CH633524A5 - Somatostatin analogs and their preparation - Google Patents

Description

La présente invention est relative à des dérivés peptidiques de somatostatine, à leurs procédés de préparation, aux compositions pharmaceutiques en contenant, ainsi qu'à des produits utilisés dans leur préparation.

On sait que le facteur inhibant la libération de somatotropine (SRIF), de type cyclique, connu sous le nom de somatostatine, présente, suivant Brazeau et coll., «Science», 179,77 (1973), la structure ci-après:

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

S S (A)

tous les aminoacides étant de la configuration naturelle ou L.

5

On a décrit dans la littérature plusieurs procédés de synthèse de la somatostatine, notamment le procédé en phase solide de Rivier, « J. Am. Chem. Soc.», 96,2986 (1974), et les procédés à solution de Sarantakis et coll., «Biochemical Biophysical Research Communica-10 tions», 54,234 (1973), et d'Immer et coll., «Helv. Chim. Acta», 57, 730 (1974). Il y a de nombreuses recherches en cours sur les peptides, dont le but est d'améliorer l'activité pharmacologique de la somatostatine en modifiant sa structure de manière synthétique.

La forme réduite (forme à chaîne ouverte) de la somatostatine is (RS) est le tétradécapeptide linéaire de la formule:

SH SH (B)

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

20 La forme réduite (B) a été préparée par synthèse totale [voir Rivier et coll., «C. R. Acad. Sci. Ser. p. Sei. Natur.» (Paris), 276, 2737 (1973), et Sarantakis et McKinley, «Biochem. and Biophys. Res. Communications», 54,234 (1973)] et cette forme peut être convertie en somatostatine (A) par oxydation, de manière qu'une 25 liaison de pontage soit formée entre les deux sulfhydryles des deux fragments aminoacides de cystéinyle dans le tétradécapeptide.

On a préparé par synthèse divers polypeptides que l'on peut considérer comme étant des modifications structurales de la somatostatine, et ces préparations ont été décrites dans la littérature 30 chimique. De tels polypeptides ont certaines caractéristiques structurales en commun avec la somatostatine et diffèrent de celle-ci en ce que des groupes fonctionnels ou des fragments aminoacides spécifiques, présents à l'origine dans la molécule de somatostatine, sont ou bien manquants ou bien remplacés par d'autres groupes fonctionnels 35 ou fragments aminoacides. La présente invention est relative à de nouveaux polypeptides synthétiques, biologiquement actifs, que l'on peut considérer comme une modification structurale de la somatostatine. Les polypeptides de l'invention diffèrent delà somatostatine sous les rapports ci-après:

io a) le segment Ala1-Gly1 est présent, manquant ou remplacé par Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Ala-D-Ala, acétyle, ou benzoyle;

b) est remplacé par Arg ou His ;

c) le reste Asn5 est remplacé par His, Glu, ou Asp, et d) le reste Trp8 est ou bien présent ou remplacé par D-Trp ou 6-45 F-D-Trp.

Tous les fragments aminoacides et les aminoacides optiquement actifs sont de la configuration L à moins d'indications contraires.

En conséquence, la présente invention prévoit des composés chimiques thérapeutiquement actifs répondant à la formule I:

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X-Cys-Xi-X2-Phe-Phe-X3-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X4-OH (I)

I I

SA SA

dans laquelle A représente de l'hydrogène ou les deux symboles A 55 signifient une liaison directe entre les atomes de soufre; X représente l'hydrogène, Ala-Gly, Gly-Gly, Ala-D-Ala, Gly-Gly-Gly, acétyle ou benzoyle; Xi représente His ou Arg; X2 représente His, Glu ou Asp, X3 représente Trp, D-Trp ou 6-F-D-Trp, et X4 représente Cys ou D-Cys, ainsi que les sels acceptables du point de vue pharmacologique 60 des composés ci-dessus.

En outre, l'invention envisage la forme linéaire des composés de la formule I, c'est-à-dire les composés réduits non cycliques de formule la ci-après, qui contiennent deux groupes sulfhydryles libres, ainsi que les sels d'addition d'acides acceptables du point de vue 65 pharmaceutique de ces composés.

SH SH

I I

X-Cys-Xj-X2-Phe-Phe-X3-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X4-OH (la)

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Les symboles identifiant les aminoacides et les fragments aminoacides dans les polypeptides décrits dans le cas présent sont les symboles qui ont été adoptés par le IUPAC-IUB Committee on Biochemical Nomenclature Recommendation (1971), et ont été décrits dans «Archives of Biochemistry and Biophysics», 150,1-8 (1972). Le symbole 6-F-D-Trp désigne D-tryptophane, où la position 6 est substituée par du fluor.

Les matières tangibles obtenues suivant l'invention présentent les propriétés physiques inhérentes d'être des matières solides de couleur blanche à ton clair, qui sont essentiellement insolubles dans le chloroforme, le benzène, etc., mais qui montrent une solubilité dans l'eau et dans des solutions acides aqueuses, par exemple des solutions d'acide chlorhydrique ou d'acide acétique. Les compositions suivant l'invention ne montrent pas de points de fusion pouvant être discernés de manière nette et elles peuvent être purifiées, par exemple par des moyens chromatographiques. Une hydrolyse des compositions suivant l'invention, par exemple dans de l'acide méthanesulfo-nique 4N, permet la détermination de leur teneur en aminoacides, qui est compatible avec les structures telles que définies précédemment.

Les matières tangibles obtenues suivant l'invention présentent une activité pharmaceutique, en particulier la caractéristique de pouvoir en pratique inhiber la libération d'une ou plusieurs des hormones formées par la somatotropine, le glucagon, l'insuline, ce qui est mis en évidence par des méthodes d'essai pharmacologiques classiques. Grâce à un contrôle du dosage, la sélectivité d'action permet l'inhibition de la libération de la somatotropine et du glucagon, sans influencer les taux de sécrétion d'insuline endogène.

En outre, on peut utiliser les matières tangibles obtenues suivant l'invention en mélange avec de l'insuline pour le traitement des animaux à sang chaud souffrant du diabète sucré.

L'invention englobe également, suivant un aspect plus particulier, les composés chimiques de la formule I, dans laquelle X est de l'hydrogène, X3 est de préférence D-Trp et X4 est de préférence Cys.

Suivant un aspect plus particulier, l'invention englobe:

a) un composé de formule I, dans laquelle X représente l'hydrogène, Ala-Gly, Ala-D-Ala, Gly-Gly ou Gly-Gly-Gly; Xt est His; X2 est His; X3 est Trp ou D-Trp, et X4 est Cys.

b) un composé de formule I, dans laquelle X représente l'hydrogène, Ala-Gly, Ala-D-Ala, Gly-Gly ou Gly-Gly-Gly; Xj est Arg; X2 est His; X3 est Trp ou D-Trp, et X4 est Cys ou D-Cys.

c) un composé de formule I, dans laquelle X représente l'hydrogène, Xj est His, X2 est His, X3 est Trp ou D-Trp, et X4 est Cys ou D-Cys.

d) un composé de formule I, dans laquelle X représente l'hydrogène, Ala-Gly, Gly-Gly-Gly, Ala-D-Ala, acétyle ou benzoyle;

Xj est Arg ou His;

X2 est Glu ou Asp;

X3 est Trp ou D-Trp, ou 6-F-D-Trp, et

X4 est Cys ou D-Cys;

X! et X2 sont de préférence tous deux His, ou bien Xj représente Arg et X2 représente Glu. Des composés tout particulièrement préférés sont:

H-Cys-Arg-His-Phe-Phe-D-Trp-Lys

I

S S

I

Thr-Phe-Thr-Ser- Cys-OH,

H-Cys-His-His-Phe-Phe-T rp-Lys-

Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH,

H-Cys-His-His-Phe-Phe-D-Trp-Lys I

S S

I

Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH,

H-Cys-His-His-Phe-Phe-D-T rp-Ly s-

I

S S

I

Thr-Phe-Thr-Ser-D-Cys-OH H-Cys-Arg-Glu-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys

I I

S S

et H-Cys-His-Glu-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys

I I

S S

ainsi que leurs formes réduites (chaîne ouverte).

L'invention envisage également des intermédiaires protégés pour les composés de la formule I, notamment des composés répondant à la formule:

R1-Cys-B1-B2-Phe-Phe-X3-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X4-OR

! I I I I I

Sa R6 R7 R8 R9 Sß (II)

dans laquelle R est un groupe protecteur de carboxyle (par exemple un alcoyle, un aralcoyle) ou un support de résine de polystyrène, lié à l'intervention d'un groupe de méthylène, c'est-à-dire que, dans ce cas, R représente — CH2 — support de résine de polystyrène; R1 représente un groupe protecteur d'a-amino ou un groupe Ala-Gly, Gly-Gly, Ala-D-Ala ou Gly-Gly-Gly protégé en a-amino, ou encore l'acétyle ou le benzoyle;

R2 R3

I I

Bj représente His ou Arg, où R3 est un groupe protecteur pour les atomes d'azote de chaîne latérale de l'arginine et R2 est l'hydrogène ou un groupe protecteur pour l'atome d'azote d'imidazole de l'histidine;

B2 représente His tel que défini ci-dessus, Glu ou Asp, où R4 et Rs

I I I

R2 R4 Rs sont respectivement des groupes protecteurs pour les groupes car-boxy de chaîne latérale de l'acide glutamique et de l'acide aspartique; R6 est un groupe protecteur pour le groupe amino de chaîne latérale de la lysine; R7, R8 et R9 sont chacun des groupes protecteurs pour les groupes hydroxyles de la thréonine et de la sérine; X3 représente Trp, D-Trp ou 6-F-D-Trp; X4 représente Cys ou D-Cys, et a et ß représentent chacun un groupe protecteur de sulfhydryle ou de l'hydrogène, ou bien a et ß représentent une liaison directe entre les atomes de soufre.

Des exemples de groupes protecteurs d'a-amino pour R1 ou comme partie de R1 sont: 1) des groupes protecteurs du type acyle, illustrés par formyle, trifluoroacétyle, phtalyle, p-toluènesulfonyle (tosyle), nitrophénylsulfényle, etc. ; 2) des groupes protecteurs du type uréthanne aromatiques, illustrés par le benzyloxycarbonyle et les benzyloxycarbonyles substitués, notamment le p-chlorobenzyloxycarbonyle et le p-nitrobenzyloxycarbonyle; 3) des groupes protecteurs du type uréthanne aliphatique, illustrés par tert-butyloxycarbonyle, diisopropylméthoxycarbonyle, isopropyloxycar-bonyle, allyloxycarbonyle, 2,2,2-trichloroéthoxycarbonyle, amyloxy-carbonyle; 4) des groupes protecteurs du type uréthanne cycloalcoy-liques, illustrés par le cyclopentyloxycarbonyle, l'adamantylcarbo-nyle, le cyclohexyloxycarbonyle; 5) des groupes protecteurs du type thio-uréthanne, tels que le phénylthiocarbonyle; 6) des groupes protecteurs du type alcoyle, tels qu'illustrés par le triphénylméthyle (trityle); 7) des groupes de trialcoylsilane, par exemple le triméthyl-silane. Le groupe protecteur préféré d'a-amino est le tert-butyloxycarbonyle.

