CH634550A5

CH634550A5 - ANALOGS OF SOMATOSTATIN.

Info

Publication number: CH634550A5
Application number: CH1052778A
Authority: CH
Inventors: Dimitrios Sarantakis
Original assignee: American Home Prod
Priority date: 1977-12-13
Filing date: 1978-10-10
Publication date: 1983-02-15
Also published as: FR2411827A1; SE7810156L; IT7828705A0; JPS5484573A; FR2411827B1; GB2010280A; GB2010280B; BE871051A; NL7810197A; DE2843737A1; IT1099705B; DK432878A; LU80335A1

Description

La présente invention est relative à de nouveaux analogues de somatostatine. The present invention relates to new somatostatin analogs.

On sait que le facteur inhibant la libération de somatotropine (SRIF), de type cyclique, que l'on connaît sous le nom de somatosta-tine, présente, suivant Brazeau et coll., «Science», 179,77 (1973), la structure suivante: It is known that the factor inhibiting the release of somatotropin (SRIF), of cyclic type, which is known under the name of somatostatin, has, according to Brazeau et al., "Science", 179,77 (1973), the following structure:

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

I i I i

S S S S

tous les aminoacides étant de la configuration naturelle ou L. all the amino acids being of the natural configuration or L.

On a décrit dans la littérature plusieurs procédés de synthèse de la somatostatine, notamment le procédé en phase solide de Rivier, « J. Am. Chem. Soc.», 96,2986 (1974), et les méthodes à dissolution de Sarantakis et coll., «Biochemical Biophysical Research Communications», 54,234 (1973), et d'Immer et coll., «Helv. Chim. Acta», 57, 730 (1974). Il y a également de nombreuses recherches en cours sur les peptides, dont le but est d'améliorer l'activité pharmacologique de la somatostatine en modifiant sa structure par voie synthétique, s La présente invention concerne de nouveaux analogues de somatostatine, dans lesquels les restes Ala1-Gly2 peuvent exister ou être remplacés par H, Gly, Ala-Ala, ou Gly-Gly-Gly; le reste L-Trps est remplacé par D-Trp8, et les restes L-Lys4-L-Asns sont remplacés soit par Gly soit par un reste dérivant d'un D-aminoacide particulier, io Le remplacement du reste L-Trp dans la somatostatine par D-Trp! a été décrit par J. Rivier et coll., «Biochemical Biophysical Research Communications», 65,746 (1975). Several methods of synthesis of somatostatin have been described in the literature, in particular the solid phase method of Rivier, "J. Am. Chem. Soc. ", 96.2986 (1974), and the dissolution methods of Sarantakis et al.," Biochemical Biophysical Research Communications ", 54.234 (1973), and Immer et al.," Helv. Chim. Acta ”, 57, 730 (1974). There is also a great deal of research in progress on peptides, the aim of which is to improve the pharmacological activity of somatostatin by modifying its structure synthetically. The present invention relates to new somatostatin analogs, in which the residues Ala1-Gly2 can exist or be replaced by H, Gly, Ala-Ala, or Gly-Gly-Gly; the rest L-Trps is replaced by D-Trp8, and the rests L-Lys4-L-Asns are replaced either by Gly or by a residue deriving from a particular D-amino acid, io The replacement of the rest L-Trp in the somatostatin by D-Trp! has been described by J. Rivier et al., "Biochemical Biophysical Research Communications", 65,746 (1975).

Les analogues de somatostatine, dans lesquels les restes L-Lys4-L-Asn5 sont remplacés par divers restes aminoacides, ont été décrits 15 dans le brevet belge N° 839405. Somatostatin analogs, in which the L-Lys4-L-Asn5 residues are replaced by various amino acid residues, have been described in Belgian Patent No. 839405.

L'invention concerne des composés chimiques thérapeutiquement actifs choisis dans la classe répondant à la formule: The invention relates to therapeutically active chemical compounds chosen from the class corresponding to the formula:

SA HER

I I

20 X1-L-Cys-X2-X3-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys- 20 X1-L-Cys-X2-X3-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-

L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH

I I

SA HER

dans laquelle A représente l'hydrogène ou bien les deux groupes A 25 forment une liaison directe entre les atomes de soufre; X1 représente H, Gly, L-Ala-Gly, L-Ala-D-Ala, ou Gly-Gly-Gly; X2 et X3, qui peuvent être identiques ou différents, sont choisis parmi Gly, D-Leu, D-Phe, D-Tyr, D-Trp, D-Met, D-His, D-Arg, D-Lys, D-Ser, D-Asp ou D-Asn, à la condition que X2 et X3 ne soient pas simultanément le 30 reste Gly, l'invention englobant également les sels d'addition acceptables en pharmacologie des composés ci-dessus. in which A represents hydrogen or the two groups A 25 form a direct bond between the sulfur atoms; X1 represents H, Gly, L-Ala-Gly, L-Ala-D-Ala, or Gly-Gly-Gly; X2 and X3, which may be the same or different, are chosen from Gly, D-Leu, D-Phe, D-Tyr, D-Trp, D-Met, D-His, D-Arg, D-Lys, D- Ser, D-Asp or D-Asn, provided that X2 and X3 are not simultaneously the Gly residue, the invention also encompasses pharmacologically acceptable addition salts of the above compounds.

Les composés suivant la présente invention sont, de façon inhérente, des matières solides de couleur blanche à tan clair, ils sont pratiquement insolubles dans le chloroforme, le benzène, etc., mais ils 35 montrent une solubilité dans l'eau et dans des solutions acides aqueuses, par exemple des solutions aqueuses d'acide chlorhydrique et d'acide acétique. Les composés de l'invention ne présentent pas de point de fusion nettement défini et ils peuvent être purifiés, par exemple, par des voies chromatographiques. Une hydrolyse des composés 40 suivant l'invention, par exemple dans de l'acide méthanesulfonique 4N, permet la détermination de la teneur en aminoacides, qui est compatible avec les structures mentionnées ci-dessus. The compounds according to the present invention are inherently white to light tan solids, they are practically insoluble in chloroform, benzene, etc., but they show solubility in water and in solutions aqueous acids, for example aqueous solutions of hydrochloric acid and acetic acid. The compounds of the invention do not have a clearly defined melting point and they can be purified, for example, by chromatographic routes. Hydrolysis of the compounds 40 according to the invention, for example in 4N methanesulfonic acid, makes it possible to determine the amino acid content, which is compatible with the structures mentioned above.

Les composés suivant l'invention et les compositions en contenant présentent la caractéristique d'inhiber la libération des hormo-45 nés somatotropine, glucagon et insuline, ce qui est mis en évidence par des méthodes d'essai pharmacologiques classiques. The compounds according to the invention and the compositions containing them have the characteristic of inhibiting the release of the hormone-45 somatotropin, glucagon and insulin, which is demonstrated by standard pharmacological test methods.

Suivant un aspect plus particulier, l'invention englobe des composés chimiques répondant à la formule : According to a more particular aspect, the invention includes chemical compounds corresponding to the formula:

SA HER

50 I 50 I

H-L-Cys-X2-X3-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH H-L-Cys-X2-X3-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH

I I

SA HER

55 dans laquelle A représente l'hydrogène ou bien les deux groupes A forment une liaison directe entre les atomes de soufre; X2 et X3, qui peuvent être identiques ou différents, sont choisis parmi Gly, D-Leu, D-Phe, D-Tyr, D-Trp, D-Met, D-His, D-Arg, D-Lys, D-Ser, D-Asp ou D-Asn, à la condition que X2 et X3 ne représentent pas simultané-60 ment le reste Gly, l'invention englobant également les sels d'addition acceptables en pharmacologie de ces composés. 55 in which A represents hydrogen or the two groups A form a direct bond between the sulfur atoms; X2 and X3, which may be the same or different, are chosen from Gly, D-Leu, D-Phe, D-Tyr, D-Trp, D-Met, D-His, D-Arg, D-Lys, D- Ser, D-Asp or D-Asn, provided that X2 and X3 do not simultaneously represent the Gly residue, the invention also encompassing the pharmacologically acceptable addition salts of these compounds.

