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REVENDICATIONS
1. Procédé d'analyse spectrophotométrique selon lequel on détermine le taux d'absorbance d'un échantillon traversé par un faisceau de lumière mono chromatique issu d'une source de lumière blanche à éclairs, en comparant l'intensité lumineuse à la sortie de cet échantillon et celle d'un faisceau de lumière de référence provenant de cette même source, caractérisé par le fait que:
:
a) l'on forme un faisceau unique à partir d'un éclair de lumière blanche émis par cette source,
b) on rend constante la distribution spatiale de l'intensité du faisceau de sorte que cette distribution soit la même pour des faisceaux dérivés d'éclairs différents,
c) on prélève du spectre lumineux dudit faisceau unique un faisceau monochromatique,
d) on divise ce faisceau monochromatique en deux faisceaux élémentaires,
e) on dirige l'un de ces faisceaux élémentaires à travers ledit échantillon,
f) on mesure l'intensité de la lumière résiduelle sortant de cet échantillon,
g) on mesure l'intensité de l'autre faisceau élémentaire et on détermine le taux d'absorbance dudit échantillon.
2. Spectrophotomètre pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1, comportant une source de lumière blanche aux éclairs, caractérisé par le fait qu'il comporte:
a) un dispositif optique (12, 13) pour former un faisceau lumineux unique à partir de chaque éclair émis par cette source,
b) un monochromateur à réseau (16) disposé dans la trajectoire de ce faisceau lumineux unique pour en prélever un faisceau mono chromatique,
c) un dispositif optique stabilisateur disposé sur la trajectoire de ce faisceau entre le dispositif optique et le monochromateur et servant à rendre constante la distribution spatiale de l'intensité du faisceau,
de sorte que cette distribution soit la
même pour des faisceaux dérivés d'éclairs différents,
d) un élément de division optique disposé le long de la tra
jectoire du faisceau monochromatique issu du monochroma
teur, pour former deux faisceaux élémentaires,
e) un premier photodétecteur disposé sur la trajectoire de
l'un des faisceaux élémentaires,
f) un second photodétecteur disposé sur la trajectoire de l'autre faisceau élémentaire, et
g) une cuvette d'analyse transparente pour ledit échantillon, disposée sur la trajectoire de l'un de ces faisceaux élémentaires entre l'élément de division optique et le photodétecteur disposé sur la trajectoire.
3. Spectrophotomètre selon la revendication 2, caractérisé en ce que la lampe à éclairs comporte une électrode d'amorçage se trouvant beaucoup plus proche de la cathode que de l'anode afin de stabiliser la position de l'arc.
4. Spectrophotomètre selon la revendication 2, caractérisé
en ce que le dispositif stabilisateur comprend un tube ayant des parois internes réfléchissantes qui servent à produire des réflexions multiples du faisceau de lumière dérivé de chaque
éclair.
5. Spectrophotomètre selon la revendication 2, caractérisé
en ce que le monochromateur comprend un réseau concave ho
lographique.
6. Spectrophotomètre selon la revendication 2, caractérisé
en ce que l'élément de division optique du faisceau filtré est une
lame en quartz placée de telle façon que l'angle d'incidence du
faisceau filtré soit compris entre 10 et 25 ".
7. Spectrophotomètre selon la revendication 2, caractérisé
en ce que l'élément de division optique du faisceau filtré est une
lame en quartz plein comportant une alternance de bandes
transparentes et réfléchissantes.
8. Spectrophotomètre selon la revendication 2, caractérisé en ce que le dispositif stabilisateur comprend un cylindre de quartz servant à produire des réflexions multiples du faisceau de lumière dérivé de chaque éclair.
9. Spectrophotomètre selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'un échantillon de référence ou de mesure est interposable sur chacun des deux faisceaux filtres issus de l'élément de division.
10. Application du procédé selon la revendication 1, pour effectuer des analyses dans le domaine de la chimie clinique.
La présente invention concerne un procédé d'analyse spectrophotométrique selon lequel on détermine le taux d'absorbance d'un échantillon traversé par un faisceau de lumière monochromatique issu d'une source de lumière blanche à éclairs, en comparant l'intensité à la sortie de cet échantillon et celle d'un faisceau de lumière de référence provenant de cette même source, ainsi qu'un spectrophotomètre pour la mise en oeuvre du procédé.
La présente invention concerne plus particulièrement un tel procédé et un spectrophotomètre utilisables pour l'analyse optique d'échantillons dans un analyseur rotatif.
On connaît des spectrophotomètres à double faisceau, dans lesquels le double faisceau est obtenu par séparation physique d'un faisceau fourni par un monochromateur (H. Moenke et L.
Moenke - Blankenburg, Optische Bestimmungsverfahren und Geräte für Mineralogen und Chemiker , Akademische Verlagsgesellschaft Geest & Portig K.-G., Leipzig 1965, pages 185307). Cette séparation en deux faisceaux a pour but la compensation des variations de l'intensité de la source de lumière du spectrophotomètre. L'un des faisceaux sert de référence d'intensité et l'autre traverse l'échantillon à mesurer.
Différentes solutions sont utilisées pour réaliser les fonctions principales des spectrophotomètres. La source lumineuse est constituée par une ou deux lampes à émission continue des types: halogène, deutérium, arc mercure ou/et xénon. Pour le monochromateur, on trouve soit des dispositifs de dispersion à prisme soit à réseau. Enfin, pour les détecteurs on utilise généralement des photomultiplicateurs ou des phototubes et dans certains développements, plus récents, des photodiodes silicium.
Les nombreux types de composants disponibles et les différentes structures possibles donnent de nombreuses possibilités de combinaison susceptibles de réaliser un spectrophotomètre.
Les désavantages des spectrophotomètres connus ont leur origine principalement dans la source lumineuse et le monochromateur utilisés.
La source lumineuse la plus courante pour les applications dans le spectre visible est certainement la lampe tungstène halogène. Cependant, ses inconvénients sont bien connus:
- très faible émission dans l'ultraviolet,
-très importante variation d'intensité lumineuse dans le spectre utile; I'intensité de la lumière à 290 nm est environ 900 fois plus faible qu'à 700 nm,
- taux de lumière parasite important d'où la nécessité d'utiliser des filtres de blocage onéreux,
- le système de compensation de la variation de l'intensité lumineuse avec la longueur d'onde doit avoir une grande dynamique,
- durée de vie relativement courte,
- mauvais rendement lumineux: 8 Im/W,
- puissance dissipée importante, et
- alimentation électrique de la lampe relativement lourde et encombrante.
Pour palier les difficultés rencontrées dans l'ultraviolet avec
ce type de lampe, certains spectrophotomètres utilisent une seconde source de lumière, généralement une lampe au deuté
rium. Mais cette solution présente comme inconvénients supplé-
mentaires un coût élevé et un encombrement important.
Comme autre souce de lumière, des lampes avec différents
types de décharge électrique sont utilisées, par exemple lampes
au xénon, au Mercure, à l'argon. Les lampes au xénon présen
tent le spectre le plus uniforme pour le domaine spectral de
l'application et par ailleurs leur efficacité lumineuse est beau
coup supérieure au tungstène, par exemple 21 Im/W avec une lampe de 150W. Ces lampes sont généralement offertes pour des puissances plus élevées que 100W et leur emploi pose de sérieux problèmes de refroidissement. L'alimentation et la monture de ce type de lampe sont très volumineuses et coûteuses.
Le monochromateur à réseau constitue la solution de choix pour une variation continue de la longueur d'onde. Cependant, il faut que le taux de lumière parasite résultant de l'association lampe et monochromateur soit très faible, pratiquement inférieur à 1.104 si l'on désire effectuer des mesures avec une erreur de linéarité inférieure à 1,5 % jusqu'à atténuation de 1000 fois (ce qui correspond à une absorbance = 3). Pour ces performances, on utilise des monochromateurs à double réseau car les monochromateurs à un réseau présentent un taux de lumière parasite trop élevé. Ces monochromateurs à double réseau sont cependant coûteux, encombrants et leur alignement exige relativement beaucoup de temps.
Dans la description du brevet américain No. 3 810 696, on a déjà décrit un spectrophotomètre comportant une lampe à éclairs, un monochromateur ou un filtre d'interférence pour produire deux faisceaux dont le premier traverse un échantillon à analyser et le deuxième arrive sur un détecteur lequel délivre un signal de référence correspondant à l'intensité du deuxième faisceau. Cette description ne contient aucune mention ni des difficultés ou désavantages dues aux fluctuations de la position de l'arc (dans la lampe éclair) d'un éclair au suivant, ni des moyens placés entre la lampe éclair et le monochromateur afin de surmonter ces difficultés.
A la base de l'invention, se trouve le problème de réaliser un spectrophotomètre pour un analyseur de chimie clinique comportant un rotor tournant aux environs de 1000 t/min. et sur lequel sont disposés des échantillons de faible volume. Un tel spectromètre doit présenter les caractéristiques suivantes, qu'aucun spectrophotomètre connu ne satisfait aujourd'hui simultanément:
- mesure de l'absorbance d'échantillons liquides déposés dans des cuvettes en rotation à environ 1000 t/min.,
- courte durée de la mesure des 30 échantillons contenus sur le rotor, soit moins de 350 millisecondes,
- intervalle de temps disponible pour une mesure inférieure à 50 microsecondes,
- faible volume d'échantillon de liquide: 200 microlitres,
- selection continue des longueurs d'onde entre 290 et 700 nm,
- largeur de bande: 8 nm,
- large plage d'absorbance mesurable de 0,0 à 3,0.