Des exemples de R3 sont nitro, tosyle, benzyloxycarbonyle, adamantyloxycarbonyle ou tert-butyloxycarbonyle, avec une préférence pour le tosyle.

Une protection via le groupe nitro ou tosyle se fait sur l'un ou l'autre des atomes d'azote N™ ou Nral de l'arginine, tandis que les

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groupes protecteurs du type oxycarbonyle protègent l'atome N8 et l'un ou l'autre des atomes d'azote Nra ou NMl.

Des exemples de R2 sont tosyle, benzyloxycarbonyle, adamanty-loxycarbonyle et tert-butyloxycarbonyle, de préférence le groupe tosyle.

Le groupe amino de chaîne latérale de la lysine est protégé par Rs qui peut être exemplifié par tosyle, t-amyloxycarbonyle, t-butyloxycarbonyle, diisopropyloxycarbonyle, benzyloxycarbonyle, halobenzyloxycarbonyle, nitrobenzyloxycarbonyle, etc., le groupe 2-chlorobenzyloxycarbonyle étant préféré.

Des exemples de groupes protecteurs R7, R8 et R9 pour le groupe hydroxyle de la thréonine et de la sérine sont l'acétyle, le benzoyle, le butyle tertiaire et le benzyle, avec une préférence pour ce dernier.

Des exemples de R4 et R5 sont le benzyle et le t-butyle.

Des exemples des groupes protecteurs a et ß pour le groupe sulfhydryle du fragment aminoacide de cystéine sont le benzyle; les benzyles substitués dans lesquels le substituant est constitué par au moins l'un des radicaux méthyle, méthoxy, nitro ou halo (par exemple 3,4-diméthylbenzyle, p-méthoxybenzyle, p-chlorobenzyle, p-nitrobenzyle, etc.), trityle, benzyloxycarbonyle, benzhydryle, p-méthoxybenzyloxycarbonyle, benzylthiométhyle, éthylcarbamoyle, thioéthyle, tétrahydropyrannyle, acétamidométhyle, benzoyle, sel s-sulfonique, avec une préférence pour le groupe p-méthoxybenzyle.

On peut préparer les composés de la formule I par enlèvement de tous les groupes protecteurs et du support de résine de polystyrène lorsqu'il y en a un, au départ d'un composé de formule II tel que défini précédemment, avec ensuite, si on le désire, l'oxydation ou la réduction du produit pour donner la forme cyclique ou à chaîne ouverte et, si on le désire également, l'isolement sous la forme de la base libre ou sous la forme d'un sel acceptable en pharmacologie.

La séparation des groupes protecteurs peut être réalisée par des méthodes connues en pratique pour les groupes protecteurs en question. Les groupes protecteurs sont de préférence enlevés au cours d'une seule phase, par exemple en utilisant de l'acide fluorhydrique en présence d'anisole.

Le support de résine de polystyrène peut être séparé en même temps que l'enlèvement des groupes protecteurs, par exemple en utilisant de l'acide fluorhydrique en présence d'anisole, ou bien il peut être scindé par transestérification pour donner un intermédiaire protégé sur le carboxyle de formule II, dans laquelle R est une fonction ester. A titre d'exemple, une méthanolyse donne un intermédiaire d'ester méthylique de formule II, dans laquelle R représente le méthyle. L'hydrolyse de ces esters donne la fonction carboxyle C-terminale requise.

Par un choix approprié des groupes protecteurs, les groupes protecteurs a et ß peuvent être séparés sélectivement des composés de la formule II pour donner les dérivés disulfhydryles libres de formule II, dans laquelle a et ß représentent de l'hydrogène. A titre d'exemple, lorsque a et ß sont un radical trityle ou acétamido, ils peuvent être sélectivement séparés par l'action d'un sel mercurique ou d'un sel d'argent pour obtenir le dérivé disulfhydryle correspondant sous la forme de son sel mercurique ou de diargent correspondant. Ce dernier sel peut être soumis à l'action d'hydrogène sulfuré pour obtenir le dérivé disulfhydryle libre correspondant de formule II.

Les dérivés disulfhydryles libres des formules I et II peuvent chacun être cyclisés par oxydation en utilisant un agent oxydant, par exemple de l'iode, de l'oxygène (tel l'air), du 1,2-diiodoéthane ou du ferricyanure de sodium ou de potassium, pour obtenir le composé correspondant de formule I, dans laquelle les deux groupes A forment une liaison directe, et de formule II, dans laquelle a et ß forment une liaison directe.

Les produits polypeptides finals et leurs intermédiaires nécessaires peuvent se préparer par le procédé en phase solide bien connu, tel que décrit, par exemple, par Merrifield, «J. Am. Chem. Soc.», 85, 2149 (1963), ou encore par une synthèse classique. La présente invention prévoit donc également un procédé de préparation d'un composé de formule II, dans laquelle a et ß sont des groupes protecteurs et R représente un support de résine de polystyrène, ce procédé comprenant la combinaison séquentielle des aminoacides convenablement protégés et/ou activés requis sous des conditions de synthèse en phase solide pour donner un support de résine chloromé-5 thylé ou hydroxyméthylé. A titre de variante, les composés de la formule II, dans laquelle a et ß sont des groupes protecteurs et R est un groupe protecteur de carboxyle, peuvent se préparer par combinaison des aminoacides convenablement protégés et/ou activés requis ou des groupes d'aminoacides de ce genre par des procédés connus io pour la formation de liaisons peptidiques afin d'obtenir la séquence désirée d'aminoacides. Les groupes protecteurs a et ß peuvent ensuite être séparés sélectivement et le produit peut être oxydé pour former le disulfure cyclique de formule II, dans laquelle a et ß forment une liaison directe.

15 Des procédés d'activation des aminoacides avant la combinaison, et les procédés de combinaison eux-mêmes sont bien connus en pratique et on peut se reporter notamment au manuel de Schroeder et Lubke mentionné précédemment.

Dans le choix d'un groupe protecteur particulier de chaîne 20 latérale à utiliser dans la synthèse des peptides suivant l'invention, on devrait suivre les règles suivantes : a) le groupe protecteur de chaîne latérale doit être stable vis-à-vis du réactif et sous les conditions de réaction choisies pour la séparation du groupe protecteur d'a-amino à chaque étape de la synthèse; b) le groupe protecteur doit conserver 25 ses propriétés protectrices (c'est-à-dire ne pas se séparer sous les conditions de combinaison), et c) le groupe protecteur de chaîne latérale doit être séparable à la fin de la synthèse comportant le séquence désirée d'aminoacides sous des conditions de réaction qui ne modifieront pas la chaîne peptique.

30 Dans le procédé classique tel qu'appliqué aux composés suivant la présente invention, le peptide désiré est construit par condensation d'aminoacides ou de groupes d'aminoacides qui sont protégés suivant les nécessités. Les réactions de condensation peuvent être réalisées en utilisant des procédés d'une façon générale pour la 35 formation de liaisons d'amide dans la chimie des peptides et des pénicillines. Pour favoriser une condensation facile des aminoacides, il est préférable d'utiliser un agent de condensation. Des exemples d'agents de condensation sont les carbodiimides, par exemple le N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCQ, le N,N'-.40 diisopropylcarbodiimide. A titre de variante, la condensation peut être réalisée en activant l'un des groupes terminaux ou les deux. Des exemples de la forme activée du carboxyle terminal sont le chlorure d'acide, l'anhydride d'acide, l'azoture d'acide et l'ester activé. Il sera évident pour les spécialistes en ce domaine que le procédé proposé de 45 réalisation des réactions de condensation doit être compatible avec les groupes protecteurs existant sur les aminoacides.

Dans la construction de la molécule par l'intermédiaire du procédé classique, il est préférable de condenser un peptide protégé de la formule:

50 R1-Cys-B1-B2-Phe-OH

I

Sa (Via)

avec un peptide protégé de formule : s, H-Phe-X3-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X4-OR

II III

R6 R7 R8 R9 Sß

dans laquelle R est un groupe protecteur de carboxyle (de préférence le benzyle), R1, R6, R7, R8, R9, Blt B2, X3 et X4 sont tels que définis 60 précédemment, et a et ß sont des groupes protecteurs, de préférence le p-méthoxybenzyle, afin d'obtenir un composé de formule II qui est débarrassé de sa protection et cyclisé.

Dans le procédé en phase solide, tel qu'appliqué aux composés suivant la présente invention, la cystéine protégée en a-amino et en 65 sulfhydryle est d'abord attachée à une résine de polystyrène chloro-méthylée, avec ensuite séparation du groupe protecteur d'a-amino en utilisant de l'acide trifluoroacétique dans du chlorure d.e méthylène, de l'acide trifluoroacétique seul ou du HCl dans du dioxanne. La

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suppression de la protection est réalisée à une température comprise entre environ 0°C et la température ambiante. D'autres réactifs et conditions classiques de séparation pour l'enlèvement des groupes protecteurs d'a-amino peuvent s'utiliser comme décrit par Schroeder et Lubke, «The Peptides», 1, 72-75 (Academic Press, 1965). Après enlèvement du groupe protecteur d'a-amino, les aminoacides protégés désirés suivants sont combinés individuellement à la séquence supportée sur la résine, et ce en série. A titre de variante, de petits fragments de peptide peuvent être préparés, par exemple par le procédé à solution, et introduits dans la réaction en phase solide dans l'ordre désiré. Chaque aminoacide protégé ou chaque séquence d'aminoacides protégés est introduire) dans la réaction en phase solide en un excès d'environ quatre fois. La combinaison est réalisée dans du diméthylformamide, du chlorure de méthylène ou un mélange de ces deux solvants. Le succès de chaque réaction de combinaison à chaque stade de la synthèse est déterminé par la réaction à la ninhydrine, telle que décrite par E. Kaiser et coll., «Analyt. Biochem.», 34, 595 (1970). Lorsqu'une combinaison incomplète s'est produite, la réaction est répétée avant que le groupe protecteur d'a-amino soit séparé pour l'introduction de l'aminoacide suivant ou de la séquence suivante d'aminoacides.

Les réactifs préférés de combinaison sont le 1-hydroxybenzotriazole et le diisopropylcarbodiimide, mais d'autres réactifs intéressants sont connus des spécialistes.

Après que la séquence désirée d'aminoacides a été synthétisée, le Polypeptide est séparé du support de résine par traitement, par exemple avec de l'acide fluorhydrique et de l'anisole, afin d'obtenir le Polypeptide linéaire totalement débarrassé de ses protections. Le disulfure cyclique peut être produit par oxydation à l'air ou, par exemple, par oxydation avec du K3Fe(CN)6.

