BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Präparate, welche lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen von Säugetieren in einem flüssigen oder festen inerten Medium enthalten.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung derartiger pharmazeutischer Präparate und ferner Verfahren zur Bestimmung der pharmazeutischen Wirksamkeit der erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparate.
In der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 038 511 werden Polypeptide, Glycosteroide und Glycosphingolipide beschrieben, die aus Organen von Säugetieren, wie zum Beispiel Pancreas, Herz, Lunge, Muskel und Rückenmark oder auch aus Blutplasma oder Serum von Säugetieren isoliert werden können. Die fraglichen Wirkstoffe werden in pharmazeutischen Präparaten zur Verbesserung der Wundheilung eingesetzt.
In der österreichischen Patentschrift Nr. 364 079 wird ein Verfahren zur Herstellung von entfibrinierten und gefriergetrockneten Placentazellen beschrieben. Bei diesem Verfahren wird die fetomaterne Placenta eines Ende des vierten Monates der Trächtigkeit getöteten Mutterschafes zerkleinert. Die erhaltenen Teilchen werden dann sofort in Ringer-Lösung getaucht, um Blutspuren wegzuwaschen. Anschliessend werden die Teilchen zerteilt und in einer wässrigen Trypsin enthaltenden Lösung unter Rühren einer Trypsinverdauung unterworfen und dann abfiltriert, gewaschen, zentrifugiert und der Rückstand bis zur Gewichtskonstanz gefriergetrocknet.
Die so erhaltenen lyophilisierten Placentazellen enthalten keine lebenden Zellen mehr, besitzen einen hohen Proteingehalt und enthalten gonadotrope Hormone. Sie sollen als Wirkstoffe in medizinischen oder kosmetischen Präparaten verwendet werden, und beispielsweise durch Injektion verabreicht werden.
Noch andere Therapieverfahren mit lyophilisierten Zellen sind bereits in der Literatur beschrieben. Auch aus Organextrakten gewonnene Substanzen, wurden bereits durch Injektion verabreicht, um immunogene Reaktionen hervorzurufen. Derartige Therapieverfahren werden als unspezifische Reiztherapien bezeichnet.
Ziel der vorliegenden Erfindung war es jedoch, ein pharmazeutisches Präparat zu entwickeln, das in der Lage ist, eine Regenerierung von geschädigten Zellen hervorzurufen, bzw. einer Schädigung vorzubeugen. Uberraschenderweise zeigte es sich, dass ein pharmazeutisches Präparat, das lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen von Säugetieren enthält, zu diesem Zweck geeignet ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein pharmazeutisches Präparat, das dadurch gekennzeichnet ist, das es lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen von Säugetieren in einem flüssigen oder festen inerten Medium enthält.
In den erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparaten können die lebenden vermehrungsfähigen Embryonalzellen von toten Zellen einfach unterschieden werden, indem man Anfärbungen mit Trypanblau bzw. Anfärbungen mit Methylrot durchführt. Das Methylrot wird von den lebenden Zellen aufgenommen, wodurch diese rot gefärbt werden, während tote Zellen ungefärbt bleiben. Im Gegensatz dazu färbt das Trypanblau tote Zellen blau, während lebende Zellen farblos bleiben.
Die entsprechende Bestimmung wird durchgeführt, indem man ein erfindungsgemässes pharmazeutisches Präparat nach einer entsprechenden Verdünnung anfärbt und die gefärbten Zellen zählt. Die Zellenbruckstücke werden nicht gezählt. Es zeigte sich dabei, dass erfindungsgemässe pharmazeutische Präparate, deren Embryonalzellen Herzzellen, Knochenmarkzellen, Leberzellen, Milzzellen oder Thymuszellen sind, meist über 90% an lebenden Zellen enthalten, wobei der Rest auf 100% der Gesamtzellen in dem erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparat aus toten Zellen besteht. Wenn die Embryonalzellen aus der Placenta, den Hoden, der Schilddrüse, den Nieren oder den Nebennieren der Embryonen stammen, dann betragen die Anteile der Lebendzellen meist mehr als 30%, häufig 5080%.
Die Vermehrungsfähigkeit der in den erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparaten enthaltenen Embryonalzellen konnte dadurch festgestellt werden, dass die Zellen nach Einbringung in ein geeignetes Nährmedium sogenannte Klone bildeten, d. h. um die teilungsfähigen Zellen herum bildeten sich Höfe von weiteren lebenden Zellen aus.
Die erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparate enthalten im allgemeinen 0,5 bis 25 x 106 lebende Zellen pro ml, vorzugsweise 1 bis 10 x 106 lebende Zellen pro ml.
Es ist bevorzugt, Embryonalzellen von solchen Säugetierembryonen zu verwenden, die ein Entwicklungsstadium besitzen, das der Hälfte der üblichen Tragzeit der speziellen Säugetierart bis drei Viertel der üblichen Tragzeit der Säugetierart entspricht. In dem angegebenen Entwicklungsstadium haben die Embryonalzellen die für diese Zellart typische Vermehrung, wobei sie sich nach mehreren Passagen in vitro transformieren und/oder nach einer bestimmten Anzahl von Passagen in vitro aussterben. Zum Unterschied von Embryonalzellen vermehren sich Zellen von entsprechenden Organen erwachsener Tiere, also adulten Organen, unter den angegebenen Bedingungen im allgemeinen nicht. Die in den erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparaten enthaltenen Embryonalzellen sind, im Gegensatz zu adulten Zellen oder lyophilisierten Zellen schwache Antigene.
Aus wirtschaftlichen Gründen werden zur Herstellung der erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparate bevorzugt Embryonen solcher Säugetierarten verwendet, bei denen sich das Muttertier nach der Schlachtung als Frischfleisch weiterverwenden lässt. Bevorzugte Säugetierembryonen sind daher diejenigen von Wiederkäuern, insbesondere Schafen. Ziegen und Rindern oder die Embryonen von Pferden oder Schweinen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparates. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man den Uterus eines trächtigen Säugetieres entfernt. ihn in einem sterilen Behälter unter aseptischen Bedingungen öffnet, den Fötus entnimmt und seziert, die einzelnen Gewebe, Organe, bzw. Drüsen von anhaftenden Gewebsfasern und Körperflüssigkeiten befreit, sie anschliessend zu ganz kleinen Stücken zerteilt, in einzelne Zellen mechanisch zerlegt und diese in einem inerten Medium dispergiert.
Bei diesem Verfahren wird zunächst das Muttertier, dessen Embryo oder Embryonen für die Herstellung der Präparate vorgesehen sind, so markiert, dass seine Erkennung jederzeit möglich ist. Beispielsweise kann eine derartige Markierung durch entsprechende Zeichen an beiden Ohren vorgenommen werden, falls das Muttertier ein Schaf, eine Ziege, ein Schwein oder ein Rind ist.
Ehe dem trächtigen Muttertier der Uterus entnommen wird, werden ihm Blutproben genommen, um mit Sicherheit die folgenden Krankheiten, bzw. die Anwesenheit der entsprechenden Krankheitserreger auszuschliessen:
Bruzellose, die durch Brucella abortus (Bang Bakterien) und Brucella melitensis (Maltafieber) hervorgerufen wird, Salmonellose, die durch Salmonella typhi murium 0, Salmonella typhi murium H, Salmonella enteritidis Gärtner O, Salmonella enteritidis Gärtner H, Salmonella abortus ovis 0 und/oder Salmonella abortus ovis H hervorgerufen wird, Ornithose, bzw. Psittakose (Papageienkrankheit), die von grossen Viren mit der Bezeichnung Chlamydia hervorgerufen werden, sowie ferner Rickettsiose, Listeriose und Leptospirose. Die Tests auf sämtliche dieser Mikroorganismen oder Krankheiten müssen negativ sein.
Die Säugetierembryonen werden dem Muttertier zu einem Zeitpunkt entnommen, der der Hälfte der üblichen Tragzeit der Säugetierart bis drei Viertel der üblichen Tragzeit der Säugetierart entspricht. Wenn das fragliche Säugetier ein Schaf ist, vorzugsweise die schwarze Rasse der Juraschafe. dann ist der günstigste Zeitpunkt für die Entnahme der Embryonen dreieinhalb Monate nach der Befruchtung des Tieres.
Zur Entnahme der Embryonen wird dem Muttertier ein Kaiserschnitt gemacht und der Uterus wird mit Hilfe einer speziellen Pinzette abgeklemmt, vom Muttertier entnommen und sofort in einen sterilen Behälter eingebracht.
In einem unter aseptischen Bedingungen gehaltenen Operationssaal wird dann der Uterus geöffnet und die Lappen der Plazenta werden abgetupft. Anschliessend entnimmt man dem geöffneten Uterus den Fötus oder die Föten und seziert sie.
Zur Herstellung der erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparate können praktisch sämtliche Gewebsteile, Organe. bzw. Drüsen des Embryos verwendet werden. Beispiele für verwendbare Embryonalzellen, bzw. Organe, Drüsen und Gewebe des Embryos sind die folgenden:
Hirn mit sämtlichen Substrukturen, wie Zwischenhirn, Hirnlappen. Hypothalamus, Thalom, Putamen, Dickdarm, Dünndarm. Zwölffingerdarm, Magen, Leber, Herz, Lunge, Milz. Niere. Mastzellen, Thymus, Auge mit sämtlichen Substrukturen. Lymphknoten, Hypophyse mit sämtlichen Substrukturen, nämlich vordere Hypophyse, mittlere Hypophyse und hintere Hypophyse, Rückenmark, Knochenmark, Muskel. Bauchspeicheldrüse, Nebennieren, und zwar sowohl die Nebennierenrinde als auch das Nebennierenmark, Schilddrüse.
Nebenschilddrüse, Arterien, Venen, Knorpel, Mundschleimhaut, Nasenschleimhaut, Nerven, einschliesslich des Sehnervs, Haut, Harnblase, Gallenwege, Epiphyse und Knochengewebe. Von den männlichen Embryonen können ferner die Hoden, die Prostata und die Sertolizellen verwendet werden und von den weiblichen Embryonen die Eierstöcke und die Placenta.
Wenn das aufgearbeitete Embryonalorgan das Gehirn ist, dann entfernt man sofort die harte Hirnhaut.
Wenn das aufgearbeitete Embryonalorgan aus dem Verdauungstrakt stammt, dann wird sofort der Mageninhalt, bzw. Darminhalt entfernt.
Wenn man die Plazenta des Embryos aufarbeitet, dann werden die Lappen der Plazenta von allen fasrigen Geweben, Schleimstoffen und Venen, von denen sie durchzogen sind, befreit.
Sämtliche entnommenen Organe werden von anhaftenden Gewebsfasern befreit und anhaftende Körperflüssigkeiten, beispielsweise Blut, werden durch Waschen mit einer inerten Flüssigkeit entfernt, vorzugsweise durch Waschen mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Zur Durchführung der Waschvorgänge ist eine physiologische Kochsalzlösung, die sogenannte Ringerlösung, speziell vorteilhaft.
Jedes der entnommenen Organe wird dann seziert und mit Spezialinstrumenten in ganz klene Stücke zerteilt und mechanisch in einzelne Zellen zerlegt. Die so isolierten lebenden vermehrungsfähigen Embryonalzellen des jeweiligen Säugetierorganes werden dann in einem inerten flüssigen Medium suspendiert. Ein bevorzugtes inertes flüssiges Medium ist eine physiologische Kochsalzlösung.
Anschliessend filtriert man diese die Embryonalzellen suspendiert enthaltende physiologische Kochsalzlösung um darin vorkommende grössere Teilchen zu entfernen.
Das so erhaltene Filtrat stellt ein erfindungsgemässes pharmazeutisches Präparat dar, das sofort zur intramuskulären Injektion an die Patienten verabreicht werden kann.
Erfindungsgemässe Zellsupensionen, die aus dem Gehirn oder Gehirnteilen des Embryos, sowie aus Verdauungsorganen des Embryos gewonnen wurden, nämlich aus dem Magen, dem Zwölffingerdarm, dem Dünndarm, dem Dickdarm und dem Pankreas, müssen besonders schnell durch Injektionen an den Patienten verabreicht werden oder weiter verarbeitet werden, weil die aus dem Hirn stammenden Zellen bekanntlich besonders schwer züchtbar sind und eine geringe Lebensfähigkeit besitzen und die aus den Verdauungsorganen stammenden Zellen vermutlich infolge der Anwesenheit von Spuren von Enzymen ebenfalls häufig nur eine geringe Lebensfähigkeit aufweisen.
Zu beachten ist ferner, dass die nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellten direkt injizierbaren pharmazeutischen Präparate, welche die vermehrungsfähigen Embryonalzellen von Säugetieren enthalten, noch vor der Verabreichung an den Patienten durch Injektionen auf die Anwesenheit von krankheitserregenden Mikroorganismen geprüft werden. Besonders wichtig ist dabei eine Prüfung auf die Abwesenheit der Ornithose, bzw. Psittakose hervorrufenden grossen Viren mit der Bezeichnung Chlamydia. Es soll auch auf die Abwesenheit von krankheitserregenden Bakte rien getestet werden. Zu diesem Zweck können die in der Literatur beschriebenen Färbeverfahren von Stamm, bzw. Koster und Gram durchgeführt werden.
Es zeigte sich, dass die in dem erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparat enthaltenen Embryonalzellen weiter gezüchtet werden können, wenn man sie in ein geeignetes Nährmedium überträgt. Die vermehrungsfähigen Embryo nalzellen der jeweiligen Organe bilden dabei um sich Höfe von weiteren Tochterzellen, die als Klone bezeichnet werden.
Gemäss einer weiteren bevorzugten Ausführungsart des erfindungsgemässen Verfahrens zur Herstellung der erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparate werden daher die in dem inerten flüssigen Medium dispergierten Embryonalzellen der Säugetiere in ein wässriges Nährmedium überführt, wobei der Anteil der teilungsfähigen lebenden Zellen durch Zellvermehrung Klone bildet. Die Zellen werden dann nach einer Züchtungszeit von 3 - 15 Tagen erneut in eine physiologische Kochsalzlösung eingebracht und man erhält so ein sofort injizierbares pharmazeutisches Präparat.
Bei der Weiterzüchtung der lebenden vermehrungsfähigen Embryonalzellen in einem Nährmedium ist die Anzahl der Zellen pro ml der fraglichen Suspensionszellkultur ein wesentlicher Parameter. Im allgemeinen soll diese Anzahl 100 000 bis eine Million betragen, der optimale Wert ist jedoch abhängig von dem Zelltyp, also von dem Organ des Embryos, von welchem diese Zellen stammen.
Bei der Weiterzüchtung der Zellen in dem Nährmedium wurden die folgenden Grössen bestimmt:
Die Klonierausbeute, d.h. die Anzahl derjenigen Zellen, die innerhalb von fünf Tagen in dem Nährmedium Klone gebildet haben, ausgedrückt in Prozent aller in das Nährmedium eingebrachten Zellen.
Die primäre Teilungseffizienz, d. h. die Anzahl der innerhalb von fünf Tagen in der Kultur gebildeten Klone, ausgedrückt in Prozent der eingesäten tatsächlich lebenden Zellen.
Der dritte bestimmte Parameter war die Anzahl der teilungsfähigen Zellen pro ml, d. h. die Anzahl derjenigen Zellen pro ml der in dem Nährmedium hergestellten Suspension, welche innerhalb von fünf Tagen zur Bildung von Klonen befahigt war.
Bei den hier durchgeführten Tests zeigten Herzzellen, Knochenmarkszellen, Leberzellen, Milzzellen und Thymuszellen besonders hohe Lebendzellanteile, Klonierausbeuten und auch eine gute primäre Teilungseffizienz. Bei diesen genannten Zellen lag der Lebendzellanteil zwischen 93 Prozent und 100 Prozent, die Klonierausbeute lag zwischen 38 Prozent und 70 Prozent und die primäre Teilungseffizienz lag zwischen 40 Prozent und 60 Prozent. Die Anzahl an teilungsfähigen Zellen pro ml lag bei den genannten Zellen im Bereich von 4,2 x 106 Zellen pro ml bis 77 x 106 Zellen pro ml.
Auch die Zellsuspensionen, die unter Verwendung von Hypothalamuszellen, Lungenzellen, Nierenzellen, Plazentazellen, Schilddrüsenzellen und Hodenzellen hergestellt wurden, zeigten Lebendzellenanteile im Bereich von 46% bis 79%, Klonierausbeuten im Bereich von 13% bis 27% (ausgenommen die Hypothalamuszellen, deren Klonierausbeute schlechter war) und auch eine entsprechend gute primäre Teilungseffizienz.
Bei den Zellen aus dem Magen/Darmtrakt ist die Haltbarkeit der Zellen nach ihrer Aufarbeitung wesentlich schlechter, weil offenbar Spuren an zurückgebliebenen Verdauungsenzymen zerstörend auf die Zellen einwirken. Auch bei den Zellen, die von Hirnteilen stammen, war die Vermehrungsfähigkeit gering. Es ist jedoch für den Fachmann auf diesem Gebiet bekannt, dass Hirnzellen schlechte Vermehrungsfähigkeiten ausserhalb ihres Gewebeverbandes besitzen.
Die durchgeführten Tests zeigten ferner, dass erfindungsgemässe pharmazeutische Präparate, die vermehrungsfähige Embryonalzellen von Säugetieren in einer physiologischen Kochsalzlösung enthalten, mehr als zehn Tage lang bei 4 "C gelagert werden können und dann immer noch hohe Anteile an lebenden vermehrungsfähigen Zellen darin enthalten sind. Die einzigen Ausnahmen stellen Präparate dar, bei denen die Embryonalzellen aus dem Magen/Darmtrakt oder aus dem Gehirn oder Gehirnteilen stammen.
Die Lagerfähigkeit der erfindungsgemässen lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen enthaltenden pharmazeutischen Präparate lässt sich jedoch durch Tiefgefrieren noch weiter verlängern. Gemäss einer weiteren bevorzugten Ausführungsart des erfindungsgemässen Verfahrens zur Herstellung der erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparate wird zunächst ein sofort injizierbares Präparat hergestellt, welches die lebenden Säugetierzellen in einer physiologischen Kochsalzlösung enthält und zu diesem Präparat wird dann Glyzerin zugesetzt und anschliessend die Zellsuspension tiefgefroren, sodass man ein tiefgefrorenes pharmazeutisches Präparat enthält, das in tiefgefrorenem Zustand bis unmittelbar vor dessen Verwendung aufbewahrt wird.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Testen der pharmazeutischen Wirksamkeit eines erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparates.
Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man entweder von dem injizierbaren pharmazeutischen Präparat ausgeht oder ein tiefgefrorenes erfindungsgemässes pharmazeutisches Präparat auftaut und so ebenfalls ein injizierbares Präparat erhält, welches die lebenden vermehrungsfähigen Embryonalzellen in einem inerten flüssigen Medium enthält und anschliessend diese Zellsuspension zu einer Monolayerkultur von Säugerzellen einer anderen Säugerart, die geschädigt wurden, gibt, wobei einerseits eine merkliche Vermehrung, andererseits eine deutliche Wiederherstellung der gestörten Morphologie der geschädigten adulten Säugerzellen die zellregenerierende Wirksamkeit der Embryonalzellen anzeigt.
