**ATTENTION** debut du champ DESC peut contenir fin de CLMS **.
REVENDICATIONS
1. Procédé de dosage des coenzymes NADll, NADPH, NAD+ et NADP+, caractérisé en ce qu'on utilise un système amplificateur comprenant, outre le coenzyme NAD(P)(H) à doser, une déshydrogénase E, et son substrat Si, ladite déshydrogénase E, étant capable de réduire NAD(P)+, un complexe ferrique Fe3+ (complexant) et un transmetteur d'électrons T capable de permettre l'oxydation du
NAD(P) H par le Fe2+ complexé.
2. Procédé de dosage selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on mesure par spectrophotométrie la concentration en Fe2+ (complexant) formé.
3. Procédé de dosage selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il fait intervenir les réactions suivantes: (4) NAD(P)+ + S,
EMI1.1
NAD(P)H + P, + H+ (5) NAD(P)H + 2Fe3+ (complexant)
(complexant) + H+
EMI1.2
NAD(P)+ + 2Fe2+ dans lesquelles E" S, et T sont définis comme indiqué précédemment et Pl représente le produit de la réaction (4).
4. Système amplificateur pour la mise en oeuvre du procédé de dosage des coenzymes NADH, NADPH, NAD+ et NADP+ selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend, outre le coenzyme NAD(P)(H) à doser, une déshydrogénase E, et son substrat S,, ladite déshydrogénase E, étant capable de réduire NAD(P)+, un complexe ferrique Fe3+(complexant) et un transmetteur d'électrons
T capable de permettre l'oxydation du NAD(P) H par le Fe3+ complexé.
5. Système selon la revendication 4, caractérisé en ce que le transmetteur d'électrons est le N-méthylphénazonium méthosulfate, le méthoxy-l N-méthylphénazonium méthosulfate ou un autre dérivé de substitution du N-méthyl phénazonium méthosulfate.
6. Système selon la revendication 4, caractérisé en ce que le transmetteur d'électrons est une enzyme telle que la diaphorase, la
NAD+ peroxydase (E.C. 1.11.1.1) ou la peroxydase (E.C. 1.11.1.7).
7. Système selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que-le complexant du Fe3+ est le disulfonate sodique de la bathophénantroline, ou le sel disodique de l'acide (pyridyl-2)3-p,p-dibenzène sulfonique-5,6-triazine- 1,2,4.
8. Système selon l'une des revendications 4 à 7, caractérisé en ce qu'à titre de déshydrogénase E, il comprend la glucose-6-phosphate déshydrogénase de Leuconostoc mesenteroides (E.C. 1.1.1.49) et à titre de substrat S, le glucose-6-phosphate.
9. Système amplificateur selon l'une des revendications 4 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend un tampon permettant de mettre en oeuvre le cycle amplificateur à un pH situé dans une zone telle que les enzymes soient suffisamment actives et que le Fe2+ (complexant) soit coloré,
10. Application du procédé selon la revendication 1 au dosage en particulier immunochimique en phase hétérogène de substances Z choisies parmi des haptènes ou des protéines, selon laquelle la substance à doser, Z, est mise en compétition avec un marqueur, constitué par Z lié covalentiellement à NAD(P)(H), vis-à-vis d'une substance possédant une forte affinité pour Z, cette substance étant fixée sur un support solide, la quantité de marqueur Z-NAD(P)(H) lié à cette substance dépendant inversement de la quantité de Z à doser et étant mesurée,
après séparation à l'aide du système amplificateur utilisé pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1.
La présente invention concerne un procédé de dosage de microquantités de NADH, NADPH, NAD+ et NADP+, I'application de ce procédé à des dosages immunochimiques ainsi qu'un système amplificateur destiné à la mise en oeuvre dudit procédé.
Au sens de la présente description, et ainsi qu'il est communément admis dans la littérature technique, la notation NAD(P)+ désigne NAD+ ou NADP+ et la notation NAD(P) H désigne
NADH ou NADPH. De plus, la notation abrégée NAD(P)(H) peut désigner l'une quelconque des coenzymes NAD+, NADP+, NADH ou NADPH.
Des systèmes amplificateurs des coenzymes, tels que le nicotinamide adénine dinucléotide, NAD(H), et le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate, NADP(H), sont déjà connus, ainsi que leur application dans le dosage de faibles quantités de ces coenzymes, notamment d'après Lowry O.H. et al., J. Biol. Chem. 236(10), 2746-55 (1961).
De tels systèmes sont basés sur un cycle enzymatique que l'on peut schématiser comme suit: Sol + NAD(P)+
EMI1.3
P1 + NAD(P)H + H+ (1) S2+ NAD(P)H + H+
EMI1.4
P2 + NAD(P)+ (2) où Si et Sî sont les substrats respectivement des enzymes E1 et E2, et Pl et P2 les produits des réactions enzymatiques dont l'un ou l'autre sera dosé ultérieurement par une réaction dite indicatrice .
De petites quantités de NAD(P)(H) permettent l'enclenchement du cycle, pour autant que les concentrations en enzymes E1 et E2 et celles en substrats Si et Sî soient convenablement choisies. L'arrêt des réactions du cycle amplificateur est donc nécessaire avant de procéder au dosage de l'un des produits de l'amplification.
La réaction indicatrice est le plus souvent enzymatique: Pl (out2) + NAD(P)+
EMI1.5
X1 (ou X2) + NAD(P)H + H+ (3)
Dans le schéma (3) ci-dessus, E3 désigne une déshydrogènase, et
X1 (ou X2) est le produit de cette réaction.
Le NAD(P)H formé peut être mesuré soit par fluorimétrie, soit par spectrophotométrie. Dans les méthodes précédemment décrites, il est donc nécessaire de procéder à l'arrêt des réactions du cycle amplificateur, avant d'effectuer le dosage de P1 ou P2.