Suivant une forme de réalisation plus particulière, l'invention englobe également les composés chimiques répondant à la formule: According to a more particular embodiment, the invention also includes the chemical compounds corresponding to the formula:

SA HER

65 1 65 1

H-L-Cys-X4-X5-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH H-L-Cys-X4-X5-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH

I I

SA HER

3 3

634 550 634,550

dans laquelle A représente l'hydrogène ou bien les deux groupes A forment une liaison directe entre les atomes de soufre; X4 et X5, qui peuvent être identiques ou différents, sont choisis parmi D-Tyr, D-Trp, D-His ou D-Arg, l'invention englobant également les sels d'addition acceptables en pharmacologie de ces composés. in which A represents hydrogen or the two groups A form a direct bond between the sulfur atoms; X4 and X5, which may be the same or different, are chosen from D-Tyr, D-Trp, D-His or D-Arg, the invention also encompassing the addition salts acceptable in pharmacology of these compounds.

L'invention englobe plus particulièrement encore le composé chimique répondant à la formule: The invention more particularly still encompasses the chemical compound corresponding to the formula:

H-L-Cys-D-Arg-D-Tyr-L-Phe-L-Phe-D-Trp- H-L-Cys-D-Arg-D-Tyr-L-Phe-L-Phe-D-Trp-

I I

S S S S

I I

L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH

L'invention englobe également de façon plus particulière le composé chimique répondant à la formule: The invention also more particularly includes the chemical compound corresponding to the formula:

H-L-Cys-D-Ty r-D-T rp-L-Phe-L-Phe-D-T rp- H-L-Cys-D-Ty r-D-T rp-L-Phe-L-Phe-D-T rp-

I I

S S S S

I I

L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH

L'invention englobe également le composé chimique plus particulier répondant à la formule: The invention also includes the more specific chemical compound corresponding to the formula:

H-L-Cys-D-His-D-Tyr-L-Phe-L-Phe-D-Trp- H-L-Cys-D-His-D-Tyr-L-Phe-L-Phe-D-Trp-

I I

s S s s

I I

L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH

Les polypeptides finals produits et leurs intermédiaires nécessaires se préparent par la méthode en phase solide bien connue, telle que décrite, par exemple, par Merrifield, «J. Am. Chem. Soc.», 85, 2149 (1963). Dans l'application de ce procédé aux composés de l'invention, de la cystéine protégée en a-amino et en sulfhydryle est d'abord attachée à une résine de polystyrène chlorométhylée, avec ensuite séparation du groupe protecteur en a-amino par de l'acide trifluoro-acétique dans du chlorure de méthylène, par de l'acide trifluoro-acétique seul ou par du HCl dans du dioxanne. La suppression de la protection est réalisée à une température comprise entre environ 0°C et la température ambiante. On peut utiliser d'autres réactifs et conditions classiques de séparation pour l'enlèvement des groupes protecteurs particuliers en a-amino, de la façon décrite par Schröder E. Lubke, «The Peptides», 1,12-15 (Academic Press, 1965). Après séparation du groupe protecteur en a-amino, les aminoacides protégés désirés suivants sont combinés individuellement à la séquence supportée par la résine, et ce en série. A titre de variante, de petits fragments de peptide peuvent être préparés, par exemple par la méthode à dissolution, et ils peuvent être introduits dans le système réactif en phase solide dans l'ordre désiré. Chaque aminoacide protégé ou chaque séquence d'aminoacides protégés est introduit dans le système réactif en phase solide en un excès d'environ quatre fois. La combinaison est réalisée dans du diméthylformamide, du chlorure de méthylène ou un mélange de ces deux solvants. Le succès de chaque réaction de combinaison à chaque stade de la synthèse est déterminé par la réaction à la ninhydrine, telle que décrite par E. Kaiser et coll., «Analyt. Biochemical», 34, 595 (1970). Lorsqu'une combinaison incomplète se produit, la réaction est refaite avant que le groupe protecteur d'a-amino soit séparé pour l'introduction de l'aminoacide suivant ou de la séquence suivante d'aminoacides. The final polypeptides produced and their necessary intermediates are prepared by the well-known solid phase method, as described, for example, by Merrifield, "J. Am. Chem. Soc. ”, 85, 2149 (1963). In the application of this process to the compounds of the invention, cysteine protected in α-amino and in sulfhydryl is first attached to a chloromethylated polystyrene resin, then separation of the protective group into α-amino by l trifluoroacetic acid in methylene chloride, with trifluoroacetic acid alone or with HCl in dioxane. The protection is removed at a temperature between about 0 ° C and room temperature. Other conventional reagents and separation conditions can be used for the removal of particular protecting groups for α-amino, as described by Schröder E. Lubke, "The Peptides", 1,12-15 (Academic Press, 1965 ). After separation of the protecting group into a-amino, the following desired protected amino acids are combined individually with the sequence supported by the resin, and this in series. Alternatively, small peptide fragments can be prepared, for example by the dissolution method, and they can be introduced into the solid phase reagent system in the desired order. Each protected amino acid or each protected amino acid sequence is introduced into the solid phase reactive system in an excess of about four times. The combination is carried out in dimethylformamide, methylene chloride or a mixture of these two solvents. The success of each combination reaction at each stage of the synthesis is determined by the ninhydrin reaction, as described by E. Kaiser et al., "Analyt. Biochemical ", 34, 595 (1970). When an incomplete combination occurs, the reaction is repeated before the α-amino protecting group is separated for the introduction of the next amino acid or the next sequence of amino acids.

Les réactifs préférés de combinaison sont le 1-hydroxybenzo-triazole et le diisopropylcarbodiimide, mais d'autres réactifs intéressants de ce genre sont connus des spécialistes. Preferred combination reagents are 1-hydroxybenzo-triazole and diisopropylcarbodiimide, but other useful reagents of this kind are known to those skilled in the art.

Après que la séquence désirée d'aminoacides a été synthétisée, le Polypeptide est séparé du support de résine par traitement, par exemple, avec de l'acide fluorhydrique et de l'anisole, en vue d'obtenir le Polypeptide linéaire totalement débarrassé de ses protections. Le di-sulfure cyclique peut être produit par oxydation à l'air. After the desired amino acid sequence has been synthesized, the polypeptide is separated from the resin support by treatment, for example, with hydrofluoric acid and anisole, to obtain the linear polypeptide completely free of its protections. Cyclic di-sulfide can be produced by air oxidation.

Les sels d'addition non toxiques des polypeptides linéaires et cycliques sont produits par des procédés bien connus en pratique, au départ d'acides chlorhydrique, bromhydrique, sulfurique, phosphori-que, polyphosphorique, maléique, acétique, citrique, benzoïque, suc-cinique, malonique, ascorbique, etc. On préfère le sel d'acide acétique. The non-toxic addition salts of the linear and cyclic polypeptides are produced by methods well known in the art, starting from hydrochloric, hydrobromic, sulfuric, phosphoric, polyphosphoric, maleic, acetic, citric, benzoic, suc-kinic acids. , malonic, ascorbic, etc. The acetic acid salt is preferred.