Cette caractéristique est particulièrement importante dans les instruments automatiques pour couvrir les différences importantes d'absorbance rencontrées entre les cas normaux et les cas pathologiques des matériaux biologiques examinés. Soit par exemple entre un sérum lipémique et un sérum normal.
- reproductibilité des mesures compatibles avec les exigences des réactions enzymatiques (écart type S < 5.10-4 unité d'absorbance). Ceci s'entend dans le sens de la reproductibilité des mesures d'absorbances effectuées sur un même échantillon.
Ce point est particulièrement important dans le cas des méthodes cinétiques. Dans ces méthodes la variation d'absorbance est faible au cours du temps, aussi une bonne reproductibilité permet de réduire la durée des mesures. De plus dans ces méthodes, le niveau d'absorbance est parfois assez élevé (1,7 - 2,2).
Aussi la reproductibilité doit être excellente dans une large pla
ge d'absorbance.
- Une excellente linéarité entre l'absorbance et la concen
tration dans une large plage d'absorbance. Cette linéarité sim
plifie l'utilisation de l'instrument en éliminant l'utilisation d'une
courbe de calibration. A absorbance élevée et spécialement
dans l'ultraviolet, la linéarité est difficile à obtenir. Celle-ci dé
pend de la pureté de la lumière monochromatique que l'on peut
caractériser par un taux de lumière parasite défini par le rapport
entre l'intensité de lumière résiduelle émise en dehors de la
bande spectrale sélectionnée à l'intensité de lumière à l'intérieu
re de cette bande.
- faible encombrement. Cette qualité est souhaitée pour un
instrument qui est le plus souvent utilisé dans de petits labora toires très encombrés.
- maintenance réduite.
- bas prix de revient.
Pour des raisons d'encombrement et de prix de revient du
spectrophotomètre à réaliser, il est de plus souhaitable d'utiliser
comme détecteurs des photodiodes silicium en association avec
des amplificateurs à faible bruit.
L'obtention des performances photométriques indiquées ci
dessus avec des temps de mesure aussi courts crée des difficultés
techniques particulières relatives d'une part au rapport signal
sur bruit à atteindre et d'autre part à l'obtention d'un faisceau
de lumière présentant la pureté spectrale nécessaire. De plus, la
forme des cuvettes utilisées pour contenir les échantillons impo
se le besoin d'utiliser un faisceau de lumière de petite section sur
une longueur relativement grande, de ce fait l'ouverture numé
rique de l'optique est limitée et par conséquent l'angle solide de
collection de la lumière de la source est aussi limité.
Comme on désire effectuer des mesures reproductibles avec
une atténuation maximale du signal de 1000 fois au travers de
l'échantillon, il est donc nécessaire que le rapport signal sur
bruit soit au moins de 2.105 à absorbance nulle. La mesure
durant un intervalle de temps très court ( < 50 microsecondes)
nécessite un amplificateur à large bande passante, ce qui rend
difficile d'atteindre le rapport signal bruit désiré, car, comme on
le sait, le bruit augmente avec la largeur de la bande passante de
l'amplificateur. L'influence de ce bruit est importante par rap
port à l'influence du bruit présent dans des spectrophotomètres
usuels, dans lesquels on peut diminuer l'influence du bruit sur
les résultats des mesures en intégrant le signal de mesure sur une
ou plusieurs secondes.
Le problème de l'obtention d'un rapport
signal sur bruit suffisant est encore rendu plus difficile, par le fait
que l'on cherche à utiliser des photodiodes silicium dont l'asso
ciation avec un amplificateur gènere un bruit beaucoup plus
élevé que celui des photomultiplicateurs à bas niveau de lumiè
re. Ceci plu particulièrement pour les longueurs d'onde au des
sous de 400 nm pour des mesures d'absorption élevée (A - 3),
en raison de la plus faible sensibilité de ces photodétecteurs dans
cette partie du spectre.
Pour atteindre les caractéristiques photométriques indiquées ci-dessus, le faisceau de lumière fourni par le monochromateur doit présenter une grande pureté spectrale, afin d'éviter les problèmes bien connus des non-linéarités introduites par la lumière parasite et des effets de largeur de bande. L'obtention d'un faisceau de lumière présentant la pureté spectrale nécessaire pour satisfaire aux exigences photométriques requises présente des difficultés certaines lorsqu'on cherche en même temps à minimiser le coût et l'encombrement du spectrophotomètre.
Pour atteindre ces buts, on cherche à réduire le taux de lumière parasite à une valeur de l'ordre de 1.10 4 à une longueur d'onde de 290 nm avec un monochromateur utilisant un réseau de courte distance focale (environ 100 mm) (ceci avec une plage spectrale d'émission limitée par un filtre entre 270 et 380 nm).
Le procédé d'analyse spectrophotométnque est caractérisé par le fait que:
a) I'on forme un faisceau unique à partir d'un éclair de lumière blanche émis par cette source,
b) on rend constante la distribution spatiale de l'intensité du faisceau de sorte que cette distribution soit la même pour des faisceaux derivés d'éclairs différents,
c) on prélève du spectre lumineux dudit faisceau unique un faisceau monochromatique,
d) on divise ce faisceau monochromatique en deux faisceaux élémentaires,
e) on dirige l'un de ces faisceaux élémentaires à travers ledit échantillon,
f) on mesure l'intensité de la lumière résiduelle sortant de cet échantillon,
g) on mesure l'intensité de l'autre faisceau élémentaire et on détermine le taux d'absorbance dudit échantillon.
Le spectrophotomètre selon l'invention pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1, comporte une source de lumière blanche aux éclairs et est caractérisé par le fait qu'il comporte:
a) un dispositif optique (12, 13) pour former un faisceau lumineux unique à partir de chaque éclair émis par cette source,
b) un monochromateur à réseau (16) disposé dans la trajectoire de ce faisceau lumineux unique pour en prélever un faisceau monochromatique,
c) un dispositif optique stabilisateur disposé sur la trajectoire de ce faisceau entre le dispositif optique et le monochromateur et servant à rendre constante la distribution spatiale de l'intensité du faisceau,
de sorte que cette distribution soit la même pour des faisceaux dérivées d'éclairs différents,
d) un élément de division optique disposé le long de la trajectoire de faisceau monochromatique issu due monochromateur, pour former deux faisceaux élémentaires,
e) un premier photodétecteur disposé sur la trajectoire de l'un des faisceaux élémentaires,
f) un second photodétecteur disposé sur la trajectoire de l'autre faisceau élémentaire, et
g) une cuvette d'analyse transparente pour ledit échantillon, disposée sur la trajectoire de l'un de ces faisceaux élémentaires entre l'élément de division optique et le photodétecteur disposé sur la trajectoire.
Le procédé et le spectrophotomètre selon l'invention permettent d'atteindre les performances désirées indiquées ci-dessus et présente de plus les avantages suivants:
- très faible puissance consommée et dissipée, d'où une alimentation peu coûteuse et peu volumineuse et la possibilité d'intégrer la lampe dans un bloc optique très compact (voir figure 6), en raison de l'absence de contraintes thermiques,
- longue durée de vie de la source (plus de 20.106 éclairs) et des détecteurs, d'où il résulte une bonne fiabilité et une faible maintenance,
- absence d'un temps de stabilisation de l'émission de la lampe utilisée comme source de lumière.
La description ci-après décrit à titre d'exemple et avec référence aux dessins annexés, une réalisation préférée d'un procédé et d'un spectrophotomètre selon l'invention. Dans ces dessins:
-la figure 1 est une représentation schématique en perspective de l'arrangement optique d'un spectrophotomètre selon l'invention,
- la figure 2 montre une disposition préférée des électrodes de la lampe à éclairs 11 dans la figure 1,
- la figure 3 montre de façon schématique une vue en coupe d'une partie du dispositif stabilisateur du faisceau dans l'arran- gement optique de la figure 1,
-la figure 4 montre de façon schématique une variante de
l'arrangement optique de la figure 1,
- la figure 5 est un schéma de principe montrant l'utilisation d'un spectrophotomètre selon l'invention dans un analyseur rotatif,
- la figure 6 est une vue en
perspective montrant la structure compacte et le faible encombrement d'un spectrophotomètre selon l'invention,
- la figure 7 montre de façon schématique une vue d'une partie d'un deuxième dispositif stabilisateur du faisceau, lequel peut aussi être utilisé dans l'arrangement optique de la figure 1,
- la figure 8 illustre une méthode de réalisation du tube la dans la figure 1,
- la figure 9 montre de façon schématique une optique
d'entrée du monochromateur démunie du tube 14,
- les figures 10a, lOb, pila, îlb illustrent les variations de la
distribution de l'intensité lumineuse d'un éclair au suivant, au niveau de la fente d'entrée du monochromateur, avec l'optique
d'entrée de la fig. 9.
