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REVENDICATIONS
1. Complexe lipoprotéique normalisant l'efficacité de la vitamine
E et des antioxydants de synthèse, caractérisé en ce qu'il renferme les composants suivants:
un un antioxydant de synthèse,
un composé du sélénium,
au au moins une enzyme lipolytique ayant de l'affinité pour les interfaces lipides-eau,
des lipides polaires.
2. Complexe conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que l'antioxydant de synthèse est constitué par de la vitamine E.
3. Complexe conforme à la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient au moins un lipide apolaire.
4. Complexe conforme à la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient de la globine.
5. Complexe conforme à la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient au moins un dérivé à chaîne phytyle.
6. Procédé pour la préparation du complexe lipoprotéique conforme à l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il est obtenu par association au niveau d'une interface lipides-eau structurée: un antioxydant de synthèse; un composé du sélénium; au moins une enzyme lipolytique ayant de l'affinité pour les interfaces lipideseau et des lipides polaires.
L'invention concerne un complexe lipoprotéique normalisant l'efficacité de la vitamine E et des antioxydants de synthèse.
Le complexe conforme à l'invention est caractérisé en ce qu'il renferme les composants suivants:
un un antioxydant de synthèse,
un composé du sélénium,
au au moins une enzyme lipolytique ayant de l'affinité pour les interfaces lipides-eau,
- des lipides polaires.
On a fondé, depuis une dizaine d'années, de grands espoirs sur l'utilisation thérapeutique de la vitamine E et des tocophérols dérivés, notamment dans la prévention et le traitement de la sénescence, des maladies cardio-vasculaires et du cancer.
Ces espoirs ont été déçus, en partie du fait que la vitamine E peut être mal absorbée au niveau de l'intestin, ou sa destruction peut être accélérée par oxydation. Dans ce dernier cas, non seulement elle perd ses propriétés antioxydantes, mais elle peut produire des effets inverses. Or, ce risque est actuellement accru, du fait de la vogue de la prescription, dans la diététique, des hyperlipémies, de corps gras alimentaires contenant un pourcentage élevé d'acides gras polyinsaturés.
Il est bien connu que les acides gras polyinsaturés à longues chaînes (AGPLC) sont des constituants majeurs des phospholipides et stérides des membranes cellulaires, ainsi que des lipoprotéines sériques.
Les mieux étudiés des AGPLC sont l'acide linoléique, d'une part, et l'acide arachidonique, d'autre part. L'organisme peut réaliser la synthèse de ce dernier à partir d'acide linoléique, dont la présence dans l'alimentation est obligatoire, d'où son ancienne dénomination de vitamine F et sa dénomination actuelle d'acide gras essentiel (AGE).
Il est également connu que les AGPLC peuvent donner lieu, in vitro comme in vi vo, à la formation d'hydroperoxydes et de substances toxiques (malonaldéhyde, par exemple), ces réactions pouvant être initiées et auto-entretenues par des radicaux libres instables, et on admet que le rôle antioxydant de la vitamine E consisterait en un piégeage desdits radicaux libres.
L'association vitamine E/sélénium est également connue en prophylaxie et thérapeutique vétérinaires pour être plus efficace que la vitamine E seule. Le sélénium, qui est un oligo-élément essentiel, agirait en tant que coenzyme de la peroxydase du glutathion (forme réduite), ce dernier pouvant être un accepteur de l'oxygène peroxydique.
La bonne absorption intestinale des AGPLC (acides linoléique et arachidonique) revêt donc une importance majeure, ainsi que celle de la vitamine E. Cette absorption se fait en même temps que celle des graisses alimentaires et nécessite, par conséquent, la présence dans l'intestin de sels biliaires et de lipase pancréatique en quantités suffisantes. Or, une carence en sélénium entraîne un tarissement de la sécrétion de lipase pancréatique, donc une malabsorption des
AGPLC et de la vitamine E. Il en résulte des troubles graves au niveau des structures lipidiques membranaires, se traduisant, notamment, par une surcharge lipidique et une nécrose du foie, des hyperet dyslipémies et des dégénérescences cireuses des muscles squelettiques ou du myocarde.
Certaines modifications de la composition en acides gras des différentes fractions lipidiques du plasma sanguin et des tissus, ainsi que du turn-over des acides gras, accompagnent les affections susvisées. C'est principalement le cas pour l'acide arachidonique. Or, les fractions lipidiques plasmatiques ou tissulaires les plus riches en cet acide le sont également en vitamine E et sélénium.
C'est en 1957, pour la première fois, que Schwarz et Folz ( J.
Am. Chem. Soc. , 79, 3292-3293) mirent en évidence le rôle du sélénium dans la prévention de la dégénérescence nécrotique du foie des rats. Depuis lors, des affections musculaires et hépatiques consécutives à une carence en sélénium ont été constatées chez d'autres espèces animales: porcs, veaux, poulets, agneaux. La prévention et la thérapeutique desdites affections consistent en l'administration aux animaux de sélénium, soit sous forme minérale - sélénite ou sélénate de sodium - soit sous forme organique - sélénoamino- acides libres ou inclus dans des structures polypeptidiques. Sous cette dernière forme organique, le taux d'incorporation du sélénium dans les lipoprotéines plasmatiques est plus élevé, de même que son taux de rétention tissulaire (muscles, foie, rein, pancréas).
