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PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I
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sowie deren nicht toxische Salze, worin n eine ganze Zahl von 5 bis 12 darstellt, dadurch gekennzeichnet, dass man ein 8 Halogen-cycl.- adenosin-monophosphat der allgemeinen Formel
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worin X ein Halogenatom darstellt, oder ein anorganisches oder organisches Salz davon mit einem Alkalimetallsalz eines linearen Alkylmercaptans der allgemeinen Formel
CH3(CH2)nSH worin n eine ganze Zahl von 5 bis 12 bedeutet, umsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in Gegenwart eines Alkohols als Lösungsmittel durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Alkalimetallsalz des linearen Alkylmercaptans in einem Verhältnis von 1 bis 10 Molen pro Mol des 8-Halogencycl.- adenosin-monophosphats verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion beim Siedepunkt des verwendeten Lösungsmittels durchgeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsdauer 1 bis 5 Std. beträgt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung cyclischer 8-linearer Alkylmercapto Adenosinmonophosphate der folgenden Formel I, die vorzügliche biologische und pharmakologische Aktivitäten zeigen
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worin n eine ganze Zahl von 5 bis 12 darstellt.
Im Jahr 1957 wurde von Sutherland und Mitarb. gefunden, dass wenn Epinephrin und Glucagon auf Leberzellen höherer Tiere einwirken, ein niedermolekulares Nukleotid gebildet wird, das Kinasen aktivieren kann. Später wurde diese Substanz als Adenosin-3',5'-cyclisches-monophosphat identifiziert (im folgenden c-AMP genannt). Das c-AMP ist heute als sekundärer intrazellulärer Messenger der Aktivitäten von Hormonen in höheren Tieren bekannt. Dies bedeutet, dass wenn ein bestimmtes Hormon an einem Hormonrezeptor einer Zielzelle gebunden ist, eine Adenylat-Cyclase aktiviert wird, um den Spiegel von c-AMP zu erhöhen. Mit der Erhöhung des c-AMP Spiegels, werden die c-AMP abhängigen Protein-Kinasen aktiviert und eine grosse Zahl biologischer Reaktionen kommen in Gang.
In einigen Fällen wird die Demaskierung von Nukleohistonen stimuliert und damit die Bildung von verschiedenen Enzymen (Proteine) angeregt. In anderen Fällen wird gespeicherte Glucose oder Glycogen-Phosphorylase aktiviert und damit die Glycogenolyse beschleunigt. Eine Anzahl weiterer biologischer Reaktionen werden durch den c-AMP-Spiegel bestimmt. Als eine dieser biologischen Reaktionen kann Asthma genannt werden. Die Hauptursache von Asthma liegt in einer Reduktion der Reaktivität des ss-adrenergischen Rezeptors (eines der Hormonrezeptoren) des glatten Atmungsmuskels. Das Steroid zeigt die Aktivität der Erhöhung der Reaktivität des Badrenergischen Rezeptors und Theophyllin hat die Aktivität des Antagonisierens und Blockierens von c-AMPzersetzenden Enzymen (Phosphodiesterase für c-AMP: im folgenden als PDE bezeichnet).
Beide dieser Chemikalien bewirken eine Erhöhung des c-AMP-Spiegels (A. Szentivanyi, J. Allergy, 42, 203-232 (1968)). Weiter wird vermutet, dass Scabies, eine Hautkrankheit, ebenfalls durch Reduktion des c AMP-Spiegels verursacht wird. Dieser Krankheit liegt eine Überproduktion anomalen Epithelzellen zugrunde, die reich an Glykogen sind und die Krankheit ist dadurch charakterisiert, dass die Funktion des Hormonrezeptoren geändert hat und demzufolge ss-adrenergische Promotoren, Adenylat-Cyclase Aktivatoren und NaF unwirksam sind (J.J. Voorhees und Mitarb. Arch. Dermatol., 105, 695 (1972)). Bis heute sind eine ganze Reihe von Krankheiten bekannt, denen eine Störung des c-AMP-Haushalts zugrunde liegt.