La figure 1 montre en perspectives et de façon schématique l'arrangement optique d'un spectrophotomètre selon l'invention. Celui-ci comporte:
une lampe à éclairs 1 1; un dispositif optique composé d'un miroir sphérique 12, d'une lentille 13 (distance focale 8mm, diamètre 12,5 mm) et d'un tube 14, lequel dispositif appelé ici dispositif optique stabilisateur sert à rendre constante la di stnbution spatiale et angulaire de la lumière fournie par la lampe à éclairs à un monochromateur à réseau 16;
une lame séparatrice 17 laquelle reflête une partie du faisceau de lumière fourni par le monochromateur vers une photodiode au silicium 18 pour générer un signal de référence et laquelle transmet le reste du faisceau fournit par le monochromateur à travers des lentilles 19, 21 (chacune avec une distance focale de 13 mm, etun diamètre de 8 mm); d'une cuvette 22 contenant un échantillon d'une lentille 23 et d'un des filtres d'ordre 24 vers une photodiode au silicium 25 qui fournit un signal électrique correspondant à l'intensité du faisceau transmis à travers l'échantillon.
L'arrangement optique de la figure 1 comporte en outre un déflecteur 15 de lumière diffractée d'ordre zéro, un masque 27 réduisant la lumière parasite et un dispositif 26 permettant la sélection et l'affichage de la longueur d'onde choisie pour la mesure.
La lampe à éclairs 1 1 est une lampe au xénon avec laquelle on produit des impulsions lumineuses avec une durée d'environ 2,3 avec., ce qui est nettement inférieur au temps de passage ( >
150 mise.) d'un échantillon dans l'axe du faisceau lumineux dans le cas d'un analyseur rotatif rapide (par exemple avec un rotor comportant 30 échantillons et tournant à 1000 tours par minute).
La lampe à éclairs 11 est du type bulbe et d'une puissance d'environ 7 W. Si l'énergie libérée par éclair dans la lampe est de 0,3 joules pour une durée de 2,3 microsecondes, la puissance moyenne émise durant ces 2,3 microsecondes correspond à celle d'une lampeXe continu de 130kW. On comprend aisément le gain en niveau de lumière et, par conséquent, en rapport signal sur bruit que produit l'utilisation d'une lampe pulsée. Les avantages de l'utilisation de la lampe à éclairs Il se résument aux points suivants:
- une source unique pour tout le spectre,
- puissance dissipée extrêmement faible,
- faible dimensions de l'ensemble lampe et alimentation,
- spectre relativement uniforme,
- longue durée de vie,
- mveau de lumière monochromatique très élevé.
L'utilisation d'une source de lumière pulsée du type décharge gazeuse se heurte cependant à des difficultés liées au fait que le chemin de l'arc varie aléatoirement d'un éclair à l'autre. Il s'en suit une variation de l'énergie lumineuse émise et de sa distribution spatiale. Ces variations doivent être réduites ou compensées pour permettre des mesures reproductibles dans le cas d'un spectrophotomètre.
Les variations de l'énergie lumineuse sont compensées par
le fait que l'on travaille avec un double faisceau, c'est-à-dire
avec un faisceau traversant l'échantillon et un faisceau de réfé
rence, de sorte que ces variations n'affectent pas de façon sensi
ble les résultats des mesures.
Afin d'obtenir une stabilisation de la position spatiale des
éclairs, il est convenable d'utiliser une lampe à éclairs du type
bulbe où la distance entre l'anode 31 et la cathode 32 est de
l'ordre de 1,5 mm et oû une électrode d'amorçage 33 est dispo
sée très près de la cathode (voir fig. 2), par exemple à une
distance de 0,2 à 0,5 mm. II est particulièrement avantageux
d'utiliser une lampe à éclairs comportant une anode et une ca
thode ayant chacune la forme d'une pastille rectangulaire, ces
pastilles étant placées dans le même plan et de telle façon que l'arc correspondant à chaque éclair s'établit entre deux coins desdites pastilles. Dans la forme d'exécution décrite ici à titre d'exemple l'on utilise une lampe désignée par FX-233U construite par EG & G, Inc, Salem, Massachusetts, USA.
Alternativement, on peut aussi utiliser une lampe désignée par XFX
1 19U construite par la même maison.
Afin de minimiser les fluctuations de la distribution spatiale de l'intensité des éclairs, il est aussi convenable de disposer la lampe 11 de façon à ce que la longueur des arcs produits le long de l'axe des électrodes soit parallèle à la largeur de fente d'en írée 93 (voir figure 9).
Ces deux dernières mesures contribuent à minimiser les variations de la longueur d'onde du faisceau délivré par le monochromateur dues aux fluctuations de la position de l'arc d'un éclair au suivant.
Comme mentionné ci-dessus, le dispositif stabilisateur du faisceau dans l'arrangement optique de la figure 1 comporte une lentille 13 (condenseur), laquelle forme l'image de l'éclair produit par la lampe 11 sur l'entrée du tube 14. Comme montré par la figure 3, les rayons lumineux 41 sont réfléchis par les parois internes du tube 14, ce qui donne une distribution spatiale pratiquement constante de l'intensité du faisceau 42 à la sortie du tube 14. De préférence, le dispositif stabilisateur est disposé de façon à éviter que les rayons lumineux issus des parties proches de la cathode et de l'anode entrent dans le tube 14, car la position spatiale des rayons lumineux issus desdites parties est particulièrement instable, c'est-à-dire qu'elle varie sensiblement d'un éclair au suivant.
Le tube 14 comporte des parois intérieures réfléchissant la lumière. Sur son entrée, on forme l'image de l'arc, sa sortie est placée directement au niveau de la fente d'entrée du monochromateur. Ses dimensions intérieures correspondent à celle de ladite fente et sa section peut être ronde, carrée ou rectangulaire.
Les réflexions successives de la lumière sur les parois permettent de rendre constante la distribution spatiale de l'intensité du faisceau de lumière à la sortie du tube 14 indépendamment des fluctuations de la distribution spatiale de l'intensité du faisceau à l'entrée du tube 14 d'un flash à un autre. Cette indépendance s'accroit avec la longueur du tube, mais ceci aux dépens du rendement lumineux du fait de l'auumentation du nombre de réflexions. Avec une longueur de 11 ou 22 mm, on observe encore une certaine influence des fluctuations de la position de l'arc dans la lampe éclair sur la reproductibilité des mesures, bien que avec une longueur de 11 mm l'on puisse déjà constater une amélioration considérable de la reproductibilité par rapport aux valeurs de ce paramètre obtenus dans le tube 14.
Des essais de reproductibilité avec un tube 14 de 33 mm de longneur et de diamètre 1,5 mm ainsi qu'un tube de même longueur mais de section carrée de 1,5 x 1,5 mm ont été effectués avec différentes lampes et types de lampes. Pour ces essais, on a remplacé la cuvette 22 par un filtre dont l'absorbance varie de 0,4 à 2 pour une variation de la longueur d'onde de 10 nm.
Les écarts types suivants de la variation d'absorbance ont été obtenus:
sanstube avectube =2.10-à4.10- =3.10-à5.10-
Ces résultats illustrent de façon spectaculaire l'amélioration
de la reproductibilité 5 introduite par l'utilisation de ce tube 14
de stabilisation de la lumière au niveau de la fente d'entrée du
monochromateur.
Une méthode préférée de réalisation du tube 14 consiste à
juxtaposer deux demi-cylindres 111, 112 (fig. 8), sur les parois internes desquels on a déposé par évaporation une couche réflé
chissante 113, par exemple une couche d'aluminium avec une
couche protectrice en fluorure de magnésium, le matériau des
demi-cylindres pouvant être du verre, du métal, ou encore du
plastique moulé. Le tube 14 peut ainsi être produit à un prix de
revient raisonnable et présenter une durée de vie acceptable.
Pour éviter une détérioration des parois du tube 14, la lentille de focalisation 13 (fig. 1) fait office de fermeture du c6té de son entrée. Si désiré, on peut prévoir à la sortie du tube 14 une lame de quartz ou une lentille de courte focale qui effectue l'image au niveau du réseau d'une section à l'intérieur du tube où le faisceau est stable.
Le tube 14 constitue une très bonne solution pour améliorer la reproductibilité du spectrophotomètre COBAS dans toutes les situations envisageables et plus particulièrement à absorban
ce élevée et en dehors du pic d'absorbance de l'échantillon me
suré. De plus, grace à ce tube, les critères d'acceptation des
lampes éclair du point de vue de la stabilité spatiale de leur arc
sont moins rigoureux.
Le tube 14 du dispositif stabilisateur du faisceau peut aussi être réalisé avec des moyens différents, par exemple en utilisant un cylindre de quartz plein 14' où les rayons lumineux sont mélangés par réflexion totale sur les parois de ce cylindre (voir figure 7) ou encore par un faisceau de fibres optiques entremêlés.
La fonction du dispositif stabilisateur du faisceau dans le spectrophotmètre selon l'invention est facile à comprendre si
I'on considère les difficultés qu'on a avec un montage (voir fig.
9) qui ne comporte pas un tel dispositif, c'est-à-dire un montage dans lequel l'image de l'éclair fourni par la lampe est formé directement sur la fente d'entrée du monochromateur à réseau.
La figure 9 montre de façon schématique un tel montage. L'image de l'arc dans la lampe éclair 11 est formée par la lentille 13 au niveau de la fente d'entrée 93 du monochromateur. Cette image présente une certaine distribution d'intensité lumineuse (IL) dont le profil se modifie d'un éclair au suivant selon la position de l'arc (voirfig. 10a, lOb, 11a, 11b). Figures 10a, lOb illustrent la modification de cette distribution d'un éclair (fig. 10a) au suivant (fig. 10b) dans le plan de diffraction ZOY. Figures lla, 1 1b illustrent la modification de cette distribution d'un éclair (fig. lla) au suivant (fig. llb) dans un plan ZOX perpendiculaire au plan de diffraction.