Cependant, en plus de ces composés de nature hydrosoluble du sélénium, on peut mettre facilement en évidence des composés lipidosolubles du sélénium, notamment dans les membranes cellulaires et subcellulaires (membranes du réticulum endoplasmique et des organelles cellulaires). Or, le sélénium, de même que la vitamine E, étant fortement liée à ces structures membranaires, il se pose le problème de la stabilité de la vitamine E et donc des AGPLC, au niveau d'interfaces plus ou moins hydrophobes. En effet, la haute affinité des enzymes lipolytiques pour de telles interfaces fait qu'elles peuvent être encore actives dans des milieux peu hydratés et y libérer des AGPLC, particulièrement menacés de peroxydation par des radicaux libres dans de tels milieux.
L'invention consiste dans la découverte que les AGPLC et la vitamine E ne sont pas le siège de réactions radicalaires destructives, pour eux-mêmes et pour d'autres structures cellulaires, notamment au niveau des interfaces lipides-eau, à condition qu'ils soient protégés par un composé du sélénium (sélénite, sélénate, aminoacides séléniés, notamment) et une ou des enzymes lipolytiques ayant de l'affinité pour ces interfaces.
Rappelons à ce sujet que les enzymes lipolytiques non spécifiques sont des hydrolases qui peuvent se classer suivant un ordre hiérarchique allant de la lysophospholipase du cerveau qui attaque en phase aqueuse un substrat monomoléculaire (= estérase vraie), à la lipase pancréatique qui agit à la surface de gouttelettes huileuses totalement insolubles dans l'eau (=lipase vraie). Les hydrolases intermédiaires agissent à des interfaces relativement hydratées comme celles que constituent les micelles. Parmi ces hydrolases, on peut citer: la cholestérol estérase, les monoglycérides hydrolases, certaines phospholipases et galactolipases, ainsi que la lipoprotéine lipase.
Les hydrolases contractant les liaisons les plus fortes avec les lipides polaires et étant plus spécialement revendiquées sont:
- les enzymes lipolytiques des glandes digestives: glycérolesterhydrolase (EC 3.I.I.3); phosphoglycéride 2 et I-acylhydrolases (EC 3.I.I.4) et stérolester hydrolase (EC 3.1.1.13).
- les glycérolester hydrolases des moisissures appartenant aux
genres Mucor. Rhizopus, Penicillium. Aspergillus, Geotrichum, ainsi qu'aux végétaux supérieurs: germe de blé, son de riz, ricin, olive.
L'agrégation de ces hydrolases avec les lipides polaires se fait en phase aqueuse. Les températures à respecter sont données dans les exemples ci-après illustrant l'invention. L'association moléculaire des protéines douées d'activité lipolytique est réalisée par agitation mécanique avec deux à dix fois leur poids de lipides polaires. Ces derniers sont représentés par des phospholipides (phosphatidylcholine, phosphatidyléthanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylsérine) ou des esters d'acides gras (à 16-20 atomes de carbone) et de glycérol (monoglycérides) ou de sorbitol (tweens) ou de saccharose (sucroglycérides) ou d'autres sucres (glucolipides).
L'a-tocophérol (vitamine E) ou ses dérivés rentrant dans la composition médicamenteuse gagnent à être incorporés dans un premier temps à la phase lipidique, de même que les composés du sélénium (sels minéraux ou aminoacides séléniés) gagnent à être incorporés dans un premier temps à la phase aqueuse sus-visée.
Les quantités de vitamine E et de sélénium à incorporer sont calculées sur le poids de la composition médicamenteuse terminée prête à l'utilisation clinique. La quantité de vitamine E ainsi calculée est comprise entre 20 et 30 mg (22 et 23 Ul) par gramme et celle de sélénium (Se=78,96 g) est de 0,40 mg par gramme de médicament prêt à l'emploi.
Il résulte des associations intermoléculaires entre lipides polaires et enzymes lipolytiques la formation de complexes moléculaires lipoprotéiques suffisamment stables pour être déshydratés par cryodessiccation.
Après pulvérisation, le produit cryodesséché est réparti en gélules, celles-ci peuvent être gastrorésistantes.
Un second mode de préparation du médicament consiste à incorporer le complexe lipoprotéique obtenu ci-dessus (vitamine E, composé sélénié, lipides polaires et enzymes lipolytiques) a, des lipides apolaires pour les protéger de réactions d'oxydation radicalaires qui peuvent se produire lors d'une déshydratation poussée. On entend par lipides apolaires: les triglycérides neutres; le cholestérol et ses esters d'acides gras de C16 à C20; les acides gras libres à longues chaînes lorsqu'ils ne sont pas ionisables. Le poids des lipides apolaires pouvant être émulsionnés avec le complexe lipoprotéique sus-visé est égal à 0,5-t fois le poids de ce complexe.
Un troisième mode de préparation du médicament consiste à y incorporer, en plus des lipides apolaires, ou à leur substituer la globine (chaîne latérale des hémoglobines) et/ou le phytol (chaîne latérale des chlorophylles) ou des dérivés à chaîne phytyle.
Les exemples suivants illustrent l'invention:
Exemple 1:
Le composé sélénié est du séléniate de sodium (Na2SeO4IO H20); la vitamine E est du succinate d'a-tocophérol titrant 250 UI/g; le lipide polaire est une phosphatidylcholine (a, dimyristoyllécithine); le lipide apolaire est un triglycéride (trimyristine) et l'hydrolase est la glycérolester-hydrolase (EC 3.1.1.3) apportée par un extrait pancréatique purifié de porc contenant la colipase et titrant 150 000 Ul/g.