Das c-AMP wird durch Phosphodiesterase zum 5'-Adenosin-monophosphat umgesetzt. Mit anderen Worten wird der intrazelluläre Spiegel von c-AMP durch die Differenz der Aktivitäten des synthetisierenden Enzyms, Adenylat-Cyclase und des abbauenden Enzyms PDE kontrolliert. Die biologische Aktivität von intrazellulären c-AMP manifestiert sich in den Protein-Kinasen. Unter Berücksichtigung dieser genannten Tatsachen, wurden von uns die 8-substituierten c-AMP-Derivate mit dem Ziel untersucht, pharmakologisch wirksame Verbin
dungen zu erhalten, die zur Behandlung und Kontrolle von Krankheiten, die durch abnormale Spiegel von c-AMP verursacht werden, geeignet sind. In Kürze wurden 8-substituierte Derivate die einige oder alle der folgenden Bedingungen erfüllten, synthetisiert:
1. Stabilität gegenüber der Wirkung von PDE.
2. Spezifische Hemmung von PDE (Wirkung als kompetitiver Inhibitor von PDE).
3. Ausgezeichnete Permeabilität für Membranen.
4. Aktivierung von Protein-Kinasen.
Im Verlaufe unserer Arbeit an chemischen Synthesen und biologischen Tests, wurde eine neue biologische Tatsache gefunden, und darauf basierend gelang es neue c-AMP-Derivate zu synthetisieren, die so ausgezeichnete Eigenschaften aufwiesen, wie sie bei keiner der bisher bekannten Verbindungen auftreten.
Einige der 8-substituierten c-AMP-Derivate sind bekannt.
Diese bekannten Derivate werden wie folgt klassiert. In dieser Klassifizierung wurden Alkylderivate, in denen eine lineare Alkylgruppe an das Kohlenstoffatom in der 8-Position über eine Amino- oder Thiogruppe gebunden ist, als Alkylamino- bzw.
Alkylthio-Derivate bezeichnet.
1. 8-Halogen-substituierte Derivate (inklusive Cl- und Br Derivate) 2. 8-Alkylamino-Derivate (inklusive NH2-, CH3NH- und CH3CH2NH- Derivate) 3. 8-Alkylthio-derivate (inklusive CH3S- und CH2CH2S Derivate).
Wie aus dem oben stehenden ersichtlich ist, beträgt in jedem der bekannten 8-Alkyl-substituierten c-AMP-Derivate die Zahl der Kohlenstoffatome in der Alkylgruppe bis zu 2.
Bei der Durchführung der Synthese von 8-Alkyl-substituierten c-AMP in dem die Zahl der Kohlenstoffatome in der Alkylgruppe erhöht wurde, fanden wird, dass neue Derivate, in denen die Zahl der Kohlenstoffatome 6 oder mehr beträgt, nämlich CH3(CH2)sS-Derivate und höhere Alkyl-substituierte Derivate, eine viel grössere PDE-hemmende Aktivität aufweisen, als die bisher bekannten Derivate. Ferner wurde gefunden, dass neue Derivate, in denen die Zahl der Kohlenstoffatome der Alkylgruppe 10 oder mehr beträgt, nämlich CH3(CH2)9S Derivate und höhere Alkyl-substituierte Derivate eine PDEhemmende Aktivität aufweisen und eine ausgezeichnete Membran-Permeabilität in der lebenden Zelle zeigen.
Die neuen c-AMP-Derivate, wie sie auch ausserhalb des erfindungsgemässen Verfahrens von uns synthetisiert wurden, die eine lineare Alkylgruppe mit 3-13 Kohlenstoffatomen (d. h.
n in der oben angegebenen allgemeinen Formel beträgt demzufolge zwischen 2 und 12) als Substituent in der 8-Position über eine Amino- oder Thio-Gruppe gebunden tragen, sind vor allem aktiv als PDE-Inhibitoren in vivo und bewirken eine Erhöhung des intrazellulären Spiegels von c-AMP. Ferner werden alle die neuen durch uns synthetisierten Substanzen durch c-AMP PDE nicht abgebaut, sondern sind gegenüber der Wirkung von PDE stabil. Die Daten der hauptsächlichen biochemischen Eigenschaften dieser neuen Verbindungen sind in unten stehender Tabelle 1 illustriert.