L'invention se rapporte à un nouveau cycre amplificateur qui permet le dosage de l'un des produits de l'amplification, directement dans le milieu du cycle, et son utilisation présente ainsi un avantage important de mise en oeuvre par rapport à la technique antérieure.
Les deux phases, auparavant distinctes, d'amplification et de révélation sont maintenant réalisées en une seule opération.
Le système amplificateur selon l'invention comprend, outre le coenzyme NAD(P)(H) à doser, une déshydrogénase E1 et son substrat S,, ladite déshydrogénase El étant capable de réduire NAD(P)+, un complexe ferrique Fe3+ (complexant), et un transmetteur d'électrons T capable de permettre l'oxydation du NAD(P) H par le Fe3+ complexé.
Les réactions mises en oeuvre dans le cycle amplificateur sont les suivantes:
Dans la présente description, et notamment dans les schémas réactionnels (4) et (5), la notation Fe3+ (complexant) désigne un complexe ferrique et la notation Fe2+ (complexant) désigne le complexe ferreux correspondant.
Dans ce système, pour autant que les concentrations en Si, Fe3+ (complexant), E, et T soient convenablement choisies, une très faible quantité de NAD(P)(H) permet au cycle de fonctionner. La quantité de Fe2+ (complexant) qui se forme est proportionnelle à la quantité de NAD(P)(H) mise en oeuvre.
L'enzyme El permet la réduction de NAD(P)+ en NAD(P)H.
On utilise une déshydrogénase dont la réaction est favorisée thermo
NAD(P)+ + S,
EMI1.6
NAD(P)H+H++P1 (4)
NAD(P)H + 2 Fe3+ (complexant)
EMI1.7
NAD(P)+ + H+ + 2 Fe2+
(complexant) (5)
dynamiquement dans le sens NAD(P)+ vers NAD(P)H; telle la glucose-6-phosphate déshydrogénase de Leuconostoc mesenteroides, qui réduit irréversiblement NAD(P)+ en NAD(P)H en présence de glucose-6-phosphate pour former du 6-phosphogluconate. D'autres déshydrogénases peuvent cependant convenir.
La seconde réaction réoxyde NAD(P)H en NAD(P)+ à l'aide du
Fe3+ (complexant) comme oxydant et d'un transmetteur d'électrons,
T. Sans ce transmetteur, I'oxydation du NAD(P)H par le Fe3+ (complexant) est impossible. De manière à pouvoir mesurer le Fe2+ au fur et à mesure de son apparition dans le cycle, on travaille en présence d'un complexant du fer, fortement coloré avec le Fe2+ et pratiquement incolore avec le Fe3+. Ce complexant permet également le maintien en solution du Fe3+ et du Fe2+, insolubles aux pH utilisés. Dès lors, le couple d'oxydoréduction n'est plus Fe3+/Fe2+, mais Fe3+ (complexant)/Fe2+ (complexant).
Tous les complexants colorés avec Fe2+ et sensiblement incolores avec Fe3+ peuvent convenir, pour autant que le potentiel redox du couple Fe3+ (complexant)/Fe2+ (complexant) soit suffisamment élevé par rapport à celui du couple NAD(P)+ / NAD(P)H.
Le cycle amplificateur est avantageusement mis en oeuvre à un pH situé dans une zone telle que les enzymes soient suffisamment actives et que le Fe2+ (complexant) soit coloré.
De nombreux complexants du Fe2+ ont été proposés, voir par exemple P. Métalis, J. Agneray, G. Férard, J.C. Fruchart, J.C. Jardillier, A. Revol, G. Siest, A. Stahl, Biochimie Clinique 1. Biochimie
Analytique, p. 47, Simep Ed. 1977, Villeurbanne, France.
Cependant, de manière à obtenir le maximum de sensibilité lors du dosage, on utilisera un complexant présentant un coefficient d'extinction molaire le plus élevé possible avec le Fe2+. On a utilisé avec succès le disulfonate sodique de la bathophénantroline (I) et le sel disodique de l'acide (pyridyl-2)-3p,p dibenzéne sulfonique-5,6 triazine 1,2,4 (ici).
EMI2.1
En présence de Fe2+, (I) donne un complexe coloré dont le maximum d'absorbance se situe à 536 nm (s=22.400 M-' cm-').
Pour (II), le maximum se situe à 562 nm (e (s=27 800 M-' cm-2).
Avec (II), on obtiendra donc une meilleure sensibilité; quoique (I) puisse également être utilisé.
D'autres complexants du fer sont également utilisables pour autant que le complexe coloré avec le Fe2+ soit stable dans la zone de pH utilisée pour le cycle et soit pratiquement incolore avec le Fe3+
A titre de transmetteur d'électrons T, on peut utiliser un composé chimique ou une enzyme.
Différentes substances sont utilisables comme transmetteur d'électrons pour la réaction (5), tels que le N-méthylphénazonium méthosulfate (III) ou le méthoxy-1 N-méthylphénazonium métho sulfate (IV):
EMI2.2
On préfère utiliser le composé IV à la place du III, peu stable à la lumière, ou tout autre dérivé de substitution du N-méthylphénazonium méthosulfate ayant un pouvoir oxydoréducteur comparable et un potentiel de couple redox voisin.
Une enzyme, admettant NAD(P)H et le complexe Fe3+ (complexant) comme substrats, peut aussi être utilisée comme transmetteur d'électrons. Parmi les enzymes utilisables, on peut citer la diaphorase, la NAD+ peroxydase (E.C. 1.11.1.1), la peroxydase (E.C.
1.11.1.7).
