CH659085A5

CH659085A5 - PROCESS FOR THE SYNTHESIS OF A POLYSACCHARIDE.

Info

Publication number: CH659085A5
Application number: CH3523/81A
Authority: CH
Inventors: Minoru Tanaka; Yoshiaki Machida; Shozo Tanaka; Hiroshi Okamatsu; Tsuneya Yatake
Original assignee: Showa Sangyo Co
Priority date: 1980-07-28
Filing date: 1981-06-25
Publication date: 1986-12-31
Also published as: IT1195275B; DE3121548A1; FR2487376B1; NL8102628A; GB2080818A; GB2080818B; FR2487376A1; IT8122039A0

Description

Cette invention concerne un procédé de synthèse d'un Polysaccharide. Une méthode de préparation de Polysaccharide utilisant le Bacillus polymyxa N° 271 a été révélée dans le brevet japonais N° 67-7600. Le Bacillus polymyxa a été enregistré par l'Institut de Recherches sur les Fermentations, Agence de la Science industrielle et de la Technologie, Ministère du Commerce international et de l'Industrie (1-3, Higashi 1-Chome, Yatabe-machi Tsubuka-gun, Iba-raki-ken 305-JP), et son numéro de dépôt est FERM-P N° 1824. This invention relates to a process for the synthesis of a Polysaccharide. A method of preparing Polysaccharide using Bacillus polymyxa No. 271 was disclosed in Japanese patent No. 67-7600. Bacillus polymyxa has been registered by the Fermentation Research Institute, Industrial Science and Technology Agency, Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-Chome, Yatabe-machi Tsubuka- gun, Iba-raki-ken 305-JP), and its deposit number is FERM-P N ° 1824.

Le brevet japonais 67-7600 révèle une méthode de préparation d'un Polysaccharide très visqueux comprenant la culture du Bacillus polymyxa N° 271 dans un milieu de culture contenant une source de carbone assimilable comme du glucose, du sucrose ou du lactose. Le Polysaccharide obtenu dans le bouillon de culture visqueux est formé de glucose, de mannose, de galactose et d'acide glucuronique. On sait aussi que le Polysaccharide acide mentionné ci-dessus peut être obtenu en compagnie du même Polysaccharide à l'état neutre lorsque l'on part d'un milieu contenant du sucrose comme source de carbone assimilable. Japanese patent 67-7600 discloses a method of preparing a very viscous polysaccharide comprising the culture of Bacillus polymyxa No. 271 in a culture medium containing a source of assimilable carbon such as glucose, sucrose or lactose. The Polysaccharide obtained in the viscous culture broth is formed from glucose, mannose, galactose and glucuronic acid. It is also known that the acidic polysaccharide mentioned above can be obtained in the company of the same neutral polysaccharide when starting from a medium containing sucrose as an assimilable carbon source.

Le poids moléculaire du Polysaccharide élaboré par le Bacillus polymyxa N° 271 dans le milieu contenant du glucose a été déterminé selon la formule de Staudinger, et on a découvert que ce poids moléculaire était d'environ 1 300 000, comme cela a été révélé dans le «Journal of Agricultural Chemical Society of Japan», vol. 42, N° 7, pages 431-434 (1968). The molecular weight of the Polysaccharide produced by Bacillus polymyxa No. 271 in the medium containing glucose was determined according to Staudinger's formula, and it was discovered that this molecular weight was about 1,300,000, as has been revealed in the "Journal of Agricultural Chemical Society of Japan", vol. 42, No. 7, pages 431-434 (1968).

5 L'objet de cette invention est donc de fournir un procédé de synthèse d'un Polysaccharide ayant un poids moléculaire supérieur à 200 000 et présentant une activité réductrice sur le taux de cholestérol du sérum et dans le foie et sur l'indice athérogène. The object of this invention is therefore to provide a process for the synthesis of a Polysaccharide having a molecular weight greater than 200,000 and having a reducing activity on the serum cholesterol level and in the liver and on the atherogenic index.

Un autre objet de cette invention est de fournir un procédé de io synthèse d'un sel dudit Polysaccharide avec un cation, dont le degré de substitution par ce cation est supérieur à 0,2, ce sel présentant une activité réductrice sur le taux de cholestérol dans le sérum et dans le foie et sur l'indice athérogène. Another object of this invention is to provide a process for synthesizing a salt of said Polysaccharide with a cation, the degree of substitution of which by this cation is greater than 0.2, this salt having a reducing activity on the cholesterol level in serum and in the liver and on the atherogenic index.

Les objets de cette invention sont définis aux revendications 1 et 15 4. L'un de ceux-ci consiste en un procédé de Polysaccharide dans lequel on cultive le Bacillus Polymyxa N° 271 sur un milieu contenant des saccharides assimilables jusqu'à ce que le Polysaccharide, The objects of this invention are defined in claims 1 and 15 4. One of these consists of a Polysaccharide method in which Bacillus Polymyxa No. 271 is cultivated on a medium containing assimilable saccharides until the Polysaccharide,

très visqueux, s'accumule dans le milieu, puis on sépare ledit Polysaccharide du milieu. On cultive le Bacillus polymyxa N° 271 dans ce 20 milieu de préférence pendant plus de 20 heures. Le Polysaccharide qui s'est concentré dans le milieu peut être purifié par ultrafiltration et/ou par précipitation avec de l'alcool. very viscous, accumulates in the medium, then the said polysaccharide is separated from the medium. Bacillus polymyxa No. 271 is grown in this medium preferably for more than 20 hours. The Polysaccharide which has concentrated in the medium can be purified by ultrafiltration and / or by precipitation with alcohol.

On peut réaliser un autre objet de cette invention en proposant un procédé de synthèse d'un sel dudit Polysaccharide avec un cation 25 où le Bacillus polymyxa N° 271 est cultivé dans un milieu de culture contenant des saccharides assimilables et une quantité suffisante de cation pour produire un sel du Polysaccharide présentant un degré de substitution par le cation qui est supérieur à 0,2, cette culture continuant jusqu'à ce que le sel du Polysaccharide très visqueux s'ac-30 cumule dans ledit milieu, puis on sépare ce sel de Polysaccharide du milieu. Another object of this invention can be achieved by proposing a process for the synthesis of a salt of said Polysaccharide with a cation where Bacillus polymyxa No. 271 is cultivated in a culture medium containing assimilable saccharides and a sufficient amount of cation for producing a salt of the Polysaccharide having a degree of substitution by the cation which is greater than 0.2, this culture continuing until the salt of the highly viscous Polysaccharide accumulates in said medium, then this salt is separated of Polysaccharide from the medium.

Le milieu de culture contient de préférence une quantité totale d'équivalents de cation d'au moins 0,005 équivalent par litre de milieu, et son pH sera maintenu en dessus de 4,5. Si les conditions de 35 la culture ne permettent pas la production du sel désiré de Polysaccharide ou si l'on doit soumettre le sel de Polysaccharide qui s'est accumulé à un échange de cations, un sel du cation désiré peut être ajouté au milieu de culture ou au Polysaccharide libre, et on agite pendant un temps suffisant pour obtenir un sel du Polysaccharide •to dont le degré de substitution par le cation concerné est supérieur à 0,2. The culture medium preferably contains a total amount of cation equivalents of at least 0.005 equivalents per liter of medium, and its pH will be maintained above 4.5. If the culture conditions do not allow the production of the desired polysaccharide salt or if the polysaccharide salt which has accumulated has to be subjected to cation exchange, a salt of the desired cation can be added to the medium. culture or to the free Polysaccharide, and the mixture is stirred for a sufficient time to obtain a salt of the Polysaccharide • to whose degree of substitution by the cation concerned is greater than 0.2.

Ce sel de Polysaccharide qui s'est accumulé dans le milieu peut être purifié directement ou après le traitement avec le sel du cation désiré par ultrafiltration et/ou par précipitation avec de l'alcool. This polysaccharide salt which has accumulated in the medium can be purified directly or after treatment with the salt of the desired cation by ultrafiltration and / or by precipitation with alcohol.

Ces Polysaccharides qui possèdent un poids moléculaire qui est 45 supérieur à 200 000 et les sels de Polysaccharides dont le degré de substitution par le cation désiré est supérieur à 0,2 ont un effet réducteur remarquable sur le taux de cholestérol du sérum et dans le foie et sur l'indice athérogène, et ils sont donc utiles dans le traitement thérapeutique ou prophylactique de l'artériosclérose ou de so l'hypercholestêrolémie. These Polysaccharides which have a molecular weight which is greater than 200,000 and the Polysaccharide salts whose degree of substitution by the desired cation is greater than 0.2 have a remarkable reducing effect on the serum cholesterol level and in the liver and on the atherogenic index, and they are therefore useful in the therapeutic or prophylactic treatment of arteriosclerosis or of hypercholesterolemia.

Ces Polysaccharides ainsi que leurs sels possèdent l'activité remarquable de faire diminuer le taux de cholestérol dans le sérum et dans le foie ainsi que l'indice athérogène. These Polysaccharides and their salts have the remarkable activity of lowering the cholesterol level in the serum and in the liver as well as the atherogenic index.

On sait depuis longtemps que le taux de cholestérol dans le sang 55 est influencé de façon importante par le type et la quantité des aliments. La cholestérémie passe pour l'un des facteurs dangereux pouvant amener une manifestation subite d'artériosclérose comme un infarctus du myocarde. It has long been known that the level of cholesterol in the blood 55 is significantly influenced by the type and amount of food. Cholesteremia is believed to be one of the dangerous factors that can lead to a sudden manifestation of arteriosclerosis such as a myocardial infarction.

Les Polysaccharides, un des composants des aliments, ont été né-60 gligés du point de vue de la diététique, sauf en ce qui concerne les Polysaccharides digestibles et assimilables comme l'amidon. Polysaccharides, one of the components of food, have been born from the point of view of dietetics, except for digestible and digestible polysaccharides such as starch.

Les inventeurs ont effectué des tests sur les animaux avec des rats pour développer un agent dépresseur du taux de cholestérol dans le sérum et dans le foie, cela à partir des Polysaccharides élaborés par 65 le Bacillus polymyxa N° 271 (les Polysaccharides produits par le Bacillus polymyxa seront désignés par la suite par l'abrévitation B.p.). The inventors carried out tests on animals with rats to develop an agent for depressing the cholesterol level in serum and in the liver, this from the Polysaccharides produced by 65 Bacillus polymyxa N ° 271 (Polysaccharides produced by Bacillus polymyxa will be designated subsequently by the abbreviation Bp).