Les sels d'addition non toxiques des polypeptides linéaires et cycliques sont produits par des procédés bien connus en pratique au départ des acides chlorhydrique, bromhydrique, sulfurique, phos-phorique, polyphosphorique, maléique, acétique, citrique,

benzoïque, succinique, malonique, ascorbique, etc., le sel d'acide acétique étant préféré.

Les groupes protecteurs utilisés dans la totalité de la synthèse en phase solide sont bien connus en pratique. Les groupes protecteurs d'a-amino, utilisés avec chaque aminoacide introduit dans la séquence du polypeptide final, sont: 1) des groupes protecteurs du type acyle, illustrés par formyle, trifluoroacétyle, phtalyle, p-toluènesulfonyle (tosyle), nitrophénylsulfényle, etc.; 2) des groupes protecteurs du type uréthanne aromatiques, illustrés par le benzyloxycarbonyle et les benzyloxycarbonyles substitués, tels que le p-chlorobenzyloxycarbonyle, le p-nitrobenzyloxycarbonyle; 3) des groupes protecteurs du type uréthanne aliphatiques, illustrés par tert-butyloxycarbonyle, diisopropylméthoxycarbonyle, isopropyloxycar-bonyle, allyloxycarbonyle; 4) des groupes protecteurs du type uréthanne cycloalcoyliques, illustrés par cyclopentyloxycarbonyle, adamantyloxycarbonyle, cyclohexyloxycarbonyle; 5) des groupes protecteurs du type thio-uréthanne, tels que le phénylthiocarbonyle; 6) des groupes protecteurs du type alcoyle, tels qu'illustrés par le triphénylméthyle (trityle); 7) des groupes de trialcoylsilane, par exemple le triméthylsilane. Le groupe protecteur préféré d'a-amino est le tert-butyloxycarbonyle.

L'atome d'azote d'imidazole de l'histidine, désigné par Nim, est protégé par un groupe qui peut être tosyle, benzyloxycarbonyle, adamantyloxycarbonyle ou tert-butyloxycarbonyle, de préférence le groupe tosyle.

La protection pour le groupe amino de chaîne latérale de la lysine peut se faire par un groupe pouvant être tosyle, t-amyloxycarbonyle, t-butyloxycarbonyle, diisopropyloxycarbonyle, benzyloxycarbonyle, halobenzyloxycarbonyle, nitrobenzyloxycarbonyle, etc., de préférence le groupe 2-chlorobenzyloxycarbonyle.

Les atomes d'azote de chaîne latérale de l'arginine, désignés par Ns, sont protégés par un groupe qui peut être nitro, tosyle, benzyloxycarbonyle, adamantyloxycarbonyle ou tert-butyloxycarbonyle, de préférence le tosyle. La protection via le groupe nitro ou tosyle se fait sur l'un ou l'autre des atomes d'azote N<° ou N™1, tandis que des groupes protecteurs du type oxycarbonyle protègent l'atome N8 et l'un ou l'autre des atomes d'azote N® ou Noi.

5 La protection pour le groupe hydroxyle et la thréonine et de la sérine peut se faire par l'acétyle, le benzoyle, le butyle tertiaire, le benzyle. Le groupe benzyle est préféré à cet effet.

Le groupe protecteur pour le groupe sulfhydryle du fragment aminoacide de cystéinyle est un groupe choisi dans la classe io comprenant le benzyle et les benzyles substitués, dans lesquels le substituant est constitué par au moins un des radicaux suivants: méthyle, méthoxy, nitro, ou halo (par exemple 3,4-diméthylbenzyle, p-méthoxybenzyle, p-chlorobenzyle, p-nitrobenzyle, etc.), trityle, benzyloxycarbonyle, benzhydryle, p-méthoxybenzyloxycarbonyle, is benzylthiométhyle, éthylcarbamoyle, thioéthyle, tétrahydropyran-nyle, acétamidométhyle, benzoyle, sel s-sulfonique, etc., le groupe p-méthoxybenzyle étant préféré.

Les compositions suivant la présente invention, comme la somatostatine elle-même, peuvent exister ou bien sous la forme à chaîne 20 ouverte monomère (dite forme réduite), ou bien sous la forme cyclique monomère (dite forme oxydée). Chacune de ces formes peut être produite grâce à un procédé essentiellement identique à celui utilisé pour obtenir la forme correspondante de la somatostatine elle-même. Ces procédés sont connus des spécialistes en ce domaine. La 25 forme réduite est représentée ici par la structure dans laquelle A est de l'hydrogène; de la sorte, il y a des substituants thiols libres sur les deux fragments aminoacides de Cys. La forme oxydée est représentée ici par la même structure lorsque les deux groupes A représentent une liaison directe, c'est-à-dire qu'il y a une seule liaison entre les atomes 30 de soufre portés par les deux fragments aminoacides de Cys, de sorte qu'un cycle monomère est formé.

En outre, les composés peuvent exister sous la forme dite réduite polymère (voir par exemple le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3926937), cette forme pouvant être obtenue par le procédé décrit 35 en pratique pour l'obtention d'une somatostatine réduite polymère. Cette forme polymère peut être illustrée par la formule:

—(H>

M

S

I

X-L-Cys-Xi-X2-L-Phe-L-Phe-X3-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L- X4-OH

(II)

-(H>

M

N

dans laquelle X, X1 et X2 ont la définition donnée pour la formule I, M est égal à 0 ou à 1, et N est un nombre entier de 2 à 100 50 inclusivement. Dans la structure entre parenthèses, lorsque X est différent de H, les liaisons soufre-soufre sont formées au hasard entre Cys3-Cys3, Cys3-Cys14, et Cys14-Cys14 (où X désigne H, Cys1 au lieu de Cys3, etc.). La structure est cyclique lorsque M est égal à 1, c'est-à-dire lorsque le composé ne contient pas de groupe SH libres et qu'il y 55 a une liaison entre les atomes de soufre portés par les fragments Cys terminaux. Pour les besoins de la présente invention, les formes réduites polymères sont, du point de vue qualitatif, tout à fait équivalentes des composés revendiqués plus particulièrement.

L'activité pharmacologique des peptides suivant la présente 60 invention caractérise les composés comme étant intéressants dans le traitement de l'acromégalie et du diabète de la même manière que dans le cas de la somatostatine elle-même. L'administration des peptides peut se faire par les voies traditionnelles courantes pour la somatostatine et les polypeptides apparentés, d'après les indications 65 d'un médecin, et ce en une quantité dictée par le degré de disfonctionnement déterminé par le médecin. On peut administrer les composés seuls ou en combinaison avec des supports et des adjuvants traditionnels, acceptables en pharmacie, sous la forme de doses unitaires.

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6

Comme on l'a signalé précédemment, les compositions suivant la présente invention sont également intéressantes en mélange avec l'insuline pour le traitement d'animaux à sang chaud souffrant du diabète sucré. On peut se reporter, par exemple, au brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3912807, qui prévoit l'utilisation d'une quantité efficace d'une composition comprenant de la somatostatine en mélange avec de l'insuline pour le traitement d'animaux à sang chaud souffrant du diabète sucré.

Dans l'utilisation thérapeutique à titre d'agents pour le traitement de l'acromégalie, du diabète juvénile et du diabète sucré, le traitement est amorcé avec de petites doses qui sont inférieures à la dose optimale du composé. Ensuite, la dose est accrue par petites quantités jusqu'à ce que l'on atteigne l'effet optimal sous les circonstances en cause. D'une façon générale, les composés de l'invention sont administrés à un taux de dosage qui donnera d'une façon générale des résultats efficaces sans provoquer d'effets secondaires nuisibles ou désagréables. Les doses peuvent cependant être modifiées suivant les exigences relatives au patient et suivant le composé que l'on utilise. Pour la commodité, la dose journalière totale peut être subdivisée et administrée par portions sur la journée, et ce suivant les désirs.

En conséquence, l'invention englobe en outre des compositions pharmaceutiques comprenant un composé de la formule I ou un sel acceptable du point de vue pharmacologique de celui-ci, en association avec un support ou véhicule acceptable du point de vue pharmacologique. Ces compositions pharmaceutiques sont de préférence sous la forme de doses unitaires.

Les exemples suivants illustreront plus complètement encore la présente invention sans pour autant limiter le cadre de celle-ci.

Exemple 1:

tert-Butyloxycarbonyl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cystéinyl-Nim-Tosyl-L-Histidyl-Nim-Tosyl-L-Histidyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-N£-2-Chlorobenzyloxycarbonyl-L-Lysyl-0-Benzyl-L-Thréonyl-L-Phénylalanyl-O-Benzyl-L-Thréonyl-O-Benzyl-L-Séryl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cystéinyl-Hydroxyméthylpolystyrène, ester

Une résine de polystyrène chlorométhylée (Lab Systems, Inc.), réticulée à 1 % avec du divinylbenzène, est estérifiée avec du BOC-Cys-(SMBzl)OH suivant Gisin, «Helv. Chim. Acta», 56,1976 (1973). L'ester de résine de polystyrène est traité suivant le programme A pour l'incorporation de BOC-Ser(Bzl)OH, BOC-Thr(Bzl)OH, BOC-Phe-OH, BOC-Thr(Bzl)OH, BOC-Lys(Clz)OH, BOC-D-Trp-OH, BOC-Phe-OH, BOC-Phe-OH, BOC-His(Tos)OH, BOC-His(Tos)OH, et BOC-Cys(SMBzl)OH, afin d'obtenir la peptidoré-sine citée en rubrique.

Programme A:

1. lavage avec du CH2C12 x 3;

2. traitement avec du TFA-CH2C12-EDT (1/1/5%, v/v) pendant 5 min;

3. traitement comme suivant 2 pendant 25 min ;

4. lavage avec du CH2C12 x 3;

5. lavage avec du DMF;

6. traitement avec du TEA à 12% dans du DMF, deux fois, pendant 3 min;

7. lavage avec du DMF ;

8. lavage trois fois au CH2C12 ;

9. traitement avec 4 équivalents du dérivé aminoacide correspondant dans du CH2C12-DMF et agitation pendant 5 min;

10. addition en deux portions de 5 équivalents de DIC en dissolution dans du CH2C12 sur une période de 30 min, durée de réaction de 6h;

11. lavage avec du DMF x 3;

12. lavage avec du CH2C12 x 3;

13. réaction d'essai à la ninhydrine, suivant Kaiser et coll., «Annal. Biochem.», 34,595 (1970).

Dans le cas d'une réaction incomplète, on répète les phases opératoires 9 à 13 ci-dessus.