Si l'on considère les variations de cette distribution dans le plan de diffraction ZOY (plan passant par les centres des fentes d'entrée et de sortie et du réseau), l'angle moyen des rayons issus de cette fente et tombant sur le réseau fluctue avec les variations de la distribution d'énergie lumineuse sur cette fente. Comme la longueur d'onde du faisceau lumineux tombant sur la fente de sortie dépend de l'angle d'incidence des rayons, il s'en suit une variation de la longueur d'onde moyenne sélectionnée. Ceci se traduit par une mauvaise reproductibilité lorsque l'absorption de l'échantillon ou la sensibilité des détecteurs varie avec la longueur d'onde.
Par ailleurs, dans le plan perpendiculaire au plan de diffraction, les variations de la position de l'arc d'un éclair au suivant entrainent également une variation de la position moyenne de 1' angle du faisceau lumineux, ce qui, au niveau de la lame séparatrice 17, change l'angle d'incidence. Les lois de la réflection oblique de Fresnel montrent que le coefficient de réflection dépend de l'angle d'incidence et de la polarisation de la lumière. Une variation de l'angle d'incidence provoque une variation du coefficient de réflection affectant ainsi la reproductibilité des mesures.
Pour illustrer ces variations, considérons que la position moyenne de la distribution de lumière est déplacée de 0,1 mm sur la fente d'entrée, ce qui correspond à une variation angulaire de 5,9.10- 2 degré pour un angle d'incidence moyen de 45 degrés dans un monochromateur de 100 mm de focale. Cette variation angulaire provoque une variation du rapport de la lumière réfléchie par la lame à la lumière transmise de l'ordre de 2%o.
Par ailleurs, la transmission dans tous les milieux interceptés par les faisceaux de lumière soit par le faisceau de mesure, soit par le faisceau de référence, peut présenter des irrégularités spatiales, par exemple des traces dues à des poussières ou autres souillures; dans un tel cas, la reproductibilité est aussi affectée par des variations de la distribution spatiale de l'intensité du faisceau d'un éclair au suivant. Les variations de sensibilité spatiale des détecteurs provoquent également un effet similaire.
La fonction du dispositif stabilisateur décrit ci-haut est donc de contribuer à minimiser l'effet négatif des déplacements de l'arc d'un éclair au suivant sur la reproductibilité des mesures effectuées avec le spectrophotomètre.
Le monochromateur utilisé comporte un réseau concave holographique 16.
Le réseau 16 utilisé est un réseau holographique concave produit par Jobin-Yvon et présentant les caractéristiques suivantes: - dimensions du support 32 x 32 mm - dimensions utiles 30 x 30 mm -nombre de traits 1800 tr/mm - rayon de courbure 99,96mm - angle entre les bras 42 - distance fente d'entrée/réseau 95,8 mm - distance réseau/fente de sortie 98,8 mm
Ce réseau est corrige d'astigmatisme pour 290 et 600 nm,
I'astigmatisme reste cependant faible en dehors de ces longueurs d'onde.
A l'intérieur du monochromateur, on a disposé des caches comme le cache 15 (voir figures 1 et 6) permettant de réduire la lumière parasite due aux réflexions et diffusions sur les parois du monochromateur. L'inclinaison de ces caches est choisie de fa çon que la lumière non absorbée par les parois du monochromateur soit réfléchie dans des directions telles que cette lumière ne puisse plus tomber sur la fente de sortie. Ce montage diffère donc des montages conventionnels, où les parois du monochromateur sont perpendiculaires au plan de diffraction, de ce fait la lumière non absorbée est réfléchie dans des directions où elle peut revenir sur le réseau et passer ensuite par la fente de sortie.
Ceci est plus particulièrement le cas pour l'ordre de diffraction zéro dans des montages de faible encombrement. Sans les caches mentionnés ci-dessus, la lumière parasite due à l'ordre de diffraction zéro, serait aussi importante que la lumière parasite propre du réseau dans le montage réalisé.
La lame séparatrice 17 montrée dans la figure 1 est une lame à quartz de faible épaisseur, par exemple d'environ 0,2 mm.
Cette lame divise le faisceau fourni par le monochromateur, en un premier faisceau qui traverse la lame 17 et l'échantillon 22 à analyser et un deuxième faisceau réfléchi par la lame lequel arrive sur la photodiode 18 laquelle délivre un signal de référence correspondant à l'intensité du deuxième faisceau. Cette division physique du faisceau fourni par le monochromateur permet de compenser les fluctuations de l'énergie émise par éclair. Ces fluctuations n'ont pas d'influence sur les résultats de la mesure spectrophotométrique, car ceux-ci sont calculés à partir du rapport d'énergie entre le faisceau qui émerge de l'échantillon et le faisceau qui arrive sur la photodiode 18.
Comme mentionné ci-dessus dans la description du fonc
tionnement du dispositif stabilisateur du faisceau au niveau de la
fente d'entrée du monochromateur, les variations de la position
de l'arc d'un éclair au suivant entrainent une variation de l'angle
d'incidence sur la lame séparatrice 17 et par là une variation du
coefficient de réflection de cette lame. La variation du coeffi
cient de réflection affecte à son tour la reproductibilité des me
sures. Afin de minimiser les variations du coefficient de reflec
tion de la lame séparatrice 17, il est convenable de placer cette
lame normalement au plan de diffraction et avec un angle d'inci
dence aussi faible que possible, car les variations du coefficient
de réflection de la lame sont minimes pour des angles d'inciden
ce faibles.
Afin de placer la lame séparatrice sous un faible angle
d'incidence, compris, par exemple, entre 10 " et 25 ", de préférence approximativement 14 , tout en conservant un montage
optique simple, cette lame est placée à l'intérieur du monochro
mateur dans le trajet du faisceau lumineux convergent allant du
réseau holographique 16 à la fente de sortie du monochroma
teur (voir 94 dans la figure 6). Ceci permet d'obtenir un faisceau
de référence convergent qui arrive sur une fente réciproque de la fente de sortie puis directement sur la photodiode de référen ce 18.
L'arrangement optique formé par les lentilles 19 et 21 forme
l'image du réseau du monochromateur sur la fenêtre d'entrée de l'échantillon et l'image de la fente de sortie du monochromateur sur la fenêtre de sortie de l'échantillon. Cette configuration permet l'utilisation optimale du flux lumineux.
Les filtres d'ordre 24 disposés après l'échantillon sont des
filtres passe-bande en verre coloré servant à éliminer la lumière
due à la fluorescence de certains échantillons, la lumière résul
tant des ordres de diffraction plus élevés et à réduire la lumière
parasite.
Le flux lumineux traversant l'échantillon est finalement fo
calisé sur la photodiode 25, laquelle délivre un signal correspon
dant à l'intensité dudit flux lumineux.
Le photocourant délivré par chaque photodiode est intégré
pour chaque impulsion lumineuse et les signaux résultants sont
traités après conversion analogique-digitale par un microproces
seur.
La solution décrite est particulièrement adaptée pour des
analyseurs rotatifs, elle présente une structure optique simple
comportant peu de composants. Du fait de la très courte durée
de l'éclair (2,3 micro-secondes), les effets de bord (passage de
lumière par les parois de la cuvette) sont évités lors du déplace
ment de l'échantillon.
Le schéma de principe de la figure 5 illustre l'utilisation du
spectrophotomètre 61 selon l'invention (voir figure 1) dans un
analyseur rotatif comportant un rotor 62 dans lequel sont placés
les échantillons 22, montrés dans la figure 1. La flèche 74 indi
que la rotation du rotor 62 pendant les mesures spectrophoto
métriques. Une source d'alimentation programmable 64 ali
mente lalampe à éclairs 11 du spectrophotomètre 61. Le con
trôle de l'ensemble et le calcul des résultats est effectué par un
microprocesseur 66. Les mesures à effectuer sont commandées
par ce dernier lorsque réchantillon sélectionné se trouve exacte
ment dans l'axe du faisceau lumineux. Cette position est détec
tée à l'aide d'un capteur optique de position 65 détectant des
repères sur le rotor.
Un intégrateur 67 intègre le signal corre
spondant au faisceau de lumière reçu par la photodiode 25 dans
la figure 1, c'est-à-dire au faisceau transmis à travers l'échantil
lon 22. Un intégrateur 68 intègre le signal correspondant au
faisceau de lumière reçu par la photodiode 18 dans la figure 1,
c'est-à-dire au faisceau de référence. Un amplificateur 69 à gain
auto-ajustable amplifie le signal de sortie de l'intégrateur 67.
L'amplificateur 69 est relié au micro-processeur 66. Un circuit
multiplexeur 71 conduit alternativement les sorties de l'intégra
teur 68 (signal de référence) et de l'amplificateur 69 (signal de
mesure) à un convertisseur analogique/digital 72 lequel conver tit les signaux analogiques appliqués à son entrée et les fournit sous forme digitale au microprocesseur 66. Au moyen de l'amplificateur 69, le canal du signal mesuré dispose d'une adaptation automatique du gain en fonction de l'atténuation du signal de façon à utiliser la plage du convertisseur 72 présentant la meilleure résolution.
