, pH about 7.2); KGlu (potassium glutamate); SSC (salt and sodium citrate buffer); SDS (sodium dodecyl sulfate); PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis); Novex (Novex, San Diego, CA);
BioRad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), Pharmacia (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), Boehringer-Mannheim (Boehringer-Mannheim Corp., Concord, CA); Amersham (Amersham, Inc., Chicago, IL); Stratagene (Strategene Cloning Systems, La Jolla, CA); NEB (New England Biolabs, Beverly, MA); Pierce (Pierce Chemical Co., Rockford IL); Beckman (Beckman Instruments, Fullerton, CA), Lab Industries (Lab Industries, Inc., Berkeley, CA), Eppendorf (Eppendorf Scientific, Madison, WI); and Molecular Dynamics (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
example 1
Isolation of telomerase proteins and clones
The following example describes in detail the isolation of telomerase proteins and clones from different organisms, including the hTRT and S. pombe telomerasec DNA clones
A. Background
i) Introduction
The section provides an overview of purification and cloning, which is described in more detail in subsequent sections of this example. While telomerase RNA subunits have been identified in ciliates, yeast, and mammals, protein subunits of the enzyme as such were not identified prior to the present invention. Purification of telomerase from the protozoan Euplotes aediculatus yielded two proteins, designated p123 and p43 (see below; Lingner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 10712). Euplotes aediculatus is a hypotricher ciliate with a macronucleus that is approximately 8 x 10 <7> telomeres and about 3 x 10 <5> contains telomerase molecules.
After purification, the active telomerase complex showed a molecular weight of approximately 230 kD, which corresponds to an RNA subunit of 66 kD and two proteins of approximately 123 kD and 43 kD (see Lingner (1996) above). Experiments with photo-cross-linking indicated that the larger p123 protein was involved in the specific binding of the telomer DNA substrate (Lingner (1996), op. Cit.).
The p123 and p43 proteins were sequenced and the cDNA clones encoding these proteins were isolated. It was found that these Euplotes sequences are not related to the telomerase-associated proteins of Tetrahymena p80 and p95. Sequence analysis of Euplotes-p123 revealed the presence of reverse transcriptase (RT) motifs. Furthermore, a homologous yeast protein was found by the sequence analysis of the Euplote p123, which is referred to as Est2 protein (Lingner, Science 276 (1997), 561). The yeast Est2 has recently been shown to be essential for the maintenance of telomeres in vivo (Lendvay, Genetics 144 (1996), 1399), but has not been identified as a catalytic telomerase protein.
Site-directed mutagenesis showed that the RT motifs of yeast Est2 are essential for the synthesis of telomer DNA in vivo and in vitro (Lingner (1997) cited above).
ii) Identification and characterization of S. pombe telomerase
PCR amplification of S. pombe DNA was performed with degenerate sequence primers designed according to the Euplotes p123 RT motifs as described below. One of the four major PCR products generated was a 120 base pair band encoding a peptide sequence homologous to p123 and Est2. This PCR product was used as a probe in colony hybridization and thus two overlapping clones from a S. pombe genomic library and three from a S. pombe cDNA library could be identified. Sequence analysis revealed that none of the three S. pombe cDNA clones were full length, so reverse transcriptase (RT) -PCR was used to obtain sequences encoding the N-terminus of the protein.
Complete sequencing of these clones revealed a putative S. pombe telomerase RT gene, trt1. The full nucleotide sequence of trt1 has been deposited with GenBank under accession number AF015783. Analysis of the sequence revealed that trt1 encodes a basic protein with an estimated molecular weight of 116 kD. The homology to p123 and Est2 in the seven reverse transcriptase motifs was shown to be exceptionally high. These motifs are underlined and designated as motifs 1, 2, A, B, C, D and E (see Fig. 1). An additional telomerase-specific motif was found, which was referred to as the T motif. 15 introns in the size range from 36 to 71 base pairs interrupted the coding sequence.
To test S. pombe-trt1 as a catalytic subunit, two deletion constructs were created. In one, only motifs B to D in the RT domains were removed. The second removed 99% of the open reading frame.
Haploid cells that had grown from S. pombe spores from both mutants showed progressive telomeric shortening to the point where hybridization to telomer repeat units was practically undetectable. A trt1 <+> / trt1 <-> Diploid was sporulated and the resulting tetrads were segmented and germinated on a yeast extract medium supplemented with amino acid (a YES plate, Alfa, (1993) Experiments with Fission Yeast, Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor, NY). The colonies obtained from each spore were grown at 32 ° C. for 3 days and streaked on fresh YES plates every three days. One colony from each round was placed at 32 ° C. in 6 ml of a YES liquid culture and grown to the stationary phase. Genomic DNA was prepared.
After cleavage with ApaI, the DNA was electrophoresed on a 2.3% agarose gel, to confirm that approximately equal amounts were given in each lane, stained with ethidium bromide, then transferred to a nylon membrane and with a telomeric DNA probe hybridizes.
Senescence was indicated by the delayed onset of inability to grow on agar (typically the fourth streak after germination), by colonies with margins that were increasingly frayed (the ion morphology is shown in Figure 22B) and by a high Number of elongated cell fractions that increased more and more (as shown in Figure 22C). Cells were plated on minimal medium (Alfa, (1993), op. Cit.), With glutamic acid replaced by ammonium chloride, at 32 ° C. for 2 days before the photographing.
The separation of individual enlarged cells under the dissection microscope showed that the majority of the cells were not subject to any further division. The same telomerase negative (trt1 <->) Cell population always contained cells of normal size that continued to divide but often produced non-dividing offspring. The telomerase-negative surviving cells could use a recombination mode of telomer preservation, as documented for budding yeast strains with which various genes for telomer replication have been deleted (Lendvay (1996) op. Cit. And Lundblad Cell 73 (1993), 347.
iii) The identification and characterization of human telomerase
An EST (expressed sequence "tag") derived from human telomerase reverse transcriptase (hTRT) cDNA was identified by a BLAST search of the dbEST (expressed sequence "tag") gene bank database and designated as Genbank AA28196, the Euplotes-123 kD peptide and the corresponding nucleic acid sequences as well as the Schizosaccharomyces protein and corresponding cDNA (tez1) sequences were used. The AA281296 EST is 389 nucleotides in length and the positions of its residues in the hTRTcDNA clone (Fig. 16) lie between residues 1679 to 2076. A clone containing the EST sequence which is called clone # 712562 (Fig. 18) was obtained from the IMAGE Consortium (Human Genome Center, DOE, Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA).
This clone was obtained from a cDNA library of germinating B cells derived from a flow sorting of almond cells. Complete sequencing of this hTRT cDNA clone revealed the presence of all eight telomerase RT (TRT) motifs, as shown in Figure 1. This hTRT clone did not encode a contiguous region of TRT because the RT motifs B min, C, D and E were contained in a different open reading frame compared to the more N-terminally located RT motifs. In addition, the distance between RT motifs A and B was much smaller than that of the three previously known (non-human) TRTs.
To isolate a full length cDNA clone, a cDNA library derived from human cell line 293 (described above) that expresses high levels of telomerase activity was screened. A lambda cDNA library from cell line 293 was divided into 25 pools, each containing approximately 200,000 plaques. Each pool was screened by PCR with the primer sets 5 min -CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3 min and 5 min -GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3 min. Six sub-pools of a positive primary pool were further screened by PCR using the same primer pair. When screening the primary pool and the secondary sub-pool, hTRT was amplified with a total of 31 cycles, 45 seconds at 94 ° C., 45 seconds at 60 ° C. and 90 seconds at 72 ° C.
As a control, RNA of the "house-keeping" enzyme GAPDH was amplified using the primer pairs 5 min -CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3 min and 5 min -ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3 min with a total of 16 cycles, in each case 45 seconds at 94 ° C., 45 seconds at 55 ° C and 90 seconds at 72 ° C.
An hTRT-positive sub-pool from the secondary screening was then screened by plaque hybridization with a probe from the 5 min area of clone # 712562. One phage could be identified as positive (with the designation Lambda phage 25-1.1, ATCC 209024, deposited on May 12, 1997). It contained an insert of about 4 kilobases, which was excised and subcloned into the EcoRI site of the "Bluescript II SK +" vector (Stratagene, San Diego, CA) as an EcoRI fragment. This plasmid containing the cDNA clone was named pGRN121. The cDNA insert has a total length of about 4 kilobase pairs. The complete nucleotide sequence of the human hTRT cDNA (pGRN121) was deposited with Genbank (accession number AF015950) and with ATCC accession number ATCC 209016 on May 6, 1997.
B. Cultivation of Euplotes aediculatus
The cultures of E. aediculatus used in this example were developed by Dr. David Prescott, MCDB, University of Colorado. Dr. Prescott originally isolated this culture from water in a pond, but this organism is also available from the ATCC (ATCC # 30859). Cultures were grown as in Swanton et al., (Swanton et al., Chromosoma 77 (1980), 203) in 15 liter glass containers containing chlorogonium as a food source. The organisms were grown after reaching a density of about 10 <4> cells / ml harvested from the cultures.
C. Preparation of Nuclear Extracts
In this example, nuclear extracts from E. aediculatus were prepared using the method of Lingner et al., (Lingner et al., Genes Develop. 8 (1994) 1984) with the minor modifications described below. In summary, cells grown as described in Part B were concentrated with 15 µm Nytex filters and cooled on ice. The cell pellet was resuspended to a final volume of 110 ml TMS / PMSF / spermidine phosphate buffer. The TMS / PMSF / spermidine phosphate storage buffer was prepared by adding 0.075 g of spermidine phosphate (USB) and 0.75 ml of PMSF (from a 100 mM stock solution prepared in ethanol) to 150 ml of TMS. TMS contained 10 mM Tris acetate, 10 mM MgCl2, 85.5752 g sucrose / liter and 0.33297 g CaCl2 / liter, pH 7.5.
After resuspending in TMS / PMSF / spermidine phosphate buffer, 8.8 ml of 10% NP-40 and 94.1 g of sucrose were added. The mixture was placed in a siliconized glass beaker with a stainless steel stir bar attached to a motor above it. The mixture was stirred until the cells were completely lysed (about 20 minutes). The mixture was then centrifuged for 10 minutes at 7500 rpm (8950 x g) at 4 ° C. using a Beckman JS-13 swing-out rotor. The supernatant was removed and the pellet from nuclei was resuspended in TMS / PMSF / spermidine phosphate buffer, then again centrifuged for 5 minutes at 7500 rpm (8950 x g) at 4 ° C. using a Beckman JI-D-13 swing-out rotor.
The supernatant was removed and the pellet from nuclei was resuspended in a buffer containing 50 mM Tris acetate, 10 mM MgCl2, 10% glycerol, 0.1% NP-40, 0.4 M KGlu, 0.5 mM PMSF, pH -Value 7.5, using a buffer volume of 0.5 ml per 10 g of cells harvested. The resuspended nuclei were then homogenized in a "dounced" glass homogenizer with about 50 up and down movements and then centrifuged for 25 minutes at 14,000 rpm at 4 ° C. in an Eppendorf centrifuge. The supernatant containing the nuclear extract was collected, frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C. until used.
D. Purification of Telomerase
In this example, as described in Part C, prepared nuclear extracts were used to purify E. aediculatus telomerase. In this purification protocol, telomerase was first enriched by chromatography on an Affi-Gel heparin column and then extensively purified by affinity purification with an "antisense" oligonucleotide. Since the template region of telomerase RNA in the telomerase RNP particle is amenable to hybridization, an "antisense" oligonucleotide (ie the "affinity oligonucleotide") was synthesized as an "affinity bait" for the telomerase, which oligonucleotide was complementary to this template region . A biotin residue was added to the 5 min end of the oligonucleotide so that it could be immobilized on an avidin column.
After binding the telomerase to the oligonucleotide and washing thoroughly, the telomerase was eluted using a displacement oligonucleotide. The affinity oligonucleotide contained DNA bases which was not complementary to the telomerase RNA located 5 min to the telomerase-specific sequence. Because the displacement oligonucleotide was complementary to the affinity oligonucleotide along its entire length, it could form a thermodynamically more stable duplex than the telomerase bound to the affinity oligonucleotide. Thus, the addition of the displacement oligonucleotide resulted in the elution of the telomerase from the column.
In this example, nuclear extract prepared from 45 liter cultures was frozen until a total of 34 ml of nuclear extract could be obtained. This corresponded to 630 liters of culture (about 4 x 10 <9> cells). The nuclear extract was diluted to 410 ml with a buffer, with final concentrations of 20 mM Tris acetate, 1 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, 33 mM KGlu, 10% (v / v) glycerol, 1 mM dithiothreitol ( DTT) and 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) were obtained at a pH of 7.5.
The diluted nuclear extract was applied to an Affi-Gel heparin gel column (Bio-Rad) with a final volume of 230 ml and a diameter of 5 cm, equilibrated with the same buffer and with a 2 liter gradient from 33 to 450 mM KGlu eluted. The column was operated at a flow rate of one column volume / hour at 4 ° C. Fractions of 50 ml each were collected and examined for telomerase activity as described in Part D.
Telomerase eluted from the column at approximately 170 mM KGlu. Fractions containing telomerase (approximately 440 ml) were pooled and adjusted to 20 mM Tris acetate, 10 mM M9Cl2, 1 mM EDTA, 300 mM KGlu, 10% glycerol, 1 mM DTT and 1% Nonidet P-40. This buffer was named "WB".
For this preparation, 1.5 mmol of the two competitive DNA oligonucleotides (5 min -TAGACCTGTTAGTGTACATTTGAATTGAAGC-3 min) and
(5 min -TAGACCTGTTAGGTTGGATTTGTGGCATCA-3 min), 50 μg yeast RNA (Sigma) and 0.3 nmol biotin-labeled telomerase-specific oligonucleotide
(5 min -Biotin-TAGACCTGTTTA- (rmeG) 2- (rmeU) 4- (rmeG) 4-rmeG-3 min)) per ml of the pool. The 2-O-methylribonucleotides of the telomerase-specific oligonucleotides were complementary to the template region of the telomerase RNA; the deoxyribonucleotides were not complementary.
The inclusion of competitive, non-specific DNA oligonucleotides increased the effectiveness of the purification because the effects of nucleic acid binding proteins and other components in the mixture that would either bind to the affinity nucleotide or would remove the telomerase from the mixture were minimized.
This material was then added to an "Ultralink" immobilized "Neutravidin plus" (Pierce) column material at a volume of 60 μl suspension per ml pool. The column material was pre-blocked twice for 15 minutes each time using a preparation of WB containing 0.01% Nonidet P-40, 0.5 mg BSA, 0.5 mg / ml lysozyme, 0.05 mg / ml glycogen and 0 , 1 mg / ml yeast RNA contained. The blocking was carried out by means of a rotating disc so as to block the column material thoroughly. After the first and before the second blocking step, the column material was centrifuged at 200 x g for 2 minutes to pellet the matrix.
The mixture of pool and column was incubated on a rotating disk (about 10 rpm; lab industries) for 8 minutes at 30 ° C. and then again for 2 hours at 4 ° C., in order to allow binding. The pool and column mixture was then centrifuged at 200 x g for 2 minutes and the supernatant containing unbound material was removed. The pool and column mixture was then washed. This washing process comprised the following steps: rinsing the mixture of pool and column at 4 ° C. with WB, 15 minutes washing the mixture at 4 ° C. with WB, rinsing with WB, 5 minutes washing at 30 ° C. with 0.6 M KGlu and no WB containing Nonidet P-40, 5 minutes washing at 25 ° C. with WB and finally rinsing again with WB. That after the last exposure of tracks 25-30 of Fig. 31.
The lower exposure of Figure 33 was therefore made to allow visualization of the nucleotides that were added and the delay positions in extended products. The percentage of elongated substrate was quantified for every third line of a set on a "phosphor imager" as shown in Figure 31 below.
The effectiveness of these hairpin structures as a substrate was compared to double-stranded telomer-like structures with overhangs of different lengths. A model substrate that ended with four G residues (see lanes 1 to 15 of Figure 31) was not elongated if it contained a smooth end (see lanes 1-3). However, a slight elongation with an overhang length of two bases was observed. However, the extension became efficient when the overhang was about 4 bases long. Telomerase worked similarly with a double-stranded substrate that ended with four T residues, requiring a 6 base overhang for highly efficient elongation. The weak bands among the primers in lanes 10-15 of FIG. 31, which are independent of telomerase, represent shorter oligonucleotides in the primer preparations.
The weaker exposure of lanes 25-30 in FIG. 33 shows a ladder of elongated products, the darkest bands correlating with the presumed 5 min limit of the matrix (as described by Lingner et al., Genes Develop. 8 (1994) , 1984). The frequent occurrence of products that correspond to other positions in the template suggested that "pausing" and / or "dissociating" with the purified polymerase occurs at sites that do not correspond to the translocation site.
As shown in Figure 31, double-stranded, blunt-ended oligonucleotides were not substrates for telomerase. A competition experiment was carried out to find out whether these molecules could bind to telomerase. In this experiment, 2 nM 5 min end-labeled substrate with the sequence (G4T4) 2 or a hairpin substrate with an overhang of six bases with 0.125 mM telomerase were extended (FIG. 31, lanes 25-27). Although the same unlabeled oligonucleotide substrates competed efficiently with the labeled substrate for elongation, no decrease in activity was observed when the double-stranded, smooth-ended hairpin oligonucleotides were used as competitors, even in the presence of a 100-fold excess of hairpin structures.