On a découvert que le B.p. ayant un poids moléculaire moyen supérieur à 200 000 possède l'activité remarquable de faire diminuer It was discovered that the B.p. having an average molecular weight greater than 200,000 has the remarkable activity of reducing

3 3

659 085 659,085

le taux du cholestérol dans le sérum et dans le foie et l'activité surprenante de faire augmenter le taux de cholestérol des lipoprotéines à haute densité (abrégées par la suite HDL) qui sont connues comme un facteur de prévention de l'artériosclérose. the cholesterol level in serum and in the liver and the surprising activity of increasing the cholesterol level of high density lipoproteins (subsequently abbreviated HDL) which are known as a factor for preventing arteriosclerosis.

Cette activité de croissance du taux de cholestérol de l'HDL correspond à une activité réductrice sur l'index athérogène qui est défini par la formule ci-dessous : This activity of growth of the HDL cholesterol level corresponds to a reducing activity on the atherogenic index which is defined by the formula below:

cholestérol du sérum - cholestérol de l'HDL cholestérol de l'HDL serum cholesterol - HDL cholesterol HDL cholesterol

Cela est un effet imprévu du B.p. This is an unforeseen effect of the B.p.

Le poids moléculaire moyen (désigné par la suite simplement par «poids moléculaire») du B.p. a été déterminé selon la méthode de Ninomiya et ai, publiée dans le «J. Agr. Chem. Soc. Japan» 42 (7), p. 431 (1968). The average molecular weight (hereinafter simply referred to as "molecular weight") of the B.p. was determined according to the method of Ninomiya et al, published in "J. Agr. Chem. Soc. Japan ”42 (7), p. 431 (1968).

Le Polysaccharide peut être élaboré en cultivant le Bacillus polymyxa N° 271 (FERM-P N° 1824) de manière aérobie dans un milieu de culture aqueux contenant 3-5% de saccharides assimilables comme du glucose, du sucrose, du lactose, des mélasses ou d'autres saccharides, en compagnie d'une source d'azote comme une peptone, de l'extrait de blé, de l'extrait de levure ou de l'urée et des sels comme du sulfate de magnésium. Le Polysaccharide visqueux qui s'accumule est purifié par précipitation avec de l'alcool et par ultrafiltration. Il est essentiel que le poids moléculaire du Polysaccharide soit supérieur à 200 000 pour que se manifeste l'activité réductrice sur le taux du cholestérol dans le sérum et dans le foie. The Polysaccharide can be produced by cultivating Bacillus polymyxa N ° 271 (FERM-P N ° 1824) aerobically in an aqueous culture medium containing 3-5% of assimilable saccharides such as glucose, sucrose, lactose, molasses or other saccharides, along with a nitrogen source such as a peptone, wheat extract, yeast extract or urea and salts such as magnesium sulfate. The viscous Polysaccharide which accumulates is purified by precipitation with alcohol and by ultrafiltration. It is essential that the molecular weight of the Polysaccharide is greater than 200,000 so that the reducing activity on cholesterol levels in serum and in the liver is manifested.

Les conditions de culture des micro-organismes et de purification du B.p. ont été étudiées en détail, car le bouillon de culture est très visqueux et l'application de traitements usuels comme la filtration, la concentration et le séchage pour l'étape de purification s'est révélée très difficile. The conditions for culturing microorganisms and for purifying B.p. have been studied in detail, because the culture broth is very viscous and the application of usual treatments such as filtration, concentration and drying for the purification stage has proved to be very difficult.

Le temps de culture est en général supérieur à 20 heures pour pouvoir obtenir un Polysaccharide ayant un poids moléculaire moyen supérieur à 200 000. On obtient un Polysaccharide ayant un poids moléculaire de 190 000 en cultivant les micro-organismes pendant 16 heures. On peut aussi obtenir un Polysaccharide ayant un poids moléculaire moyen supérieur à 200 000 si l'on traite le Polysaccharide qui a un poids moléculaire inférieur à 200 000 avec des alcools faiblement concentrés. Les Polysaccharides à haut poids moléculaire précipitent en présence d'alcools de faible concentration, et ceux qui ont un poids moléculaire plus faible précipitent en présence d'une forte concentration d'alcool. Des sels tels que le chlorure de sodium ou le chlorure de potassium facilitent la précipitation du Polysaccharide dans de l'alcool faiblement concentré. Le Polysaccharide à faible poids moléculaire précipite plus facilement lorsqu'on ajoute des sels, cela pour une même concentration d'alcool. The culture time is generally greater than 20 hours in order to be able to obtain a Polysaccharide having an average molecular weight greater than 200,000. A Polysaccharide having a molecular weight of 190,000 is obtained by culturing the microorganisms for 16 hours. A Polysaccharide having an average molecular weight greater than 200,000 can also be obtained if the Polysaccharide which has a molecular weight less than 200,000 is treated with low-concentrated alcohols. High molecular weight polysaccharides precipitate in the presence of low concentration alcohols, and those which have a lower molecular weight precipitate in the presence of a high concentration of alcohol. Salts such as sodium chloride or potassium chloride facilitate the precipitation of the Polysaccharide in low concentrated alcohol. The low molecular weight polysaccharide precipitates more easily when salts are added, for the same concentration of alcohol.

Le Polysaccharide à haut poids moléculaire peut être hydrolysé par un acide ou par une base de manière à obtenir le Polysaccharide de plus faible poids moléculaire. Il est préférable d'hydroliser le Polysaccharide avant de séparer les cellules du milieu par filtration, car la résistance à la filtration s'en trouve diminuée. The high molecular weight polysaccharide can be hydrolyzed by an acid or a base so as to obtain the lower molecular weight polysaccharide. It is preferable to hydrolyze the Polysaccharide before separating the cells from the medium by filtration, because the resistance to filtration is thereby reduced.

Le Polysaccharide produit selon le procédé de cette invention présente une activité réductrice sur le taux du cholestérol dans le sérum et dans le foie lorsqu'on examine des rats qui ont été nourris avec une diète contenant 5% de B.p. The Polysaccharide produced according to the method of this invention exhibits a reducing activity on the cholesterol level in serum and in the liver when examining rats which were fed with a diet containing 5% of B.p.

Le B.p. peut être administré sous la forme d'une poudre, d'une solution aqueuse ou d'une suspension aqueuse. Il peut être pris séparément ou inclus dans un régime ou dans certains aliments (aliments diététiques). The B.p. can be administered as a powder, an aqueous solution or an aqueous suspension. It can be taken separately or included in a diet or in certain foods (dietetic foods).

On a encore découvert que les sels du Polysaccharide élaboré par le Bacillus polymyxa N° 271 ont aussi une activité réductrice sur le taux du cholestérol dans le sérum et dans le foie. It has also been discovered that the salts of the Polysaccharide produced by Bacillus polymyxa No. 271 also have a reducing activity on the level of cholesterol in serum and in the liver.

On a étudié les différentes combinaisons entre le Polysaccharide acide et plusieurs cations pour trouver une relation entre l'activité réductrice du taux de cholestérol, le type de cation utilisé pour substituer le B.p. et le degré de substitution. We studied the different combinations between the acidic polysaccharide and several cations to find a relationship between the activity reducing cholesterol, the type of cation used to replace B.p. and the degree of substitution.

Les sels de Polysaccharides avec un cation choisi dans au moins l'un des groupes suivants: les métaux alcalins, les métaux alcalino-terreux, les métaux de transition ou avec les ions de manganèse, d'aluminium, de zinc, de cuivre et d'ammonium, qui présentent un degré de substitution supérieur à 0,2, possèdent l'activité remarquable de faire diminuer le taux de cholestérol dans le sérum et dans le foie. Salts of Polysaccharides with a cation chosen from at least one of the following groups: alkali metals, alkaline earth metals, transition metals or with manganese, aluminum, zinc, copper and d ions ', which have a degree of substitution greater than 0.2, have the remarkable activity of lowering the cholesterol level in serum and in the liver.

Les sels du B.p. avec ces divers cations peuvent être obtenus en cultivant de manière aérobie le Bacillus polymyxa N° 271 dans un milieu de culture contenant 3-5% des saccharides assimilables tels que du glucose, du galactose, du lactose, des mélasses ou d'autres saccharides, en compagnie d'une source d'azote comme une peptone, de l'extrait de blé ou de levures, ou de l'urée, ainsi qu'avec des sels du cation désiré avec du phosphate et du sulfate de magnésium. The salts of B.p. with these various cations can be obtained by aerobically cultivating Bacillus polymyxa No. 271 in a culture medium containing 3-5% of assimilable saccharides such as glucose, galactose, lactose, molasses or other saccharides, in the company of a nitrogen source such as a peptone, wheat or yeast extract, or urea, as well as with salts of the desired cation with phosphate and magnesium sulfate.

Le Polysaccharide qui s'est accumulé dans le milieu est très visqueux et il est composé de D-glucose, de D-mannose, de D-galactose et d'acide D-glucuronique, le rapport existant entre ces composants étant de 3:3:1:2. A partir du rapport qui existe entre ces différents sucres et de la combinaison de 2 cations représentant un poids moléculaire de 1500, on peut calculer le degré de substitution du Polysaccharide par ces cations au moyen de la formule qui suit: The Polysaccharide which has accumulated in the medium is very viscous and it is composed of D-glucose, D-mannose, D-galactose and D-glucuronic acid, the ratio existing between these components being 3: 3 : 1: 2. From the relationship between these different sugars and the combination of 2 cations representing a molecular weight of 1500, we can calculate the degree of substitution of the Polysaccharide by these cations using the following formula:

J - J u • ■ (Mi\ , 1000 J - J u • ■ (Mi \, 1000

ûcsré de substitution — X I t-tt I / substitute ûcsré - X I t-tt I /

5 \Ni )' 750 5 \ Ni) '750

Mi = concentration du cation en g/kg Mi = cation concentration in g / kg

Ni = nb. d'équivalents-grammes de cation Ni = nb. equivalent grams of cation

Les métaux alcalins comprennent le sodium et le potassium et les métaux alcalino-terreux incluent le calcium et le magnésium. The alkali metals include sodium and potassium and the alkaline earth metals include calcium and magnesium.

La quantité de cation qui est contenue dans le milieu de culture est de préférence d'au moins 0,005 Eq. par litre de milieu, calculée d'après la somme des équivalents, et on doit nécessairement ajuster le pH du milieu à une valeur supérieure à 4,5 et de préférence entre 6 et 7. The amount of cation which is contained in the culture medium is preferably at least 0.005 Eq. per liter of medium, calculated from the sum of the equivalents, and the pH of the medium must necessarily be adjusted to a value greater than 4.5 and preferably between 6 and 7.