Les groupes protecteurs utilisés dans la totalité de la synthèse en phase solide sont bien connus en pratique. Les groupes protecteurs d'a-amino, utilisés avec chaque aminoacide introduit dans la séquence du polypeptide final, sont: 1) des groupes protecteurs du type acyle, illustrés par: formyle, trifluoroacétyle, phtalyle, p-toluène-sulfonyle (tosyle), nitrophénylsulfényle, etc.; 2) des groupes protecteurs du type uréthanne aromatiques, illustrés par le benzyloxy-carbonyle et un benzyloxycarbonyle substitué, tel que le p-chloro-benzyloxycarbonyle et le p-nitrobenzyloxycarbonyle; 3) des groupes protecteurs du type uréthanne aliphatiques, illustrés par: tert.-butyloxycarbonyle, diisopropylmêthoxycarbonyle, isopropyloxy-carbonyle, allyloxycarbonyle, 2,2,2-trichloroéthoxycarbonyle, amyloxycarbonyle; 4) des groupes protecteurs du type uréthanne cycloalcoyliques, illustrés par: cyclopentyloxycarbonyle, adamantyloxycarbonyle, cyclohexyloxycarbonyle; 5) des groupes protecteurs du type thio-uréthanne, tels que le phénylthiocarbonyle; 6) des groupes protecteurs du type alcoyle, illustrés par le triphényl-méthyle (trityle); 7) des groupes de trialcoylsilane, tels que le triméthylsilane. Le groupe protecteur d'a-amino préféré est le tert.-butyloxycarbonyle. Les atomes d'azote de chaîne latérale de l'arginine, désignés par N«n, sont protégés par un groupe qui peut être un groupe nitro, tosyle, benzyloxycarbonyle, adamantyloxycarbonyle ou tert.-butyloxycarbonyle, avec une préférence pour le groupe tosyle. The protecting groups used throughout the solid phase synthesis are well known in the art. The protective groups of α-amino, used with each amino acid introduced into the sequence of the final polypeptide, are: 1) protective groups of the acyl type, illustrated by: formyl, trifluoroacetyl, phtalyl, p-toluene-sulfonyl (tosyl), nitrophenylsulfenyl, etc .; 2) protective groups of the aromatic urethane type, illustrated by benzyloxy-carbonyl and a substituted benzyloxycarbonyl, such as p-chloro-benzyloxycarbonyl and p-nitrobenzyloxycarbonyl; 3) protective groups of the aliphatic urethane type, illustrated by: tert.-butyloxycarbonyl, diisopropylmethoxycarbonyl, isopropyloxy-carbonyl, allyloxycarbonyl, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl, amyloxycarbonyl; 4) protective groups of the cycloalkyl urethane type, illustrated by: cyclopentyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl, cyclohexyloxycarbonyl; 5) protective groups of the thio-urethane type, such as phenylthiocarbonyl; 6) protecting groups of the alkyl type, illustrated by triphenyl-methyl (trityl); 7) trialkylsilane groups, such as trimethylsilane. The preferred α-amino protecting group is tert.-butyloxycarbonyl. The nitrogen atoms of the arginine side chain, designated by N "n, are protected by a group which can be a nitro, tosyl, benzyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl or tert.-butyloxycarbonyl group, with a preference for the tosyl group.

La protection pour le groupe amino de chaîne latérale de la lysine peut se faire par un groupe pouvant être: tosyle, t-amyloxycarbonyle, t-butyloxycarbonyle, diisopropyloxycarbonyle, benzyloxycarbonyle, halobenzyloxycarbonyle, nitrobenzyloxycarbonyle, etc., le groupe 2-chlorobenzyloxycarbonyle étant préféré. La protection pour le groupe hydroxyle de la thréonine et de la sérine peut se faire par un groupe acétyle, benzoyle, tert.-butyle, benzyle, avec une préférence pour le groupe benzyle. Protection for the lysine side chain amino group can be provided by a group which may be: tosyl, t-amyloxycarbonyl, t-butyloxycarbonyl, diisopropyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, halobenzyloxycarbonyl, nitrobenzyloxycarbonyl, etc., the 2-chlorobenzyloxycarbonyl group being preferred. The protection for the hydroxyl group of threonine and of the serine can be done by an acetyl, benzoyl, tert.-butyl, benzyl group, with a preference for the benzyl group.

Le groupe protecteur pour le groupe sulfhydryle du fragment aminoacide de cystéinyle est un groupe choisi dans la classe comprenant: le benzyle; un benzyle substitué, dans lequel le substituant est constitué par au moins un des radicaux suivants : méthyle, méthoxy, nitro, ou halo (par exemple 3,4-diméthylbenzyle, p-méthoxybenzyle, p-chlorobenzyle, p-nitrobenzyle, etc.); le trityle, le benzyloxycarbonyle, le benzhydryle, le p-méthoxybenzyloxycarbonyle, le benzylthiométhyle, l'éthylcarbamoyle, le thioéthyle, le tétrahydro-pyrannyle, l'acétamidométhyle, le benzoyle, le sel s-sulfonate, etc., le groupe p-méthoxybenzyle étant préféré. The protecting group for the sulfhydryl group of the amino acid fragment of cysteinyl is a group selected from the class comprising: benzyl; a substituted benzyl, in which the substituent consists of at least one of the following radicals: methyl, methoxy, nitro, or halo (for example 3,4-dimethylbenzyl, p-methoxybenzyl, p-chlorobenzyl, p-nitrobenzyl, etc.) ; trityl, benzyloxycarbonyl, benzhydryl, p-methoxybenzyloxycarbonyl, benzylthiomethyl, ethylcarbamoyl, thioethyl, tetrahydro-pyrannyl, acetamidomethyl, benzoyl, s-sulfonate salt, etc., p-methoxybenz group being preferred.

L'activité pharmacologique démontrée des peptides suivant l'invention caractérise ces composés comme étant intéressants dans le traitement de l'acromegalie et du diabète juvénile, ainsi que du diabète commençant à l'âge adulte, de la même manière que la somatostatine elle-même. L'administration des peptides peut se faire par les voies traditionnelles, qui sont courantes pour la somatostatine et les polypeptides apparentés, sous la surveillance d'un médecin, en une quantité imposée par le degré de la dysfonction déterminée par ce médecin. On peut administrer les composés seuls ou en combinaison avec des supports et des adjuvants traditionnels, acceptables en pharmacie, sous forme de doses posologiques. The demonstrated pharmacological activity of the peptides according to the invention characterizes these compounds as being advantageous in the treatment of acromegaly and juvenile diabetes, as well as of diabetes beginning in adulthood, in the same way as somatostatin itself . Administration of the peptides can be by traditional routes, which are common for somatostatin and related polypeptides, under the supervision of a physician, in an amount dictated by the degree of dysfunction determined by that physician. The compounds can be administered alone or in combination with conventional carriers and adjuvants, acceptable in pharmacies, as dosage doses.

Les exemples suivants illustreront plus complètement encore la présente invention. The following examples will further illustrate the present invention.

Exemple 1 : Example 1:

N-a-tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cystéinyl-N8"-To-syl-D- Arginy 1-0-2,6-Dichlorobenzyl-D-Tyrosyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-Ns-2-Chlorobenzyloxycarbonyl-L-Lysyl-O-Benzyl-L-Thréonyl-L-Phénylalanyl-O-Benzyl-L-Thréonyl-O-Ben-zyl-L-Séryl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cystéinyl Hydroxymêthyl Polystyrène. Na-tert.-Butyloxycarbonyl-Sp-Methoxybenzyl-L-Cysteinyl-N8 "-To-syl-D- Arginy 1-0-2,6-Dichlorobenzyl-D-Tyrosyl-L-Phenylalanyl-L-Phenylalanyl-D-Tryptophyl -Ns-2-Chlorobenzyloxycarbonyl-L-Lysyl-O-Benzyl-L-Thréonyl-L-Phénylalanyl-O-Benzyl-L-Thréonyl-O-Ben-zyl-L-Séryl-Sp-Méthoxybenzyl-L-Cystéinyl Hydroxymethyl Polystyrene .

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

634550 634550

4 4

Une résine de polystyrène chlorométhylée (Lab Systems, Inc.), réticulée à 1 % avec du divinylbenzène, est estérifiée avec du Boc-Cys (SMBzl)-OH suivant Gisin, «Helv. Chim. Acta», 56,1976 (1973). L'ester de résine de polystyrène est traité suivant le programme A ci-après pour l'incorporation de Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Thr (Bzl)-OH, Boc-Lys(ClZ)-OH, Boc-D-Trp-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Phe-OH, Boc-D-Tyr(Cl2Bzl)-OH, Boc-D-Arg(Tos)-OH et Boc-Cys(SMBzl)-OH, en vue d'obtenir la peptidoré-sine citée en rubrique. A chloromethylated polystyrene resin (Lab Systems, Inc.), crosslinked at 1% with divinylbenzene, is esterified with Boc-Cys (SMBzl) -OH according to Gisin, "Helv. Chim. Acta ”, 56.1976 (1973). The polystyrene resin ester is treated according to program A below for the incorporation of Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Thr (Bzl ) -OH, Boc-Lys (ClZ) -OH, Boc-D-Trp-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Phe-OH, Boc-D-Tyr (Cl2Bzl) -OH, Boc-D-Arg ( Tos) -OH and Boc-Cys (SMBzl) -OH, with a view to obtaining the peptidore-sine mentioned in the heading.