These results indicated that double-stranded, blunt-ended oligonucleotides cannot bind at the concentrations of telomerase tested in this example, i.e. a single-stranded 3 min end is required for binding. This 3 min end is probably required for base pairing with the telomerase RNA template.
J. Cloning & sequencing of the 123 kD polypeptide
This example describes the cloning of the 123 kD polypeptide from telomerase (i.e. the 123 kD protein subunit). In this study, an internal fragment of the telomerase gene was amplified using PCR. Oligonucleotide primers were used that were designed to match the peptide sequences obtained from the purified polypeptide obtained in Part D above. The polypeptide sequence was determined using the "nanoES tandem" mass spectroscopy method known in the art and described by Calvio et al., RNA 1 (1995), 724-733. The oligonucleotide primers used in this example had the following sequences, with degenerate positions shown in parentheses:
EMI280.1
A 50 μl reaction contained 0.2 mM dNTPs, 0.15 μg E. aediculatus chromosomal DNA, 0.5 μl Taq (Boehringer Mannheim), each 0.8 μg primer and 1 × reaction buffer (Boehringer Mannheim) . The reaction was incubated in a "thermal cycler" (Perkin-Elmer), incubating for 5 minutes at 95 ° C., followed by 30 cycles of 1 minute each at 94 ° C., 1 minute at 52 ° C. and 2 minutes at 72 ° C. The reaction was completed by incubation at 72 ° C. for 10 minutes.
A genomic DNA library was prepared from the chromosomal DNA of E. aediculatus by cloning DNA with blunt ends into the site of the "pCR-Script" plasmid vector (Stratagene) called SmaI. This library was screened by colony hybridization with the radiolabeled gel-purified PCR product. The plasmid DNA from positive clones was prepared and sequenced according to the dideoxy method (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74 (1977), 5463) or manually using an automatic sequencer (ABI). The DNA sequence of the gene encoding this polypeptide is shown in Figure 13. The start codon derived from the DNA sequence is in this sequence at the nucleotide at position 101 and the open reading frame ends at position 3193.
Euplotes' genetic code differs from other organisms in that the "UGA" codon encodes a cysteine residue. The amino acid sequence of the polypeptide derived from the DNA sequence is shown in FIG. 14. It was assumed that no unusual amino acids were incorporated during translation and that there were no post-translational modifications.
K. Cloning and sequencing of the 43 kD polypeptide
This example describes the cloning of the 43 kD polypeptide from telomerase (i.e. the 43 kD protein subunit). In this study, an internal fragment of the telomerase gene was PCR amplified using oligonucleotide primers designed to match the peptide sequences obtained from the purified polypeptide obtained in Part D above. The polypeptide sequence was determined using the "nanoES tandem" mass spectroscopy methods known in the art and described by Calvio et al., RNA 1 (1995), 724-733. The oligonucleotide primers used in this example had the following sequences:
5 min -NNNGTNAC (C / T / A) GG (C / T / A) AT (C / T / A) AA (C / T) AA-3 min and
5 min - (T / G / A) GC (T / G / A) GT (C / T) TC (T / C) TG (G / A) TC (G / A) TT (G / A) TA- 3 min.
In this sequence, "N" means the presence of one of four nucleotides (i.e. A, T, G or C).
A 50 μl reaction contained 0.2 mM dNTPs, 0.2 μg E. aediculatus chromosomal DNA, 0.5 μl Taq (Boehringer Mannheim), each 0.8 μg primer and 1 × reaction buffer (Boehringer Mannheim) . The reaction was incubated in a "thermocycler" (Perkin-Elmer), incubating for 5 minutes at 95 ° C., followed by 30 cycles of 1 minute each at 94 ° C., 1 minute at 52 ° C. and 1 minute at 72 ° C. The reaction was completed by incubation at 72 ° C. for 10 minutes.
A genomic DNA library was prepared from the chromosomal DNA of E. aediculatus by cloning DNA with blunt ends into the site of the "pCR-Script" plasmid vector (Stratagene) called SmaI. This library was screened by colony hybridization with the radioactively labeled gel-purified PCR products. The plasmid DNA from positive clones was prepared and sequenced according to the dideoxy method (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74 (1977), 5463) or manually using an automatic sequencer (ABI). The DNA sequence of the gene encoding this polypeptide is shown in Figure 34. Three possible reading frames are shown for this sequence, as shown in FIG. 35. For the sake of clarity, the amino acid sequence is shown under the nucleotide sequence for all three reading frames.
These reading frames are labeled "a", "b" and "c". A possible start codon is encoded at nucleotide position 84 in reading frame "c". The coding region could end at position 1501 in reading frame "b". Premature stop codons, indicated by asterisks in this figure, occur in all three reading frames between nucleotide positions 337-350.
The "La domain" is identified by bold letters. Further downstream, the protein sequence appears to be encoded by different reading frames, since none of these reading frames is interrupted by stop codons. In addition, peptide sequences from the purified protein are encoded in all three reading frames. Thus this gene appears to contain intron sequences or, alternatively, the RNA is edited. Other options include ribosomal reading frame shifting or sequencing errors. However, the homology to the sequence of the La protein remains of great interest. It should be noted again that in Euplotes the "UGA" codon encodes a cysteine residue.
L. Comparisons of amino acids and nucleic acids
In this example, comparisons are made between published sequences and the sequences of the 123 kD and 43 kD telomerase polypeptide subunits.
i) Compare to the 123 kD telomerase subunit of E. aediculatus
The amino acid sequence of the 123 kD polypeptide from Euplotes aediculatus was compared to the sequence of the 80 kD telomerase protein subunit from Tetrahymena thermophila (GenBank accession number # U25641) to examine their similarity. The nucleotide sequence encoding this protein obtained from GenBank is shown in Figure 42. The amino acid sequence of this protein as obtained from GenBank is shown in Figure 43. The sequence comparison between the 123 kD protein from E. aediculatus and the 80 kD protein from T. thermophila is shown in FIG. 36. In this figure the sequence of E. aediculatus represents the upper sequence and the sequence of T. thermophila the lower sequence.
In this, as well as in FIGS. 37-39, identities are indicated by vertical bars, while individual dots between the sequences indicate amino acids with somewhat similarity and colons between the sequences indicate amino acids with greater similarity. The proven identity was about 19%, while the percentage of similarity was about 45%. These values are similar to those observed with any random protein sequence.
The amino acid sequence of the 123 kD polypeptide from Euplotes aediculatus was also compared to the sequence of the 95 kD telomerase protein subunit from Tetrahymena thermophila (GenBank accession number # U25642) to investigate the similarities. The nucleotide sequence encoding this protein obtained from GenBank is shown in FIG. 44. The amino acid sequence of the protein obtained from Gen-Bank is shown in Fig. 45 and the sequence comparison in Fig. 37. In this figure, the sequence of E. aediculatus is the upper sequence and the sequence of T. thermophila is the lower sequence. Identities are indicated by vertical bars. The identity observed was about 20%, while the percentage of similarity was about 43%. These values are similar to the values observed with any random protein sequence.
It is striking that the amino acid sequence of the 123 kD protein from E. aediculatus contains the five motifs which are characteristic of reverse transcriptases. The 123 kD polypeptide was also compared to the polymerase domains of various reverse transcriptases. Figure 40 shows the alignment of the 123 kD polypeptide with the putative yeast homolog (L8543.12 or ESTp). The amino acid sequence of L8543.12 (or ESTp) obtained from GenBank is shown in Figure 46.
Four motifs (A, B, C and D) were part of this comparison. In Fig. 40 highly preserved residues are identified by white letters on a black background. Remains of the sequences of E. aediculatus that are conserved in the other sequence are marked in bold. The "h" indicates the presence of a hydrophobic amino acid. The digits between the amino acid residues of the motifs indicate the amount of gaps within the sequences. For example, the "100" between motifs A and B refers to a gap of 100 amino acids in the sequence between motifs.
By searching the gene bank, a yeast protein (GenBank accession number # u20618) and the gene "L8543.12" (Est2) could be identified, which shows some homology to the 123 kD telomerase subunit of E. aediculatus. Based on the observation that both proteins contain reverse transcriptase motifs in their C-terminal regions; that both proteins have in common that they show similarity in areas outside the reverse transcriptase motif; that the proteins are similarly basic (pI = 10.1 for E. aediculatus and pI = 10.0 for yeast); and both proteins are large (123 kD for E. aediculatus and 103 kD for yeast) it can be concluded that these sequences encompass the catalytic core of their corresponding telomerases.
Based on this observation regarding the homology between two phylogenetically removed organisms such as E. aediculatus and yeast, it is assumed that human telomerase contains a protein that has the same characteristics (ie has reverse transcriptase motifs, is basic and large (> 100 kD)) .
ii) Compare with the 43 kD telomerase subunit of E. aediculatus
The amino acid sequence of the "La domain" of the 43 kD polypeptide from Euplotes aediculatus was compared to the sequence of the 95 kD telomerase protein subunit from Tetrahymena thermophila (described above) to examine their similarity. The sequence comparison is shown in Fig. 38. In this figure, the E. aediculatus sequence is the top sequence and the T. thermophila sequence is the bottom sequence. Identities are marked with vertical bars. The observed identity was about 23%, while the percentage of similarity was about 46%. These values are similar to those that you would observe with any random protein sequences.
The amino acid sequence of the "La domain" of the 43 kD polypeptide from Euplotes aediculatus was compared to the sequence of the 80 kD telomerase protein subunit from Tretrahymena thermophila (described above) to examine their similarity. The sequence comparison is shown in Fig. 39. In this figure, the sequence of E. aediculatus is the upper sequence and the sequence of T. thermophila is the lower sequence. Identities are marked with vertical bars. The observed identity was about 26%, while the percentage of similarity was about 49%. These values are similar to those that would be observed with any random red sequences.
The amino acid sequence of a domain of the 43 kD polypeptide from E. aediculatus was also compared to La proteins from numerous other organisms. These comparisons are shown in Fig. 41. In this figure, highly preserved residues are identified by white letters on a black background. Remains of the sequences of E. aediculatus that are conserved in the other sequence are marked in bold.
M. Identification of telomerase protein subunits in another organism
In this example, the sequences identified in the previous examples were used to identify the telomerase protein subunits of Oxytricha trifallax. This is a ciliate that is only distantly related to E. aediculatus. In this example, primers were selected based on the conserved region of the E. kediculatus 123 kD polypeptide, which included the motifs of the reverse transcriptase domain. Suitable primers were synthesized and used in a PCR reaction with total DNA from Oxytricha. Oxytricha DNA was prepared according to methods known in the art. The PCR products were then cloned and sequenced using methods known in the art.
The oligonucleotide sequences used for the primers were:
EMI287.1
Positions that were degenerate are shown in parentheses with the alternative bases shown in parentheses. "N" corresponds to any of the four nucleotides.
The PCR reaction (50 μl) contained 0.2 mM dNTPs, 0.3 μg chromosomal DNA from Oxytricha trifallax, 1 μl Taq polymerase (Boehringer Mannheim), in each case 2 μM primer, 1 × reaction buffer (Boehringer Mannheim ). The reaction mixture was incubated in a "thermocycler" (Perkin-Elmer) under the following conditions: 1 × 5 minutes at 95 ° C., 30 cycles for 1 minute each at 94 ° C., 1 minute at 53 ° C. and 1 minute at 72 ° C, then 1 x 10 minutes at 72 ° C. The PCR product was gel purified and by means of the dideoxy method (see, for example, Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (1977), 5463-5467) or other methods known in the art.
The amino acid sequence was derived from the PCR product and compared with the sequence of E. aediculatus. Fig. 47 shows the alignment of these sequences, the sequence of 0. Trifallax being shown in the top row and the E. aediculatus sequence being shown in the bottom row. As can be seen from this figure, there is a high degree of homology between the 0. Trifallax polypeptide sequence identified in this example and the polypeptide sequence of E. aediculatus. Thus, it is clear that the sequences identified in the present invention are useful for the identification of homologous telomerase protein subunits in other eukaryotic organisms. In fact, due to the development according to the invention, homologous telomerase sequences could be identified in numerous different species.
N.
Identification of telomerase sequences from Tetrahymena
In this example, a Tetrahymena clone was created that has homology with the Euplotes sequences and EST2p.
In this experiment, a PCR with degenerate oligonucleotide primers directed against conserved motifs was used in order to identify homology areas between Tetra hymena, Euplotes and EST2p sequences. The PCR method used in this example represents a new method that was designed for the specific amplification of rare DNA sequences from complex mixtures. This method avoids the problem of amplifying DNA products with the same PCR primer at both ends (i.e. products, a single primer) that is commonly encountered in PCR cloning procedures. These products of a single primer create an undesirable background and this can often complicate the amplification and detection of the desired product from two primers.
This method used in these experiments is preferably selected for products from two primers. The special thing is that one primer is biotinylated and the other is not. After several rounds of PCR amplification, the products are purified using magnetic streptavidin beads and products from two primers are specifically eluted by heat denaturation. This method is also used in other experiments that were not described in these examples. In fact, this method is in use in applications where it is desirable to amplify rare DNA sequences, including the initial steps in cloning procedures, e.g. 5 min and 3, RACE and any procedure that uses degenerate primers in PCR.
A first PCR run was performed using Tetrahymena macronuclear DNA as a template, which was isolated according to methods known in the art. A 24-mer forward primer was used with the sequence
5 min -Biotin-GCCTATTT (TC) TT (TC) TA (TC) (GATC) (GATC) (GATC) AC (GATC) GA-3 min, designated "K231", which corresponds to the FFYXTE range and the 23-mer reverse primer with the sequence
5 min -CCAGATAT (GATC) A (TGA) (GATC) A (AG) (AG) AA (AG) TC (AG) TC-3 min, which is referred to as "K220" and the DDFL (FIL) I area speaks accordingly. This PCR reaction contained 2.5 μl DNA (50 ng), 4 μl each of primer (20 μμM), 3 μl 10 × PCR buffer, 3 μl 10 × dNTPs, 2 μl Mg, 0, 3 ml Taq and 11.2 ml dH2O. 8 cycles were carried out with the mixture, in each case 45 seconds at 94 ° C. 45 seconds at 37 ° C. and 1 minute at 72 ° C.
The mixture of the PCR reaction was bound to 200 μl magnetic streptavidin beads, washed with 200 μl TE, resuspended in 20 μl dH2O and then heat-denatured by boiling at 100 ° C. for 2 minutes. The beads were pulled down and the eluate was removed. Thereafter, 2.5 μl of this eluate was amplified again under the above conditions, with the exception that 0.3 μl of alpha - <3> <2> P dATP was included and 33 PCR cycles were carried out. The reaction mixture was separated on a denaturing 5% polyacrylamide gel and the appropriate area was cut out of the gel. These products were amplified again with a further 34 cycles under the conditions enumerated above, except that the addition temperature was 42 ° C.
A second PCR run was performed using Tetrahymena macronuclear DNA isolated using methods known in the art as a template, with the 23-mer forward primer sequence 5 min
EMI290.1
with the designation "228" was used, which corresponds to the region R (LI) (LI) PKK and a reverse primer with the sequence 5 min
EMI290.2
with the designation "K224", which corresponds to the CYDSIPR range. This PCR reaction contained 2.5 μl DNA (50 ng), 4 μl each of primer (20 μμM), 3 μl 10 × PCR buffer, 3 μl 10 × dNTPs, 2 μl Mg, 0, 3 ml alpha - <3> <2> P-dATP, 0.3 ml Taq and 10.9 ml dH2O. The reaction mixture was separated on a denaturing 5% polyacrylamide gel and the appropriate area was cut out of the gel. These products were amplified again with 34 additional cycles under the conditions specified above, except that the annealing temperature was 42 ° C.
10 μl of the reaction product from Run 1 was bound to magnetic streptavidin-coated beads in 200 μl TE. The beads were washed with 200 μl TE and then resuspended in 20 μl dH2O, heat denatured and the eluate was removed. The reaction product from Run 2 was then added to the beads and diluted with 30 µl 0.5 x SSC. The mixture was heated to 94 ° C. and allowed to cool to 50 ° C. The eluate was removed and the beads were washed three times in 0.5 x SSC at 55 ° C. The beads were then resuspended in 20 µl dH2O, heat denatured, and the eluate labeled "Round 1 Eluate" removed and stored.
To isolate the Tetrahymena band, the round 1 eluate with the forward primer K228 and the reverse primer K227 with the sequence 5 min =
EMI291.1
which corresponds to the DIKSCYD range, amplified again. The PCR reactions were carried out as described above. The reaction products were separated on a 5% polyacrylamide gel, the band corresponding to approximately 295 nucleotides was cut out of the gel and sequenced.
The clone labeled 168-3 was sequenced. The following DNA sequence (including the primer sequences) was found:
EMI292.1
An additional sequence of this gene was obtained by PCR using a new primer designed to mate with the sequence of 168-3 ("K2-97" with the sequence 5 min -GAGTGACATAATATACGTGA-3 min; and primer K231 (FFYXTE) The sequence of the fragment obtained from this reaction, together with 1683, is as follows (without the primer sequences):
EMI292.2
The amino acid sequence corresponding to this DNA fragment is:
EMI292.3
This amino acid sequence was aligned against other telomerase genes (EST2p and Euplotes). The orientation is shown in Fig. 53. A "consensus" sequence is also shown in this figure.