Als teilungsfähige lebende Embryonalzellen können bei diesem Testverfahren beispielsweise die entsprechenden Embryonalzellen verwendet werden, die von Embryonen der schwarzen Rasse des Juraschafes stammen. Die Suspension der adulten Säugerzellen kann von irgendwelchen anderen Säugern stammen, die mit den Säugetieren, aus deren Embryonen das pharmazeutische Präparat hergestellt wurde, in keiner Weise verwandt sind.
Die erfindungsgemässen lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen enthaltenden pharmazeutischen Präparate sind insbesondere zur Frischzellenbehandlung bei menschlichen Patienten vorgesehen. Aus diesem Grunde wird beim erfindungsgemässen Verfahren die stimulierende Wirkung des lebende Embryonalzellen enthaltenden Präparates insbesondere auf solche geschädigte adulte Zellen geprüft, die vom Menschen oder einer dem Menschen relativ nahe verwandten Säugetierrasse stammen. Bei den meisten dieser Tests wurden daher als geschädigte adulte Säugerzellen geschädigte menschliche Epithelzellen oder geschädigte Affennierenzellen verwendet.
Bei einem der erfindungsgemässen Tests wurden Affennierenzellen in einem Nährmedium gezüchtet, wobei alle Kulturen bis zu Zellzahlen von 22 000 bis 28 000 Zellen angezogen wurden. Anschliessend wurde in einer Gruppe der Zellen der Serumgehalt des Nährmediums von 5% auf 1% gesenkt, wodurch eine deutliche Schädigung der Zellen eintrat. Dies zeigte sich darin, dass bei denjenigen Gruppen, in denen der Serumgehalt des Nährmediums nicht gesenkt wurde, die adulten Nierenzellen bis zum 12. Tag ein kontinuierliches Anwachsen von 24000 Zellen pro Kultur auf 630 000 Zellen, bzw. 660 000 Zellen aufwiesen. Im Gegensatz dazu zeigte sich bei denjenigen Gruppen, wo die adulten Zellen durch Senkung des Serumgehaltes geschädigt wurden, bis zum 12. Tag der Züchtung ein Anstieg der Zellzahl pro Kultur von 24000 auf 60 000 bzw. auf 160 000.
Zu den Proben mit geschädigten adulten Affennierenzellen wurden dann erfindungsgemässe lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen enthaltende pharmazeutische Präparate zugesetzt. Nach der Zugabe dieser lebenden Embryonalzellen trat sowohl eine starke Zellvermehrung als auch eine deutliche Wiederherstellung der gestörten Morphologie der adulten Nierenzellen auf und es wurden drei bis sechs Tage nach der Zugabe der lebenden Embryonalzellen Zellzahlen von 400 000 bis 1 500 000 Zellen pro Kultur festgestellt.
Besonders überraschend bei der Durchführung dieser
Versuche war es, dass eine Organunabhängigkeit zwischen den im zu testenden Präparat enthaltenen Embryonalzellen und den künstlich geschädigten adulten Säugetierzellen der anderen Säugetierart festgestellt wurde.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart des erfindungsgemässen Testverfahrens können also die in dem zu testenden pharmazeutischen Präparat enthaltenen lebenden Embryonalzellen von einem anderen Organ, Gewebe oder Drüse als die künstlich geschädigten adulten Säugetierzellen der anderen Säugetierart stammen.
Bei den durchgeführten Versuchen zeigte es sich beispielsweise, dass erfindungsgemässe pharmazeutische Präparate, welche lebende vermehrungsfähige Leberzellen, bzw.
Herzzellen, bzw. Nierenzellen der Embryonen der schwarzen Rasse des Juraschafes enthalten, in annähernd gleicher Weise die Regeneration von adulten geschädigten Nierenzellen der Affennieren fördern. Die gleichen Ergebnisse wurden auch bezüglich der Regeneration von geschädigten adulten Herzzellen von Affen festgestellt.
Analoge Versuche wurden auch mit adulten menschlichen Epithelzellen durchgeführt. Die Epithelzellen wurden in Monolayer-Kulturen gezogen und durch Erniedrigung des Serumgehaltes des Nährmediums geschädigt. Zu Vergleichszwecken wurden in anderen Proben die menschlichen Epithelzellen ohne Schädigung weitergezüchtet.
Durch eine intramuskuläre Injektion von gereinigtem a- Actinin in lebende Kaninchen wurden in den Tieren Antiactin-Antikörper gebildet und diese aus dem Blut der Kaninchen isoliert und mit Fluorescein-isothiocyanat (FITC) markiert.
Die gesunden nicht geschädigten menschlichen Epithelzellen werden durch den genannten fluoreszierenden Antikörper markiert. Die geschädigten menschlichen Epithelzellen besitzen offensichtlich in ihrer Zellmembran kein verankertes Actin, sodass der fluoreszierende Antiactin-Antikörper nicht an der Zellmembran gebunden wird. Auch durch ihre amorphe Struktur unterscheiden sich die geschädigten Zellen von den faserförmig gestalteten ungeschädigten menschlichen Epithelzellen.
Durch die Zugabe von erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparaten, die lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen enthalten, beispielsweise embryonale Nierenzellen der schwarzen Rasse des Juraschafes, konnten die geschädigten menschlichen Epithelzellen wieder regeneriert werden, d. h. sie nahmen die urpsrüngliche Grösse und Form der ungeschädigten Zellen an und sie waren auch wieder in der Lage, den fluoreszierenden Antiactin-Antikörper in der Zellmembran aufzunehmen, was darauf hindeutet, dass die Zellmembran wieder das Actin auf ihr verankert hatte.
Weitere Tests wurden mit dem Serum von Patienten durchgeführt, und zwar wurden den Patienten vor der Verabreichung der erfindungsgemässen lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen enthaltenden Präparate Blut entnommen und das Serum aus diesen Blutproben gewonnen. Am vierten Tag, bzw. am elften Tag nach der Verabreichung der erfindungsgemässen lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen enthaltenden Präparate durch Injektion wurde den Patienten wiederum Blut entnommen und das Blutserum weiter untersucht. Die menschlichen Seren wurden sowohl mit adulten Nierenzellen als auch mit embryonalen Nierenzellen in entsprechenden Monolayerkulturen zusammengebracht. Diese Versuche zeigten, dass in dem Serum der Patienten auch elf Tage nach der Frischzelleninjektion keine zytotoxischen Substanzen vorlagen.
Bei der Behandlung der Monokulturen, die embryonale noch nicht differenzierte Zellen enthielten, zeigte das menschliche Serum, das vier Tage nach der Frischzelleninjektion gewonnen wurde, eine leichte Erhöhung der Zellenzahl im Vergleich zu entspre chenden Kulturen von Embryonalzellen, die mit dem Serum des gleichen Patienten vor der Frischzellenbehandlung in Berührung gebracht wurden.
Eine noch stärkere Zunahme der Embryonalzellen wurde festgestellt, wenn diese mit dem Serum des menschlichen Patienten behandelt wurden, das elf Tage nach der Verabreichung der Frischzelleninjektion gewonnen wurde.
Diese Versuchsergebnisse deuten darauf hin, dass während eines längeren Zeitraumes nach der Frischzelleninjektion im menschlichen Serum Faktoren vorhanden sind, die eine zellwachstumsfördernde Wirkung zeigen. Diese Faktoren sind bis jetzt noch nicht näher untersucht worden und werden in der Folge als Stimuline bezeichnet.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zum Testen der pharmazeutischen Wirksamkeit eines erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparates durch Bestimmung von zellregenerierenden Faktoren im Serum von erwachsenen Säugern, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man das Serum des Säugers, dem das pharmazeutische Präparat verabreicht wurde, zu einer Monolayerkultur von adulten Säugerzellen der gleichen Säugerart oder einer anderen Säugerart, die vorher geschädigt wurden, gibt, wobei eine merkliche Vermehrung und/oder eine deutliche Wiederherstellung der gestörten Morphologie der geschädigten adulten Säugerzellen, die Anwesenheit von zellregenerierenden Faktoren im getesteten Serum anzeigt.
In einer bevorzugten Ausführungsart dieses Testverfahrens wird das Serum von erwachsenen menschlichen Patienten getestet. Mit Hilfe dieses Verfahrens kann man feststellen, ob ein Patient, dem ein erfindungsgemässes lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen von Säugetieren enthaltendes pharmazeutisches Präparat durch Injektion verabreicht wurde, auf diese Therapie positiv anspricht oder nicht.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart wird daher dieses Testverfahren so durchgeführt, dass das Serum von erwachsenen menschlichen Patienten getestet wird, um das Ansprechen des menschlichen Patienten auf die Injektion von lebenden vermehrungsfähigen Embryonalzellen von Säugetieren in einem flüssigen inerten Medium zu überprüfen, indem man das Serum von Blut, das dem menschlichen Patienten sowohl vor der Injektion der Embryonalzellen als auch mindestens eine Woche nach der Injektion von Embryonalzellen entnommen wurde, zu einer Monolayerkultur von adulten Säugerzellen, die vorher geschädigt wurden, gibt,
wobei eine deutliche stärkere Vermehrung und/oder ein höheres Ausmass der Wiederherstellung der gestörten Morphologie der geschädigten adulten Säugerzellen in der zweiten Serumprobe im Vergleich zur ersten Serumprobe die Bildung von zellregenerierenden Faktoren im Serum und damit das positive Ansprechen des Patienten auf die Injektion von frischen Embryonalzellen anzeigt.
Bei einer Ausführungsart dieses Tests wurden 20 000 adulte Affennierenzellen in Zellkulturflaschen in einem optimalen Medium bei 37 "C gezüchtet. Dieses Medium enthielt 5% an fötalem Kälberserum. Die Anzuchtphase betrug sechs Tage, und anschliessend hatten die einzelnen Kulturen Zellzahlen von 300 000 bis 380 000 erreicht.
Zu Vergleichszwecken wurde eine der Zellkulturen ohne Schädigung in dem 5% fötales Kälberserum enthaltenden Nährmedium während 12 Tagen weitergezüchtet, wobei zu diesem Zeitpunkt dann die fragliche Kultur 2 100 000 Zellen enthielt. Die restlichen Gruppen an Zellkulturen wurden nach dem sechsten Tag geschädigt, indem man auf ein Medium wechselte, das nur 1% fötales Kälberserum enthielt.
12 Tage nach der Schädigung enthielten diese Proben 260 000 Zellen bis 320 000 Zellen pro Kultur.
Menschlichen Patienten wurde unmittelbar vor der Injektion der erfindungsgemässen lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen von Säugetieren enthaltenden Präparate Serum entnommen. Wenn man dieses Serum den Zellkulturen mit den geschädigten Affennierenzellen in einer Menge von 2,5 Vol.-%, bezogen auf das gesamte Medium zusetzte, und anschliessend sechs Tage lang weiterbrütete, dann trat ein geringfügiger Anstieg der Zellzahlen pro Kultur auf, d.h.
es wurden Zellzahlen erreicht, die im Bereich von 510 000 bis 630 000 Zellen pro Kultur lagen.
Elf Tage nach der Injektion der erfindungsgemässen Präparate wurde den gleichen Patienten wieder Blut entnommen und das daraus gewonnene Serum getestet. Die Herstellung der Kulturen mit den geschädigten Affennierenzellen erfolgte in der gleichen Weise wie oben beschrieben und die geschädigten Kulturen enthielten 12 Tage nach der Schädigung 260 000 bis 320 000 Zellen pro Kultur.
Sechs Tage nach der Zugabe des Serums, das elf Tage nach der Frischzellentherapie gewonnen wurde, zeigte es sich, dass die Zellzahlen in den geschädigten Kulturen auf 900 000 bis 1 700 000 angestiegen waren.
Ein analoger Test wurde mit dem Serum eines Patienten vor der Injektion des erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparates und vier Tage nach der Injektion des erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparates vorgenommen. In diesem Falle zeigte sich überraschenderweise nur eine geringfügige Vermehrung der geschädigten Zellen, bzw. nur eine geringfügige Wiederherstellung der gestörten Morphologie.
Aus diesen Testresultaten sieht man, dass unmittelbar nach der Verabreichung des erfindungsgemässen Präparates durch Injektion im Serum des behandelten Patienten noch keine oder nur geringfügige Mengen an zellregenerierenden Faktoren anzutreffen sind. Beginnend etwa mit einer Woche nach der Injektion bilden sich offensichtlich bei den behandelten Patienten ständig grösser werdende Mengen an zellregenerierenden Faktoren. Diese zellregenerierenden Faktoren können nicht von den injizierten lebenden vermehrungsfähigen Embryonalzellen stammen, weil ja die Menge an injiziertem pharmazeutischem Präparat im Vergleich zum Körpergewicht des behandelten Patienten überaus gering ist und bei dieser extremen Verdünnung daher zellregenerierende Faktoren, die direkt von den injizierten Embryonalzellen stammen, nicht mehr nachweisbar wären.
Ausserdem müssten zellregenerierende Faktoren, die von den injizierten Embryonalzellen selbst stammen, kurze Zeit nach der Injektion bereits im Serum des Patienten vorhanden sein.
Es kann eher angenommen werden, dass durch die Injektion der lebenden vermehrungsfähigen Embryonalzellen irgendwo im Körper des behandelten Patienten die Bildung von zellregenerierenden Faktoren ausgelöst wird. Diese zellregenerierenden Faktoren werden offensichtlich mit dem Blutserum weitertransportiert und können so ihre zellregenerierende Wirkung an geschädigten Organen des Patienten ausüben.
Bei Patienten, die altersbedingte Gehirnstörungen aufwiesen, wurde festgestellt, dass einige Zeit nach der Verabreichung der erfindungsgemässen, lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen enthaltenden Präparate durch Injektion eine deutliche Besserung der Störungen auftrat. Hochmolekulare Substanzen und natürlich auch lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen können bekanntlich die Blut-Hirn Schranke nicht überwinden. Es ist also ausgeschlossen, dass die lebenden vermehrungsfähigen Embryonalzellen direkt regenerierend auf die Gehirnzellen des Patienten einwirken.
Basierend auf der Theorie, dass die Injektion der lebenden vermehrungsfähigen Embryonalzellen irgendwo im Körper des Patienten die Produktion von zellwachstumsfördernden Faktoren nach einem sogenannten Kaskadenmechanismus auslöst, kann auch das Phänomen der Besserung von Hirnstörungen erklärt werden. Im Gegensatz zu hochmolekularen Substanzen sind offensichtlich die vom Körper des Patienten selbst gebildeten zellregenerierenden Faktoren in der Lage, die Blut- Hirn-Schranke zu passieren und dann im Gehirn selbst ihre zellregenerierende Wirkung auszuüben.
Die Erfindung sei nun anhand von Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1
Herstellung eines injizierbaren pharmazeutischen Präparates, das lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen der schwarzen Rasse des Juraschafes enthält.
Vor ihrer Insemination werden die vorgesehenen Muttertiere durch zwei Markierungen an ihren Ohren so gekennzeichnet, dass jedes dieser Tiere in der Herde sofort identifiziert werden kann. Dies ist deshalb nötig, weil die Embryonen dem Muttertier vor dem Ende der Tragzeit entnommen werden müssen, und zwar jedem Muttertier dreieinhalb Monate nach seiner Befruchtung.
Unmittelbar bevor dem Muttertier die Embryonen entnommen werden, werden dem Muttertier Blutproben entnommen um festzustellen, ob das Tier an einer der folgenden Krankheiten leidet, bzw. die folgenden Krankheitserreger in seinem Blute feststellbar sind:
Bruzellose, die durch Brucella abortus (Bang Bakterien) und Brucella melitensis (Maltafieber) hervorgerufen wird, Salmonellose, die durch Salmonella typhi murium 0, Salmonella typhi murium H, Salmonella enteritidis Gärtner O, Salmonella enteritidis Gärtner H, Salmonella abortus ovis 0 und/oder Salmonella abortus ovis H hervorgerufen wird, Ornithose, bzw. Psittakose (Papageienkrankheit), die von grossen Viren mit der Bezeichnung Chlamydia hervorgerufen werden, sowie ferner Rickettsiose, Listeriose und Leptospirose.
Die entsprechenden Testverfahren sind in der Literatur beschrieben und sie werden in üblicher Weise durchgeführt.
Nur dann, wenn die Tests auf sämtliche dieser Mikroorganismen oder Krankheiten negativ sind, werden dem Tier die Embryonen entnommen. Kranke Tiere hingegen werden einem entsprechenden Heilverfahren unterzogen und man lässt sie ihre Jungen gebären und aufziehen.
Die Embryonen werden dem Muttertier entnommen, indem man bei dem Muttertier einen Kaiserschnitt vornimmt, den Uterus mit einer speziellen Pinzette abklemmt und ihn anschliessend vom Muttertier entnimmt und sofort in einen sterilen Behälter einbringt.
Unter vollkommen aseptischen Bedingungen, nämlich in einem Operationssaal, wird der Uterus geöffnet und die Lappen der Plazenta werden abgetupft. Anschliessend entnimmt man den Fötus oder die Föten aus ihren Fruchtblasen und seziert sie.
Praktisch jedes Organ, jedes Gewebe und jede Drüse des Embryos kann zur Herstellung der lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen enthaltenden pharmazeutischen Präparate herangezogen werden. Als Beispiele für verwendbare Gewebe, Organe oder Drüsen seien die folgenden genannt:
Leber, Herz, Nieren, Nebennieren, Milz, Knochenmark, Hypothalamus, Hypophyse, Lunge, Schilddrüse, Nebenschilddrüse, Plazenta, Thymusdrüse, Gehirn, Arterien, Magen, Zwölffingerdarm, Dünndarm, Dickdarm, Pankreas, Bindegewebe, Augen, Plazenta, Hoden und viele weitere Organe, Drüsen und Gewebe.
Einige der Organe des Embryos müssen einer Spezialbehandlung unterworfen werden, und zwar die folgenden:
Bei der Aufarbeitung der Plazenta des Embryos werden die Lappen der Plazenta von allen fasrigen Geweben, Schleimstoffen und Venen, von denen sie durchzogen sind, befreit.
Bei der Aufarbeitung des Magens des Embryos wird die Magenflüssigkeit sofort entfernt. Auch bei der Aufarbeitung von Dickdarm. Dünndarm, Zwölffingerdarm und Pankreas wird der Darminhalt, bzw. der Drüseninhalt sofort entfernt.
Bei der Aufarbeitung des Gehirns entfernt man sofort die harten Hirnhäute.
Sämtliche entnommenen Gewebe werden sofort mit physiologischer Kochsalzlösung, nämlich der sogenannten Ringer-Lösung gewaschen, um sie von anhaftenden Körperflüssigkeiten, beispielsweise Blut, zu befreien. Es werden von den entsprechenden Organen anhaftende Gewebsfasern und andere nicht zum Organ gehörende Materialien, wie zum Beispiel Schleimstoffe und ähnliches entfernt, damit diese organfremden Zellen nicht in das aus dem einzelnen Organ hergestellte pharmazeutische Präparat gelangen.