Lorsque l'on utilise un dérivé du N-méthylphénazonium méthosulfate comme transmetteur d'électrons, la spécificité du cycle pour
NAD(H) ou NADP(H) dépend uniquement de la déshydrogénase
E1. Certaines déshydrogénases n'acceptent que NAD(H) comme coenzyme tandis que d'autres n'acceptent que NADP(H). Certaines, telles que la glucose-6-phosphate déshydrogénase de Leuconostoc mesenteroides acceptent les deux coenzymes. Lorsque'le transmetteur est une enzyme, celle-ci peut également présenter une spécificité pour NAD(H) ou NADP(H). La spécificité du cycle pour NAD(H) ou NADP(H) sera donc dépendante de la spécificité des deux enzymes du cycle amplificateur.
L'homme du métier, par une expérimentation de routine, disposera des transmetteurs fournissant la meilleure amplification, selon les conditions particulières considérées.
Les conditions expérimentales de pH, température, concentrations en S,, T, Fe3+ (complexant) et E, seront aussi choisies de façon à obtenir la sensibilité désirée, le plus souvent maximale.
Ces conditions expérimentales dépendent du choix de El, T, ainsi que du fait qu'il faut amplifier du NAD(H) ou du NADP(H).
Ces systèmes amplificateurs sont avantageusement appliqués à des dosages, en particulier immunochimiques, dans lequel le
NAD(P)(H) est utilisé comme marqueur.
Dans ce qui suit et dans un but purement illustratif, on a décrit l'application du procédé de l'invention à des dosages immunochimiques. Cependant l'invention peut aussi être appliquée à d'autres types de dosage pour autant qu'on dispose d'une molécule ayant une affinité suffisante vis-à-vis de la substance Z à doser.
Soit Z une substance à doser et soit Z-NAD(P)(H) cette substance liée covalentiellement au NAD(P)(H) (couple appelé marqueur en immunochimie); on peut établir une compétition entre Z et Z-NAD(P)(H) vis-à-vis d'une substance Ac ayant une forte affinité pour Z. Généralement, Ac sera un anticorps spécifique dirigé contre Z, mais d'autres molécules avec forte affinité pour Z sont envisageables.
L'équilibre suivant s'établit:
Z + Z-NAD(P)(H) + Ac +s Z-Ac + [Z-NAD(P)(H)] - Ac (6)
Z-NAD(P)(H) conserve une partie des propriétés du coenzyme
NAD(P)(H) et on sait qu'il peut être dosé dans un cycle amplificateur du type de ceux précédemment décrits. Par contre, dans (Z
NAD(P)(H) - Ac), les propriétés de coenzyme de la partie
NAD(P)(H) sont fortement altérées et la vitesse d'amplification par un cycle est considérablement diminuée.
Etant donné la réaction (6), lorsque l'on introduit l'échantillon contenant le produit Z à doser dans un milieu contenant un mélange du marqueur et de Ac, il y aura d'autant plus de Z-NAD(P)(H) non lié à Ac, à l'équilibre, qu'une plus grande quantité de Z aura été introduite. En appliquant le système amplificateur selon l'invention, où le Z-NAD(P)(H) jouera le rôle de coenzyme, on constatera une formation de Fe2+ (complexant) d'autant plus rapide que la concentration en Z dans l'échantillon à doser sera plus élevée.
Cette méthode de dosage immunochimique, d'autant plus avantageuse qu'elle peut être effectuée en une seule opération, peut s'appliquer à des substances Z de natures très diverses; Z peut être une protéine, qui possède un caractère immunogène, mais aussi un hapténe (petite molécule non immunogène par elle-même); de plus,
Ac peut ne pas être un anticorps, mais uniquement une molécule ayant une forte affinité pour Z.
La présente invention concerne donc des dosages immunochimiques, caractérisés en ce qu'ils comportent la mesure du Z-NAD(P)(H) amplifié à l'aide d'un cycle des réactions (4)+(5), dans lequel l'oxydant est le cation Fe2+ complexé par un agent convenablement choisi; ces nouvelles méthodes de dosage permettent la détermination dans les milieux biologiques d'hormones hapténiques ou protéiques, de médicaments et de protéines.
Le procédé de l'invention comportant un marquage avec
NAD(P)(H) peut être appliqué à des dosages immunochimiques en phase hétérogène aussi bien qu'homogène.
Lorsqu'on travaille en phase hétérogène, la substance Ac est immobilisée sur un support solide et on met en compétition Z
NAD(P)(H) et Z à doser vis-à-vis des Ac.
Lorsque l'équilibre de compétition est atteint, on sépare Z
NAD(P)(H) non fixé à Ac et on dose le Z-NAD(P)(H) fixé à Ac.
Dans ce cas, Z-NAD(P)(H) lié à Ac, conservant une partie de son pouvoir coenzymatique, peut être amplifié par un cycle amplificateur utilisant les réactions (4) +(5).
Il y aura d'autant plus de Z-NADP(H) lié à Ac qu'il y aura moins de Z à doser.
Les exemples suivants illustrent l'invention, sans aucunement la limiter.
Dans l'ensemble du texte, les concentrations sont exprimées en
M (M"uM, mM), soit moles (micro... milli...) par litre.
Exemple 1:
Dosage du NAD+ avec un cycle à glucose-6-phosphate déshydrogénase (G-6-PDH) et méthoxy-l N-méthylphénazonium méthosulfate (IV).
Schéma réactionnel
NAD+ + glucose-6-phosphate
EMI3.1
NADH + H+ +6
phosphogluconate
NADH + 2(Fe3+ complexant)
EMI3.2
NAD+ + H+ + A(Fe2+
complexant)
La vitesse du cycle augmente avec les concentrations en G-6
PDH et IV. Pour ne pas avoir un blanc trop important, la concentration de G-6-PDH est fixée à 2,5 ou 5 U/ml dans le milieu final.