Exemple 2:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystéinyl-L-Histidyl-L-Histidyl-L-

Phênylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-

Phénylalanyl-L-Thréonyl-L-Sêryl-L-Cystéine

On mélange la peptidorésine de l'exemple 1 (9 g) avec 18 mg d'anisole et on traite avec du HF liquide (180 ml) pendant 45 min dans un bain de glace. On sépare l'excès de HF sous vide aussi vite que possible (environ 1 h) et on extrait le reste avec de l'acide acétique glacial 2M, puis on filtre. Le filtrat est lavé à l'éther et la couche aqueuse est oxydée avec du K3Fe(CN)6 à un pH de 7. L'excès d'oxydant est séparé par une résine échangeuse d'ions Bio-Rad AG-3, puis on absorbe le peptide sur une résine échangeuse d'ions Bio-Rex 70 et on élue avec un tampon de Pyridine de pH 7 pour obtenir, après lyophilisation, 1,5 g de matière que l'on applique sur une colonne de Sephadex G15 (2,5 x 160 cm) et que l'on élue avec de l'acide acétique aqueux à 15%. Les fractions (5,2 ml chacune) des tubes 88-90 sont rassemblées et lyophilisées pour donner le composé cité en rubrique, 174 mg.

Rf(BWA, 4/1/1) 0,45 Rf (BWAP, 30/24/6/20) 0,64

Analyse des aminoacides:

Thr(2): 1,87 Ser(l):0,89 Cys(2): 1,16 Phe(3):3 Lys(l): 1,05 His(2): 1,76 Trp: non déterminé.

Exemple 3:

L'activité pharmacologique in vivo du dodécapeptide préparé suivant l'exemple 2 a été établie par les procédés suivants avec les résultats indiqués.

Suppression de l'hormone de croissance

Une injection sous-cutanée de peptide solubilisé ou mis en suspension dans une solution saline physiologique est faite à des rats mâles Charles River CD, qui ne sont pas à jeun. Des rats correspondants ayant subi une injection sous-cutanée d'une solution saline témoin servent d'animaux témoins de manière que chaque rat expérimental soit accompagné d'un rat témoin. Les rats sont maintenus dans des cages séparées et, 20 min avant la fin de la période d'essai, ils reçoivent une injection dans le péritoine de Nembutal à une dose de 50 mg/kg. On obtient des échantillons de sang par une ponction cardiaque et on sépare le plasma pour la détermination par voie radio-immunologique de la concentration d'hormone de croissance (GH) en ng/ml. On prévoit des périodes de 2 et 4 h après injection pour vérifier la durée de l'activité du peptide dans la suppression des taux de GH périphériques en circulation. Des comparaisons entre les valeurs de GH obtenues sur les rats témoins et sur les rats expérimentaux à chacun des moments indiqués sont estimées par la méthode d'essai t de Student et la signification statistique p au taux de 0,05 ou à un taux inférieur est utilisée à titre d'indice d'activité.

Composé (dose)

2h

4h

Témoin

Exemple 2 (1 mg/kg)

118 ±20 32 ± 6 p = < 0,01

115 ± 23 62 ± 13 p = < 0,01

Suppression de l'hormone de croissance, du glucagon et de l'insuline On répartit des rats mâles albinos en trois groupes (9 rats par groupe) et on leur injecte dans le péritoine du Nembutal a raison de 50 mg/kg. 15 min après l'injection de Nembutal, on injecte par voie sous-cutanée suivant le groupe : a) le composé essayé, normalement à raison de 10-2000 ng/kg; b) du SRIF à raison de 200 |xg/kg, ou c) une solution saline physiologique. 10 min plus tard, on injecte dans le cœur 0,5 ml d'arginine (300 mg/ml, pH de 7,2). Les rats sont décapités 5 min après avoir reçu l'arginine et on récolte leur sang dans du Trasylol-EDTA. De petites quantités appropriées sont alors soumises à une détermination quant à l'hormone de croissance, au glucagon et à l'insuline. Un composé actif est un composé qui

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

633 524

modifie de façon significative le taux, dans le plasma, de l'une quelconque de ces hormones par rapport aux animaux témoins traités par la solution saline. Des comparaisons entre les valeurs témoins et les valeurs expérimentales sont estimées de manière statistique par l'analyse de variance, et la signification statistique p au taux de 0,05 ou moins est utilisée à titre d'indice d'activité.

Composé (dose |ig/kg)

GH (ng/ml)

Insuline (|iU/ml)

Glucagon (Pg/ml)

Témoin

Exemple 2 (100)

163 ± 29 20 ± 8 p < < 0,01

278 ± 32 202 + 49 p = > 0,05

69 ± 13 20 ± 8 p = < 0,01

Exemple 4:

tert-Butyloxycarbonyl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cystéinyl-NS"-Tosyl-L-Arginyl-N'm-Tosyl-L-Histidyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-N£-2-Chlorobenzyloxycarbonyl-L-Lysyl-0-Benzyl-L-Thréonyl-L-Phénylalanyl-O-Benzyl-L-Thrêonyl-O-Benzyl-L-Séryl-S-p-Mëthoxybenzyl-L-Cystéinyl-Hydroxymèthylpolystyrène, ester

Une résine de polystyrène chlorométhylée (Lab Systems, Inc.), réticulée à 1 % avec du divinylbenzène, est estérifiée avec du Boc-Cys(SMBzl)-OH suivant Gisin, «Helv. Chim. Acta», 56,1976 (1973). L'ester de résine de polystyrène est traité suivant le programme A ci-après pour l'incorporation de Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Lys(ClZ)-OH, Boc-D-Trp-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Phe-OH, Boc-His(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH et Boc-Cys(SMBzl)-OH, afin d'obtenir la peptidorésine citée en rubrique.

Programme A:

1. on lave trois fois avec du CH2 Cl2 ;

2. on traite avec du TFA-CH2C12-EDT (1/1/5%, v/v) pendant 5 min;

3. on traite comme suivant 2 pendant 25 min ;

4. on lave avec du CH2C12 x 3;

5. on lave avec du DMF ;

6. on traite avec du TEA à 12% dans du DMF, deux fois pendant 3 min;

7. on lave avec du DMF ;

8. on lave avec du CH2C12 x 3;

9. on traite avec 4 équivalents du dérivé aminoacide correspondant dans du CH2C12-DMF et on agite pendant 5 min;

10. on ajoute en deux portions 5 équivalents de DIC en dissolution dans du CH2C12 sur une période de 30 min, durée de réaction de 6 h;

11. on lave avec du DMF x 3;

12. on lave avec du CH2C12 x 3;

13. on procède à un essai par la réaction à la ninhydrine suivant Kaiser et coll. «Annal. Biochem.», 34, 595 (1970).

Dans le cas d'une réaction incomplète, on répète les phases opératoires 9 à 13 ci-dessus.

ExempleS:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystéinyl-L-Arginyl-L-Histidyl-L-

Phénylalaryl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-

Phénylalanyl-L-Thréonyl-L-Sêryl-L-Cystèine

On mélange la peptidorésine de l'exemple précédent (8,5 g) avec 16 ml d'anisole et on traite avec du HF liquide (100 ml) pendant 45 min. On sépare l'excès de HF sous vide aussi vite que possible et on reprend le reste dans de l'acide acétique aqueux à 25%. Le support polymère est séparé par filtration et on lave le filtrat à l'éther. La couche aqueuse est versée dans 3,51 d'eau, on règle le pH avec du NH4.OH à 7, et on oxyde ensuite le composé sulfhydryle avec du K3Fe(CN)6. Le pH est ajusté à 5 avec de l'acide acétique glacial et on sépare l'oxydant inorganique avec du Bio-Rad AG 3. La matière peptidique est absorbée sur du Bio-Rex 70 et on élue avec un tampon de Pyridine de pH 7 pour obtenir le composé brut, 2 g. On fait passer cettematièreàtraversunecolonnedeSephadexG-15(2,5 x 160 cm) et on élue avec du AcOH aqueux à 15%. La matière des fractions 47 à 93 (5,2 ml pour chaque fraction) (886 mg) est appliquée sur une colonne de CM-Sephadex G-25 et on élue avec un gradient de NH4OAc progressif (NH40Ac 0,1 à 0,3 molaire) pour obtenir le composé cité en rubrique. Cette matière est appliquée sur une colonne de Sephadex LH 20 (2,5 x 92 cm) et on élue avec du AcOH aqueux à 10%. Le composé cité en rubrique émerge à l'état pur dans les fractions 55 à 63 (4,1 ml chacune). Production: 159 mg.

Rf(BWA, 4/1/1): 0,46 Rf(BWAP, 30/24/6/20): 0,65

Analyse des aminoacides:

Thr (2) : 1,94 Ser (1) : 0,91 Cys (2) : 1,79 Phe (3): 3 His (1): 1,02 Lys (1): 0,85 Arg (1) : 0,95 Trp : non déterminé.

Exemple 6:

L'activité pharmacologique in vivo du composé préparé suivant l'exemple 5 a été déterminée par le procédé suivant les résultats indiqués.

Suppression de l'hormone de croissance, du glucagon et de l'insuline On répartit des rats mâles albinos en deux groupes (9 rats par groupe) et on leur injecte dans le péritoine du Nembutal à raison de 50 mg/kg. 15 min après l'injection de Nembutal, on injecte par voie sous-cutanée le composé d'essai à l'un des groupes et une solution saline physiologique à l'autre groupe. 10 min plus tard, on injecte 0,5 ml d'arginine (300 mg/ml, pH de 7,2) dans le cœur des rats. Ceux-ci sont décapités 5 min après avoir reçu l'arginine et on récolte le sang dans du Trasylol-EDTA. De petites quantités appropriées sont soumises à détermination pour ce qui concerne l'hormone de croissance (GH), le glucagon (GLUN) et l'insuline (INS). Un composé actif est un composé qui modifie de façon significative le taux, dans le plasma, de l'une quelconque de ces hormones par rapport aux rats traités avec la solution saline. Des comparaisons entre les valeurs témoins et les valeurs expérimentales sont estimées de manière statistique par l'analyse de variance, et on utilise la signification statistique p au taux de 0,05 ou moins à titre d'indice d'activité.