Jedes der einzelnen Organe, Gewebe oder Drüsen wird dann seziert und mit Spezialinstrumenten in ganz kleine Stücke zerteilt und diese werden mechanisch in einzelne Zellen zerlegt. Anschliessend werden diese einzelnen Zellen in der nötigen Menge einer physiologischen Kochsalzlösung, nämlich der sogenannten Ringer-Lösung suspendiert. Wie in der Folge noch erläutert werden wird, ist die optimale Anzahl an Zellen, die pro ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert wird, vom einzelnen Organ, Gewebe oder der Drüse abhängig.
Die Suspension der einzelnen Embryonalzellen in der physiologischen Kochsalzlösung wird dann filtriert, um darin vorkommende Teilchen, die grösser sind als Einzelzellen, zu entfernen.
Das so erhaltene Filtrat stellt das direkt injizierbare pharmazeutische Präparat dar, das durch intramuskuläre Injektion an den Patienten verabreicht werden kann. Unmittelbar vor der Verabreichung der Injektion wird jedoch das pharmazeutische Präparat, das die lebenden vermehrungsfähigen Embryonalzellen eines bestimmten Organes, Gewebes oder einer Drüse des schwarzen Juraschafes suspendiert in der physiologischen Kochsalzlösung enthält, darauf geprüft, ob irgendwelche Zellen vorhanden sind, die nicht vom Embryo sondern von den Plazentalappen des Muttertieres stammen. Dann wird unmittelbar vor der Injektion, vorzugsweise in einem Laboratorium direkt beim Operationssaal geprüft, ob in dem injizierbaren pharmazeutischen Präparat irgendwelche krankheitserregenden Mikroorganismen anwesend sind.
Besonders wichtig ist dabei die Prüfung auf die grossen Viren mit der Bezeichnung Chlamydia, die die Vogelseuchen mit der Bezeichnung Ornithosen hervorrufen. Die entsprechende Ornithose wird bei Papageien Papageienkrankheit oder Psittakose genannt. Ferner werden die injizierbaren Präparate vor ihrer Injektion auch auf die Abwesenheit von krankheitserregenden Bakterien getestet. Zu diesem Zweck können die in der Literatur beschriebenen Färbeverfahren von Stamm. bzw. Koster und Gram durchgeführt werden.
Wenn alle Tests negativ sind, dann wird das injizierbare Präparat sofort verabreicht.
Aus dem nachfolgenden Beispiel 2 ist ersichtlich, dass Embryonalzellen. die aus dem Gehirn oder Gehirnteilen stammen. wie zum Beispiel verlängertes Mark, Hypothalamus und Stirnlappen des Gehirns, in physiologischer Kochsalzlösung nur kurze Zeit überleben und auch in Zellkulturen schlechte Vermehrungschancen haben. Dies ist nicht überraschend, weil für den Fachmann auf dem Gebiet der Zellkulturen bekannt ist, dass aus dem Gehirn stammende Zellen ausserordentlich schwer ausserhalb des Gewebeverbandes isoliert zu züchten sind.
In der Praxis muss also beachtet werden, dass erfindungsgemässe pharmazeutische Präparate, bei denen die vermehrungsfähigen Embryonalzellen aus dem Gehirn oder Gehirnteilen des Embryos stammen, sofort durch Injektion an den Patienten verabreicht werden.
Wie aus dem nachfolgenden Beispiel 2 ferner ersichtlich ist, haben auch solche erfindungsgemässen pharmazeuti schen Präparate, deren lebende Embryonalzellen aus dem
Magen-Darmtrakt des Embryos stammen, häufig nur eine geringe Lagerfähigkeit, d. h. in ihnen nimmt der Anteil an lebenden Embryonalzellen bisweilen rasch ab. Dies dürfte darauf zurückzuführen sein, dass in derartige Zellsuspensionen manchmal trotz sorgfältiger Reinigung noch Verdauungsenzyme des Magen-Darmtraktes gelangen. Diese Verdauungsenzyme wirken zerstörend auf die isolierten Zellen.
Aus diesem Grunde muss man beachten, dass erfindungsgemässe pharmazeutische Präparate, die Embryonalzellen aus dem Magen-Darmtrakt enthalten, möglichst rasch durch Injektion an den Patienten verabreicht werden.
Die aus anderen Organen als dem Magen-Darmtrakt und dem Gehirn stammenden Zellen sind jedoch bei Aufbewahrung bei einer Temperatur von 4 "C gut lagerfähig und sie können ferner auch in entsprechenden Nährmedien mit Erfolg weitergezüchtet werden.
Beispiel 2 Weiterzüchtung der lebenden Embryonalzellen in einem
Nährmedium
Als Nährmedium wurde das Minimum essential medium Eagle with earth salt verwendet, das in der Folge mit MEM abgekürzt wird. Dieses Medium ist in der Veröffentlichung von H. Eagle, in Science , Heft 30, Seite 342, 1959, beschrieben. Zur Anzucht der Zellen wurde ein Medium bestehend aus 90% MEM plus 10% fötales Kälberserum verwendet.
Bei der Weiterzüchtung von lebenden vermehrungsfähigen Embryonalzellen in Nährmedien ist die Anzahl der Zellen pro ml der fraglichen Suspensionskultur ein wesentlicher Parameter. Die für die Weiterzüchtung optimale Anzahl hängt von dem Organ des Embryos ab, von welchem die Zellen stammen. Im allgemeinen sollen die Zellen in dem Medium zur Weiterzüchtung in einer Menge von 100 000 Zellen bis 1 000 000 Zellen pro ml vorliegen.
In den nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1 hergestellten Zellsuspensionen wurden bei entsprechender Verdünnung die Zellen gezählt. Anschliessend wurde eine solche Menge der Zellsuspension in 250 ml fassende Kultuflaschen, die das Nährmedium enthielten, eingesät, sodass pro cm2 Oberfläche des Nährmediums 2,3 x 103 Zellen eingebracht wurden. Die Kulturflaschen enthielten 20 ml an Nährmedium. Zum Beginn der Züchtung betrug die Zellkonzentration in dem Nährmedium 105 Zellen pro ml.
Die Zellen wurden unter optimalen Bedingungen bei 37 C 24 Stunden lang gezüchtet. Anschliessend wurde mit 50 ml Medium aufgefüllt und die Kulturen weitere vier Tage lang unter den optimalen Bedingungen inkubiert. Anschliessend wurden die Höfe mikroskopisch ausgezählt, die sich um die vermehrungsfähigen Zellen gebildet haben. Diese werden als Klone bezeichnet.
Sowohl in der zur Weiterzüchtung verwendeten frischen Zellsuspension als auch nach dem Züchtungsverfahren wurden die lebenden Zellen und die toten Zellen gezählt. Hierzu verwendete man eine Anfärbung mit Trypanblau, bzw. Methylrot in physiologischem Medium. Trypanblau färbt tote Zellen blau, während lebende Zellen farblos bleiben. Im Gegensatz dazu wird Methylrot von lebenden Zellen aufgenommen und diese werden dadurch gefärbt, während tote Zellen ungefärbt bleiben.
Vor der Färbung werden jeweils 0,2 Ill der Originalsuspension entnommen, entsprechend mit physiologischem Me dium verdünnt und dann gefärbt. Die Auszählung erfolgt in einer Fuchs-Rosenberg-Zählkammer. Aus den ausgezählten Werten wurden die Anzahl an lebenden Zellen und toten Zellen in der ursprünglichen Suspension berechnet. Es wurden die folgenden Werte bestimmt:
1. Gesamtzahl der Zellen pro ml, also die Anzahl der lebenden und toten Zellen pro ml in der Originalsuspension.
Zellbruchstücke werden nicht gezählt.
2. Die Anzahl der toten durch Trypanblau angefärbten Zellen pro ml der Originalsuspension.
3. Die Anzahl der lebenden, durch Methylrot gefärbten Zellen pro ml der Originalsuspension. Es zeigte sich nach mehreren Messungen, dass die Summe aus den durch Trypanblau gefärbten Zellen und Methylrot gefärbten Zellen sehr gut mit der Gesamtzahl der Zellen übereinstimmt. Aus diesem Grunde wurde bei weiteren Arbeiten nurmehr eine Färbung mit Trypanblau vorgenommen und die durch Trypanblau gefärbten Zellen von der Gesamtzahl der Zellen abgezogen, sodass man so die Anzahl der lebenden Zellen erhielt.
Berechnet wurde ferner der Anteil an lebenden Zeilen, also der Lebendzellenanteil, ausgedrückt in Prozent der Gesamtzellzahl.
Nach dem Züchtungsverfahren wurden ferner die folgenden Grössen bestimmt:
A) Die Klonierausbeute, also die Anzahl der innerhalb der Züchtungsperiode von insgesamt fünf Tagen in einer Kultur gebildeten Klone, ausgedrückt in Prozent aller eingesäten Zellen.
B) Die primäre Teilungseffizienz, nämlich die Anzahl der innerhalb der insgesamt fünf Tage dauernden Züchtung in einer Kultur gebildeten Klone, ausgedrückt in Prozent der eingesäten lebenden Zellen.
C) Die Anzahl der teilungsfähigen Zellen pro ml, also die Anzahl der Zellen pro ml Originalsuspension, welche innerhalb der fünf Tage dauernden Züchtung zur Bildung von Klonen befähigt waren.
Die für die einzelnen Zellarten gewonnenen Ergebnisse sind in der nachfolgende Tabelle I zusammengestellt. In der Tabelle werden für die einzelnen Spalten die folgenden Abkürzungen verwendet: GZZ = Gesamtzahl an Zellen pro ml x 106 TZA = Totzellenanteil, also Anzahl der toten Zellen pro mlx 106 LZA = Lebendzellenanteil, also Anteil der lebenden
Zellen, ausgedrückt in Prozent der Gesamt zellzahl KA = Klonierausbeute, also Anzahl der gebildeten
Klone in Prozent aller eingesäten Zellen PTE = Primäre Teilungseffizienz, Anzahl der Klone in Prozent der eingesäten lebenden Zellen GZZ x KA= Anzahl teilungsfähiger Zellen pro ml x 106, also die Menge der Zellen pro ml, welche
Klone gebildet haben.
Tabelle I Zelltyp GZZ TZA LZA KA PTE GZZxKA verlängertes Mark (vieleDebris) 14+4 4+1 71% < 1% < 1.5% < 0.21 Herz (starkeAggreg.) 7+2 - 100% 60% 60% 4.2 Hypothalamus 3+1 1+0.2 67% < 1% < 1.5% < 0.05 Knochenmark 45+7 1 98% 46% 47% 20.7 Leber 110+4 8+1 93% 45% 48% 49.5 Stirnlappen des Gehirns 8+3 5+2 37% < 1% < 3% < 0.24 Lunge 43+2 14+4 67% 13% 19% 8.2 Magen/Darm 22+6 20+5 9% 1% 10% 2.2 Magen/Darm 9+2 3+0.6 67% 4% 6% 0.54 Milz 50+7 3+1 94% 38% 40% 19 Nebenniere 5+1 3+1 40% 22% 55% 2.8 Nebenniere 0.7+0.3 0.6+0.1 14% 8% 57% 0.4 Niere 14+1 3+1 79% 20% 25% 2.8 Placenta 24+4 13+2 46% 27% 59%
14.2 Placenta normaleKonz. 17+11 16+11 6% 4% 67% 0.68 Placenta 66+6 36+3 45% 29% 64% 19.1 hohe Konz. Placenta sehr hohe Konz. 473+15 170+16 64% 43% 67% 203.4 Schilddrüse 23+4 16+3 30% 11% 37% 2.5 Schilddrüse normale Konz. 1.8+0.5 0.6+0.2 67% 25% 37% 0.5 Schilddrüse 4+2 2+0.6 50% 17% 34% 0.7 hohe Konz. Hoden 23+3 9+2 61% 24% 39% 5.5 Thymus 3.2.83 frisch 110+11 - 100% 70% 70% 77 Thymus3.2.83 91+4 13+1 86% - 6 Std. RT
Man sieht aus dieser Tabelle, dass frische Thymuszellen, Herzzellen, Knochenmarkzellen, Leberzellen und Milzzellen Lebendzellanteile von über 90%, bezogen auf die Gesamtzahl der Zellen, aufweisen. Relativ gering ist der Lebendzell anteil bei Gehirnteilen (Stirnlappen) und sehr stark von der Aufarbeitung abhängig bei Zellen aus dem Magen-Darmtrakt.
Die Präparate, die Plazentazellen enthalten und Schilddrüsenzellen enthalten, zeigen, dass der Lebendzellenanteil stark von der angewandten Konzentration abhängig ist.
Bei Lagerung der Thymuszellen während sechs Stunden bei Raumtemperatur nimmt der Lebendzellenanteil deutlich ab, was auf die zu hohe Lagerungstemperatur zurückzuführen ist. Werden nämlich die gemäss Beispiel 1 hergestellten Zellsuspensionen unter sterilen Bedingungen in der physiologischen Kochsalzlösung bei 4 "C während einer Woche gelagert, dann zeigen einige Organzellen der Embryonen noch immer erstaunlich hohe Lebendzellenanteile.
Tabelle II Zell typ Lebendzellenanteil nach einer Woche Lagerung Thymus 70% Milz 96% Knochenmark 94% Leber 90% Schilddrüse 60%
Es ist möglich, aus den im Nährmedium befindlichen, während fünf Tagen weitergezüchteten Embryonalzellen ein injizierbares pharmazeutisches Präparat herzustellen. Zu diesem Zwecke werden die Embryonalzellen aus dem Nährmedium isoliert, beispielsweise indem man sie abzentrifugiert.
Anschliessend werden dann die lebenden Embryonalzellen erneut in einer sterilen physiologischen Kochsalzlösung dispergiert, wobei man ein entsprechendes injizierbares pharmazeutisches Präparat erhält.
Beispiel 3 Herstellung eines tiefgefrorenen lebende Embryonalzellen enthaltenden pharmazeutischen Präparates
Die nach Beispiel 1 hergestellten injizierbaren pharmazeutischen Präparate sind, wie bereits erwähnt wurde, dann, wenn die Embryonalzellen aus anderen Organen stammen, als dem Magen-Darmtrakt und dem Gehirn, bei einer Aufbewahrung bei 4 C ohne weiteres eine Woche oder etwas länger lagerfähig.
Es zeigte sich jedoch, dass die in der physiologischen Kochsalzlösung dispergierten lebenden Embryonalzellen dann, wenn sie von anderen Organen stammen als dem Gehirn und dem Magen-Darmtrakt, noch länger lagerbar sind, indem man die Zellsuspension tiefgefriert.
Vor dem Tiefgefrieren werden der physiologischen Kochsalzlösung ein oder mehrere in injizierbaren Lösungen zulässige Stoffe beigegeben, die die Ausbildung grosser Eiskristalle verhindern. Derartige Zusätze sind für den Fachmann auf diesem Gebiet bekannt und als Beispiel hiefür sei Glyzerin genannt, das im allgemeinen in einer Menge von 10 Gew.-% bis 20 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht der Zellsuspension, beigegeben wird.
Eine Zellsuspension in der physiologischen Kochsalzlösung, die Herzzellen enthielt, wurde unter Aufrechterhaltung der sterilen Bedingungen mit 17 Gew.% Glyzerin, bezogen auf das Gesamtgewicht der Suspension versetzt. Dann wurde die Suspension unter sterilen Bedingungen in Ampullen abgefüllt und tiefgefroren und bei einer Temperatur von etwa - 120 C bis etwa -180 "C aufbewahrt.
Nach eineinhalb Monaten Lagerungszeit wurde die Pro be aufgetaut und nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Ver fahren verdünnt, mit Trypanblau gefärbt und ausgezählt. Es zeigte sich, dass die Probe einen Lebendzellenanteil von 92% besass.
Beispiel 4
Regenerierung von geschädigten adulten Affennierenzellen durch Embryonalzellen enthaltende Präparate
Adulte Affennierenzellen wurden in Monolayerkulturen zu 80% Konfluenz gezogen und mit Trypsin suspendiert.
Als optimales Medium zur Weiterzüchtung der adulten
Affennierenzellen wurde wieder das im Beispiel 2 beschriebe ne MEM-Medium verwendet, jedoch in diesem Fall 95%
MEM plus 5% fötales Kälberserum.
Dieses optimale Zuchtmedium befand sich in 75 ml Kul turflaschen, und zwar enthielt jede Kulturflasche 10 ml an
Medium. Pro Kulturflasche wurden 20 000 adulte Affennie renzellen eingesät und die Kulturen randomisiert. Die Kul turen wurden bis zum vierten Tag unter gleichen Bedingun gen weitergezüchtet.
Am vierten Tag wurden die Kulturen in fünf Gruppen aufgeteilt.
Bei den Gruppen 1, 2 und 5 wurde am vierten Tag das
Medium gewechselt und ein Medium eingesetzt, das nur 1 % fötales Kälberserum und 99% MEM enthielt.
Bei den Gruppen 3 und 4 wurde zwar auch das Medium gewechselt, jetzt jedoch wiederum ein Medium verwendet, das 5% fötales Kälberserum plus 95% MEM enthielt.
Bis zum Mediumwechsel wurde bei allen Kulturen ein gleiches Wachstum beobachtet und die Kulturen erreichten bis dahin 22 000 Zellen pro Kultur bis 28 000 Zellen pro
Kultur.
Nach dem Mediumwechsel wurden sämtliche Kulturen bis zum achten Tage inkubiert, und am 12. Tag wurde wie der bei allen Kulturen das Medium gewechselt.
In den Gruppen 3 und 4 zeigte sich ein kontinuierliches Wachsen der Zellen und am 12. Tag waren in der Gruppe 3
660 000 Zellen pro Kultur vorhanden, in der Gruppe 4
630 000 Zellen pro Kultur. In den Kulturen 1, 2 und 5, bei denen mit dem verminderten Gehalt an fötalem Kälberserum weitergezüchtet wurde, zeigte sich eine deutliche Schädigung der adulten Nierenzellen. In den Gruppen 1 und 2 war die Zellzahl pro Kolonie zum 12. Tag nur auf 60 000 gestiegen und in der Gruppe 5 nur auf 160 000.
Ferner zeigte sich in den Gruppen 1, 2 und 5 eine deutliche morphologische Veränderung der geschädigten Zellen gegenüber den ungeschädigten Zellen der Gruppen 3 und 4.
Die geschädigten Zellen wiesen ein stark vergrössertes Cytoplasma auf und enthielten mehrere Zellkerne.
Am 12. Tag wurde in den Gruppen 1, 2, 3,4 und 5 wiederum das Medium gewechselt und die adulten Affennierenzellen sämtlicher Gruppen wurden weiter auf einem Medium aus 95% MEM Medium plus 5% fötalem Kälberserum weitergezogen.
In der Gruppe 3, stieg die Zellzahl der ungeschädigten Nierenzellen von 660 000 am 12. Tag kontinuierlich auf 1 300 000 am 20. Tag an.