Zur Vereinfachung teilten wird die neuen, nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Derivate, entsprechend ihren Aktivitäten in die folgenden zwei Gruppen: Gruppe I 8-CH3(CH2)nS-c-AMP, worin n 5 bis 8 beträgt.
Gruppe II 8-CH3(CH2)n-S-c-AMP, worin n 9 bis 12 beträgt.
Derivate der Gruppe I mit einer Alkylgruppe von 5-9 Kohlenstoffatomen weisen eine stark erhöhte PDE-hindernde Aktivität auf, verglichen mit den bekannten c-AMP-Derivaten, worin n zwischen 2 und 4 liegt. Ferner ist diese Inhibitor Aktivität wesentlich grösser als diejenige des bekannten Theophyllins. Theophyllin und seine Derivate werden als Anti Asthmat-Wirkstoffe verwendet. Die neuen c-AMP-Derivate der Gruppe I sollen diese bekannten Anti-Asthma wirksamen Stoffen ersetzen.
Derivate der Gruppe II zeigen eine erhöhte Membran Permeabilität, verglichen mit bekannten Derivaten. Aus Versuchsergebnissen bei denen Protein-Kinasen verwendet wurden, zeigte sich, dass die Derivate dieser Gruppe keine Kinaseaktivierenden Eigenschaften aufwiesen. Kurz gesagt sind also die Derivate der genannten Gruppe PDE-Inhibitoren mit ausgezeichneter Permeabilität für Membranen.
Wie weiter oben genannt ist Scabies, eine Krankheit, die durch Reduktion des c-AMP-Spiegels verursacht wird, dadurch charakterisiert, dass die Funktionen sowohl des Hormonrezeptors und der Adenylat-Cyclase verändert sind und im allgemeinen nicht in ihre ursprüngliche Form zurückgebracht werden können. Als Mittel zur Erhöhung des intrazellulären c-AMP Spiegels kann eine Hemmung von PDE in Betracht gezogen werden. In diesem Zusammenhang sind die genannten Derivate der Gruppe II infolge ihrer Inhibitoreigenschaften für PDE und ihrer ausgezeichneten Membran-Permeabilität geeignet. Es kann demzufolge beim Auftragen einer Salbe, die ein Derivat der Gruppe II enthält auf von Scabies befallene Haut eine genügende Heilungswirkung erwartet werden.
Die mit den neuen c-AMP-Derivaten durchgeführten biologischen Tests und die dabei erhaltenen Ergebnisse sollen im folgenden dargelegt werden.
1. Tests unter Verwendung von CHO-Ki-Zellkulturen:
Im Jahr 1971 wurde von A.W. Hsie und T.T. Puck gefunden, dass bei Zugabe von N6,O2'-Dibutyryl-c-AMP in einer Konzentration von 10-3 Mol/Liter zu einem Medium, das eine Zellkultur (CHO-Ki) stammend vom chinesischen Hamster, CHO Ki reversibel von der epitherialen Form in die Fibrobrast-Form umgewandelt wurde (Proc. Nat. Acd. Sci. US., 68,358-361).
Anschliessend fanden die genannten Autoren, dass N6,O2,- Di- butyryl-c-AMP eine Inhibitorwirkung gegenüber PDE aufweist, den intrazellulären c-AMP-Spiegel erhöht und Protein-Kinasen aktiviert.