Programme A Program A

1. Lavage avec du CH2C12x 3 1. Washing with CH2C12x 3

2. Traitement avec du TFA-CH2Cl2-EDT (1/1/5%, v/v) pendant 5 min 2. Treatment with TFA-CH2Cl2-EDT (1/1/5%, v / v) for 5 min

3. Traitement suivant 2 pendant 25 min 3. Next treatment 2 for 25 min

4. Lavage avec du CH2C12 x 3 4. Washing with CH2C12 x 3

5. Lavage avec du DMF 5. Washing with DMF

6. Traitement avec du TEA à 12% dans du DMF x 2 pendant 3 min 6. Treatment with 12% TEA in DMF x 2 for 3 min

7. Lavage avec du DMF 7. Washing with DMF

8. Lavage avec du CH2C12 x 3 8. Washing with CH2C12 x 3

9. Traitement avec 4 équivalents du dérivé aminoacide correspondant dans du CH2C12-DMF et agitation pendant 5 min 9. Treatment with 4 equivalents of the corresponding amino acid derivative in CH2C12-DMF and stirring for 5 min

10. Addition en deux portions de 5 équivalents de DIC en dissolution dans du CH2C12, sur une période de 30 min, durée de réaction de 6 h 10. Addition in two portions of 5 equivalents of DIC dissolved in CH2C12, over a period of 30 min, reaction time of 6 h

11. Lavage avec du DMF x 3 11. Washing with DMF x 3

12. Lavage avec du CH2C12 x 3 12. Washing with CH2C12 x 3

13. Réaction d'essai à la ninhydrine suivant Kaiser et coll., 13. Test reaction with ninhydrin according to Kaiser et al.,

«Anal. Biochemical», 34, 595 (1970); dans le cas d'une réaction incomplète, on répète les phases 9 à 13 susdites. "Anal. Biochemical ", 34, 595 (1970); in the case of an incomplete reaction, the above-mentioned phases 9 to 13 are repeated.

Exemple 2: Example 2:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystêinyl-D-Arginyl-D-Tyrosyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phènylalanyl-L-Thréonyl-L-Séryl-L-Cystêine (A) Cyclic disulfide (1-12) of L-Cystêinyl-D-Arginyl-D-Tyrosyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phènylalanyl-L-Thréonyl-L- Séryl-L-Cystêine (A)

La peptidorésine de l'exemple précédent (10,2 g) est mélangée avec de l'anisole (20 ml) et traitée avec du HF liquide (200 ml) pendant 45 min dans un bain de glace. On sépare l'excès de HF sous vide et le reste est extrait avec du AcOH aqueux à 25%. La solution aqueuse est extraite avec de l'éther et ensuite la phase aqueuse est neutralisée avec du NH4OH dilué jusqu'au pH 7 et laissée au repos pendant 2 d à l'air libre. Le mélange est acidifié avec du AcOH glacial jusqu'au pH 5 et lyophilisé. Le produit brut est appliqué sur une colonne de Sephadex G-15 et élué avec du AcOH aqueux à 10%. On récolte des fractions de 5,5 ml et la matière qui émerge entre les fractions 96 à 126 est récoltée pour former 260 mg de disulfure cyclique (1 -12) de L-cystéinyl-D-arginyl-D-tyrosyl-L-phénylalanyl-L-phényl-alanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-thréonyl-L-phénylalanyl-L-thréonyl-L-sêryl-L-cystéine sous la forme du sel d'acide diacétique. The peptidoresin of the previous example (10.2 g) is mixed with anisole (20 ml) and treated with liquid HF (200 ml) for 45 min in an ice bath. The excess HF is separated in vacuo and the remainder is extracted with 25% aqueous AcOH. The aqueous solution is extracted with ether and then the aqueous phase is neutralized with NH4OH diluted to pH 7 and left to stand for 2 d in the open air. The mixture is acidified with glacial AcOH to pH 5 and lyophilized. The crude product is applied to a Sephadex G-15 column and eluted with 10% aqueous AcOH. 5.5 ml fractions are collected and the material which emerges between fractions 96 to 126 is collected to form 260 mg of cyclic disulfide (1 -12) of L-cysteinyl-D-arginyl-D-tyrosyl-L-phenylalanyl -L-phenyl-alanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-cysteine in the form of the diacetic acid salt.

Rf(BWA, 4/5/1, v/v): 0,52 Rf (BWA, 4/5/1, v / v): 0.52

Rf (BWAP, 30/24/6/20, v/v): 0,77 Rf (BWAP, 30/24/6/20, v / v): 0.77

BWA=butanol/eau/acide acétique BWA = butanol / water / acetic acid

BWAP=butanol/eau/acide acétique/pyridine BWAP = butanol / water / acetic acid / pyridine

Analyse des aminoacides : Thr (2): 1,76; Ser (1): 0,88; Tyr (1): 0,95; Phe (3): 3; Lys (1): 1,09; Arg (1): 0,89; Trp et Cys: non déterminés. Amino acid analysis: Thr (2): 1.76; Ser (1): 0.88; Tyr (1): 0.95; Phe (3): 3; Lys (1): 1.09; Arg (1): 0.89; Trp and Cys: not determined.

Exemple 3: Example 3:

L'activité pharmacologique in vivo du composé préparé suivant l'exemple 2 (composé désigné par A) a été établie par les procédés suivants avec les résultats indiqués. The in vivo pharmacological activity of the compound prepared according to Example 2 (compound designated by A) was established by the following methods with the results indicated.

Suppression de l'hormone de croissance Suppression of growth hormone

Une injection sous-cutanée de peptide solubilisé ou mis en suspension dans une solution saline physiologique est faite à des rats mâles Charles River CD, qui ne sont pas à jeun. Des rats correspondants ayant subi une injection sous-cutanée d'une solution saline témoin servent d'animaux témoins de manière que chaque rat expérimental soit accompagné d'un rat témoin. Les rats sont maintenus dans des cages séparées et, 20 min avant la fin de la période d'essai, ils reçoivent une injection de Nembutal (marque déposée) dans le péritoine à une dose de 50 mg/kg. On obtient des échantillons de sang par une ponction cardiaque et on sépare le plasma pour la détermination par voie radio-immunologique de la concentration d'hormone de croissance (GH) en nanogrammes par millilitre. On prévoit des périodes de 2,4, 5 et 6 h après injection pour vérifier la durée de réactivité du peptide dans la suppression des taux de GH périphérique en circulation. Des comparaisons entre les valeurs de GH obtenues sur les rats témoins et sur les rats expérimentaux à chacun des moments indiqués sont estimées par la méthode d'essai t de Student et la signification statistique (p) au taux de 0,05 ou à un taux inférieur est utilisée à titre d'indice d'activité. A subcutaneous injection of peptide solubilized or suspended in physiological saline solution is made to male Charles River CD rats, which are not fasted. Corresponding rats which have undergone a subcutaneous injection of a control saline solution serve as control animals so that each experimental rat is accompanied by a control rat. The rats are kept in separate cages and, 20 min before the end of the test period, they receive an injection of Nembutal (registered trademark) in the peritoneum at a dose of 50 mg / kg. Blood samples are obtained by a cardiac puncture and the plasma is separated for radioimmunological determination of the concentration of growth hormone (GH) in nanograms per milliliter. Periods of 2.4, 5 and 6 h after injection are provided to verify the duration of reactivity of the peptide in suppressing the levels of peripheral GH in circulation. Comparisons between the GH values obtained in the control rats and in the experimental rats at each of the times indicated are estimated by Student's test method t and the statistical significance (p) at the rate of 0.05 or at a rate lower is used as an activity index.

20 20

30 30

Composé (dose) Compound (dose)

2h 2h

4h 4h

5 h 5 a.m.