Die ungeschädigten Zellen der Gruppe 4 wurden in zwei
Untergruppen (a) und (b) unterteilt. Zu der Kultur der Un tergruppe (a) wurden am 12. Tage 11 000 Leberzellen der
Embryonen des Juraschafes und zu der Gruppe (b) 14000
Herzzellen der Embryonen des Juraschafes zugesetzt. Diese embryonalen Zellsuspensionen wurden nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1 hergestellt.
Nach der Zugabe der embryonalen Herzzellen in der
Gruppe 4 stieg die Zellenzahl von 630 000 am 12. Tage auf
1 700 000 am 20. Tag an. Nach der Zugabe der Leberzellen konnte die Kultur nur bis zum 18. Tag verfolgt werden, weil dann bereits vollständige Konfluenz in der Zellkultur Flasche bestand und sich die Zellen im Wachstum gegenseitig hemmten.
Man sieht aus diesen Werten, dass ungeschädigte adulte Affennierenzellen durch die Zugabe von embryonalen Zellen des Schafes anderer Organe, nämlich z.B. Herzzellen oder Leberzellen in ihrem Wachstum und ihrer Zellvermehrung gegenüber ungeschädigten Affennierenzellen, die ohne Zugabe von Embryonalzellen weitergezüchtet wurden, deutlich erhöht sind.
Die geschädigten Zellen der Gruppe 2 wurden ohne Zugabe von Fötalzellen in dem Medium mit 5% Gehalt an fötalem Kälberserum weitergezüchtet und es zeigte sich dabei zum 20. Tage ein leichter Anstieg der Zellzahl von 60 000 pro Kultur auf 240 000 pro Kultur. Jedoch blieben die morphologischen Veränderungen der Zellen erhalten, und es wurde keine Abnahme der Anzahl der Zellen mit vergrössertem Cytoplasma festgestellt.
Die geschädigten Zellen der Gruppe 1 wurden bei der Weiterzüchtung in zwei Untergruppen (a) und (b) unterteilt.
In der Gruppe (a) wurden dem Medium mit einem Gehalt von 5% an fötalem Rinderserum pro Kultur 10 000 embryonale Leberzellen zugesetzt und in der Gruppe (b) statt dessen pro Kultur 10 000 embryonale Herzzellen zugesetzt. In der Gruppe (a) stieg dabei die Zellzahl von 60 000 am 12. Tag bis 750 000 am 20. Tag an. In der Gruppe (b) stieg die Zellzahl von 60 000 am 12. Tag auf 1 300 000 adulte Nierenzellen pro Kultur am 20. Tag an.
Die geschädigten Zellen der Gruppe 5 wurden wiederum in zwei Untergruppen (a) und (b) unterteilt. Zu der Gruppe (a) wurden 2%, bezogen auf das Medium einer Suspension von toten lyophilisierten embryonalen Leberzellen zugesetzt.
Zu der Gruppe (b) wurden pro Kultur 10 000 lebende embryonale Nierenzellen zugesetzt. In der Gruppe (a) verminderte sich die Zellzahl von 160 000 Zellen am 12. Tag auf 60 000 Zellen. Vermutlich wurden die geschädigten Nierenzellen durch lysosomale Enzyme, die beim Lyophilisieren der embryionalen Leberzellen freigesetzt wurden, lysiert.
In der Gruppe 5 (b) hingegen stieg die Zellzahl von 160 000 am 12. Tag auf 480 000 Zellen pro Kultur am 20.
Tag an.
Sehr deutlich konnte auch in den Gruppen la, 1b und 5b die Regenerierung der geschädigten adulten Affennierenzellen durch die Zugabe der embryonalen Leberzellen, Herzzellen und Nierenzellen festgestellt werden. Die Anzahl der Zellen mit vergrössertem Cytoplasma nahm ab und es wurden wieder vermehrt die normalen kleineren Nierenzellen aufgefunden.
In der Gruppe 5b, wo organgleiche Embryonalzellen zugesetzt wurden, wurde ferner eine ausgeprägte Kontaktbildung zwischen den embryonalen und den adulten Nierenzellen festgestellt. Es wurden oft Tentakel gebildet.
Die Versuche zeigen, dass geschädigte adulte Zellen durch blosses Zurückwechseln auf das optimale Medium nicht regeneriert werden. Durch Zugabe von lyophilisierten lebenden Embryonalzellen werden sie sogar noch weiter im Wachstum behindert und geschädigt. Setzt man jedoch bei den geschädigten Zellen zu dem optimalen Wachstumsmedium noch embryonale Zellen des gleichen Organes oder eines fremden Organes zu, dann erfolgt nicht nur eine Steigerung des Zellwachstums sondern auch eine Regenerierung der geschädigten Zellen. Auch ungeschädigte adulte Nierenzellen werden durch die Zugabe von embryonalen Zellen in ihrem Wachstum gefördert.
Beispiel 5
Es wurde die gleiche Versuchsanordnung beibehalten wie in Beispiel 4, jedoch wurden jetzt adulte Affenherzzellen geschädigt und es wurde ihre Regeneration mit frischen fötalen Schafnierenzellen bestimmt. Am Anfang wurde bei diesem Versuche eine höhere Anzahl an adulten Herzzellen eingesät und so war nach vier Tagen Wachstum in dem Medium aus 95% MEM plus 5% fötalem Kälberserum in allen Kulturen eine Zellzahl von 280 000 erreicht. Auch hier wurde am vierten Tag das Medium gewechselt. In der Gruppe, die weiterhin mit einem Medium mit 5% Zusatz an fötalem Kälberserum gezüchtet wurde, stieg die Anzahl der Herzzellen auf
1 500 000 bis 1 900 000 pro Kultur nach acht Tagen Weiterzucht, also bis zum 12. Tag an.
Zu denjenigen Gruppen, wo vom vierten Tag bis zum 12.
Tag auf einem Medium mit nur 1 % an fötalem Kälberserum weitergezüchtet wurde, war die Zellzahl auf etwa 440 000 Zellen pro Kultur gestiegen.
Zu derjenigen Gruppe, wo die geschädigten Zellen dann drei Tage lang auf dem optimalen Medium mit 5% fötalem Kälberserum weitergezüchtet wurden, sank die Zahl der Zellen von 440 000 Zellen pro Kultur auf 43 000 pro Kultur ab, woraus man sehen kann, dass eine Regeneration durch blossen Wechsel auf das optimale Medium nicht mehr möglich war.
Zu derjenigen Kultur von geschädigten Zellen, wo am 12.
Tage zu dem Medium mit 5% fötalem Kälberserum ausserdem noch 10 000 fötale Schafsnierenzellen zugesetzt wurden, stieg die Zellzahl bis zum 15. Tag von 440 000 Zellen pro Kultur auf 670 000 Tellen pro Kultur an.
Zu einer Kultur mit ungeschädigten adulten Affenherzzellen wurden fötale Nierenzellen zugesetzt. Dabei konnten jedoch die Zellzahlen nicht mehr ausgewertet werden, weil die adulten Zellen bereits konfluent waren und der Versuch wurde dementsprechend abgebrochen.
Auch aus diesem Beispiel sieht man, dass geschädigte adulte Zellen durch Zugabe von fötalen Zellen eines anderen Organes regeneriert werden können.
Beispiel 6 Regeneration von geschädigten menschlichen Epithelzellen durch embryonale Nierenzellen
Die in Beispiele 4 und 5 beschriebenen Versuche deuten darauf hin, dass bei Schädigung von adulten Affennierenzellen, bzw. Affenherzzellen, offensichtlich im Skelett der Zelle Änderungen auftreten. Ungeschädigte menschliche Epithelzellen besitzen in ihrer Zellmembran verankertes Actin. Es soll in diesem Beispiel untersucht werden, wie sich das Actingerüst der menschlichen Epithelzellen bei Schädigung, bzw. Regenerierung verhält.
Zu diesem Zwecke werden die Actin enthaltenden Mikrofilamentbänder durch Antiactin-Antikörper sichtbar gemacht, die mit Fluorescein-isothiocyanat (FITC) markiert sind.
Erzeugung der Antiactin-Antikörper
In immunisierte Kaninchen erfolgte eine Verabreichung von Actin, und zwar erhielten sie am 1. und am 7. Tag durch intramuskuläre Injektion jeweils 0,3 mg gereinigtes Actin, das in 0,5 ml Freud's Adjuvant emulgiert war. Freud's Adjuvant ist in Chemical and Biological Bases ofAdjuvants von Jolle und Paraf, Berlin, Springer 1973, beschrieben.
Anschliessend wurden dann an das Kaninchen noch weitere Mengen an Actin verabreicht, jedoch jetzt intravenös mit Actin, das an Aluminiumverbindungen absorbiert ist.
Zu diesem Zweck wurden 1-2 mg Actin/ml mit 0,5 ml einer 10%-igen wässrigen Lösung an KAl (SO4)2 pro mg Protein gemischt. Der pH-Wert wurde mit Natronlauge auf 7,3 eingestellt und der Niederschlag in 0,15 molarer wässriger Natriumchloridlösung in einer Konzentration von 1 mg Actin pro ml suspendiert. Am 16., 18., sowie am 21. Tag wurden 0,1 mg Actin pro Kaninchen injiziert, am 26., 28.
und 30. Tag 0,2 mg Actin pro Kaninchen, am 33. Tag 0,3 mg Actin pro Kaninchen und schliesslich am 37. Tag 0,8 mg Actin pro Kaninchen.
Am 40. Tag wurde den Tieren Blut entnommen.
Nach einer Ammoniumsulfatfällung der gesammelten Seren wurde die Gammaglobulin-Fraktion auf einer Actin Sepharose-Säule gereinigt.
Die gebundenen Antiactin-Antikörper wurden von der Säule mit 0,2 molarem wässrigen Glyzerin, dessen pH-Wert durch Salzsäure auf 2,7 eingestellt wurde, eluiert, die Frak tonen welche den Antiactin-Antikörper enthielten, miteinander vereinigt und gegen eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung dialysiert und auf 0,1 mg/ml Protein konzentriert.
Die Reinheit des Antiactin-Antkörpers wurde mit Actin nach dem Verfahren überprüft, das von Ouchterlony im Handbook of Experimental Immunology von L. A.
Nilsson, 19.1 - 19.39, Blackwell Scientific Publication, Oxford, 1973, beschrieben ist.
Immunofluoreszenz-Färbung von ungeschädigten, geschä digten, bzw. regenerierten menschlichen Epithelzellen
Die zell beschichteten Deckgläser wurden zweimal mit einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung, abgekürzt PBS gewaschen und dann mit einer Lösung aus 10 Vol-% PBS plus 10 Vol-% Glyzerin plus 10 Vol-% Dimethylsulfoxid behandelt. Diese zuletzt genannte Lösung wird mit GS-PBS abgekürzt.
Dann fixiert man während 10 Min. durch Behandlung mit einer Lösung aus PBS mit 2 mM KCI, die ferner, bezogen auf das Gesamtvolumen der Lösung, 3,7 Vol-% Formal dehydlösung. 10% Glyzerin und 10% DMSO enthält.
Schliesslich wird zweimal mit GS-PBS gewaschen, 4 Min. bei 0 C in Methanol getaucht und schliesslich 2 Min. in Aceton bei - 70 DC gelassen.
Anschliessend werden die Gläser an der Luft getrocknet und in einer Befeuchtungskammer mit 20 ul des nach dem vorher beschriebenen Verfahren hergestellten Antiactin Antikörper-Konzentrates bei 37 "C während 45 Min. inkubiert. Anschliessend wird mit PBS gewaschen.
Schliesslich erfolgt die Markierung mit dem Fluorescein Isothiocyanat, abgekürzt als FITC, indem man nach dem Waschvorgang mit 20 u1 an FITC-konjugiertem Schafsantikaninchengammaglobulin bei 37 "C während 45 Min. inkubiert. Schliesslich wird wieder mit PBS gewaschen und die Zellen werden dann mit einem weiteren Deckgläschen abgedeckt.
Durch dieses Markierungsverfahren werden in den Zellen die Actin enthaltenden Mikrofilamentbündel durch den fluoreszierenden Antiactin-Antikörper sichtbar gemacht.
Gesunde nicht geschädigte menschliche Epithelzellen zeigen die mit dem fluoreszierenden Antikörper markierten Actin-Mikrofilamentbündel. Dabei bildet das Actin mit seiner faserförmigen Struktur das Gerüst der vollständigen zelle.
Das Actin stützt also skelettmässig die äussere Membran der Zelle und bestimmt dadurch ihre äussere Form.
Bei den geschädigten menschlichen Epithelzellen fehlt offenbar die Verankerung des Actins an der Zellmembran. In diesem Fall besitzt das mit dem fluoreszierenden Antikörper markierte Actin keine faserförmige Struktur sondern eine amorphe Struktur und es befindet sich ausserdem hauptsächlich im Inneren der Zelle und nicht an der Zellmembran verankert. Bei den geschädigten Zellen ist also die äussere
Form der Zelle nicht mehr fixiert und die Zellmembran kann sich in allen Richtungen ausdehen. Es entstehen dadurch
Zellen mit stark vergrössertem Umfang, beispielsweise runde
Zellen.
Züchtung, Schädigung und Regeneration der menschlichen
Epithelzellen
Die menschlichen Epithelzellen wurden in Petrischalen auf Deckgläschen in Monolayer-Kulturen gezogen. Als
Zuchtmedium dienten 95 Vol.-% MEM plus 5% fötales
Kälberserum.
Nach vier Tagen wurde das Medium gewechselt und man züchtete auf einem Medium aus 99 Vol.-% MEM und 1 Vol.-% embryonalem Kälberserum während acht Tagen, also bis zum 12. Tag, gerechnet vom Beginn der Züchtung, weiter. Durch die Verminderung des Gehaltes an fötalem Kälberserum in dem Zuchtmedium wurden die Zellen geschädigt. Die Schädigung der Zellen wurde nach dem weiter vorne beschriebenen Verfahren mit Hilfe des fluoreszierenden Antiactin-Antikörpers sichtbar gemacht.
Am 12. Tage wurde das Medium wieder gewechselt und man züchtete die Zellen auf einem Medium aus 95 Vol.-% MEM und 5 Vol.-% fötalem Kälberserum weiter. Zu einer Gruppe von Proben setzte man gleichzeitig ein nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1 hergestelltes embryonale Schafsnierenzellen enthaltendes Präparat zu, und zwar in einer solchen Menge, dass pro Kultur 10 000 embryonale Schafsnierenzellen zugesetzt wurden.
In denjenigen Proben, wo ohne Zugabe der Schafsnierenzellen auf dem 5% fötales Kälberserum enthaltenden Medium weitergezüchtet wurde, zeigte sich mehrere Tage später keine Regeneration der geschädigten menschlichen Epithelzellen. Dies wurde durch die oben beschriebene Anfärbung mit dem fluoreszierenden Antiactin-Antikörper sichtbar gemacht. Bei denjenigen Proben, bei denen in dem 5% fötales Kälberserum enthaltenden Medium unter Beigabe der 10 000 embryonalen Schafsnierenzellen weitergezüchtet wurde, liess sich nach einigen Tagen eine deutliche Regenerierung der geschädigten Zellen feststellen.
Mit Hilfe der Anfärbung mit dem fluoreszierenden Antiactin-Antikörper konnte sichtbar gemacht werden, dass das Actin wieder zur Zellenmembran zurückwandert und wie bei den ungeschädigten gesunden Zellen sich offensichtlich wieder in der Zellmembrane verankert und diese stützt. Die regenerierten Zellen nehmen auch wieder ihre urpsrüngliche Grösse und Form an.
Die oben beschriebenen Versuche zeigen, dass durch die Zugabe von frischen lebenden Embryonalzellen ein durch Schädigung zerstörtes Stützgerüst des Actins von menschlichen Epithelzellen wieder aufgebaut werden kann und dass die geschädigten Zellen so wieder die Form und Grösse von ungeschädigten Zellen annehmen.
Beispiel 7
Nachweis von zellregenerierenden Faktoren im Serum
In diesem Beispiel wurde untersucht, wie menschliches Serum das Wachstum von ungeschädigten embryonalen Nierenzellen und ungeschädigten adulten Nierenzellen beeinflusst. Die embryonalen Nierenzellen waren Nierenzellen der Embryonen der schwarzen Rasse des Juraschafes, und zwar die gleiche Art an Zellen, die auch zur Herstellung der erfindungsgemässen Präparate verwendet wurde.
Bei diesem Versuch wurden 1 000 000 embryonale Nierenzellen bzw. 1 000 000 adulte Nierenzellen in 75 ml Zell kulturflaschen eingesät. In diesen Zellkulturflaschen befan den sich jeweils 10 ml eines Kulturmediums aus 95 Vol.-% MEM plus 5 Vol.-% fötalem Kälberserum.
Nach der Anzuchtphase wurden die Kulturen in mehrere Gruppen unterteilt. In allen Gruppen wurde das Medium gewechselt und drei Tage nach dem Mediumwechsel und sie ben Tage nach dem Mediumwechsel in den Kulturen die Anzahl der embryonalen Nierenzellen bzw. drei Tage und fünf Tage nach dem Mediumwechsel die Anzahl der adulten Affennierenzellen bestimmt.
In der Gruppe zu Vergleichszwecken wurde ohne Zusatz von Humanserum auf einem Medium aus 95 Vol.-% MEM plus 5 Vol.-% fötalem Kälberserum ohne irgendwelchen Zusatz von menschlichem Serum, also Humanserum, das in der Folge mit HS bezeichnet wird, weitergezüchtet.
In den anderen Gruppen wurden auf dem gleichen Medium, jedoch unter Zugabe von 2,5 VoL-% Humanserum, bezogen auf das Gesamtmedium, weitergezüchtet. In diesem Test zeigt eine deutliche Zellvermehrung der ungeschädigten embryonalen, bzw. adulten Nierenzellen, in den Gruppen mit Zugabe von menschlichem Serum im Vergleich zu der Kontrollgruppe die Anwesenheit von zellregenerierenden Faktoren in dem menschlichen Serum an.
Beispiel 8 Bestimmung von zellregenerierenden Faktoren im Serum erwachsener menschlicher Patienten vor Verabreichung eines erfindungsgemässen Präparates und nach dessen Verabrei chung
Die Tests wurden nach den in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der dort beschriebenen embryonalen Nierenzellen bzw. adulten Nierenzellen durchgeführt.
Es wurden, wie in Beispiel 7 erläutert, pro Zellkulturflasche 1 000 000 embryonale Nierenzellen bzw. 1 000 000 adulte Nierenzellen eingesetzt und nach der Anzuchtphase erfolgte der Mediumwechsel, wobei in der Kontrollgruppe jeweils ohne Zugabe von Humanserum weitergezüchtet wurde, in den übrigen Gruppen unter Zugabe von 2,5% Humanserum, bezogen auf das Gesamtmedium. Die Medien waren die gleichen wie in Beispiel 7 beschrieben und die Auszählung der Zellen erfolgte zwei Tage nach dem Medium wechsel und fünf Tage nach dem Mediumwechsel.