Le méthoxy-l N-méthylphénazonium méthosulfate peut être utilisé aux concentrations de 40 à 80 gM dans le milieu final.
On utilise, comme complexant, le sel disodique de l'acide (pyridyl-2)-3 p,p-dibenzène sulfonique-5,6 triazine-1,2,4 (11) et le rapport des concentrations de ce complexant et du Fe3+ est de 5/1.
Si on fixe la concentration en Fe3+ dans le milieu final à 0,3 mM, on obtient une réponse linéaire dans une gamme étendue de concentrations de NAD+.
Le pH optimum du cycle est de 6,85 en tampon imidazole/HC1 0,1M.
On réalise le dosage comme suit: à 1 ml de tampon 0,1M imida zole/HC1 contenant du glucose- 6-phosphate à une concentration de 12 mM, pH = 6,85, préincubé à 37 C, on ajoute successivement:
- 50 1 de solution étalon en NAD+ préparée dans du tampon imidazole 0,1M àpH=6,85;
50 111 d'une solution 37,5 mM du complexant II dans du tampon imidazole 0,1M à pH=6,85;
- 50 111 de solution 7,5 mM en FeCI2 dans HC1 N/100;
50 111 de solution 1 ou 2 mM en transmetteur d'électrons IV dans du tampon imidazole 0,1M à pH=6,85.
La réaction est démarrée par addition de 50 1ll de solution de
G-6-PDH à 62,5 U/ml dans du tampon imidazole 0,1M, pH=6,85.
Le mélange est incubé à 370 C tandis qu'à 562 nm on mesure, par méthode cinétique, la différence d'absorption de la lumière entre l'essai ainsi préparé et celui obtenu en remplaçant la solution étalon en NAD+ par du tampon imidazole 0,1M, pu=6,85 (essai en blanc). Au lieu d'une lecture continue, on peut utiliser une lecture à terme (méthode en point final), en faisant la lecture après une heure d'incubation. Sur la figure 1 sont représentées les droites d'étalonnage après 1 heure d'incubation pour les deux concentrations de transmetteur d'électrons, [(1) C=80 loM; (2) C=40 ,uM], donnant la différence d'absorbance entre l'échantillon et le blanc A A en fonction de la concentration en NAD+ dans le milieu final (en nM).
On voit que la vitesse évolue avec la concentration du transmetteur. Elle est de 0,0121 A/min pour la solution de IV à 80 loM et de 0,0105 A/min pour la solution de IV de concentration moitié (40 Ils).
Exemple 2:
Dosage du NAD+ avec un cycle amplificateur à glucose-6-phosphate déshydrogénase (G-6-PDH) et diaphorase.
Schéma réactionnel Glucose-6-phosphate +
EMI3.3
NADH + H+ +
6-phosphogluconate
NADH + 2(Fe3+ complexant)
EMI3.4
NAD+ H+ + 2(Fe2+
complexant)
On utilise le sel disodique de (pyridyl-2)-3 p,p-dibenzène sulfonique-5,6 triazine-1,2,4 (II) comme complexant. Avec le tampon trishydroxyméthylaminométhane (Tris)/HC1 0,1M, le pH optimum de ce cycle est de 8.
On utilise pour Fe2+ une concentration dans le milieu final de 0,3 mM et pour le complexant II de 1,5 mM, tandis que pour la déshydrogénase (G-6-PDH) et la diaphorase, on aura 2,5 U/ml dans le milieu final. Le dosage est effectué comme suit: à 1 ml de tampon
Tris 0,1M contenant du glucose-6-phosphate en solution à une concentration 12 mM, amené à pH = 8 et préincubé à 37 C, on ajoute successivement:
:
- 50 111 de solution étalon de NAD+ préparée dans un tampon tris (0,1M, pH=8);
- ,ul de solution de concentration 37,5 mM, en complexant II dans du tampon Tris (0,1 M, pH=8);
- 50 111 de solution à 7,5 mM de FeCI2 dans HC1 N/100;
- 50 111 de solution de G-6-PDH de concentration 62,5 U/ml, dans un tampon Tris (0,1 M, pu=8,0);
- 50 111 de solution, à 62,5 U/ml de diaphorase dans du tampon
Tris (0,1M, pH=8,0).
Comme dans l'exemple 1, soit on mesure, en incubant à 37 C,
I'augmentation de la différence d'absorbance entre l'essai et le blanc, soit on fait la mesure en point final, après une heure d'incubation à 37" C.
La droite d'étalonnage obtenue est représentée à la figure 2. On peut la comparer à celle obtenue dans l'exemple 1.
Pour une concentration c en NAD+ dans le cycle, la différence d'absorbance vaut, avec le méthoxy-lN-méthylphénazonium à:
c = 80 loM A = 0,725
c = 40 loM A = 0,630 tandis qu'avec la diaphorase, en milieu final A = 0,1325.
Le système de l'exemple 2 est donc plus lent, mais la valeur du blanc est nettement plus faible et on peut prolonger l'incubation plusieurs heures, ce qui en fait un ensemble plus sensible. Dans la figure 3, on montre l'évolution de la pente des droites d'étalonnage en fonction du temps d'incubation avant la mesure de la différence d'absorbance.
Exemple 3:
Dosage du NADP+ avec un cycle amplificateur à glucose-6phosphate déshydrogénase et méthoxy- I-N-méthylphénazonium méthosulfate (IV).
Schéma réactionnel
Glucose-6-phosphate +
EMI4.1
NADPH + H+ + 6-phosphogluconate
NADPH + Fe3+ (complexant)
EMI4.2
NADP+ + H+ + 2 Fe2+
(complexant)
On utilise la G-6-PDH à la même concentration finale que dans l'exemple 1 avec NAD+, soit 2,6 Ujml dans le milieu final.