Mode opératoire: On opère dans un réacteur thermostaté muni d'un agitateur. Le sélénate (2 g) est dissous dans 2100 ml d'eau distillée, on introduit la lécithine (350 g) sous agitation modérée mais constante, et la température est portée à 70-80 C en vue de la formation d'un gel homogène.
La vitamine E (100 g) est dissoute à part dans le triglycéride (350 g) qui est chauffé à 70-80"C et introduit dans le réacteur pour réaliser une émulsion homogène avec la lécithine. On laisse alors refroidir jusqu'à 30 C.
Parallèlement, on a introduit dans un mixer 900 ml d'eau distillée refroidie à +2"C dans laquelle on dissout l'équivalent de 10 mg de calcium sous forme de chlorure de calcium et 5 g d'un mélangetampon équimolaire de phosphates (PO4H2K, PO4HNa2) de pH 7,5. On ajoute dans le mixer l'extrait pancréatique (150 g) sous agitation, puis la suspension obtenue est introduite dans le réacteur également sous agitation.
Lorsque l'émulsion obtenue est homogène, on vérifie le pH qui ne doit pas être inférieur à 6,5; sinon, il est ajusté entre 6,5 et 7,0 avec le tampon à base de phosphates.
Entre 10 et 20 min depuis le moment de l'introduction de l'extrait pancréatique dans le réacteur, le contenu de celui-ci est refroidi jusqu'à une température de + 2 C et il est conservé à cette température durant 24 h environ pour obtenir la structuration de l'interface lipides-eau.
Le complexe lipoprotéique obtenu est homogénéisé à nouveau, puis congelé et déshydraté par cryodessiccation jusqu'à une teneur en eau résiduelle comprise entre 3 et 5%.
Après pulvérisation et tamisage, la poudre obtenue est répartie en gélules renfermant 500 mg de complexe lipoprotéique déshydraté.
Dans cet exemple 1, les constituants de la phase lipidique ont été choisis compte tenu, d'une part, de ce que l'on sait de l'effet freinateur des triglycérides à chaînes moyennes (trimyristine notamment) sur le développement de certains cancers, d'autre part, des résultats d'une enquête établissant une relation négative entre le taux sanguin de sélénium et la mortalité humaine due au cancer ( Nutrition
Reviews , 1970, 28, 3, 75) et plus généralement du rôle protecteur dévolu aux antioxydants vis-à-vis des agents cocarcinogénétiques ( Canad. Med. Ass. J. , 1969, 100, 682).
Exemple 2:
Les seules différences par rapport à l'exemple 1 portent sur les points suivants:
- la phase lipidique est constituée, d'une part, de L-a-lécithine de jaune d'oeuf de grade I (350 g) et, d'autre part, de monostéarate/palmitate de glycérol (200 g).
- la lipase EC 3.1.1.3 est d'origine fongique (150 g); elle titre 200 000 UI/g et on l'additionne d'extrait pancréatique de boeuf (150 g) en tant que source de colipase.
Exemple 3:
Les seules différences par rapport à l'exemple 1 portent sur les points suivants:
- la phase lipidique est constituée, d'une part, de lécithine fluide de soja (350 g) renfermant 80% de phospholipides et, d'autre part, de palmitate de cholestérol (350 g),
les hydrolases sont les lipases, phospholipases et estérases, renfermées dans un mélange (150 g) par parties égales de pancréatines délipidées de porc et de boeuf,
on substitue à la vitamine E du ditertiobutylhydroxytoluène, antioxydant de synthèse connu sous le nom de BHT (100 g).
Dans cet exemple 3, les constituants de la formule ont été choisis en vue d'une utilisation éventuelle du complexe lipoprotéique pour un usage externe en dermatologie et cosmétologie.
Données toxicologiques
Le sélénium (Se), sous les formes énoncées, est le seul composé rentrant dans la composition du médicament objet de l'invention, pouvant être considéré, isolément, comme susceptible d'être toxique à certaines doses. C'est en effet par les intoxications aiguës et chroniques dues à cet oligo-élément, qu'ont débuté les études sur le Se en biologie. Aujourd'hui le Se est considéré comme étant un oligoélément parmi les plus importants (OMS, Publication offset, No 5, 1974). Or, des carences ou insuffisances d'apports alimentaires sont possibles, compte tenu de son inégale répartition dans les aliments, de ses taux variables et des besoins relatifs, fonction des déperditions et des apports en vitamine E et AGPLC.
La carence en Se peut être détectée par son dosage dans le sang, où son taux est de l'ordre de 0,05-0,1 mcg/ml, ou par détermination de l'activité de la peroxydase du glytathion dans les hématies ou le sang total, cette enzyme ayant le Se comme cofacteur.
Les besoins en Se, pour l'homme, sont encore assez imprécis. Par extrapolation des données connues en alimentation animale, on les estime à 0,1-0,2 ppm de la matière sèche de la ration alimentaire, soit à 2-3 mcg/kg corporel/d. La limite de tolérance (dose toxique à long terme) serait de 2 à 5 ppm de la matière sèche de la ration et le niveau toxique de 7 à 15 ppm. La toxicologie aiguë du sélénite et du sélénate de sodium a été déterminée par voie orale, intraveineuse, sous-cutanée, chez une dizaine d'espèces animales. Il existe de grandes différences entre les espèces. Ainsi, la dose minimale létale par voie orale varie de 2,2 à 15 mg/kg corporel et la dose létale-50 de 3 à 5 mg/kg corporel pour le rat.