6h 6h

Témoin A (1 mg/kg) Control A (1 mg / kg)

171+20 17+8 p <0,001 171 + 20 17 + 8 p <0.001

73 ±21 73 ± 21

23+8 23 + 8

p<0,05 p <0.05

60± 11 60 ± 11

32+7 p<0,05 32 + 7 p <0.05

82 ±21 74+14 p>0,05 82 ± 21 74 + 14 p> 0.05

Suppression de l'hormone de croissance, du glucagon et de l'insuline Suppression of growth hormone, glucagon and insulin

On répartit des rats mâles albinos en trois groupes (9 rats par groupe) et on leur injecte dans le péritoine du Nembutal à raison de 50 mg/kg. 15 min après l'injection de Nembutal, on injecte par voie sous-cutanée suivant le groupe: a) le composé essayé, normalement à raison de 10-2000 jig/kg; b) du SRIF à raison de 200 ng/kg, ou c) une solution saline physiologique. 10 min plus tard, on injecte dans le cœur 0,5 ml d'arginine (300 mg/ml, pH de 7,2). Les rats sont décapités 5 min après avoir reçu l'arginine et on récolte leur sang dans du Trasylol-EDTA. De petites quantités appropriées sont alors soumises à une détermination quant à l'hormone de croissance, au glucagon et à l'insuline. Un composé actif est un composé qui modifie de façon significative le taux, dans le plasma, de l'une quelconque de ces hormones par rapport aux animaux témoins traités par la solution saline. Des comparaisons entre les valeurs témoins et les valeurs expérimentales sont estimées de manière statistique par l'analyse de va-riance, et la signification statistique (p) au taux de 0,05 ou moins est utilisée à titre d'indice d'activité. Male albino rats are divided into three groups (9 rats per group) and injected into the peritoneum of Nembutal at a rate of 50 mg / kg. 15 min after the injection of Nembutal, the following are injected subcutaneously according to the group: a) the compound tested, normally at a rate of 10-2000 jig / kg; b) SRIF at a rate of 200 ng / kg, or c) physiological saline solution. 10 min later, 0.5 ml of arginine (300 mg / ml, pH 7.2) is injected into the heart. The rats are decapitated 5 min after receiving the arginine and their blood is collected in Trasylol-EDTA. Appropriate small amounts are then determined for growth hormone, glucagon and insulin. An active compound is one that significantly changes the level in the plasma of any of these hormones compared to control animals treated with saline. Comparisons between control and experimental values are estimated statistically by variance analysis, and statistical significance (p) at the rate of 0.05 or less is used as an activity index.

55 55

Composé (dose, ng/kg) Compound (dose, ng / kg)

Hormone de croissance (ng/ml) Growth hormone (ng / ml)

Insuline (nU/ml) Insulin (nU / ml)

Glucagon (Pg/ml) Glucagon (Pg / ml)

Témoin Witness

164+38 164 + 38

213 ± 12 213 ± 12

37 ±8 37 ± 8

A (2000) A (2000)

20+2 20 + 2

97+18 97 + 18

8 + 5 8 + 5

p <0,001 p <0.001

p<0,01 p <0.01

Témoin Witness

— -

221 ±9 221 ± 9

71 ±6 71 ± 6

A (100) 100)

— -

127 ± 9 127 ± 9

24+4 24 + 4

p<0,01 p <0.01

Témoin Witness

163+29 163 + 29

278 + 32 278 + 32

69 ±13 69 ± 13

A (10) A (10)

11 ±3 11 ± 3

312 ± 52 312 ± 52

39+7 39 + 7

p<0,01 p <0.01

p>0,05 p> 0.05

p<0,05 p <0.05

60 Exemple 4: 60 Example 4:

Tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cystéinyl-0-2,6-Di-chlorobenzyl-D-Tyrosyl-D-Tryptophyl-L-Phénylalanyl-L-Phényl-alanyl-D-Tryptophyl-e-2-ChlorobenzyloxycarbonyI-L-Lysyl-O-Ben-zyl-L-Thréonyl-L-Phênyl-alanyl-O-Benzyl-L-Thréonyl-O-Benzyl-L- Tert.-Butyloxycarbonyl-Sp-Methoxybenzyl-L-Cysteinyl-0-2,6-Di-chlorobenzyl-D-Tyrosyl-D-Tryptophyl-L-Phenylalanyl-L-Phenyl-alanyl-D-Tryptophyl-e-2-ChlorobenzyloxycarbonyI -L-Lysyl-O-Ben-zyl-L-Threonyl-L-Phênyl-alanyl-O-Benzyl-L-Thréonyl-O-Benzyl-L-

65 Sèryl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cystéinyl Hydroxymèthylpolystyrène 65 Seryl-S-p-Methoxybenzyl-L-Cysteinyl Hydroxymethylpolystyrene

Une résine de polystyrène chlorométhylée (Lab. Systems, Inc.), réticulée à 1 % avec du divinylbenzène, est estérifiée avec du Boc-Cys(SMBzl)-OH suivant Gisin, citation précédente. L'ester de résine de polystyrène est traité suivant le programme A de l'exemple 1 pour A chloromethylated polystyrene resin (Lab. Systems, Inc.), crosslinked at 1% with divinylbenzene, is esterified with Boc-Cys (SMBzl) -OH according to Gisin, previous citation. The polystyrene resin ester is treated according to program A of Example 1 to

5 5

634 550 634,550

l'incorporation de Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Lys(Clz)-OH, Boc-D-Trp-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Phe-OH, Boc-D-Trp-OH, Boc-D-Tyr(ClzBzl)-OH et Boc-Cys(SMBzl)-OH pour donner la peptidorésine citée en rubrique. incorporation of Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Lys (Clz) -OH, Boc-D- Trp-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Phe-OH, Boc-D-Trp-OH, Boc-D-Tyr (ClzBzl) -OH and Boc-Cys (SMBzl) -OH to give the above-mentioned peptidoresin .

Exemple 5: Example 5:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystéinyl-D-Tyrosyl-D-Tryptophyl-L-Phênylalanyl-L-Phênylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phènylalanyl-L-Thrèonyl-L-Sèryl-L-Cystëine (B) Cyclic disulfide (1-12) of L-Cysteinyl-D-Tyrosyl-D-Tryptophyl-L-Phenylalanyl-L-Phenylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Threonyl-L-Phenylalanyl-L-Threonyl-L- Sèryl-L-Cystëine (B)

La peptidorésine de l'exemple 4 (7,9 g) est traitée avec du HF liquide (150 ml) en présence d'anisole (15 ml) sous vide et dans un bain de glace pendant 45 min. L'excès de HF est séparé aussi vite que possible sous vide (environ 45 min) et le reste est repris dans du AcOH aqueux à 25%. Le support polymère est séparé par filtration et le filtrat est lavé à l'éther, puis la phase aqueuse est versée dans 3,51 d'eau désaérée et le pH est amené à 7 avec du NH40H dilué. Le dodéca-peptide disulfhydryle est oxydé avec du K3Fe(CN)6, puis le pH est amené à 5 avec du AcOH glacial. L'excès d'oxydant est séparé avec une résine échangeuse d'ions Bio-Rad AG 3 et le peptide est absorbé sur une résine de Bio-Rex 70. Une élution avec un tampon de Pyridine de pH 7 donne le dodécapeptide brut (300 mg). The peptidoresin of Example 4 (7.9 g) is treated with liquid HF (150 ml) in the presence of anisole (15 ml) under vacuum and in an ice bath for 45 min. The excess HF is separated as quickly as possible under vacuum (about 45 min) and the rest is taken up in 25% aqueous AcOH. The polymer support is separated by filtration and the filtrate is washed with ether, then the aqueous phase is poured into 3.51 of deaerated water and the pH is brought to 7 with dilute NH40H. The disulfhydryl dodeca-peptide is oxidized with K3Fe (CN) 6, then the pH is brought to 5 with glacial AcOH. The excess oxidant is separated with an ion exchange resin Bio-Rad AG 3 and the peptide is absorbed on a Bio-Rex 70 resin. Elution with a pyridine buffer of pH 7 gives the crude dodecapeptide (300 mg).

La matière brute (150 mg) est chromatographiée à travers du Se-phadex G-15 (1,5 x 90 cm) et éluée avec du AcOH aqueux à 15%. Les matières qui émergent dans les fractions (3,1 ml chacune) 49 à 77 sont rassemblées et lyophilisées pour donner le disulfure cyclique (1-12) de L-cystéinyl-D-tyrosyl-D-tryptophyl-L-phénylalanyl-L-phényl-alanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-thréonyl-L-phénylalanyl-L-thréonyl-L-séryl-L-cystéine (69 mg). The crude material (150 mg) is chromatographed through Se-phadex G-15 (1.5 x 90 cm) and eluted with 15% aqueous AcOH. The materials which emerge in the fractions (3.1 ml each) 49 to 77 are combined and lyophilized to give the cyclic disulfide (1-12) of L-cysteinyl-D-tyrosyl-D-tryptophyl-L-phenylalanyl-L- phenyl-alanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-cysteine (69 mg).