Le méthoxy-1-N-méthylphénazonium méthosulfate est utilisé à la concentration finale de 80 loM dans le milieu final.
Le complexant est le même que dans l'exemple 1 et on utilise les mêmes concentrations en Fe3+ et complexant.
On réalise le dosage comme suit: à 1 ml de tampon imidazo le/HCl 0,1 M contenant du glucose-6-phosphate à la concentration de 12 mM, pH=6,85, préincubé à 37" C, on ajoute successivement:
- 50 lo de solution étalon en NADP+ préparée dans du tampon imidazole/HCI 0,1M, pH=6,85;
50 l d'une solution 37,5 mM du complexant II dans du tampon imidazole/HCI 0,1M, pH=6,85;
- 50 ,ul d'une solution de FeCl3 7,5 mM dans du HCI N/100;
50 pL1 d'une solution 2 mM en transmetteur d'électrons IV dans du tampon imidazole/HCI 0,1M, pH=6,85.
Le cycle amplificateur est démarré par addition de 50 l d'une solution de G-6-PDH à 62,5 U/ml dans du tampon imidazole/HCl 0,1M, pH =6,85.
Le mélange est incubé à 37 C, tandis qu'on mesure par méthode cinétique la différence d'absorption de la lumière à 562 nm entre l'essai ainsi préparé et celui obtenu en remplaçant la solution étalon en NADP+ par 50 lo1 du tampon imidazole/HCI 0,1M, pH=6,85 (essai en blanc). Au lieu d'une lecture continue, on peut utiliser une lecture en point final, en faisant la lecture après 35 minutes d'incubation. Sur la figure 4, on a représenté la droite d'étalonnage après 35 minutes d'incubation, donnant la différence d'absorbance entre l'essai et le blanc (A A), en fonction de la concentration en NADP+ dans le milieu final (nM).
** ATTENTION ** start of the DESC field may contain end of CLMS **.
CLAIMS
1. Method for assaying the coenzymes NADll, NADPH, NAD + and NADP +, characterized in that an amplifier system is used comprising, in addition to the coenzyme NAD (P) (H) to be assayed, a dehydrogenase E, and its substrate Si, said dehydrogenase E, being capable of reducing NAD (P) +, a ferric complex Fe3 + (complexing) and an electron transmitter T capable of allowing the oxidation of
NAD (P) H by Fe2 + complexed.
2. Assay method according to claim 1, characterized in that the concentration of Fe2 + (complexing agent) formed is measured by spectrophotometry.
3. Assay method according to claim 1, characterized in that it involves the following reactions: (4) NAD (P) + + S,
EMI1.1
NAD (P) H + P, + H + (5) NAD (P) H + 2Fe3 + (complexing)
(complexing) + H +
EMI1.2
NAD (P) + + 2Fe2 + in which E "S, and T are defined as indicated above and Pl represents the product of reaction (4).
4. Amplifier system for implementing the method for assaying the coenzymes NADH, NADPH, NAD + and NADP + according to claim 1, characterized in that it comprises, in addition to the coenzyme NAD (P) (H) to be assayed, a dehydrogenase E, and its substrate S ,, said dehydrogenase E, being capable of reducing NAD (P) +, a ferric complex Fe3 + (complexing) and an electron transmitter
T capable of allowing the oxidation of NAD (P) H by the complexed Fe3 +.
5. System according to claim 4, characterized in that the electron transmitter is N-methylphenazonium methosulfate, methoxy-1 N-methylphenazonium methosulfate or another substitution derivative of N-methyl phenazonium methosulfate.
6. System according to claim 4, characterized in that the electron transmitter is an enzyme such as diaphorase,
NAD + peroxidase (E.C. 1.11.1.1) or peroxidase (E.C. 1.11.1.7).
7. System according to one of claims 4 to 6, characterized in that the complexing agent of Fe3 + is the sodium disulfonate of bathophenanthroline, or the disodium salt of acid (2-pyridyl) 3-p, p-dibenzene sulfonic-5,6-triazine- 1,2,4.
8. System according to one of claims 4 to 7, characterized in that as dehydrogenase E, it comprises glucose-6-phosphate dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides (EC 1.1.1.49) and as substrate S, the glucose-6-phosphate.
9. Amplifier system according to one of claims 4 to 8, characterized in that it comprises a buffer making it possible to implement the amplifier cycle at a pH located in a zone such that the enzymes are sufficiently active and that the Fe2 + ( complexing) or colored,
10. Application of the method according to claim 1 to the in particular immunochemical assay in heterogeneous phase of substances Z chosen from haptens or proteins, according to which the substance to be assayed, Z, is put in competition with a marker, constituted by Z covalently linked to NAD (P) (H), vis-à-vis a substance having a strong affinity for Z, this substance being fixed on a solid support, the quantity of marker Z-NAD (P) (H) linked to this substance inversely dependent on the quantity of Z to be assayed and being measured,
after separation using the amplifier system used for implementing the method according to claim 1.
The present invention relates to a method for assaying microquantities of NADH, NADPH, NAD + and NADP +, the application of this method to immunochemical assays and an amplifier system intended for the implementation of said method.
Within the meaning of this description, and as is commonly accepted in the technical literature, the notation NAD (P) + denotes NAD + or NADP + and the notation NAD (P) H denotes
NADH or NADPH. In addition, the abbreviated notation NAD (P) (H) can denote any of the coenzymes NAD +, NADP +, NADH or NADPH.
Coenzyme enhancing systems, such as nicotinamide adenine dinucleotide, NAD (H), and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADP (H), are already known, as well as their application in the assay of small amounts of these coenzymes, in particular d after Lowry OH et al., J. Biol. Chem. 236 (10), 2746-55 (1961).