Si le milieu de culture ne convient pas à la production du sel désiré de B.p., le sel de B.p. qui s'accumule peut ne pas avoir le degré de substitution prédéterminé. Le B.p. ainsi obtenu ou le Polysaccharide soumis à un traitement de substitution de cations par échange d'ions, ou par électrolyse, peuvent être traités avec les sels du cation désiré et brassés pendant assez de temps pour produire le B.p. présentant un degré de substitution supérieur à 0,2, cela avant la purification par ultrafiltration ou par précipitation avec de l'alcool. If the culture medium is not suitable for producing the desired B.p. salt, the B.p. that accumulates may not have the predetermined degree of substitution. The B.p. thus obtained or the Polysaccharide subjected to a cation substitution treatment by ion exchange, or by electrolysis, can be treated with the salts of the desired cation and stirred for sufficient time to produce the B.p. having a degree of substitution greater than 0.2, this before purification by ultrafiltration or by precipitation with alcohol.

Par le fait que tous les cations ne sont pas toujours nécessaires pour cultiver les microbes, il est préférable de traiter le B.p. avec les sels désirés après avoir enlevé le cation du sel du B.p. par échange d'ions ou par électrolyse pour obtenir exclusivement le sel de B.p. avec le cation souhaité. By the fact that not all cations are always necessary to cultivate microbes, it is preferable to treat B.p. with the desired salts after removing the salt cation from the B.p. by ion exchange or by electrolysis to obtain exclusively the salt of B.p. with the desired cation.

Le sel du Polysaccharide produit selon le procédé de cette invention, qui présente un degré de substitution supérieur à 0,2, possède une activité réductrice sur le taux de cholestérol du sérum et dans le foie lorsqu'on examine des rats ayant été nourris avec un régime contenant 5% de sel de B.p. The salt of the Polysaccharide produced according to the process of this invention, which has a degree of substitution greater than 0.2, has a reducing activity on the serum cholesterol level and in the liver when examining rats having been fed with a diet containing 5% Bp salt

Le sel de B.p. de cette invention peut être pris sous la forme d'une poudre, d'une solution aqueuse ou d'une dispersion aqueuse et il peut être utilisé comme ingrédient dans les aliments diététiques. The salt of B.p. of this invention can be taken in the form of a powder, an aqueous solution or an aqueous dispersion and it can be used as an ingredient in dietetic foods.

La méthode de préparation du B.p. et du sel de celui-ci ainsi que les résultats concernant leur activité de réducteur du taux de cholestérol sont décrits dans les exemples et dans les expériences qui suivent. The B.p. and salt thereof as well as the results regarding their cholesterol lowering activity are described in the examples and in the experiments which follow.

Exemple 1 Example 1

On ajoute 600 ml de bouillon de culture dans lequel le Bacillus polymyxa N° 271 (FERM-P N° 1824) a été précultivé pendant 24 heures à 12 1 de milieu de culture (pH = 7,0) contenant 4% de glucose cristallisé, 0,1% de peptone, 2% d'extrait de blé, 0,2% de 600 ml of culture broth are added in which Bacillus polymyxa No. 271 (FERM-P No. 1824) has been precultured for 24 hours to 12 l of culture medium (pH = 7.0) containing 4% of crystallized glucose , 0.1% peptone, 2% wheat extract, 0.2%

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

659 085 659,085

4 4

sulfate de magnésium et 6 ppm de sulfate de manganèse. La culture se poursuit à 28° C avec une aération de 0,8 WM pendant 72 heures. La viscosité du bouillon de culture atteint une valeur aussi haute que 9500 cP. Le bouillon est dilué avec cinq fois son volume d'eau chaude et on chauffe le tout à 70-80° C. Les cellules des microbes sont éliminées du milieu par filtration sur du papier filtre préenduit de terre de diatomées. On filtre 40 1 de bouillon sur une membrane ultrafiltrante (UF-SWM-85V-1, module Abcor SWM-85M produit par Bioengineering Co., Ltd.), il est purifié par filtration à volume constant jusqu'à un rapport V/Vo = 5 (rapport entre la quantité d'eau ajoutée et celle qui est contenue dans le bouillon original), on le concentre et on le lyophilise pour obtenir 50 g de Polysaccharide en poudre (échantillon 1). magnesium sulfate and 6 ppm manganese sulfate. The culture continues at 28 ° C with aeration of 0.8 WM for 72 hours. The viscosity of the culture broth reaches a value as high as 9500 cP. The broth is diluted with five times its volume of hot water and the whole is heated to 70-80 ° C. The cells of the microbes are eliminated from the medium by filtration on filter paper pre-coated with diatomaceous earth. 40 l of broth are filtered on an ultrafiltrating membrane (UF-SWM-85V-1, Abcor module SWM-85M produced by Bioengineering Co., Ltd.), it is purified by filtration at constant volume up to a V / Vo ratio = 5 (ratio between the amount of water added and that contained in the original broth), it is concentrated and lyophilized to obtain 50 g of powdered Polysaccharide (sample 1).

Exemples 2-4, contrôle 1 Examples 2-4, check 1

On ajuste le pH à 1,5 au moyen d'acide chlorhydrique de quatre échantillons de 40 1 de bouillon filtré obtenu à l'exemple 1 et on chauffe à 80° C pendant 5 minutes (ex. 2), pendant 15 minutes (ex. 3), pendant 45 minutes (ex. 4) et pendant 2 heures (ex. 5) respectivement ces quatre échantillons puis on les neutralise avec de l'hy-droxyde de sodium. Par la suite, chaque échantillon est ultrafiltré comme dans l'exemple 1 et séché, ce qui permet d'obtenir 48 g de poudre de Polysaccharide (échantillon 2), 46 g de poudre de Polysaccharide (échantillon 3), 45 g de poudre de Polysaccharide (échantillon 4) et 40 g de poudre de Polysaccharide (échantillon 5), qui correspondent respectivement aux exemples 2 à 4 et au contrôle 1. The pH is adjusted to 1.5 using hydrochloric acid from four 40 l samples of filtered broth obtained in Example 1 and the mixture is heated at 80 ° C for 5 minutes (ex. 2), for 15 minutes (ex. . 3), for 45 minutes (ex. 4) and for 2 hours (ex. 5) respectively these four samples then they are neutralized with sodium hydroxide. Thereafter, each sample is ultrafiltered as in Example 1 and dried, which makes it possible to obtain 48 g of polysaccharide powder (sample 2), 46 g of polysaccharide powder (sample 3), 45 g of powder of Polysaccharide (sample 4) and 40 g of Polysaccharide powder (sample 5), which correspond respectively to Examples 2 to 4 and to Control 1.

Le poids moléculaire et les résultats de l'analyse des échantillons 1 à 4 et de l'échantillon de contrôle 1 sont présentés dans le tableau 1. The molecular weight and the results of the analysis of samples 1 to 4 and of the control sample 1 are presented in Table 1.

Tableau 1 Table 1

Ech. N° Ech. No.

Poids moléculaire Molecular weight

Protéine brute (%) Crude protein (%)

Cendres (%) Ash (%)

1 1

93 x 104 93 x 104

1,16 1.16

7,6 7.6

2 2

54x10* 54x10 *

1,02 1.02

7,5 7.5

3 3

36 x 104 36 x 104

0,87 0.87

7,2 7.2

4 4

25 x 104 25 x 104

0,89 0.89

8,1 8.1

5 5

16 x 104 16 x 104

0,78 0.78

8,2 8.2

Exemple 5 Example 5

On obtient le bouillon filtré en cultivant les microbes comme dans l'exemple 1 avec un milieu de culture à pH 7,0 qui contient 4% d'hydrol, produit secondaire solide obtenu dans la production du glucose cristallisé, 0,1 % de peptone, 2% d'extrait de blé, 0,2% de sulfate de magnésium et 6 ppm de sulfate de manganèse. On ajoute 401 de bouillon filtré à 801 d'éthanol. The filtered broth is obtained by cultivating the microbes as in Example 1 with a culture medium at pH 7.0 which contains 4% of hydrol, a solid secondary product obtained in the production of crystallized glucose, 0.1% of peptone , 2% wheat extract, 0.2% magnesium sulfate and 6 ppm manganese sulfate. 401 filtered broth is added to 801 ethanol.

On recueille le précipité fibreux qui s'est formé par centrifuga-tion. Ce précipité est déshydraté, séché et redissous dans 15 1 d'eau. On chauffe à 70-80° C cette solution aqueuse et on filtre, puis on ajoute 25 1 d'éthanol au filtrat. Le précipité qui se forme est à nouveau recueilli, on le sèche sous vide à 50° C et on le broie, ce qui donne 50 g de Polysaccharide en poudre (échantillon 6). The fibrous precipitate which has formed by centrifugation is collected. This precipitate is dehydrated, dried and redissolved in 15 l of water. This aqueous solution is heated to 70-80 ° C and filtered, then 25 l of ethanol is added to the filtrate. The precipitate which forms is collected again, it is dried under vacuum at 50 ° C. and it is ground, which gives 50 g of powdered polysaccharide (sample 6).

Exemple 6 Example 6

On passe 401 du bouillon filtré obtenu à l'exemple 5 à travers une membrane ultrafiltrante (UF-SWM-85V-1, module Abcor SWM-85V produite par Bioengineering Co. Ltd.), celui-ci est purifié par filtration à volume constant jusqu'à un rapport V/Vo = 5 (rapport entre la quantité d'eau ajoutée et celle qui est contenue dans le bouillon original), on le concentre et on le lyophilise, ce qui permet d'obtenir 50 g de Polysaccharide en poudre (échantillon 7). 401 of the filtered broth obtained in Example 5 is passed through an ultrafiltrating membrane (UF-SWM-85V-1, Abcor module SWM-85V produced by Bioengineering Co. Ltd.), it is purified by filtration at constant volume up to a ratio V / Vo = 5 (ratio between the amount of water added and that which is contained in the original broth), it is concentrated and it is lyophilized, which makes it possible to obtain 50 g of powdered Polysaccharide (sample 7).

Exemple 7 Example 7

600 ml de bouillon de culture dans lequel le Bacillus polymyxa N° 271 a été précultivé pendant 24 heures sont versés dans 121 de milieu de culture (à pH = 7,0) qui contient 5% de glucose cristallisé. 600 ml of culture broth in which Bacillus polymyxa No. 271 has been precultured for 24 hours are poured into 121 of culture medium (at pH = 7.0) which contains 5% of crystallized glucose.

0,3% d'extrait de levures en poudre, 0,05% d'urée, 0,2% de sulfate de magnésium et 6 ppm de sulfate de manganèse. La culture se poursuit à 28° C avec une aération de 0,8 VVM pendant 120 heures. On obtient ainsi 40 1 de bouillon filtré comme dans l'exemple 1 et on ef-s fectue la purification de la même manière que dans l'exemple 1, sauf que cette fois on utilise du méthanol comme agent de précipitation, ce qui permet d'obtenir 40 g de Polysaccharide en poudre (échantillon 8). 0.3% powdered yeast extract, 0.05% urea, 0.2% magnesium sulfate and 6 ppm manganese sulfate. The culture continues at 28 ° C with aeration of 0.8 VVM for 120 hours. 40 1 of filtered broth are thus obtained as in Example 1 and the purification is carried out in the same manner as in Example 1, except that this time methanol is used as a precipitation agent, which allows d '' obtain 40 g of powdered Polysaccharide (sample 8).