Résultats

Expé

Dose

GH

INS

GLUN

rience

(fig/kg)

(ng/ml)

(UN/ml)

(Pg/ml)

1

257 + 49

177 ± 19

61 ± 9

100

61+5

52 + 16*

0 + 0*

2

•—•

131 ± 43

262 ± 26

42 +6

10

71 ± 21*

238 ± 72

4 + 3*

*p <0,01

Exemple 7:

tert-Butyloxycarbonyl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cystéinyl-im-Tosyl-L-Histidyl-im-Tosyl-L-Histidyl-L-Phënylalanyl-L-Phênylalanyl-D-Tryptophyl-e-2-Chlorobentyloxycarbonyl-L-Lysyl-O-Benzyl-L-Thro-nyl-L-Phénylalanyl-O-Benzyl-L-Thréonyl-O-Bentyl-L-Sêryl-S-p-Mé-thoxybenzyl-D-Cystényl-Hydroxymêthylpolystyrène, ester

Une résine de polystyrène chlorométhylée (Lab Systems, Inc.), réticulée à 1 % avec du divinylbenzène, est estérifiée avec du Boc-D-Cys(SMBzl)OH suivant Gisin, «Helv. Chim. Acta», 56,1976 (1973). L'ester de résine de polystyrène est traité suivant le programme A pour l'incorporation de Boc-Ser(Bzl)OH, Boc-Thr(Bzl)OH, Boc-Phe-OH, Boc-Thr(Bzl)OH, Boc-Lys(ClZ)OH, Boc-D-Trp-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Phe-OH, Boc-His(Tos)OH, Boc-His(Tos)OH et Boc-Cys(SMBzl)OH, afin d'obtenir la peptidorésine citée en rubrique.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

633 524

8

Exemple 8:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystéinyl-L-Histidyl-Histidyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phénylalanyl-L-Thréonyl-L-Séryl-D-Cystéine, sel diacétate

La peptidorésine de l'exemple précédent (10 g) est mélangée avec 20 ml d'anisole et traitée avec du HF liquide (150 ml) dans un bain de glace pendant 45 min et à l'exclusion de l'air. L'excès de HF liquide est séparé sous vide et le reste est repris dans du AcOH aqueux à 50%. Le mélange est filtré et le filtrat est dilué à l'eau jusqu'à 3,51. On ajuste le pH à 7 avec du NaOH dilué et on oxyde le peptide disulfhydryle avec du K3F(CN)6 pour obtenir le disulfure cyclique. Le pH du mélange est ajusté à 5 avec du AcOH glacial et traité avec du Bio-Rad AG 3. La matière peptidique est absorbée sur du Bio-Rex 70 (forme H+) et éluée avec un tampon de pyridine (Py-H20-AcOH, 30/66/4, v/v). Les fractions contenant la matière peptidique sont rassemblées et lyophilisées pour donner 1,6 g de matière brute. Cette dernière est appliquée sur une colonne de Sephadex LH-20 (2,5 x 90 cm) et éluée avec du AcOH aqueux à 10% (fractions de 5,8 ml chacune). La matière qui émerge dans les fractions 97-101 est rassemblée et lyophilisée pour obtenir le dodécapeptide cité en rubrique, 171 mg.

Chromatographie en couche mince, plaques de verre préalablement enrobées d'Avicel,

Rf(BWA, 4/1/1, v/v): 0,32 Rf (BWAP, 30/24/6/20, v/v): 0,56

Analyse des aminoacides:

Thr (2) : 1,85 Ser (1) : 0,84 Cys (2) : 1,29 Phe(3): 3 Lys (1): 1,05 His (2): 1,41 Trp (1): 0,75. L'activité pharmacologique in vivo du dodécapeptide préparé suivant l'exemple 8 a été établie par les méthodes détaillées à la fin de l'exemple 3. Les résultats obtenus sont les suivants.

Suppression de l'hormone de croissance

Composé (dose)

2h

4h

Témoin

Exemple 8 (1 mg/kg) ** < 0,001

127 ± 22 20 ± 3**

59 + 20 107 ± 34

Suppression de l'hormone de croissance, de glucagon et d'insuline

Composé

Insuline

Glucagon

(dose, ng/kg)

GH (ng/ml)

(nU/ml)

(Pg/ml)

Témoin

279 ± 53

323 ± 30

42 + 6

Exemple 8 (100)

64 ± 20*

165 ± 21*

5 + 2*

Témoin

201 ± 35

397 ± 36

117 + 11

Exemple 8 (100)

110 ± 22+

318 ± 54

70 ± 7*

*p < 0,01, + p < 0,05

De ce qui précède, on peut voir que, aux faibles doses, le peptide de l'exemple 8 est spécifique pour la suppression de glucagon et de l'hormone de croissance, sans influencer la sécrétion d'insuline.

Exemple 9:

tert-Butyloxycarbonyl-S-p-méthoxybenzyl-L-cystéinyl-Ns"-tosyl-L-arginyl-y-benzyl-L-glutamyl-L-phénylalanyl-L-phénylalanyl-D-trypto-phyl-Nt-2-chlorobenzyloxycarbonyl-L-Lysyl-0-benzyl-L-thréonyl-L-phénylalanyl-O-benzyl-L-thréonyl-O-benzyl-L-séryl-S-p-méthoxyben-zyl-L-cystéine-Hydroxymêthylpolystyrène, ester

Une résine de polystyrène chlorométhylée est estérifiée avec du Boc-Cys(SMBzl)-OH, suivant le procédé de Gisin, «Helv. Chim. Acta», 56,1976 (1973). L'ester de résine/aminoacides est ensuite traité suivant le programme A tel que développé ci-après, du Boc-Ser(Bzl)-OH étant utilisé comme aminoacide protégé dans la phase 9

de ce programme. Ce programme A est ensuite répété afin d'incorporer en succession les aminoacides suivants dans la peptidorésine:

Boc-Thr(Bzl)-OH

Boc-Phe-OH

Boc-Thr(Bzl)-OH

Boc-Lys(ClZ)-OH

Boc-D-Trp-OH

Boc-Phe-OH

Boc-Phe-OH

Boc-Glu(OBzl)-OH

Boc-Arg(Tos)-OH

Boc-Cys(SMBzl)-OH

Programme A (pour le traitement de l'ester de résine) :

1. lavage avec du chlorure de méthylène (CH2C12), trois fois ;

2. traitement avec de l'acide trifluoroacétique/chlorure de méthylène (1/1, v/v) contenant 5% de 1,2-éthanedithiol, pendant 5 min;

3. répétition de la phase 2 pendant 25 min ;

4. lavage avec du CH2CI2, trois fois;

5. lavage avec du diméthylformamide (DMF) ;

6. traitement avec de la triéthylamine à 12% dans du DMF pendant3 min;

7. lavage avec du DMF ;

8. lavage avec du CH2C12, trois fois;

9. traitement avec 4 équivalents de l'aminoacide protégé approprié dans du CH2C12-DMF et agitation pendant 5 min;

10. addition en deux parties, sur une période de 30 min, de

5 équivalents de diisopropylcarbodiimide dissous dans du CH2C12, en laissant la réaction se développer pendant 6 h;

11. lavage avec du DMF, trois fois;

12. lavage avec du CH2C12, trois fois;

13. essai par la réaction à la ninhydrine suivant la méthode de Kaiser et coll., «Annal. Biochem.», 34,595 (1970). Dans le cas d'une réaction incomplète, on répète les phases 9 à 13 précédentes.

Exemple 10:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystéinyl-L-arginyl-L-glutamyl-L-

phénylalanyl-L-phénylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-thréonyl-L-phê-

nylalanyl-L-thréonyl-L-séryl-L-cystéine

La peptidorésine de l'exemple 9 (8,5 g) est mise en suspension dans 16 ml d'anisole et traitée avec de l'acide fluorhydrique (HF) liquide anhydre pendant 45 min dans un bain de glace, puis on sépare l'excès de HF sous vide et on extrait le reste avec de l'acide acétique aqueux à 10%. Le filtrat est lavé à l'éther et la couche aqueuse est versée dans 51 d'eau, puis le pH est amené à 7 avec de l'hydroxyde d'ammonium dilué. Le mélange est agité à l'air libre pendant 48 h, puis on ajuste le pH à 5 avec de l'acide acétique glacial, et le peptide est absorbé sur de l'Amberlite CG-50 (forme H+). La matière peptidique est éluée avec de l'acide acétique aqueux à 50% et lyophilisée pour donner 850 mg de matière solide.

Le produit brut est appliqué sur une colonne de Sephadex LH-20 (2,5 x 150 cm) et élué avec de l'acide acétique à 10%. Les fractions 94-130 sont rassemblées et lyophilisées pour donner 483 mg de matière que l'on applique sur une colonne de Sephadex G25 (1,5 x 115 cm) et que l'on élue avec de l'acide acétique aqueux à 10%. Les fractions 43-53 sont rassemblées et lyophilisées pour obtenir le peptide cité en rubrique et lyophilisées pour obtenir le peptide cité en rubrique, 286 mg.

Chromatographie en couche mince, plaques de verre préalablement enrobées d'Avicel,

Rf (BWA, 4/1/1, v/v): 0,40 Rf (BWAP, 30/24/6/20, v/v): 0,65

Analyse des aminoacides:

Thr (2): 1,92 Ser (1): 0,89 Glu (1): 1,03

Cys (2): 1,49 Phe(3):3 Lys (1): 1,05 Trp (1): 0,81

Arg (1): 1,02.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

633 524

Exemple 11:

tert-Butyloxycarbonyl-S-p-méthoxybenzyl-L-cystéinyl-N'm-tosyl-L-histìdyl-y-benzyl-L-glutamyl-L-phénylalanyl-L-phénylalanyl-D-tryp-tophyl-Ne-2-chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysyl-0-benzyl-L-thrêonyl-L-phênylalanyl-O-benzyl-L-thréonyl-O-Benzyl-L-séryl-S-p-méthoxyben- 5 zyl-L-cystêine Hydroxyméthylpolystyrène, ester

Une résine de polystyrène chlorométhylée est estérifiée avec du Boc-Cys(SMBzl)-OH, suivant la méthode de Gisin, «Helv. Chim.

Acta», 56,1976 (1973). L'ester de résine aminoacides est ensuite traité suivant le programme A (voir exemple 9), du Boc-Ser(Bzl)-OH 10 étant utilisé comme aminoacide protégé dans la phase 9 de ce programme. On répète ce programme A afin d'incorporer successivement les aminoacides suivants dans la peptidorésine:

Boc-Thr[Bzl)-OH Boc-Phe-OH Boc-Thr(Bzl)-OH Boc-Lys(ClZ)-OH Boc-D-Trp-OH Boc-Phe-OH Boc-Phe-OH Boc-Glu(OBzl)-OH Boc-His(Tos)-OH Boc-Cys(SMBzl)-OH

Exemple 12:

Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystéinyl-L-histidyl-L-glutamyl-L-phènylalanyl-L-phénylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-thréonyl-L-phé-nylalanyl-L-thrèonyl-L-séryl-L-cystèine

La peptidorésine de l'exemple 11 (8 g) est traitée avec du HF anhydre liquide de la façon décrite dans l'exemple 10, et le dodécapeptide disulfhydryle linéaire est cyclisé par oxydation avec du K3Fe(CN)6 au pH de 7,3 et avec forte dilution. Le pH est amené à 5 avec de l'acide acétique glacial et on traite le mélange avec de la résine échangeuse d'ions Bio-Rad AG3-X4 (forme Cl), puis on absorbe sur de l'Amberlite CG-50 (forme H+). La matière peptidique est diluée avec de l'acide acétique aqueux à 30% et lyophilisée pour donner 500 mg de matière brute. Celle-ci est chromatographiée sur une colonne de Sephadex LH-20 pour donner le dodécapeptide cité en rubrique.