P. Identification of Schizosaccharomyces pombe Telomerase Sequences
In this example, the S. pombe tez1 sequence was identified as a homologue of E. aediculatus p123 and S. cerevisiae Est2p.
55 shows a summary of these experiments. In this figure, the upper region (part A) shows the relationship between the two overlapping genomic clones and the 5825 bp region that was sequenced. The region labeled "tez1" corresponds to the protein-coding region, the flanking sequences also being shown. The box below the 5825 bp range is an approximately 2 kb Hind III fragment used to prepare the tez1 disruption construct as described below.
The lower half of Fig. 55 (Part B) is an "broken down" scheme of the same DNA region. The "original PCR" sequence is the original degenerate PCR fragment generated with the degenerate pair of oligonucleotides based on the sequence of motif 4 (B min) and motif 5 (C) from Euplotes, such as described in the previous examples.
i) PCR with degenerate primers
A PCR using the genetic primers was used to find the protein p123 of E. aediculatus homologous in S. pombe. Figure 56 shows the sequences of the degenerate primers used in this reaction (designated "poly 4" and "poly 1"). The PCR runs were carried out under the same buffer conditions as described in the examples above (see, for example, part K above) with a 5-minute "ramp" time of 94 ° C., after which cycles were repeated for 30 seconds at 94 ° C. for 45 seconds Connect at 50 ° C and seconds at 72 ° C, then 7 minutes at 72 ° C, and then the reaction mixture was stored at 4 ° C. The PCR runs were carried out under different conditions (i.e. different concentrations of S. pombe DNA and different MgCl2 concentrations).
The PCR products were separated on agarose gels and stained with ethidium bromide as described above. Different PCR runs resulted in the production of 3 bands (labeled "T", "M1" and "B"). These bands were amplified again under the same conditions as described above and separated on gels. After this re-amplification, four bands were observed ("T", "M1", "M2" and "B") as shown in Fig. 57. These four bands were then re-amplified under the same conditions as described above. The third band from the top of the lane in Figure 57 was identified as a band that contained the correct sequence for a telomerase protein. It was found that the PCR product labeled M2 fits relatively well with other telomerase proteins, as shown in FIG. 58.
In addition to the orientation shown, this figure also shows the actual sequence of tez1. In this figure, asterisks denote residues that have all four sequences in common (Oxytricha "OT"; E. aediculatus "Ea_p123", S. cerevisiae "Sc_p103" and M2), and the circles (i.e. dots) denote similar amino acid residues.
ii) 3 min RT PCR
In order to obtain additional sequence information, 3 min and 5 min RT-PCR were carried out on the telomerase candidate shown in FIG. 58. 59 shows a schematic of the 3 min RT-PCR strategy used. First, using the oligonucleotide primer "QT" (5 min -CCA GTG AGC AGA GTG ACG AGG ACT CGA GCT CAA GCT TTT TTT TTT TTT TT-3 min; prepared from mRNA cDNA, then this cDNA as a template for OCR with "QO" (5 min -CCA GTG AGC AGA GTG ACG-3 min; used and a primer designed based on the original degenerate PCR reaction (ie "M2-T" with the sequence 5 min -G TGT CAT TTC TAT ATG GAA GAT TTG ATT GAT G-3 min).
The second PCR reaction (i.e. "nested" PCR) was performed with "QI" (5 min -GAG GAC TCG AGC TCA AGC-3 min); and another PCR primer designed with a sequence derived from the original degenerate PCR reaction or "M2-T2" with the sequence 5 min -AC CTA TCG TTT ACG AAA AAG AAA GGA TCA GTG-3 min; carried out. The buffers used in this PCR corresponded to those described above, the amplification carried out starting with a 5-minute "ramp up" at 94 ° C., after which 30 cycles of 30 seconds each at 94 ° C., 30 seconds at 55 ° C. and 3 minutes Connect at 72 ° C., then the mixture was incubated at 72 ° C. for 7 minutes. The reaction products were stored at 4 ° C. until used.
iii) Screening of genomic and cDNA libraries
After receiving this additional sequence information, various genomic and cDNA libraries were screened in order to be able to identify all banks which contained this candidate for the telomerase gene. The procedure used as well as the gene banks and results are shown in FIG. 60. In this figure, part A lists the gene banks tested in this experiment; Part B shows the areas used; parts C and D show the results of the dot blot hybridization obtained with these banks. Positive libraries were then screened to obtain the tez1 genomic gene and a cDNA version of the tez1 gene by colony hybridization. In this experiment, approximately 3 x 10 <4> Colonies were screened by the HindIII genomic library and six positive clones were identified (approximately 0.01%).
Then DNA from two independent clones (A5 and B2) was prepared. Figure 61 shows the results obtained with HindIII-cleaved positive genomic clones A5 and B2.
In addition, cDNA REP banks were used. There were about 3 x 10 <5> colonies were screened and 5 positive clones (0.002%) were identified. DNA was prepared from three independent clones (2-3, 4-1 and 5-20). In later experiments it was found that 2-3 and 5-20 contained identical insertions.
iv) 5 min RT-PCR
Since the cDNA version of the gene product was not complete up to this point, a 5 min RT-PCR was performed to obtain a full length clone. The strategy is shown schematically in Fig. 62 shown. In this experiment, cDNA was prepared using the DNA oligonucleotide primer "M2-B" (5 min -CAC TGA TCC TTT CTT TTT CGT AAA CGA TAG GT-3 min); and "M2-B2" (5 min -C ATC AAT CAA ATC TTC CAT ATA GAA ATG ACA3 min); that were designed based on known and previously identified areas of tez1. An oligonucleotide linker "PCR Adapt SfiI" with a phosphorylated 5 min end ("P") (p-GGG CCG TGT TGG CCT AGT TCT CTG CTC3 min); was then ligated to the 3 min end of this cDNA and this construct was used as the template for a "nested" PCR. In the first round of PCR, PCR Adapt SFI and M2-B were used as primers.
In the second round, PCR Adapt SfiII (5-GAG GAG GAG AAG AGC AGA GAA CTA GGC CAA CAC GCC CC-3 min); and M2-B2 (5 min -ATC AAT CAA ATC TTC CAT ATA GAA ATG ACA-3 min); used as a primer. "Nested" PCR was used to increase the specificity of the reaction.
v) sequence alignments
After the sequence of tez1 was determined, it was compared to sequences previously described. Fig. 63 shows the alignment of reverse transcriptase (RT) domains from telomerase catalytic subunits of S. pombe ("S. p. Tez1p "), p. cerevisiae "S. c. Est2p "), and E. aediculatus p123 (E. a. p123 "). In this figure, "h" denotes hydrophobic residues, "p" small polar residues and "c" charged residues. The amino acid residues indicated above the alignment show Y's "Consensus" RT motif. Xiong and T. H. Eickbush (Y. Xiong and T. H. Eickbush, EMBO J. 9 (1990) 3353-3362). The asterisks indicate the residues that are conserved in all three proteins. "Motif 0" was identified here as a motif that is specific for this telomerase subunit and is generally not found in reverse transcriptases.
It is therefore valuable in order to be able to identify other amino acid sequences as good candidates for catalytic telomerase subunits.
Fig. 64 shows the alignment of the entire sequences of Euplotes ("Ea_P123"), p. cerevisiae ("Sc_Est2P") and S. pombe ("Sp_Tez1p"). In part A, shaded areas indicate residues that both sequences have in common. In Part B, shaded areas denote residues that all three sequences have in common.
vi) Genetic Disruption of tez1
In this example, the effects of tez1 disruption were examined. Since telomerase is involved in the maintenance of telomeres, it was assumed that if tez1 is actually a component of telomerase, the disruption of tez1 should lead to a gradual telomer shortening.
In these experiments, the specific disruption of the tez1 gene in S. pombe homologous recombination used. This procedure is shown schematically in Fig. 65 shown. As in Fig. At 65, wild type tez1 was exchanged for a fragment containing the ura4 or LEU2 marker.
The disruption of the tez1 gene was confirmed by PCR (Fig. 66) and a Southern blot was carried out to check the telomer length. Fig. 67 shows the Southern blot results of this experiment. Since an ApaI restriction enzyme site is immediately adjacent to a telomeric sequence in S. pombe is present, allows the cleavage of genomic DNA preparations from S. pombe the analysis of telomere length. Thus DNA from S. pombe cut with ApaI, the cleavage products were separated on an agarose gel and these were then hybridized with a probe specific for a telomer sequence in order to find out whether the telomeres of the disrupted S. pombe cells were shortened. The results are shown in Fig. 67 shown. From these results it could be concluded that disruption of the tez1 gene caused a shortening of the telomeres.
Q.
Cloning and characterization of human telomerase protein and cDNA
In this example, information regarding the nucleic acid sequence and amino acid sequence for human telomerase was obtained. Partially homologous sequences were first identified using a BLAST search using the Euplotes 123 kD peptide and nucleic acid sequences as well as the sequences of the Schizosaccharomyces protein and the corresponding cDNA (tez1) sequence. The human sequences (also with "hTCP1. 1 ") were determined from a partial cDNA clone (clone 712562). Sequences from this clone were aligned against the sequences determined as described in previous examples.
Fig. Figure 1 shows the sequence alignment of Euplotes ("p123") Schizosaccharomyces ("tez1"), Est2p (i.e. H. the protein of S. encoded by the Est2 nucleic acid sequence cerevisiae, also here with "L8543. 12 ") and the human homologue identified in this comparison search. Fig. 51 shows the amino acid sequence of tez1 and FIG. 52 the DNA sequence of tez1. In Fig. 52, the introns and other non-coding areas are shown in small letters and the exons (i.e. H. coding areas) in capital letters.
As in Fig. 75, there are areas that are highly conserved among these proteins. For example, this figure shows that there are identity areas "motif 0", "motif 1", "motif 2" and "motif 3". The identical amino acids are identified by an asterisk (*) and the similar amino acid residues by a circle (& cirf &). This shows that there are areas within the telomerase motifs that are conserved within a large number of eukaryotes, which range from yeast to ciliate to human. It is believed that other organisms also contain such conserved sequence regions. Fig. 49 shows the partial amino acid sequence of the clone encoding human telomerase motifs and FIG. 50 the corresponding DNA sequence of the Genbank clone # AA281296.
To complete the information on the sequence of Genbank clone # AA281296, Sanger dideoxy sequencing and other methods known in the art were used. Some of the primers used in sequencing are shown in Table 7. These primers were designed to hybridize to the clone (GenBank accession number # AA281296); this was based on sequence complementarity to either the sequence of the plasmid backbone or the sequence of insertion of the human cDNA into the clone.
EMI300. 1
Based on these experiments, it was found that the EcoRI-NotI insert of Genbank clone # AA281296 contains only a partial open reading frame for the human telomerase protein, but it could encode an active fragment of this protein. The open reading frame in the clone encodes a protein of approximately 63 kD. The sequence of the longest open reading frame found is shown in Fig. 68 shown. The open reading frame (ORF) begins at the ATG codon with the "met" marked in the figure. The poly A tail at the 3 min end of the sequence is also shown. Fig. 69 shows a preliminary alignment of telomerase reverse transcriptase proteins from the human sequence (human telomerase "Core Protein 1", "HS TCP1"), E. aediculatus p123 ("Ep p123"), p. pombe tez1 ("Sp Tez1"), p. cerevisiae EST2 ("Sc Est2") and the "Consensus" sequence.
Various motifs are given in this figure.
In order to obtain a complete clone, the hybridization of a cDNA library and 5 min -RACE were carried out in order to obtain clones which encode regions of regions which have not yet been cloned. In these experiments, RACE was used to generate material for a sequence analysis (rapid amplification of cDNA ends, "Rapid Amplification of cDNA Ends"; see e.g. B. M. A. Frohman, "RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends," in Innis et al. (Ed. ) PCR protocols: A Guide to Methods and Applications (1990) p. 2838, and Frohman et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8998-9002 (1988)). Four such clones were generated and used to provide additional 5 min sequence information (pFWRP5, 6, 19 and 20).
In addition, human cDNA libraries (inserted in lambda) were hybridized with the EcoRI-NotI fragment of the clone (# AA281296). A lambda clone called "lambda 25-1. 1 "(ATCC accession number # 209024) was found which contained complementary sequences. Fig. 75 shows a restriction map of this lambda clone. The insertion of human cDNA was subcloned from this clone as an EcoRI restriction fragment into the EcoRI site of the commercially available "phagemid" pBluescriptIISK + (Stratagene), creating the plasmid "pGRN121" which was deposited with the ATCC (ATCC- Accession number # 209016). Preliminary results showed that the plasmid pGRN121 contains the complete sequence of the open reading frame (ORF) encoding the human telomerase protein.
The cDNA insert from plasmid pGRN121 was sequenced using methods known in the art. Fig. 70 shows a map of the plasmid pGRN121 with regard to restriction sites and function, the determination of which is based on this preliminary work. The results of this preliminary sequence analysis are shown in Fig. 71 shown. Based on this analysis, and as in Fig. 70, a putative starting point for the coding region was found at a position approximately 50 nucleotides from the EcoRI site (located at position 707) and the location of the telomerase-specific motifs "FFYVTE", "PKP", "AYD", "QG" and "DD". In addition, a putative stop point was found at nucleotide # 3571 (see Fig. 72). Fig. 72 shows the DNA sequences and corresponding amino acid sequences for the open reading frames in the sequence ("a", "b" and "c").
However, due to the preliminary nature of this early sequencing work, it turned out that the reading frames for the various motifs were not correctly aligned.
An additional analysis performed with pGRN121 showed that the plasmid contained significant regions of the 5 min end of the coding sequences which are not present on the Genbank clone with the accession number # AA281296. It was further found that pGRN121 contains a variant of the coding sequence which contains an insertion of approximately 182 nucleotides. This insertion was found to be missing in the Genbank clone with accession number # AA281296. Variants like the E. aediculatus sequences are tested in functional assays, for example telomerase assays, in order to be able to detect the presence of a functional telomerase in a sample.
The cDNA sequence of pGRN121 could be determined by a further sequence analysis, whereby a coherent open reading frame was found which contains a protein with a molecular weight of approx. 127,000 daltons and 1132 amino acids, as shown in FIG. 74 shown, encoded. An improved map of pGRN121 based on this analysis is shown in Fig. 73 shown. The results of the additional sequence analysis of the hTRT cDNA are shown in FIG. 16 shown.
Example 2
The correlation between hTRT frequency and cell immortality
The relative abundance of hTRT mRNA was assessed in six strains of telomerase-negative mortal cells and six cell lines of telomerase-positive immortal cells (Fig. 5). The steady state of minor levels of hTRT mRNA was significantly increased in immortal cells that were previously shown to have active telomerase. Lower levels of hTRT mRNA were found in some strains of telomerase negative cells.
RT-PCR was carried out for hTRT, hTR, TP1 (telomerase-associated protein, which is related to Tetrahymena p80 (Harrington et al. , Science 275 (1997) 973 and Nakayama et al. , Cell 88 (1997), 875)) and GAPDH (to normalize for equal amounts of RNA template) with RNA derived from the following cells: (1) human fetal lung fibroblasts GFL, (2) human fetal skin fibroblasts GFS , (3) adult prostate stromal fibroblasts 31 YO, (4) human fetal knee synovial fibroblasts HSF, (5) neonatal foreskin fibroblasts Bi, (6) human fetal lung fibroblasts IMR90 and the immortalized cell lines: (7) melanoma LOX IMVI, (8) Leukemia U251, (9) Lung cancer NCI H23, (10) Colon adenocarcinoma SW620, (11) Breast tumor MCF7, (12) 293 Adenovirus E1-transformed human embryonic kidney cell line.
hTRT nucleic acid was amplified by cDNA using the oligonucleotide primers LT5 and LT6 (Table 2) with a total of 31 cycles (94 ° C 45 s, 60 ° C 45 s, 72 ° C 90 s). GAPDH was amplified using the primer K136 (CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA) and K137 (ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA) with a total of 16 cycles (94 ° C 45 s, 55 ° C 45 s, 72 ° C 90 s). hTR was amplified with the primers F3B (TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG) and R3c (GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG) with a total of 22 cycles (94 ° C 45 s, 55 ° C 45 s, 72 ° C 90 s). TP1 mRNA was primed with TP1. 1 and TP1. 2 amplified in 28 cycles (the cycles were the same as for hTRT). The reaction products were separated on an 8% polyacrylamide gel, stained with "SYBR Green" (Molecular Probes) and visualized by scanning on a "Storm 860" (Molecular Dynamics).
The in Fig. Results shown in FIG. 5 show that hTRT mRNA levels correlate directly with the levels of telomerase activity in the cells tested.
Example 3
Characterization of an hTRT intron sequence
A suspected intron was first identified by PCR amplification of human genomic DNA as described in this example, and the result was subsequently confirmed by sequencing the genomic clone lambda G PHI 5 (see Example 4). PCR amplification was carried out using the forward primer TCP1. 57 performed in combination with the individual reverse primers TCP1. 46, TCP1. 48, TCP1. 50, TCP1. 52, TCP1. 54, TCP1. 56 and TCP1. 58 was combined (see Table 2). The products of genomic DNA amplified with TCP1. 57 / TCP1. 46, TCP1. 48, TCP1. 50, TCP1. 52, TCP1. 54 or TCP1. 56 were about 100 base pairs longer than the products of the pGRN121 amplifications. The amplification with TCP1. 57 / TCP1. 58 was the same when using genomic DNA and pGRN121 DNA.