Les poids moléculaires et les résultats de l'analyse des échantil-io Ions 6-8 des exemples 5 à 7 sont reportés dans le tableau 2. The molecular weights and the results of the analysis of samples 6-8 of Examples 5 to 7 are given in Table 2.

Tableau 2 Table 2

Echant. N° Sam. No.

Poids moléculaire Molecular weight

Protéine brute (%) Crude protein (%)

Cendres (%) Ash (%)

6 6

104 xlO4 104 xlO4

2,0 2.0

8,1 8.1

7 7

100 xlO4 100 xlO4

1,4 1.4

6,2 6.2

8 8

136x104 136x104

1,9 1.9

7,5 7.5

20 20

Exemple 8 Example 8

600 ml de bouillon de culture dans lequel le Bacillus polymyxa N° 271 a été précultivé pendant 24 heures sont ajoutés à 121 de 25 milieu de culture (à pH = 7,0) qui contient 4% de glucose cristallisé, 0,5% de peptone, 0,5% de dihydrogénophosphate de potassium, 0,1% de sulfate de magnésium ( • 7H20), 6 ppm de sulfate de manganèse (4-6H20) et 0,1% de silicone antimousse. La culture est effectuée à 28° C avec une aération de 0,8 WM pendant 96 heures. La 30 viscosité du milieu de culture était de 14000 cP. Le bouillon final est dilué avec 5 fois son volume d'eau chaude et on le traite comme dans l'exemple 5, ce qui donne 53 g de poudre de Polysaccharide (échantillon 9). 600 ml of culture broth in which Bacillus polymyxa No. 271 has been precultured for 24 hours are added to 121 of culture medium (at pH = 7.0) which contains 4% of crystallized glucose, 0.5% of peptone, 0.5% potassium dihydrogen phosphate, 0.1% magnesium sulphate (• 7H20), 6 ppm manganese sulphate (4-6H20) and 0.1% anti-foam silicone. The culture is carried out at 28 ° C. with aeration of 0.8 WM for 96 hours. The viscosity of the culture medium was 14000 cP. The final broth is diluted with 5 times its volume of hot water and it is treated as in Example 5, which gives 53 g of polysaccharide powder (sample 9).

35 Exemple 9 35 Example 9

On ajoute 40 ml d'une solution saturée en NaCl, servant d'agent de précipitation, à 401 de bouillon fiîtré obtenu dans l'exemple 7, puis on ajoute encore 801 d'éthanol et on traite le mélange obtenu comme dans l'exemple 5, ce qui donne 55 g de Polysaccharide en 40 poudre (échantillon 10). 40 ml of a saturated NaCl solution, serving as a precipitation agent, are added to 401 of the filtered broth obtained in Example 7, then another 801 of ethanol is added and the mixture obtained is treated as in Example 5, which gives 55 g of polysaccharide powder 40 (sample 10).

Echantillon de contrôle N° 2 Control sample N ° 2

On dilue 40 1 du bouillon filtré obtenu dans l'exemple 8 avec la même quantité d'eau puis on ajoute à ce mélange 300 ml d'une 45 résine échangeuse d'ions Amberlite 200 (forme H+) et 600 ml d'une résine échangeuse d'ions Amberlite IRA-411 (forme OH~). Le mélange obtenu est brassé pendant 3 heures à 40° C. Le liquide ainsi traité est purifié au moyen d'une membrane ultrafiltrante (UF-SWM-85V-1, module Abcor SWM-85V produite par Bioengineering 50 Co. Ltd.) jusqu'à un rapport V/Vo = 5 (rapport de la quantité totale d'eau ajoutée à celle qui était déjà contenue dans le bouillon original), on le concentre et on le lyophilise, ce qui permet d'obtenir 40 l of the filtered broth obtained in Example 8 are diluted with the same amount of water and then 300 ml of an Amberlite 200 ion exchange resin (form H +) and 600 ml of a resin are added to this mixture Amberlite IRA-411 ion exchange (OH ~ form). The mixture obtained is stirred for 3 hours at 40 ° C. The liquid thus treated is purified by means of an ultrafiltrating membrane (UF-SWM-85V-1, Abcor module SWM-85V produced by Bioengineering 50 Co. Ltd.) until 'at a ratio V / Vo = 5 (ratio of the total amount of water added to that which was already contained in the original broth), it is concentrated and lyophilized, which makes it possible to obtain

50 g de Polysaccharide en poudre (échantillon 11). 50 g of powdered Polysaccharide (sample 11).

55 Exemple 10 55 Example 10

Le bouillon filtré obtenu dans l'exemple 8 est traité avec des résines échangeuses d'ions comme pour l'échantillon de contrôle N° 2 et on y ajoute 50 ml d'une solution aqueuse de chlorure de po-60 tassium à 5%. On laisse reposer le mélange pendant une nuit puis on le traite comme l'échantillon de contrôle N° 2 et l'on obtient ainsi The filtered broth obtained in Example 8 is treated with ion-exchange resins as for control sample No. 2 and 50 ml of an aqueous solution of po-60 tassium chloride at 5% are added thereto. The mixture is left to stand overnight then it is treated as control sample No. 2 and thus obtained

51 g de Polysaccharide en poudre (échantillon 12). 51 g of polysaccharide powder (sample 12).

Exemple 11 Example 11

65 On effectue le même traitement sur le bouillon que dans l'exemple 10, mais en utilisant cette fois 20 ml d'une solution aqueuse de NaCl à 5% au lieu de chlorure de potassium, ce qui permet d'obtenir 51 g de Polysaccharide en poudre (échantillon 13). The same treatment is carried out on the broth as in Example 10, but this time using 20 ml of a 5% aqueous NaCl solution instead of potassium chloride, which gives 51 g of Polysaccharide powder (sample 13).

659 085 659,085

Les poids moléculaires, les résultats analytiques, le contenu en cations et le degré de substitution des échantillons 9 à 13 sont reportés dans le tableau 3. The molecular weights, the analytical results, the cation content and the degree of substitution of samples 9 to 13 are given in table 3.

Tableau 3 Table 3

Ech. N° Ech. No.

Poids mol. xlO4 Mol weight xlO4

Prot. Prot.

brute % brute %

Cendres % Ash%

Contenu en cations ppm/équival./kg Cation content ppm / equivalent / kg

Equiv. totaux Equiv. totals

Degré de subst. Degree of subst.

Na N / A

K K

Mg Mg

Ca It

9 9

114 114

1,46 1.46

7,4 7.4

5400 5400

18 800 18,800

3400 3400

50 50

0,23 0.23

0,46 0.46

0,28 0.28

0,002 0.002

0,97 0.97

0,73 0.73

10 10

98 98

1,23 1.23

7,2 7.2

15000 15000

9 700 9,700

2700 2700

50 50

0,65 0.65

0,25 0.25

0,22 0.22

0,002 0.002

1,12 1.12

0,84 0.84

11 11

118 118

0,74 0.74

3,0 3.0

590 590

120 120

270 270

<50 <50

0,025 0.025

0,003 0.003

0,022 0.022

0,002 0.002

0,052 0.052

0,039 0.039

12 12

118 118

0,73 0.73

4,5 4.5

550 550

22 300 22,300

260 260

50 50

0,024 0.024

0,57 0.57

0,021 0.021

0,002 0.002

0,62 0.62

0,47 0.47

13 13

116 116

0,73 0.73

4,9 4.9

6900 6900

130 130

270 270

50 50

0,30 0.30

0,003 0.003

0,022 0.022

0,002 0.002

0,33 0.33

0,25 0.25

Exemple 12 Example 12

600 ml de bouillon de culture dans lequel le Bacillus polymyxa N° 271 a été précultivé pendant 24 heures sont versés dans 12 1 de milieu de culture (à pH = 7,0) qui contient 5% de glucose cristallisé, 0,625% de peptone, 0,5% de dihydrogénophosphate de potassium, 0,2% de sulfate de magnésium ( • 7H20), 0,5% de carbonate de calcium, 6 ppm de sulfate de manganèse (4-6H20) et 0,1% d'huile de soja. On effectue la culture à 28° C avec une aération de 0,8 WM pendant 96 heures. La viscosité du bouillon de culture était de 16000 cP. On traite 40 1 de bouillon filtré comme dans l'exemple 5 pour obtenir 58 g de Polysaccharide en poudre (échantillon 14). 600 ml of culture broth in which Bacillus polymyxa No. 271 has been precultured for 24 hours are poured into 12 l of culture medium (at pH = 7.0) which contains 5% crystallized glucose, 0.625% peptone, 0.5% potassium dihydrogen phosphate, 0.2% magnesium sulfate (• 7H20), 0.5% calcium carbonate, 6 ppm manganese sulfate (4-6H20) and 0.1% oil soy. The culture is carried out at 28 ° C. with aeration of 0.8 WM for 96 hours. The viscosity of the culture broth was 16,000 cP. 40 l of filtered broth are treated as in Example 5 to obtain 58 g of powdered polysaccharide (sample 14).

Exemple 13 Example 13

401 de bouillon filtré obtenus dans l'exemple 12 ont été ultrafil-trés dans des conditions similaires à celles de l'échantillon de contrôle N° 2, ce qui permet d'obtenir 62 g de poudre de Polysaccharide (échantillon 15). 401 of filtered broth obtained in Example 12 were ultrafiltered in conditions similar to those of control sample No. 2, which allows to obtain 62 g of polysaccharide powder (sample 15).

Exemple 14 Example 14

401 de bouillon filtré obtenus comme dans l'exemple 12 ont été dilués avec une même quantité d'eau et déminéralisés par passage descendant avec un débit SV1 = 3 dans une colonne de 5 cm de dia-25 mètre remplie d'un mélange de 300 ml d'Amberlite 200 (forme H) et de 600 ml d'Amberlite IRA-411 (forme OH). On dissout dans une petite quantité d'eau un mélange de sels [35 g de dihydrogénophosphate de potassium et 15 g de sulfate de magnésium (7H20)] dont les quantités ont été calculées d'après la concentration des sels conte-30 nus dans le milieu de culture originel. On ajoute ce mélange au bouillon déminéralisé. Le mélange obtenu est encore neutralisé avec de l'hydroxyde de sodium et on le laisse reposer pendant une nuit puis on le soumet à une ultrafiltration selon la méthode décrite pour l'échantillon de contrôle N° 2; cela permet d'obtenir 60 g de poudre 35 de Polysaccharide (échantillon 16). 401 of filtered broth obtained as in Example 12 were diluted with the same amount of water and demineralized by descending passage with a flow SV1 = 3 in a column of 5 cm dia-25 meter filled with a mixture of 300 ml of Amberlite 200 (form H) and 600 ml of Amberlite IRA-411 (form OH). A mixture of salts [35 g of potassium dihydrogen phosphate and 15 g of magnesium sulfate (7H20)] is dissolved in a small amount of water, the amounts of which have been calculated according to the concentration of the salts contained in the original culture medium. This mixture is added to the demineralized broth. The mixture obtained is further neutralized with sodium hydroxide and allowed to stand overnight then subjected to ultrafiltration according to the method described for the control sample No. 2; this makes it possible to obtain 60 g of Polysaccharide powder 35 (sample 16).