L'élimination du Se s'effectue par les urines, les fèces et l'air expiré. C'est ainsi que le cycle, très toxique pour l'homme, du méthylmercure peut être détoxifié par les sels de Se, car il se forme du diméthylsélénium qui est exhalé.
Sur la base de son contenu en Se (0,40 mg/g de médicament prêt à l'emploi), I'index thérapeutique pour l'homme du médicament objet de l'invention, c'est-à-dire le rapport dose efficace/dose toxique, peut être estimé être de 1 à 100.
Données pharmacologiques
De très nombreux travaux effectués depuis 20 ans sur la pharmacologie des AGPLC, vitamine E et Se et de leurs interrelations, on peut retenir, pour l'essentiel, que le couple synergique vitamine E/Se, joue un rôle capital dans la régulation du métabolisme glucidolipidique, le contrôle de l'oxydation des AGPLC et les flux ioniques membranaires, notamment des ions calcium. La perturbation de ces flux peut aboutir à l'asthénie, voire même à la dystrophie, musculaires. L'apport d'acides gras essentiels (qui ne sont bien assimilés qu'en présence de vitamine E, de lipase pancréatique et de sels biliaires ou autres émulsifiants), ne suffit pas à restaurer le tonus musculaire. L'apport de Se est également indispensable.
L'impact musculaire et hépatique des carences en vitamine E et/ou Se, a été tout spécialement étudié sur le rat, le poulet, I'agneau, le veau et le porc. La carence en Se aboutit à des dystrophies musculaires avec élévation dans le sang des enzymes caractéristiques de la physiologie du muscle, comme conséquence probable de la rupture des membranes des lysosomes et autres membranes cellulaires. Ces enzymes sont: la transaminase glutamique-oxaloacétique (SGOT); la transaminase glutamique-pyruvique (SGPT) et la créatine-phosphokinase (CP).
La notion de carence relative ressort d'essais sur l'animal qui ont démontré que 0,1 ppm de Se (base sèche de la ration) suffisait en présence de 100 ppm de vitamine E, tandis qu'il fallait 0,2 ppm de Se en présence de 10 ppm de vitamine E. De cette carence relative en
Se, il peut aussi résulter une accélération du catabolisme du glucose avec élévation du rapport lactate/pyruvate dans le muscle et le sérum sanguin. En cas de glycogénolyse très rapide, telle qu'elle peut survenir chez le porc, il peut y avoir élévation de la température musculaire et corporelle. C'est le syndrome dit hyperthermie maligne, reproductible expérimentalement chez les animaux prédisposés par simple narcose à l'halothane (fluothane). Plus précisément, cet anesthésique favorise la libération des ions calcium dans le muscle, en même temps qu'il y active l'ATPase et élève la CP sérique.
Or, l'halothane est également connu pour provoquer des lésions hépatiques lorsqu'il se trouve être déshalogéné par les enzymes qui détoxifient les drogues et dont on peut évaluer l'activité à travers le dosage du Cytochrome-P450. On s'explique ainsi qu'une carence relative en Se puisse fragiliser les membranes cellulaires du muscle et du foie et conduire à la dystrophie musculaire et/ou à la nécrose hépatique. A titre d'exemple, I'étude pharmacologique du médicament objet de l'invention a été réalisée sur des porcelets Landrace belge issus de mères supposées être en état de subcarence en vitamine E/Se.
Le pourcentage cumulé de mortalité par dystrophie musculaire et nécrose hépatique atteignait 50 à 80% à l'âge de 2 mois. Le traitement classique consistant en une injection intramusculaire de 5 UI de vitamine E et 0,05 mg de Se par kilo corporel ne réussissait pas à sauver plus de la moitié des porcelets. Par contre, le médicament objet de l'invention, administré quotidiennement par voie orale à la dose de 0,05% de l'aliment (base sèche), a réduit le taux cumulé de mortalité sus-visé à moins de 2%.
Essais cliniques chez l'homme
Le médicament objet de l'invention correspondant à l'exemple de préparation No 1, a été administré à 25 sujets (8 hommes et 17 femmes) âgés de 30 à 70 ans et plus. La posologie était de 500 mg/d (répartis en 5 gélules) et la durée du traitement de 8 d pour 5 sujets; de 2 séries de 8 d, entrecoupées du même laps de temps pour 17 sujets; de 3 séries de 3 d entrecoupées d'intervalles de 5 d sans médicament pour 2 sujets, enfin de 5 séries de 8 d entrecoupées de 8 d sans médicament pour un sujet qui a ainsi reçu le médicament pendant 2 1/2 mois. Ce dernier sujet présentait de l'asthénie avec hypothyroïdie, hyperlipémie et arthrose douloureuse. Du point de vue clinique, on a noté un effet tonique général du médicament et analgésique sur les douleurs articulaires.
Du point de vue biologique, le cholestérol sérique est tombé de 3,80 g/l à 2,25 g/l et est resté à ce taux pendant les 2 1/2 mois de cure avec le médicament comme seul hypolipémiant. Après traitement, les taux des transaminases étaient particulièrement bas: 8 mU/ml pour la SGOT et I mU/ml pour la SGPT.
Aucun des sujets ne présentait de transaminases sériques anormalement élevées au départ mais, à chaque fois qu'elles ont été dosées, on a constaté des niveaux très bas en fin de traitement.