This showed that the genomic DNA inserted between the sites for TCP1. 58 and TCP1. 50 contained. The PCR products from TCP1. 57 / TCP1. 50 and TCP1. 57 / TCP1. 52 were without subcloning with the primers TCP1. 39, TCP1. 57 and TCP1. 49 directly sequenced.
As shown below, the 104 base intron sequence (SEQ. ID. No. 7) (Fig. 12) in the hTRT mRNA (shown in bold) on the compound that bases 274 and 275 of SEQ. ID. No. 1 corresponds to:
EMI305. 1
"/" denotes the splice points, the sequence shows good agreement with the "Consensus" -5 min and 3 min splice point sequences, which are typical for human introns.
This intron contains motifs that are characteristic of a cleavage site for topoisomerase II and an NFKB binding site (see FIG. 21). These motives are partly of interest because the expression of topoisomerase II is highly regulated in most tumors. Topoisomerase II relaxes DNA by cutting and retrieving the DNA, which increases the expression of certain genes. It has been shown that inhibitors of topoisomerase II act as anti-tumor agents. In the case of NFKB, this transcription factor could play a role in the regulation of telomerase during terminal differentiation.
NFKB could play a role in the early repression of telomerase during development and is therefore another target for therapeutic intervention in regulating telomerase activity in cells.
Example 4
Cloning of the lambda phage G PHI 5 and characterization of genomic hTRT sequences
a) Lambda G PHI 5
A human genomic DNA library was screened by PCR and hybridization, and a genomic clone containing sequences encoding hTRT-RNA was found. The bank is a genomic bank of human fibroblasts made using DNA from W138 lung fibroblast cells (Stratagene, catalog # 946204). In this bank, partial Sau3AI fragments are inserted into the XhoI site of the lambda vector FIXRII (Stratagene) with an insertion size of 9-22 kb.
This genomic bank was divided into pools of 150,000 phages each and each pool was screened by "nested" PCR (outer primer pair TCP1. 52 & TCP1. 57; inner primer pair TCP1. 49 & TCP1. 50, see table 1). These primer pairs span a suspected intron (see Example 3 above) in the hTRT genomic DNA and ensure that the PCR product was from a genomic source and not from contamination by the hTRTcDNA clone. Positive pools were further divided until a pool of 2000 phages was obtained. This pool was plated out at low density and by hybridization with a DNA fragment that the base pairs 1552-2108 of SEQ. ID. No. 1 includes (restriction sites SphI or EcoRV) screened.
Two positive clones were isolated and screened again via "nested" PCR as described above. Both clones were positive on the edge of the PCR. One of the clones (lambda G PHI 5) was cleaved with NotI, which showed an insertion size of about 20 kb. The subsequent mapping (see below) showed an insertion size of 15 kb and showed that the phage G PHI 5 contains about 13 kb of DNA upstream from the starting point of the cDNA sequence.
The phage G PHI 5 was mapped by restriction enzyme cleavage and DNA sequencing. The map obtained is shown in Fig. 7 shown. The phage DNA was digested with NcoI and the fragments cloned into pBBS167. The subclones obtained were screened by PCR to identify those containing sequences corresponding to the 5 min region of the hTRT cDNA. A subclone (pGRN140) containing a 9 kb NcoI fragment (with the hTRT gene sequence and 4 to 5 kb of the lambda vector sequence) was partially sequenced to determine the orientation of the insert. pGRN 140 was cut with SalI to remove lambda vector sequences to give pGRN144. pGRN144 was then sequenced. Preliminary sequencing results are shown in Fig. 76 and the results of further sequencing are shown in SEQ. ID. No. 6 (Fig. 21) provided.
The 5 min end of the hTRT mRNA corresponds to the base 2441 of SEQ. ID. No. 6 (Fig. 21). As in Fig. As shown in Figure 7, two Alu sequence elements are 1700 base pairs upstream of the 5 min end of the hTRT cDNA and these are likely to provide the upstream limit on the promoter region of hTRT. The sequence also has an intron located at base 4173 (SEQ. ID. No. 6) (Fig. 21) is located 3 minutes from the intron described in Example 3 above.
b) Additional genomic clones
In addition to the genomic clone described above, two P1 bacteriophage clones and a human BAC clone are provided as illustrative embodiments of the invention. The P1 insertions are typically 75 to 100 kb in length and the BAC insertions are typically greater than 100 kb.
The P1 clones (DMPC-HFF # 1-477 (F6) -GS # 15371 and DMPC-HEF # 1-1103 (H6) -GS # 15372) were obtained by PCR screening of a human P1 library by human Foreskin fibroblast cells (Shepherd et al. , PNAS USA 91 (1994) 2629) where the primers TCP1. 12 and UTR2 were used to amplify the 3 min end of hTRT. These clones were both negative with primers that amplify the 5 min end of hTRT (i.e. H. no amplification took place).
The human BAC clone (326 E 20) was hybridized to a human genomic BAC library using an 1143 bp SphI / XmnI fragment from SEQ. ID. No. 1 (bases 1552-2695) obtained, which includes the RT motif area. This clone is believed to contain the 5 min. It is believed that the genomic hTRT clones in this example encompass the entire hTRT gene.
Example 5
Chromosomal location of the hTRT gene
The hTRT gene was located on chromosome 5p by "radiation hybrid" mapping (Boehnke et al. , At the. J. Hum. Genet. 49 (1991) 1174 and Walter et al. , Nature Genet. 7 (1994) 22) using the "medium resolution Stanford G3 panel" of 83 RH clones of the entire human genome (generated at the Stanford Human Genome Center). A human lymphoblastoid cell line (donor; rM) was exposed to 10,000 rad X-rays and then fused with non-irradiated hamster recipient cells (A3). 83 independent hybrid clones from somatic cells were isolated, each clone representing a fusion event between an irradiated donor cell and a hamster recipient cell. The DNA from panel G3 was used to order markers in the desired area and to establish the distance between these markers.
The primers used for RH mapping were TCP1. 12 and UTR2, where 45 cycles with Taq buffers from Boehringer Mannheim and Taq polymerase from Perkin-Elmer were used, in each case 45 seconds 94 ° C., 45 seconds 55 ° C. and 45 seconds 72 ° C. The 83 pools were amplified independently and 14 (17%) were positive for hTRT (by occurrence of a 346 bp band). The amplification results were entered into the "Stanford RH server" which then provided the card position 5p and the next marker, STS D5S678.
By querying the "Genethon genom mapping" website, a YAC was identified during the mapping, which contains the STS marker D5S678: CEPH YAC 780_C_3, size: 390 660 kb. This YAC also contained markers for chromosome 17. This result indicated that the hTRT gene is on chromosome 5, near the telomer end. In a number of tumors there are increased number of copies for 5p. The cat cry syndrome has also been mapped to deletions in this area.
Example 6
Design and construction of vectors for the expression of hTRT proteins and polynucleotides
Expression of hTRT in bacteria
The following example describes in detail the design of hTRT-expressing bacterial expression vectors with which large amounts of biologically active full-length hTRT (SEQ. ID. No. 2) can be manufactured. The production of biologically active hTRT protein in this manner is useful for telomerase reconstitution assays, for the study of modulators of telomerase activity, for the analysis of the activity of newly isolated species of hTRT, for the identification and isolation of compounds that associate specifically with hTRT, for the analysis of the activity of an hTRT protein variant that has been site-specifically mutated as described above, and as an immunogen, to name just a few examples.
The bacterial expression vector pThioHis A / hTRT
For large amounts of hTRT (SEQ. ID. No. 2) To be able to produce the full length, the bacterial expression vector pThioHis A (Invitrogen, San Diego, CA) was selected as the expression system. The hTRT-encoding insert contains nucleotides 707 to 4776 of the hTRT insert in plasmid pGRN121 (SEQ. ID. No. 1). This nucleotide sequence contains the complete coding sequence of the hTRT protein (SEQ. ID. No. 2).
This expression vector according to the invention can be designed for inducible expressions in bacteria. Expression can be induced to occur in E. encode coli high levels of a fusion protein composed of a cleavable, "HIS-tagged" thioredoxin moiety and the full-length hTRT protein. The expression system was used essentially according to the manufacturer's instructions. The amino acid sequence of the vector-encoded fusion protein obtained according to the invention is shown below: (- * -) denotes a cleavage site for enterokinase;
EMI310. 1
EMI311. 1
pGEX-2TK with hTRT nucleotides 3272-4177 from pGRN121
This construct according to the invention is used for the production of fusion protein, for example in order to be able to obtain polyclonal and monoclonal antibodies against the hTRT protein. Fragments of hTRT can also be used for other purposes, for example to modulate telomerase activity, e.g. B. as a dominant-negative mutant or to prevent association of telomerase with other proteins or nucleic acids.
To produce large amounts of an hTRT protein fragment, the E. coli expression vector pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N. J. ) selected and used essentially according to the manufacturer's instructions. An expression system according to the invention was thus produced. The construct obtained contains an insert which is derived from nucleotides 3272 to 4177 of the hTRT insert in the plasmid pGRN121. The vector controls the expression of high levels of a fusion protein in E. coli consisting of the glutathione-S-transferase sequence (underlined below), the cleavage sequence for thrombin (double underlined), the recognition sequence for cardiac muscle protein kinase (italics), residues introduced by cloning (in brackets, GSVTK) and the hTRT protein fragment (in bold) (SEQ. ID. No. 38) as shown below:
EMI312. 1
When this fusion protein was expressed, insoluble aggregates were formed. It was treated generally as described above in the section "Purification of proteins from inclusion bodies". Induced cells were suspended in PBS (20 mM sodium phosphate, pH 7.4 and 150 mM NACl) and broken up by ultrasound treatment. NP-40 was added up to 0.1% and the mixture was incubated for 30 minutes at 4 ° C. with gentle mixing. The insoluble material was obtained by centrifugation at 25,000 g at 4 ° C. for 30 minutes. The insoluble material was washed once in 4 M urea in PBS, collected by centrifugation and then washed again in PBS. It was estimated that the pellet obtained contained more than 75% fusion protein.
This material was quickly dried in a vacuum, then suspended in an adjuvant for injection into mice and rabbits to generate antibodies. The recombinant protein is separated from the glutathione S-transferase unit by site-specific proteolysis using thrombin in accordance with the manufacturer's instructions.
pGEX-2TK with nucleotides 2426 to 3274 of pGRN121 with a "HIS-8 tag"
Another E. was used to produce large quantities of a fragment of hTRT. coli expression vector pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N. J. ) Construct. This construct contains an insert that is derived from nucleotides 2426 to 3274 of the hTRT insert in plasmid pGRN121 (SEQ. ID. No. 1) and a sequence encoding eight consecutive histidine residues (HIS-8 day). To insert this "HIS-8 tag", the vector pGEX-2TK was linearized with the hTRT nucleotides 2426 to 3274 of pGRN121 with BamHI. This opens the plasmid at the junction between GST-thrombin myocardial proteinase and the hTRT coding sequence.
A double-stranded oligonucleotide with BamHI compatible ends, as seen in the sequence shown below, was ligated to the linearized plasmid, resulting in the introduction of eight histidine residues upstream of the hTRT sequence in the reading frame.
The vector controls in E. coli expression of high levels of a fusion protein composed of the glutathione-S-transferase sequence (underlined); the cleavage sequence for thrombin (double underlined); the recognition sequence for cardiac muscle protein kinase (italic); a set of three and a set of five residues introduced by cloning (GSV and GSVTK) eight on consecutive histidines (also underlined) and the hTRT protein fragment (in bold) (SEQ. ID. No. 39):
EMI314. 1
This vector can be used to produce fusion protein to generate polyclonal and monoclonal antibodies to an hTRT protein. This fusion protein can also be used to affinity purify antibodies directed against hTRT peptides contained within the fusion protein. The recombinant protein can be separated from the glutathione-S-transferase unit by site-specific proteolysis using thrombin in accordance with the manufacturer's instructions.
pGEX-2TK with the hTRT nucleotides 2426 to 3274 of pGRN121 without "HIS-8-TAG"
Another E. was used to produce large amounts of an hTRT fragment. coli expression vector pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N. J. ) Construct. This vector construct can be used to produce fusion protein for the generation of polyclonal and monoclonal antibodies against the hTRT protein. This fusion protein can also be used to affinity purify antibodies directed against hTRT peptides contained in the fusion protein.
This construct contains an insert that is derived from nucleotides 2426 to 3274 of the hTRT insert in plasmid pGRN121 (SEQ. ID. No. 1), but without the "His-8-tag". The vector controls in E. coli the expression of high levels of a fusion protein composed of glutathione-S-transferase (underlined), a cleavage sequence for thrombin (double underlined), a recognition sequence for the heart muscle protein kinase (italics), residues introduced by cloning (in brackets, GSVTK) and the hTRT protein fragment (in bold) (SEQ. ID. No. 40):
EMI315. 1
The recombinant protein can be separated from the glutathione S-transferase unit by site-specific proteolysis using thrombin in accordance with the manufacturer's instructions.
pGEX-2TK with the hTRT nucleotides 1625 to 2458 of gPRN121
Another E. was used to produce large amounts of an hTRT protein fragment. coli expression vector pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N. J. ) Construct. This vector construct can be used to produce fusion protein for generating polyclonal and monoclonal antibodies against an hTRT protein. In addition, this fusion protein can be used to affinity purify antibodies directed against hTRT peptides contained in the fusion protein.
This construct contains an insert that is derived from nucleotides 1625 to 2458 of the hTRT insert in plasmid pGRN121 (SEQ. ID. No. 1) comes. The vector controls in E. coli the expression of high levels of a fusion protein composed of glutathione-S-transferase (underlined), a cleavage sequence for thrombin (double underlined), a recognition sequence for heart muscle protein kinase (italics), residues introduced by cloning (in brackets, GSVTK ) and the hTRT protein fragment (in bold) (SEQ. ID. No. 41):
EMI316. 1
The recombinant protein is separated from the glutathione-S-transferase unit by site-directed proteolysis using thrombin in accordance with the manufacturer's instructions.
pGEX-2TK with hTRT nucleotides 782-1636 from pGRN121
Another E. was used to produce large amounts of an hTRT protein fragment. coli expression vector pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N. J. ) Construct. This vector construct can be used to produce fusion protein for generating polyclonal and monoclonal antibodies against an hTRT protein. In addition, this fusion protein can be used to affinity purify antibodies directed against hTRT peptides contained in the fusion protein.
This construct contains an insert that is derived from nucleotides 782 to 1636 of the hTRT insert in plasmid pGRN121 (SEQ. ID. No. 1) comes. The vector controls in E. coli the expression of high levels of a fusion protein composed of glutathione-S-transferase (underlined), a cleavage sequence for thrombin (double underlined), a recognition sequence for heart muscle protein kinase (italics), residues introduced by cloning (in brackets, GSVTK ) and an hTRT protein fragment (in bold) (SEQ. ID. No. 42):
EMI317. 1
The recombinant protein is separated from the glutathione-S-transferase unit by site-specific proteolysis using thrombin in accordance with the manufacturer's instructions.
pT7FLhTRT with hTRT cDNA lacking the 5 min non-coding sequence
As described above, in one embodiment, the invention provides an hTRT that is site-modified to facilitate cloning in bacterial, mammalian, yeast, and insect expression vectors and does not contain a 5 min untranslated hTRT sequence. In some circumstances, minimizing the amount of non-protein coding sequence allows for improved protein production (yield) and leads to increased mRNA stability. In this embodiment according to the invention, the 5 min non-coding region of hTRT was removed in the bacterial expression vector before cloning.
This was accomplished by creating an additional restriction site immediately upstream (5 min) from the start codon (ATG) of the hTRT coding sequence (Fig. 16) causes. The creation of a restriction site immediately 5 minutes to the coding region of the protein allows the efficient production of a large number of vectors which encode fusion proteins, for example fusion proteins which contain labels and peptide "TAGs" for immunodetection and purification.
In this case the oligonucleotide was used for 5 min -CCGGCCACCCCCCATATGCCGCGCGCTCCC-3 min as described above to modify the hTRT cDNA nucleotides 779 to 781 of the hTRT cDNA (Fig. 16) used from GCG to CAT. These 3 nucleotides are the last nucleotides before the ATG start codon, so this change does not lead to modification of the protein sequence. The sequence change leads to the creation of a single NdeI restriction site in the hTRT cDNA. Single stranded hTRT DNA was used as a source of DNA for site-directed mutagenesis. The plasmid obtained was sequenced to confirm successful mutagenesis.
* This modification allowed the construction of the plasmid according to the invention described below called pT7FLhTRT. The site-specifically modified hTRT sequence (addition of the NdeI restriction site) was cleaved with NdeI and NotI, whereby an hTRT fragment was generated. This fragment was then cloned into a pSL3418 plasmid which had previously been cleaved with NdeI and SmaI (also a restriction enzyme which cleaves to blunt ends). pSL 3418 is a modified paED4 plasmid into which a FLAG sequence (Immunex Corp. Seattle WA) and an enterokinase sequence immediately upstream of the aforementioned NdeI site.