Such systems are based on an enzymatic cycle which can be schematized as follows: Sol + NAD (P) +
EMI1.3
P1 + NAD (P) H + H + (1) S2 + NAD (P) H + H +
EMI1.4
P2 + NAD (P) + (2) where Si and Sî are the substrates of the enzymes E1 and E2 respectively, and Pl and P2 the products of the enzymatic reactions, one or the other of which will be determined later by a so-called indicator reaction.
Small amounts of NAD (P) (H) allow the initiation of the cycle, provided that the concentrations of enzymes E1 and E2 and those of substrates Si and Sî are suitably chosen. Stopping the amplifier cycle reactions is therefore necessary before proceeding with the determination of one of the amplification products.
The indicator reaction is most often enzymatic: Pl (out2) + NAD (P) +
EMI1.5
X1 (or X2) + NAD (P) H + H + (3)
In the diagram (3) above, E3 denotes a dehydrogenase, and
X1 (or X2) is the product of this reaction.
The NAD (P) H formed can be measured either by fluorimetry or by spectrophotometry. In the methods described above, it is therefore necessary to stop the reactions of the amplifier cycle, before carrying out the assay of P1 or P2.
The invention relates to a new amplifier cycre which allows the dosing of one of the amplification products, directly in the middle of the cycle, and its use thus presents an important advantage of implementation compared to the prior art. .
The two phases, previously separate, of amplification and revelation are now carried out in a single operation.
The amplifier system according to the invention comprises, in addition to the coenzyme NAD (P) (H) to be assayed, a dehydrogenase E1 and its substrate S ,, said dehydrogenase El being capable of reducing NAD (P) +, a ferric complex Fe3 + (complexing ), and an electron transmitter T capable of allowing the oxidation of NAD (P) H by the complexed Fe3 +.
The reactions implemented in the amplifier cycle are as follows:
In the present description, and in particular in the reaction schemes (4) and (5), the notation Fe3 + (complexing agent) denotes a ferric complex and the notation Fe2 + (complexing agent) denotes the corresponding ferrous complex.
In this system, provided that the concentrations of Si, Fe3 + (complexing agent), E, and T are suitably chosen, a very small amount of NAD (P) (H) allows the cycle to operate. The amount of Fe2 + (complexing agent) which forms is proportional to the amount of NAD (P) (H) used.
The enzyme E1 allows the reduction of NAD (P) + to NAD (P) H.
A dehydrogenase is used whose reaction is favored thermo
NAD (P) + + S,
EMI1.6
NAD (P) H + H ++ P1 (4)
NAD (P) H + 2 Fe3 + (complexing)
EMI1.7
NAD (P) + + H + + 2 Fe2 +
(complexing) (5)
dynamically in the direction NAD (P) + towards NAD (P) H; such as glucose-6-phosphate dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides, which irreversibly reduces NAD (P) + to NAD (P) H in the presence of glucose-6-phosphate to form 6-phosphogluconate. Other dehydrogenases may however be suitable.
The second reaction reoxides NAD (P) H to NAD (P) + using the
Fe3 + (complexing agent) as an oxidant and an electron transmitter,
T. Without this transmitter, the oxidation of NAD (P) H by Fe3 + (complexing agent) is impossible. In order to be able to measure Fe2 + as it appears in the cycle, one works in the presence of an iron complexing agent, strongly colored with Fe2 + and practically colorless with Fe3 +. This complexing agent also allows the Fe3 + and Fe2 +, insoluble at the pH used, to be kept in solution. Consequently, the redox couple is no longer Fe3 + / Fe2 +, but Fe3 + (complexing) / Fe2 + (complexing).
All complexing agents colored with Fe2 + and substantially colorless with Fe3 + may be suitable, provided that the redox potential of the Fe3 + (complexing) / Fe2 + (complexing) pair is sufficiently high compared to that of the NAD (P) + / NAD (P) pair. H.
The amplifying cycle is advantageously carried out at a pH located in a zone such that the enzymes are sufficiently active and that the Fe2 + (complexing agent) is colored.
Many complexing agents of Fe2 + have been proposed, see for example P. Métalis, J. Agneray, G. Férard, J.C. Fruchart, J.C. Jardillier, A. Revol, G. Siest, A. Stahl, Clinical Biochemistry 1. Biochemistry
Analytics, p. 47, Simep Ed. 1977, Villeurbanne, France.
However, in order to obtain the maximum sensitivity during the assay, a complexing agent will be used which has the highest possible molar extinction coefficient with Fe2 +. The sodium disulfonate of bathophenanthroline (I) and the disodium salt of (pyridyl-2) -3p, p dibenzene sulfonic-5,6 triazine 1,2,4 (here) have been used with success.
EMI2.1
In the presence of Fe2 +, (I) gives a colored complex whose maximum absorbance is located at 536 nm (s = 22,400 M- 'cm-').
For (II), the maximum is located at 562 nm (e (s = 27,800 M- 'cm-2).
With (II), we will therefore obtain a better sensitivity; although (I) can also be used.
Other iron complexing agents can also be used provided that the complex colored with Fe2 + is stable in the pH zone used for the cycle and is practically colorless with Fe3 +
As the electron transmitter T, a chemical compound or an enzyme can be used.
Different substances can be used as an electron transmitter for the reaction (5), such as N-methylphenazonium methosulfate (III) or 1-methoxy-N-methylphenazonium metho sulfate (IV):
EMI2.2
It is preferred to use compound IV in place of III, not very stable in light, or any other derivative of substitution of N-methylphenazonium methosulfate having a comparable oxidoreductive power and a potential of neighboring redox couple.