Exemples pour 3 sujets chez qui, par ailleurs, les résultats du traitement ont été bons sur le syndrome dépressif:
EMI3.1
<tb> <SEP> SGOT <SEP> (mU/ml)
<tb> <SEP> Avant <SEP> traitement <SEP> Après <SEP> traitement
<tb> Sujet014 <SEP> 19 <SEP> 4
<tb> SujetNOU) <SEP> 4 <SEP> 2
<tb> Sujet024 <SEP> 16 <SEP> 6
<tb> <SEP> SGPT <SEP> (mU/ml)
<tb> <SEP> Avant <SEP> traitement <SEP> Après <SEP> traitement
<tb> SujetN014 <SEP> 13 <SEP> 1
<tb> Sujet <SEP> N" <SEP> 20 <SEP> 2 <SEP> 1
<tb> SujetN024 <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP>
<tb>
Les diagnostics pour les 25 sujets qui ont reçu le médicament étaient les suivants:
:
Essai de tolérance sur un sujet en bonne santé 1 sujet
Dépression d'involution 2 sujets
Syndrome asthéno-dépressif 7 sujets
Syndrome asthéno-dépressif plus arthrose douloureuse 7 sujets Hypothyroldie, asthénie et arthrose 2 sujets
Diabète gras tardif 5 sujets
Anxiété et hyperlipémie I sujet
Au total, on a enregistré, sur 21 patients revus:
Résultats très bons: 3
Résultats bons: 9
Résultats assez bons: 4
Résultats douteux: 2
Résultats nuls: 2
Intolérance majeure: 1 (érythème généralisé et oedème de
Quincke).
Dans ce dernier cas, il s'agissait d'une femme obèse, hyperlipémique et hypothyroîdienne de 60 ans, déjà connue pour être allergique à l'aspirine, aux poussières et aux moisissures.
En ce qui concerne les résultats dans le diabète gras tardif, on peut citer le cas suivant (observation No 13):
Chute du cholestérol sérique: de 3,70 g/l à 3,10 g
Chute des lipides totaux: de 12,60 g/l à 8,50 g
Chute des triglycérides: de 4,60 g/l à 1,43 g (en un mois).
Sur un plan clinique général, on a pu noter l'effet tonique du médicament, ainsi que des effets anti-inflammatoires, antidépresseurs et eutrophiques. On peut aussi compter sur des effets hépatotropes, antiathéromateux et vasculotropes.
Le complexe lipoprotéique de l'invention est applicable à la réale sation de médicaments à usage interne ou externe pour l'homme et les animaux, ainsi que de produits cosmétologiques.
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CLAIMS
1. Lipoprotein complex normalizing the effectiveness of the vitamin
E and synthetic antioxidants, characterized in that it contains the following components:
a synthetic antioxidant,
a selenium compound,
at least one lipolytic enzyme with affinity for lipid-water interfaces,
polar lipids.
2. Complex according to claim 1, characterized in that the synthetic antioxidant consists of vitamin E.
3. Complex according to claim 1, characterized in that it contains at least one apolar lipid.
4. Complex according to claim 1, characterized in that it contains globin.
5. Complex according to claim 1, characterized in that it contains at least one derivative with phytyl chain.
6. Method for the preparation of the lipoprotein complex according to one of claims 1 to 5, characterized in that it is obtained by association at the level of a structured lipid-water interface: a synthetic antioxidant; a selenium compound; at least one lipolytic enzyme with affinity for the lipid-water and polar lipid interfaces.
The invention relates to a lipoprotein complex normalizing the effectiveness of vitamin E and synthetic antioxidants.
The complex according to the invention is characterized in that it contains the following components:
a synthetic antioxidant,
a selenium compound,
at least one lipolytic enzyme with affinity for lipid-water interfaces,
- polar lipids.
For the past ten years, great hopes have been placed on the therapeutic use of vitamin E and tocopherol derivatives, in particular in the prevention and treatment of senescence, cardiovascular diseases and cancer.
These hopes have been dashed, in part because vitamin E may be poorly absorbed from the gut, or its destruction may be accelerated by oxidation. In the latter case, not only does it lose its antioxidant properties, but it can produce opposite effects. However, this risk is currently increased, due to the popularity of the prescription, in dietetics, hyperlipemias, of fatty foods containing a high percentage of polyunsaturated fatty acids.
It is well known that long chain polyunsaturated fatty acids (AGPLC) are major constituents of phospholipids and sterids of cell membranes, as well as serum lipoproteins.
The best-studied AGPLCs are linoleic acid, on the one hand, and arachidonic acid, on the other. The body can synthesize the latter from linoleic acid, the presence of which in food is compulsory, hence its former name of vitamin F and its current name of essential fatty acid (EFA).
It is also known that AGPLCs can give rise, in vitro as well as in vi vo, to the formation of hydroperoxides and toxic substances (malonaldehyde, for example), these reactions being able to be initiated and self-sustained by unstable free radicals, and it is recognized that the antioxidant role of vitamin E would consist in trapping said free radicals.
The vitamin E / selenium combination is also known in veterinary prophylaxis and therapy to be more effective than vitamin E alone. Selenium, which is an essential trace element, is said to act as a coenzyme of glutathione peroxidase (reduced form), the latter being possibly an acceptor of peroxidic oxygen.
The good intestinal absorption of AGPLC (linoleic and arachidonic acids) is therefore of major importance, as well as that of vitamin E. This absorption takes place at the same time as that of edible fats and therefore requires presence in the intestine bile salts and pancreatic lipase in sufficient quantities. However, a selenium deficiency leads to a drying up of the pancreatic lipase secretion, therefore a malabsorption of
AGPLC and vitamin E. This results in serious disorders at the level of the lipid membrane structures, resulting, in particular, in lipid overload and necrosis of the liver, hyperet dyslipemias and waxy degenerations of the skeletal muscles or the myocardium.