Den menschlichen Patienten wurde unmittelbar vor der Injektion eines erfindungsgemässen lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen von Säugetieren enthaltenden pharmazeutischen Präparates Blut entnommen und ferner vier Tage nach der Injektion des erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparates und elf Tage nach der Injektion des erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparates.
Wenn in dem Körper des Patienten durch die Verabreichung des erfindungsgemässen lebende Frischzellen enthaltenden Präparates irgendwelche cytotoxischen Substanzen gebildet würden, dann müssten sie vier Tage nach der Verabreichung bzw. elf Tage nach der Verabreichung bereits im Serum des Patienten feststellbar sein. Die Anwesenheit solcher cytotoxischer Substanzen würde zu einem Absterben embryonaler Nierenzellen bzw. adulter Nierenzellen führen und dementsprechend zu einer verminderten Zellenzahl in den Proben unter Zugabe von Humanserum im Vergleich zu den Kontrollproben ohne Zugabe von Humanserum.
Tests unter Verwendung der adulten Nierenzellen
Beim Wechsel des Nährmediums nach der Anzuchtphase wurden die folgenden Gruppen an Proben weitergezüchtet:
Gruppe %Humanserum Ursprung des Humanserums A 1 0% Kontrollprobe ohne Zusatz von
HS A 2 2,5% Patient A vor FZ-Injektion A 3 2,5% Patient A 4 Tage nach FZ-Inj.
A 4 2,5% Patient A 11 Tage nach FZ-Inj.
A 5 2,5% Patient B vor FZ-Injektion A 6 2,5% Patient B 4 Tage nach FZ-Inj.
A 7 2,5% Patient B 11 Tage nach FZ-Inj.
In der obigen Tabelle und in nachfolgenden Tabellen bedeutet FZ-Injektion , bzw. FZ-Inj. jeweils Frischzellen- injeküon
Die bei den Gruppen A 1- A 7 nach drei Tagen, bzw.
fünf Tagen in den Kulturen festgestellten Anzahlen an adul ten Nierenzellen, sind in der folgenden Tabelle III zus am- mengestellt.
Tabelle III Versuchsgruppe Anzahl Zellen nach 3 Tagen nach 5 Tagen Al 3,8 x 105 8,6 x A2 4,5 > < i0 9,3 x 105 A3 4,3 x 105 9,2 > < i0 A4 4,3 x 105 8,7 x 105 AS 4,8 x 105 8,9 x 105 A6 4,7 x 105 9,2 x 105 A7 4,9 x 105 9,0 x
Man sieht aus den in Tabelle III angeführten Ergebnissen, dass in sämtlichen Gruppen eine ähnlich starke Zeliver- mehrung stattgefunden hat.
Ein Vergleich der Gruppe A 2 mit der Gruppe A 4, bzw. der Gruppe A 5 mit der Gruppe A 7, zeigt, dass vor der Frischzellentherapie und elf Tage nach der Frischzellentherapie gewonnenes menschliches Serum das Wachstum von adulten Nierenzellen nicht wesentlich beeinflusst. Dies beweist, dass sich im Körper des Patienten nach der Frischzelleninjektion keine cytotoxischen Substanzen gebildet haben, weil in den Proben mit der Zugabe des entsprechenden Serums kein Absterben der adulten Nierenzellen, sondern ein normales Weiterwachsen festgestellt werden konnte.
Bei den in Tabelle III zusammengestellten Tests wurden die adulten Nierenzellen in dem jeweiligen Medium bei 37 0C bis zur Konfluenz gezogen. Nach drei Tagen und nach fünf Tagen wurde jede der Zellkulturflaschen an drei verschiedenen Stellen photographiert und dort wurden die Zellen aus gezählt. Die in der Tabelle III angegebenen Zellzahlen sind jeweils der Mittelwert aus diesen drei Auszählungen.
Tests unter Verwendung der embryonalen Nierenzellen
Beim Wechsel des Nährmediums nach der Anzuchtphase der embryonalen Nierenzellen wurden die folgenden Gruppen an Proben weitergezüchtet. Die Kontrollprobe wurde wieder ohne Zusatz von Humanserum gezüchtet. Die Proben an Humanserum stammten von den gleichen Patienten A und B jeweils vor der Frischzelleninjektion, vier Tage nach und elf Tage nach der Frischzelleninjektion.
Nach dem Mediumwechsel wurden die Zellen bei 37 0C bis zur Konfluenz gezogen. Drei Tage nach dem Medium wechsel, bzw. sieben Tage nach dem Mediumwechsel wurde jede der Zellkulturflaschen an drei verschiedenen Stellen photographiert und dort wurden die Zellen ausgezählt. Die in der nachfolgenden Tabelle IV angegebenen Zellzahlen sind ebenfalls jeweils der Mittelwert aus diesen drei Auszählungen.
Es wurden die folgenden Gruppen an Proben weitergezüchtet: Gruppe % Humanserum Ursprung des Humanserums E 1 0 % Kontrollprobe ohne Zusatz von
HS E 2 2,5 % Patient A vor FZ-Injektion E 3 2,5 % Patient A 4 Tage nach FZ-Inj.
E 4 2,5 % Patient A 11 Tage nach FZ-Inj.
E 5 2,5 % Patient B vor FZ-Injektion E 6 2,5 % Patient B 4 Tage nach FZ-Inj.
E 7 2,5 % Patient B 11 Tage nach FZ-Inj.
Die bei den Gruppen E 1- E 7 nach drei Tagen, bzw. sieben Tagen in den Kulturen bestimmten Mittelwerte an embryonalen Nierenzellen sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt.
Tabelle IV Versuchgruppe Anzahl Zellen nach 3 Tagen nach 7 Tagen E 1 2,3 x 105 4,0 x 105 E2 1,6 x 105 2,8 > < x 105 l0 E3 1,8 x 105 2,7 x 105 E4 3,0 x 105 3,7 x 105 E5 1,5 x 105 3,0 > < x 105 l0 E6 1,8 x 105 3,8 x 105 E7 2,2 x 105 3,6 x 105
Aus den in Tabelle IV zusammengestellten Werten für die Zellzahlen sieht man, dass in dem Serum der Patienten nach der Frischzellentherapie keine cytotoxischen Substanzen feststellbar sind.
Beim Vergleich der Gruppe E 2 mit der Gruppe E 4, bzw.
der Gruppe E 5 mit der Gruppe E 7, sieht man, dass nach einer Züchtungszeit von drei Tagen zwischen den beiden Gruppen deutlichere Unterschiede in der Anzahl der Zellen pro Kultur bestehen als nach sieben Tagen. Dies ist darauf zurückzuführen, dass sich die Zellen nach sieben Tagen bereits nicht mehr in der Wachstumsphase befinden. Nach drei Tagen Züchtung sieht man jedoch, dass sowohl beim Patienten A als auch beim Patienten B ein Serum, das vor der Frischzelleninjektion gewonnen wurde, zu einer wesentlich geringeren Zellvermehrung führt, als ein Serum, das elf Tage nach der Frischzelleninjektion gewonnen wurde.
Wie man aus der Tabelle IV sehen kann, haben sich die embryonalen Nierenzellen in der Gruppe E 4, also bei derjenigen Kultur, in der eine Serumprobe des Patienten A zugesetzt wurde, die elf Tage nach der Frischzelleninjektion genommen wurde, im Vergleich zu der Zellkultur, bei der Serum des gleichen
Patienten, jedoch vor der Frischzellenbehandlung zugesetzt wurde, nämlich der Gruppe E 2 nahezu verdoppelt.
An diesen Versuchen sieht man also, dass fünf Tage nach der Frischzelleninjektion im Serum des Patienten irgendwel che Substanzen enthalten sind, die das Wachstum von em bryonalen Nierenzellen fördern. Diese wachstumsfördern den Substanzen werden in der Folge auch als Stimuline be zeichnet.
Deutlich zu sehen ist aus den Ergebnissen der Tabelle IV ferner, dass in der Gruppe E 3 und in der Gruppe E 6, also in denjenigen Serumproben, die vier Tage nach der Injektion der Frischzellen gewonnen wurden, offensichtlich weniger das Wachstum der embryonalen Nierenzellen fördernde
Substanzen enthalten sind, als in denjenigen Serumproben, die dem gleichen Patienten elf Tage nach der Frischzelleninjektion entnommen wurden, nämlich den Proben der Grup pe E 4 und E 7. Daraus kann man schliessen, dass die das
Zellwachstum fördernden Stoffe nicht von den injizierten
Embryonalzellen selbst stammen, sondern dass die injizier ten lebenden Embryonalzellen im Organismus des Patienten die Bildung der Stimuline hervorgerufen haben, die das
Wachstum der embryonalen Nierenzellen fördern.
Beispiel 9
Nachweis von zellregenerierenden Faktoren im Serum
Es wurde ähnlich gearbeitet, wie in Beispiel 7, jedoch wurde jetzt untersucht, wie menschliches Serum das Wachs tum von geschädigten adulten Zellen beeinflusst. Auch wie in Beispiel 7 wurden als adulte Nierenzellen jetzt wieder ent sprechende Affennierenzellen verwendet.
Bei diesem Versuch wurden jeweils 20 000 adulte Nieren zellen in 75 ml Zellkulturflaschen eingesät. In diesen Zellkul turflaschen befanden sich jeweils 10 ml eines Kulturmediums aus 95 Vol.-% MEM plus 5 Vol.-% fötalem Kälberserum.
Es wurde in diesem Medium wieder bei einer Temperatur von 37 "C gezüchtet und nach dieser Anzuchtphase, die sechs
Tage dauerte, wurde das Medium gewechselt. Nach der An zuchtphase wurden die Kulturen in mehrere Gruppen unter teilt.
In allen Gruppen wurde das Medium gewechselt.
In einer Gruppe, die als Gruppe zu Vergleichszwecken dient, wird doch die folgenden zwölf Tage lang wieder in ei nem Medium gezüchtet, das 95 Vol.-% an MEM plus 5
Vol.-% an fötalem Kälberserum enthält. In diesem Medium wurden die adulten Affennierenzellen nicht geschädigt.
In den übrigen Gruppen wurde zwölf Tage lang in einem
Medium weitergezüchtet, das nur 1 Vol.-% an fötalem Käl berserum und 99 Vol.-% an MEM enthält. In diesem Medi um wurden die adulten Affennierenzellen geschädigt. Nach dieser Schädigungsphase wurde in allen Gruppen das Medi um wieder gewechselt, und zwar auf ein Kulturmedium aus
95 Vol.-% MEM plus 5 Vol.-% fötalem Kälberserum.
In einigen Gruppen wurden ferner dem Medium 2,5
Vol.-%, bezogen auf dieses Gesamtmedium, an menschli chem Serum zugesetzt.
Eine merkliche Zellvermehrung in denjenigen Gruppen, die unter Beigabe von menschlichem Serum weitergezüchtet wurden, im Vergleich zu der Gruppe an geschädigten Zellen, die nur in dem Medium aus 95 Vol.-% MEM plus 5 Vol.-% fötalem Kälberserum weitergezüchtet wurde, zeigt die An wesenheit von zellregenerierenden Faktoren im getesteten
Serum an. Die Anwesenheit von derartigen zellregenerieren den Faktoren kann auch an den geschädigten Zellen festge stellt werden, indem nämlich die gestörte Morphologie der geschädigten adulten Säugetierzellen gebessert oder beseitigt wird. Auch in diesem Falle erfolgt der Vergleich zwischen den entsprechenden Proben mit Serumzusatz und den Pro ben ohne Serumzusatz.
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Beispiel 10
Bestimmung von zellregenerierenden Faktoren im Serum er wachsener menschlicher Patienten vor Verabreichung eines erfindungsgemässen Präparates und nach dessen Verabrei chung
Diese Tests wurden nach dem in Beispiel 9 beschriebenen
Verfahren unter Verwendung von Affennierenzellen durch geführt. Nach der in Beispiel 9 beschriebenen, sechs Tage dauernden Anwachsphase folgte der Mediumwechsel. In der
Gruppe 1 wurden die Zellen nicht geschädigt, da man diese wiederum in einem Medium mit 5% fötalem Kälberserum plus 95% MEM weiterzüchtete.
In den Gruppen 2 bis 7 wurden die Zellen zwölf Tage lang geschädigt, indem man sie in dem Medium mit nur 1 Vol.-% Kälberserum plus 99 Vol.-% MEM weiterzüchtete.
Anschliessend wurden dann in den Gruppen 2 bis 7 die geschädigten Zellen in Medien weitergezüchtet, die 95% MEM und 5% fötales Kälberserum enthielten und ferner 2,5 Vol. %, bezogen auf das Gesamtvolumen des Mediums an menschlichem Serum. Das menschliche Serum stammte von drei verschiedenen Patienten, und zwar wurde es jeweils vor der Frischzelleninjektion und elf Tage nach der Frischzelleninjektion, bzw. in einem Fall vier Tage nach der Frischzelleninjektion aus Blutproben der entsprechenden Patienten gewonnen.
Die getesteten Gruppen waren die folgenden: Gruppe % Humanserum Ursprung des Humanserums 1 0 % ungeschädigte Zellen 2 2,5 % Patient A vor FZ-Injektion 3 2,5 % Patient A 11 Tage nach FZ-Inj.
4 2,5 % Patient C vor FZ-Injektion 5 2,5 % Patient C 11 Tage nach FZ-Inj.
6 2,5 % Patient E vor FZ-Injektion 7 2,5 % Patient E 4 Tage nach FZ-Inj.
Die geschädigten Zellen wurden in dem Nährmedium mit dem Zusatz an 2,5% Humanserum während sechs Tagen gezüchtet. Auch die ungeschädigten Zellen der Gruppe 1 wurden in dem Medium aus 95% MEM plus 5% fötalem Kälberserum sechs Tage lang weitergezüchtet. Alle Weiterzüchtungen wurden ebenfalls bei 37 "C durchgeführt. Alle Zellkulturen wurden vor der Schädigung, nach der Schädigungsphase, sowie nach der sechstägigen Nachzüchtung, photographiert und ausgezählt.
In der nachfolgenden Tabelle V sind die Ergebnisse zusammengestellt. Die dort angeführten Zellzahlen sind jeweils die Mittelwerte aus drei identischen Kulturen.
Tabelle V Gruppe Anzahl Zellen pro Kultur vor nach 12-tägiger nach 6 Tagen
Schädigung Schädigung Nachzucht 1 3.4l0 2.1.106 2.4.106 2 3.7 105 3.2 105 5.1 105 3 3.8 105 3.0 105 15.0 105 4 3.3 105 3.2 105 6.3 105 5 3.0 105 2.7 105 9.5 105 6 3.2 105 2.6 105 5.7 105 7 3.5 105 3.1 105 5.9 105
Man sieht aus den in
Tabelle V zusammengestellten Werten, dass das Humanserum des Patienten C und insbesondere des Patienten A vor der Frischzellenbehandlung zu einer wesentlich geringeren Vermehrung der Zellen führt, als das Humanserum der gleichen Patienten, das elf Tage nach der Frischzelleninjektion gewonnen wurde.
Wie ein Vergleich der Gruppe 2 mit der Gruppe 3 zeigt, hat das Serum des Patienten A nach der Frischzellenbehandlung etwa die dreifache Zellvermehrung in den Kulturen hervorgerufen, verglichen mit dem Serum des gleichen Patienten vor der Frischzellenbehandlung. Ein Vergleich der Gruppen 6 und 7 zeigt, dass jedoch vier Tage nach der Zelleninjektion beim Patienten E das fragliche Serum etwa die gleiche Zellvermehrung hervorruft, wie das Serum des gleichen Patienten vor der Frischzellenbehandlung.
Aus diesem Ergebnis kann man schliessen, dass die Bildung der das Zellwachstum fördernden Substanzen im Körper des Patienten, nach mehr als vier Tagen nach der Frischzelleninjektion einsetzt.
Eine mikroskopische Beobachtung der Gruppe 2 im Vergleich zur Gruppe 3 und der Gruppe 4 im Vergleich zur Gruppe 5 zeigte, dass die im Serum des Patienten 11 Tage nach der Frischzelleninjektion gebildeten wachstumsfördernden Substanzen auch zu einer Regenerierung der geschädigten Zellen führt. In den Gruppen 2 und 4 waren sechs Tage nach der Züchtung in dem 2,5% Humanserum enthaltenden Medium immer noch geschädigte adulte Affennierenzellen mit stark vergrössertem Cytoplasma erkennbar. Im Gegensatz dazu enthielten die Proben der Gruppen 3 und 5 nur noch sehr wenige geschädigte Zellen mit stark vergrössertem Cytoplasma und eine relativ hohe Dichte an gesunden regenerierten adulten Affennierenzellen.
Auch bei der mikroskopischen Beobachtung wurde festgestellt, dass die Zelldichte in den Gruppen 2 und 4 wesentlich geringer war als die entsprechende Zelldichte in den Gruppen 3 und 5.
DESCRIPTION
The present invention relates to pharmaceutical preparations which contain live reproductive embryonic cells of mammals in a liquid or solid inert medium.
Furthermore, the present invention relates to methods for producing such pharmaceutical preparations and furthermore methods for determining the pharmaceutical effectiveness of the pharmaceutical preparations according to the invention.
In European Patent Publication No. 0 038 511 describes polypeptides, glycosteroids and glycosphingolipids which can be isolated from mammalian organs such as, for example, the pancreas, heart, lungs, muscle and spinal cord or from blood plasma or serum from mammals. The active substances in question are used in pharmaceutical preparations to improve wound healing.
In Austrian patent specification no. 364 079 describes a process for the production of defibrinated and freeze-dried placenta cells. This process crushes the fetal maternal placenta at the end of the fourth month of gestation. The particles obtained are then immediately immersed in Ringer's solution in order to wash away traces of blood. The particles are then broken up and subjected to trypsin digestion in an aqueous solution containing trypsin with stirring and then filtered off, washed, centrifuged and the residue freeze-dried to constant weight.
The lyophilized placenta cells thus obtained no longer contain living cells, have a high protein content and contain gonadotropic hormones. They are intended to be used as active ingredients in medical or cosmetic preparations and to be administered, for example, by injection.
Still other therapy methods with lyophilized cells have already been described in the literature. Substances obtained from organ extracts have already been administered by injection to elicit immunogenic reactions. Such therapy methods are referred to as non-specific stimulus therapies.
However, the aim of the present invention was to develop a pharmaceutical preparation which is capable of causing regeneration of damaged cells, or to prevent damage. Surprisingly, it was found that a pharmaceutical preparation which contains live reproductive embryonic cells from mammals is suitable for this purpose.
The present invention relates to a pharmaceutical preparation which is characterized in that it contains living reproductive embryonic cells from mammals in a liquid or solid inert medium.
In the pharmaceutical preparations according to the invention, the living reproductive embryonic cells can be easily distinguished from dead cells by staining with trypan blue or Stains with methyl red. The methyl red is absorbed by the living cells, causing them to turn red, while dead cells remain unstained. In contrast, the trypan blue stains dead cells blue, while living cells remain colorless.