Dieses genannte Test-System wurde auf die von uns synthetisierten neuen Derivate zur Untersuchung der folgenden zwei Eigenschaften angewandt:
1. Fähigkeit zur Erhöhung des c-AMP-Spiegels in CHO-Ki Zellen.
2. Membran-Permeabilität.
Die Tests wurden in folgender Weise, entsprechend der Modifikation der Methode von Hsie und Puck durchgeführt: (1) Zur Bestimmung der Fähigkeit der c-AMP-Spiegel zu erhöhen, wurden die neuen Derivate zu dem oben genannten Medium in einer Konzentration von 1 mMol/Liter oder 10-' mMol/Liter gegeben und nach 24 h eine mikroskopische Analyse durchgeführt. Als Kontrollen wurden das CHO-Ki-Zellmedium, in Abwesenheit irgendeiner biologischen Verbindung und das CHO-Ki-Zellmedium, enthaltend 10-3 Mol/Liter N6,O2'-Dibutyryl-c-AMP in gleicher Weise analysiert.
(2) Die Membran-Permeabilität wurde basierend auf der inversen Transformation ermittelt. Im besonderen wurden die neuen Derivate in Konzentrationen von l0-3, 5 x 10-2, 10-1, 2 X 10-l,5 x 10- oder 1 mMol/Liter zum oben genannten Medium gegeben. Nach 16 und 30 h wurde eine mikroskopische Analyse durchgeführt und die limitierende invers-transformierbare Konzentration (in folgenden als L.R.C. bezeichnet) wurde ermittelt, worauf die Membran-Permeabilität, basierend auf dem auf diese Weise bestimmten L.R.C.-Wert bestimmt wurde.
Die bei diesen Tests erhaltenen Ergebnisse sind in unten stehenden Tabellen 1 und 2 aufgeführt.
Tabelle 1 Neue c-AMP Bekannte Verbindungen 8-Brom-c-AMP erfindungs- (8-Br-c-AMP) gemässe Stabilität Membran- N6,O2'-Dibutyryl-c-AMP c-AMP- gegenüber permea- [N6,O2'- (CH3CH2CH2CO)2- c-AMP] Stabilität Inhibitor Derivate PDE* bilität gegenüber Wirkung (Gruppen) *** Stabilität Inhibitor- Membran- PDE* gegenüber gegenüber Wirkung Permeabi- PDE**
PDE* gegenüber lität PDE** *** Bekannte ++ + + + - + + Derivate mit n 2 bis 4 Neue ++ + + ++ + + ++ Derivate der Gruppe I Neue ++ ++ + + ++ + + Derivate der Gruppe II Erläuterungen: *:
: Dll-Fraktion, erhalten durch partielle Purifikation von
Phosphodiesterase, stammend vom Gehirn des Schweins wurde als Standardenzym verwendet und die Stabilität gegenüber PDE wurde mit dem Abbau-Verhältnis bei einer Konzentration von 1 mMol/Liter bestimmt.
**: Die Inhibitorwirkung gegenüber PDE wurde in der Weise ermittelt, dass bei Zugabe der Probeverbindung in dersel ben molaren Konzentration wie diejenige des Substrats (1 mMol/Liter) die entsprechende relative Hemmung gemes sen wurde, worauf die Hemmungskonstante (ki) gemäss der enzymologischen Methode (Lineweaver-Burk plot) berechnet wurde.
***: Die Membran-Permeabilität wurde basierend auf der minimalen Konzentration, die eine Re-Transformation von CHO-Ki-Zellkulturen bewirkte, bestimmt (die Re- Trans- formation von CHO-Ki wird durch eine Erhöhung des c-
AMP-Spiegels bewirkt).
Die in Tabelle 1 gegebenen Symbole bedeuten Ergebnisse von Vergleichen der genannten Eigenschaften zwischen den neuen, dem erfindungsgemässen Verfahren entsprechenden Derivaten und den bekannten Verbindungen und haben die folgende Bedeutung: + + :Das neue erfindungsgemässe Derivat ist viel stärker wirksam als die bekannte Verbindung.
+: Das neue erfindungsgemässe Derivate ist wirksamer als die bekannte Verbindung.