Certain modifications in the fatty acid composition of the various lipid fractions of the blood plasma and of the tissues, as well as the turnover of fatty acids, accompany the aforementioned conditions. This is mainly the case for arachidonic acid. However, the plasma or tissue lipid fractions which are richest in this acid are also rich in vitamin E and selenium.
It was in 1957, for the first time, that Schwarz and Folz (J.
Am. Chem. Soc. , 79, 3292-3293) demonstrated the role of selenium in the prevention of necrotic degeneration of the liver of rats. Since then, muscular and hepatic affections following a selenium deficiency have been observed in other animal species: pigs, calves, chickens, lambs. The prevention and the therapy of said affections consist in the administration to animals of selenium, either in mineral form - selenite or sodium selenate - or in organic form - selenoamino acids free or included in polypeptide structures. In this latter organic form, the rate of incorporation of selenium into plasma lipoproteins is higher, as is its rate of tissue retention (muscles, liver, kidney, pancreas).
However, in addition to these water-soluble compounds of selenium, it is easy to identify lipid-soluble compounds of selenium, especially in cell and subcellular membranes (membranes of the endoplasmic reticulum and cell organelles). However, selenium, like vitamin E, being strongly linked to these membrane structures, there is the problem of the stability of vitamin E and therefore of the AGPLC, at the level of more or less hydrophobic interfaces. In fact, the high affinity of lipolytic enzymes for such interfaces means that they can still be active in poorly hydrated environments and release AGPLCs there, particularly threatened by peroxidation by free radicals in such environments.
The invention consists in the discovery that the AGPLCs and vitamin E are not the seat of destructive radical reactions, for themselves and for other cellular structures, in particular at the level of the lipid-water interfaces, provided that they are protected by a selenium compound (selenite, selenate, seleniated amino acids, in particular) and one or more lipolytic enzymes having affinity for these interfaces.
In this regard, it should be recalled that non-specific lipolytic enzymes are hydrolases which can be classified in a hierarchical order ranging from the lysophospholipase of the brain which attacks in aqueous phase a monomolecular substrate (= true esterase), to the pancreatic lipase which acts on the surface. oily droplets completely insoluble in water (= true lipase). Intermediate hydrolases act at relatively hydrated interfaces like those made up of micelles. Among these hydrolases, mention may be made of: cholesterol esterase, monoglycerides hydrolases, certain phospholipases and galactolipases, as well as lipoprotein lipase.
The hydrolases contracting the strongest bonds with polar lipids and being more specifically claimed are:
- the lipolytic enzymes of the digestive glands: glycerolesterhydrolase (EC 3.I.I.3); phosphoglyceride 2 and I-acylhydrolases (EC 3.I.I.4) and sterolester hydrolase (EC 3.1.1.13).
- the glycerolester hydrolases of molds belonging to
genera Mucor. Rhizopus, Penicillium. Aspergillus, Geotrichum, as well as to higher plants: wheat germ, rice bran, castor, olive.
The aggregation of these hydrolases with polar lipids takes place in the aqueous phase. The temperatures to be observed are given in the examples below illustrating the invention. The molecular association of proteins endowed with lipolytic activity is carried out by mechanical agitation with two to ten times their weight of polar lipids. The latter are represented by phospholipids (phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine) or esters of fatty acids (with 16-20 carbon atoms) and glycerol (monoglycerides) or sorbitol (tweens) or sucrose (sucroglycerides) or other sugars (glucolipids).
The a-tocopherol (vitamin E) or its derivatives included in the drug composition benefit from being incorporated initially in the lipid phase, just as the selenium compounds (mineral salts or amino acids selected) benefit from being incorporated into a first time to the above-mentioned aqueous phase.
The amounts of vitamin E and selenium to be incorporated are calculated on the weight of the finished medicinal composition ready for clinical use. The amount of vitamin E thus calculated is between 20 and 30 mg (22 and 23 IU) per gram and that of selenium (Se = 78.96 g) is 0.40 mg per gram of ready-to-use medicine.
It results from intermolecular associations between polar lipids and lipolytic enzymes the formation of lipoprotein molecular complexes sufficiently stable to be dehydrated by cryodessiccation.
After spraying, the freeze-dried product is divided into capsules, which can be gastro-resistant.
A second mode of preparation of the medicament consists in incorporating the lipoprotein complex obtained above (vitamin E, selenium compound, polar lipids and lipolytic enzymes) a, non-polar lipids to protect them from radical oxidation reactions which can occur during '' severe dehydration. Apolar lipids are understood to mean: neutral triglycerides; cholesterol and its fatty acid esters from C16 to C20; long chain free fatty acids when they are not ionizable. The weight of apolar lipids which can be emulsified with the above-mentioned lipoprotein complex is equal to 0.5-t times the weight of this complex.
A third mode of preparation of the medicament consists in incorporating therein, in addition to apolar lipids, or in replacing them with globin (side chain of hemoglobins) and / or phytol (side chain of chlorophylls) or derivatives with phytyl chain.
The following examples illustrate the invention:
Example 1:
The selenium compound is sodium selenate (Na2SeO4IO H2O); vitamin E is a-tocopherol succinate grading 250 IU / g; the polar lipid is a phosphatidylcholine (a, dimyristoyllecithin); the apolar lipid is a triglyceride (trimyristin) and the hydrolase is the glycerol ester hydrolase (EC 3.1.1.3) provided by a purified pancreatic extract of pig containing colipase and titrating 150,000 IU / g.