This plasmid, called pT7FLhTR, allows the expression of full-length hTRT (with a "flag tag" at its 5 min end) in an E. coli strain that expresses T7 RNA polymerase.
Vector in which an hTRT coding sequence is controlled by the MPSV promoter
The invention also provides a mammalian expression vector in which hTRT is oriented so that the hTRT coding sequence is controlled by the MPSV promoter (described below). An EcoRI restriction fragment from pGRN137 containing the hTRT ORF was cloned into the EcoRI site of pBBS212 (see below), thereby removing the 5 min untranslated region (5 min -UTR) of hTRT (pGRN137 was excised) of a SalI-Sse8387 I fragment of pGRN130 (described below) that encodes the Kozak mutation of hTRT.
Contained in the SalI SSE 83871 sites of pGRN136, engineered to produce a mammalian expression plasmid expressing hTRT (a "Kozak consensus" sequence) expressed by the MPSV promoter (pGRN136 was cut by cutting a HindIII-SalI Fragments of pGRN126 containing the hTRT ORF and cloning into the HindIII-SalI sites of pBBS242. This creates a mammalian expression plasmid that expresses hTRT from the MPSV promoter). This gave a mammalian expression plasmid called pGRN145 which expresses hTRT with a "Kozak Consensus" sequence using the MPSV promoter. See also the mammalian expression vector, pGRN152-MPSV promoter, which is described below.
Plasmids with hTRT cDNA lacking the 3 min non-coding sequence
As discussed above, the invention provides expression vectors containing TRT-encoding nucleic acids in which some or all of the non-coding sequences have been deleted. In some circumstances, minimizing the amount of non-protein coding sequence allows for improved protein production (yield) and increases mRNA stability. In this embodiment according to the invention, the 3 min untranslated region of hTRT was deleted before cloning into the bacterial expression plasmid.
Plasmid pGRN121, which contains full length hTRT cDNA as discussed above, was first deleted for all APAI sites. This was followed by the deletion of the MscI-HincII-hTRT restriction fragment, which contains the 3 min UTR. The NcoI-XbaI fragment containing the stop codon of hTRT was then inserted into the NcoI-XbaI site of pGRN121 to obtain a plasmid called pGRN124, which is equivalent to pGRN121, except that the 3 min - UTR is missing.
Bacterial expression vectors with antibiotic selection markers
The invention also provides bacterial expression vectors containing selection markers for conferring a selectable phenotype in transformed cells and sequences encoding the maintenance of the vector as an episome and replication so that integration into the host genome is not required. For example, the marker can code for biotic resistance, for example resistance to chloramphenicol (see Harrod, Nucleic Acids Res. 25 (1997), 1720-1726), kanamycin, G418, bleomycin and hygromycin, which allows the selection of the cells which have been transformed with the desired DNA sequences; see for example Blondelet-Rouault, Gene 190 (1997), 315-317 and Mahan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 669-673 (1995).
In one embodiment according to the invention, the full-length hTRT (SEQ. ID. No. 1) cloned into a modified "BlueScript" plasmid vector (Stratagene, San Diego, CA), which bears the designation pBBS235 and in which a resistance gene for the antibiotic chloramphenicol had been inserted. The NotI fragment of pGRN124 (discussed above) containing the hTRT-ORF was cloned into the NotI site of pBBS235 so that the TRT-ORF is in the opposite direction to the lac promoter of the vector. This creates a plasmid which is suitable for the mutagenesis of plasmid insertions, for example the TRT nucleic acids according to the invention. This plasmid construct with the name pGPN125 is used in the methods according to the invention which include mutagenesis of telomerase enzyme and sequences coding for TRT protein.
It can also be used for the in vitro transcription of hTRT using the T7 promoter and the in vitro transcription of "antisense" hTRT using the T3 promoter.
In a further embodiment according to the invention, the NotTR restriction fragments containing hTRT-ORF from pGRN124 were subcloned into the NotI site of pBBS235 (described below), so that the TRT-ORF has the same orientation as the lac promoter of the vector. This creates a plasmid called pGRN126, which is used to express hTRT with full length in E. coli can be used. The expressed product contains 29 amino acids encoded by the vector pBBS235, followed by 18 amino acids encoded by the 5 min UTR of hTRT, followed by the full length hTRT protein.
In a further embodiment according to the invention, an in vitro mutagenesis of pGRN125 was carried out to convert the ATG initiation codon of hTRT in a "Kozak consensus" sequence and to generate EcoRI and BglII restriction sites to facilitate cloning into the bacterial expression vectors.
In this mutagenesis procedure, the oligonucleotide
EMI322. 1
(SEQ. ID. No. 43) used. This new expression vector was named pGRN127.
In another embodiment of the invention, the second Asp of the TRT "DD motif" (described above) was converted to an alanine to produce a non-functional telomerase enzyme and thus a mutant TRT protein for use in dominant experiments / negative mutants. hTRT (SEQ. ID. No. 1) was mutagenized in vitro with the oligonucleotide
EMI322. 2nd
(SEQ. ID. No. 44) to the asparagine at residue 869 (Asp869) (from SEQ. ID. No. 2) convert to an alanine (Ala) codon. This also created an MluI restriction site. This expression plasmid was named pGRN130 and also contains the "Kozak Consensus" sequence as described for pGRN127.
The invention also provides a vector designed to express an "antisense" sequence fragment from hTRT. The plasmid pGRN126 was completely cleaved with the restriction enzymes MscI and SmaI and ligated again, with over 95% of the hTRT-ORF being deleted in mammalian cells. An SmaI-MscI fragment was reinserted during this process to restore CAT activity. This unpurified plasmid was then cut again with SalI and EcoRI and the fragment containing the initiation codon of hTRT was inserted into the SalI-EcoRI sites of pBBS212 (described above). This resulted in an "antisense" expression plasmid which expresses the "antisense" sequence spanning the 5 min -UTR and 73 base pair residues of the hTRT-ORF. This plasmid was named pGRN135.
Expression of hTRT telomerase in yeast
In the following example, the construction of the hTRT-expressing yeast expression vectors according to the invention for the production of large amounts of biologically active hTRT (SEQ. ID. No. 2) shown with full length. The use of biologically active hTRT in many embodiments according to the invention has been described above.
Pichia pastoris full length pPICZ B and hTRT expression vector
The Pichia pastoris expression vector PPICZ B (Invitrogen, San Diego, CA) was selected for the production of large amounts of biologically active hTRT. The insertion for the hTRT coding sequence originated from nucleotides 659 to 4801 of the hTRT insertion in the plasmid pGRN121 (SEQ. ID. No. 1). This nucleotide sequence contains the full length hTRT coding sequence (SEQ. ID. No. 2). This expression vector was used for the inducible expression of high amounts of unmodified hTRT protein (SEQ. ID. No. 2) with full length in P. pastoris designed. Expression is controlled by a yeast promoter, but the expressed sequence uses the hTRT initiation and termination codons. No exogenous codons were introduced by cloning.
The resulting PPICZ B / hTRT vector (Invitrogen, San Diego, CA) was used to transform the yeast.
Pichia pastoris expression vector hTRT-His6 / pPICZ B
A second Pichia pastoris expression vector according to the invention, which was derived from pPICZ B (Invitrogen, San Diego, CA), also contains the full-length hTRT coding sequence (SEQ. ID. No. 2), which depend on nucleotides 659 to 4801 of the hTRT insertion in the plasmid pGRN121 (SEQ. ID. No. 1) comes. This expression vector hTRT-His6 / pPICZ B encodes the hTRT protein (SEQ. ID. No. 2) Full length and fused to the Myc epitope and His6 reporter sequences at its C-terminus. The hTRT stop codon was removed and replaced with vector sequences encoding the Myc epitope and the His6 reporter "tag" as well as a stop codon.
This vector was designed to control the inducible expression of the subsequent high-level fusion protein in yeast, this fusion protein comprising the hTRT sequence (underlined), vector sequences (in brackets L and NSAVD), the Myc epitope (double underlined) and the His6- " day "(italic) (SEQ. ID. No. 45) there is:
EMI324. 1
Expression of hTRT in insect cells
The following example details the construction of hTRT-telomerase-expressing expression vectors for insect cells for the production of large amounts of biologically active full-length hTRT (SEQ. ID. No. 2 and SEQ. ID. No. 4).
Full-length baculovirus expression vector pVL1393 and hTRT
The desired telomerase coding sequence was cloned into the baculovirus expression vector pVL1393 (Invitrogen, San Diego, CA). This construct was then cotransfected in Spodoptera fungupeida (sf-9) cells with linearized DNA from the Autograph California nuclear polyhedrosis virus (Baculogold-AcMNPV). The recombinant baculoviruses obtained were then plaque-cleaned and expanded in accordance with published protocols.
This expression vector allows the expression of high levels of full-length hTRT protein in insect cells. Expression is controlled by a baculovirus polyhedrin gene promoter. No exogenous codons were introduced by cloning.
Full-length baculovirus expression vector pBlueBacHis2 B and hTRT
For the production of large amounts of biologically active full-length hTRT (SEQ. ID. No. 2) the baculovirus expression vector pBlueBacHis2 B (Invitrogen, San Diego, CA) was selected as a source of control elements. The hTRT coding insert consisted of nucleotides 707 to 4776 from the hTRT insertion in plasmid pGRN121 (SEQ. ID. No. 1), the full length coding sequence hTRT (SEQ. ID. No. 2) contains.
A full length hTRT with His6 and anti-Xpress tags (Invitrogen) was also constructed. This vector contains an insertion which is derived from nucleotides 707 to 4776 of the hTRT insertion of plasmid pGRN121 (SEQ. ID. No. 1) exists. This vector controls the expression of high levels of full length hTRT protein fused to a cleavable 6-histidine and "anti-Xpress tags" in insect cells. The amino acid sequence of the fusion protein is shown below; (- * -) indicates a cleavage site for enterokinase:
EMI326. 1
Baculovirus expression vector pBlueBac4. 5 and hTRT protein with HE1>
The NotI fragment of pGRN121, which contains the sequence coding for the hTRT-ORF (open reading frame), is inserted into the NotI site of pEBVHisA, so that the coding sequence is functionally linked to the RSV promoter. This plasmid expresses a fusion protein which is composed of a "His6 flag" fused to the N-terminus of the hTRT protein. The marker that can be used with this vector is ampicillin or hygromycin.
pGRN123
The NotI fragment of pGRN121, which contains the sequence encoding the hTRT-ORF (open reading frame), is inserted into the NotI site of pEBVHisA so that the coding sequence is oriented in the opposite direction compared to the RSV promoter that "antisense" hTRT is expressed.
pGRN124
All APAI sites in pGRN121 were deleted and then the MscI-HincII fragment containing the 3 min -UTR ("untranslated region") was deleted. The Nco-XbaI fragment containing the stop codon of the hTRT coding sequence was then inserted into the Nco-XbaI sites of pGRN121, resulting in a plasmid which is equivalent to pGRN121, except that it lacks the 3 min -UTR. This plasmid can preferably be used for increased expression levels in some cells.
pGRN125
The NotI fragment of pGRN124 containing the hTRT coding sequence is inserted into the NotI site of pBBS235 so that the open reading frame is in the opposite orientation compared to the lac promoter. The detectable marker used with this vector is chloramphenicol.
pGRN126
The NotI fragment of pGRN124 containing the hTRT coding sequence is inserted into the NotI site of pBBS235 so that the hTRT coding sequence is inserted in the same orientation as the lac promoter.
pGRN127
The oligonucleotide
EMI339. 1
was used for the in vitro mutagenesis of pGRN125 to convert the initiation codon ATG of the hTRT coding sequence into a "Kozak consensus" sequence and to generate EcoRI and BglII sites for cloning. COD2866 was also used to convert AmpS to AmpR (ampicillin resistance) and COD1941 was used to convert CatR (chloramphenicol resistance, to CatS (chloramphenicol sensitivity).
pGRN128
The oligonucleotide
EMI339. 2nd
was used for in vitro mutagenesis to convert the initiation codon ATG of hTRT into a "Kozak consensus" sequence and to create EcoRI and BglII sites for cloning. It also became the oligonucleotide
EMI339. 3rd
to insert the "IBI Flag" (International Biotechnolgies Inc. (IBI) Kodak, New Haven, CT) used at the C-terminus and to generate EcoRI and BglII sites for cloning. COD2866 was also used to convert AmpS to AmpR and COD1941 was used to convert CatR to CatS.
pGRN129
The oligonucleotide
EMI340. 1
was used for in vitro mutagenesis to convert Asp869 to an Ala codon (i.e. H. the second Asp of the DD motif was converted to an alanine for dominant / negative experiments). This also created an MluI site. The oligonucleotide too
EMI340. 2nd
was used to insert the "IBI Flag" (IBI, New Haven, CT) at the C-terminus and to create EcoRI and BglII sites for cloning. COD2866 was also used to convert AmpS to AmpR and COD1941 was used to convert CatR to CatS.
pGRN130
The oligonucleotide
EMI340. 3rd
was used in in vitro mutagenesis to convert the Asp869 codon to an Ala codon (i.e. H. the second Asp of the DD motif was converted to an alanine to produce a dominant / negative protein variant). This also created an MluI site. The oligonucleotide too
EMI340. 4th
was used in an in vitro mutagenesis to convert the initiation codon ATG of the hTRT coding sequence into a "Kozak consensus" sequence and to generate EcoRI and BglII sites for cloning. COD2866 was also used to convert AmpS to AmpR (ampicillin resistance) and COD1941 was used to convert CatR (chloramphenicol resistance) to CatS (chloramphenicol sensitivity).
pGRN131
The EcoRI fragment from pGRN128, which contains the hTRT ORF with a "Kozak" sequence and "IBI Flag" (IBI, New Haven, CT) mutations, is inserted into the EcoRI site of pBBS212 so that the hTRT ORF is expressed by the MPSV promoter.
pGRN132
The EcoRI fragment from pGRN128, which contains the hTRT ORF with a "Kozak" sequence and "IBI Flag" (IBI, New Haven, CT) mutations, is inserted into the EcoRI site of pBBS212 so that the "antisense "Sequence of the hTRT-ORF is expressed by the MPSV promoter.
pGRN133
The EcoRI fragment from pGRN121, which contains the hTRT coding sequence, inserts into the EcoRI site of pBBS212 so that the hTRT protein is expressed under the control of the MPSV promoter.
pGRN134
The EcoRI fragment from pGRN121, which contains the hTRT coding sequence, is inserted into the EcoRI site of pBBS212 so that the "antisense" sequence of the hTRT coding sequence is expressed under the control of the MPSV promoter. The selectable markers used with this vector are chlorine / HygB / PAC.
pGRN135
pGRN126 was completely cut with MscI and SmaI and re-ligated to delete more than 95% of the inserted hTRT coding sequence. An SmaI-MscI fragment was reinserted during this process to re-generate Cat activity for selection. This unpurified plasmid was then cut again with SalI and EcoRI and the fragment containing the initiation codon of the hTRT coding sequence inserted into the SalI-EcoRI sites of pBBS212. An "antisense" expression plasmid was then produced which expresses the "antisense" sequence of the 5 min -UTR and of 73 bases of the coding sequence. The selectable markers that can be used with this vector are chlorine / HygB / PAC.
pGRN136
The HindIII-SalI fragment from pGRN126, which contains the hTRT coding sequence, is inserted into the HindIII-SalI sites of pBBS242.
pGRN137
The SalI-Sse8387I fragment from pGRN130, which contains the "Kozak" sequence, is inserted into the SalI-Sse8387I sites of pGRN136.
pGRN138
The EcoRI fragment from pGRN124, which contains hTRT without the 3 min -UTR, inserts into the EcoRI site of pEGFP-C2 so that the orientation of hTRT is the same as for the EGFP domain.
pGRN139
The oligonucleotide
EMI343. 1
was used to insert the "IBI Flag" (IBI, New Haven, CT) at the C-terminus of hTRT in pGRN125 using in vitro mutagenesis and to generate EcoRI and BglII sites for cloning. COD2866 was also used to convert AmpS to AmpR (ampicillin resistance) and COD1941 to convert CatR (chloramphenicol resistance) to Cats (chloramphenicol sensitivity).
pGRN140
The NcoI fragment containing the upstream sequence of genomic hTRT and the first intron of hTRT from lambdaG55 inserts into the NcoI site of pBBS167. The fragment is oriented so that hTRT is in the same direction as the lac promoter.
pGRN141
The NcoI fragment containing the upstream sequences of the genomic hTRT and the first intron of hTRT from lambdaG55 inserts into the NcoI site of pBBS167. This fragment is oriented so that hTRT is in the opposite direction compared to the lac promoter.
pGRN142
The NotI fragment from lambdaG45, which contains the complete genomic & tilde & 15 kbp insert, including the hTRT gene promoter region, was inserted into the NotI site of plasmid pBBS185. The fragment is oriented so that the hTRT ORF is in an opposite orientation to the lac promoter.
pGRN143
The NotI fragment from lambdaG45, which contains the complete genomic & tilde & 15 kbp insert, including the hTRT gene promoter region, was inserted into the NotI site of plasmid pBBS185. The fragment is oriented so that the hTRT ORF is in the same orientation as the lac promoter.
pGRN144
SalI deletion of pGRN140 to remove lambda sequences.
pGRN145
This vector was designed to express hTRT sequences in mammalian cells. The EcoRI fragment from pGRN137 containing the hTRT coding sequence inserts into the EcoRI site of pBBS212 to remove the portion of the sequence corresponding to the 5 min UTR of hTRT mRNA. The hTRT coding sequence is oriented so that it is expressed under the control of the MPSV promoter. The selectable markers used with this vector are chlorine / HygB / PAC.
pGRN146
This vector was constructed for the expression of hTRT sequences in mammalian cells. The Sse8387I-NotI fragment of pGRN130, which contains the D869A mutation of hTRT, inserts into the Sse8387I-NotI sites of pGRN137. The selectable markers used with this vector are ampicillin / HygB / PAC.
pGRN147
The Sse8387I-NotI fragment from pGRN139, which contains the "IBI Flag" (IBI, New Haven, CT), is inserted into the Sse8387I-NotI sites of pGRN137.
pGRN148
The BglII-Eco47III fragment from pGRN144, which contains the promoter region of hTRT, is inserted into BglII-NruI sites of pSEAP2, resulting in an hTRT promoter / reporter construct.
pGRN149
This vector is an intermediate vector for the construction of an expression vector for an hTRT fusion protein. The mutagenic oligonucleotide
3 min was used to add a Csp45I site to the C-terminus of hTRT by in vitro mutagenesis of pGRN125. The "Stop" codon from hTRT was deleted and exchanged for a Csp451 site.