Chromatographie en couche mince, plaques de verre préalablement enrobées d'Avicel,

Rf(BWA, 4/1/1, v/v): 0,43 Rf (tert-AmOH/)y/W, 7/7/6, v/v): 0,74

Analyse des aminoacides:

Th(2): 1,92 Ser (1): 0,93 Glu (1): 0,94 Cys (2): 1,59 Phe(3): 3 Lys(l):l,02 His(l):0,91 Trp(l):0,81.

Exemple 13:

L'activité biologique des peptides des exemples 10 et 12 a été déterminée par la méthode suivante.

Des rats mâles albinos reçoivent une injection de Nembutal dans le péritoine à une dose de 50 mg/kg. 15 min plus tard, on administre une injection sous-cutanée du composé d'essai ou d'une solution saline physiologique. Après 10 min, on injecte dans le cœur 0,5 ml d'arginine (300 mg/ml, pH de 7,2). 5 min après réception de l'arginine, les rats sont décapités et on récolte le sang dans du Trasylol-EDTA. On soumet une petite quantité appropriée à une détermination de l'hormone de croissance, de l'insuline et du glucagon par la voie radio-immunologique. Les résultats de cette détermination se présentent comme suit.

20

25

Composé

Dose

GH

Insuline

Glucagon

Nombre d'animaux

(Hg/kg)

(ng/kg)

(nU/ml)

(Pg/ml)

Témoin

277 ± 69

301 ± 27

46 ± 8*

10

Exemple 10

200

42 ± 6*

115 ± 16*

1,5 ± 1*

10

Témoin

—

216 ± 35

283 ± 28

55 ± 5

10

Exemple 10

40

28 ± 5*

158 ± 57

12 ± 2*

10

Témoin

454 + 106

269 + 37

60 ± 10

10

Exemple 12

200

107 ± 29*

205 ± 36

4 ± 2*

10

Témoin

233 + 35

343 ± 45

44 ± 4

10

Exemple 12

50

84 + 17*

322 ± 40

10 ± 4*

10

* p < 0,01

Les résultats précédents montrent que les peptides des exemples 10 et 12, représentatifs des autres peptides suivant l'invention, sont des agents efficaces pour réduire l'hormone de croissance et le glucagon sans influencer fortement les taux d'insuline à une dose de 40 mg/kg et de 50 mg/kg respectivement. Les peptides des exemples 10 et 12 ont également été essayés pour déterminer la durée de leur effet sur la sécrétion d'hormone de croissance chez des rats traités au Nembutal. Le peptide de l'exemple 10 a montré une inhibition 55

significative de l'hormone de croissance pendant au moins 4 h à une dose de 1000 mg/kg par voie sous-cutanée. Le peptide de l'exemple 12 n'a pas montré d'inhibition significative d'hormone de croissance après 2 h et après 4 h.

Les composés décrits ci-dessus peuvent être administrés à des 60 animaux à sang chaud par voie intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire ou orale, pour contrôler le glucose du sérum dans le traitement du diabète. La dose requise variera avec l'état particulier que l'on traite, la sévérité de cet état et la durée du traitement.

L'ingrédient actif peut être administré seul ou en combinaison 65 avec des véhicules ou excipients acceptables en pharmacie. Des compositions pharmaceutiques appropriées seront évidentes pour les spécialistes en ce domaine.

Exemple 14:

Synthèse classique de disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystéinyl-L-

Histidyl-L-Histidyl-L-Phênylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thrëo-

nyl-L-Phénylalanyl-L-Thréonyl-L-séryl-L-Cystêine a) N-Benzyloxycarbonyl-im-Benzyloxycarbonyl-L-Histidyl-L-Phëny-lalanyl, ester mêthylique (I)

Une suspension de 42,3 g (0,1 mol) de Z-His(Z)-OH et de 21,8 g (0,1 mol) de Phe-OMe-HCl (98%) dans 1000 ml de CH2C12 est refroidie à 0°C, puis on ajoute 22 g (0,12 mol) de DCC et 10,1 g (0,10 mol) de triéthylamine. On laisse le mélange atteindre la température ambiante pendant la nuit.

La dicyclohexylurée qui se sépare est enlevée par filtration et le filtrat est concentré pour donner une matière gommeuse. On dissout cette matière dans de l'acétate d'éthyle, et la matière insoluble est enlevée par filtration. Le EtOAc est lavé avec de l'acide citrique à 5%, de l'eau, une solution de bicarbonate de sodium à 5% refroidie à la glace et de l'eau. La couche organique est séchée sur du sulfate de sodium, concentrée au tiers de son volume initial, puis on ajoute 500 ml d'éther jusqu'à ce que la solution devienne trouble, cette solution étant ensuite laissée en chambre froide pendant la nuit. Une

50

633524

10

matière solide blanche qui se forme est séparée et séchée, 32 g, point de fusion de 131-133°C; Chromatographie en couche mince: gel de silice F-254, CH2C12: MeOH (9/1); Rf = 0,8.

b) Im-Benzyloxycarbonyl-L-Histidyl-L-Phénylalanyl, ester méthyli-que, sel dibromhydrate (II)

On dissout 30 g (0,5 mol) de Z-His(Z)-Phe-OMe (I) dans 300 ml de HBr-HOAc (32 %) (la solution devient trouble après 2 min), et le mélange est laissé à la température ambiante pendant 30 min, puis on ajoute de l'éther pour provoquer une précipitation. La matière solide molle est filtrée et séchée pendant la nuit, 32 g de matière solide,

point de fusion de 135-137°C; Chromatographie en couche mince: ne marche pas.

c) N-Benzyloxycarbonyl-im-Benzyloxycarbonyl-L-Histidyl-im-Ben-zyloxycarbonyl-L-Histidyl-L-Phénylalanyl, ester méthylique (III)

Une suspension de 30,5 g (0,05 mol) de His(Z)-Phe-OMe-2HBr (II) et de 21,7 g (0,05 mol) de Z-His(Z)-OH dans 500 ml de CH2C12 est refroidie à 0°C, puis on ajoute 11 g de DCC et 10,1 g (0,10 mol) de triéthylamine. On laisse le mélange atteindre la température ambiante pendant la nuit.

La dicyclohexylurée formée est séparée par filtration et on concentre le filtrat en une matière vitreuse. Le reste est dissous dans de l'acétate d'éthyle et le EtOAc est lavé avec de l'acide citrique à 10%, de l'eau, une solution à 5% de bicarbonate de sodium refroidie à la glace et de l'eau. Le EtOAc est séché sur du sulfate de sodium, concentré jusqu'à environ 1/3 de son volume, puis on ajoute de l'éther pour former une solution trouble qu'on laisse en chambre froide. Une matière solide blanche se sépare, 29,5 g.

d) L-Histidyl-L-Histidyl-L-Phênylalanyl, ester méthylique, sel tri-chlorhydrate (IV) ^

I f

Le mélange de 29 g de Z-His-His-Phe-OMe (IV), de 10,8 ml de HCl concentré, de 180 ml de MeOH et de deux spatules pleines de 10% Pd-C est hydrogéné pendant 5 h en utilisant l'hydrogénateur Parr.

Après séparation par filtration, le méthanol est concentré en une huile et on ajoute de l'éther pour former une matière solide. On utilise 18 g de matière brute pour la réaction suivante sans autre purification.

e) tert-Butyloxycarbonyl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cystéinyl-L-Histi-dyl-L-Histidyl-L-Phênylalanyl, ester méthylique (V)

On agite 13 g de BOC-Cys(MBzl)-OH (0,038 mol), 5,4 g d'hydroxybenzotriazole (0,040 mol) et 8,3 g de cyclohexylcarbodii-mide (0,040 mol) dans 11 de chlorure de méthylène refroidi à la glace pendant 30 min. On ajoute 19,5 g de His-His-Phe-OMe-3HCl (0,0345 mol) et 10,5 g de N-méthylmorpholine (0,096 mol) et on agite le mélange pendant la nuit lorsqu'il atteint la température ambiante. La suspension est filtrée pour séparer la dicyclohexylurée et on lave le filtrat successivement avec de l'eau, du H2C02 à 10% et de l'eau,

puis on sèche sur Na2S04. Après filtration, le solvant est séparé sous vide, ce qui laisse 21,0 g de produit brut. Cette matière est agitée dans 100 ml d'acétonitrile pendant 30 min à la température ambiante, puis on filtre. On lave le précipité avec de l'acétonitrile, puis avec de l'éther, et on sèche, production de 11 g; Chromatographie en couche mince: Rf = 0,12, gel de silice 60, CHC13/CH3/OH-HAc,

9/1/0,5, v/v.

Le filtrat provenant de l'extraction à l'acétonitrile contient le produit et des impuretés et on peut l'utiliser pour l'extraction d'autres lots de matière brute.

f) tert-Butyloxycarbonyl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cystêinyl-L-Histi-dyl-L-Histidyl-L-Phênylalanine (VI)

11,0 g de BOC-Cys(MBzl)-His-His-Phe-OMe (0,0142 mol) sont dissous dans 200 ml de méthanol et on ajoute 30 ml d'hydroxyde de potassium IN. On agite la solution à la température ambiante pendant 2 h, puis on sépare le méthanol sous vide. Le reste est dilué avec 200 ml d'eau, puis filtré. Le filtrat est ajusté au pH de 5 avec de l'acide citrique à 10% et on laisse reposer le précipité gommeux tandis qu'il cristallise. Le produit est filtré, lavé à l'eau et séché sous vide sur du P205 ; production de 7,3 g (67%); Chromatographie en couche mince: Rfde 0,52, gel de silice 60, n-butanol acétate d'éthyle acide acétique H20,1/1/1/1, v/v; Rfde 0,43, gel de silice 60, alcool tert-amylique pyridine H20,7/6/7, v/v.

g) N-tert-Butyloxycarbonyl-O-Benzyl-L-Thrêonyl-L-Phênylalanine, ester méthylique (VII)

Une solution de Boc-L-Thr(Bzl)-OH (61,8 g, 0,2 mol) dans du THF est refroidie à —15° C. On ajoute par portions 26,2 ml de chloroformiate d'isobutyle (0,2 mol), en maintenant la température entre — 15 et —10° C. Après agitation à — 15° C pendant 15 min, on ajoute par portions un mélange froid de L-Phe-OMe HCl (43,1 g, 0,2 mol) et de N-méthylmorpholine (22,4 mol) dans du DMF, tout en maintenant la température entre —lOet —5°C. On agite le mélange à 0°C pendant 2 h, puis à la température ambiante pendant la nuit. Le mélange de réaction filtré est concentré sous vide et le reste est repris dans de l'acétate d'éthyle. La solution à l'acétate d'éthyle est lavée successivement avec du KHS04 à 5%, du KHC03 à 5% et une solution saline, puis on sèche sur Na2S04. Après concentration sous vide, on obtient une huile qui cristallise au repos. La matière solide est recristallisée dans de l'éther isopropylique hexane, 74,9 g (80%); point de fusion de 78-81°C;[a]^= +10,75(c, 1,023,MeOH); Rf (CHC13): 0,35.