Procedure: We operate in a thermostatically controlled reactor equipped with an agitator. The selenate (2 g) is dissolved in 2100 ml of distilled water, the lecithin (350 g) is introduced with moderate but constant stirring, and the temperature is brought to 70-80 C for the formation of a homogeneous gel .
Vitamin E (100 g) is dissolved separately in the triglyceride (350 g) which is heated to 70-80 "C and introduced into the reactor to produce a homogeneous emulsion with lecithin. It is then allowed to cool to 30 C .
At the same time, 900 ml of distilled water cooled to +2 "C were added to a mixer, in which the equivalent of 10 mg of calcium in the form of calcium chloride and 5 g of an equimolar phosphate buffer mixture (PO4H2K) are dissolved. , PO4HNa2) of pH 7.5 The pancreatic extract (150 g) is added to the mixer with stirring, then the suspension obtained is introduced into the reactor also with stirring.
When the emulsion obtained is homogeneous, the pH is checked, which must not be less than 6.5; otherwise, it is adjusted between 6.5 and 7.0 with the phosphate-based buffer.
Between 10 and 20 min from the moment of the introduction of the pancreatic extract into the reactor, the content thereof is cooled to a temperature of + 2 ° C. and it is kept at this temperature for approximately 24 h for to obtain the structure of the lipid-water interface.
The lipoprotein complex obtained is homogenized again, then frozen and dehydrated by cryodessiccation to a residual water content of between 3 and 5%.
After spraying and sieving, the powder obtained is divided into capsules containing 500 mg of dehydrated lipoprotein complex.
In this example 1, the constituents of the lipid phase were chosen taking into account, on the one hand, what is known of the braking effect of medium chain triglycerides (notably trimyristine) on the development of certain cancers, on the other hand, the results of a survey establishing a negative relationship between the selenium blood level and human mortality due to cancer (Nutrition
Reviews, 1970, 28, 3, 75) and more generally of the protective role of antioxidants vis-à-vis cocarcinogenetic agents (Canad. Med. Ass. J., 1969, 100, 682).
Example 2:
The only differences compared to Example 1 relate to the following points:
- The lipid phase consists, on the one hand, of L-a-lecithin of egg yolk of grade I (350 g) and, on the other hand, of monostearate / glycerol palmitate (200 g).
- EC 3.1.1.3 lipase is of fungal origin (150 g); it titer 200,000 IU / g and add pancreatic extract of beef (150 g) as a source of colipase.
Example 3:
The only differences compared to Example 1 relate to the following points:
the lipid phase consists, on the one hand, of soy fluid lecithin (350 g) containing 80% of phospholipids and, on the other hand, of cholesterol palmitate (350 g),
hydrolases are lipases, phospholipases and esterases, contained in a mixture (150 g) in equal parts of delipidated pancreatins from pork and beef,
Vitamin E is substituted for ditertiobutylhydroxytoluene, a synthetic antioxidant known as BHT (100 g).
In this example 3, the constituents of the formula were chosen with a view to possible use of the lipoprotein complex for external use in dermatology and cosmetology.
Toxicological data
Selenium (Se), in the stated forms, is the only compound included in the composition of the medicament subject of the invention, which can be considered, in isolation, as likely to be toxic at certain doses. It is indeed by acute and chronic intoxications due to this trace element, that studies on Se in biology began. Today Se is considered to be one of the most important trace elements (WHO, Publication offset, No 5, 1974). However, deficiencies or insufficiencies of food intake are possible, given its unequal distribution in food, its variable rates and relative needs, depending on the losses and intakes of vitamin E and AGPLC.
Se deficiency can be detected by its assay in the blood, where its level is of the order of 0.05-0.1 mcg / ml, or by determination of the activity of glytathione peroxidase in red blood cells or whole blood, this enzyme having Se as a cofactor.
Se needs for humans are still rather imprecise. By extrapolation of the known data in animal nutrition, they are estimated at 0.1-0.2 ppm of the dry matter of the food ration, that is to say 2-3 mcg / kg body / d. The tolerance limit (long-term toxic dose) would be 2 to 5 ppm of the dry matter in the ration and the toxic level of 7 to 15 ppm. The acute toxicology of selenite and sodium selenate has been determined orally, intravenously, subcutaneously, in a dozen animal species. There are big differences between the species. Thus, the minimum lethal oral dose varies from 2.2 to 15 mg / kg body and the lethal-50 dose from 3 to 5 mg / kg body for the rat.
The elimination of Se takes place via urine, faeces and expired air. Thus, the very toxic human cycle of methylmercury can be detoxified by the salts of Se, because dimethylselenium is formed which is exhaled.
On the basis of its Se content (0.40 mg / g of ready-to-use drug), the therapeutic index for humans of the drug which is the subject of the invention, that is to say the dose ratio effective / toxic dose, can be estimated to be 1 to 100.
Pharmacological data
Numerous studies carried out over the past 20 years on the pharmacology of AGPLCs, vitamin E and Se and their interrelationships, we can note, essentially, that the synergistic couple vitamin E / Se plays a capital role in the regulation of metabolism glucidolipid, the control of the oxidation of AGPLC and the membrane ion fluxes, in particular calcium ions. The disruption of these flows can lead to muscle weakness, or even dystrophy. The contribution of essential fatty acids (which are only assimilated in the presence of vitamin E, pancreatic lipase and bile salts or other emulsifiers), is not enough to restore muscle tone. The contribution of Se is also essential.