The selectable marker used with this vector is ampicillin.
pGRN150
The GblII-FspI fragment from pGRN144, which contains the promoter region of hTRT, is inserted into the BglII-NruI sites of pSEAP2, resulting in an hTRT promoter / reporter construct.
pGRN151
This vector was designed to express hTRT sequences in mammalian cells. The EcoRI fragment from pGRN147 containing the hTRT coding sequence inserts into the EcoRI site of pBBS212 so as to remove the portion of the sequence that corresponds to the 5 min UTR of the hTRT mRNA. The hTRT coding sequence is oriented so that it is expressed under the control of the MPSV promoter. The markers used with this vector are chlorine / HygB / PAC.
pGRN152
The EcoRI fragment from pGRN146 containing the hTRT coding sequence inserts into the EcoRI site of pBBS212 to remove the portion of the sequence that corresponds to the 5 min UTR of hTRT. The hTRT coding sequence is oriented so that it is expressed under the control of the MPSV promoter.
pGRN153
The StyI fragment from pGRN130, which contains the D869-> A mutation of hTRT (a sequence coding for an hTRT variant), was inserted into the StyI sites of pGRN158, whereby a plasmid was obtained which gave the hTRT coding sequence with a " Kozak Consensus "sequence at its 5 min end, an" IBI FLAG "sequence at its 3 min end containing the C-terminus coding region and the D869-> A mutation.
pGRN154
The EcoRI fragment of pGRN153 containing the hTRT gene was inserted into the EcoRI site of plasmid pBS212 so that the hTRT ORF is in the same orientation as the MPSV promoter. This creates an MPSV-controlled expression plasmid which expresses the hTRT protein with a "Kozak-Con sensus" sequence at its amino-terminal end, an "IBI FLAG" at its C-terminus and the D869-> A mutation.
pGRN155
This vector was designed to express hTRT sequences in mammalian cells. The insertion contained full-length hTRT cDNA without 5 min and 3 min UTR and "Kozak" sequences. The EcoRI fragment from pGRN145, which contains the hTRT cDNA with the "Kozak Consensus" sequence but no 3 min or 5 min UTR, was inserted into the EcoRI site of p91023 (B) so that the hTRT is in the same orientation as the DHFR-ORF. This creates an expression vector for the transient expression of hTRT. The selectable marker used with this vector is tetracycline.
pGRN156
This vector was designed to express hTRT sequences in mammalian cells. The EcoRI fragment from pGRN146, which contains the D869A mutation of the hTRT cDNA with the "Kozak Consensus" sequence without 3 min or 5 min UTR, is inserted into the EcoRI site of p91023 (B) so that hTRT is in the same orientation as the DHFR ORF. This creates an expression vector for the transient expression of hTRT. The insertion contained full-length hTRT cDNA without 5 min and 3 min UTR, D869A and "Kozak" sequences. The selectable marker used with this vector is tetracycline.
pGRN157
This vector was constructed for the expression of hTRT sequences in mammalian cells. The EcoRI fragment of pGRN147, which contains the hTRT cDNA with the "Kodak flag" at the C-terminus, and the "Kozak Consensus" sequence without 3 min or 5 min UTR, inserted into the EcoRI site of p91023 (B) so that hTRT is in the same orientation as the DHFR ORF. This creates an expression vector for the transient expression of hTRT. The insertion contained full length hTRT cDNA without 5 min and 3 min UTR a "FLAG" sequence (Immunex Corp. , Seattle, WA) and "Kozak" sequences. The selectable marker used with this vector is tetracycline.
pGRN158
This vector was used for the expression and mutagenesis of TRT sequences in E. coli constructed. The EcoRI fragment from pGRN151, which contains the hTRT-ORF, inserts into the EcoRI site of pBBS183, so that the hTRT-ORF is in the opposite orientation compared to the lac promoter. The insert contained full length hTRT cDNA without 5 min and 3 min UTR, a "FLAG" sequence (Immunex Corp. , Seattle, WA) and "Kozak" sequences. The coding sequence is controlled by a T7 promoter. The selectable marker used with this vector is ampicillin.
pGRN159
This vector was used for the expression and mutagenesis of TRT sequences in E. coli constructed. The HeI-KpnI fragment from pGRN138, which contains the fusion of EGFP to hTRT, inserts into the XbaI-KpnI sites of pBlueScriptIIKS +. This results in a T7 expression vector for the fusion protein (the coding sequence is controlled by a T7 promoter). This insert contains full length hTRT cDNA without the 3 min UTR as a fusion protein with EGFP. The selective marker used with this vector is ampicillin.
pGRN160
This vector was designed to express "antisense" hTR sequences in mammalian cells. The coding sequence is controlled by an MPSV promoter. The XhoI-NsiI fragment of pGRN90 containing the full length hTR inserted into the SalI-SSE / 8387I sites of pBBS295. This results in a transiently stable vector which expresses hTR in the "antisense" orientation. A GPT marker was built into the vector. The selectable markers used with this vector are chlorine / gpt / PAC.
pGRN161
This vector was constructed to express "sense" -HT sequences in mammalian cells. An XhoI-NsiI fragment from pGRN89 containing full length hTR inserts into the SalI SSE8387I sites of pBBS295. This results in a transient / stable vector which expresses hTR in the "sense" orientation. The coding sequence is controlled by an MPSV promoter. A GPT marker was built into the vector. The markers used with this vector are chlorine / gpt / PAC.
pGRN162
An XhoI-NsiI fragment from pGRN87 containing full length hTR inserts into the SalI SSE8387I sites of pBBS295. This results in a transient / stable vector that expresses shortened hTR (from position +108 to +435) in the "sense" orientation.
pGRN163
This vector was used for the expression and mutagenesis of TRT sequences in E. coli constructed. The coding sequence is controlled by a T7 promoter. RA45
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is used in an in vitro mutagenesis to convert the initiation Met into hTRT to Leu and to introduce an XhoI site in the next two codons after the Leu. COD 1941 was also used for the transfer from CatR to CatS and the introduction of a BSPHI site and COD 2866 for the transfer from AmpS to AmpR, whereby an FspI site was introduced. The selectable marker used with this vector is ampicillin.
pGRN164
This vector was used for the expression of hTR sequences in E. coli constructed. The primers hTR + 1
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were used by PCR to amplify a fragment of pGRN33 containing the full length hTR and the T7 promoter at its 5 min end (as in hTR + 1). A BamHI-HindIII cleavage of the PCR product was inserted into the BamHI-HindIII sites of pUC119. The coding sequence is controlled by a T7 promoter. The selectable marker used with this vector is ampicillin.
pGRN165
This vector was used for the expression and mutagenesis of hTRT sequences in E. coli used. The coding sequence is controlled by a T7 promoter. An EcoRI fragment from pGRN145 containing the hTRT-orf with a "Kozak" sequence at the front end is inserted into the EcoRI site of pBluescriptIISK + so that hTRT is in the same orientation as the T7 promoter. The selectable marker used with this vector is ampicillin.
pGRN166
This vector was constructed for the expression and mutagenesis of TRT sequences in mammalian cells. The coding sequence is controlled by a T7 promoter. The EcoRI fragment from pGRN151, which contains the hTRT ORF with a "Kozak" sequence at the front end and an "IBI flag" at the rear end, inserted into the EcoRI site of pBluescriptIISK <+> so that hTRT is in the same orientation as the T7 promoter. The insert contained full length hTRT cDNA without 5 min and 3 min UTR, a "FLAG" sequence (Immunex Corp. Seattle, WA) and "Kozak" sequences. The selectable marker used with this vector is ampicillin.
pGRN167
An AvrII-StuI fragment from pGRN144 containing the 5 min end of the hTRT ORF inserts into the XbaI-StuI sites of pBES161.
pGRN168
The EcoRI fragment of pGRN145 containing the optimized hTRT expression cassette was inserted into the EcoRI site of pIND so that the hTRT coding sequence is in the same orientation as the miniCMV promoter.
pGRN169
The EcoRI fragment from pGRN145 containing the optimized hTRT expression cassette was inserted into the EcoRI site of pIND in such a way that the hTRT is in the opposite orientation, based on the miniCMV promoter.
pGRN170
The EcoRI fragment from pGRN145 containing the optimized hTRT expression cassette was inserted into the EcoRI site of pIND (sp1) in such a way that the hTRT is in the opposite orientation, based on the miniCMV promoter.
pGRN171
The Eco47II-NarI fragment from pGRN163 inserts into the Eco47111-NarI sites of pGRN167. The M1L mutation is thus introduced into a fragment of the genomic hTRT DNA.
pGRN172
The BamHI-StuI fragment from pGRN171, which contains the Met mutation to Leu in hTRT, inserts into the BglII-NruI sites of pSEAP2- "Basic".
pGRN173
The EcoRV-Eco47III fragment from pGRN144, which contains the 5 min end of the hTRT promoter region, was inserted into the SrfI-Eco47III sites of pGRN172. This resulted in a promoter / reporter plasmid which contains the promoter region of hTRT of approximately 2.3 kb upstream of the start of the hTRT-ORF until immediately after the first intron in the coding region with the Met1-> Leu mutation.
pGTN174
The EcoRI fragment of pGRN145 containing the "optimized" hTRT expression cassette was inserted into the EcoRI site of pIND (sp1) so that the hTRT has the same orientation as the miniCMV promoter.
Example 7
Reconstitution of telomerase activity
a) Co-expression of hTRT and hTR in vitro
In this example, the co-expression of hTRT and hTR is described using a cell-free in vitro expression system. The results show that the hTRT polypeptide encoded by pGRN121 encodes a catalytically active telomerase protein and that the in vitro reconstitution (IVR) of the telomerase RNP can be achieved using recombinantly expressed hTRT and hTR.
Telomerase activity was increased by adding linearized plasmids with hTRT (pGRN121; 1 μg DNA, digested with XbaI) and hTR (pHTR + 1; 1 μg, digested with FspI) to a coupled transcription / translation reticulocyte lysate (Promega TNT <TM>) reconstituted. pHTR + 1 is a plasmid which, after linearization with FspI and subsequent transcription by T7 RNA polymerase, generates a transcript with 445 nucleotides, which begins with nucleotide +1 and extends to nucleotide 446 of hTR (Autexier et al. , EMBO J. 15 (1996), 5928). The following components were added for a 50 μl reaction: 2 μl TNT <TM> buffer, 1 μl TNT <TM> -T7 RNA polymerase, 1 μl 1 mM amino acid mixture, 40 units rnasin RNase inhibitor, each 1 µg linearized template DNA and 25 µl TNT <TM> -Reticulocyte lysate.
The ingredients were added in the ratio recommended by the manufacturer and incubated at 30 ° C. for 90 minutes. The transcription was controlled by the T7 promoter and could also be carried out with similar results before the addition of reticulocyte lysate. After incubation, 5 and 10 μl of the programmed transcription / translation reaction for telomerase activity were examined using the TRAP assay described above (Autexier et al., Op. Cit.) Using 20 PCR cycles for signal amplification.
The results of the reconstitution are shown in Fig. 10. There are three lanes for each transcription-translation reaction. The first two lanes are duplicate assays and the third lane is a duplicate sample that has been heat-denatured (95 ° C., 5 minutes) to exclude PCR-generated artifacts before the TRAP phase.
As shown in Figure 10, the reticulocyte lysate has no detectable telomerase activity (lane 6). Similarly, no detectable activity is observed when either hTR alone (lane 1) or the full length hTRT gene (lane 4) is added to the lysate. When both components are added (lane 2), telomerase activity is generated, as shown by the characteristic pattern of repeats. If the carboxy-terminal region of the hTRT gene is removed by cleavage of the vector with NcoI ("truncated hTRT"), telomerase activity is abolished (lane 3). Lane 5 shows that translation of the truncated hTRT alone does not produce telomerase activity.
Lane "R8" shows a positive control for a telomerase product ladder generated by "TRAP" from TSR8 (a synthetic telomerase product with a nucleotide sequence of the standard for quantification)
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B) Mixing hTRT and hTR in vitro
The in vitro reconstitution of telomerase activity was also achieved by mixing. hTRT was transcribed and translated as described above, but without the addition of the hTR plasmid. Reconstitution of the Telomerase RNP was then accomplished by mixing the hTRT translation mixture with hTR (previously generated by transcription with T7 RNA polymerase from phTR + 1-Fsp) in the ratio of 2 Al hTRT translation mixture to 2 μl hTR (1 μg ) and then the 90 minute incubation at 30 ° C. This method of hTRT-hTR reconstitution is referred to as "linked reconstitution" or "linked IVR". Telomerase activity is present in this mixture (i.e. can be detected). An improved signal was observed after partial purification of the activity by DEAE chromatography.
In this case, a "Millipore Ultrafree-MC DEAE central filter" device was used according to standard procedures (i.e. according to the manufacturer's instructions). The buffers used were: hypo0.1, hypo0.2 and hypo1.0, where hypo 20mM Hepes-KOH, pH 7.9, 2mM MgCl2, 1mM EGTA, 10% glycerol, 0.1% NP- 40, 1mM DTT, 1mM sodium metabisulfite, 1mM benzamidine and 0.2mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and where 0.1, 0.2 and 1.0 refer to 0.1, 0.2 or 1.0 M KCl. The filters were preconditioned with hpyo1.0, washed with hypo0.1, then the reconstituted telomerase was charged, the column was washed with hypoo.1 and then hypo0.2, and the reconstituted telomerase was compared with half the volume with hypo 1.0 to the charging volume eluted.
This preparation could be kept frozen at -70 ° C. and it remains active.
Telomerase activity was examined in a two-step procedure. In the first step, a conventional telomerase assay was carried out as described by Morin, Cell 59 (1989), 521, except that no radioactive labeling was used. In the second step, an aliquot was examined using the "TRAP" method for 20 to 30 cycles (as described above). The usual telomerase assay was carried out so that 1 to 10 μl of reconstituted telomerase were examined in 25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM potassium acetate, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 2 mM DATP, 2 mM TTP, 10 μM dGTP and 1 μM primer (usually M2, AATCCGTCGAGCAGAGTT) in a final volume of 40 to 50 μl at 30 ° C. and for 60 to 180 minutes.
The reaction was stopped by heating at 95 ° C. for 5 minutes and the second step, the “TRAP” reaction (50 μl), was carried out with 1-10 μl of the mixture from the first step.
In additional experiments, the synthesis of hTRT and hTR was monitored during in vitro reconstitution based on the incorporation of 35S methionine and Northern blotting. Proteins of approximately the predicted size were synthesized for hTRT (127 kD), hTRT-Nco (85 kD) and pro90hTRT (90 kD) in approximately equimolar amounts (relative to one another). Northern analysis showed that hTR synthesis was the correct size (445 nucleotides) and was predominantly intact.
Variations on the reconstitution protocol described above will be apparent to those skilled in the art. For example, the following parameters can be varied: reconstitution time and temperature, the presence or concentration of components such as monovalent salts (e.g. NaCl, KCl, potassium acetate, potassium glutamate etc.), divalent salts (MgCl2, MnCl2, MgSO4, etc.), denaturing agents (urea , Formamide etc.), detergents (NP-40, Tween, CHAPS, etc.). Alternative improved purification methods (e.g. immunoprecipitation, affinity chromatography or standard chromatography) can also be used. These and other parameters can be systematically varied so as to optimize the conditions for certain assays or other reconstitution protocols.
C) Reconstitution using hTRT variants and fusion proteins
Reconstitution of catalytic telomerase activity occurred when EGFP-hTRT co-expressed a fusion of the "enhanced green fluorescent protein to hTRT (see Example 15) or" epitope-tagged "hTRT (IBI FLAG, see Example 6) with hTR both telomerase activity reconstituted to approximately wild-type levels.
In contrast, telomerase activity was not reconstituted when the hTRT variant pro90hTRT (which lacks the RT motifs B min, C, D and E) was used. This shows that pro90hTRT has no catalytic telomerase activity, which could have other activities (e.g. the ability to bind RNA (i.e. hTR) and it could also act as a dominant-negative regulator of telomerase in vivo as described above.