Analyse pour C26H34N2Oa (470,55):

Calculé: C 66,36 H 7,28 N5,95%

Trouvé: C 66,72 H 7,32 N5,85%

h) N-tert-Butyloxycarbonyl-O-Benzyl-L-Thréonine-L-Phènylalanine (VIII)

On dissout du Boc-Thr(Bzl)-Phe-OMe (23,5 g; 0,05 mol) dans un mélange de MeOH/dioxanne (100 ml, 1/1) et on traite avec du N-NaOH (55 ml) pendant 3 h jusqu'à ce que la matière de départ ne puisse plus être décelée par Chromatographie en couche mince. La plus grande partie du solvant est évaporée sous vide et on dilue le reste avec de l'eau, puis on acidifie avec de l'acide citrique à 5%. La gomme qui se sépare est reprise dans du EtOAc, et on lave à l'eau (saumure), puis on évapore jusqu'à siccité. Le reste est cristallisé dans du Et20-hexane, 19,8 g (87%), point de fusion de 118-119°C; Rf (chloroforme/méthanol/acide acétique, 85/10/5): 0,80.

i) N-tert-Butyloxycarbonyl-O-Benzyl-L-Thréonyl-O-Benzyl-L-Sérine, ester méthylique (IX)

On dissout de la N-tert-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-thréonine (30,9 g, 0,1 mol) dans du tétrahydrofuranne sec (200 ml), on refroidit à — 20°C et on traite avec de la N-méthylmorpholine (11 ml), puis avec du chloroformiate d'isobutyle (13,4 ml). Le mélange de réaction froid est agité pendant 5 min à — 20° C, puis traité avec une solution de O-benzyl-L-sérine, ester méthylique, chlorhydrate (25 g, environ 0,1 mol) contenant de la N-méthylmorpholine (11 ml) dans du DME, et on laisse le mélange atteindre la température ambiante pendant la nuit.

Le solvant est séparé sous vide et le reste est partagé entre de l'eau et de l'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée avec de l'acide citrique à 5%, avec de l'eau, avec du KHC03 aqueux et avec de l'eau, puis on sèche sur MgS04 et on évapore jusqu'à siccité pour obtenir un reste huileux qui cristallise dans de l'éther diéthylique/hexane en une matière ressemblant à une gelée (29 g); Rf (CHCl3/MeOH, 25/1); Rf (EtOAc/hexane, 1/1): 0,65.

j) N-tert-Butyloxycarbonyl-O-Benzyl-L-Thréonyl-O-Benzyl-L-Sérine

(X)

On dissout du Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-OMe (28,2 g, 0,0563 mol) dans du méthanol (environ 50 ml) et on traite avec de l'hydroxyde de sodium IN (75 ml) pendant 1,5 h à la température ambiante. La solution alcaline est neutralisée jusqu'au pH de 7 avec de l'acide citrique à 10% et la plus grande partie du méthanol est séparée sous vide. Le reste est dilué avec une certaine quantité d'eau et acidifié avec du KHS04 aqueux à 5%, puis extrait avec du EtOAc. La phase organique est lavée avec de l'eau, puis séchée sur du Na2S04 et

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évaporée jusqu'à siccité pour former une huile. Le rendement est quantitatif. Rf(EtOAc/hexane, 1/1): 0,15 (longue tache).

k) N-tert-Butyloxycarbonyl-O-Benzyl-L-Thrèonyl-O-Benzyl-L-Sé-ryl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cystéine, ester benzyligue (XI)

On dissout du Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-OH (24,3 g, 50 mmol) dans de l'acétonitrile et du dichlorométhane (250 ml, 2/3) et on mélange avec du H-Cys(SMBzl) Bzl-TosOH (25 g, 50 mmol), puis avec de la triéthylamine (6,8 ml) et du N-hydroxybenzotriazole (6,8 g) et le mélange est refroidi dans un bain de glace.

On ajoute une solution de DCC (11 g, 53 mmol) dans 50 ml d'acétonitrile et on agite le mélange de réaction pendant 2 h à froid, puis pendant 2 d à la température ambiante. Le DCU qui se sépare est enlevé par filtration et le filtrat est évaporé jusqu'à siccité. Le reste huileux est partagé entre de l'acétate d'éthyle et de l'eau, et la phase organique est lavée avec de l'acide citrique à 10%, de l'eau, du KHC03 à 5% et de la saumure, puis on sèche sur du Na2S04. Le solvant est évaporé et le reste huileux est cristallisé dans du Et20/ hexane pour donner une matière solide blanche, 24,5 g, point de fusion de 87-90°C; Rf (chloroforme/méthanol, 25/1): 0,54; traces à 0,4 et 0,3 (heptane/EtOAc, 1/1): 0,64; traces à 0,25, positif au I2, Wîf = —14,7 (c, 0,98 DMF).

Analyse élémentaire pour C44H52N3S09 (798,9):

Calculé: C 66,15 H 6,56 N5,26%

Trouvé: C 66,22 H6,95 N 5,29%

/) O-Benzyl-L- Thréonyl-O-Benzyl-L-Séryl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cystèine, ester benzylique, trifluoroacétate (XII)

On mélange du Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(SMBzl)-OBzl (8 g,

10 mmol) avec de l'anisole (100 mmol) et on traite avec du TFA (100 ml) pendant 45 min. Le solvant est évaporé sous vide et le reste est dissous dans du Et20 sec, puis on évapore jusqu'à siccité sous vide élevé pour obtenir un composé huileux, 7,2 g (90%); Rf (n-butanol/eau/acide acétique glacial, 4/1/1): 0,9; Rf (heptane/EtOAc): 0,0-0,1 longue tache, positif au I2 et à la ninhydrine.

m) N-tert-Butyloxycarbonyl-O-Benzyl-L- Thréonyl-L-Phënylalanyl-O-Benzyl-L-Thréonyl-O-Benzyl-L-Séryl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cys-têine, ester benzy lique ( XIII)

On dissout du Boc-Thr(Bzl)-Phe-OH (préparé par la méthode de l'exemple III) (9,2 g, 20 mmol) dans du DMF (100 ml) et on mélange avec du N-hydroxysuccinimide (3,4 g) et une solution de Thr(Bzl)Ser(Bzl)-Cys(SMBzl)OBzl, sel trifluoroacétate (20 mmol) dans du DMF (20 ml), neutralisé avec de la triéthylamine au pH 7. Le mélange est refroidi dans un bain de glace et traité avec du DCC (4,5 g) pendant 2 h à froid, puis pendant 2 d à la température ambiante. La DCU est filtrée et le filtrat est évaporé jusqu'à siccité. On triture le reste avec de l'eau pour obtenir un précipité que l'on reprend dans du EtOAc, puis on lave avec de l'acide citrique à 5%, de l'eau, du Na2C03 à 5% et de l'eau, on sèche sur Na2S04 et on évapore jusqu'à siccité. Le reste est solidifié à partir de Et20/hexane,

11 peut être cristallisé dans du MeOH et il est très soluble dans le CHC13; 17,3 g (70%); point de fusion de 105-107 C ; Rf (CHCl3/MeOH, 10/1): 0,90; [a]2D5= -3,6 (c: 1, DMF).

Analyse pour C64H75N5S0i2H20 (1156,2):

Calculé: C 66,46 H 6,71 N6,05%

Trouvé: C 66,68 H 6,59 N6,20%

n) tert-Butyloxycarbonyl-D-Tryptophyl-Ne-Benzyloxycarbonyl-L-ly-syl, ester méthylique (XIV)

On dissout du Boc-D-Trp-OH (30,4 g, 0,1 mol), du Lys(Z)-OMe HCl (33 g, 0,1 mol) et 13,6 ml de triéthylamine dans 400 ml de DMF et on refroidit dans un bain de glace, puis on ajoute 22 g de dicyclohexylcarbodiimide et on laisse le mélange atteindre la température ambiante pendant la nuit. La dicyclohexylurée qui se sépare est filtrée et le filtrat est concentré à un petit volume, puis on ajoute un excès d'eau pour former une matière gommeuse. Cette matière est reprise dans de l'acétate d'éthyle et lavée avec de l'acide citrique aqueux à 10%, de l'eau, du NaHC03 saturé et de l'eau, puis on sèche sur Na2S04 et on évapore jusqu'à siccité. Le reste est trituré à l'éther, puis à l'hexane pour donner une matière solide cristalline, 28 g; Chromatographie en couche mince: gel de silice G, hexane/EtOAc (1/1, v/v), Rf: 0,3.

o) tert-Butyloxycarbonyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-N£-Benzy-loxycarbonyl-L-lysine (XV)

A. On ajoute du Boc-Z>-Trp-Lys(Z)-OMe (22 g, 44 mmol) à un mélange préalablement refroidi de 220 ml de TFA et de 25 ml d'anisole, puis on agite pendant 30 min dans un bain de glace. Le TFA est séparé aussi rapidement que possible à 27° C sur un appareil rotatif et l'huile restante est triturée plusieurs fois avec une solution d'hexane/éther, 2/1, puis on décante et finalement on pompe pour obtenir une gomme, production de 21,3 g, 36 mmol.

B. On agite du Boc-Phe-OH (9,6 g, 36 mmol), du HOBT (5,3 g, 39 mmol) et du DCC (8 g, 39 mmol) dans 500 ml de dichlorométhane froid pendant 20 min. On ajoute du D-Trp-Lys(Z)-OMe sel trifluoroacétate (21,3 g, 36 mmol) dans 200 ml de dichlorométhane, puis de la N-méthylmorpholine (4,25 ml, 39 mmol). Le mélange de réaction est agité pendant la nuit tandis qu'il se réchauffe jusqu'à la température ambiante. Le mélange est filtré pour séparer le DCC et le filtrat est lavé deux fois à l'eau, puis deux fois à l'acide citrique à 10%, deux fois avec du NaHC03 saturé, deux fois à l'eau, puis on sèche sur Na2S04. Après filtration et évaporation, le reste pèse 21,4 g (82%) et on l'utilise sans autre purification. Chromatographie en couche mince: gel de silice F-254 (CHCl3/CH3OH/HAc, 9/1/0,5); Rf=0,76 plus traces de petites impuretés.