Echantillon de contrôle N" 3 Control sample N "3

On soumet à une ultrafiltration le bouillon obtenu après le passage dans la colonne échangeuse d'ions sans que l'on rajoute de 40 sels, ce qui permet d'obtenir 56 g de poudre de Polysaccharide (échantillon 17). The broth obtained after passage through the ion exchange column is subjected to ultrafiltration without the addition of 40 salts, which makes it possible to obtain 56 g of polysaccharide powder (sample 17).

Le poids moléculaire, les résultats de l'analyse, le contenu en cations et le degré de substitution par le cation des échantillons des exemples 12 à 14 et de l'échantillon de contrôle N° 3 sont reportés 45 dans le tableau 4. The molecular weight, the results of the analysis, the content in cations and the degree of substitution by the cation of the samples of Examples 12 to 14 and of the control sample No. 3 are reported 45 in Table 4.

Tableau 4 Table 4

Ech. N° Ech. No.

Poids mol. xlO4 Mol weight xlO4

Prot. Prot.

brute % brute %

Cendres % Ash%

Contenu en cations ppm/équival. de cation/kg Content in ppm ppm / equivalent. cation / kg

Equiv. totaux Equiv. totals

Degré de subst. Degree of subst.

Na N / A

K K

Mg Mg

Ca It

14 14

104 104

2,0 2.0

8,1 8.1

5470 5470

18 800 18,800

7 850 7,850

4250 4250

0,24 0.24

0,48 0.48

0,65 0.65

0,21 0.21

1,58 1.58

1,18 1.18

15 15

100 100

1,4 1.4

8,9 8.9

6670 6670

15 600 15,600

4420 4420

4120 4120

— -

0,29 0.29

0,40 0.40

0,36 0.36

0,21 0.21

1,26 1.26

0,95 0.95

16 16

89 89

0,9 0.9

6,1 6.1

5610 5610

16 350 16,350

6 700 6,700

920 920

— -

0,24 0.24

0,42 0.42

0,55 0.55

0,046 0.046

1,26 1.26

0,95 0.95

17 17

91 91

0,9 0.9

1,2 1.2

670 670

70 70

310 310

3 190 3,190

— -

0,029 0.029

0,002 0.002

0,025 0.025

0,16 0.16

0,216 0.216

0,16 0.16

Exemple 15 Example 15

600 ml de bouillon de culture dans lequel le Bacillus polymyxa N° 271 a été précultivé pendant 24 heures sont ajoutés à 12 1 de 600 ml of culture broth in which Bacillus polymyxa No. 271 has been precultured for 24 hours are added to 12 l of

65 milieu de culture (à pH = 7,0) contenant 4% de glucose cristallisé, 0,5% de peptone, 0,5% de dihydrogénophosphate de potassium, 65 culture medium (pH = 7.0) containing 4% crystallized glucose, 0.5% peptone, 0.5% potassium dihydrogen phosphate,

SV = «Space Velocity» = vélocité spatiale. SV = "Space Velocity" = spatial velocity.

659 085 659,085

6 6

0,5% de carbonate de calcium, 0,1% de sulfate de magnésium ( • 7H20), 6 ppm de sulfate de manganèse et 0,1 % de silicone antimousse. La culture se poursuit à 28° C avec une aération de 0,8 WM pendant 72 heures. La viscosité finale du bouillon de culture était de 100000 cP. On dilue ce bouillon avec cinq fois son volume d'eau chaude et on chauffe le tout à 70-80° C. Les cellules du micro-organisme sont éliminées du milieu par filtration à travers un filtre en papier recouvert de terre de diatomées. 0.5% calcium carbonate, 0.1% magnesium sulphate (• 7H20), 6 ppm manganese sulphate and 0.1% anti-foam silicone. The culture continues at 28 ° C with aeration of 0.8 WM for 72 hours. The final viscosity of the culture broth was 100,000 cP. This broth is diluted with five times its volume of hot water and the whole is heated to 70-80 ° C. The cells of the microorganism are eliminated from the medium by filtration through a paper filter covered with diatomaceous earth.

401 de ce bouillon filtré sont soumis à une ultrafiltration (filtre UF-SWM-85V-1, module Abcor SWM-85V produit par Bioengineering Co. Ltd.) et purifiés jusqu'à un rapport V/Vo = 5 (rapport entre la quantité d'eau ajoutée et celle qui était présente dans le bouillon original), on concentre et lyophilise cette solution, ce qui donne 50 g de Polysaccharide en poudre (échantillon 18). 401 of this filtered broth are subjected to ultrafiltration (filter UF-SWM-85V-1, Abcor module SWM-85V produced by Bioengineering Co. Ltd.) and purified to a ratio V / Vo = 5 (ratio between the quantity of water added and that which was present in the original broth), this solution is concentrated and lyophilized, which gives 50 g of powdered Polysaccharide (sample 18).

Exemples 16 à 20 Examples 16 to 20

6 échantillons de 401 de bouillon de culture filtré sont formés à partir du bouillon de culture obtenu dans l'exemple 15. Chaque échantillon est dilué avec un volume égal d'eau et on le déminéralise en le faisant couler dans une colonne (de 5 cm de diamètre) contenant un mélange composé de 300 ml d'Amberlite 200 (forme H+) et de 600 ml d'Amberlite IRA-411 (forme OH-), cela à un débit SV = 3. 6 samples of 401 filtered culture broth are formed from the culture broth obtained in Example 15. Each sample is diluted with an equal volume of water and is demineralized by running it in a column (5 cm diameter) containing a mixture composed of 300 ml of Amberlite 200 (form H +) and 600 ml of Amberlite IRA-411 (form OH-), this at a flow rate SV = 3.

Un de ces échantillons devient l'échantillon 19 alors qu'on ajoute One of these samples becomes sample 19 while adding

à chacun des cinq autres 1 litre de solution aqueuse à 10% de NaCl, de KCl, de MgCl2, de CaCl2 et de NH4C1 respectivement. On laisse reposer tous les échantillons pendant une nuit et on les soumet à une ultrafiltration similaire à celle de l'exemple 1, ce qui permet d'obtenir 5 40-45 g des sels respectifs du Polysaccharide (échantillons 19 à 24). to each of the other five 1 liter of 10% aqueous solution of NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2 and NH4C1 respectively. All the samples are left to stand overnight and subjected to an ultrafiltration similar to that of Example 1, which gives 5 40-45 g of the respective salts of the Polysaccharide (samples 19 to 24).

Exemple 21 Example 21

On ajoute 1 litre de solution aqueuse à 10% de chlorure ferrique au bouillon de culture après son traitement par la résine échangeuse io d'ions, comme cela est décrit dans l'exemple 16. 1 liter of 10% aqueous solution of ferric chloride is added to the culture broth after its treatment with the ion exchange resin, as described in Example 16.

On laisse reposer une nuit le mélange obtenu en agitant occasionnellement. On recueille le précipité qui s'est formé, par centrifu-gation, on le lave deux fois avec de l'eau déminéralisée et on le sèche sous vide pour obtenir le sel ferrique du Polysaccharide (échantil-15 Ion 25). The mixture obtained is left to stand overnight, stirring occasionally. The precipitate which has formed is collected by centrifugation, washed twice with demineralized water and dried under vacuum to obtain the ferric salt of the Polysaccharide (sample-15 Ion 25).

Exemple 22 Example 22

On ajoute 1 litre de solution aqueuse à 10% de chlorure d'aluminium au bouillon de culture après son traitement par la résine 20 échangeuse d'ions, traitement décrit dans l'exemple 16. On ajuste le pH de la solution à 4,5. On laisse reposer une nuit le mélange résultant, en le brassant de temps en temps. Le précipité obtenu est traité de la même manière que dans l'exemple 21, ce qui donne le sel d'aluminium du Polysaccharide (échantillon 26). 1 liter of 10% aqueous solution of aluminum chloride is added to the culture broth after its treatment with the ion exchange resin, treatment described in Example 16. The pH of the solution is adjusted to 4.5 . The resulting mixture is left to stand overnight, stirring occasionally. The precipitate obtained is treated in the same manner as in Example 21, which gives the aluminum salt of the Polysaccharide (sample 26).

Tableau 5 Table 5

Ech. N° Ech. No.

Poids mol. x 104 Mol weight x 104

Equiv. totaux en cations Equiv. total in cations

Degré de subst. Degree of subst.

Na N / A

K K

Mg Mg

Ca autres That others

18 18

ultra ultra

89 89

5860 5860

13000 13000

3 720 3,720

2850 2850

filtration filtration

0,25 0.25

0,33 0.33

0,31 0.31

0,14 0.14

1,03 1.03

0,78 0.78

19 19

déminéra demineralized

59 59

660 660

85 85

250 250

1750 1750

lisation reading

0,03 0.03

0,002 0.002

0,02 0.02

0,09 0.09

0,14 0.14

0,10 0.10

20 20

substitué substituted

63 63

19500 19500

210 210

70 70

380 380

avec Na with Na

0,85 0.85

0,005 0.005

0,02 0.02

0,88 0.88

0,66 0.66

21 21

substitué substituted

54 54

1150 1150

23400 23400

70 70

280 280

avecK withK

0,05 0.05

0,60 0.60

0,005 0.005

0,01 0.01

0,67 0.67

0,50 0.50

22 22

substitué substituted

68 68

78 78

130 130

13700 13700

200 200

avec Mg with Mg

0,003 0.003

1,13 1.13

0,01 0.01

1,15 1.15

0,86 0.86

23 23

substitué substituted

— -

250 250

110 110

130 130

19500 19500

avec Ca with that

0,01 0.01

0,003 0.003

0,01 0.01

0,98 0.98

1,00 1.00

0,75 0.75

24 24

substitué substituted

70 70

1090 1090

75 75

32 32

280 280

2 2

M * M *

00 as o o 00 as o o

avec NH4 with NH4

0,05 0.05

0,002 0.002

0,01 0.01

1,03 1.03

1,09 1.09

0,82 0.82

25 25

substitué substituted

— -

93 93

120 120

50 50

75 75

Fe: 24300 Fe: 24300

avec Fe II with Fe II

0,004 0.004

0,003 0.003

0,004 0.004

1,30 1.30

1,32 1.32

0,99 0.99

26 26

substitué substituted

— -

25 25

70 70

3 3

25 25

Al: 11600 Al: 11600

avec Al with Al

0,001 0.001

0,002 0.002

— -

0,001 0.001

1,29 1.29

0,97 0.97

Le poids moléculaire, le contenu en cations, le nombre total d'éqi sont présentés dans ce tableau 5. The molecular weight, the cation content, the total number of eqi are presented in this table 5.