The muscular and hepatic impact of vitamin E and / or Se deficiencies has been specially studied in rats, chicken, lamb, veal and pork. Se deficiency results in muscular dystrophies with elevation in the blood of enzymes characteristic of muscle physiology, as a likely consequence of rupture of the membranes of lysosomes and other cell membranes. These enzymes are: glutamic-oxaloacetic transaminase (SGOT); glutamic-pyruvic transaminase (SGPT) and creatine-phosphokinase (CP).
The notion of relative deficiency has emerged from animal tests which have shown that 0.1 ppm of Se (dry basis of the ration) was sufficient in the presence of 100 ppm of vitamin E, while 0.2 ppm of Se in the presence of 10 ppm of vitamin E. From this relative deficiency in
Se, it can also result from an acceleration of the catabolism of glucose with elevation of the lactate / pyruvate ratio in muscle and blood serum. In the event of very rapid glycogenolysis, as it can occur in pigs, there may be an increase in muscle and body temperature. This is the so-called malignant hyperthermia syndrome, reproducible experimentally in animals predisposed by simple halothane narcosis (fluothane). More specifically, this anesthetic promotes the release of calcium ions in the muscle, at the same time that it activates ATPase and elevates serum CP.
However, halothane is also known to cause liver damage when it is found to be dehalogenated by the enzymes which detoxify drugs and whose activity can be evaluated through the assay of Cytochrome-P450. This explains why a relative deficiency in Se can weaken the cell membranes of the muscle and the liver and lead to muscular dystrophy and / or hepatic necrosis. By way of example, the pharmacological study of the medicament which is the subject of the invention was carried out on Belgian Landrace piglets from mothers supposed to be in a state of vitamin E / Se deficiency.
The cumulative percentage of mortality from muscular dystrophy and hepatic necrosis reached 50 to 80% at the age of 2 months. The conventional treatment consisting of an intramuscular injection of 5 IU of vitamin E and 0.05 mg of Se per kilo body failed to save more than half of the piglets. On the other hand, the drug which is the subject of the invention, administered daily orally at a dose of 0.05% of the food (dry base), has reduced the above-mentioned cumulative mortality rate to less than 2%.
Human clinical trials
The drug which is the subject of the invention, corresponding to preparation example No 1, was administered to 25 subjects (8 men and 17 women) aged 30 to 70 years and over. The dosage was 500 mg / d (divided into 5 capsules) and the duration of treatment was 8 d for 5 subjects; 2 sets of 8 d, interspersed with the same period of time for 17 subjects; 3 sets of 3 d interspersed with intervals of 5 d without medication for 2 subjects, finally 5 sets of 8 d interspersed with 8 d without medication for a subject who thus received the medication for 2 1/2 months. The latter subject presented with asthenia with hypothyroidism, hyperlipemia and painful arthritis. From a clinical point of view, there has been a general tonic effect of the drug and analgesic on joint pain.
From a biological point of view, serum cholesterol fell from 3.80 g / l to 2.25 g / l and remained at this rate during the 2 1/2 months of treatment with the drug as the only lipid-lowering agent. After treatment, the transaminase levels were particularly low: 8 mU / ml for SGOT and I mU / ml for SGPT.
None of the subjects presented abnormally high serum transaminases at the start but, each time they were measured, very low levels were observed at the end of the treatment.
Examples for 3 subjects in whom, moreover, the results of the treatment were good on the depressive syndrome:
EMI3.1
<tb> <SEP> SGOT <SEP> (mU / ml)
<tb> <SEP> Before <SEP> treatment <SEP> After <SEP> treatment
<tb> Subject014 <SEP> 19 <SEP> 4
<tb> SubjectNOU) <SEP> 4 <SEP> 2
<tb> Subject024 <SEP> 16 <SEP> 6
<tb> <SEP> SGPT <SEP> (mU / ml)
<tb> <SEP> Before <SEP> treatment <SEP> After <SEP> treatment
<tb> SubjectN014 <SEP> 13 <SEP> 1
<tb> Subject <SEP> N "<SEP> 20 <SEP> 2 <SEP> 1
<tb> SubjectN024 <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP>
<tb>
The diagnoses for the 25 subjects who received the drug were as follows:
:
Tolerance test on a healthy subject 1 subject
Involution depression 2 subjects
Astheno-depressive syndrome 7 subjects
Astheno-depressive syndrome plus painful arthritis 7 subjects Hypothyroldia, asthenia and arthritis 2 subjects
Late fatty diabetes 5 subjects
Anxiety and hyperlipemia I subject
A total of 21 patients reviewed were recorded:
Very good results: 3
Good results: 9
Fairly good results: 4
Doubtful results: 2
Drawn results: 2
Major intolerance: 1 (generalized erythema and edema of
Quincke).
In the latter case, it was an obese, hyperlipemic and hypothyroid woman aged 60, already known to be allergic to aspirin, dust and mold.
Regarding the results in late fatty diabetes, we can cite the following case (observation No 13):
Serum cholesterol drop: from 3.70 g / l to 3.10 g
Total fat drop: from 12.60 g / l to 8.50 g
Triglyceride drop: from 4.60 g / l to 1.43 g (in one month).
On a general clinical level, the tonic effect of the drug has been noted, as well as anti-inflammatory, antidepressant and eutrophic effects. We can also count on hepatotropic, anti-atheromatous and vasculotropic effects.
The lipoprotein complex of the invention is applicable to the production of medicaments for internal or external use for humans and animals, as well as cosmetic products.