Par ailleurs, le niveau du signal incident ou du signal transmis est ajusté pour l'utilisation optimum du convertisseur, en fonction de la longueur d'onde, en variant la tension d'alimentation du circuit d'alimentation 64 de la lampe éclair; cet ajustement est également contrôlé par le microprocesseur. Enfin, le microprocesseur procède à tous les calculs désirés, par exemple les calculs servant à déterminer la transmission, l'absorbance, la moyenne sur plusieurs point de mesure, la concentration, et fourni les signaux correspondants au résultats des mesures à un dispositif d'affichage et/ou enregistrement 73.
Les spectrophotomètres à double faisceau permettent de compenser les fluctuations d'intensité de la source lumineuse et également les dérives indésirables des caractéristiques photométriques de l'échantillon, par exemple les variations d'absorbance au cours du temps du réactif dans certaines analyses de chimie clinique. Pour ceci, les mesures sont effectuées par rapport à un échantillon de référence qui présente la même dérive que l'échantillon à mesurer. Parmi les spectrophotomètres à double faisceau, peu d'équipements comprennent deux faisceaux physiquement distincts fournissant simultanément un signal de référence et un signal de mesure car ces équipements sont relativement onéreux en raison de la complexité de l'optique et du double système de photodétection.
Plus couramment on trouve divers dispositifs où les mesures de l'échantillon de référence et de l'échantillon à mesurer sont effectuées successivement, ceci en utilisant un dispositif de commutation mécanique, soit du faisceau lumineux d'un échantillon à l'autre, soit des échantillons devant un même faisceau. Ce type de solution comprend le plus souvent un seul système de détection et ne permet pas de compenser les fluctuations d'intensité de la source entre deux mesures successives.
L'utilisation d'une lampe à éclairs nécessite un système avec deux photodétecteurs, mais, par contre, elle permet l'utilisation de photodiodes silicium à bas prix de revient, avec des performances photométriques satisfaisantes du point de vue rapport signal sur bruit.
Le spectrophotomètre selon l'invention dans le cas des analyseurs rotatifs effectue une compensation des dérives photométriques indésirables par commutation des échantillons de référence et de mesures, la commutation s'effectuant du fait que lorsque le rotor tourne le spectrophotomètre produit des signaux représentatifs de l'absorption aussi bien à travers des échantillons à mesurer qu'à travers d'au moins un échantillon de référence intercalé parmi les échantillons à mesurer disposés sur le rotor.
L'exécution du spectrophotomètre selon l'invention décrite ci-dessus est particulièrement adaptée pour des analyseurs rotatifs; elle peut être modifiée comme montré schématiquement dans la figure 4 pour obtenir un spectrophotomètre à double faisceau d'usage plus général et présentant des avantages par rapport aux dispositifs connus.
La modification représentée à la figure 4 montre un spectrophotomètre à double faisceau sans éléments mécaniques en mouvement. La division du faisceau filtré en deux faisceaux de mesure est effectuée statiquement. Un échantillon peut être disposé dans chacun des deux faisceaux. Dans ce cas, on cherche à obtenir des faisceaux d'intensité sensiblement identiques. Pour ceci, on dépose sur la lame de quartz 51 un réseau de Ronchi présentant un pas de l'ordre de 0,3 à 1 mm. Ce réseau est caractérisé par une alternance régulière de bandes réfléchissantes et transparentes. Comme précédemment, le faisceau traversant cette lame passe par une fente de sortie puis par l'intermédiaire d'une lentille 53 forme un faisceau de lumière traversant l'échantillon de référence 54, le filtre passe-bande lequel n'est pas montré dans la figure 4) et tombe sur la photodiode 25.
Le faisceau réfléchi par la lame après déviation sur un miroir 52 de renvoi arrive sur une fente de sortie puis par l'intermédiaire d'une lentille 55 continue son chemin vers la photodiode 18. Sur la trajectoire de ce faisceau réfléchi, on peut interposer les échantillons à mesurer 56.
L'appareil selon l'invention est un spectrophotomètre à double faisceau, d'usage général, sans éléments mécaniques en mouvement, et présentant les avantages résultant de l'utilisation d'une lampe à éclairs, lequel, par définition, sert à effectuer des mesures de transmission ou d'absorbance dans un domaine spectral donné d'échantillons les plus divers, par exemple pour les mesures usuelles avec cuvette statique des solutions utilisées pour des analyses de chimie clinique.
Ces mesures optiques peuvent porter sur la mesure de l'absorbance à quelques longueurs d'onde prédéterminées ou encore sur l'enregistrement des caractéristiques de transmission de l'échantillon sur une plage spectrale continue. Dans ce dernier cas, la valeur du rapport des signaux récoltés en l'absence d'échantillon est préalablement mémorisée dans une mémoire du microprocesseur. Ceci permet de soustraire avec précision le niveau de base, et d'augmenter ainsi la précision des mesures, le déplacement du réseau pour la sélection des longueurs d'onde est alors commandé par un moteur.
Parmi les avantages déjà mentionnés dans l'introduction de cette description il est important de noter que, comme montré par la figure 6, le spectrophotomètre selon l'invention présente une structure très compacte et un faible encombrement. En plus des éléments qui ont déjà été définis ci-dessus avec référence à la figure 1, la figure 6 montre un boitier 91 contenant un préamplificateur du signal correspondant à l'intensité du flux lumineux transmis à travers l'échantillon, un sélecteur 92 des filtres d'ordre 24 (voir figure 1), une plaquette 93 contenant la fente d'entrée du monochromateur, une plaquette 94 contenant la fente de sortie de celui-ci, une vis de réglage 95 servant à ajuster la position du boitier 91, un axe 96 pour la sélection des longueurs d'onde par un moteur et une connection 97 au réseau d'alimentation,
dans le cas où la source d'alimentation 64 est alimentée par le réseau.
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CLAIMS
1. A spectrophotometric analysis method according to which the absorbance rate of a sample crossed by a beam of monochromatic light coming from a white light source with flashes is determined, by comparing the light intensity at the output of this sample and that of a reference light beam from this same source, characterized in that:
:
a) a single beam is formed from a flash of white light emitted by this source,
b) the spatial distribution of the beam intensity is made constant so that this distribution is the same for beams derived from different lightning,
c) a monochromatic beam is taken from the light spectrum of said single beam,
d) this monochromatic beam is divided into two elementary beams,
e) one of these elementary beams is directed through said sample,
f) the intensity of the residual light leaving this sample is measured,
g) the intensity of the other elementary beam is measured and the absorbance rate of said sample is determined.
2. Spectrophotometer for implementing the method according to claim 1, comprising a source of white lightning flash, characterized in that it comprises:
a) an optical device (12, 13) for forming a single light beam from each flash emitted by this source,
b) a grating monochromator (16) arranged in the path of this single light beam to take a mono chromatic beam therefrom,
c) an optical stabilizing device placed on the path of this beam between the optical device and the monochromator and serving to make the spatial distribution of the beam intensity constant,
so that this distribution is the
even for beams derived from different lightning,
d) an optical division element arranged along the path
jectory of the monochromatic beam from the monochroma
tor, to form two elementary beams,
e) a first photodetector disposed on the trajectory of
one of the elementary beams,
f) a second photodetector disposed on the path of the other elementary beam, and
g) a transparent analysis cuvette for said sample, disposed on the path of one of these elementary beams between the optical division element and the photodetector disposed on the path.
3. Spectrophotometer according to claim 2, characterized in that the flashlight comprises a starting electrode being located much closer to the cathode than to the anode in order to stabilize the position of the arc.
4. Spectrophotometer according to claim 2, characterized
in that the stabilizer includes a tube having internal reflective walls which serve to produce multiple reflections of the light beam derived from each
lightning bolt.
5. Spectrophotometer according to claim 2, characterized
in that the monochromator includes a concave lattice ho
lographic.
6. Spectrophotometer according to claim 2, characterized
in that the element of optical division of the filtered beam is a
quartz blade placed in such a way that the angle of incidence of the
filtered beam is between 10 and 25 ".
7. Spectrophotometer according to claim 2, characterized
in that the element of optical division of the filtered beam is a
solid quartz blade with alternating bands
transparent and reflective.
8. Spectrophotometer according to claim 2, characterized in that the stabilizing device comprises a quartz cylinder used to produce multiple reflections of the light beam derived from each flash.
9. Spectrophotometer according to claim 2, characterized in that a reference or measurement sample can be interposed on each of the two filter beams coming from the dividing element.
10. Application of the method according to claim 1, for performing analyzes in the field of clinical chemistry.
The present invention relates to a spectrophotometric analysis method according to which the absorbance rate of a sample crossed by a beam of monochromatic light coming from a source of white light with flashes is determined, by comparing the intensity at the output of this sample and that of a reference light beam from this same source, as well as a spectrophotometer for implementing the method.
The present invention relates more particularly to such a method and a spectrophotometer which can be used for the optical analysis of samples in a rotary analyzer.
Double beam spectrophotometers are known, in which the double beam is obtained by physical separation of a beam supplied by a monochromator (H. Moenke and L.
Moenke - Blankenburg, Optische Bestimmungsverfahren und Geräte für Mineralogen und Chemiker, Akademische Verlagsgesellschaft Geest & Portig K.-G., Leipzig 1965, pages 185307). The purpose of this separation into two beams is to compensate for variations in the intensity of the light source of the spectrophotometer. One of the beams serves as an intensity reference and the other crosses the sample to be measured.