Rf(BWA, 4/1/1): 0,68 Rf (BWA, 4/1/1): 0.68

Rf (BWAP, 30/24/6/20): 0,86 Rf (BWAP, 30/24/6/20): 0.86

Analyse des aminoacides: Thr (2): 2,05; Ser (1): 1,05; Tyr (1): 0,96; Phe (3): 3; Lys (1): 1,04; Cys et Trp: non déterminés. Amino acid analysis: Thr (2): 2.05; Ser (1): 1.05; Tyr (1): 0.96; Phe (3): 3; Lys (1): 1.04; Cys and Trp: not determined.

Exemple 6: Example 6:

L'activité pharmacologique in vivo du composé préparé suivant l'exemple 5 (composé désigné par B) est établie par les procédés décrits dans l'exemple 3 et on obtient les résultats suivants. The in vivo pharmacological activity of the compound prepared according to Example 5 (compound designated by B) is established by the methods described in Example 3 and the following results are obtained.

Suppression de l'hormone de croissance Suppression of growth hormone

Composé (dose) Compound (dose)

2h 2h

4h 4h

5 h 5 a.m.

Témoin B (1 mg/kg) Control B (1 mg / kg)

199±27 111 + 14 p<0,01 199 ± 27 111 + 14 p <0.01

303 ±95 133 ± 34 p < 0,05 303 ± 95 133 ± 34 p <0.05

161 ±30 67 ±14 p<0,01 161 ± 30 67 ± 14 p <0.01

158 ±26 151 ± 18 p > 0,05 158 ± 26 151 ± 18 p> 0.05

Composé (dose, Hg/kg) Compound (dose, Hg / kg)

Hormone de croissance (ng/ml) Growth hormone (ng / ml)

Insuline (|iU/ml) Insulin (| iU / ml)

Glucagon (Pg/ml) Glucagon (Pg / ml)

Témoin Witness

197 ±26 197 ± 26

166±8 166 ± 8

50 ±5 50 ± 5

B(500) B (500)

38 ±6 38 ± 6

116±8 116 ± 8

18 ±4 18 ± 4

p<0,01 p <0.01

Témoin Witness

— -

171 ±6 171 ± 6

86±6 86 ± 6

B (300) B (300)

— -

153 ± 9 153 ± 9

38 ±8 38 ± 8

p>0,05 p> 0.05

p<0,01 p <0.01

Témoin Witness

— -

278 ±26 278 ± 26

71 ±9 71 ± 9

B(200) B (200)

— -

239± 17 239 ± 17

44±9 44 ± 9

p>0,05 p> 0.05

p<0,05 p <0.05

Témoin Witness

171 ±29 171 ± 29

251 ±50 251 ± 50

32±6 32 ± 6

B (100) B (100)

43 ±7 43 ± 7

170± 15 170 ± 15

5± 1 5 ± 1

p<0,01 p <0.01

p>0,05 p> 0.05

p<0,01 p <0.01

Témoin Witness

197 ±26 197 ± 26

166±8 166 ± 8

50 ±5 50 ± 5

B (10) B (10)

125 ± 26 125 ± 26

162± 13 162 ± 13

36±4 36 ± 4

p>0,05 p> 0.05

p<0,05 p <0.05

Exemple 7: Example 7:

Tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cystéinyl-N'm-Tosyl-D-Histidyl-0-2,6-Dichlorobenzyl-D-Tyrosyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-N£-2-Chlorobenzyloxycarbonyl-L-Lysyl-O-Benzyl-L- Thrêonyl-L-Phénylalanyl-O-Benzyl-L- Thrèonyl-O-Ben-zyl-L-Séryl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cystéinyl-Hydroxyméthyl-polystyrène, ester Tert.-Butyloxycarbonyl-Sp-Methoxybenzyl-L-Cysteinyl-N'm-Tosyl-D-Histidyl-0-2,6-Dichlorobenzyl-D-Tyrosyl-L-Phenylalanyl-L-Phenylalanyl-D-Tryptophyl-N £ - 2-Chlorobenzyloxycarbonyl-L-Lysyl-O-Benzyl-L- Threonyl-L-Phenylalanyl-O-Benzyl-L- Threonyl-O-Ben-zyl-L-Seryl-Sp-Methoxybenzyl-L-Cysteinyl-Hydroxymethyl-polystyrene, ester

Une résine de polystyrène chlorométhylée est estérifiée avec du Boc-Cys(SMBzl)-OH suivant Gisin, citation précédente, et l'ester polymère est traité suivant le programme A de l'exemple 1 pour l'incorporation de Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Lys(Clz), Boc-D-Trp-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Phe-OH, Boc-D-Tyr(ClBzl)-OH, Boc-D-His(Tos)-OH, et Boc-Cys(SMBzl)-OH, en vue d'obtenir la peptidorésine citée en rubrique. A chloromethylated polystyrene resin is esterified with Boc-Cys (SMBzl) -OH according to Gisin, previous quotation, and the polymeric ester is treated according to program A of Example 1 for the incorporation of Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Lys (Clz), Boc-D-Trp-OH, Boc-Phe-OH, Boc- Phe-OH, Boc-D-Tyr (ClBzl) -OH, Boc-D-His (Tos) -OH, and Boc-Cys (SMBzl) -OH, in order to obtain the peptidoresin cited in the heading.

Exemple 8: Example 8:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystèinyl-D-Histidyl-D-Tyrosyl-L-Phênylalanyl-L-Phênylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phênylalanyl-L-Thrëonyl-L-Séryl-L-Cystëine (C) Cyclic disulfide (1-12) of L-Cysteinyl-D-Histidyl-D-Tyrosyl-L-Phenylalanyl-L-Phenylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Threonyl-L-Phenylalanyl-L-Thrëonyl-L- Séryl-L-Cystëine (C)

La peptidorésine de l'exemple 7 (9,8 g) est mélangée avec 18 ml d'anisole et le mélange est traité avec du HF liquide en l'absence d'air et dans un bain de glace pendant 60 min, puis on sépare l'excès de HF sous vide et le reste est extrait avec du AcOH aqueux 2M et filtré. Le filtrat est versé dans 71 d'eau désaérée et le pH est ajusté à la valeur de 7,2 avec du NH4OH. Le mélange est agité pendant la nuit (l'oxydation est totale), puis le pH est ajusté à 5 avec du AcOH glacial, et le peptide est absorbé sur de l'Amberlite CG-50 (forme H+). La matière peptidique est éluée avec du AcOH aqueux à 30% et lyophilisée pour donner 250 mg de produit brut. The peptidoresin of Example 7 (9.8 g) is mixed with 18 ml of anisole and the mixture is treated with liquid HF in the absence of air and in an ice bath for 60 min, then it is separated. excess HF in vacuo and the remainder is extracted with 2M aqueous AcOH and filtered. The filtrate is poured into 71 of deaerated water and the pH is adjusted to the value of 7.2 with NH4OH. The mixture is stirred overnight (the oxidation is complete), then the pH is adjusted to 5 with glacial AcOH, and the peptide is absorbed on Amberlite CG-50 (H + form). The peptide material is eluted with 30% aqueous AcOH and lyophilized to give 250 mg of crude product.

La matière précédente est chromatographiée à travers une colonne de Sephadex G-25 (2,5 x 57 cm) et éluée avec du AcOH aqueux à 10%. Les matières qui émergent dans les fractions (5,4 ml chacune) 61 à 111 sont rassemblées et lyophilisées pour donner le dodécapeptide cité en rubrique. Chromatographie en couche mince, plaques de verre préalablement enrobées d'Avicel, pulvérisation de chlorox-tolidine: The above material is chromatographed through a column of Sephadex G-25 (2.5 x 57 cm) and eluted with 10% aqueous AcOH. The materials which emerge in the fractions (5.4 ml each) 61 to 111 are combined and lyophilized to give the dodecapeptide mentioned in the heading. Thin layer chromatography, glass plates previously coated with Avicel, spraying with chlorox-tolidine:

Rf (BWA, 4/11, v/v) : 0,62 Rf (tert.-AmOH, P, W, 7/7/6, v/v): 0,80 Rf (BWA, 4/11, v / v): 0.62 Rf (tert.-AmOH, P, W, 7/7/6, v / v): 0.80

Analyse des aminoacides: Thr (2): 1,89; Ser (1): 0,91 ; Cys (2): 1,52; Tyr (1): 0,95; Phe (3): 3; Lys (1): 1,03; His (1): 0,93; Trp (1): 0,85. Amino acid analysis: Thr (2): 1.89; Ser (1): 0.91; Cys (2): 1.52; Tyr (1): 0.95; Phe (3): 3; Lys (1): 1.03; His (1): 0.93; Trp (1): 0.85.