+: Kein substantieller Unterschied der Eigenschaften des neuen erfindungsgemässen Derivats und der bekannten
Verbindung.
Die bekannte Verbindung ist wirksamer als das neue erfindungsgemässe Derivat.
Tabelle 2 Inverse Transformation von Zellkulturen (CHOKi) durch neue 8-substituierte c-AMP-Derivate Verbindung Inverse Transformation bei 10-4 bei 10-3 L.R.C.
Mol/Liter Mol/Liter (10-3
Mol/Liter)
4. 8-CH3(CH2)5S C A 0,3
5. 8-CH3(CH2)6S C A Q3
6. 8-CH3(CH2),S A C (toxisch) 0,02
7. 8-CH3(CH2)8S A C (toxisch) 0,01
8. 8-CH3(CH2)9S A C (toxisch) < 0,005
9. 8-CH3(CH2)oS A C (toxisch) < 0,005 10. 8-CH3(CH2)1tS A C (toxisch) < 0,005 Fussnoten: A: grösste Aktivität bei der inversen Transformation B: befähigt zur inversen Transformation C: keine feststellbare inverse Transformation
Aus den oben stehenden Testergebnissen geht klar hervor, dass wenn bei neuen erfindungsgemäss hergestellten Derivaten die Anzahl der Kohlenstoffatome in der Alkylgruppe 9 oder mehr beträgt, der L.R.C.-Wert abnimmt.
Grund dafür scheint die Tatsache zu sein, dass bei Grösserwerden der Anzahl Methylengruppen in der Alkylgruppe (d. h. n in der oben genannten allgemeinen Formel wird grösser), die hydrophoben Eigenschaften des Moleküls erhöht werden und damit das Durchtreten durch Zellmembranen erleichtert wird. In anderen Experimenten konnte festgestellt werden, dass die neuen Derivate mit 8 oder mehr Kohlenstoffatomen in der Alkylgruppe nicht mehr als c-AMP gegenüber Protein-Kinasen wirksam sind. Bei diesen Derivaten ist nämlich die inverse Transformation von CHO-Ki (Erhöhung des intrazellulären c-AMP-Spiegels) nur durch die Hemmung von PDE verursacht.
2. Tests unter Verwendung von Phosphodiesterase (PDE) vom Hin des Schweins:
Im allgemeinen wird c-AMP durch die in den Zellen vorhandene PDE zu 5'-AMP abgebaut und verliert damit eine Aktivität oder Funktion als c-AMP. Wegen dieser Abbauwirkung von PDE ist c-AMP in verschiedenen Experimenten und klinischen Tests oft unwirksam. Demzufolge muss als erste Eigenschaft von c-AMP-Derivaten die wirksam sein sollen, verlangt werden, dass diese eine hohe Stabilität gegenüber der Wirkung von PDE aufweisen. Andererseits sollten sie auch eine hohe Inhibitorwirkung gegenüber dem Enzym d.h. PDE aufweisen. Dementsprechend wählten wir als Standard-Enzym PDE, extrahiert aus dem Hirn von Schweinen, das partiel gereinigt wurde entsprechend der Methode von Teo, Wang und Mitarb. Dieses Standard-Enzym enthielt keine andere verunreinigenden Esterase (5'-Nukleotidase).
Die Reinigung des Enzyms erfolgt durch Fraktionierung mit Ammoniumsulfat und Passage durch eine DEAE-Cellulose Säule, entsprechend der Modifikation der Methode von T.S.
Teo, T.T. Wang und Mitarb. (J. Biol. Chemi., 248, 585). Das Reaktionsgemisch (10 ml) enthielt 40 mMol Tris-HCl (pH=8,0), 3 mMole, MgCl2, 0,34,0 mMole c-AMP, 0,5 oder 1,0 mMole des c-AMP-Derivats und 82 g des Enzyms. Die Reaktion und Analyse wurde durchgeführt wie von Bucher und Sutherland in J. Biol. Chemi., 237, 1244 (1962) besh beschrieben.