Different solutions are used to realize the main functions of spectrophotometers. The light source consists of one or two continuous emission lamps of the types: halogen, deuterium, mercury arc and / or xenon. For the monochromator, there are either prism or network dispersion devices. Finally, for detectors, photomultipliers or phototubes are generally used and in certain more recent developments, silicon photodiodes.
The many types of components available and the different possible structures give many possibilities of combination capable of producing a spectrophotometer.
The disadvantages of known spectrophotometers have their origin mainly in the light source and the monochromator used.
The most common light source for visible spectrum applications is certainly the halogen tungsten lamp. However, its drawbacks are well known:
- very low emission in the ultraviolet,
-very large variation in light intensity in the useful spectrum; The light intensity at 290 nm is around 900 times lower than at 700 nm,
- high level of stray light hence the need to use expensive blocking filters,
- the system for compensating for the variation in light intensity with the wavelength must have great dynamics,
- relatively short lifespan,
- poor light output: 8 Im / W,
- significant dissipated power, and
- relatively heavy and bulky lamp power supply.
To overcome the difficulties encountered in the ultraviolet with
this type of lamp, some spectrophotometers use a second light source, generally a deute lamp
rium. However, this solution has the additional disadvantages of
high cost and a large footprint.
Like another source of light, lamps with different
types of electric shock are used, for example lamps
xenon, mercury, argon. Xenon lamps present
try the most uniform spectrum for the spectral domain of
the application and furthermore their luminous efficacy is beautiful
blow superior to tungsten, for example 21 Im / W with a 150W lamp. These lamps are generally offered for powers higher than 100W and their use poses serious cooling problems. The power supply and the mounting of this type of lamp are very bulky and expensive.
The grating monochromator is the solution of choice for a continuous variation of the wavelength. However, the stray light rate resulting from the combination of lamp and monochromator must be very low, practically less than 1.104 if it is desired to carry out measurements with a linearity error of less than 1.5% until attenuation of 1000 times (which corresponds to an absorbance = 3). For these performances, dual network monochromators are used because monochromators with a network have a too high stray light rate. These dual network monochromators are however expensive, cumbersome and their alignment is relatively time-consuming.
In the description of US Pat. No. 3,810,696, a spectrophotometer has already been described comprising a flash lamp, a monochromator or an interference filter to produce two beams, the first of which passes through a sample to be analyzed and the second arrives at a detector which delivers a reference signal corresponding to the intensity of the second beam. This description does not contain any mention nor of the difficulties or disadvantages due to the fluctuations of the position of the arc (in the flash lamp) from one flash to the next, nor of the means placed between the flash lamp and the monochromator in order to overcome these difficulties .
At the base of the invention is the problem of producing a spectrophotometer for a clinical chemistry analyzer comprising a rotor rotating at around 1000 rpm. and on which are arranged samples of small volume. Such a spectrometer must have the following characteristics, which no known spectrophotometer simultaneously satisfies today:
- measurement of the absorbance of liquid samples deposited in rotating cuvettes at around 1000 rpm.,
- short measurement time of the 30 samples contained on the rotor, i.e. less than 350 milliseconds,
- time interval available for a measurement of less than 50 microseconds,
- low volume of liquid sample: 200 microliters,
- continuous selection of wavelengths between 290 and 700 nm,
- bandwidth: 8 nm,
- large absorbance range measurable from 0.0 to 3.0.
This characteristic is particularly important in automatic instruments to cover the significant differences in absorbance encountered between normal and pathological cases of the biological materials examined. Or for example between a lipemic serum and a normal serum.
- reproducibility of measurements compatible with the requirements of enzymatic reactions (standard deviation S <5.10-4 absorbance unit). This is understood in the sense of the reproducibility of the absorbance measurements carried out on the same sample.
This point is particularly important in the case of kinetic methods. In these methods the variation in absorbance is small over time, so good reproducibility makes it possible to reduce the duration of the measurements. In addition, in these methods, the level of absorbance is sometimes quite high (1.7 - 2.2).
Also the reproducibility must be excellent in a large pla
absorbance age.
- Excellent linearity between absorbance and concentration
tration over a wide absorbance range. This sim linearity
simplifies the use of the instrument by eliminating the use of a
calibration curve. High absorbency and specially
in the ultraviolet, linearity is difficult to obtain. This one
hangs from the purity of monochromatic light that we can
characterize by a stray light rate defined by the ratio
between the intensity of residual light emitted outside the
spectral band selected at the light intensity inside
re from this band.
- small footprint. This quality is desired for a
instrument which is most often used in very crowded small laboratories.
- reduced maintenance.
- low cost price.
For reasons of space and cost
spectrophotometer to perform, it is more desirable to use
as detectors of silicon photodiodes in association with
low noise amplifiers.
Obtaining the photometric performances indicated below
top with such short measurement times creates difficulties
particular techniques relating on the one hand to the signal ratio
on noise to be achieved and on the other hand to obtain a beam
of light with the necessary spectral purity. In addition, the
shape of cuvettes used to hold tax samples
se the need to use a small section light beam on
a relatively large length, therefore the numerical opening
risk of optics is limited and therefore the solid angle of
source light collection is also limited.
Since we want to make reproducible measurements with
a maximum attenuation of the signal of 1000 times through
the sample, so it is necessary that the signal to
noise at least 2.105 at zero absorbance. Measurement
during a very short time interval ( <50 microseconds)
requires a high bandwidth amplifier, which makes
difficult to achieve the desired signal-to-noise ratio because, as we
you know, the noise increases with the bandwidth of
the amplifier. The influence of this noise is important compared to
influence of noise present in spectrophotometers
usual, in which we can reduce the influence of noise on
measurement results by integrating the measurement signal on a
or several seconds.
The problem of getting a report
sufficient signal to noise is made even more difficult by the fact
that we are looking to use silicon photodiodes whose asso
ciation with an amplifier generates much more noise
higher than that of low light level photomultipliers
re. This is particularly true for wavelengths at
below 400 nm for high absorption measurements (A - 3),
due to the lower sensitivity of these photodetectors in
this part of the spectrum.
To achieve the photometric characteristics indicated above, the light beam supplied by the monochromator must have a high spectral purity, in order to avoid the well-known problems of non-linearities introduced by stray light and of bandwidth effects. Obtaining a beam of light having the spectral purity necessary to satisfy the required photometric requirements presents certain difficulties when we seek at the same time to minimize the cost and the bulk of the spectrophotometer.
To achieve these goals, we seek to reduce the stray light rate to a value of the order of 1. 10 4 at a wavelength of 290 nm with a monochromator using a network of short focal distance (approximately 100 mm) (this with a spectral range of emission limited by a filter between 270 and 380 nm).
The spectrophotometric analysis method is characterized by the fact that:
a) a single beam is formed from a flash of white light emitted by this source,
b) the spatial distribution of the beam intensity is made constant so that this distribution is the same for beams derived from different lightning,
c) a monochromatic beam is taken from the light spectrum of said single beam,
d) this monochromatic beam is divided into two elementary beams,
e) one of these elementary beams is directed through said sample,
f) the intensity of the residual light leaving this sample is measured,
g) the intensity of the other elementary beam is measured and the absorbance rate of said sample is determined.
The spectrophotometer according to the invention for implementing the method according to claim 1, comprises a source of white light with flashes and is characterized in that it comprises:
a) an optical device (12, 13) for forming a single light beam from each flash emitted by this source,
b) a grating monochromator (16) arranged in the path of this single light beam to take a monochromatic beam therefrom,
c) an optical stabilizing device placed on the path of this beam between the optical device and the monochromator and serving to make the spatial distribution of the beam intensity constant,
so that this distribution is the same for beams derived from different lightning,
d) an optical division element disposed along the path of the monochromatic beam coming from the monochromator, to form two elementary beams,
e) a first photodetector disposed on the path of one of the elementary beams,
f) a second photodetector disposed on the path of the other elementary beam, and
g) a transparent analysis cuvette for said sample, disposed on the path of one of these elementary beams between the optical division element and the photodetector disposed on the path.
The method and the spectrophotometer according to the invention make it possible to achieve the desired performances indicated above and also has the following advantages:
- very low power consumed and dissipated, hence an inexpensive and not bulky power supply and the possibility of integrating the lamp into a very compact optical unit (see FIG. 6), due to the absence of thermal constraints,
- long service life of the source (more than 20. 106 flashes) and detectors, resulting in good reliability and low maintenance,
- absence of a stabilization time for the emission of the lamp used as a light source.
The description below describes by way of example and with reference to the accompanying drawings, a preferred embodiment of a method and a spectrophotometer according to the invention. In these drawings:
FIG. 1 is a schematic perspective representation of the optical arrangement of a spectrophotometer according to the invention,
FIG. 2 shows a preferred arrangement of the electrodes of the flash lamp 11 in FIG. 1,
FIG. 3 schematically shows a sectional view of part of the beam stabilizing device in the optical arrangement of FIG. 1,
FIG. 4 schematically shows a variant of
the optical arrangement of FIG. 1,
FIG. 5 is a block diagram showing the use of a spectrophotometer according to the invention in a rotary analyzer,
- Figure 6 is a view in
perspective showing the compact structure and the small footprint of a spectrophotometer according to the invention,
FIG. 7 schematically shows a view of part of a second beam stabilizing device, which can also be used in the optical arrangement of FIG. 1,
FIG. 8 illustrates a method of producing the tube 1a in FIG. 1,
- Figure 9 schematically shows an optic
input of the monochromator without the tube 14,
- Figures 10a, lOb, pila, îlb illustrate the variations of the
distribution of the light intensity from one flash to the next, at the entrance slot of the monochromator, with the optics
input of fig. 9.