An enzyme, admitting NAD (P) H and the Fe3 + complex (complexing) as substrates, can also be used as an electron transmitter. Among the enzymes which can be used, mention may be made of diaphorase, NAD + peroxidase (E.C. 1.11.1.1), peroxidase (E.C.
1.11.1.7).
When an N-methylphenazonium methosulfate derivative is used as an electron transmitter, the specificity of the cycle for
NAD (H) or NADP (H) depends only on dehydrogenase
E1. Some dehydrogenases only accept NAD (H) as a coenzyme while others only accept NADP (H). Some, such as the glucose-6-phosphate dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides accept both coenzymes. When the transmitter is an enzyme, this can also have specificity for NAD (H) or NADP (H). The specificity of the cycle for NAD (H) or NADP (H) will therefore be dependent on the specificity of the two enzymes of the amplifying cycle.
Those skilled in the art, through routine experimentation, will have transmitters providing the best amplification, according to the particular conditions considered.
The experimental conditions of pH, temperature, concentrations of S ,, T, Fe3 + (complexing agent) and E, will also be chosen so as to obtain the desired sensitivity, most often maximum.
These experimental conditions depend on the choice of E1, T, as well as on the fact that it is necessary to amplify NAD (H) or NADP (H).
These amplifying systems are advantageously applied to assays, in particular immunochemicals, in which the
NAD (P) (H) is used as a marker.
In what follows and for purely illustrative purposes, the application of the method of the invention to immunochemical assays has been described. However, the invention can also be applied to other types of assay provided that a molecule has sufficient affinity for the substance Z to be assayed.
Let Z be a substance to be assayed and let Z-NAD (P) (H) this substance covalently linked to NAD (P) (H) (couple called marker in immunochemistry); we can establish a competition between Z and Z-NAD (P) (H) against a substance Ac having a strong affinity for Z. Generally, Ac will be a specific antibody directed against Z, but other molecules with strong affinity for Z are possible.
The following balance is established:
Z + Z-NAD (P) (H) + Ac + s Z-Ac + [Z-NAD (P) (H)] - Ac (6)
Z-NAD (P) (H) retains some of the properties of the coenzyme
NAD (P) (H) and we know that it can be dosed in an amplifying cycle of the type of those previously described. On the other hand, in (Z
NAD (P) (H) - Ac), the coenzyme properties of the part
NAD (P) (H) are strongly altered and the speed of amplification by a cycle is considerably reduced.
Given the reaction (6), when the sample containing the product Z to be assayed is introduced into a medium containing a mixture of the marker and of Ac, there will be all the more Z-NAD (P) (H ) not linked to Ac, at equilibrium, that a greater amount of Z will have been introduced. By applying the amplifier system according to the invention, where the Z-NAD (P) (H) will play the role of coenzyme, a formation of Fe2 + (complexing agent) will be observed, the faster the Z concentration in the sample. to be dosed will be higher.
This immunochemical assay method, which is all the more advantageous since it can be carried out in a single operation, can be applied to substances Z of very diverse natures; Z can be a protein, which has an immunogenic character, but also a hapten (a small molecule which is not immunogenic by itself); Furthermore,
Ac may not be an antibody, but only a molecule with a strong affinity for Z.
The present invention therefore relates to immunochemical assays, characterized in that they comprise the measurement of Z-NAD (P) (H) amplified using a cycle of reactions (4) + (5), in which l 'oxidant is the Fe2 + cation complexed by a suitably chosen agent; these new assay methods allow the determination in biological media of haptenic or protein hormones, drugs and proteins.
The process of the invention comprising a marking with
NAD (P) (H) can be applied to immunochemical assays in heterogeneous as well as homogeneous phase.
When working in heterogeneous phase, the substance Ac is immobilized on a solid support and we put in competition Z
NAD (P) (H) and Z to be assayed against Acs.
When the balance of competition is reached, we separate Z
NAD (P) (H) not attached to Ac and the Z-NAD (P) (H) attached to Ac is assayed.
In this case, Z-NAD (P) (H) linked to Ac, retaining part of its coenzymatic power, can be amplified by an amplifying cycle using reactions (4) + (5).
There will be all the more Z-NADP (H) linked to Ac as there will be less Z to be assayed.
The following examples illustrate the invention without limiting it in any way.
Throughout the text, the concentrations are expressed in
M (M "uM, mM), or moles (micro ... milli ...) per liter.
Example 1:
Determination of NAD + with a glucose-6-phosphate dehydrogenase (G-6-PDH) and methoxy-1 N-methylphenazonium methosulfate (IV) cycle.
Reaction scheme
NAD ++ glucose-6-phosphate
EMI3.1
NADH + H + +6
phosphogluconate
NADH + 2 (Fe3 + complexing)
EMI3.2
NAD + + H + + A (Fe2 +
complexing)
Cycle speed increases with G-6 concentrations
PDH and IV. In order not to have too large a blank, the concentration of G-6-PDH is fixed at 2.5 or 5 U / ml in the final medium.
Methoxy-1 N-methylphenazonium methosulfate can be used at concentrations of 40 to 80 gM in the final medium.
The disodium salt of (pyridyl-2) -3 p, p-dibenzene sulfonic-5,6 triazine-1,2,4 (11) and the ratio of the concentrations of this complexing agent and of the Fe3 + is 5/1.
If the concentration of Fe3 + in the final medium is fixed at 0.3 mM, a linear response is obtained over a wide range of concentrations of NAD +.
The optimum pH of the cycle is 6.85 in 0.1M imidazole / HCl buffer.