D) The investigation of in vitro reconstituted telomerase activity using the gel blot and the usual telomerase assay
The following example shows that in vitro reconstituted telomerase (IVR) can be tested in addition to amplification based assays (i.e. TRAP) using standard telomerase assays. Telomerase was reconstituted in vitro (IVR) as described in part (B) above (the "linked reconstitution" procedure), followed by DEAE purification as described above. The IVR telomerase was examined by means of the gel blot assay under the following reaction conditions: 1 to 10 μl IVR telomerase in 25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM potassium acetate, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 0.8 mM dATP, 0.8 mM TTP, 1.0 mM dGTP and 1 μM primer (M2, AATCCGTCGAGCAGAGTT; or H3.03, TTAGGGTTAGGGTTAGGG) for 180 minutes at 30 ° C. and a final volume of 40 μl .
The synthesized telomeric DNA was isolated using standard procedures, separated on a gel with 8% polyacrylamide and 8 M urea, transferred to a nylon membrane and using those used in the dot blot assay <3> <2> P- (CCCTAA) n ribonucleotide probe searched. Using this probe, a ladder of six nucleotides in the lane could be identified that represents 10 μl IVR telomerase, which was equivalent to the ladder observed for 5 μl native nuclear telomerase purified with “mono Q” and heparin chromatography . The results show that IVR telomerase, equivalent to native telomerase, has a processive catalytic telomerase activity.
The IVR telomerase ("linked reconstitution") was also based on the usual, on the incorporation of <3> <2> P-dGTP based telomerase assays examined. The telomerase thus reconstituted, which was then purified via DEAE purification as described above, was examined under both process and non-process reaction conditions. The assay conditions were: 5-10 µl reconstituted telomerase ("linked reconstitution") in 25mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM potassium acetate, 1mM EGTA, 1mM MgCl2, 2mM dATP, 2mM TTP with 10 mu M <3> <2> P-dGTP (72 Ci / mmol) (for the assay regarding process conditions) or 1 µM <3> <2> P-dGTP (720 Ci / mmol) (for non-process conditions) and 1 µM primer (i.e.
H3.03 TTAGGGTTAGGGTTAGGG) at 30 ° C (for the process reaction) or 37 ° C for the non-process reaction for 180 minutes in a final volume of 40 ml. The synthesized telomer DNA was isolated using standard methods and separated on a sequencing gel with 8% polyacrylamide and 8 M urea.
The process response showed a weaker ladder of six nucleotides, which corresponds to a process telomerase reaction, and a repeat unit was added to the non-process reaction, a pattern equivalent to the control reaction with a preparation of native telomerase. Common assays using telomerase "linked reconstitution" are useful in the search for telomerase modulators as described herein, as well as in other applications such as the elucidation of structural and functional properties of telomerase.
E) In vitro reconstituted telomerase recognizes 3 min ends of primers
This experiment shows that telomerase produced by "linked reconstitution" recognizes 3 min ends of primers, equivalent to native (purified) telomerase. Telomerase forms a base-paired duplex between the 3 min end of a primer and the template region of hTR and adds the next proposed nucleotide (Morin, 1989, op. Cit.). In order to verify that (recombinant) IVR telomerase ("linked reconstitution") has the same property, the reactions of primers with --- GGG or --- TAG-3 min ends (AATCCGTCGAGCAGAGGG or
AATCCGTCGAGCAGATAG) with a primer compared to a --- GTT 3 min term (M2;
AATCCGTCGAGCAGAGTT; the standard "TRAP" primer) using in vitro reconstituted and native telomerase which were assayed by the two-step assay (common / TRAP) described in detail above.
The product heads of the primers --- GGG and --- TAG shifted by +4 and +2 respectively compared to the standard primer (--GTT 3 min end); the same effect was observed with native telomerase. This experiment shows that in vitro reconstituted ("linked reconstitution") and native telomerase recognize primer ends in the same way.
These results (along with the above results, which show that IVR telomerase has both processive and non-processive catalytic activity) indicate that IVR telomerase has a similar structure and properties compared to native or purified telomerase.
Example 8
Production of anti-hTRT antibodies
A) The production of anti-hTRT antibodies against hTRT peptides
To produce anti-hTRT antibodies, the following peptides of hTRT were synthesized with the addition of C (cysteine) as the amino-terminal residue (see Fig. 54):
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The cysteine unit was used to immobilize (i.e. covalently link) the peptides to BSA and KLH ("keyhole limpet" hemocyanin) carrier proteins. The KLH peptides were used as the antigen. The BSA peptide conjugates served as material for ELISAs to test the specificity of immune antisera.
The KLH peptide conjugates were injected into "New Zealand White" rabbits. The introductory injections were given proximal to the armpit and groin lymph nodes. Subsequent injections were given intramuscularly. The antigen was emulsified with complete Freund's adjuvant for introductory injections, and incomplete Freund's adjuvant was used for subsequent injections. The rabbits followed a 3 week booster cycle, with 50 ml of blood delivering 20 to 25 ml of serum drawn 10 days after each booster. Antisera against each of the four peptides recognized the hTRT unit of recombinant hTRT fusion protein (GST-HIS8-hTRT fragment 2426 to 3274) on Western blots (see Example 6).
Using a partially purified telomerase fraction from human 293 cells (approximately 1000-fold purification compared to the crude nuclear extract), which is described in the parallel US patent application with serial no. 08 / 833,37 (see also PCT application No. 97/06012) and affinity-purified with anti-S-2 antibodies, a 130 kD protein duplicate could be detected on a Western blot. A sensitive chemiluminescence detection method was used ("SuperSignal" chemiluminescent substrates, Pierce), but the signal on the blot was weak, indicating that hTRT is present in these immortal cells with little or very little frequency. The occurrence of a duplicate is consistent with a post-translational modification of hTRT, i.e. Phosphorylation or glycosylation.
For affinity purification, the S-2 peptide was immobilized on "SulfoLink" (Pierce, Rockford, IL) via its N-terminal cysteine residue in accordance with the manufacturer's protocol. First blood serum from a rabbit immunized with the KLH-S-2 peptide was loaded via an S-2 "SulfoLink" and antibodies specifically bound to the S-2 peptide were eluted.
B) Production of anti-hTRT antibodies against hTRT fusion proteins
GST-hTRT fusion proteins were expressed in E. coli as the GST-hTRT fragment # 4 (nucleotides 3272-4177) and the GST-His8-hTRT fragment # 3 (nucleotides 2426 to 3274) as described in Example 6. The fusion proteins were purified as an insoluble protein and the purity of the antigen was examined via SDS-polyacrylamide gels and checked for approximately 75% purity with respect to the recombinant protein GST-hTRT fragment # 4 and over 75% purity for the recombinant protein GST-His8-hTRT fragment # 3 estimated. (Routine procedures can be used to obtain these and other fusion proteins with a purity greater than 90%). These recombinant proteins were used to immunize both "New Zealand White" rabbits and female Balb / c mice.
The antigen was emulsified with complete Freund's adjuvant for introductory injections, and incomplete Freund's adjuvant was used for subsequent injections. A 3 week booster cycle was performed for the rabbits and mice, with blood drawn 10 days after each booster.
The first and second blood draws from both mice and rabbits were tested for the presence of anti-hTRT antibodies after removal of anti-GST antibodies using an immobilized GST-containing matrix. The antisera were tested for anti-hTRT antibodies by Western blots using an immobilized recombinant GST-hTRT fusion protein and by immunoprecipitation using the partially purified native telomerase enzyme. No signal was observed at these early blood draws; It is assumed that the titer of anti-hTRT antibodies increases with subsequent blood samples.
Example 9
Detection of an HTRT-MRNA that corresponds to the RNA of the DELTA 182 variant
Poly-A RNA from human testes and the 293 cell line was analyzed for hTRT mRNA by means of RT-PCR and "nested" primers. The first set of primers was TCP1.1 and TCP1.15, the second set of primers TCP1.14 and billTCP6. The amplification with both sets of primers resulted in two products which differed by 182 bp. The larger and smaller products of testicular RNA were sequenced and it turned out that they corresponded exactly to pGRN121 (FIG. 16) and clone 712562 (FIG. 18). The variant hTRT-RNA product was observed in mRNA from SW39i, OVCAR4, 293 and testes.
Additional experiments were carried out to show that the DELTA 182 cDNA was not an artifact of reverse transcription. Briefly summarized, hTRT-RNA (i.e. without deletion) was generated by in vitro transcription of pGRN121 for use as a template for RT-PCR. Separately, cDNA synthesis reactions were carried out using the "Superscript Reverse transcriptase (Bethesda Research Laboratories, Bethesda MD) was carried out at 42 ° C. or 50 ° C. using random primers or a specific primer. After 15 PCR cycles, the longer product was detectable, but not the smaller product (ie that of the Corresponding deletion, even after 30 or more cycles, indicating that the RTPCR product is not an artifact.
Example 10
Sequencing of testicular hTRT mRNA
The sequence of the form of hTRT-RNA found in testes was determined by direct manual sequencing of DNA fragments, which were PCR by testis cDNA ("Marathon" testicular cDNA, Clontech, San Diego, CA) using a " ThermoSequenase radiolabeled terminator cycle "sequencing kits (Amersham Life Science). The PCR reactions were performed using "nested" PCR as shown in Table 7 unless otherwise stated. In all cases, a negative control reaction was carried out with primers, but without cDNA. The lack of a product in the control reaction indicated that the products derived from the reaction with cDNA were not present due to contamination with hTRT from pGRN121 or other cell sources (e.g. 293 cells). The DNA fragments were excised from agarose gels to purify the DNA prior to sequencing.
The sequence of the testicular mRNA, which corresponds to bases 27 to 3553 of the insertion sequence of pGRN121 (SEQ. ID. No. 1) and the entire hTRT-ORF (bases S6 to 3451) was obtained. In this area there were no differences between the testicle and pGRN121 sequences.
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Example 11
Detection of hTRT mRNA by RNase protection reaction
RNase protection assays can be used to detect, monitor or diagnose for the presence of an hTRT mRNA or the mRNA of a variant. An illustrative probe for such an assay is an in vitro synthesized RNA comprising sequences complementary to hTRT mRNA sequences and additional non-complementary sequences. The latter sequences are therefore advantageous in order to be able to distinguish the full-length probe from the fragment of the probe which results from a positive result in the assay. In a positive assay, the complementary sequences of the probe are protected from cleavage with RNase, since they are hybridized with the hTRTmRNA. The non-complementary sequences are cleaved from the probe in the presence of RNase and complementary target nucleic acid.
Two probes for the RNase protection assays are described for illustration, each of which can be used in the assay. The probes differ in their sequences complementary to hTRT, but contain identical non-complementary sequences which in this embodiment derive from the late leader sequence of the SV40 mRNA. In the 5 min-3 min direction, the first probe comprises 33 nucleotides of a non-complementary sequence and 194 nucleotides of a sequence that is complementary to the hTRT nucleotides 2513 to 2707 for a full-length probe of 227 nucleotides. In the 5 min -3 min direction, the second probe comprises 33 nucleotides of a non-complementary sequence and 198 nucleotides of a sequence that is complementary to the hTRT nucleotides 2837 to 3035 for a full-length probe of 231 nucleotides.
To carry out the assay, each of the two probes can be used with RNA, i.e. PolyA <+> - RNA are hybridized from a test sample and then T1-ribonuclease and RNase A are added. After cleavage, the probe RNA is purified and analyzed by gel electrophoresis. Detection of a 194 nucleotide fragment of the nucleotide probe with a length of 227 nucleotides or a 198 nucleotide fragment of the probe with a length of 231 nucleotides is a sign of the presence of hTRT-mRNA in the sample.
The illustrative probes for the RNase protection assay described in this example can be generated by in vitro transcription using T7 RNA polymerase. Radioactive or otherwise labeled ribonucleotides can be included for the synthesis of labeled probes. The matrices for the in vitro transcription reaction for the production of the RNA probes are PCR products. These illustrative probes can be synthesized with T7 polymerase after PCR amplification of pGRN121 DNA using primers that span the corresponding complementary region of the hTRT gene or the hTRT mRNA. In addition, the downstream primer contains T7 RNA polymerase promoter sequences and the non-complementary sequences.
The PCR product from the following primer pair T701 and reverse 01) is used to generate the first probe for the RNase protection assay:
EMI367.1
and reverse 01
EMI367.2
The PCR product from the following pair of primers (T702 and reverse 02) is used to generate the second probe for the RNase protection assay:
EMI367.3
and reverse 02
EMI368.1
Example 12
Construction of a phylogenetic family tree by comparing hTRT with other reverse transcriptases
A phylogenetic family tree (Fig. 6) was constructed by comparing the seven Xiong and Eickbush (EMBO J. 9 (1990), 3353) RT domains. After sequence alignment of motifs 1, 2 and AE of 4 TRTs, 67 RTs and 3 RNA polymerases, the family tree was constructed using the "NJ (" Neighbor joining ") method (Saitou and Nei, Mol. Biol. Evol. 4 (1987 ), 4406) Elements of the same class that are located on the same branch of the family tree are shown in simplified boxes, the length of each box corresponds to the most divergent element within the box.
The TRTs appear to be more closely related to the RTs that are associated with msDNA, group II introns and non-LTR (long terminal repeat unit) retrotransposons than with the LTR retrotransposon and viral RTs. The relationship of the telomerase RTs to the non-LTR branch of retro elements is very interesting, given that the latter elements have exchanged telomerase for telomer retention in Drosophila. The most striking observation, however, is that the TRTs form a discrete subset that is almost as closely related to the RNA-dependent RNA polymerases of +-stranded RNA viruses, such as poliovirus, as to one of the previously known RTs.
If one considers that the four telomerase genes come from evolutionarily distant organisms - protozoa, fungi and mammals - this separate grouping cannot be explained by the lack of phylogenetic diversity in the data set. Instead, this early fork suggests that the telomerase RTs are a very old group that may have arisen with the first eukaryote.
GenBank protein identification numbers or accession numbers used for phylogenetic analysis are:
msDNAs (94535, 134069, 134074, 134075, 134078), Group II introns (483039, 101880, 1332208, 1334433, 1334435, 133345, 1353081), mitochondrial plasmid / RTL (903835, 134084), non-LTR retrotransposons (140023, 140023 , 103221, 103353, 134083, 435415, 103015, 1335673, 85020, 141475, 106903, 130402, U0551, 903695, 940390, 2055276, L08889), LTR retrotransposons (74599, 85105, 130582, 99712, 8358944, 8358944 224319, 130398, 130583, 1335652, 173088, 226407, 101042, 1078824), Hepadnaviruses (1 18876, 1706510, 118894), Caulimoviruses (331554, 130600, 130593, 93553), retroviruses (130601, 325465, 7460167, 1305 130607, 130629, 130589, 130631, 1346746, 130651, 130635, 1780973, 130646). Alignment was determined using "ClustalW 1.5" (J.D. Thompson, D.G. Higgins, T.J. Gibson, Nucleic Acids Res. 22, (1994), 4673) and "PHYLIP.3.5" (J.
Felsenstein, Cladisfics 5 (1989), 164).
Example 13
Transfection of cultured human fibroblasts (BJ) with a control plasmid and a plasmid encoding hTRT
This example shows that expression of a recombinant hTRT protein in a mammalian cell leads to the generation of an active telomerase.
Subconfluent bi-fibroblasts were trypsinized and in fresh medium (DMEM / 199, containing 10% fetal calf serum) at a concentration of 4 x 10 <6> cells / ml resuspended. The cells were electroporation with the "Gene Pulser <TM> "electroporator from BioRad transfected. If necessary, cells can also be used using the" Superfect Transfect the <TM> "reagent (Quiagen) according to the manufacturer's instructions. For the electroporation, 500 .mu.l of cell suspension were added to an electroporation cuvette (BioRad, 0.4 cm electrode spacing). Plasmid DNA (2 .mu.g) was added to the cuvettes The control plasmid (pBBS212) contained no insert behind the MPSV promoter and the experimental plasmid (pGRN133) expressed hTRT from the MPSV promoter.
The cells were electroporation at 300 V and 960 mu FD. After the pulse was delivered, the cuvettes were kept on ice for approximately 5 minutes before being plated on 100 mm tissue culture plates in medium. After 6 hours the medium was exchanged for new medium. 72 hours after the transfection, the cells were trypsinized, washed once with PBS, pelleted and stored in the frozen state at -80 ° C. Cell extracts were prepared at a concentration of 25,000 cells / ml by a modified lysis method using detergents (see Bodnar et al., Exp.
Cell Res. 228 (1996), 58 and Kim et al., Science 266 (1994) 2011 and the description in patents and publications relating to the above TRAP assay) and telomerase activity in the cell extracts was modified using a modified determined on PCR-based TRAP assays (Kim et al., 1994, Bodnar et al., 1996). In short, 5 x 10 <4> Cell equivalents were used for the telomerase primer extension part of the reaction. While the extract is typically added directly from the telomerase extension reaction to the PCR amplification, one can extract once with phenol / chloroform and once with chloroform before the PCR amplification. One fifth of the material was used in the PCR amplification portion of the TRAP reaction (approximately 10,000 cell equivalents).