Figure 1 shows in perspective and schematically the optical arrangement of a spectrophotometer according to the invention. This includes:
a flashlight 1 1; an optical device composed of a spherical mirror 12, a lens 13 (focal length 8 mm, diameter 12.5 mm) and a tube 14, which device called here stabilizing optical device serves to make the spatial distribution constant and angle of the light supplied by the flash lamp to a grating monochromator 16;
a splitter plate 17 which reflects part of the light beam supplied by the monochromator to a silicon photodiode 18 to generate a reference signal and which transmits the rest of the beam supplied by the monochromator through lenses 19, 21 (each with a focal length of 13 mm, and a diameter of 8 mm); from a cuvette 22 containing a sample of a lens 23 and from one of the filters of order 24 to a silicon photodiode 25 which supplies an electrical signal corresponding to the intensity of the beam transmitted through the sample.
The optical arrangement of FIG. 1 also comprises a deflector 15 for zero order diffracted light, a mask 27 reducing stray light and a device 26 allowing the selection and display of the wavelength chosen for the measurement. .
The flash lamp 1 1 is a xenon lamp with which light pulses are produced with a duration of about 2.3 with. , which is significantly less than the passage time (>
150 bet. ) of a sample in the axis of the light beam in the case of a rapid rotary analyzer (for example with a rotor comprising 30 samples and rotating at 1000 revolutions per minute).
The flash lamp 11 is of the bulb type and has a power of about 7 W. If the energy released by flash in the lamp is 0.3 joules for a duration of 2.3 microseconds, the average power emitted during these 2.3 microseconds corresponds to that of a continuous lampXe of 130kW. It is easy to understand the gain in light level and, consequently, in signal-to-noise ratio produced by the use of a pulsed lamp. The advantages of using the flashlight It boils down to the following points:
- a single source for the whole spectrum,
- extremely low dissipated power,
- small dimensions of the lamp and power supply assembly,
- relatively uniform spectrum,
- long life expectancy,
- very high level of monochromatic light.
The use of a pulsed light source of the gas discharge type however encounters difficulties linked to the fact that the path of the arc varies randomly from one lightning to another. It follows a variation of the light energy emitted and its spatial distribution. These variations must be reduced or compensated to allow reproducible measurements in the case of a spectrophotometer.
Variations in light energy are compensated by
the fact that we work with a double beam, that is to say
with a beam passing through the sample and a reference beam
rence, so these variations do not affect sensi
ble the measurement results.
In order to stabilize the spatial position of
lightning, it is advisable to use a lightning lamp of the type
bulb where the distance between anode 31 and cathode 32 is
around 1.5 mm and where a priming electrode 33 is available
placed very close to the cathode (see fig. 2), for example at a
distance from 0.2 to 0.5 mm. It is particularly advantageous
to use a flashlight comprising an anode and a ca
thode each having the shape of a rectangular patch, these
pellets being placed in the same plane and in such a way that the arc corresponding to each flash is established between two corners of said pellets. In the embodiment described here by way of example, a lamp designated by FX-233U constructed by EG & G, Inc, Salem, Massachusetts, USA is used.
Alternatively, you can also use a lamp designated by XFX
1 19U built by the same house.
In order to minimize the fluctuations in the spatial distribution of the intensity of the lightning, it is also suitable to arrange the lamp 11 so that the length of the arcs produced along the axis of the electrodes is parallel to the width of the slit in 93 (see Figure 9).
These last two measurements help to minimize variations in the wavelength of the beam delivered by the monochromator due to fluctuations in the position of the arc from one flash to the next.
As mentioned above, the beam stabilizing device in the optical arrangement of FIG. 1 comprises a lens 13 (condenser), which forms the image of the lightning produced by the lamp 11 on the inlet of the tube 14. As shown in FIG. 3, the light rays 41 are reflected by the internal walls of the tube 14, which gives a practically constant spatial distribution of the intensity of the beam 42 at the outlet of the tube 14. Preferably, the stabilizing device is arranged so as to prevent the light rays coming from the parts close to the cathode and the anode from entering the tube 14, because the spatial position of the light rays coming from said parts is particularly unstable, it that is, it varies significantly from one flash to the next.
The tube 14 has interior walls reflecting light. On its input, the image of the arc is formed, its output is placed directly at the level of the input slot of the monochromator. Its internal dimensions correspond to that of said slot and its section can be round, square or rectangular.
The successive reflections of the light on the walls make it possible to make the spatial distribution of the intensity of the beam of light constant at the outlet of the tube 14 independently of the fluctuations in the spatial distribution of the intensity of the beam at the inlet of the tube 14 from one flash to another. This independence increases with the length of the tube, but this at the expense of light output due to the increase in the number of reflections. With a length of 11 or 22 mm, we still observe a certain influence of the fluctuations of the position of the arc in the flash lamp on the reproducibility of the measurements, although with a length of 11 mm we can already see an improvement considerable reproducibility compared to the values of this parameter obtained in tube 14.
Reproducibility tests with a tube 33 of 33 mm in length and 1.5 mm in diameter as well as a tube of the same length but with a square section of 1.5 x 1.5 mm were carried out with different lamps and types of lamps. For these tests, the dish 22 was replaced by a filter whose absorbance varies from 0.4 to 2 for a variation of the wavelength of 10 nm.
The following standard deviations of the absorbance variation were obtained:
sanstube avectube = 2. 10 -4. 10- = 3. 10 -5. 10-
These results dramatically illustrate the improvement
reproducibility 5 introduced by the use of this tube 14
light stabilization at the entrance slit of the
monochromator.
A preferred method of producing the tube 14 consists in
juxtapose two half-cylinders 111, 112 (fig. 8), on the internal walls of which a reflective layer has been deposited by evaporation
chissant 113, for example a layer of aluminum with a
protective layer of magnesium fluoride, the material of
half-cylinders can be glass, metal, or even
molded plastic. The tube 14 can thus be produced at a price of
is reasonable and has an acceptable service life.
To avoid deterioration of the walls of the tube 14, the focusing lens 13 (fig. 1) acts as a closure on the side of its entrance. If desired, one can provide at the outlet of the tube 14 a quartz blade or a short focal lens which performs the image at the level of the network of a section inside the tube where the beam is stable.
The tube 14 constitutes a very good solution for improving the reproducibility of the COBAS spectrophotometer in all conceivable situations and more particularly to be absorbed.
this high and outside the absorbance peak of the sample me
safe. In addition, thanks to this tube, the acceptance criteria for
flash lamps from the point of view of the spatial stability of their arc
are less rigorous.
The tube 14 of the beam stabilizing device can also be produced with different means, for example using a solid quartz cylinder 14 'where the light rays are mixed by total reflection on the walls of this cylinder (see Figure 7) or by a bundle of intertwined optical fibers.
The function of the beam stabilizing device in the spectrophotmeter according to the invention is easy to understand if
We consider the difficulties we have with an assembly (see fig.
9) which does not include such a device, that is to say an assembly in which the image of the lightning provided by the lamp is formed directly on the input slot of the grating monochromator.
Figure 9 shows schematically such an arrangement. The image of the arc in the flash lamp 11 is formed by the lens 13 at the entrance slit 93 of the monochromator. This image shows a certain light intensity distribution (IL) whose profile changes from one flash to the next depending on the position of the arc (see fig. 10a, 10b, 11a, 11b). Figures 10a, 10b illustrate the modification of this distribution of a flash (fig. 10a) to the next (fig. 10b) in the ZOY diffraction plane. Figures 11a, 11b illustrate the modification of this distribution of a flash (fig. lla) to the next (fig. llb) in a ZOX plane perpendicular to the diffraction plane.
If we consider the variations of this distribution in the ZOY diffraction plane (plane passing through the centers of the entry and exit slits and of the grating), the mean angle of the rays coming from this slit and falling on the grating fluctuates with variations in the distribution of light energy on this slit. As the wavelength of the light beam falling on the exit slit depends on the angle of incidence of the rays, there follows a variation in the selected average wavelength. This results in poor reproducibility when the absorption of the sample or the sensitivity of the detectors varies with the wavelength.
Furthermore, in the plane perpendicular to the diffraction plane, variations in the position of the arc from one flash to the next also cause a variation in the average position of the angle of the light beam, which, at the level of the separating blade 17, changes the angle of incidence. The laws of Fresnel oblique reflection show that the reflection coefficient depends on the angle of incidence and the polarization of the light. A variation in the angle of incidence causes a variation in the reflection coefficient, thus affecting the reproducibility of the measurements.
To illustrate these variations, consider that the average position of the light distribution is moved by 0.1 mm on the entry slit, which corresponds to an angular variation of 5.9. 10- 2 degree for an average angle of incidence of 45 degrees in a monochromator with 100 mm focal length. This angular variation causes a variation in the ratio of the light reflected by the plate to the transmitted light of the order of 2% o.
Furthermore, the transmission in all the environments intercepted by the light beams either by the measurement beam or by the reference beam, can present spatial irregularities, for example traces due to dust or other stains; in such a case, the reproducibility is also affected by variations in the spatial distribution of the intensity of the beam from one flash to the next. Variations in the spatial sensitivity of the detectors also cause a similar effect.