Die Testergebnisse sind in unten stehender Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3 Inhibitorwirkung von 8-substituierten c-AMP-Derivaten auf die Hydrolyse von c-AMP durch Schweinehirn-Phosphodiesterase Verbindung Inhibitor- Inhibitor wirkung I wirkung II
Konzen- Relative Inhibitor tration Inhibitor- wirkungs (mMol/Liter) wirkung* konstante im (%) (Ki)**
Reaktions- (mM) gemisch c-AMP Deri vat 8-CH3(CH2)5S-c-AMP 1,0 1,0 92,4 0,019 8-CH3(CH2)6S-c-AMP 1,0 0,5 90,4 0,0095 8-CHa(CH2)7S-c-AMP 1,0 1,0 95,0 0,016 8-CH3(CH2)8S-c-AMP 1,0 0,5 74,9 0,031 8-CH3(CH2)9S-c-AMP 1,0 0,5 68,2 0,046 8-CH3(CH2)10S-c-AMP 1,0 1,0 39,1 0,088 8-CH3(CH2)11S-c-AMP 1,0 1,0 26,4 0,14 Bemerkungen *:
Die Werte wurden gemäss der folgenden Gleichung berechnet: 100X (l-a/b) worin a den Anteil von hydrolisiertem c-AMP im Reak tionsgemisch, enthaltend den Inhibitor (das c-AMP
Derivat) bedeutet und b den Anteil des hydrolysierten c
AMP im Reaktionsgemisch, enthaltend keinen Inhibitor, darstellt.
**: Ki-Werte wurde aus der Steigung des Lineweaver-Burk
Plots und aus dem Kreuzungspunkt des Dixon-plots berechnet.
Für die neuen, nach dem erfindungsgemässen Verfahren erzeugten Alkylthio-Derivate, konnte festgestellt werden, dass die PDE-Inhibitorwirkung von 8-CH3(CH2)n S-c-AMP-Derivaten, in welchen n 3 oder 4 beträgt, vergleichbar ist oder leicht herabgesetzt ist, verglichen mit derjenigen von bekannten 8-CH3S-c-AMP und 8-CH3CH2S-c-AMP-Derivaten, während die PDE-Inhibitorwirkung von 8-CH3(CH2)nS-c-AMP, in welchen n zwischen 5 und 8 beträgt wesentlich grösser ist als diejenige der bekannten Alkylthio-Derivate. Die Inhibitorwirkungskonstanten von 8-CH3(CH2)6S-c-AMP betrugen 9,3 mM und 9,5 mM, wobei diese Werte die grössten aller bisher synthetisierten c-AMP-Derivate, waren.
Zur Untersuchung des Inhibitor-Mechanismus von 8-substituierten c-AMP-Derivaten wurde für jedes Derivat ein Lineweaver-Burk-Plot aufgenommen. Die Reaktion wurde dafür bei einer Substrat-Konzentration (c-AMP) von 0,3 bis 4,0 mMol/Liter und einer Derivat-Konzentration von 0,5 mMol/Liter durchgeführt. Es wurde gefunden, dass alle der neuen, dem erfindungsgemässen Verfahren entsprechenden Derivate einen antagonistischen Inhibitor-Mechanismus aufweisen. Damit konnte nachgewiesen werden, dass alle neuen Derivate, wie sie von uns synthetisiert wurden, eine spezifische Inhibitorwirkung gegenüber dem c-AMP-abbauenden Enzym, PDE, aufweisen.