Half of the TRAP reaction was loaded on a gel for analysis so that each trace in Figure 25 represents reaction products of 5000 cell equivalents. Extracts from cells transfected with pGRN133 were positive for telomerase activity, while extracts from untransfected cells (not shown) or cells transfected with the control plasmid showed no telomerase activity. Similar experiments with RPE cells gave the same result.
Reconstitution in BJ cells was also performed using other hTRT constructs (i.e. pGRN145, pGRN155 and pGRN138). Reconstitution using these constructs appeared to result in increased telomerase activity compared to cells transfected with pGRN133.
The highest level of telomerase activity was achieved with pGRN155. As already discussed above, pGRN155 is a vector which contains the late main promoter of adenovirus as a control element for the expression of hTRT and has been shown to be able to reconstitute telomerase activity upon transfection in BJ cells. Remarkably, reconstitution using the hTRT-GFP fusion protein pGRN138 (located in the nucleus, see Example 15 below) gave either in vitro (see Example 7) or with in vivo reconstitution systems (transfection in bi-cells) Telomerase activity. When transfected into BJ cells as described above, for example, the telomerase activity was comparable to that resulting from reconstitution with pGRN133 or pGRN145.
Similar results were obtained after transfection of normal human pigment-containing retinal epithelial cells (RPE) with the hTRT expression vectors according to the invention. RES cell senescence is believed to lead to or contribute to macular degeneration associated with age. RPE cells treated according to the method according to the invention with the hTRT expression vectors according to the invention should have a delayed senescence compared to untreated cells and should thus be useful in transplantation therapies for the treatment or for the prevention of age-related macular degeneration.
Example 14
Promoter-reporter construct
This example describes the construction of plasmids in which reporter genes are functionally linked to upstream hTRT sequences containing promoter elements. These vectors have numerous possible uses, including the identification of regulatory factors of transcription acting in cis and trans in vivo and the screening for agents that can modulate hTRT expression (e.g. activation or inhibition) (e.g. screening of active substances). Although a number of reporter genes can be used (for example filament luciferase, beta-glucuronidase, beta-galactosidase, chloramphinicol acetyl transferase and GFP), the secreted human alkaline phosphatase (SEAP; CloneTech) was used for preliminary experiments.
The SEAP reporter gene encodes a truncated form of the placenta enzyme that lacks the domain for membrane anchoring, thereby enabling efficient protein secretion from transfected cells. It could be shown that the levels of SEAP activity detected in the culture medium are directly proportional to changes in intracellular concentrations of SEAP mRNA and protein (Berger et al., Gene 66 (1988), 1 and Cullen et al., Meth. Enzymol 216 (1992), 362).
Four constructs (pGRN148, pGRN150, "pSEAP2 basic" (no promoter sequence = negative control) and "pSEAP2 control" (which contains the early SV40 promoter and enhancer) were transfected in triplicate into mortal and immortal cells.
Plasmid pGRN148 was constructed as illustrated in Figure 9. Briefly, a BglII-Eco47III fragment from pGRN144 was digested and cloned into the BglII-NruI site of pSEAp2Basic (Clontech, San Diego, CA). A second reporter promoter, plasmid pGRN150, contains the sequences from the hTRT intron described in Example 3, so that regulatory sequences which may be present in the intron can be used. The initiation codon Met has mutated to Leu, so that the second ATG following the promoter region is the initiation ATG of the SEAP-ORF.
Constructs pGRN148 and pGRN150 containing the hTRT promoter were transfected into mortal (BJ cells) and immortal (293) cells. All transfections were carried out in parallel with two control plasmids. A plasmid as a negative control (pSEAP basic) and a plasmid as a positive control ("pSEAP control", which contains the early SV40 promoter and the SV4O enhancer).
In immortal cells, constructs pGRN148 and pGRN150 appear to control SEAP expression as efficiently as positive pSEAP2 control (which contains the early SV40 promoter and enhancer). In contrast, only the "pSEAP2 control" showed detectable activity in mortal cells. These results show that, as expected, hTRT promoter sequences are active in tumor cells, but not in mortal cells.
Similar results were obtained with another normal cell line (RPE), (pigment-containing, retinal epithelial cell line). In RPE cells transfected with pGRN150 (containing 2.2 kb of upstream genomic sequence), the hTRT promoter region was inactive while the plasmid "pSEAP2 control" was active.
As noted above, plasmids in which reporter genes are functionally linked to the upstream hTRT sequence containing promoter elements are extremely useful for the identification and screening of telomerase activity modulating agents, using both transient and stable methods Transfection can be used. In one procedure, for example, stable transformants of pGRN148 in telomerase-negative and telomerase-positive cells are produced by cotransfection with a eukaryotic selectable marker (such as neo) according to Ausubel et al., 1997, cited above.
The cell lines obtained are then used for the screening of suspected telomerase-modulating agents, for example by comparing the hTRT promoter-controlled expression in the presence or absence of a test compound.
The promoter-reporter vectors (and others) according to the invention are also used for the identification of regulatory elements acting in trans and in cis for transcription and translation. Examples of regulatory elements of transcription acting in cis include promoters and enhancers of the telomerase gene. The identification and isolation of regulatory agents acting in cis and in trans leads to the provision of further methods and reagents for the identification of agents which modulate the transcription and translation of telomerase.
Example 15
Subcellular localization of hTRT
A fusion protein with hTRT and "enhanced green fluorescent protein" (EGFP; Cormack et al., Gene 173 (1996), 33) regions was constructed as described below. The EGFP unit provides a detectable "tag" or signal which can be used to easily determine the presence or location of the fusion protein. Since EGFP fusion proteins are located in the correct cellular compartments, this construct can be used to determine the subcellular location of the hTRT protein.
A. Construction of pGRN138
A vector for expressing an hTRT-EGFP fusion protein in mammalian cells was constructed by integrating the EcoRI insert of pGRN124 (see Example 6) into the EcoRI site of pEGFP-C2 (Clontech, San Diego, CA). The amino acid sequence of the fusion protein is shown below. EGFP residues are in bold, residues encoded by the 5 min untranslated region of hTRT mRNA are underlined and the hTRT protein sequence is given in normal script.
EMI375.1
Additional EGFP fusion constructs were made using a partial (e.g., truncated) hTRT coding sequence and, as described below, used to identify activities of certain regions of the hTRT polypeptide.
B. Nuclear localization and uses for DGRN138
The transfection of NIH 293 and BJ cells with pGRN138 allowed the nuclear localization of recombinantly expressed hTRT to be confirmed. Cells were transfected with pGRN138 (EGFPhTRT) and a control construct (only EGFP expressed). The nuclear localization of EGFP-hTRT is evident in both cell types (determined by fluorescence microscopy). As noted above, the pGRN138 hTRT-GFP fusion protein aids in the reconstitution of telomerase activity in both an in vitro transcription / translation system and in vivo when transfected into BJ cells.
hTRT-EGFP fusion proteins (or similar detectable fusion proteins) are used for a variety of applications. For example, the fusion construct described in this example or an EGFP construct and a truncated form of hTRT is used to assess the ability of hTRT and variants to enter a cell nucleus and / or to attach to the chromosome ends. In addition, cells transfected stably or transiently with pGRN138 are used for screening for suspected telomerase-modulating active substances or compounds. Agents that interfere with nuclear or telomer localization are identified as telomerase inhibitors. Tumor cell lines which stably express EGFP-hTRT are used for this purpose.
Potential modulators of telomerase are administered to these transfected cells and the location of the EGFP-hTRT can be assessed. In addition, FACS or other fluorescence-based methods are used to select cells expressing hTRT, which provides homogeneous populations for the screening of active substances, especially when transient cell transfection is used.
In other applications, areas of hTRT to identify areas (eg residues 193-196 (PRRR) and residues 235-240 (PKRRRR)) that are required for nuclear localization can be mutagenized, these areas being targets for anti-telomerase agents (Modulators of telomerase activity). Other applications include:
Use of the fusion protein as a fluorescent marker for efficient cell transfection, both for experiments relating to transient transfection and for the establishment of stable cell lines expressing EGFP-hTRT;
Expression of an hTRT-EGFP fusion protein with mutated signals for nuclear localization (deficient for nuclear localization) in immortal cells so that the hTRT mutant EGFP captures all hTR of the immortal cells, retains them in the cytoplasm and prevents telomer maintenance;
The GFP can also be used as a "tag" for immunoprecipitation.
Example 16
The effect of a mutation on the catalytic activity of telomerase
This example describes experiments regarding the modification of hTRT amino acids, as well as the effect of amino acid exchanges in hTRT on the catalytic activity of telomerase. The exchange of amino acids and then the functional analysis is a standard procedure for evaluating the meaning and function of a polypeptide sequence. This example shows that changes in the reverse transcriptase (RT) and telomerase T motifs affect the catalytic activity of telomerase and provides additional confirmation of the catalytic nature of the hTRT polypeptide.
The usual nomenclature is used to describe the mutants: the target residue in the native molecule (hTRT) is indicated by the one-letter code and the position, and the corresponding residue in the mutant protein is indicated by the one-letter code. Thus, for example, the term "K626A" denotes a mutant in which the lysine at position 626 (i.e. in motif 1) is replaced by an alanine by hTRT.
A) Mutagenesis of the FFYxTE motif from hTRT
In preliminary experiments, a mutant hTRT protein coding vector, "F560A", was produced in which the amino acid 560 from SEQ. ID. No. 2 was changed from phenylalanine (F) to alanine (A) by site-directed mutagenesis of pGRN121 using standard procedures. This mutation interrupts the TRT FFYxTE motif. The mutant F560A polynucleotide obtained could be shown to direct the synthesis of a full-length hTRT protein, as was done using a cell-free reticulocyte lysate transcription / translation system in the presence of <3> <5> S-methionine could be determined.
When the mutant polypeptide was translated together with hTRT as described in Example 7, no telomerase activity was detected by means of the TRAP assay using 20 PCR cycles, while the control cotranslation of hTRT-hTR activity reconstituted. When using 30 PCR cycles in the TRAP assay, telomerase activity was detectable with the mutated hTRT, but it was considerably lower compared to the control (wild-type) hTRT.
B) Additional site-directed mutagenesis of hTRT amino acid residues
Conserved amino acids in six RT motifs were changed to alanine to assess their contribution to catalytic activity using standard site-directed mutagenesis procedures (see, for example, Ausubel, op. Cit.). The mutants were examined using IVR telomerase, using the two-step assay (common / TRAP) described in detail in Example 7.
Mutants K626A (motif 1), R631A (motif 2), D712A (motif A), Y717A (motif A) and D868A (motif C) showed greatly reduced or undetectable telomerase activity, while the mutants Q833A (motif B) and G932A (Motif E) had moderate activity levels. Two mutations outside of the RT motifs (R688A and D897A) showed activity that was equivalent to the activity of wild-type hTRT. These results were consistent with analogous mutations in reverse transcriptase (Joyce et al., Ann. Rev. Biochem. 63 (1994), 777), and were similar to the results obtained with Est2P (see Lingner, Science 276 (1997), 561) . These experiments identified residues in the RT motifs that are critical for enzymatic activity. These experiments also show the hTRT, which is the catalytic protein of human telomerase.
The mutations generate hTRT polypeptide variants which can be used as dominant-negative regulators of telomerase activity.
The telomerase-specific motif T (see above) was identified by amino acid alignment of the known TRTs. To determine the catalytic role of this motif in hTRT, a six amino acid deletion in this motif (DELTA 560-565; FFYxTE) was constructed using standard site-directed mutagenesis techniques (Ausubel, op. Cit.). The deletion was examined using IVR telomerase by means of two-step assays (common / TRAP) described in detail in Example 7. The mutant DELTA 560-565 showed no detectable telomerase activity after 25 PCR cycles, while wild-type hTRT-IVR telomerase generated a strong signal. Each amino acid residue in motif T was examined independently in a similar manner.
The mutants FS6OA, Y562A, TS64 and E565A maintained medium levels of telomerase activity, while the control mutant F487A had a minimal effect on the activity. Remarkably, the mutant F561A showed a greatly reduced or undetectable telomerase activity, while in its "revertant" F561A561P activity was fully restored. With the F561A561F, the original phenylalanine is again at the mutated position. This is a control that shows that there were no further amino acid changes in the plasmid that could have explained the reduced activity observed. Thus, the T motif is the first non-RT motif that has been shown to be required for telomerase activity.
Motif T is useful for the identification of TRTs from other organisms and as a potential dominant / negative regulator of telomerase activity. Unlike most other RTs, telomerase stably associates with a small portion of a single RNA (ie hTR) and copies it processively, so the motif T could be involved in mediating hTR binding, processivity of the reaction, or other functions that are unique for the Telomerase-RT.
Example 17
Screen for modulators of telomerase activity using recombinantly expressed telomerase components
This example describes the use of in vitro reconstituted telomerase to screen and identify modulators of telomerase activity. The described assay can easily be adapted for high throughput processes (e.g. using multiple well plates and / or robotic technology systems). The numerous possible variations with regard to the assay steps are obvious to the person skilled in the art.
Recombinant clones for telomerase components (e.g. hTRT and hTRR) are generated in an in vitro reaction as follows and in Example 7 described above using the TNT <TM> T7-coupled reticulocyte lysate system (Promega; which is described in US Pat. No. 5,324,637 and was used according to the manufacturer's instructions) transcribed and translated (only hTRT):
<tb> <TABLE> Columns = 2
<tb> Head Col 1: reagent
<tb> Head Col 2: amount per reaction
(mu l)
<tb> <SEP> TNT rabbit reticulocyte lysate <SEP> 25
<tb> <SEP> TNT reaction buffer <SEP> 2
<tb> <SEP> TNT T7 RNA polymerase <SEP> 1
<tb> <SEP> AA mixture (complete) <SEP> 1
<tb> <SEP> "Prime" RNase inhibitor <CEL AL = L> 1
<tb> <SEP> Nuclease-free water <SEP> 16
<tb> <SEP> XbaI-cut pGRN121 (hTRT, 0.5 mu g) <CEL AL = L> 2
<tb> <CEL AL = L> FspI-cut pGRN164 (hTR, 0.5 mu g) <SEP> 2
<tb> </TABLE>
The reaction is incubated at 30 ° C. for 2 hours. The product is then cleaned on an "ultrafree-MC" DEAE filter (Millipore).
The recombinant telomerase product (IVRP) is examined in the presence or absence of multiple concentrations of test compounds that have been solubilized in DMSO (e.g. 10 mu M to 100 mu M). The test compounds are preincubated for 30 minutes at room temperature in a total volume of 25 μl, in the presence of 2.5 μl IVRP, 2.5% DMSO and 1 × TRAP buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8, 3, 1.5 mM MgCl2, 63 mM KCl, 0.05% Tween 20, 1.0 mM EGTA and 0.1 mg / ml bovine serum albumin). After preincubation, 25 μl of TRAP assay reaction mixture are added to each sample. The TRAP assay reaction mixture consists of 1 x TRAP buffer, 50 μl dNTP, 2.0 μg / ml primer ACX, 4 μg / ml primer U2, 0.8 attomol / ml TSU2, 2 units 50 μl Taq polymerase (Perkin Elmer) and 2 µg / ml [ <3> <2> P] 5 min end-labeled primer TS (3000 Ci / mmol).
The tubes with the reaction mixture are then placed in the PCR thermal cycler (MJ Research) and the PCR is carried out as follows: 60 minutes at 30 ° C., 20 cycles of 30 seconds each at 94 ° C., 30 seconds at 60 ° C. and 30 seconds at 72 ° C, then 1 minute at 72 ° C and cooling to 10 ° C. The TRAP assay, as previously mentioned, is described in U.S. Patent No. 5,629,154. The primers and substrates used have the sequences:
EMI382.1
After the PCR step was completed, 4 μl of application buffer containing 10 × bromophenol blue were added to each reaction tube and the products (20 μl) were run on a 12.5% non-denaturing PAGE gel in 0.5 × TBE at 400 V. calmly. After the gel run has ended, the gel is dried and the TRAP products are made visible by means of the "phosphor imager" or by autoradiography. The telomerase activity in the presence of the test compound is measured by comparing the incorporation of the label into the reaction product with a parallel reaction without the agent.
The following clones described in the examples were deposited with the American Type Culture Collection, Rockville, MD20852, USA.
<tb> <TABLE> Columns = 2
<tb> <SEP> Lambda phage lambda 25-1.1 <SEP> ATCC accession number 209024
<tb> <SEP> pGRN121 <SEP> ATCC accession number 209016
<tb> <SEP> Lambda phage lambda G PHI 5 <SEP> ATCC accession number 98505
<tb> </TABLE>
These deposits under the Budapest Treaty were made on May 12, 1997 for ATCC 209024, on May 6, 1997 for ATCC 209016 and on August 14, 1997 for ATCC 98505.
The present invention provides new methods and substances for the diagnosis and treatment of diseases related to telomerase. Specific examples have been provided, but the above description is illustrative only and is not intended to be limiting. After reading the description, many possibilities of variation with regard to the invention are obvious to the person skilled in the art. The scope of the invention is thus not determined by the foregoing description, but is intended to be determined by the claims below, along with the full scope of its equivalents.
All publications and patent documents cited in this application are to be regarded as part of the description by reference and for all purposes, to the same extent as if each individual publication or patent document had been individually designated.