The corresponding determination is carried out by staining a pharmaceutical preparation according to the invention after appropriate dilution and counting the stained cells. The cell bridges are not counted. It was found that pharmaceutical preparations according to the invention, the embryonic cells of which are heart cells, bone marrow cells, liver cells, spleen cells or thymus cells, usually contain over 90% of living cells, the rest of 100% of the total cells in the pharmaceutical preparation according to the invention consisting of dead cells. If the embryonic cells come from the placenta, testes, thyroid, kidneys or adrenal glands of the embryos, then the proportion of living cells is usually more than 30%, often 5080%.
The reproductive capacity of the embryonic cells contained in the pharmaceutical preparations according to the invention could be determined in that the cells formed so-called clones after being introduced into a suitable nutrient medium, i. H. Courts of other living cells formed around the divisible cells.
The pharmaceutical preparations according to the invention generally contain 0.5 to 25 x 106 living cells per ml, preferably 1 to 10 x 106 living cells per ml.
It is preferred to use embryonic cells from those mammalian embryos that are at a developmental stage that is half the usual gestation period of the particular mammal species to three quarters of the usual gestation period of the mammalian species. At the specified stage of development, the embryonic cells have the proliferation typical of this cell type, whereby they transform in vitro after several passages and / or die out in vitro after a certain number of passages. In contrast to embryonic cells, cells from corresponding organs of adult animals, i.e. adult organs, generally do not multiply under the specified conditions. In contrast to adult cells or lyophilized cells, the embryonic cells contained in the pharmaceutical preparations according to the invention are weak antigens.
For economic reasons, embryos of those mammal species are preferably used to produce the pharmaceutical preparations according to the invention, in which the mother animal can be used as fresh meat after slaughter. Preferred mammalian embryos are therefore those of ruminants, especially sheep. Goats and cattle or the embryos of horses or pigs.
Another object of the present invention is a method for producing the pharmaceutical preparation according to the invention. This procedure is characterized by removing the uterus of a pregnant mammal. opens it in a sterile container under aseptic conditions, removes and dissects the fetus, the individual tissues, organs or Glands are freed of adhering tissue fibers and body fluids, then broken up into very small pieces, mechanically broken down into individual cells and dispersed in an inert medium.
In this method, the mother animal whose embryo or embryos are intended for the preparation of the preparations is first marked in such a way that it can be identified at any time. For example, such a marking can be made by corresponding signs on both ears if the mother animal is a sheep, a goat, a pig or a cattle.
Before the pregnant mother takes the uterus, blood samples are taken to ensure that the following diseases or to exclude the presence of the relevant pathogens:
Brucellosis caused by Brucella abortus (Bang bacteria) and Brucella melitensis (Malta fever), Salmonellose caused by Salmonella typhi murium 0, Salmonella typhi murium H, Salmonella enteritidis Gärtner O, Salmonella enteritidis Gärtner H, Salmonella abortus ovis 0 and Salmonella abortus ovis H is caused, ornithosis, or Psittacosis (parrot disease) caused by large viruses called chlamydia, as well as rickettsiosis, listeriosis and leptospirosis. The tests for all of these microorganisms or diseases must be negative.
The mammalian embryos are removed from the mother animal at a time which corresponds to half the usual gestation period of the mammal species to three quarters of the usual gestation period of the mammal species. If the mammal in question is a sheep, preferably the black breed of Jurassic sheep. then the best time to take the embryos is three and a half months after fertilization of the animal.
To remove the embryos, a caesarean section is made from the mother animal and the uterus is pinched off using special tweezers, removed from the mother animal and immediately placed in a sterile container.
The uterus is then opened in an operating room kept under aseptic conditions and the flaps of the placenta are blotted. The fetus or fetuses are then removed from the opened uterus and dissected.
Practically all tissue parts and organs can be used to produce the pharmaceutical preparations according to the invention. respectively. Glands of the embryo can be used. Examples of embryonic cells that can be used, or The organs, glands and tissues of the embryo are the following:
Brain with all substructures, such as the midbrain, brain lobes. Hypothalamus, thaloma, putamen, large intestine, small intestine. Duodenum, stomach, liver, heart, lungs, spleen. Kidney. Mast cells, thymus, eye with all substructures. Lymph nodes, pituitary with all substructures, namely anterior pituitary, middle pituitary and posterior pituitary, spinal cord, bone marrow, muscle. Pancreas, adrenal glands, namely both the adrenal cortex and the adrenal medulla, thyroid.
Parathyroid gland, arteries, veins, cartilage, oral mucosa, nasal mucosa, nerves, including the optic nerve, skin, urinary bladder, biliary tract, epiphysis and bone tissue. The testicles, prostate and sertoli cells of the male embryos can also be used, and the ovaries and placenta of the female embryos.
If the processed embryonic organ is the brain, the hard meninges are immediately removed.
If the processed embryonic organ comes from the digestive tract, the stomach contents or Intestinal contents removed.
When the placenta of the embryo is worked up, the flaps of the placenta are freed from all fibrous tissues, mucilages and veins from which they are traversed.
All removed organs are freed of adhering tissue fibers and adhering body fluids, for example blood, are removed by washing with an inert liquid, preferably by washing with water or an aqueous solution. A physiological saline solution, the so-called Ringer's solution, is particularly advantageous for carrying out the washing processes.
Each of the removed organs is then dissected and cut into small pieces using special instruments and mechanically broken down into individual cells. The living reproductive embryonic cells of the respective mammalian organ isolated in this way are then suspended in an inert liquid medium. A preferred inert liquid medium is a physiological saline solution.
Subsequently, this physiological saline solution, which contains the embryonic cells in suspension, is filtered in order to remove larger particles occurring therein.
The filtrate obtained in this way is a pharmaceutical preparation according to the invention which can be administered to the patient immediately for intramuscular injection.
Cell suspensions according to the invention, which were obtained from the brain or brain parts of the embryo, as well as from the digestive organs of the embryo, namely from the stomach, the duodenum, the small intestine, the large intestine and the pancreas, must be administered to the patient particularly quickly by injection or processed further because the cells originating from the brain are known to be particularly difficult to grow and have a low viability and the cells originating from the digestive organs also presumably also have a low viability due to the presence of traces of enzymes.
It should also be noted that the directly injectable pharmaceutical preparations which contain the reproductive embryonic cells of mammals and are produced by the method described above are tested by injections for the presence of pathogenic microorganisms before being administered to the patient. A check for the absence of ornithosis or Large viruses called chlamydia that cause psittacosis. The absence of disease-causing bacteria should also be tested. For this purpose, the dyeing processes of strain or Koster and Gram are carried out.
It was found that the embryonic cells contained in the pharmaceutical preparation according to the invention can be grown further if they are transferred to a suitable nutrient medium. The reproductive embryonic cells of the respective organs form courtyards of other daughter cells, which are called clones.
According to a further preferred embodiment of the method according to the invention for producing the pharmaceutical preparations according to the invention, the embryonic cells of the mammals dispersed in the inert liquid medium are therefore transferred into an aqueous nutrient medium, the proportion of the divisible living cells forming clones by cell multiplication. The cells are then re-introduced into a physiological saline solution after a cultivation period of 3 to 15 days, and an immediately injectable pharmaceutical preparation is thus obtained.
The number of cells per ml of the suspension cell culture in question is an essential parameter in the further cultivation of the live reproductive embryonic cells in a nutrient medium. In general, this number should be 100,000 to one million, but the optimal value depends on the cell type, that is, on the organ of the embryo from which these cells originate.
The following sizes were determined when the cells were grown in the nutrient medium:
The cloning yield, i. H. the number of cells that cloned in the nutrient medium within five days, expressed as a percentage of all cells introduced into the nutrient medium.
The primary division efficiency, i. H. the number of clones formed in the culture within five days, expressed as a percentage of the sown actual living cells.
The third parameter determined was the number of divisible cells per ml, i.e. H. the number of those cells per ml of the suspension prepared in the nutrient medium, which was able to form clones within five days.
In the tests carried out here, heart cells, bone marrow cells, liver cells, spleen cells and thymus cells showed particularly high living cell proportions, cloning yields and also good primary division efficiency. In these cells, the living cell percentage was between 93 percent and 100 percent, the cloning yield was between 38 percent and 70 percent and the primary division efficiency was between 40 percent and 60 percent. The number of cells capable of division per ml for the cells mentioned ranged from 4.2 x 106 cells per ml to 77 x 106 cells per ml.
The cell suspensions, which were produced using hypothalamic cells, lung cells, kidney cells, placenta cells, thyroid cells and testicular cells, also showed living cell proportions in the range from 46% to 79%, cloning yields in the range from 13% to 27% (except for the hypothalamic cells, whose cloning yield was worse was) and a correspondingly good primary division efficiency.
In the case of the cells from the gastrointestinal tract, the shelf life of the cells is considerably poorer after they have been processed, because evidently traces of digestive enzymes left behind have a destructive effect on the cells. The ability of the cells to reproduce was also poor. However, it is known to those skilled in the art that brain cells have poor ability to multiply outside of their tissue structure.
The tests carried out further showed that pharmaceutical preparations according to the invention which contain reproductive embryonic cells from mammals in a physiological saline solution can be stored at 4 ° C. for more than ten days and then still contain high proportions of living reproductive cells. The only exceptions are preparations in which the embryonic cells come from the gastrointestinal tract or from the brain or parts of the brain.
The shelf life of the pharmaceutical preparations containing live reproductive embryonic cells according to the invention can, however, be further extended by freezing. According to a further preferred embodiment of the method according to the invention for producing the pharmaceutical preparations according to the invention, an immediately injectable preparation is first prepared which contains the living mammalian cells in a physiological saline solution, and glycerin is then added to this preparation and the cell suspension is then deep-frozen, so that a deep-frozen pharmaceutical is obtained Contains preparation that is kept in the frozen state until immediately before use.
Another object of the present invention is a method for testing the pharmaceutical effectiveness of a pharmaceutical preparation according to the invention.
This method is characterized in that either one starts from the injectable pharmaceutical preparation or thaws a frozen pharmaceutical preparation according to the invention and thus likewise obtains an injectable preparation which contains the living reproductive embryonic cells in an inert liquid medium and then this cell suspension to form a monolayer culture of mammalian cells Another type of mammal that has been damaged, whereby on the one hand a noticeable increase, on the other hand a clear restoration of the disturbed morphology of the damaged adult mammalian cells indicates the cell-regenerating effectiveness of the embryonic cells.
In this test method, for example, the corresponding embryonic cells derived from embryos of the black breed of Jurassic sheep can be used as divisible living embryonic cells. The suspension of the adult mammalian cells can be from any other mammals that are in no way related to the mammals from whose embryos the pharmaceutical preparation was made.
The pharmaceutical preparations containing live reproductive embryonic cells according to the invention are intended in particular for the treatment of fresh cells in human patients. For this reason, in the method according to the invention, the stimulating effect of the preparation containing living embryonic cells is tested, in particular, for damaged adult cells that originate from humans or from a mammal breed that is relatively closely related to humans. Most of these tests therefore used damaged human epithelial cells or damaged monkey kidney cells as damaged adult mammalian cells.
In one of the tests according to the invention, monkey kidney cells were grown in a nutrient medium, all cultures being grown up to cell numbers from 22,000 to 28,000 cells. The serum content of the nutrient medium in a group of the cells was then reduced from 5% to 1%, as a result of which the cells were clearly damaged. This was shown by the fact that in those groups in which the serum content of the nutrient medium was not reduced, the adult kidney cells by the 12th Day a continuous growth from 24,000 cells per culture to 630,000 cells, or Had 660,000 cells. In contrast, those groups in which the adult cells were damaged by lowering the serum content showed up to the 12th Day of cultivation, an increase in the number of cells per culture from 24,000 to 60,000 or to 160,000.
Pharmaceutical preparations containing live reproductive embryonic cells according to the invention were then added to the samples with damaged adult monkey kidney cells. After the addition of these living embryonic cells, both a strong cell proliferation and a significant restoration of the disturbed morphology of the adult kidney cells occurred, and cell numbers of 400,000 to 1,500,000 cells per culture were found three to six days after the addition of the living embryonic cells.
Particularly surprising when doing this
Attempts were made to establish an organ independence between the embryonic cells contained in the preparation to be tested and the artificially damaged adult mammalian cells of the other mammal species.
According to a preferred embodiment of the test method according to the invention, the living embryonic cells contained in the pharmaceutical preparation to be tested can originate from a different organ, tissue or gland than the artificially damaged adult mammalian cells of the other mammal type.
In the experiments carried out, it was found, for example, that pharmaceutical preparations according to the invention which contain living, reproducible liver cells or
Heart cells or Kidney cells of the embryos of the black breed of Jurassic sheep contain, in approximately the same way, promote the regeneration of adult damaged kidney cells of the monkey kidneys. The same results were also found for the regeneration of damaged adult monkey heart cells.
Analogous experiments were also carried out on adult human epithelial cells. The epithelial cells were grown in monolayer cultures and damaged by lowering the serum content of the nutrient medium. For comparison purposes, human epithelial cells were grown without damage in other samples.
By intramuscular injection of purified a-actinin into live rabbits, antiactin antibodies were formed in the animals and these were isolated from the blood of the rabbits and labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC).
The healthy, undamaged human epithelial cells are marked by the fluorescent antibody mentioned. The damaged human epithelial cells obviously have no actin anchored in their cell membrane, so that the fluorescent antiactin antibody is not bound to the cell membrane. The damaged cells also differ from the fibrous undamaged human epithelial cells by their amorphous structure.
By adding pharmaceutical preparations according to the invention which contain living reproductive embryonic cells, for example embryonic kidney cells of the black breed of Jurassic sheep, the damaged human epithelial cells could be regenerated again. H. they assumed the original size and shape of the undamaged cells and were also able to take up the fluorescent antiactin antibody in the cell membrane, suggesting that the cell membrane had anchored the actin on it again.
Further tests were carried out on the serum of patients, namely that blood was taken from the patients before the administration of the preparations according to the invention containing live reproductive embryonic cells and the serum was obtained from these blood samples. On the fourth day or on the eleventh day after the administration of the preparations according to the invention containing live reproductive embryonic cells by injection, blood was again taken from the patients and the blood serum was further examined. The human sera were brought together with adult kidney cells as well as with embryonic kidney cells in appropriate monolayer cultures. These experiments showed that there were no cytotoxic substances in the patient's serum even eleven days after the fresh cell injection.
In the treatment of monocultures containing embryonic cells that had not yet been differentiated, human serum obtained four days after the fresh cell injection showed a slight increase in the number of cells in comparison to corresponding cultures of embryonic cells that were present with the serum from the same patient have been brought into contact with the fresh cell treatment.
An even greater increase in embryonic cells was observed when treated with human patient serum obtained eleven days after the fresh cell injection was administered.
These test results indicate that factors which have a cell-growth-promoting effect are present in human serum for a longer period after the fresh cell injection. These factors have not yet been examined in detail and are referred to below as stimulins.
The present invention therefore furthermore relates to a method for testing the pharmaceutical effectiveness of a pharmaceutical preparation according to the invention by determining cell-regenerating factors in the serum of adult mammals, which is characterized in that the serum of the mammal to which the pharmaceutical preparation has been administered is added a monolayer culture of adult mammalian cells of the same or a different type of mammal that have been previously damaged, with a marked increase and / or a significant restoration of the disturbed morphology of the damaged adult mammalian cells indicating the presence of cell regenerative factors in the serum tested.
In a preferred embodiment of this test method, the serum is tested in adult human patients. With the aid of this method, it can be determined whether a patient to whom a pharmaceutical preparation containing a live reproductive embryonic cell of mammals has been administered by injection, responds positively to this therapy or not.
According to a preferred embodiment, therefore, this test method is carried out so that the serum of adult human patients is tested in order to check the response of the human patient to the injection of live reproductive embryonic cells of mammals in a liquid inert medium by checking the serum of blood taken from the human patient both before the injection of the embryonic cells and at least one week after the injection of the embryonic cells into a monolayer culture of adult mammalian cells that had previously been damaged,
a significantly greater increase and / or a greater degree of restoration of the disturbed morphology of the damaged adult mammalian cells in the second serum sample compared to the first serum sample indicates the formation of cell-regenerating factors in the serum and thus the positive response of the patient to the injection of fresh embryonic cells .
In one embodiment of this test, 20,000 adult monkey kidney cells were grown in cell culture flasks in an optimal medium at 37 ° C. This medium contained 5% fetal calf serum. The cultivation phase lasted six days, and then the individual cultures had reached cell numbers of 300,000 to 380,000.
For comparison purposes, one of the cell cultures was grown without damage in the nutrient medium containing 5% fetal calf serum for 12 days, at which time the culture in question then contained 2 100 000 cells. The remaining groups of cell cultures were damaged after the sixth day by switching to a medium containing only 1% fetal calf serum.
12 days after the damage, these samples contained 260,000 cells to 320,000 cells per culture.
Serum was removed from human patients immediately before the injection of the live reproductive embryonic cells containing mammalian preparations. If this serum is added to the cell cultures with the damaged monkey kidney cells in an amount of 2.5 vol. %, based on the total medium, and then continued to incubate for six days, then there was a slight increase in the number of cells per culture, i. H.
cell counts ranging from 510,000 to 630,000 cells per culture were achieved.
Eleven days after the injection of the preparations according to the invention, blood was again taken from the same patients and the serum obtained was tested. The cultures with the damaged monkey kidney cells were prepared in the same manner as described above and the damaged cultures contained 260,000 to 320,000 cells per culture 12 days after the damage.
Six days after the addition of the serum, which was obtained eleven days after the fresh cell therapy, it was found that the cell numbers in the damaged cultures had risen to 900,000 to 1,700,000.
An analogous test was carried out on the serum of a patient before the injection of the pharmaceutical preparation according to the invention and four days after the injection of the pharmaceutical preparation according to the invention. In this case, surprisingly, only a slight increase in the damaged cells or only a minor restoration of the disturbed morphology.
From these test results it can be seen that immediately after the administration of the preparation according to the invention by injection into the serum of the treated patient, no or only small amounts of cell-regenerating factors can be found. Beginning around a week after the injection, the treated patients obviously develop ever larger amounts of cell-regenerating factors. These cell-regenerating factors cannot come from the injected living reproductive embryonic cells, because the amount of pharmaceutical preparation injected is extremely small compared to the body weight of the patient being treated and, at this extreme dilution, cell-regenerating factors which come directly from the injected embryonic cells are therefore no longer possible would be detectable.
In addition, cell-regenerating factors that originate from the injected embryonic cells themselves should already be present in the patient's serum shortly after the injection.
It can rather be assumed that the injection of the living reproductive embryonic cells somewhere in the body of the treated patient triggers the formation of cell-regenerating factors. These cell-regenerating factors are obviously transported on with the blood serum and can thus exert their cell-regenerating effect on damaged organs of the patient.
In patients who had age-related brain disorders, it was found that some time after the administration of the preparations according to the invention containing live reproductive embryonic cells, there was a marked improvement in the disorders by injection. High-molecular substances and, of course, also living reproductive embryonic cells cannot cross the blood-brain barrier. It is therefore impossible for the living reproductive embryonic cells to have a direct regenerative effect on the patient's brain cells.