(tert.-AmOH, P, W = alcool amylique tertiaire, pyridine, eau). Les composés suivants se préparent d'une manière similaire à celle des exemples précédents. (tert.-AmOH, P, W = tertiary amyl alcohol, pyridine, water). The following compounds are prepared in a similar manner to that of the previous examples.

Exemple 9: Example 9:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystêinyl-D-Arginyl-D-Tryptophyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phénylalanyl-L-Thrêonyl-L-Séryl-L-Cystéine (D) Cyclic disulfide (1-12) of L-Cystêinyl-D-Arginyl-D-Tryptophyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phénylalanyl-L-Threonyl-L- Seryl-L-Cysteine (D)

Chromatographie en couche mince, plaques de verre préalablement enrobées d'Avicel, pulvérisation de chlorox-tolidine: Thin layer chromatography, glass plates previously coated with Avicel, spraying with chlorox-tolidine:

Rf(BWA, 4/1/1, v/v): 0,49 Rf (BWAP, 30/24/6/20, v/v): 0,77. Rf (BWA, 4/1/1, v / v): 0.49 Rf (BWAP, 30/24/6/20, v / v): 0.77.

Analyse des aminoacides: Thr (2): 2,04; Ser (1): 1,09; Cys (2): 1,42; Phe (3): 3; Lys (1): 1,04; Trp (1): 0,77; Arg (1): 0,99. Amino acid analysis: Thr (2): 2.04; Ser (1): 1.09; Cys (2): 1.42; Phe (3): 3; Lys (1): 1.04; Trp (1): 0.77; Arg (1): 0.99.

Exemple 10: Example 10:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystêinyl-D-Histidyl-D-Histidyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phénylalanyl-L-Thréonyl-L-Séryl-L-Cystéine (E) Cyclic disulfide (1-12) of L-Cystêinyl-D-Histidyl-D-Histidyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phénylalanyl-L-Thréonyl-L- Seryl-L-Cysteine (E)

Rf(BWA, 4/1/1, v/v): 0,43 Rf (BWAP, 30/24/6/20, v/v): 0,67. Rf (BWA, 4/1/1, v / v): 0.43 Rf (BWAP, 30/24/6/20, v / v): 0.67.

Analyse des aminoacides: Thr (2): 1,93; Ser (1): 0,91 ; Cys (2): 1,53; Phe (3): 3; Lys (1): 1,06; His (2): 1,78. Amino acid analysis: Thr (2): 1.93; Ser (1): 0.91; Cys (2): 1.53; Phe (3): 3; Lys (1): 1.06; His (2): 1.78.

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

634550 634550

6 6

Exemple 11: Example 11:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystéinyl-D-Tyrosyl-D-Arginyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phénylalanyl-L-Thréonyl-L-Séryl-D-Cystéine (F) Cyclic disulfide (1-12) of L-Cysteinyl-D-Tyrosyl-D-Arginyl-L-Phenylalanyl-L-Phenylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Threonyl-L-Phenylalanyl-L-Threonyl-L- Seryl-D-Cysteine (F)

Rf(BWA, 4/1/1, v/v): 0,55 Rf (tert.-AmOH, W, P, 7/6/7, v/v): 0,81. Rf (BWA, 4/1/1, v / v): 0.55 Rf (tert.-AmOH, W, P, 7/6/7, v / v): 0.81.

Analyse des aminoacides: Thr (2): 1,91 ; Ser (1): 0,83; Cys (2): 1,45; Phe (3): 3; Tyr (1): 0,89; Lys (1): 1,02; Arg (1): 0,93; Trp: non déterminé. Amino acid analysis: Thr (2): 1.91; Ser (1): 0.83; Cys (2): 1.45; Phe (3): 3; Tyr (1): 0.89; Lys (1): 1.02; Arg (1): 0.93; Trp: not determined.

Exemple 12: Example 12:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystëinyl-D-Leucyl-D-Tyrosyl-L-Phênylalanyl-L-Phënylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thrèonyl-L-Phênylalanyl-L-Thrêonyl-L-Sèryl-L-Cystèine (G) Cyclic disulfide (1-12) of L-Cystëinyl-D-Leucyl-D-Tyrosyl-L-Phênylalanyl-L-Phënylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Threonyl-L-Phênylalanyl-L-Thrêonyl-L- Sèryl-L-Cystèine (G)

Rf(BWA, 4/1/1, v/v): 0,53 Rf (BWAP, 30/24/6/20, v/v): 0,85 Rf (BWA, 4/1/1, v / v): 0.53 Rf (BWAP, 30/24/6/20, v / v): 0.85

Analyse des aminoacides: Thr (2) : 1,93 ; Ser (1) : 0,86 ; Cys (2) : 1,28; Leu (1): 0,95; Tyr (1): 0,91 ; Phe (3): 3; Trp: non déterminé. Amino acid analysis: Thr (2): 1.93; Ser (1): 0.86; Cys (2): 1.28; Leu (1): 0.95; Tyr (1): 0.91; Phe (3): 3; Trp: not determined.

Exemple 13: Example 13:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystêinyl-D-Arginyl-D-Tyrosyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phênylalanyl-L-Thréonyl-L-Sêryl-D-Cystéine (H) Cyclic disulfide (1-12) of L-Cystêinyl-D-Arginyl-D-Tyrosyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phênylalanyl-L-Thréonyl-L- Seryl-D-Cysteine (H)

Rf(BWA, 4/1/1, v/v): 0,48 Rf (BWAP, 30/24/6/20, v/v): 0,69. Rf (BWA, 4/1/1, v / v): 0.48 Rf (BWAP, 30/24/6/20, v / v): 0.69.

Analyse des aminoacides: Thr (2): 1,79; Ser (1): 0,85; Phe (3): 3; Tyr(l): 0,95; Lys (1): 1,03; Trp (1): 0,69; Arg(l): 0,96; Cys (2): Amino acid analysis: Thr (2): 1.79; Ser (1): 0.85; Phe (3): 3; Tyr (1): 0.95; Lys (1): 1.03; Trp (1): 0.69; Arg (1): 0.96; Cys (2):

1,22. 1.22.

Exemple 14: Example 14:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystéinyl-D-Tyrosyl-D-Tryptophyl-L-Phënylalanyl-L-Phënylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thrèonyl-L-Phênylalanyl-L-Thréonyl-L-Séryl-D-Cystéine (I) Cyclic disulfide (1-12) of L-Cysteinyl-D-Tyrosyl-D-Tryptophyl-L-Phënylalanyl-L-Phënylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thrèonyl-L-Phênylalanyl-L-Thréonyl-L- Seryl-D-Cysteine (I)

Rf(BWA, 4/1/1, v/v): 0,55 Rf (BWAP, 30/24/6/20, v/v): 0,87 Rf (BWA, 4/1/1, v / v): 0.55 Rf (BWAP, 30/24/6/20, v / v): 0.87

Analyse des aminoacides: Thr (2): 1,89; Ser (1): 0,86; Cys (2): 1,29; Tyr (1): 1; Phe (3): 3; Lys (1): 1,07; Trp (2): 0,93. Amino acid analysis: Thr (2): 1.89; Ser (1): 0.86; Cys (2): 1.29; Tyr (1): 1; Phe (3): 3; Lys (1): 1.07; Trp (2): 0.93.

Exemple 15: Example 15:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystêinyl-D-Tyrosyl-D-Glutamyl-L-Phénylalanyl-L-Phênylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phénylalanyl-L-Thréonyl-L-Séryl-L-Cystéine (J) Cyclic disulfide (1-12) of L-Cystêinyl-D-Tyrosyl-D-Glutamyl-L-Phénylalanyl-L-Phênylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phénylalanyl-L-Thréonyl-L- Seryl-L-Cysteine (J)

Rf(BWA, 4/1/1, v/v): 0,55 Rf (BWAP, 30/24/6/20, v/v): 0,69. Rf (BWA, 4/1/1, v / v): 0.55 Rf (BWAP, 30/24/6/20, v / v): 0.69.