Expérience N" 1 Experience # 1

Sept groupes de cinq rats élevés jusqu'à quatre semaines ont été nourris pendant quatre jours avec des-régimes tests pour étudier l'influence du poids moléculaire du B.p. sur l'activité réductrice sur le taux de cholestérol. On établit sept groupes expérimentaux. Ils consistent en un groupe de contrôle recevant un régime sans cholestérol, un groupe de contrôle recevant un régime avec cholestérol et des groupes expérimentaux recevant un régime avec cholestérol et 5% de B.p. de chacun des échantillons 1 à 5 du tableau 1 respectivement. Seven groups of five rats reared for up to four weeks were fed for four days with test diets to study the influence of the molecular weight of B.p. on the reducing activity on the cholesterol level. Seven experimental groups are established. They consist of a control group receiving a diet without cholesterol, a control group receiving a diet with cholesterol and experimental groups receiving a diet with cholesterol and 5% B.p. of each of samples 1 to 5 of table 1 respectively.

ivalents de cations et le degré de substitution des exemples 18 à 26 cation equivalents and the degree of substitution of examples 18 to 26

La composition de chaque régime est donnée dans le tableau 6. Les rats ont été nourris librement avec le régime et avec de l'eau. A «o la fin de l'expérience, on ouvre l'abdomen des rats qui ont été préalablement anesthésiés à l'éther et on recueille du sang prélevé dans l'artère abdominale. Le foie est enlevé et pesé. Le sérum a été obtenu par centrifugation du sang. Le foie et le sérum sont congelés et mis de côté. Le taux de cholestérol dans le sérum a été déterminé par 65 l'appareil Déterminer TC fait par Kyowa Hakko Co. Ltd. On saponifie le foie et les matières non saponifiables sont séparées. Le taux de cholestérol des matières non saponifiables est mesuré par le même appareil. The composition of each diet is given in Table 6. The rats were fed freely with the diet and with water. At the end of the experiment, the abdomen of the rats which have been previously anesthetized with ether is opened and blood collected from the abdominal artery is collected. The liver is removed and weighed. The serum was obtained by centrifugation of the blood. The liver and serum are frozen and set aside. The serum cholesterol level was determined by 65 the Determine TC device made by Kyowa Hakko Co. Ltd. The liver is saponified and the non-saponifiable matter is separated. The cholesterol level of non saponifiable matter is measured by the same device.

7 7

659 085 659,085

Le taux de cholestérol des HDL est mesuré par l'appareil HDL- sterozyme fabriqué par Fuji Zoki Seiyaku Co. Ltd. Les résultats sont présentés dans le tableau 7. The HDL cholesterol level is measured by the HDL-sterozyme device manufactured by Fuji Zoki Seiyaku Co. Ltd. The results are presented in Table 7.

Tableau 6 Composition des régimes (% en poids) Table 6 Composition of the diets (% by weight)

Composition Composition

Régime de base Basic diet

Régime de contrôle Control regime

Régimes testés4 Schemes tested4

Caséine Casein

22 22

Mélange de sels1 Mixture of salts1

4 4

Mélange de vitamines2 (solubles dans l'eau) Mixture of vitamins2 (water soluble)

0,85 0.85

Huile de soja3 (contenant les vitamines liposolubles) Soybean oil3 (containing fat-soluble vitamins)

1 1

Choline Choline

0,15 0.15

Lard Bacon

10 10

Cholestérol Cholesterol

0 0

0,5 0.5

Sel de sodium de l'acide cholique Cholic acid sodium salt

0 0

0,25 0.25

B.p. B.p.

0 0

5(3) 5 (3)

Sucrose Sucrose

62 62

61,25 61.25

56,25 (58,25) 56.25 (58.25)

Total Total

100 100

1 Mélange de sels de Harper. 1 Mixture of Harper's salts.

2 Mélange de vitamines de Harper. 2 Mixture of Harper's vitamins.

3 Contenant de la vitamine A (3000 UI), de la vitamine D (300 UI) et de la vitamine E (100 mg/kg de régime). 3 Containing vitamin A (3000 IU), vitamin D (300 IU) and vitamin E (100 mg / kg diet).

4 Les valeurs entre parenthèses correspondent à l'addition de 3% de B.p. au régime. 4 The values in parentheses correspond to the addition of 3% B.p. on a diet.

Mélange de sels de Harper: Mixture of Harper's salts:

CaC03: 29,29; CaHP04-2H20: 0,43; KH2P04: 34,31; NaCl: 25,06; MgS04-7H20: 9,98 et d'autres. CaCO3: 29.29; CaHPO4-2H20: 0.43; KH2PO4: 34.31; NaCl: 25.06; MgS04-7H20: 9.98 and others.

Tableau 7 Table 7

Groupes de régime Diet groups

Taux de cholestérol (mg/dl) Cholesterol level (mg / dl)

Indice athérogène Atherogenic index

Taux de cholestérol accumulé Accumulated cholesterol level

sérum serum

HDL HDL

foie (mg/g) liver (mg / g)

dans le foie1 in the liver1

Régime de base Basic diet

91 ±16 91 ± 16

59,6± 16,0 59.6 ± 16.0

3,7± 1,2 3.7 ± 1.2

0,6 ±0,4 0.6 ± 0.4

— -

Régime de contrôle Control regime

291 + 53 291 + 53

31,6±7,0 31.6 ± 7.0

22,2 ±0,6 22.2 ± 0.6

8,2 + 2,0 8.2 + 2.0

50,4 ±4,7 50.4 ± 4.7

Régimes testés 5% de B.p. échant. 1 Diets tested 5% of B.P. samples 1

116+16 116 + 16

39,5 ±4,8 39.5 ± 4.8

7,6± 1,1 7.6 ± 1.1

1,9 + 0,3 1.9 + 0.3

14,2± 1,7 14.2 ± 1.7

5% de B.p. échant. 2 5% of P.O. samples 2

129+40 129 + 40

38,9 + 8,4 38.9 + 8.4

10,2+1,9 10.2 + 1.9

2,4 ±1,0 2.4 ± 1.0

16,6 ±6,4 16.6 ± 6.4

5% de B.p. échant. 3 5% of P.O. samples 3

165±41 165 ± 41

34,5 ±4,7 34.5 ± 4.7

9,6 ±2,5 9.6 ± 2.5

3,8 ± 1,2 3.8 ± 1.2

15,9 ±4,7 15.9 ± 4.7

5% de B.p. échant. 4 5% of P.O. samples 4

190±37 190 ± 37

40,1 ±9,7 40.1 ± 9.7

12,9±0,9 12.9 ± 0.9

4,2 ±2,6 4.2 ± 2.6

20,6 ±6,0 20.6 ± 6.0

5% de B.p. échant. 5 5% of P.O. samples 5

243 ±35 243 ± 35

30,5±4,8 30.5 ± 4.8

20,6 ±1,7 20.6 ± 1.7

7,0±2,0 7.0 ± 2.0

35,4 ± 5,3 35.4 ± 5.3

cholestérol dans le foie cholestérol dans le foie du groupe de contrôle ou — du groupe de régime j des groupes tests de base prise de cholestérol cholesterol in the liver cholesterol in the liver of the control group or - of the diet group j of the basic test groups cholesterol intake

Comme on le voit clairement dans le tableau 7, les B.p. qui ont un poids moléculaire supérieur à 200000 (échantillons 1-4) présentent l'activité remarquable de faire baisser le taux de cholestérol dans le sérum et dans le foie. As can be clearly seen in Table 7, the B.p. which have a molecular weight greater than 200,000 (samples 1-4) exhibit the remarkable activity of lowering the cholesterol level in serum and in the liver.

100 100

La couleur du foie des rats nourris avec le régime de base était « brun-rouge et celle du foie des rats nourris avec le régime de contrôle était brun-jaune. The liver color of rats fed the basic diet was "red-brown and the liver of rats fed the control diet was yellow-brown.

De l'autre côté, la couleur du foie des rats nourris avec les B.p. des échantillons 1 à 4 était aussi brun-rouge, ce qui indique des foies On the other hand, the liver color of rats fed B.p. samples 1 to 4 was also reddish brown, which indicates livers

659 085 659,085

8 8

sains. Les foies des rats nourris avec le régime contenant l'échantillon 5 étaient aussi brun-jaune, comme ceux du groupe de contrôle. Cela est caractéristique de foies graisseux. healthy. The livers of rats fed the diet containing sample 5 were also brown-yellow, like those of the control group. This is characteristic of fatty livers.

Expérience N" 2 Experience # 2

L'essai a été effectué sur des rats nourris avec les échantillons 6 à The test was carried out on rats fed with samples 6 to

8 décrits dans le tableau 2 pour prouver l'activité réductrice du produit sur le taux de cholestérol. On établit 8 groupes recevant des régimes différents. La composition du régime de base et la manière de nourrir les rats étaient semblables à celles de l'expérience 1. 8 described in Table 2 to prove the reducing activity of the product on the cholesterol level. 8 groups are established receiving different diets. The composition of the basic diet and the manner of feeding the rats were similar to that of Experiment 1.

Les résultats sont reportés au tableau 8. The results are reported in Table 8.