The assay is carried out as follows: to 1 ml of 0.1M imida zole / HCl buffer containing glucose-6-phosphate at a concentration of 12 mM, pH = 6.85, preincubated at 37 ° C., is successively added:
- 50 l of standard NAD + solution prepared in 0.1M imidazole buffer at pH = 6.85;
50 111 of a 37.5 mM solution of complexing agent II in 0.1M imidazole buffer at pH = 6.85;
- 50 111 of 7.5 mM solution of FeCI2 in HC1 N / 100;
50 111 of 1 or 2 mM solution in IV electron transmitter in 0.1M imidazole buffer at pH = 6.85.
The reaction is started by adding 50 μl of solution of
G-6-PDH at 62.5 U / ml in 0.1M imidazole buffer, pH = 6.85.
The mixture is incubated at 370 ° C. while at 562 nm the difference in light absorption between the test thus prepared and that obtained by replacing the standard solution in NAD + with imidazole buffer 0 is measured by kinetic method. 1M, pu = 6.85 (blank test). Instead of continuous reading, one can use a term reading (end point method), reading after one hour of incubation. In Figure 1 are shown the calibration lines after 1 hour of incubation for the two concentrations of electron transmitter, [(1) C = 80 loM; (2) C = 40 μM], giving the difference in absorbance between the sample and the blank A A as a function of the concentration of NAD + in the final medium (in nM).
We see that the speed changes with the concentration of the transmitter. It is 0.0121 A / min for the IV solution at 80 loM and 0.0105 A / min for the IV solution of half concentration (40 ILS).
Example 2:
Determination of NAD + with an amplifier cycle of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G-6-PDH) and diaphorase.
Glucose-6-phosphate + reaction scheme
EMI3.3
NADH + H + +
6-phosphogluconate
NADH + 2 (Fe3 + complexing)
EMI3.4
NAD + H + + 2 (Fe2 +
complexing)
The disodium salt of (pyridyl-2) -3 p, p-dibenzene sulfonic-5,6 triazine-1,2,4 (II) is used as complexing agent. With the 0.1M trishydroxymethylaminomethane (Tris) / HCl 1 buffer, the optimum pH for this cycle is 8.
A concentration in the final medium of 0.3 mM is used for Fe2 + and for complexing agent II of 1.5 mM, while for dehydrogenase (G-6-PDH) and diaphorase, there will be 2.5 U / ml in the final medium. The assay is carried out as follows: 1 ml of buffer
0.1M tris containing glucose-6-phosphate in solution at a concentration of 12 mM, brought to pH = 8 and preincubated at 37 ° C., the following are successively added:
:
- 50 111 standard solution of NAD + prepared in a tris buffer (0.1M, pH = 8);
-, ul of 37.5 mM concentration solution, complexing II in Tris buffer (0.1 M, pH = 8);
- 50 111 of 7.5 mM solution of FeCl2 in HC1 N / 100;
- 50 111 of G-6-PDH solution with a concentration of 62.5 U / ml, in a Tris buffer (0.1 M, pu = 8.0);
- 50 111 of solution, at 62.5 U / ml of diaphorase in buffer
Tris (0.1M, pH = 8.0).
As in Example 1, either we measure, by incubating at 37 ° C.,
The increase in the absorbance difference between the test and the blank, or the measurement is made at the end point, after one hour of incubation at 37 "C.
The calibration line obtained is shown in FIG. 2. It can be compared to that obtained in Example 1.
For a concentration c of NAD + in the cycle, the difference in absorbance is, with methoxy-1N-methylphenazonium at:
c = 80 loM A = 0.725
c = 40 loM A = 0.630 while with diaphorase, in final medium A = 0.1325.
The system of example 2 is therefore slower, but the value of the white is much lower and the incubation can be prolonged for several hours, which makes it a more sensitive unit. In FIG. 3, the evolution of the slope of the calibration lines is shown as a function of the incubation time before the measurement of the difference in absorbance.
Example 3:
Determination of NADP + with a glucose-6phosphate dehydrogenase and methoxy- I-N-methylphenazonium methosulfate (IV) enhancer cycle.
Reaction scheme
Glucose-6-phosphate +
EMI4.1
NADPH + H + + 6-phosphogluconate
NADPH + Fe3 + (complexing)
EMI4.2
NADP + + H + + 2 Fe2 +
(complexing)
G-6-PDH is used at the same final concentration as in Example 1 with NAD +, ie 2.6 Ujml in the final medium.
Methoxy-1-N-methylphenazonium methosulfate is used at the final concentration of 80 loM in the final medium.
The complexing agent is the same as in Example 1 and the same concentrations of Fe3 + and complexing agent are used.
The assay is carried out as follows: to 1 ml of 0.1 M imidazo / HCl buffer containing glucose-6-phosphate at a concentration of 12 mM, pH = 6.85, preincubated at 37 "C, successively added:
- 50 lo of standard solution in NADP + prepared in 0.1M imidazole / HCl buffer, pH = 6.85;
50 l of a 37.5 mM solution of complexing agent II in 0.1M imidazole / HCl buffer, pH = 6.85;
- 50 μl of a 7.5 mM FeCl3 solution in N / 100 HCl;
50 pL1 of a 2 mM solution of IV electron transmitter in 0.1M imidazole / HCl buffer, pH = 6.85.
The amplifier cycle is started by adding 50 l of a G-6-PDH solution at 62.5 U / ml in 0.1M imidazole / HCl buffer, pH = 6.85.
The mixture is incubated at 37 ° C., while the difference in light absorption at 562 nm is measured by kinetic method between the test thus prepared and that obtained by replacing the standard solution in NADP + with 50 lo1 of imidazole / 0.1M HCI, pH = 6.85 (blank test). Instead of continuous reading, end point reading can be used, reading after 35 minutes of incubation. In FIG. 4, the calibration line is represented after 35 minutes of incubation, giving the difference in absorbance between the test and the blank (AA), as a function of the concentration of NADP + in the final medium (nM ).