The function of the stabilizing device described above is therefore to help minimize the negative effect of displacements of the arc from one flash to the next on the reproducibility of the measurements made with the spectrophotometer.
The monochromator used comprises a concave holographic network 16.
The network 16 used is a concave holographic network produced by Jobin-Yvon and having the following characteristics: - dimensions of the support 32 x 32 mm - useful dimensions 30 x 30 mm - number of lines 1800 rpm - radius of curvature 99.96mm - angle between the arms 42 - distance from inlet / network slot 95.8 mm - distance from network / outlet slot 98.8 mm
This network is corrected by astigmatism for 290 and 600 nm,
Astigmatism remains weak outside these wavelengths, however.
Inside the monochromator, covers like the cover 15 have been placed (see FIGS. 1 and 6) making it possible to reduce the stray light due to reflections and diffusions on the walls of the monochromator. The inclination of these covers is chosen so that the light not absorbed by the walls of the monochromator is reflected in directions such that this light can no longer fall on the exit slot. This arrangement therefore differs from conventional arrangements, where the walls of the monochromator are perpendicular to the diffraction plane, therefore the non-absorbed light is reflected in directions where it can return to the network and then pass through the exit slit.
This is more particularly the case for the zero diffraction order in compact assemblies. Without the covers mentioned above, the stray light due to the order of zero diffraction, would be as important as the own stray light of the network in the assembly carried out.
The separating blade 17 shown in FIG. 1 is a thin quartz blade, for example around 0.2 mm.
This plate divides the beam supplied by the monochromator, into a first beam which crosses the plate 17 and the sample 22 to be analyzed and a second beam reflected by the plate which arrives on the photodiode 18 which delivers a reference signal corresponding to the intensity of the second beam. This physical division of the beam supplied by the monochromator makes it possible to compensate for the fluctuations in the energy emitted by lightning. These fluctuations have no influence on the results of the spectrophotometric measurement, because these are calculated from the energy ratio between the beam which emerges from the sample and the beam which arrives on the photodiode 18.
As mentioned above in the description of the land
operation of the beam stabilizer at the
monochromator input slot, variations in position
from the arc of a flash to the next cause a variation of the angle
of incidence on the separating blade 17 and thereby a variation of the
coefficient of reflection of this blade. The variation of the coeffi
reflective cient in turn affects the reproducibility of me
sure. To minimize variations in the reflectance coefficient
separator blade 17, it is convenient to place this
plate normally at the diffraction plane and with an angle of incidence
dence as low as possible, because variations in the coefficient
of reflection of the blade are minimal for angles of incident
this weak.
In order to place the separating blade at a low angle
incidence, for example between 10 "and 25", preferably approximately 14, while keeping a mounting
simple optic, this blade is placed inside the monochro
in the path of the converging light beam from
holographic network 16 at the monochroma exit slot
tor (see 94 in Figure 6). This provides a beam
reference beam which arrives on a reciprocal slit of the output slit and then directly on the reference photodiode ce 18.
The optical arrangement formed by the lenses 19 and 21 forms
the image of the monochromator network on the sample input window and the image of the monochromator output slot on the sample output window. This configuration allows optimal use of the luminous flux.
The 24-order filters placed after the sample are
colored glass bandpass filters for removing light
due to the fluorescence of certain samples, the light
both higher diffraction orders and to reduce the light
parasite.
The luminous flux passing through the sample is finally fo
tagged on photodiode 25, which delivers a corresponding signal
the intensity of said luminous flux.
The photocurrent delivered by each photodiode is integrated
for each light pulse and the resulting signals are
treated after analog-digital conversion by a microproces
sister.
The solution described is particularly suitable for
rotary analyzers, it has a simple optical structure
with few components. Due to the very short duration
lightning (2.3 micro-seconds), edge effects (passage of
light through the walls of the bowl) are avoided when moving
ment of the sample.
The block diagram in Figure 5 illustrates the use of the
spectrophotometer 61 according to the invention (see FIG. 1) in a
rotary analyzer comprising a rotor 62 in which are placed
samples 22, shown in Figure 1. Arrow 74 indi
that the rotation of rotor 62 during spectrophoto measurements
metrics. A programmable power source 64 ali
the light bulb 11 of the spectrophotometer 61 lies. The con
overall control and the calculation of the results is carried out by a
microprocessor 66. Measurements to be made are ordered
by the latter when the selected sample is found to be correct
in the axis of the light beam. This position is detected
ted using an optical position sensor 65 detecting
marks on the rotor.
An integrator 67 integrates the correct signal
reflecting the beam of light received by photodiode 25 in
Figure 1, i.e. the beam transmitted through the sample
lon 22. An integrator 68 integrates the signal corresponding to the
beam of light received by photodiode 18 in FIG. 1,
that is to say to the reference beam. A gain amplifier 69
self-adjusting amplifies the integrator 67 output signal.
The amplifier 69 is connected to the microprocessor 66. A circuit
multiplexer 71 alternately conducts the outputs of the integra
68 (reference signal) and amplifier 69 (signal
measurement) to an analog / digital converter 72 which converts the analog signals applied to its input and supplies them in digital form to the microprocessor 66. By means of the amplifier 69, the channel of the measured signal has an automatic adaptation of the gain as a function of the attenuation of the signal so as to use the range of the converter 72 having the best resolution.
Furthermore, the level of the incident signal or of the transmitted signal is adjusted for optimum use of the converter, as a function of the wavelength, by varying the supply voltage of the supply circuit 64 of the flash lamp; this adjustment is also controlled by the microprocessor. Finally, the microprocessor performs all the desired calculations, for example the calculations used to determine the transmission, the absorbance, the average over several measurement points, the concentration, and supplies the signals corresponding to the results of the measurements to a measurement device. display and / or recording 73.
Dual beam spectrophotometers compensate for fluctuations in the intensity of the light source and also for undesirable deviations in the photometric characteristics of the sample, for example variations in absorbance over time of the reagent in certain clinical chemistry analyzes. For this, the measurements are made with respect to a reference sample which has the same drift as the sample to be measured. Among the double-beam spectrophotometers, few devices comprise two physically distinct beams providing simultaneously a reference signal and a measurement signal because these devices are relatively expensive due to the complexity of the optics and the double photodetection system.
More commonly, there are various devices where the measurements of the reference sample and of the sample to be measured are carried out successively, this using a mechanical switching device, either of the light beam from one sample to another, or of samples in front of the same beam. This type of solution most often includes a single detection system and does not compensate for fluctuations in the intensity of the source between two successive measurements.
The use of a flash lamp requires a system with two photodetectors, but, on the other hand, it allows the use of silicon photodiodes at low cost, with satisfactory photometric performance from the point of view signal to noise ratio.
The spectrophotometer according to the invention in the case of rotary analyzers performs compensation for undesirable photometric drifts by switching the reference and measurement samples, the switching being effected by the fact that when the rotor turns the spectrophotometer produces signals representative of the absorption both through samples to be measured and through at least one reference sample interposed among the samples to be measured arranged on the rotor.
The execution of the spectrophotometer according to the invention described above is particularly suitable for rotary analyzers; it can be modified as shown diagrammatically in FIG. 4 in order to obtain a dual beam spectrophotometer of more general use and having advantages compared to known devices.
The modification shown in Figure 4 shows a double beam spectrophotometer without moving mechanical elements. The division of the filtered beam into two measurement beams is carried out statically. A sample can be placed in each of the two bundles. In this case, it is sought to obtain beams of substantially identical intensity. For this, a Ronchi grating having a pitch of the order of 0.3 to 1 mm is deposited on the quartz plate 51. This network is characterized by a regular alternation of reflective and transparent bands. As before, the beam passing through this plate passes through an exit slit and then via a lens 53 forms a beam of light passing through the reference sample 54, the bandpass filter which is not shown in the figure 4) and falls on photodiode 25.
The beam reflected by the plate after deflection on a deflection mirror 52 arrives at an exit slit and then via a lens 55 continues its path towards the photodiode 18. On the path of this reflected beam, the samples to be measured can be interposed 56.
The apparatus according to the invention is a dual-beam spectrophotometer, of general use, without moving mechanical elements, and having the advantages resulting from the use of a flash lamp, which, by definition, is used to perform measurements of transmission or absorbance in a given spectral range of the most diverse samples, for example for the usual measurements with static cuvette of the solutions used for analyzes of clinical chemistry.
These optical measurements can relate to the measurement of the absorbance at a few predetermined wavelengths or even to the recording of the transmission characteristics of the sample over a continuous spectral range. In the latter case, the value of the ratio of the signals collected in the absence of a sample is previously stored in a memory of the microprocessor. This makes it possible to precisely subtract the basic level, and thus to increase the accuracy of the measurements, the displacement of the network for the selection of wavelengths is then controlled by a motor.
Among the advantages already mentioned in the introduction to this description, it is important to note that, as shown in FIG. 6, the spectrophotometer according to the invention has a very compact structure and a small footprint. In addition to the elements which have already been defined above with reference to FIG. 1, FIG. 6 shows a box 91 containing a signal preamplifier corresponding to the intensity of the light flux transmitted through the sample, a selector 92 for filters of order 24 (see FIG. 1), a plate 93 containing the input slot of the monochromator, a plate 94 containing the output slot of the latter, an adjustment screw 95 used to adjust the position of the housing 91, an axis 96 for the selection of wavelengths by a motor and a connection 97 to the supply network,
in the case where the power source 64 is supplied by the network.