Tableau 8 Table 8

Régimes Diets

Taux de cholestérol (mg/dl) Cholesterol level (mg / dl)

Index athérogène Atherogenic index

Taux d'accumulation du cholestérol dans la foie Cholesterol accumulation rate in the liver

sérum serum

HDL HDL

foie (mg/g) liver (mg / g)

Régime de base Basic diet

96 ±13 96 ± 13

61,8+4,5 61.8 + 4.5

2,9 ±0,2 2.9 ± 0.2

0,6 ±0,2 0.6 ± 0.2

— -

Régime de contrôle Control regime

323 ±19 323 ± 19

36,3±1,2 36.3 ± 1.2

22,4+1,0 22.4 + 1.0

8,3 ±0,4 8.3 ± 0.4

52,4+3,8 52.4 + 3.8

Régimes testés 3% de B.p. échant. 6 Diets tested 3% of B.P. samples 6

213 ±11 213 ± 11

32,1 ±1,5 32.1 ± 1.5

11,9±0,6 11.9 ± 0.6

5,7 ±0,5 5.7 ± 0.5

19,8+2,5 19.8 + 2.5

5% de B.p. échant. 6 5% of P.O. samples 6

150± 11 150 ± 11

39,7±2,1 39.7 ± 2.1

9,5±0,5 9.5 ± 0.5

2,9 ±0,5 2.9 ± 0.5

14,6 ±1,4 14.6 ± 1.4

3% de B.p. échant. 7 3% of P.O. samples 7

138 + 11 138 + 11

34,9 ±1,2 34.9 ± 1.2

7,9 ±0,5 7.9 ± 0.5

3,0 ±0,3 3.0 ± 0.3

9,9 ± 1,1 9.9 ± 1.1

5% de B.p. échant. 7 5% of P.O. samples 7

90±3 90 ± 3

45,0 ±2,4 45.0 ± 2.4

5,4 ±0,6 5.4 ± 0.6

1,0±0,1 1.0 ± 0.1

3,8 ±1,3 3.8 ± 1.3

3% de B.p. échant. 8 3% of P.O. samples 8

201 ±8 201 ± 8

35,8 ±2,2 35.8 ± 2.2

11,3±0,8 11.3 ± 0.8

4,5 ±0,3 4.5 ± 0.3

18,8±2,0 18.8 ± 2.0

5% de B.p. échant. 8 5% of P.O. samples 8

155 ± 14 155 ± 14

37,1 ±1,9 37.1 ± 1.9

9,6±0,3 9.6 ± 0.3

3,0 + 0,5 3.0 + 0.5

14,7 ±1,5 14.7 ± 1.5

Comme cela ressort clairement du tableau 8, le B.p. de cette invention présente l'activité remarquable de réduire l'élévation du taux de cholestérol dans le sérum et dans le foie et de diminuer l'index athérogène lorsqu'on ajoute 3 à 5% de ce B.p. au régime. Cette activité se manifeste spécialement bien avec le B.p. qui a été traité par ultrafiltration (échantillon 7). L'échantillon 8 qui a le poids moléculaire le plus grand (1360 000) présente pratiquement la même activité que l'échantillon 6 qui a un poids moléculaire de 1 040 000. Il semble se révéler que l'activité du B.p. n'augmente plus à partir d'un poids moléculaire d'environ 1000 000. Les foies des rats nourris avec les échantillons produits selon cette invention sont brun-rouge, 30 comme ceux des rats recevant le régime de base. As is clear from Table 8, the B.p. of this invention exhibits the remarkable activity of reducing the rise in cholesterol levels in serum and in the liver and of decreasing the atherogenic index when 3 to 5% of this B.p. on a diet. This activity manifests itself especially well with the B.p. which was treated by ultrafiltration (sample 7). Sample 8, which has the largest molecular weight (1,360,000), exhibits practically the same activity as Sample 6, which has a molecular weight of 1,040,000. It seems to appear that the activity of B.p. no longer increases from a molecular weight of about 1,000,000. The livers of rats fed with the samples produced according to this invention are reddish brown, like those of rats fed the basic diet.

Expérience N° 5 Experiment N ° 5

On a effectué un test sur des animaux avec les échantillons décrits dans le tableau 3 pour démontrer la relation qui existe entre 35 le degré de substitution et l'activité réductrice sur le taux de cholestérol. On ajoute au régime 5% de chaque échantillon respectif. Le déroulement de l'expérience était similaire à celui de l'expérience 1. Les résultats sont reportés dans le tableau 9. An animal test was carried out with the samples described in Table 3 to demonstrate the relationship between the degree of substitution and the reducing activity on cholesterol levels. 5% of each respective sample is added to the diet. The course of the experiment was similar to that of experiment 1. The results are reported in Table 9.

Tableau 9 Table 9

Régimes Diets

Taux de cholestérol (mg/dl) Cholesterol level (mg / dl)

Index athérogène Atherogenic index

Taux d'accumulation du cholestérol dans le foie Cholesterol accumulation rate in the liver

sérum serum

HDL HDL

foie (mg/g) liver (mg / g)

Régime de base Basic diet

88 + 5 88 + 5

50,9 ±4,2 50.9 ± 4.2

3,2±0,3 3.2 ± 0.3

0,7 ±0,1 0.7 ± 0.1

— -

Régime de contrôle Control regime

251 ±26 251 ± 26

28,9 ±2,7 28.9 ± 2.7

20,6 ±0,5 20.6 ± 0.5

8,2 ±1,8 8.2 ± 1.8

49,8 ±2,2 49.8 ± 2.2

Régimes testés 5% de B.p. échant. 9 Diets tested 5% of B.P. samples 9

106 ±6 106 ± 6

49,9 ±6,0 49.9 ± 6.0

7,7±1,1 7.7 ± 1.1

1,3 + 0,3 1.3 + 0.3

8,6 + 2,9 8.6 + 2.9

5% de B.p. échant. 10 5% of P.O. samples 10

116 ± 16 116 ± 16

41,0±6,1 41.0 ± 6.1

7,4±1,4 7.4 ± 1.4

2,2 ±0,7 2.2 ± 0.7

7,8 ±4,2 7.8 ± 4.2

5% de B.p. échant. 11 5% of P.O. samples 11

291 ±47 291 ± 47

31,5±3,2 31.5 ± 3.2

23,4 ±0,5 23.4 ± 0.5

8,4 ±1,3 8.4 ± 1.3

51,4± 1,8 51.4 ± 1.8

5% de B.p. échant. 12 5% of P.O. samples 12

105 ±11 105 ± 11

32,0 ±4,2 32.0 ± 4.2

8,3±1,6 8.3 ± 1.6

2,3 ±0,7 2.3 ± 0.7

7,5±3,1 7.5 ± 3.1

5% de B.p. échant. 13 5% of P.O. samples 13

154±21 154 ± 21

28,1 ±2,7 28.1 ± 2.7

9,8 ±1,6 9.8 ± 1.6

4,8 ±1,1 4.8 ± 1.1

12,9 ±4,0 12.9 ± 4.0

Comme on le voit clairement dans le tableau 9, les échantillons 9, 10,12 et 13, qui ont chacun un degré de substitution supérieur à 0,2, soit de 0,73, 0,84, 0,47 et 0,25 respectivement, possèdent cette activité remarquable de faire baisser le taux de cholestérol du sérum et dans le foie. As can be clearly seen in Table 9, samples 9, 10, 12 and 13, which each have a degree of substitution greater than 0.2, ie 0.73, 0.84, 0.47 and 0.25 respectively, have this remarkable activity of lowering cholesterol levels in serum and in the liver.

Le B.p. de l'échantillon 11, qui a un degré de substitution de 0,039, a un effet comparable à celui du régime de contrôle. The B.p. of sample 11, which has a degree of substitution of 0.039, has an effect comparable to that of the control system.

Les échantillons 12 et 13, auxquels on a ajouté les sels après la déminéralisation, possèdent une bonne activité, qui est comparable à celle des échantillons 9 et 10. La présence d'un cation combiné au Samples 12 and 13, to which the salts were added after demineralization, have good activity, which is comparable to that of samples 9 and 10. The presence of a cation combined with

B.p. est essentielle à l'existence de cette activité réductrice du taux de cholestérol. Le fait de simplement mélanger le cation avec le B.p. ne permet pas d'obtenir une telle activité, comme cela est démontré dans le tableau 6 où l'on a mélangé 4% de mélange de sels de Harper aux régimes de base. L'échantillon 11 ne présente aucune activité spéciale. B.p. is essential for the existence of this cholesterol-lowering activity. Simply mixing the cation with the B.p. does not allow to obtain such an activity, as is shown in Table 6 where 4% of Harper's salt mixture was mixed with the basic regimes. Sample 11 shows no special activity.

65 L'observation des foies des animaux testés révèle que ceux qui ont été nourris avec le régime de base et avec les régimes contenant le B.p. de cette invention ont un foie rouge-brun, tandis que ceux qui ont été nourris avec le régime de contrôle ont un foie brun-jaune. La 65 Observation of the livers of the animals tested reveals that those who were fed the basic diet and with the diets containing B.p. of this invention have a red-brown liver, while those who were fed the control diet have a brown-yellow liver. The

60 60

9 9

659 085 659,085

différence de couleur entre les foies des rats nourris avec les régimes contenant le B.p. de cette invention et ceux des rats nourris avec le régime de contrôle était notable, comme on l'a déjà fait remarquer dans les expériences 1 et 2. color difference between the livers of rats fed diets containing B.p. of this invention and those of rats fed the control diet was notable, as already noted in Experiments 1 and 2.

Expérience 4 Experiment 4

Ces essais ont été effectués sur des rats nourris avec les échantillons 14 à 17 décrits dans le tableau 4 et qui ont été préparés dans les These tests were carried out on rats fed with samples 14 to 17 described in Table 4 and which were prepared in the

Comme on le voit clairement dans le tableau 10, les échantillons 14, 15 et 16 sont supérieurs au contrôle et l'échantillon 17, qui a un degré de substitution de 0,16, a une activité réduite. L'échantillon 16, qui a un degré de substitution de 0,95, a été préparé par l'addition de sels au B.p. déminéralisé, suivie d'une ultrafiltration, et il présente une activité comparable à celle de l'échantillon 15 qui présente un degré de substitution de 0,95 et qui a été préparé par ultrafiltration mais sans déminéralisation. L'activité réductrice sur le taux de cholestérol est pleinement restaurée par l'addition de sels. As can be clearly seen in Table 10, samples 14, 15 and 16 are superior to the control and sample 17, which has a degree of substitution of 0.16, has reduced activity. Sample 16, which has a degree of substitution of 0.95, was prepared by the addition of salts to the B.p. demineralized, followed by ultrafiltration, and it has an activity comparable to that of sample 15 which has a degree of substitution of 0.95 and which was prepared by ultrafiltration but without demineralization. The reducing activity on the cholesterol level is fully restored by the addition of salts.

La couleur et l'apparence des foies des rats nourris avec les régimes contenant le B.p. de cette invention étaient bien meilleures exemples 12 à 14 et dans l'échantillon de contrôle N° 3. On forme 10 groupes de régimes qui comprennent le groupe recevant le régime de base, le groupe recevant le régime de contrôle et le groupe où chacun des animaux reçoit l'un des 8 régimes testés (avec cholestérol 5 et l'un des échantillons 14 à 17 du tableau 4 à des concentrations de 3 et de 5% respectivement). La composition du régime de base et la procédure du test étaient semblables à celles de l'expérience 1. The color and appearance of the livers of rats fed diets containing B.p. of this invention were much better examples 12-14 and in control sample # 3. 10 diet groups were formed which included the group receiving the basic diet, the group receiving the control diet and the group where each of the animals received one of the 8 diets tested (with cholesterol 5 and one of samples 14 to 17 in table 4 at concentrations of 3 and 5% respectively). The composition of the basic diet and the test procedure were similar to that of Experiment 1.

Les résultats sont reportés dans le tableau 10. The results are reported in Table 10.

que celles des foies du groupe de contrôle, comme on l'a mentionné pour les expériences précédentes 1 et 3. than those of the livers of the control group, as was mentioned for the previous experiments 1 and 3.