Analyse des aminoacides: Thr (2): 1,83; Ser (1): 0,82; Glu (1): 0,98; Cys (2): 1,33; Tyr (1): 0,95; Phe(3): 3; Lys (1): 1,01; Trp (1): 0,81. Amino acid analysis: Thr (2): 1.83; Ser (1): 0.82; Glu (1): 0.98; Cys (2): 1.33; Tyr (1): 0.95; Phe (3): 3; Lys (1): 1.01; Trp (1): 0.81.

Exemple 16: Example 16:

Les composés des exemples 8 à 15 ont été essayés pour ce qui concerne la suppression de l'hormone de croissance et la suppression de l'hormone de croissance, du glucagon et de l'insuline, suivant les procédés mis en évidence dans l'exemple 3. On a obtenu les résultats suivants. The compounds of Examples 8 to 15 were tested as regards the suppression of growth hormone and the suppression of growth hormone, glucagon and insulin, according to the methods demonstrated in the example 3. The following results were obtained.

Suppression de l'hormone de croissance Suppression of growth hormone

Composé Compound

Dose (Hg/kg) Dose (Hg / kg)

Heures Hours

GH (ng/ml) GH (ng / ml)

Témoin Witness

_ _

2 2

100 + 16 100 + 16

C VS

1000 1000

2 2

34+1* 34 + 1 *

Témoin Witness

— -

4 4

145 + 35 145 + 35

C VS

1000 1000

4 4

33±2* 33 ± 2 *

Témoin Witness

— -

5 5

161+28 161 + 28

C VS

1000 1000

5 5

51+8** 51 + 8 **

Témoin Witness

— -

6 6

202 ±39 202 ± 39

C VS

1000 1000

6 6

36±3** 36 ± 3 **

Témoin Witness

— -

7 7

105 ±13 105 ± 13

C VS

1000 1000

7 7

37±5** 37 ± 5 **

Témoin Witness

— -

8 8

175 ±52 175 ± 52

C VS

1000 1000

8 8

37±6 + 37 ± 6 +

Témoin Witness

— -

2 2

302 ±67 302 ± 67

D D

1000 1000

2 2

28±3** 28 ± 3 **

Témoin Witness

— -

4 4

177 ±50 177 ± 50

D D

1000 1000

4 4

11±2* 11 ± 2 *

Témoin Witness

— -

2 2

93 ±17 93 ± 17

E E

1000 1000

2 2

36± 16 + 36 ± 16 +

Témoin Witness

— -

4 4

34± 11 34 ± 11

E E

1000 1000

4 4

45 ±10 45 ± 10

Témoin Witness

— -

2 2

170±23 170 ± 23

F F

1000 1000

2 2

113 ± 34 113 ± 34

Témoin Witness

— -

4 4

133 ±25 133 ± 25

F F

1000 1000

4 4

99 ±11 99 ± 11

Témoin Witness

— -

2 2

212±37 212 ± 37

G G

1000 1000

2 2

84±11* 84 ± 11 *

Témoin Witness

— -

4 4

173 ±25 173 ± 25

G G

1000 1000

4 4

94+23 + 94 + 23 +

Témoin Witness

— -

5 5

243 ±44 243 ± 44

G G

1000 1000

5 5

93 ±30 93 ± 30

Témoin Witness

— -

6 6

109 ±61 109 ± 61

G G

1000 1000

6 6

72 ±68 72 ± 68

Témoin Witness

— -

2 2

191 ±18 191 ± 18

H H

1000 1000

2 2

75±4** 75 ± 4 **

Témoin Witness

— -

4 4

169±32 169 ± 32

H H

1000 1000

4 4

144±21 144 ± 21

Témoin Witness

— -

2 2

187 ±28 187 ± 28

I I

1000 1000

2 2

49±5** 49 ± 5 **

Témoin Witness

— -

4 4

148 ±23 148 ± 23

I I

1000 1000

4 4

86±11 + 86 ± 11 +

Témoin Witness

— -

2 2

392 ±59 392 ± 59

J J

1000 1000

2 2

311 ±68 311 ± 68

Témoin Witness

— -

4 4

185 ± 27 185 ± 27

J J

1000 1000

4 4

179±39 179 ± 39

*p<0,01; **p<0,001; + p<0,05. * p <0.01; ** p <0.001; + p <0.05.

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

7 634 550 7,634,550

Composé Compound

Dose (Hg/kg) Dose (Hg / kg)

GH GH

(Hg/ml) (Hg / ml)

Insuline (nU/ml) Insulin (nU / ml)

Glucagon (Pg/ml) Glucagon (Pg / ml)

Témoin Witness

268 ±46 268 ± 46

323 ±28 323 ± 28

379 ±109 379 ± 109

C VS

200 200

76± 14* 76 ± 14 *

254 ±31 254 ± 31

84±25 + 84 ± 25 +

Témoin Witness

— -

365 ±31 365 ± 31

379 ±47 379 ± 47

336+51 336 + 51

C VS

200 200

109 ±10* 109 ± 10 *

273 ±36 273 ± 36

184±22 + 184 ± 22 +

C VS

10 10

149±23* 149 ± 23 *

252±41 252 ± 41

165 ±13* 165 ± 13 *

Témoin Witness

— -

122±26 122 ± 26

195 ±18 195 ± 18

99 ±22 99 ± 22

D D

100 100

21 ±2* 21 ± 2 *

35±2* 35 ± 2 *

53 ±9 53 ± 9

Témoin Witness

— -

190±28 190 ± 28

295 ±38 295 ± 38

93 ±12 93 ± 12

E E

200 200

34±3* 34 ± 3 *

182± 18 + 182 ± 18 +

29+12* 29 + 12 *

Témoin Witness

— -

109 ±21 109 ± 21

226 ±29 226 ± 29

40±4 40 ± 4

F F

100 100

11 ±3* 11 ± 3 *

103 ±24* 103 ± 24 *

24±5 + 24 ± 5 +

G G

100 100

29±16 + 29 ± 16 +

218±44 218 ± 44

28+ 16 28+ 16

Témoin Witness

— -

171 ±29 171 ± 29

224 ±20 224 ± 20

74±4 74 ± 4

H H

25 25

23 ±4* 23 ± 4 *

128 ±11* 128 ± 11 *

56±6 + 56 ± 6 +

Témoin Witness

— -

279 ±53 279 ± 53

323 ±30 323 ± 30

42±6 42 ± 6

I I

200 200

57 ±14* 57 ± 14 *

236 ±27+ 236 ± 27 +

13±2* 13 ± 2 *

Témoin Witness

— -

240+34 240 + 34

211 ±26 211 ± 26

42±7 42 ± 7

J J

100 100

128 ±24+ 128 ± 24 +

263 ±28 263 ± 28

45 ±4 45 ± 4

*p<0,01; + p<0,05. * p <0.01; + p <0.05.

Claims

634550

2

1. Therapeutically active chemical compounds, having the structure:

SA I

X1-L-Cys-X2-X3-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-

L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH

I

HER

in which A represents hydrogen or the two groups A form a direct bond between the sulfur atoms; X1 represents H, Gly, L-Ala-Gly, L-Ala-D-Ala, or Gly-Gly-Gly;

X2 and X3, which may be the same or different, are chosen from Gly, D-Leu, D-Phe, D-Tyr, D-Trp, D-Met, D-His, D-Arg, D-Lys, D- Ser, D-Asp or D-Asn, provided that X2 and X3 do not simultaneously represent the Gly residue, as well as the pharmacologically acceptable addition salts of the above compounds.

2. Chemical compounds according to claim 1, characterized in that X1 represents hydrogen.

3. Chemical compounds according to claim 1, characterized in that X2 and X3 are chosen from D-Arg, D-His, D-Trp and D-Tyr.

4. Chemical compounds according to claim 2, characterized in that X2 and X3 are chosen from D-Arg, D-His, D-Trp and D-Tyr.

5. Chemical compound according to claim 1, having the following structure:

H-L-Cys-D-Arg-D-Tyr-L-Phe-L-Phe-D-Trp-

S S

I

L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH

6. Chemical compound according to claim 1, having the following structure:

H-L-Cys-D-Tyr-D-Trp-L-Phe-L-Phe-D-Trp-

I

S S

I

L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH

7. Chemical compound according to claim 1, having the structure:

H-L-Cys-D-His-D-Tyr-L-Phe-L-Phe-D-Trp-I

S S

I

L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH