**ATTENTION** debut du champ DESC peut contenir fin de CLMS **.
REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'un peptide de formule: Pyr-TrpPrArg-PrGln-Ile-Pro-PrOR dans laquelle R est un groupe alcoyle contenant de 1 à 10 atomes de carbone, caractérisé en ce qu'on forme le peptide de formule: Pyr-TrpPro-Arg-Pro-GIn-Ile-Pro-Pro par enchaînement peptidique et en ce qu'avant, pendant ou après la formation de ce peptide on forme un groupe alcoylester sur le Pro- terminal par estérification.
2. Procédé de préparation d'un peptide de formule: Pyr-TrpPrArg-Pro-G1n-Ile-Pro-PrNH- caractérisé en ce qu'on forme le peptide de formule: Pyr-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro par enchaînement peptidique et en ce qu'avant, pendant ou après la formation de ce peptide on forme un groupe amido sur le Pro- terminal par réaction avec l'ammoniac.
La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'esters et d'amides du nonapeptide: Pyr-Trp-Pro-Arg
Pro-Gln-Ile-Pro-Pro qu'on a trouvé inhiber l'effet hypertenseur de l'angiotensine I.
L'action de la rénine qui est une enzyme, sur un substrat de rénine, une pseudo globuline dans le plasma sanguin, produit un polypeptide qui est l'angiotensine I, appelée aussi hypertensine I. Cette dernière est convertie par une enzyme en angiotensine II, appelée aussi hypertensine II ou angiotonine. L'angiotensine II est un hpyertenseur actif qui est présent dans le plasma des personnes souffrant d'hypertension en des quantités suffisantes pour maintenir une pression sanguine élevée.
L'inhibition de l'enzyme responsable pour la conversion de l'angiotensine I en angiotensine II sert à supprimer une cause de l'hypertension essentielle.
Dans le brevet USA no. 3 832 337, on divulgue divers peptides et peptides acylés qui inhibent la conversion enzymatique de l'angiotensine I en angiotensine II, et parmi ces peptides se trouve: Pyr-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-ne-Pro-Pro.
Des études des relations entre la structure et l'activité concernant les peptides tels que divulgués dans le brevet
USA no. 3 832 337 indiquent qu'un groupe carboxyle terminal libre est nécessaire pour obtenir des inhibiteurs puissants in vitro et in vivo. Voir par exemple la publication de Cushman et al., Inhibition of Angiotensin-Converting Enzyme by Analogs of Peptides from Bothrops jararaca Venom , Experienta 29, 1032 (1973), Birkhäuser Verlag, Basel, Suisse. Cependant, on a maintenant trouvé que non seulement le nonapeptide cidessus est un inhibiteur de l'hypertension induite par l'angiotensine I mais que des esters et des amides de ce nonapeptide sont aussi utiles dans ce but. Cela est surprenant dans la mesure où de tels esters et amides présentent une activité inhibitrice d'enzyme très faible ou indécelable in vitro.
En général, l'activité in vitro des peptides dans ce domaine correspond habituellement à leur activité in vivo. Ainsi, il est vraiment inattendu que ces esters et amides soient des inhibiteurs puissants de l'hypertension induite par l'angiotensine I.
La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un peptide de formule: Pyr-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-lle-
Pro-Pro-Y dans laquelle Y est un groupe -NH2 ou -OR, R étant un groupe alcoyle contenant de 1 à 10 atomes de carbone, dans lequel on forme le peptide de formule: Pyr-Trp-Pro-Arg-Pro -Gln-Ile-Pro-Pro par enchaînement peptidique, et avant, pendant ou après la formation de ce peptide on ajoute un groupe alcoylester ou un groupe amido au Pro terminal, respectivement par estérification ou par réaction avec l'ammoniac.
Sauf indication contraire, dans la suite de la description et les revendications, tous les amino-acides ont la configuration
L.
Pour décrire les peptides objets du présent procédé, on utilise les abréviations suivantes dans toute la description et les revendications:
Arg = Arginine
Gln = Glutamine
Ile = Isoleucine
Pro = Proline
Pyr = acide Pyroglutamique
Trp = Tryptophane
Les peptides suivants obtenus par le présent procédé se sont montrés efficaces pour inhiber l'hypertension induite par l'angiotensine I:
Ia - Les esters de formule: Pyr-TrpPrc-Arg-Pro-Gln-ne-Pr-PrOR,
où R est un groupe alcoyle Il-L'amide de formule:
: Pyr-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro-NH2
Le groupe alcoyle des esters ci-dessus peut comprendre un fragment hydrocarbure à chaîne droite ou ramifiée contenant de 1 à 10 atomes de carbone et de préférence de 1 à 6 atomes de carbone tel que méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, nbutyle, s-butyl, t-butyl. pentyle, hexyle, heptyle, octyle, nonyle ou décyle ainsi que les divers isomères des six derniers groupes. Les méthyles et t-butylesters sont particulièrement préfé rés.
On prépare de préférence les présents esters en faisant réagir un di-, tri-, tétra-, penta-, hexa-, hepta- ou octa-peptide y compris un groupe à terminaison Pro- protégé par un alcoylester avec un ou plusieurs paptides suivant les besoins en utilisant des techniques connues de préparation d'un peptide pour former le nonapeptide alcoylester Ia de l'invention.
Ainsi, on peut former directement le présent ester sans qu'il soit nécessaire de former d'abord le peptide-mère:
III- Pyr-TrpPro-Arg-Pro-GIn-Ile-Pro-Pro
On prépare de préférence le présent amide en faisant réagir un di-, tri-, tétra-, penta-, hexa-, hepta- ou octa-peptide y compris un groupe à terminaison Pro- protégé par un groupe amido avec un ou plusieurs peptides suivant les besoins en utilisant des techniques connues de préparation d'un peptide pour former le nonapeptide qui est l'amide ll de l'invention.
Ainsi, le présent amide peut être formé directement sans qu'il soit nécessaire de former d'abord le peptide-mère III.
Cependant, on comprendra que les esters ainsi que l'amide du présent procédé peuvent être formés en formant d'abord le peptide-mère III selon les procédés esquissés dans le brevet
USA no. 3 832 337 puis ensuite en ajoutant le groupe alcoylester ou amido au Pro- terminal en utilisant des procédés connus.
Les présents composés inhibent la conversion de I'angiotensine I en angiontensine II in vivo et ainsi antagonise l'effet
hypertenseur de l'angiotensine I. Les présents composés sont capables d'inhiber l'effet hypertenseur de l'angiotensine I lorsqu'on les administre à des mammifères tels que des rats, des souris ou des chiens à des doses d'environ 0,5 à environ 10 mg/kg. Dans ce dernier but, on peut les administrer par voie parentérale en incorporant la dose appropriée avec un véhicule physiologiquement acceptable.
Les exemples suivants illustrent l'invention; toutes les températures sont en degrés centigrade.
Exemple I
Benzyloxycarbonyl-isoleucyl-prolyl-proline
On dissout 4,24 g de bromhydrate de prolyl-proline dans un
mélange de 40 ml de diméthylformamide et 2,8 ml de triéthylamine. On ajoute 9,27 g de benzyloxycarbonyl-isoleucine-p
nitrophénylester et 3 g de 1-hydroxybenzotriazole et on garde
le mélange à la température ordinaire pendant 16 h. On ajoute
1 ml de diméthylaminopropylamine et après 2 h on chasse le
solvant sous vide. On dissout le résidu dans 200 ml d'acétate
d'éthyle et on le lave successivement avec de l'acide chlorhy
drique 0,1 N et de l'eau. On sèche la phase organique sur du
sulfate de magnésium et on la concentre à sec sous vide pour
obtenir 13,8 g de substance solide. On applique cette matière à une colonne de silicagel de 300 g dans l'acétate d'éthyle et on élue avec le même solvant.
On réunit les fractions contenant le tripeptide désiré puis on les concentre à sec.
Exemple 2
Benzyloxycarbonyl-isoleucyl-prolyl-prolinate de méthyle
On dissout 4,6 g de l'acide tripeptidique de l'exemple 1 dans
le méthanol et on la traite avec une solution éthérique de
diazométhane jusqu'à ce qu'on obtienne une couleur jaune persistante. Après 0,5 h on ajoute quelques gouttes d'acide
acétique pour faire disparaître la couleur jaune; on chasse le
solvant sous vide et on le remplace par l'acétate d'éthyle. On
lave cette solution successivement avec de l'HCl 0,1 N, de
l'eau, du bicarbonate de sodium saturé puis de l'eau. On sèche
la phase organique sur du sulfate de magnésium et on la con
centre à sec pour obtenir le composé désiré.
Exemple 3
Benzyloxycarbonyl-glutaminyl-isoleucyl-prolyl-prolinate
de méthyle
On dissout 1,4 g du tripeptide de l'exemple 2 dans 30 ml
d'éthanol à 95o et 3 ml d'acide chlorhydrique N. On ajoute
0,3 g de charbon palladié et on agite la suspension sous une
pression positive d'hydrogène jusqu'à ce qu'on ne décèle plus
d'anhydride carbonique dans les gaz sortants. On sépare le
catalyseur par filtration et on concentre le filtrat à sec sous
vide. On dissout le résidu dans un mélange de 6 ml de dimé
thylformamide et 0,5 ml de triéthylamine. On ajoute 1,6 g de
benzyloxycarbonyl-glutamine-p-nitrophénylester et 0,5 g de 1
hydroxybenzotriazole et on laisse la réaction se poursuivre à la
température ordinaire jusqu'à ce que l'essai à la ninhydrine
soit négatif.
On ajoute 0,5 ml de diméthylaminopropylamine et
on laisse la réaction se poursuivre pendant encore 1 h. On
ajoute 200 ml d'acétate d'éthyle et on lave la solution obtenue
jusqu'à neutralité. On sèche la phase organique sur du sulfate
de magnésium, et on chasse le solvant sous vide pour obtenir le
composé désiré.
Exemple 4 Benz5,tloxycarbonyl-o-nitroarginyl-prolyl-glutarninyl-
isoleucyl-prolyl-prolinate de méthyle
On dissout 14 g du tétrapeptide de l'exemple 3 dans 325 ml
d'éthanol absolu et 23 ml d'acide chlorhydrique N. On ajoute
?,() g de charbon palladié et on agite le mélange sous une
pression positive d'hydrogène jusqu'à ce qu'il ne se dégage plus d'anhydride carbonique. On sépare le catalyseur par filtration et on concentre à sec le filtrait. On dissout le résidu dans 43 ml de diméthylformamide et 3,2 ml de triéthylamine.
On ajoute 15,7 g de benzyloxycarbonylnitro-arginylproline- 2,4,5-trichlorophénylester et 3,1 g de l-hydroxybenzotriazole immédiatement et on laisse la réaction se poursuivre jusqu'à ce que l'essai à la ninhydrine soit négatif. On ajoute 5,4 ml de diméthylaminopropylamine et après 2 h on chasse le solvant sous vide. On dissout le résidu dans de l'acétate d'éthyle et on lave la solution jusqu'à neutralité. On concentre sous vide l'acétate d'éthyle jusqu'à environ 70 ml puis on verse la solution dans 1 I d'éther agité vigoureusement. On filtre le précipité et on le sèche pour obtenir le composé désiré.
Exemple S
Benzyloxycarbonyl-tryptophyl-prolyl-arginyl-prolyl
glutaminyl-isoleucyl-prolyl-prolinate de méthyle
On dissout 1,8 g de l'hexapeptide de l'exemple 4 dans 27 ml d'éthanol absolu et 4 ml d'acide chlorhydrique N. On ajoute 0,38 g de charbon palladié et on agite le mélange sous une pression positive d'hydrogène jusqu'à ce que l'absorption ultraviolette du chromophore nitroguanidine ne puisse plus être décelé. On sépare par filtration le catalyseur et on concentre le filtrat à sec sous vide. On dissout le résidu dans 10 ml de diméthylformamide et 0,28 ml de triéthylamine.
On ajoute immédiatement 1,5 g de benzyloxycarbonyl-tryptophyl-proline-2,4,5-trichlorophénylester et 0,3 g de 1-hydroxy-benzotriazole et on laisse la réaction se poursuivre jusqu'à ce que l'essai à la ninhydrine soit négatif. On sépare par filtration le chlorhydrate de triéthylamine précipité et on verse le précipité dans 250 ml d'acétate d'éthyle agité vigoureusement. On filtre le précipité et on le sèche pour obtenir le composé désiré.
Exemple 6
Méthylester de pyroglutamyl-tryptophyl-prolyl-arginyl
prolyl-glutaminyl-isoleucyl-prolyl-proline
On dissout 10 g de l'octapeptide de l'exemple 5 dans 150 ml d'éthanol absolu et 9 ml d'acide chlorhydrique N. On ajoute 2 g de charbon palladié et on agite la suspension sous une pression positive d'hydrogène jusqu'à ce qu'il ne se dégage plus d'anhydride carbonique. On sépare le catalyseur par filtration et on concentre le filtrat à sec sous vide. On dissout le résidu dans 40 ml de diméthylformamide et on ajoute rapidement et successivement 1,2 g de 1-hydroxybenzotriazole, 1,2 ml de triéthylamine et le 2,4,5-trichlorophénylester d'acide pyroglutamique. On laisse la réaction se poursuivre jusqu'à ce que l'essai à la ninhydrine soit négatif.
On sépare le chlorhydrate de triéthylamine précipité par filtration et on verse le filtrat dans 1.11 d'acétate d'éthyle agité vigoureusement. On filtre le précipité et on le sèche pour obtenir le composé désiré.
On purifie cette matière par chromatographie sur du Sephadex G-25 dans du bicarbonate d'ammonium 0,01 M.
Analyse des amino-acides; rapport molaire:
trouvé (calculé):
NH3 = 0,92(1,0); Arg = 0,86 (1,0);
Pro = 4,0 (4,0); Trp = 0,78 (1,0);
Gln = 2,12(2,0); Ile = 0,96(1,0)
la chromatographie sur couche mince; silicagel (30
alcool butylique, 20 de pyridine, 6 d'acide acétique,
20 d'eau) Rf = 0,53.
Exemple 7
Benzyloxycarbonyl-isoleucyl-proline-prolinate de n-butyle
On ajoute lentement une solution de 4,5 g de benzyloxycarbonyl-isoleucyl-prolyl-proline dans 30 ml de chloroforme à une solution de 1,9 g de 1 -n-butyl-3-p-toWltriazène dans 15 ml de chloroforme. Lorsque la réaction est complète on lave la solution chloroformique jusqu'à neutralité et on sèche la phase organique sur du sulfate de magnésium et on la concentre à sec sous vide pour obtenir le composé désiré.
Exemple 8 Benzyloxycarbonyl-giutaminyl-isoleucyl-prolyl-prolinate
de n-butyle
On prépare ce composé en procédant comme dans l'exemple 3 en partant du tripeptide de l'exemple 7.
Exemple 9 Benzyloxycarbonyl- < ss-nitro-arginyl-prolyl-glutaminyl-
isoleucyl-prolyl-prolinate de n-butyle
On prépare le composé en procédant comme dans l'exemple 4 et en partant du tétrapeptide obtenu dans l'exemple 8.
Exemple 10 Benzyloxycarbonyl-tryptophyl-prolyl-argînyl-prolyl-
glutaminyl-isoleucyl-prolyl-prolinate de n-butyle
On prépare ce composé en procédant comme dans l'exemple 5 et en partant de l'hexapeptide de l'exemple 9.
Exemple il
n-Butylester de pyroglutamyl-tryptophyl-prolyl-arginyl prolyl-giutaminyl-isoleucyl-prolyl-proline
On prépare ce composé en procédant comme dans l'exemple 6 et en partant de l'octapeptide de l'exemple 10.
Exemple 12
Benzyloxycarbonyl-isoleucyl-prolyl-prolinamide
On dissout 4,5 g de benzyloxycarbonyl-isoleucyl-prolylproline dans un mélange de 30 ml de tétrahydrofuranne et
1,4 ml de triéthylamine. On réfrigère la solution dans un bain de refroidissement à -50C et on ajoute 1,6 ml de chloroformiate d'isobutyle. On laisse la solution se réchauffer jusqu'à la température ordinaire pendant 10 mn puis on ajoute 10 ml d'ammoniac aqueux concentré. Après avoir agité pendant 4h à la température ordinaire on concentre le mélange réactionnel sous vide, on le dilue avec de l'acétate d'éthyle et on le lave successivement avec du bicarbonate de sodium saturé, de l'eau, de l'acide chlorhydrique 0,1 N et de l'eau.
On sèche la phase organique sur du sulfate de magnésium et on la concentre à sec sous vide pour obtenir le composé désiré.
Exemple 13 Benzyloxycarbonyl-glutaminyl-isoleucyl-prolyl-prolinamide
On prépare ce composé en procédant comme dans l'exemple 3 et en partant du tripeptide de l'exemple 12.
Exemple 14 Benzyloxycarbonyl- w-nitro-arginyl-prolyl-glutaminyl-
isoleucyl-prolyl-prolinamide
On prépare ce composé en procédant comme dans l'exemple 4 en partant du tétrapeptide de l'exemple 13.
Exemple 15
Benzyloxycarbonyl-tryptophyl-prolyl-arginyl-prolyl glutaminyl-isoleucyl-prolyl-prolinamide
On prépare ce composé en procédant comme dans l'exemple 5 et en partant de l'hexapeptide de l'exemple 14.
Exemple 16
Pyroglutamyl-tryptophyl-prolyl-arginyl-prolyl
glutaminyl-isoleucyl-prolyl-prolinamide
On prépare ce composé en procédant comme dans l'exemple 6 et en partant de l'octapeptide de l'exemple 15.
Exemple 17
Tert-butylester de benzyloxycarbonyl-tryptophyl-prolyl
arginyl-prolyl-glutaminyl-isoleucyl-prolyl-proline
On dissout 9,42 g (environ 10 mmoles) de benzyloxycarbo nylnitro-arginyl-proline-giutaminyl-isoleucyl-proline-prolinate de t-butyle dans 135 ml d'éthanol absolu et 20 ml d'HCI N et on ajoute 1,9 g de carbone palladié à 10% en agitant sous une pression positive d'hydrogène pendant 22 h. On filtre à travers du Hyflo et on reprend à sec sous vide.
On dissout le résidu brut dans 50 ml de diméthylformamide et 1,4 ml de triéthylamine suivi immédiatement de 7,4 g (12 mmoles) de benzyl oxycarbonyl-triptophyl-prolyl-2,4,5-trichlorophénylester. Au cours d'une période de 30 h on ajoute encore 1,5 mmole de benzyloxy-carbonyl-tryptophyl-prolyl-2,4,5-trichlorophénylester et 1,5 mmole de triéthylamine. Après 50 h on filtre le chlorhydrate de triéthylamine et on ajoute le filtrat à 1,2 l d'acétate d'éthyle agité vigoureusement. On filtre le précipité et on le lave à l'acétate d'éthyle pour obtenir 10,64 g du composé désiré.
Exemple 18
t-butylester de pyroglutamyl-tryptophyl-prolyl-arginyl prolyl-giutaminyl-isoleucyl-prolyl-proline
On dissout 10 g (environ 8,5 mmoles) du peptide de l'exemple 17 dans 150 ml d'éthanol absolu et 8,5 ml d'HCl N et on ajoute 2 g de carbone palladié à 10% et on agite sous une pression positive d'hydrogène pendant 8 h. On filtre ceci à travers du Hyflo et on concentre à sec sous vide le filtrat pour obtenir 9,2 g de résidu brut.
On dissout le résidu brut dans 40 ml de diméthylformamide et 1,14 g (8,5 mmoles) de 1-hydroxybenzotriazole et 1,2 ml (8,5 mmoles) de triéthylamine suivi immédiatement de 3,14 g de 2,4,5-trichlorophénylester d'acide pyroglutamique (excès de 20%). On ajoute encore 0,6 ml de triéthylamine. On laisse la réaction se poursuivre pendant une nuit. On filtre le chlorhydrate de triéthylamine et on verse le filtrat dans 1,1 I d'acétate d'éthyle agité vigoureusement. On filtre le précipité isolé à travers du papier #42 et on le lave à l'acétate d'éthyle pour obtenir 9,0 g du composé désiré.
Analyse des amino-acides; rapport molaire: trouvé (calculé):
NH3 = 0,85 (1,0); Trp = 0,66(1,0);
Arg = 1,0 (1,0); Glu = 2,03 (2,0);
Pro = 4,0 (4,0); Ile = 0,9 (1,0) la chromatographie sur couche mince sur du silicagel
(30 alcool butylique, 20 de pyridine, 6 d'acide acétique,
24 d'eau) donne Rf = 0,58.
On réalise la purification sur une colonne DEAE de
Sephadex A-25 par élution avec du NH4HCO3 0,005 M.
Exemple 19
Méthylester de pyroglutamyl-tryptophyl-prolyl-arginyl
prolyl-glutaminyl-isoleucyl-prolyl-proline
On dissout 1,6 g de pyroglutamyl-tryptophyl-prolyl-arginyl prolyl-glutaminyl-isoleucyl-prolyl-proline dans 80 ml de méthanol. On ajoute à ceci un excès de diazométhane éthérique et on garde la solution pendant 7h à la température ordinaire. On ajoute de l'acide acétique pour détruire l'excès de diazométhane et on concentre à sec sous vide le mélange obtenu.
On conduit la purification sur une colonne de Sephadex G25 en éluant avec du (NH4)HCO3 0,01 M suivi d'une colonne DEAE de Sephadex A-25 en éluant avec du NH4HCO3 0,005 M pour obtenir 1,1 g du composé désiré.
Exemple 20
Pyroglutamyl-tryptophyl-prolyl-arginyl-prolyl-glutaminyl
isoleucyl-prolyl-prolinamide
On dissout 1 g de pyroglutamyl-tryptophyl-prolyl-arginyl prolyl-glutaminyl-isoleucyl-prolyl-proli dans 6 ml de sulfoxyde de diméthyle en chauffant doucement. On refroidit la solution jusqu'à la température ordinaire puis on ajoute 0,14 ml de triéthylamine et 0,16 ml de chloroformiate d'isobutyle. On agite le mélange réactionnel pendant 15 mn. On
ajoute 1 ml d'hydroxyde d'ammonium concentré et la réaction
se poursuit pendant 4h avant qu'on l'ajoute lentement à
200 ml d'acétate d'éthyle agité vigoureusement.
Il se forme un
précipité qu'on filtre et qu'on lave à l'acétate d'éthyle pour
obtenir 1,375 g de substance solide. On purifie cette matière
sur une colonne de 225 ml de DEAE Sephadex A-25 par
élution avec du NH4HCO3 0,005 M pour obtenir 924 mg du
composé désiré.
Analyse des amino-acides; rapport molaire:
trouvé (calculé):
NH3 = 1,71 (2,0); Arg = 0,88 (1,0);
Pro = 4,13 (4,0); Trp = 0,80 (1,0);
Gln = 2,12(2,0; Ile = 0,93 (1,0)
la chromatographie sur couche mince: silicagel
(30 alcool butylique, 20 de pyridine, 6 d'acide acétique,
20 d'eau) donne Rf = 0,53.
Exemple 21
Afin de déterminer les valeurs Iso (concentration de peptide exprimée en microgrammes/mi produisant une inhibition à 50% de l'enzyme qui convertit l'angiotensine), on ajoute diverses concentrations du peptide de l'exemple 19 à des tubes d'essai de 13x100 mm contenant un volume final de 0,25 ml qui contient 100 mM de tampon au phosphate de potassium de pH = 7,5, 30 mM de NaCi et 0,3 mM d'angiotensine I. On amorce les réactions enzymatiques en ajoutant l'enzyme et on
conduit l'incubation à 370C.
La concentration du peptide de
l'exemple 19 de la présente invention qui inhibe la conversion
de 50% de l'angiotensine I en angiotensine II et de 7 llg/ml
comparée à une valeur Iso ( > g/ml) de 0,9 pour le peptide
mère: Pyr-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro. Cet essai in
vitro montre clairement que le peptide de l'exemple 19 est
pratiquement moins puissant que le peptide-mère témoin in
vitro pour inhiber la conversion de l'angiotensine I en angio
tensine II.
Exemple 22
On administre le peptide de l'exemple 19 et le peptide-mère témoin Pyr-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro par voie intraveineuse à deux rats mâles anesthésiés et traités à l'atropine auxquels on a infusé du pentolinium suivi d'une injection de 0,10 Fg/kg d'angiotensine I. En se basant sur le degré d'inhibition de la réponse d'hypotenseur induite par l'angiotensine I ou trouve que l'activité in vivo du peptide de l'exemple 19 est pratiquement équivalente à celle du peptide-mère témoin.
** ATTENTION ** start of DESC field can contain end of CLMS **.
CLAIMS
1. Process for preparing a peptide of formula: Pyr-TrpPrArg-PrGln-Ile-Pro-PrOR in which R is an alkyl group containing from 1 to 10 carbon atoms, characterized in that the peptide of formula is formed : Pyr-TrpPro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro by peptide linkage and in that before, during or after the formation of this peptide an alkyl ester group is formed on the Pro-terminal by esterification.
2. Process for preparing a peptide of formula: Pyr-TrpPrArg-Pro-G1n-Ile-Pro-PrNH- characterized in that the peptide of formula: Pyr-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln- is formed. Ile-Pro-Pro by peptide linkage and in that before, during or after the formation of this peptide an amido group is formed on the Pro-terminal by reaction with ammonia.
The present invention relates to a process for the preparation of esters and amides of the nonapeptide: Pyr-Trp-Pro-Arg
Pro-Gln-Ile-Pro-Pro has been found to inhibit the hypertensive effect of angiotensin I.
The action of renin, which is an enzyme, on a substrate of renin, a pseudo-globulin in the blood plasma, produces a polypeptide which is angiotensin I, also called hypertensin I. The latter is converted by an enzyme into angiotensin II , also called hypertensin II or angiotonin. Angiotensin II is an active blood pressure lowering agent which is present in the plasma of people with hypertension in amounts sufficient to maintain high blood pressure.
Inhibition of the enzyme responsible for the conversion of angiotensin I to angiotensin II serves to suppress a cause of essential hypertension.
In US patent no. 3,832,337, various peptides and acylated peptides are disclosed which inhibit the enzymatic conversion of angiotensin I to angiotensin II, and among these peptides are: Pyr-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-ne-Pro-Pro.
Studies of the relationships between structure and activity relating to peptides as disclosed in the patent
USA no. 3,832,337 indicate that a free terminal carboxyl group is necessary to obtain potent inhibitors in vitro and in vivo. See for example the publication of Cushman et al., Inhibition of Angiotensin-Converting Enzyme by Analogs of Peptides from Bothrops jararaca Venom, Experienta 29, 1032 (1973), Birkhäuser Verlag, Basel, Switzerland. However, it has now been found that not only is the above nonapeptide an inhibitor of angiotensin I induced hypertension but that esters and amides of this nonapeptide are also useful for this purpose. This is surprising since such esters and amides exhibit very weak or undetectable enzyme inhibitory activity in vitro.
In general, the in vitro activity of peptides in this area usually corresponds to their in vivo activity. Thus, it is truly unexpected that these esters and amides are potent inhibitors of angiotensin I-induced hypertension.
The present invention relates to a process for preparing a peptide of formula: Pyr-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-lle-
Pro-Pro-Y in which Y is an -NH2 or -OR group, R being an alkyl group containing from 1 to 10 carbon atoms, in which the peptide of formula is formed: Pyr-Trp-Pro-Arg-Pro - Gln-Ile-Pro-Pro by peptide linkage, and before, during or after the formation of this peptide, an alkyl ester group or an amido group is added to the terminal Pro, respectively by esterification or by reaction with ammonia.
Unless otherwise indicated, in the remainder of the description and the claims, all amino acids have the configuration
L.
To describe the peptides which are the subject of the present process, the following abbreviations are used throughout the description and the claims:
Arg = Arginine
Gln = Glutamine
Ile = Isoleucine
Pro = Proline
Pyr = Pyroglutamic acid
Trp = Tryptophan
The following peptides obtained by the present process have been shown to be effective in inhibiting hypertension induced by angiotensin I:
Ia - Esters of formula: Pyr-TrpPrc-Arg-Pro-Gln-ne-Pr-PrOR,
where R is an II-Amide alkyl group of the formula:
: Pyr-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro-NH2
The alkyl group of the above esters may comprise a straight or branched chain hydrocarbon moiety containing 1 to 10 carbon atoms and preferably 1 to 6 carbon atoms such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, nbutyl, s- butyl, t-butyl. pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl or decyl as well as the various isomers of the last six groups. Particularly preferred are methyl and t-butyl esters res.
The present esters are preferably prepared by reacting a di-, tri-, tetra-, penta-, hexa-, hepta- or octa-peptide including a Pro- terminated group protected by an alkyl ester with one or more of the following paptides. requirements using known techniques for preparing a peptide to form the alkyl ester Ia nonapeptide of the invention.
Thus, the present ester can be formed directly without the need to first form the parent peptide:
III- Pyr-TrpPro-Arg-Pro-GIn-Ile-Pro-Pro
The present amide is preferably prepared by reacting a di-, tri-, tetra-, penta-, hexa-, hepta- or octa-peptide including a Pro- terminated group protected by an amido group with one or more peptides. as needed using known techniques for preparing a peptide to form the nonapeptide which is amide II of the invention.
Thus, the present amide can be formed directly without the need to first form the parent peptide III.
However, it will be understood that the esters as well as the amide of the present process can be formed by first forming the parent peptide III according to the processes outlined in the patent.
USA no. 3,832,337 and then adding the alkyl ester or amido group to the Proterminal using known methods.
The present compounds inhibit the conversion of angiotensin I to angiontensin II in vivo and thus antagonizes the effect.
angiotensin I hypertensive agent. The present compounds are capable of inhibiting the hypertensive effect of angiotensin I when administered to mammals such as rats, mice or dogs at doses of about 0, 5 to about 10 mg / kg. For the latter purpose, they can be administered parenterally by incorporating the appropriate dose with a physiologically acceptable vehicle.
The following examples illustrate the invention; all temperatures are in degrees centigrade.
Example I
Benzyloxycarbonyl-isoleucyl-prolyl-proline
4.24 g of prolyl-proline hydrobromide are dissolved in a
mixture of 40 ml of dimethylformamide and 2.8 ml of triethylamine. 9.27 g of benzyloxycarbonyl-isoleucine-p are added
nitrophenyl ester and 3 g of 1-hydroxybenzotriazole and keep
mixing at room temperature for 16 h. We add
1 ml of dimethylaminopropylamine and after 2 hours the
solvent under vacuum. The residue is dissolved in 200 ml of acetate
ethyl and washed successively with hydrochloric acid
dric 0.1 N and water. The organic phase is dried over
magnesium sulfate and concentrated to dryness under vacuum to
obtain 13.8 g of solid substance. This material is applied to a 300 g silica gel in ethyl acetate column and eluted with the same solvent.
The fractions containing the desired tripeptide are combined and then concentrated to dryness.
Example 2
Methyl benzyloxycarbonyl-isoleucyl-prolyl-prolinate
4.6 g of the tripeptide acid of Example 1 are dissolved in
methanol and treated with an ethereal solution of
diazomethane until a persistent yellow color is obtained. After 0.5 h, a few drops of acid are added
acetic to make the yellow color disappear; we chase it
solvent under vacuum and replaced by ethyl acetate. We
wash this solution successively with 0.1 N HCl,
water, saturated sodium bicarbonate and then water. We dry
the organic phase over magnesium sulfate and con
center dry to obtain the desired compound.
Example 3
Benzyloxycarbonyl-glutaminyl-isoleucyl-prolyl-prolinate
methyl
1.4 g of the tripeptide of Example 2 are dissolved in 30 ml
95o ethanol and 3 ml of N hydrochloric acid.
0.3 g of palladium on charcoal and the suspension is stirred under
positive pressure of hydrogen until no longer detected
carbon dioxide in the outgoing gases. We separate the
catalyst by filtration and the filtrate is concentrated to dryness under
empty. The residue is dissolved in a mixture of 6 ml of dimé
thylformamide and 0.5 ml of triethylamine. 1.6 g of
benzyloxycarbonyl-glutamine-p-nitrophenyl ester and 0.5 g of 1
hydroxybenzotriazole and the reaction is allowed to proceed after
room temperature until the ninhydrin test
is negative.
0.5 ml of dimethylaminopropylamine is added and
the reaction is allowed to continue for a further 1 hour. We
add 200 ml of ethyl acetate and wash the resulting solution
until neutrality. The organic phase is dried over sulfate
magnesium, and the solvent is removed in vacuo to obtain the
desired compound.
Example 4 Benz5, tloxycarbonyl-o-nitroarginyl-prolyl-glutarninyl-
methyl isoleucyl-prolyl-prolinate
14 g of the tetrapeptide of Example 3 are dissolved in 325 ml
of absolute ethanol and 23 ml of N hydrochloric acid.
?, () g of palladium on charcoal and the mixture is stirred under a
positive pressure of hydrogen until no more carbon dioxide is released. The catalyst is filtered off and the filtered mixture is concentrated to dryness. The residue is dissolved in 43 ml of dimethylformamide and 3.2 ml of triethylamine.
15.7 g of benzyloxycarbonylnitro-arginylproline-2,4,5-trichlorophenyl ester and 3.1 g of 1-hydroxybenzotriazole are added immediately and the reaction is allowed to continue until the ninhydrin test is negative. 5.4 ml of dimethylaminopropylamine are added and after 2 h the solvent is removed in vacuo. The residue is dissolved in ethyl acetate and the solution washed until neutral. The ethyl acetate is concentrated in vacuo to about 70 ml and then the solution is poured into 1 L of vigorously stirred ether. The precipitate is filtered and dried to obtain the desired compound.
Example S
Benzyloxycarbonyl-tryptophyl-prolyl-arginyl-prolyl
methyl glutaminyl-isoleucyl-prolyl-prolinate
1.8 g of the hexapeptide of Example 4 is dissolved in 27 ml of absolute ethanol and 4 ml of N hydrochloric acid. 0.38 g of palladium on charcoal is added and the mixture is stirred under positive pressure d hydrogen until the ultraviolet absorption of the nitroguanidine chromophore can no longer be detected. The catalyst is filtered off and the filtrate is concentrated to dryness in vacuo. The residue is dissolved in 10 ml of dimethylformamide and 0.28 ml of triethylamine.
1.5 g of benzyloxycarbonyl-tryptophyl-proline-2,4,5-trichlorophenyl ester and 0.3 g of 1-hydroxy-benzotriazole are immediately added and the reaction is allowed to continue until the ninhydrin test. is negative. The precipitated triethylamine hydrochloride is separated by filtration and the precipitate is poured into 250 ml of vigorously stirred ethyl acetate. The precipitate is filtered and dried to obtain the desired compound.
Example 6
Pyroglutamyl-tryptophyl-prolyl-arginyl methyl ester
prolyl-glutaminyl-isoleucyl-prolyl-proline
10 g of the octapeptide from Example 5 are dissolved in 150 ml of absolute ethanol and 9 ml of N hydrochloric acid. 2 g of palladium-on-charcoal are added and the suspension is stirred under positive pressure of hydrogen until so that no more carbon dioxide is released. The catalyst is filtered off and the filtrate is concentrated to dryness in vacuo. The residue is dissolved in 40 ml of dimethylformamide and 1.2 g of 1-hydroxybenzotriazole, 1.2 ml of triethylamine and the 2,4,5-trichlorophenyl ester of pyroglutamic acid are added rapidly and successively. The reaction is allowed to continue until the ninhydrin test is negative.
The precipitated triethylamine hydrochloride is separated by filtration and the filtrate is poured into vigorously stirred 1.11 ethyl acetate. The precipitate is filtered and dried to obtain the desired compound.
This material is purified by chromatography on Sephadex G-25 in 0.01 M ammonium bicarbonate.
Amino acid analysis; molar ratio:
found (calculated):
NH3 = 0.92 (1.0); Arg = 0.86 (1.0);
Pro = 4.0 (4.0); Trp = 0.78 (1.0);
Gln = 2.12 (2.0); Ile = 0.96 (1.0)
thin layer chromatography; silica gel (30
butyl alcohol, 20 pyridine, 6 acetic acid,
20 of water) Rf = 0.53.
Example 7
N-butyl benzyloxycarbonyl-isoleucyl-proline-prolinate
A solution of 4.5 g of benzyloxycarbonyl-isoleucyl-prolyl-proline in 30 ml of chloroform is slowly added to a solution of 1.9 g of 1 -n-butyl-3-p-toWltriazene in 15 ml of chloroform. When the reaction is complete, the chloroform solution is washed until neutral and the organic phase is dried over magnesium sulfate and concentrated to dryness in vacuo to obtain the desired compound.
Example 8 Benzyloxycarbonyl-giutaminyl-isoleucyl-prolyl-prolinate
n-butyl
This compound is prepared by proceeding as in Example 3, starting with the tripeptide of Example 7.
Example 9 Benzyloxycarbonyl- <ss-nitro-arginyl-prolyl-glutaminyl-
n-butyl isoleucyl-prolyl-prolinate
The compound is prepared by proceeding as in Example 4 and starting with the tetrapeptide obtained in Example 8.
Example 10 Benzyloxycarbonyl-tryptophyl-prolyl-arginyl-prolyl-
n-butyl glutaminyl-isoleucyl-prolyl-prolinate
This compound is prepared by proceeding as in Example 5 and starting with the hexapeptide of Example 9.
Example he
pyroglutamyl-tryptophyl-prolyl-arginyl prolyl-giutaminyl-isoleucyl-prolyl-proline n-Butyl ester
This compound is prepared by proceeding as in Example 6 and starting with the octapeptide of Example 10.
Example 12
Benzyloxycarbonyl-isoleucyl-prolyl-prolinamide
4.5 g of benzyloxycarbonyl-isoleucyl-prolylproline are dissolved in a mixture of 30 ml of tetrahydrofuran and
1.4 ml of triethylamine. The solution is refrigerated in a cooling bath at -50C and 1.6 ml of isobutyl chloroformate are added. The solution is allowed to warm to room temperature for 10 min and then 10 ml of concentrated aqueous ammonia is added. After stirring for 4 hours at room temperature, the reaction mixture is concentrated in vacuo, diluted with ethyl acetate and washed successively with saturated sodium bicarbonate, water, hydrochloric acid. 0.1 N and water.
The organic phase is dried over magnesium sulfate and concentrated to dryness in vacuo to obtain the desired compound.
Example 13 Benzyloxycarbonyl-glutaminyl-isoleucyl-prolyl-prolinamide
This compound is prepared by proceeding as in Example 3 and starting with the tripeptide of Example 12.
Example 14 Benzyloxycarbonyl- w-nitro-arginyl-prolyl-glutaminyl-
isoleucyl-prolyl-prolinamide
This compound is prepared by proceeding as in Example 4, starting with the tetrapeptide of Example 13.
Example 15
Benzyloxycarbonyl-tryptophyl-prolyl-arginyl-prolyl glutaminyl-isoleucyl-prolyl-prolinamide
This compound is prepared by proceeding as in Example 5 and starting with the hexapeptide of Example 14.
Example 16
Pyroglutamyl-tryptophyl-prolyl-arginyl-prolyl
glutaminyl-isoleucyl-prolyl-prolinamide
This compound is prepared by proceeding as in Example 6 and starting with the octapeptide of Example 15.
Example 17
Benzyloxycarbonyl-tryptophyl-prolyl tert-butyl ester
arginyl-prolyl-glutaminyl-isoleucyl-prolyl-proline
9.42 g (approximately 10 mmol) of benzyloxycarbo nylnitro-arginyl-proline-giutaminyl-isoleucyl-proline-prolinate of t-butyl is dissolved in 135 ml of absolute ethanol and 20 ml of HCl N and one adds 1.9 g of 10% palladium on carbon by stirring under positive pressure of hydrogen for 22 h. It is filtered through Hyflo and taken up to dryness under vacuum.