Expérience 5 Experiment 5

Ces essais ont été effectués avec les échantillons 18 à 25 (tableau 5) obtenus lors des préparations des exemples 15 à 22, pour démontrer l'activité des sels de B.p. obtenus avec divers cations. These tests were carried out with samples 18 to 25 (Table 5) obtained during the preparations of Examples 15 to 22, to demonstrate the activity of the salts of B.p. obtained with various cations.

La quantité de sel de B.p. qui a été ajoutée au régime est de 4%. L'expérience est effectuée de la même manière que l'expérience N° 1. The amount of B.p. that was added to the diet is 4%. The experiment is carried out in the same way as experiment N ° 1.

Les résultats sont reportés dans le tableau 11. The results are reported in Table 11.

Tableau 10 Table 10

Régimes Diets

Taux de cholestérol Cholesterol level

Index Index

Taux d'accumulation de sérum (mg/dl) Serum accumulation rate (mg / dl)

HDL (mg/g) HDL (mg / g)

foie (mg/g) liver (mg / g)

athérogène cholestérol dans le foie atherogenic cholesterol in the liver

Régime de base Basic diet

96± 13 96 ± 13

61,8±4,5 61.8 ± 4.5

2,9 ±0,2 2.9 ± 0.2

0,6 ±0,2 0.6 ± 0.2

— -

Régime de contrôle Control regime

323+19 323 + 19

36,3 ±1,2 36.3 ± 1.2

22,4 ±1,0 22.4 ± 1.0

8,3 ±0,4 8.3 ± 0.4

52,4 ±3,8 52.4 ± 3.8

Régimes testés 3% de B.p. échant. 14 Diets tested 3% of B.P. samples 14

213 + 11 213 + 11

32,1 ±1,5 32.1 ± 1.5

11,9 ±0,6 11.9 ± 0.6

5,7 ±0,5 5.7 ± 0.5

19,8 ± 2,5 19.8 ± 2.5

. 5% de B.p. échant. 14 . 5% of P.O. samples 14

150+11 150 + 11

39,7 ±2,1 39.7 ± 2.1

9,5±0,5 9.5 ± 0.5

2,9 ±0,5 2.9 ± 0.5

14,6 ± 1,4 14.6 ± 1.4

3% de B.p. échant. 15 3% of P.O. samples 15

138 ±11 138 ± 11

34,9 ±1,2 34.9 ± 1.2

7,9 ±0,5 7.9 ± 0.5

3,0 ±0,3 3.0 ± 0.3

9,9+1,1 9.9 + 1.1

5% de B.p. échant. 15 5% of P.O. samples 15

90 + 3 90 + 3

45,0 ±2,4 45.0 ± 2.4

5,4 ±0,6 5.4 ± 0.6

1,0 ± 0,1 1.0 ± 0.1

3,8± 1,3 3.8 ± 1.3

3% de B.p. échant. 16 3% of P.O. samples 16

127 + 16 127 + 16

42,2 ±1,0 42.2 ± 1.0

6,6 ±0,4 6.6 ± 0.4

2,0 ±0,4 2.0 ± 0.4

6,5+1,1 6.5 + 1.1

5% de B.p. échant. 16 5% of P.O. samples 16

91 + 8 91 + 8

45,1 ±4,3 45.1 ± 4.3

5,3 ±0,4 5.3 ± 0.4

1,1 ±0,3 1.1 ± 0.3

2,5± 1,2 2.5 ± 1.2

3% de B.p. échant. 17 3% of P.O. samples 17

251 ±17 251 ± 17

33,9± 1,2 33.9 ± 1.2

15,6 ±1,5 15.6 ± 1.5

6,4 ±0,4 6.4 ± 0.4

31,3 ±3,4 31.3 ± 3.4

5% de B.p. échant. 17 5% of P.O. samples 17

227 ±12 227 ± 12

32,4 ±1,6 32.4 ± 1.6

15,5 ± 1,3 15.5 ± 1.3

6,1 ±0,4 6.1 ± 0.4

29,1 ±3,2 29.1 ± 3.2

35 35

40 40

Tableau 11 Table 11

Régimes Diets

Taux de cholestérol Cholesterol level

Index Index

Taux d'accumulation de sérum (mg/dl) Serum accumulation rate (mg / dl)

HDL (mg/g) HDL (mg / g)

foie (mg/g) liver (mg / g)

athérogène cholestérol dans le foie atherogenic cholesterol in the liver

Régime de base Basic diet

92 ±14 92 ± 14

43,3 ±7,3 43.3 ± 7.3

2,5 ± 0,3 2.5 ± 0.3

1,2±0,5 1.2 ± 0.5

— -

Régime de contrôle Control regime

284±31 284 ± 31

31,8±5,4 31.8 ± 5.4

17,7 + 0,6 17.7 + 0.6

8,1 ±1,8 8.1 ± 1.8

44,1 ±3,1 44.1 ± 3.1

Régimes testés B.p. ultrafiltré de l'échant. 18 Schemes tested B.p. ultrafiltered from the sample. 18

114+16 114 + 16

39,1 ±13,9 39.1 ± 13.9

7,3 ±1,1 7.3 ± 1.1

1,9 ±0,3 1.9 ± 0.3

12,2 ±2,4 12.2 ± 2.4

Sel de Na échant. 19 Na salt sam. 19

106 ±13 106 ± 13

34,6 ±6,5 34.6 ± 6.5

7,8 ±1,0 7.8 ± 1.0

1,8 ±0,6 1.8 ± 0.6

12,8±3,7 12.8 ± 3.7

Sel de K échant. 20 K sample salt 20

92 ±25 92 ± 25

40,7 ±12,7 40.7 ± 12.7

6,5 ±2,2 6.5 ± 2.2

1,6 ± 1,4 1.6 ± 1.4

8,5 ±5,3 8.5 ± 5.3

Sel de Mg échant. 21 Mg salt sam. 21

88 ±35 88 ± 35

50,3 ±13,2 50.3 ± 13.2

6,2 ±1,8 6.2 ± 1.8

1,1 ± 1,7 1.1 ± 1.7

7,7 + 5,0 7.7 + 5.0

Sel de Ca échant. 22 Ca salt sam. 22

85 ±24 85 ± 24

47,8 ±11,7 47.8 ± 11.7

5,8 ±1,6 5.8 ± 1.6

0,9 ±0,9 0.9 ± 0.9

6,1 ±3,9 6.1 ± 3.9

Sel de NH4 échant. 23 NH4 salt sample 23

72± 17 72 ± 17

46,9+4,9 46.9 + 4.9

4,6 ±1,8 4.6 ± 1.8

0,5 ±0,2 0.5 ± 0.2

3,9 ±5,0 3.9 ± 5.0

Sel de Fe échant. 24 Fe salt sam. 24

102± 17 102 ± 17

37,0±6,1 37.0 ± 6.1

7,7 ±1,3 7.7 ± 1.3

1,8 ± 0,7 1.8 ± 0.7

12,1 ±3,3 12.1 ± 3.3

Sel de Al échant. 25 Al salt sam. 25

110+17 110 + 17

42,5+17,0 42.5 + 17.0

6,5+1,9 6.5 + 1.9

1,9 ± 1,1 1.9 ± 1.1

8,6 + 5,6 8.6 + 5.6

659 085 659,085

10 10

Comme on le voit dans le tableau 11, les régimes contenant les sels de B.p. avec différents cations possèdent l'activité remarquable de faire baisser le taux de cholestérol dans le sérum et dans le foie, l'index athérogène et le taux de cholestérol accumulé dans le foie, si on les compare avec ceux du groupe de contrôle. Cela indique que s les sels des différents cations combinés au B.p. possèdent une forte activité réductrice sur le taux de cholestérol. As seen in Table 11, the diets containing B.p. with different cations have the remarkable activity of lowering the level of cholesterol in serum and in the liver, the atherogenic index and the level of cholesterol accumulated in the liver, if we compare them with those of the control group. This indicates that if the salts of the different cations combined with B.p. have a strong reducing activity on cholesterol levels.

Les sels d'ammonium, de calcium et de magnésium du B.p. présentent une activité spécialement élevée sur l'index athérogène, celui-ci étant étroitement lié à l'apparition de symptômes dus à l'artériosclérose. L'index observé est égal ou inférieur à celui du groupe recevant le régime de base. The ammonium, calcium and magnesium salts of B.p. have a particularly high activity on the atherogenic index, which is closely linked to the appearance of symptoms due to arteriosclerosis. The observed index is equal to or lower than that of the group receiving the basic diet.

L'observation des foies des rats nourris avec les sels de B.p. de cette invention révèle que leur couleur et leur apparence sont bien meilleures que celles des foies des rats nourris avec le régime de contrôle. Observation of the livers of rats fed with B.p. of this invention reveals that their color and appearance are much better than that of the livers of rats fed the control diet.

R R

Claims

659,085

1. Process for the synthesis of a Polysaccharide having a molecular weight greater than 200,000 and a reducing activity on the cholesterol level of serum and in the liver and on the atherogenic index, process consisting in carrying out the culture of Bacillus polymyxa N ° 271 FERM-P 1824 in an aqueous culture medium containing assimilable sac-charides until said Polysaccharide accumulates in said medium, then in separating said Polysaccharide from said medium.

2. Method according to claim 1, characterized in that said Bacillus polymyxa No. 271 FERM-P 1824 is cultured in said medium for more than 20 hours.

2

3. Method according to claim 1, characterized in that said Polysaccharide accumulated in said medium is subjected to ul-trafiltration before being collected.

4. Process for the synthesis of a cationic salt of the Polysaccharide having a molecular weight greater than 200,000 and a degree of substitution by the cation of more than 0.2 and a reducing activity on the cholesterol level of the serum and in the liver and on the atherogenic index, process consisting in carrying out the culture of Bacillus polymyxa N ° 271 FERM-P 1824 in an aqueous culture medium containing assimilable saccharides and a cation, until the cationic salt of the Polysaccharide accumulates in said medium, then in separating said cationic salt from said medium.

5. Method according to claim 4, characterized in that said cation is a member of the group of alkali metals, alkaline earth metals or transition metals or that it is a manganese, aluminum, zinc ion , copper or ammonium ion.

6. Method according to claim 4, characterized in that said culture medium contains a quantity of cationic equivalents of at least 0.005 Eq. per liter of medium and that Bacillus polymyxa No. 271 FERM-P 1824 is cultivated in said medium at a pH greater than 4.5.

7. Method according to claim 4, characterized in that said salts are added to the culture broth before recovering said polysaccharide salt.

8. Method according to claim 4, characterized in that the said polysaccharide salt which has accumulated is subjected to ultra-filtration before its separation from the medium.

9. Method according to claim 4, characterized in that the said polysaccharide salt which has accumulated is separated from the medium by the addition of alcohol which causes its precipitation.