Based on the theory that the injection of the living reproductive embryonic cells somewhere in the patient's body triggers the production of cell growth-promoting factors according to a so-called cascade mechanism, the phenomenon of the improvement of brain disorders can also be explained. In contrast to high-molecular substances, the cell-regenerating factors formed by the patient's body are obviously able to cross the blood-brain barrier and then exert their cell-regenerating effect in the brain itself.
The invention will now be explained in more detail by means of examples.
example 1
Production of an injectable pharmaceutical preparation containing live reproductive embryonic cells of the black breed of Jurassic sheep.
Before insemination, the intended dams are identified by two markings on their ears so that each of these animals in the herd can be identified immediately. This is necessary because the embryos have to be removed from the mother animal before the end of the gestation period, namely from each mother animal three and a half months after its fertilization.
Immediately before the embryos are taken from the mother animal, blood samples are taken from the mother animal to determine whether the animal has one of the following diseases or the following pathogens can be detected in his blood:
Brucellosis caused by Brucella abortus (Bang bacteria) and Brucella melitensis (Malta fever), Salmonellose caused by Salmonella typhi murium 0, Salmonella typhi murium H, Salmonella enteritidis Gärtner O, Salmonella enteritidis Gärtner H, Salmonella abortus ovis 0 and Salmonella abortus ovis H is caused, ornithosis, or Psittacosis (parrot disease) caused by large viruses called chlamydia, as well as rickettsiosis, listeriosis and leptospirosis.
The corresponding test methods are described in the literature and are carried out in the usual way.
The embryos are removed from the animal only if the tests for all of these microorganisms or diseases are negative. Sick animals, on the other hand, are subjected to a corresponding healing process and they are allowed to give birth and raise their young.
The embryos are removed from the mother animal by performing a caesarean section on the mother animal, pinching off the uterus with special tweezers and then removing it from the mother animal and immediately placing it in a sterile container.
Under completely aseptic conditions, namely in an operating room, the uterus is opened and the flaps of the placenta are blotted. The fetus or fetuses are then removed from their amniotic sacs and dissected.
Virtually every organ, tissue and gland of the embryo can be used to produce the pharmaceutical preparations containing live reproductive embryonic cells. The following are mentioned as examples of usable tissues, organs or glands:
Liver, heart, kidneys, adrenal glands, spleen, bone marrow, hypothalamus, pituitary gland, lungs, thyroid, parathyroid, placenta, thymus, brain, arteries, stomach, duodenum, small intestine, colon, pancreas, connective tissue, eyes, placenta, testicles and many more Organs, glands and tissues.
Some of the organs of the embryo need special treatment, namely the following:
When working up the placenta of the embryo, the flaps of the placenta are freed from all fibrous tissues, mucilages and veins from which they are traversed.
When working up the stomach of the embryo, the gastric fluid is immediately removed. Also when working up the colon. The small intestine, duodenum and pancreas become the contents of the intestine or the glandular contents removed immediately.
When working up the brain, the hard meninges are immediately removed.
All removed tissues are immediately washed with physiological saline, namely the so-called Ringer's solution, in order to rid them of adhering body fluids, for example blood. Tissue fibers and other non-organ materials, such as mucilages and the like, are removed from the corresponding organs so that these foreign cells do not get into the pharmaceutical preparation made from the individual organ.
Each of the individual organs, tissues or glands is then dissected and cut into very small pieces using special instruments, and these are mechanically broken down into individual cells. These individual cells are then suspended in the necessary amount of a physiological saline solution, namely the so-called Ringer's solution. As will be explained in the following, the optimal number of cells which are suspended per ml of physiological saline solution depends on the individual organ, tissue or the gland.
The suspension of the individual embryonic cells in the physiological saline solution is then filtered in order to remove particles that are larger than single cells.
The filtrate thus obtained is the directly injectable pharmaceutical preparation which can be administered to the patient by intramuscular injection. However, immediately prior to administration of the injection, the pharmaceutical preparation containing the live reproductive embryonic cells of a particular organ, tissue or black Jura sheep gland suspended in the physiological saline solution is checked for any cells that are not from the embryo but from the placenta of the mother animal. Then, immediately before the injection, preferably in a laboratory directly at the operating room, a check is carried out to determine whether any pathogenic microorganisms are present in the injectable pharmaceutical preparation.
It is particularly important to check for the large viruses called Chlamydia, which the bird diseases called Ornithoses cause. The corresponding ornithosis is called parrot disease or psittacosis in parrots. Furthermore, the injectable preparations are also tested for the absence of pathogenic bacteria before they are injected. For this purpose, the staining procedures described in the literature by Stamm. respectively. Koster and Gram are carried out.
If all tests are negative, the injectable will be given immediately.
From Example 2 below it can be seen that embryonic cells. that come from the brain or parts of the brain. such as elongated marrow, hypothalamus and frontal lobes of the brain, only survive for a short time in physiological saline and also have poor chances of reproduction in cell cultures. This is not surprising, because it is known to the person skilled in the field of cell cultures that cells from the brain are extremely difficult to grow in isolation outside of the tissue.
In practice, it must therefore be noted that pharmaceutical preparations according to the invention in which the reproductive embryonic cells come from the brain or brain parts of the embryo are administered to the patient immediately by injection.
As can also be seen from the following example 2, pharmaceutical preparations according to the invention also have their living embryonic cells from the
Gastrointestinal tract of the embryo, often only have a short shelf life, i.e. H. the proportion of living embryonic cells in them sometimes decreases rapidly. This may be due to the fact that digestive enzymes of the gastrointestinal tract sometimes get into such cell suspensions despite careful cleaning. These digestive enzymes have a destructive effect on the isolated cells.
For this reason it must be noted that pharmaceutical preparations according to the invention which contain embryonic cells from the gastrointestinal tract are administered to the patient as quickly as possible by injection.
The cells originating from organs other than the gastrointestinal tract and the brain, however, can be stored well at a temperature of 4 ° C and can also be successfully grown in appropriate nutrient media.
Example 2 Cultivation of Living Embryonic Cells in One
Nutrient medium
The minimum essential medium Eagle with earth salt was used as the nutrient medium, which is subsequently abbreviated to MEM. This medium is in the publication by H. Eagle, in Science, issue 30, page 342, 1959. A medium consisting of 90% MEM plus 10% fetal calf serum was used to grow the cells.
The number of cells per ml of the suspension culture in question is an important parameter in the further cultivation of live reproductive embryonic cells in nutrient media. The optimal number for further cultivation depends on the organ of the embryo from which the cells originate. In general, the cells should be present in the medium for further growth in an amount from 100,000 cells to 1,000,000 cells per ml.
In the cell suspensions prepared by the method according to Example 1, the cells were counted with appropriate dilution. Such an amount of the cell suspension was then sown in 250 ml culture flasks containing the nutrient medium, so that 2.3 × 103 cells were introduced per cm 2 surface of the nutrient medium. The culture bottles contained 20 ml of nutrient medium. At the start of cultivation, the cell concentration in the nutrient medium was 105 cells per ml.
The cells were grown under optimal conditions at 37 C for 24 hours. The mixture was then filled with 50 ml of medium and the cultures were incubated under the optimal conditions for a further four days. The courtyards that formed around the reproductive cells were then counted microscopically. These are called clones.
The live cells and the dead cells were counted both in the fresh cell suspension used for further cultivation and after the cultivation process. To do this, staining with trypan blue or Methyl red in a physiological medium. Trypan blue stains dead cells blue, while living cells remain colorless. In contrast, methyl red is absorbed by living cells and stained, while dead cells remain unstained.
Before dyeing, 0.2 Ill of the original suspension are taken, diluted accordingly with physiological medium and then stained. The counting takes place in a Fuchs-Rosenberg counting chamber. The number of living cells and dead cells in the original suspension was calculated from the counted values. The following values were determined:
1. Total number of cells per ml, i.e. the number of living and dead cells per ml in the original suspension.
Cell fragments are not counted.
2nd The number of dead cells stained by trypan blue per ml of the original suspension.
3rd The number of living cells stained by methyl red per ml of the original suspension. After several measurements it was shown that the sum of the cells stained by trypan blue and methyl red stained very well with the total number of cells. For this reason, only staining with trypan blue was carried out in further work and the cells stained with trypan blue were subtracted from the total number of cells, so that the number of living cells was obtained in this way.
The proportion of living cells, ie the proportion of living cells, expressed as a percentage of the total number of cells, was also calculated.
The following sizes were also determined after the breeding process:
A) The cloning yield, that is the number of clones formed in a culture during the cultivation period of five days in total, expressed as a percentage of all cells sown.
B) The primary division efficiency, namely the number of clones formed in the culture over a total of five days, expressed as a percentage of the sown living cells.
C) The number of cells capable of division per ml, that is to say the number of cells per ml of original suspension which were capable of forming clones within the five-day cultivation.
The results obtained for the individual cell types are summarized in Table I below. The following abbreviations are used in the table for the individual columns: GZZ = total number of cells per ml x 106 TZA = percentage of dead cells, i.e. number of dead cells per mlx 106 LZA = number of living cells, i.e. percentage of living cells
Cells, expressed as a percentage of the total cell number KA = cloning yield, that is the number of cells formed
Clones as a percentage of all sown cells PTE = primary division efficiency, number of clones as a percentage of sown living cells GZZ x KA = number of divisible cells per ml x 106, i.e. the number of cells per ml, which
Have formed clones.
Table I cell type GZZ TZA LZA KA PTE GZZxKA elongated marrow (many debris) 14 + 4 4 + 1 71% <1% <1.5% <0.21 heart (strong aggregation) 7 + 2 - 100% 60% 60% 4.2 hypothalamus 3 + 1 1 + 0.2 67% <1% <1.5% <0.05 bone marrow 45 + 7 1 98% 46% 47% 20.7 liver 110 + 4 8 + 1 93% 45% 48% 49.5 frontal lobes of the brain 8 + 3 5 + 2 37% <1% <3% <0.24 Lungs 43 + 2 14 + 4 67% 13% 19% 8.2 Gastrointestinal 22 + 6 20 + 5 9% 1% 10% 2.2 Gastrointestinal 9 + 2 3 + 0.6 67% 4% 6% 0.54 Spleen 50 +7 3 + 1 94% 38% 40% 19 adrenal gland 5 + 1 3 + 1 40% 22% 55% 2.8 adrenal gland 0.7 + 0.3 0.6 + 0.1 14% 8% 57% 0.4 kidney 14 + 1 3 + 1 79% 20 % 25% 2.8 placenta 24 + 4 13 + 2 46% 27% 59%
14.2 Placenta normal conc. 17 + 11 16 + 11 6% 4% 67% 0.68 placenta 66 + 6 36 + 3 45% 29% 64% 19.1 high conc. Placenta very high conc. 473 + 15 170 + 16 64% 43% 67% 203.4 thyroid 23 +4 16 + 3 30% 11% 37% 2.5 thyroid normal conc. 1.8 + 0.5 0.6 + 0.2 67% 25% 37% 0.5 thyroid 4 + 2 2 + 0.6 50% 17% 34% 0.7 high conc. Testes 23 + 3 9 + 2 61% 24% 39% 5.5 Thymus 3.2.83 fresh 110 + 11 - 100% 70% 70% 77 thymus3.2.83 91 + 4 13 + 1 86% - 6 hrs RT
It can be seen from this table that fresh thymus cells, heart cells, bone marrow cells, liver cells and spleen cells have living cell portions of over 90%, based on the total number of cells. The proportion of living cells in the brain (forehead lobes) is relatively low and very much dependent on the processing in cells from the gastrointestinal tract.
The preparations, which contain placenta cells and contain thyroid cells, show that the proportion of living cells strongly depends on the concentration used.
When the thymus cells are stored for six hours at room temperature, the proportion of living cells decreases significantly, which is due to the high storage temperature. If the cell suspensions prepared according to Example 1 are stored under sterile conditions in the physiological saline solution at 4 ° C. for one week, then some organ cells of the embryos still show astonishingly high living cell proportions.
Table II Cell type Live cell percentage after one week of storage Thymus 70% Spleen 96% Bone marrow 94% Liver 90% Thyroid 60%
It is possible to produce an injectable pharmaceutical preparation from the embryonic cells in the nutrient medium that have been grown for five days. For this purpose, the embryonic cells are isolated from the nutrient medium, for example by centrifuging them off.
The living embryonic cells are then redispersed in a sterile physiological saline solution, a corresponding injectable pharmaceutical preparation being obtained.
Example 3 Preparation of a frozen pharmaceutical preparation containing live embryonic cells
As already mentioned, if the embryonic cells come from organs other than the gastrointestinal tract and the brain, the injectable pharmaceutical preparations produced according to Example 1 can easily be stored for a week or a little longer if stored at 4 ° C.
However, it was found that the living embryonic cells dispersed in the physiological saline solution, if they come from organs other than the brain and the gastrointestinal tract, can be stored even longer by deep-freezing the cell suspension.
Before freezing, one or more substances which are permissible in injectable solutions and which prevent the formation of large ice crystals are added to the physiological saline solution. Such additives are known to the person skilled in the art and glycerin, which is generally added in an amount of 10% to 20% by weight, based on the total weight of the cell suspension, is mentioned as an example of this.
A cell suspension in the physiological saline solution, which contained cardiac cells, was mixed with 17% by weight glycerol, based on the total weight of the suspension, while maintaining the sterile conditions. The suspension was then filled into ampoules under sterile conditions and deep-frozen and stored at a temperature from about −120 ° C. to about −180 ° C.
After one and a half months of storage, the sample was thawed and diluted according to the procedure described in Example 2, stained with trypan blue and counted. It was shown that the sample had a living cell proportion of 92%.
Example 4
Regeneration of damaged adult monkey kidney cells by preparations containing embryonic cells
Adult monkey kidney cells were grown to 80% confluence in monolayer cultures and suspended with trypsin.
As the optimal medium for the further breeding of the adult
Monkey kidney cells again used the MEM medium described in Example 2, but in this case 95%
MEM plus 5% fetal calf serum.
This optimal culture medium was in 75 ml culture bottles, and each culture bottle contained 10 ml
Medium. 20,000 adult monkey kidney cells were sown per culture bottle and the cultures were randomized. Cultures continued to be grown under the same conditions until day four.
On the fourth day, the cultures were divided into five groups.
In groups 1, 2 and 5 this was the fourth day
Medium changed and a medium used which contained only 1% fetal calf serum and 99% MEM.
In groups 3 and 4, the medium was also changed, but now again a medium was used which contained 5% fetal calf serum plus 95% MEM.
Until the change of medium, the same growth was observed in all cultures and the cultures had previously reached 22,000 cells per culture to 28,000 cells per
Culture.
After the medium change, all cultures were incubated until the eighth day, and on the 12th day the medium was changed for all cultures.
In groups 3 and 4 there was a continuous growth of the cells and on day 12 there were 3 in group
660,000 cells per culture present in group 4
630,000 cells per culture. Cultures 1, 2 and 5, which continued to breed with the reduced fetal calf serum content, showed significant damage to the adult kidney cells. In groups 1 and 2, the number of cells per colony had risen to 60,000 on day 12 and in group 5 only to 160,000.
Groups 1, 2 and 5 also showed a clear morphological change in the damaged cells compared to the undamaged cells in Groups 3 and 4.
The damaged cells had a greatly enlarged cytoplasm and contained several cell nuclei.
On day 12, the medium in groups 1, 2, 3, 4 and 5 was changed again and the adult monkey kidney cells from all groups were further drawn on a medium composed of 95% MEM medium plus 5% fetal calf serum.
In group 3, the number of undamaged kidney cells rose continuously from 660,000 on day 12 to 1,300,000 on day 20.
The undamaged group 4 cells were divided into two
Subgroups (a) and (b) divided. The culture of subgroup (a) was 11,000 liver cells of the
Embryos of Jurassic sheep and to group (b) 14000
Heart cells of the embryos of Jurassic sheep added. These embryonic cell suspensions were produced by the method according to Example 1.
After the addition of the embryonic heart cells in the
Group 4 had 630,000 cells on day 12
1,700,000 on the 20th day. After the liver cells had been added, the culture could only be followed until the 18th day, because then there was already complete confluence in the cell culture bottle and the cells inhibited each other in growth.
It can be seen from these values that undamaged adult monkey kidney cells by the addition of embryonic cells of sheep from other organs, namely e.g. Heart cells or liver cells are significantly increased in their growth and cell proliferation compared to undamaged monkey kidney cells that were grown without the addition of embryonic cells.
The damaged cells of group 2 were grown without the addition of fetal cells in the medium containing 5% fetal calf serum and there was a slight increase in the number of cells from 60,000 per culture to 240,000 per culture on the 20th day. However, the morphological changes in the cells were retained and no decrease in the number of cells with enlarged cytoplasm was observed.
The damaged cells of group 1 were subdivided into two subgroups (a) and (b).
In group (a) 10,000 embryonic liver cells per culture were added to the medium containing 5% fetal bovine serum and in group (b) 10,000 embryonic heart cells were added instead per culture. In group (a) the cell count increased from 60,000 on day 12 to 750,000 on day 20. In group (b) the cell count increased from 60,000 on day 12 to 1,300,000 adult kidney cells per culture on day 20.
The damaged group 5 cells were again divided into two subgroups (a) and (b). 2%, based on the medium, of a suspension of dead lyophilized embryonic liver cells was added to group (a).
10,000 living embryonic kidney cells were added to group (b) per culture. In group (a) the cell count decreased from 160,000 cells on the 12th day to 60,000 cells. The damaged kidney cells were presumably lysed by lysosomal enzymes which were released when the embryonic liver cells were lyophilized.
In group 5 (b), however, the number of cells increased from 160,000 on day 12 to 480,000 cells per culture on day 20.
Day on.
The regeneration of the damaged adult monkey kidney cells by the addition of the embryonic liver cells, heart cells and kidney cells could also be determined very clearly in groups la, 1b and 5b. The number of cells with enlarged cytoplasm decreased and the normal smaller kidney cells were found again.
In group 5b, where organically identical embryonic cells were added, pronounced contact formation between the embryonic and the adult kidney cells was also found. Tentacles were often formed.
The experiments show that damaged adult cells cannot be regenerated simply by changing back to the optimal medium. By adding lyophilized living embryonic cells, they are even further hampered and damaged in growth. However, if embryonic cells from the same organ or a foreign organ are added to the optimal growth medium in the damaged cells, then not only does an increase in cell growth take place, but also a regeneration of the damaged cells. Undamaged adult kidney cells are also promoted in their growth by the addition of embryonic cells.
Example 5
The same experimental set-up as in Example 4 was retained, but now adult monkey heart cells were damaged and their regeneration with fresh fetal sheep kidney cells was determined. Initially, a higher number of adult cardiac cells was sown in this experiment, and after four days of growth in the medium composed of 95% MEM plus 5% fetal calf serum, a cell number of 280,000 was reached in all cultures. Here, too, the medium was changed on the fourth day. The number of cardiac cells increased in the group that continued to be bred with a medium containing 5% fetal calf serum
1,500,000 to 1,900,000 per culture after eight days of continued breeding, i.e. until the 12th day.
To those groups where from the fourth day to the 12th
Day on a medium with only 1% fetal calf serum, the number of cells had risen to about 440,000 cells per culture.
In the group where the damaged cells were then grown for three days on the optimal medium with 5% fetal calf serum, the number of cells decreased from 440,000 cells per culture to 43,000 per culture, from which one can see that regeneration by simply switching to the optimal medium was no longer possible.
To the culture of damaged cells where on the 12th
Days to the medium with 5% fetal calf serum and in addition 10,000 fetal sheep kidney cells were added, the number of cells rose by day 15 from 440,000 cells per culture to 670,000 cells per culture.
Fetal kidney cells were added to a culture with undamaged adult monkey heart cells. However, the cell numbers could no longer be evaluated because the adult cells were already confluent and the experiment was terminated accordingly.
This example also shows that damaged adult cells can be regenerated by adding fetal cells from another organ.
Example 6 Regeneration of Damaged Human Epithelial Cells by Embryonic Kidney Cells
The experiments described in Examples 4 and 5 indicate that, if adult monkey kidney cells or monkey heart cells are damaged, changes obviously occur in the skeleton of the cell. Undamaged human epithelial cells have actin anchored in their cell membrane. The aim of this example is to investigate how the actin framework of human epithelial cells behaves when damaged or regenerated.
For this purpose, the actin-containing microfilament tapes are visualized by antiactin antibodies labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC).
Generation of antiactin antibodies
Actin was administered to immunized rabbits, and they received 0.3 mg of purified actin emulsified in 0.5 ml of Freud's adjuvant on the 1st and 7th day by intramuscular injection. Freud's adjuvant is described in Chemical and Biological Bases of Adjuvants by Jolle and Paraf, Berlin, Springer 1973.
Subsequently, further amounts of actin were then administered to the rabbit, but now intravenously with actin, which is absorbed by aluminum compounds.
For this purpose 1-2 mg actin / ml were mixed with 0.5 ml of a 10% aqueous solution of KAl (SO4) 2 per mg protein. The pH was adjusted to 7.3 with sodium hydroxide solution and the precipitate was suspended in 0.15 molar aqueous sodium chloride solution in a concentration of 1 mg actin per ml. On the 16th, 18th and 21st day 0.1 mg actin per rabbit was injected, on 26th, 28th
and 30th day 0.2 mg actin per rabbit, on the 33rd day 0.3 mg actin per rabbit and finally on the 37th day 0.8 mg actin per rabbit.
Blood was drawn from the animals on the 40th day.
After ammonium sulfate precipitation of the collected sera, the gamma globulin fraction was purified on an Actin Sepharose column.
The bound antiactin antibodies were eluted from the column with 0.2 molar aqueous glycerol, the pH of which was adjusted to 2.7 by hydrochloric acid, the fractions containing the antiactin antibody were combined and dialyzed against a phosphate-buffered saline solution and concentrated to 0.1 mg / ml protein.
The purity of the antiactin antibody was checked with actin following the procedure described by Ouchterlony in the Handbook of Experimental Immunology by L.A.
Nilsson, 19.1-19.39, Blackwell Scientific Publication, Oxford, 1973.
Immunofluorescence staining of undamaged, damaged or regenerated human epithelial cells
The cell-coated coverslips were washed twice with a phosphate-buffered saline, abbreviated to PBS, and then treated with a solution of 10% by volume PBS plus 10% by volume glycerin plus 10% by volume dimethyl sulfoxide. This latter solution is abbreviated GS-PBS.
Then fixed for 10 min. By treatment with a solution of PBS with 2 mM KCI, which, based on the total volume of the solution, furthermore 3.7% by volume of formaldehyde solution. Contains 10% glycerin and 10% DMSO.
Finally, it is washed twice with GS-PBS, immersed in methanol at 0 ° C. for 4 minutes and finally left in acetone at −70 ° C. for 2 minutes.
The glasses are then air-dried and incubated in a humidification chamber with 20 μl of the antiactin antibody concentrate prepared according to the previously described method at 37 ° C. for 45 minutes. The mixture is then washed with PBS.
Finally, the labeling with the fluorescein isothiocyanate, abbreviated as FITC, is carried out by incubating after washing with 20 μl of FITC-conjugated sheep santhanum rabbit gamma globulin at 37 ° C. for 45 minutes. Finally, the mixture is washed again with PBS and the cells are then expanded with another Cover glasses covered.
Through this labeling process, the actin-containing microfilament bundles are made visible in the cells by the fluorescent antiactin antibody.
Healthy, undamaged human epithelial cells show the actin microfilament bundles labeled with the fluorescent antibody. The actin with its fibrous structure forms the framework of the complete cell.
The actin supports the outer membrane of the cell in a skeletal manner and thus determines its outer shape.
The actin is apparently not anchored to the cell membrane of the damaged human epithelial cells. In this case, the actin labeled with the fluorescent antibody does not have a fibrous structure but an amorphous structure and it is also mainly anchored in the interior of the cell and not on the cell membrane. The damaged cells are the outer ones
The shape of the cell is no longer fixed and the cell membrane can expand in all directions. It arises from it
Cells with a large size, for example round ones
Cells.
Breeding, damage and regeneration of the human
Epithelial cells
The human epithelial cells were grown in petri dishes on coverslips in monolayer cultures. As
Culture medium served 95 vol% MEM plus 5% fetal
Calf serum.
After four days, the medium was changed and cultivation continued on a medium composed of 99% by volume MEM and 1% by volume embryonic calf serum for eight days, that is until the 12th day, calculated from the start of the breeding. The cells were damaged by the reduction of the fetal calf serum content in the growth medium. The damage to the cells was visualized using the fluorescent antiactin antibody using the method described above.
On the 12th day, the medium was changed again and the cells were grown on a medium composed of 95% by volume MEM and 5% by volume fetal calf serum. To a group of samples, a preparation containing embryonic sheep kidney cells prepared by the method according to Example 1 was added at the same time, in such an amount that 10,000 embryonic sheep kidney cells were added per culture.
In those samples where growth was continued on the medium containing 5% fetal calf serum without addition of the sheep kidney cells, no regeneration of the damaged human epithelial cells was found several days later. This was visualized by the staining with the fluorescent anti-octin antibody described above. In those samples in which the medium containing 5% fetal calf serum was grown with the addition of 10,000 embryonic sheep kidney cells, a clear regeneration of the damaged cells was found after a few days.
With the help of the staining with the fluorescent antiactin antibody, it was possible to make it clear that the actin migrates back to the cell membrane and, as with the undamaged healthy cells, is evidently anchored in the cell membrane and supports it. The regenerated cells also return to their original size and shape.
The experiments described above show that the addition of fresh living embryonic cells can destroy a supporting structure of the actin of human epithelial cells which has been destroyed by damage, and that the damaged cells thus assume the shape and size of undamaged cells again.
Example 7
Detection of cell regenerating factors in the serum
This example investigated how human serum affects the growth of undamaged embryonic kidney cells and undamaged adult kidney cells. The embryonic kidney cells were kidney cells of the embryos of the black breed of Jurassic sheep, namely the same type of cells that was also used to produce the preparations according to the invention.
In this experiment, 1,000,000 embryonic kidney cells or 1,000,000 adult kidney cells were sown in 75 ml cell culture bottles. These cell culture bottles each contained 10 ml of a culture medium composed of 95% by volume MEM plus 5% by volume fetal calf serum.
After the cultivation phase, the cultures were divided into several groups. In all groups, the medium was changed and three days after the medium change and seven days after the medium change in the cultures, the number of embryonic kidney cells and three days and five days after the medium change, the number of adult monkey kidney cells was determined.
In the group for comparative purposes, no human serum was added to a medium composed of 95% by volume MEM plus 5% by volume fetal calf serum without any addition of human serum, that is to say human serum, hereinafter referred to as HS.
In the other groups, growth was continued on the same medium, but with the addition of 2.5% by volume of human serum, based on the total medium. In this test, a clear cell proliferation of the undamaged embryonic or adult kidney cells in the groups with the addition of human serum compared to the control group indicates the presence of cell-regenerating factors in the human serum.
Example 8 Determination of cell-regenerating factors in the serum of adult human patients before administration of a preparation according to the invention and after its administration
The tests were carried out according to the methods described in Example 7 using the embryonic kidney cells or adult kidney cells described there.
As explained in Example 7, 1,000,000 embryonic kidney cells or 1,000,000 adult kidney cells were used per cell culture bottle, and the medium was changed after the cultivation phase, with the control group continuing to grow without the addition of human serum, in the other groups with addition of 2.5% human serum, based on the total medium. The media were the same as described in Example 7 and the cells were counted two days after the medium change and five days after the medium change.
Blood was taken from human patients immediately before the injection of a live reproductive embryonic cell-containing pharmaceutical preparation containing mammals and further four days after the injection of the pharmaceutical preparation according to the invention and eleven days after the injection of the pharmaceutical preparation according to the invention.
If any cytotoxic substances were formed in the patient's body by the administration of the preparation containing live fresh cells according to the invention, then they should be detectable in the patient's serum four days after the administration or eleven days after the administration. The presence of such cytotoxic substances would lead to the death of embryonic kidney cells or adult kidney cells and, accordingly, to a reduced number of cells in the samples with the addition of human serum compared to the control samples without the addition of human serum.
Tests using adult kidney cells
When changing the nutrient medium after the cultivation phase, the following groups of samples were grown:
Group% human serum Origin of human serum A 1 0% control sample without addition of
HS A 2 2.5% patient A before FZ injection A 3 2.5% patient A 4 days after FZ injection.
A 4 2.5% patient A 11 days after FZ injection.
A 5 2.5% patient B before FZ injection A 6 2.5% patient B 4 days after FZ injection.
A 7 2.5% patient B 11 days after FZ injection.
In the table above and in the tables below, FZ-Injection or FZ-Inj means. each fresh cell injection
The groups A 1- A 7 after three days, or
The number of adult kidney cells found in the cultures for five days is shown in Table III below.
Table III Test group Number of cells after 3 days after 5 days Al 3.8 x 105 8.6 x A2 4.5> <i0 9.3 x 105 A3 4.3 x 105 9.2> <i0 A4 4.3 x 105 8.7 x 105 AS 4.8 x 105 8.9 x 105 A6 4.7 x 105 9.2 x 105 A7 4.9 x 105 9.0 x
It can be seen from the results shown in Table III that a similar increase in cell numbers took place in all groups.
A comparison of group A 2 with group A 4, or group A 5 with group A 7, shows that human serum obtained before the fresh cell therapy and eleven days after the fresh cell therapy does not significantly influence the growth of adult kidney cells. This proves that no cytotoxic substances have formed in the patient's body after the fresh cell injection, because in the samples with the addition of the appropriate serum, no death of the adult kidney cells, but normal continued growth, was found.
In the tests compiled in Table III, the adult kidney cells were drawn to confluence in the respective medium at 37 ° C. After three days and after five days, each of the cell culture bottles was photographed at three different locations and the cells were counted there. The cell numbers given in Table III are the mean of these three counts.
Tests using embryonic kidney cells
When changing the nutrient medium after the growth phase of the embryonic kidney cells, the following groups of samples were grown. The control sample was grown again without the addition of human serum. The human serum samples were from the same patients A and B, respectively, before the fresh cell injection, four days after and eleven days after the fresh cell injection.
After changing the medium, the cells were drawn to confluence at 37 ° C. Three days after changing the medium or seven days after changing the medium, each of the cell culture bottles was photographed at three different locations and the cells were counted there. The cell counts given in Table IV below are also the mean of these three counts.
The following groups of samples were grown: Group% human serum Origin of human serum E 1 0% control sample without addition of
HS E 2 2.5% patient A before FZ injection E 3 2.5% patient A 4 days after FZ injection.
E 4 2.5% patient A 11 days after FZ injection.
E 5 2.5% patient B before FZ injection E 6 2.5% patient B 4 days after FZ injection.
E 7 2.5% patient B 11 days after FZ injection.
The mean values for embryonic kidney cells determined in groups E 1- E 7 after three days or seven days in the cultures are summarized in Table IV below.
Table IV Test group Number of cells after 3 days after 7 days E 1 2.3 x 105 4.0 x 105 E2 1.6 x 105 2.8> <x 105 l0 E3 1.8 x 105 2.7 x 105 E4 3.0 x 105 3.7 x 105 E5 1.5 x 105 3.0> <x 105 l0 E6 1.8 x 105 3.8 x 105 E7 2.2 x 105 3.6 x 105
From the values for the cell numbers compiled in Table IV, it can be seen that no cytotoxic substances can be found in the serum of the patients after the fresh cell therapy.
When comparing group E 2 with group E 4, or
of group E 5 with group E 7, it can be seen that after a cultivation period of three days between the two groups there are clearer differences in the number of cells per culture than after seven days. This is due to the fact that the cells are no longer in the growth phase after seven days. After three days of cultivation, however, it can be seen that in both patient A and patient B, a serum that was obtained before the fresh cell injection leads to a significantly lower cell proliferation than a serum that was obtained eleven days after the fresh cell injection.
As can be seen from Table IV, the embryonic kidney cells in group E 4, i.e. in the culture in which a serum sample from patient A was added, which was taken eleven days after the fresh cell injection, compared to the cell culture, at the serum of the same
Patients, however, before the fresh cell treatment was added, namely the group E 2 almost doubled.
From these experiments, one can see that five days after the fresh cell injection, the patient's serum contains any substances that promote the growth of embryonic kidney cells. These growth-promoting substances are also referred to as stimulants.
It can also be clearly seen from the results of Table IV that in group E 3 and group E 6, that is to say in those serum samples which were obtained four days after the injection of the fresh cells, the growth of the embryonic kidney cells was evidently less favorable
Substances are contained in those serum samples that were taken from the same patient eleven days after the fresh cell injection, namely the samples of group E 4 and E 7. From this it can be concluded that the
Cell growth promoting substances are not injected
Embryonic cells themselves, but that the injected living embryonic cells in the patient's organism have caused the formation of the stimulins, which
Promote embryonic kidney cell growth.
Example 9
Detection of cell regenerating factors in the serum
The procedure was similar to that in Example 7, but now it has been investigated how human serum influences the growth of damaged adult cells. As in Example 7, corresponding monkey kidney cells were used again as adult kidney cells.
In this experiment, 20,000 adult kidney cells were sown in 75 ml cell culture bottles. These cell culture bottles each contained 10 ml of a culture medium composed of 95% by volume MEM plus 5% by volume fetal calf serum.
The medium was grown again at a temperature of 37 ° C. and after this cultivation phase, the six
Lasted for days, the medium was changed. After the cultivation phase, the cultures were divided into several groups.
The medium was changed in all groups.
In a group that serves as a group for comparison purposes, the following twelve days are grown again in a medium containing 95% by volume of MEM plus 5
Vol .-% of fetal calf serum contains. The adult monkey kidney cells were not damaged in this medium.
The remaining groups were in one for twelve days
Medium bred that contains only 1% by volume of fetal calf serum and 99% by volume of MEM. In this medium the adult monkey kidney cells were damaged. After this damage phase, the medium was changed again in all groups, specifically to a culture medium
95 vol% MEM plus 5 vol% fetal calf serum.
In some groups, the medium was also 2.5
Vol .-%, based on this total medium, added to human serum.
A noticeable cell proliferation in those groups which were grown with the addition of human serum compared to the group of damaged cells which was grown only in the medium from 95% by volume MEM plus 5% by volume fetal calf serum is shown in FIG The presence of cell-regenerating factors in the tested
Serum. The presence of such cell-regenerating factors can also be established on the damaged cells, namely by improving or eliminating the disturbed morphology of the damaged adult mammalian cells. In this case, too, the comparison between the corresponding samples with serum addition and the samples without serum addition takes place.
i
Example 10
Determination of cell-regenerating factors in the serum of adult human patients before administration of a preparation according to the invention and after its administration
These tests were carried out according to that described in Example 9
Procedure carried out using monkey kidney cells. After the six-day growth phase described in Example 9, the medium was changed. In the
In group 1 the cells were not damaged because they were grown in a medium containing 5% fetal calf serum plus 95% MEM.
In groups 2 to 7, the cells were damaged for twelve days by growing them in the medium containing only 1% by volume calf serum plus 99% by volume MEM.
The damaged cells were then further cultivated in groups 2 to 7 in media which contained 95% MEM and 5% fetal calf serum and also 2.5% by volume, based on the total volume of the medium in human serum. The human serum originated from three different patients, namely it was obtained from blood samples of the corresponding patients before the fresh cell injection and eleven days after the fresh cell injection, or in one case four days after the fresh cell injection.
The groups tested were as follows: Group% human serum Origin of human serum 1 0% undamaged cells 2 2.5% patient A before FZ injection 3 2.5% patient A 11 days after FZ injection.
4 2.5% patient C before FZ injection 5 2.5% patient C 11 days after FZ injection.
6 2.5% patient E before FZ injection 7 2.5% patient E 4 days after FZ injection.
The damaged cells were grown in the nutrient medium with the addition of 2.5% human serum for six days. The undamaged group 1 cells were also grown in the medium of 95% MEM plus 5% fetal calf serum for six days. All further cultivations were also carried out at 37 ° C. All cell cultures were photographed and counted before the damage, after the damage phase and after the six-day cultivation.
The results are summarized in Table V below. The cell numbers listed there are the mean values from three identical cultures.
Table V group number of cells per culture before after 12 days after 6 days
Damage Damage offspring 1 3.4l0 2.1.106 2.4.106 2 3.7 105 3.2 105 5.1 105 3 3.8 105 3.0 105 15.0 105 4 3.3 105 3.2 105 6.3 105 5 3.0 105 2.7 105 9.5 105 6 3.2 105 2.6 105 5.7 105 7 3.5 105 3.1 105 5.9 105
You can see the in
Values summarized in Table V that the human serum of patient C and in particular of patient A before the fresh cell treatment leads to a significantly smaller increase in the number of cells than the human serum of the same patients, which was obtained eleven days after the fresh cell injection.
As a comparison of group 2 with group 3 shows, the serum of patient A after the fresh cell treatment caused about three times the cell growth in the cultures compared to the serum of the same patient before the fresh cell treatment. A comparison of groups 6 and 7 shows that, however, four days after the cell injection in patient E, the serum in question produces approximately the same cell proliferation as the serum of the same patient before the fresh cell treatment.
It can be concluded from this result that the formation of the substances which promote cell growth in the patient's body begins after more than four days after the fresh cell injection.
Microscopic observation of group 2 in comparison to group 3 and group 4 in comparison to group 5 showed that the growth-promoting substances formed in the patient's serum 11 days after the fresh cell injection also leads to regeneration of the damaged cells. In groups 2 and 4, damaged adult monkey kidney cells with greatly enlarged cytoplasm were still recognizable six days after cultivation in the medium containing 2.5% human serum. In contrast, the samples from groups 3 and 5 contained very few damaged cells with a greatly enlarged cytoplasm and a relatively high density of healthy regenerated adult monkey kidney cells.
Microscopic observation also showed that the cell density in groups 2 and 4 was significantly lower than the corresponding cell density in groups 3 and 5.