C. On dissout du Boc-Phe-Z)-Trp-Lys(Z)-OMe (22,9 g,

31,4 mmol) dans 450 ml de p-dioxanne et 100 ml de méthanol, et on ajoute 39 ml de KOH aqueux IN et on agite pendant la nuit à la température ambiante. La solution est évaporée à l'évaporateur rotatif. Le reste est dissous dans 500 ml d'eau chaude, acidifié au pH de 3 avec de l'acide citrique à 10%, agité pendant 30 min et filtré. Après dessiccation sous vide pendant la nuit, on obtient 21,6 g (96%), point de fusion 85-90° C, [a]fô= + 7,09 (c, 0,987, MeOH) ; Rf: 0,63 (CHCl3/CH3OH/HAc, 9/1/0,5), gel de silice F-254.

p) tert-Butyloxycarbonyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-Nz -Benzy loxycarbony l-L-Lysyl-O-Benzyl-L-Thréonyl-L-Phény lalany l-O-Benzyl-L-Thréonyl-O-Benzyl-L-Séryl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cystéinyl, ester benzy lique ( XVI)

A. On ajoute du Boc-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser-(Bzl)-Cys(SMBzl)-OBzl (XIII) (40,5 g, 35 mmol) à une solution froide de 400 ml de TFA et de 40 ml d'anisole, puis on agite à froid pendant 30 min. Le TFA est évaporé à l'évaporateur rotatif et le reste est trituré avec 11 d'éther/hexane (1/1) pour former une poudre blanche. Après filtration, lavage avec de l'éther/hexane et dessiccation sous vide sur du P2Os et des pastilles de NaOH, on obtient 34,6 g de matière (82%), point de fusion de 136-139° C, ramollissement à 120°, [a]£3= —9,93 (c, 1,04, MeOH); Rf: 0,63, gel de silice CHCl3/CH3OH/HAc, 9/1/0,5, petite impureté plus polaire Rf: 0,53.

B. On agite du Boc-Phe-D-Trp-Lys(Z)-OH (20,0 g, 27,9 mmol), du HOBT (4,15 g, 30,8 mmol) et du DCC (6,3 g, 30,8 mmol) dans 2,01 de dichlorométhane froid dans un bain de glace pendant 30 min. On ajoute 32,6 g (27,9 mmol) de sel trifluoroacétate de H-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(SMBzl)-OBzl, puis 3,35 ml de N-méthylmorpholine (30,8 mmol), et on poursuit l'agitation pendant la nuit tandis que le mélange se réchauffe à la température ambiante. La Chromatographie en couche mince ne montrait pas de réaction essentiellement complète après 2 h.

Le mélange est filtré et le filtrat est lavé à l'eau, avec de l'acide citrique à 10%, de l'eau, du NaHC03 saturé et de l'eau, puis on sèche. Après filtration et évaporation, la Chromatographie en couche mince montre un produit et une impureté plus polaire qui est séparée par dissolution du produit brut dans 200 ml de DMF chaud et addition de 11 de NaHC03 aqueux à 2%. Le produit est filtré, lavé avec du NaHC03 dilué et de l'eau, puis on, sèche sous vide sur du P2Os, rendement de 36,5 g (75%), point de fusion de 182-184°C

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(contraction à 150°), [a]|f=0 (c, 0,988, CHC13). Rf (tache simple) 0,76, gel de silice (CHCl3/CH3OH/HAc, 9/1/0,5).

q) Préparation de H-Phe-D-Trp-Lys(Z)-Thr(Btl)-Phe-The(Bzl)-Ser(Btl)-Cys(SMBzl)-OBzl, sel trifluoroacétate (XVII)

On dissout du Boc-Phe-jD-Trp-Lys(z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Btl)-Cys(SMBzl)-OBzl (32 g) et de l'anisole (33 ml) dans 50 ml de dichlorométhane et 100 ml d'acide trifluoroacétique, et on agite pendant 30 min à la température ambiante. La solution est évaporée à l'évaporateur rotatif à 30° C. Le reste est trituré avec de l'éther anhydre pour former une poudre que l'on filtre, puis qu'on lave à l'éther et qu'on sèche sous vide sur du P2Os et des pastilles d'hydroxyde de sodium.

Une Chromatographie en couche mince sur gel de silice 60 dans du CHCl3/CH3OH/HAc (9/1/0,5) montre une simple tache, Rf de 0,65; la résonance magnétique nucléaire ne montre pas de pic pour le t-butyle.

r) tert-Butyloxycarbonyl-S-p-Mêthoxybenzyl-L-Cystênyl-L-Histidyl-L-Histidyl-L-Phênylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-N&-Benzyl-oxycarbonyl-L-Lysyl-O-Benzyl-L-Thrêonyl-L-Phénylalanyl-O-Ben-zyl-L-Thréonyl-O-Benzyl-L-Séryl-S-p-Méthoxybenzyl-L-Cystéine, ester benzylique (XVIII)

On agite du Boc-Cys(SMBzl)-His-His-PheOH (5,5 g, 7,2 mmol), du 1-hydroxybenzotriazole monohydraté (1,07 g, 7,9 mmol) et du dicyclohexylcarbodiimide (1,65 g, 7,9 mmol) dans 100 ml de dimé-thylformamide sec dans un bain de glace pendant 30 min. On ajoute 12,5 g (7,2 mmol) de H-Phe-Z)-Trp-Lys(z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(SMBzl)OBzl, sel trifluoroacétate et 0,855 g de N-méthylmorpholine (7,65 mmol), et on laisse le mélange atteindre la température ambiante pendant la nuit avec agitation. La suspension est filtrée pour séparer la dicyclohexylurée et le filtrat est évaporé jusqu'à 50 ml, puis on dilue avec 500 ml d'une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium. La matière solide résultante est filtrée, lavée à l'eau et redissoute dans 200 ml de DMF. On dilue cette solution avec 11 d'acide citrique aqueux à 5%, puis on filtre. La matière solide est lavée à l'eau, dissoute dans 200 ml de DMF et précipitée avec 11 d'une solution saturée de bicarbonate de sodium,

puis on filtre, on lave à l'eau et on dessèche sous vide sur du P2Os à la température ambiante, production de 15 g; analyse des aminoacides: His: 1,66 (2,0); Lys: 1,05 (1,0); Phe: (3,0); Ser: 1,02 (1,0); Thr: 2,2 s (2,0).

s) Disulfure cyclique ( 1-12) de L-Cystéinyl-L-Histidyl-L-Phénylalanyl-L-Phênylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phénylalanyl-L-Thréonyl-L-Séryl-L-Cystêine (XIX)

On mélange du Boc-Cys(SMBzl)-His-His-Phe-Phe-D-Trp-Lys(z)-io Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(SMBzl)OBzl (5 g) avec de l'anisole (10 ml), et on traite avec 100 ml de HF liquide en excluant l'air et dans un bain de glace pendant 60 min. On sépare l'excès de HF sous vide et on reprend le reste dans du AcOH aqueux à 10% (200 ml), puis on verse dans 71 d'eau désaérée. Le pH est ajusté à 7 avec du 15 NH40H dilué et on agite à l'air libre pendant 24 h, puis on amène le pH à 5 avec du AcOH glacial, et on fait passer les solutions à travers une colonne d'Amberlite CG 50 (forme H+). La matière peptidique qui est absorbée sur la résine échangeuse d'ions est éluée avec de l'acide acétique aqueux à 50% et les fractions contenant la matière 20 peptidique sont rassemblées et lyophilisées pour former 2 g de matière brute. Ce dodécapeptide brut est purifié par Chromatographie à travers une colonne de Sephadex G25 en éluant avec du AcOH aqueux à 10% et par une Chromatographie de partage à travers du Sephadex G25 avec le système à deux phases N-BuOH/eau/AcOH 25 glacial (4/5/1, v/v). Chromatographie en couche mince, gel de silice Merck A G, [«Chlorine peptide spray», D. E. Nitecki et coll., «Biochem.», 5 665 (1966)], Rf (BWA, 4/1/1): 0,45; Rf(BWAP, 30/24/6/20): 0,64; analyse des aminoacides: Thr(z): 1,85; Ser (1): 0,79; Phe (3): 3; Lys (1): 1,02: His (2): 1,75; Cys et Trp, non 30 déterminés.

Il sera évident pour les spécialistes en ce domaine que d'autres agents de combinaison et d'autres groupes protecteurs pourront être utilisés dans la synthèse classique décrite dans l'exemple 14. En outre, il sera évident que des séquences différentes pourront être employées 35 pour l'accumulation des fragments aminoacides afin d'arriver à la molécule désirée. Toutes les méthodes en question sont évidemment comprises également dans le cadre de la présente invention.

R

Claims (7)

633524

1. Composés thérapeutiquement actifs répondant à la formule: X-Cys-XrX2-Phe-Phe-X3-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X4-OH

I I

SA SA (I)

dans laquelle A représente l'hydrogène, ou les deux symboles A signifient une liaison directe entre les atomes de soufre; X représente l'hydrogène, Ala-Gly, Gly-Gly, Ala-D-Ala, Gly-Gly-Gly, acétyle ou benzoyle;

X, représente His ou Arg;

X2 représente His, Glu ou Asp;

X3 représente Trp, D-Trp ou 6-F-G-Trp, et

X4 représente Cys ou D-Cys,

ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.

2. Composés suivant la revendication 1, caractérisés en ce qu'il s'agit du disulfure cyclique (1-12) de L-Cystéinyl-L-Argynil-L-Histidyl-L-Phénylalanyl-L-phénylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phénylalanyl-L-Thréonyl-L-Séryl-L-Cystéine, du disulfure cyclique (1-12) de L-Cystéinyl-L-Histidyl-L-Histidyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phénylanalyl-L-Thréonyl-L-Séryl-D-Cystéine, du disulfure cyclique (1-12) de L-Cystéinyl-L-Arginyl-L-Glutamyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phénylalanyl-L-Thréonyl-L-Séryl-L-Cystéine ou du disulfure cyclique (1-12) de L-Cystéinyl-L-Histidyl-L-Glutamyl-L-Phénylalanyl-L-Phénylalanyl-D-Tryptophyl-L-Lysyl-L-Thréonyl-L-Phénylalanyl-L-Thréonyl-L-Séryl-L-Cystéine.

2

REVENDICATIONS

3. Composés suivant l'une des revendications 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils sont sous la forme de sels d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptables, choisis parmi le chlorhydrate, le bromhy-drate, le sulfate, le phosphate, le polyphosphate, le maléate, l'acétate, le citrate, le benzoate, le succhiate, le malonate et l'ascorbate.

4. Procédé de préparation de composés répondant à la formule I de la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend la combinaison des aminoacides nécessaires à la formation de Polypeptides, ou de leurs dérivés activés, pour former les liaisons peptidiques, et ce dans n'importe quel ordre désiré de succession, les groupes réactifs que l'on ne désire pas voir réagir étant protégés au cours des phases intermédiaires.

5. Procédé de préparation de composés répondant à la formule I suivant la revendication 1, dans laquelle les deux symboles A signifient une liaison directe entre les atomes de soufre, caractérisé en ce qu'il comprend la préparation de composés répondant à la formule I de la revendication 1 dans laquelle A représente l'hydrogène par le procédé selon la revendication 4, puis l'oxydation du composé obtenu.

6. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un composé répondant à la formule I ou un sel acceptable en pharmacie d'un tel composé, en combinaison avec un support ou véhicule acceptable en pharmacie.

7. Compositions selon la revendication 6, caractérisées en ce qu'elles comprennent en outre de l'insuline.