The crude residue is dissolved in 50 ml of dimethylformamide and 1.4 ml of triethylamine followed immediately by 7.4 g (12 mmol) of benzyl oxycarbonyl-triptophyl-prolyl-2,4,5-trichlorophenyl ester. Over a period of 30 hours a further 1.5 mmol of benzyloxy-carbonyl-tryptophyl-prolyl-2,4,5-trichlorophenyl ester and 1.5 mmol of triethylamine are added. After 50 h, the triethylamine hydrochloride is filtered off and the filtrate is added to 1.2 l of vigorously stirred ethyl acetate. The precipitate was filtered and washed with ethyl acetate to obtain 10.64 g of the desired compound.
Example 18
pyroglutamyl-tryptophyl-prolyl-arginyl-prolyl-giutaminyl-isoleucyl-prolyl-proline t-butyl ester
10 g (approximately 8.5 mmol) of the peptide of Example 17 are dissolved in 150 ml of absolute ethanol and 8.5 ml of N HCl and 2 g of 10% palladium on carbon are added and the mixture is stirred under a positive pressure of hydrogen for 8 h. This was filtered through Hyflo and the filtrate was concentrated to dryness in vacuo to afford 9.2 g of crude residue.
The crude residue is dissolved in 40 ml of dimethylformamide and 1.14 g (8.5 mmol) of 1-hydroxybenzotriazole and 1.2 ml (8.5 mmol) of triethylamine followed immediately by 3.14 g of 2.4, Pyroglutamic acid 5-trichlorophenyl ester (20% excess). A further 0.6 ml of triethylamine is added. The reaction is allowed to continue overnight. The triethylamine hydrochloride is filtered off and the filtrate is poured into 1.1 L of vigorously stirred ethyl acetate. The isolated precipitate was filtered through # 42 paper and washed with ethyl acetate to afford 9.0 g of the desired compound.
Amino acid analysis; molar ratio: found (calculated):
NH3 = 0.85 (1.0); Trp = 0.66 (1.0);
Arg = 1.0 (1.0); Glu = 2.03 (2.0);
Pro = 4.0 (4.0); Ile = 0.9 (1.0) thin layer chromatography on silica gel
(30 butyl alcohol, 20 pyridine, 6 acetic acid,
24 water) gives Rf = 0.58.
The purification is carried out on a DEAE column of
Sephadex A-25 by elution with 0.005 M NH4HCO3.
Example 19
Pyroglutamyl-tryptophyl-prolyl-arginyl methyl ester
prolyl-glutaminyl-isoleucyl-prolyl-proline
1.6 g of pyroglutamyl-tryptophyl-prolyl-arginyl prolyl-glutaminyl-isoleucyl-prolyl-proline are dissolved in 80 ml of methanol. To this is added an excess of ethereal diazomethane and the solution is kept for 7 hours at room temperature. Acetic acid is added to destroy excess diazomethane and the resulting mixture is concentrated to dryness under vacuum.
The purification is carried out on a Sephadex G25 column eluting with 0.01 M (NH4) HCO3 followed by a DEAE column of Sephadex A-25 eluting with 0.005 M NH4HCO3 to obtain 1.1 g of the desired compound.
Example 20
Pyroglutamyl-tryptophyl-prolyl-arginyl-prolyl-glutaminyl
isoleucyl-prolyl-prolinamide
1 g of pyroglutamyl-tryptophyl-prolyl-arginyl prolyl-glutaminyl-isoleucyl-prolyl-proli is dissolved in 6 ml of dimethyl sulfoxide with gentle heating. The solution is cooled to room temperature and then 0.14 ml of triethylamine and 0.16 ml of isobutyl chloroformate are added. The reaction mixture is stirred for 15 min. We
add 1 ml of concentrated ammonium hydroxide and the reaction
continues for 4 hours before slowly adding it to
200 ml of ethyl acetate stirred vigorously.
It forms a
precipitate which is filtered and washed with ethyl acetate to
obtain 1.375 g of solid substance. We purify this matter
on a 225 ml column of DEAE Sephadex A-25 by
elution with 0.005 M NH4HCO3 to obtain 924 mg of
desired compound.
Amino acid analysis; molar ratio:
found (calculated):
NH3 = 1.71 (2.0); Arg = 0.88 (1.0);
Pro = 4.13 (4.0); Trp = 0.80 (1.0);
Gln = 2.12 (2.0; Ile = 0.93 (1.0)
thin layer chromatography: silica gel
(30 butyl alcohol, 20 pyridine, 6 acetic acid,
20 of water) gives Rf = 0.53.
Example 21
In order to determine the ISO values (concentration of peptide expressed in micrograms / ml producing 50% inhibition of the enzyme which converts angiotensin), various concentrations of the peptide of Example 19 are added to test tubes of 13x100 mm containing a final volume of 0.25 ml which contains 100 mM of potassium phosphate buffer of pH = 7.5, 30 mM of NaCl and 0.3 mM of angiotensin I. The enzymatic reactions are initiated by adding 1 'enzyme and we
conducted incubation at 370C.
The concentration of the peptide
Example 19 of the present invention which inhibits the conversion
50% of angiotensin I to angiotensin II and 7 μg / ml
compared to an ISO value (> g / ml) of 0.9 for the peptide
dam: Pyr-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro. This essay in
vitro clearly shows that the peptide of Example 19 is
practically less potent than the control parent peptide in
vitro to inhibit the conversion of angiotensin I to angio
tensin II.
Example 22
The peptide of Example 19 and the Pyr-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro control parent peptide were administered intravenously to two anesthetized and atropine-treated male rats. pentolinium followed by injection of 0.10 Fg / kg angiotensin I. Based on the degree of inhibition of the hypotensive response induced by angiotensin I or found that the in vivo activity of the peptide of Example 19 is substantially equivalent to that of the control parent peptide.