Im besonderen zeigen die neuen Derivate der oben genannten Gruppe II, nämlich 8-CH3(CH2)nS-c-AMP, in welchen n zwischen 5 und 8 beträgt, eine höhere antagonistische Inhibitorwirkung gegenüber PDE als bei irgendeinem bisher bekannten c-AMP-Derivat. Die neuen Derivate der Gruppe II sind PDE Inhibitoren, die sämtliche eine höhere Inhibitorwirkung aufweisen als Theophyllin oder seine Derivate, das bisher als Anti Asthma-Mittel verwendet wurde. Auch wirken die genannten Derivate der Gruppe II nur als PDE-Inhibitoren, da die Aktivie- rungswirkung auf Protein-Kinasen bei keinem der genannten Derivate mehr vorhanden ist. Es kann darum erwartet werden, dass diese neuen Derivate an die Stelle von Theophyllin als wichtigstes Anti-Asthma-Mittel treten können.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I
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sowie deren nicht toxische Salze, worin n eine ganze Zahl von 5 bis 12 darstellt, dadurch gekennzeichnet, dass man ein 8 Halogen-cycl.-adenosin-monophosphat der allgemeinen Formel
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worin X ein Halogenatom darstellt, oder ein anorganisches oder organisches Salz davon mit einem Alkalimetallsalz, eines linearen Alkylmercaptans der allgemeinen Formel CH3(CH2)nSH worin n eine ganze Zahl von 5 bis 12 bedeutet, umsetzt.
Eine Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens zur Synthese der neuen c-AMP-Derivate soll im folgenden näher beschrieben werden. Die Umsetzung wird vorzugsweise in einem alkoholischen Lösungsmittel durchgeführt.
8-Halogen-cycl.-AMP-Derivate, wie sie für das erfindungsgemässe Verfahren verwendet werden, z.B. 8-Brom-c-AMP, können leicht dadurch synthetisiert werden, dass c-AMP mit Brom in Essigsäure-Puffer behandelt wird (M. Ikehara und Mitarb., Chem. Pharm. Bull., 17, 348 (1969)).
In dieser Reaktion kann das 8-Brom-c-AMP entweder in freier Form oder in Form eines anorganischen Salzes wie z. B.
des Natrium-Salzes oder eines Salzes einer organischen Base, wie Triäthylamin, verwendet werden. Als Lösungsmittel kommt ein Alkohol zur Anwendung. Ein Alkalimetallsalz des
Alkylmercaptans wird in herkömmlicher Weise hergestellt, z.B.
durch Umsetzen des Alkalimercaptans in einem Alkohollö sungsmittel mit einem Alkalimetall-Alkoholat wie Methoxy
Natrium oder t-Butoxy-Kalium. Der Anteil der verwendeten Alkalimetallsalzes des Alkylmercaptans beträgt mindestens
1 Mol, vorzugsweise aber zwischen 2 und 10 Molen pro Mol des
8-Halogen-c-AMP. Ein grösserer Oberschuss des Alkalimetall salzes des Alkylmercaptans ist einerseits aus ökonomischen
Gründen ungünstig und andererseits wird dadurch die weitere Behandlung des Produkts problematisch. Die Reaktion wird bei einer Temperatur durchgeführt, die dem Siedepunkt des verwendeten Lösungsmittels entspricht.
Die Reaktionszeit wird stark durch weitere Reaktionsbedingungen beeinflusst, wie durch den Anteil des verwendeten Alkalimetallsalzes des Alkylmercaptans, und die Art des verwendeten Lösungsmittels, doch im allgemeinen werden gute Ausbeuten erhalten, wenn die Reaktionszeit zwischen 1 und 5 h beträgt. Eine zu lange Reaktionszeit zeigt den Nachteil, dass das gewünschte Produkt zur Zersetzung neigt. Das Reaktionsprodukt kann leicht in Form von Kristallen des freien Esters in herkömmlicher Weise isoliert werden, z.B. durch Einengen des Reaktionsgemisches bei 40 C bei vermindertem Druck, anschliessender Zugabe von kaltem Wasser zum Konzentrat und durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure zu der Lösung unter gleichzeitigem Abkühlen und Umrühren, wodurch das pH auf die saure Seite verschoben wird.
Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten neuen 8-substituierten c-AMP-Derivate sind in vivo sehr stabil und wirken in vivo hauptsächlich als antagonistische Inhibitoren gegenüber dem c-AMP-abbauenden Enzym PDE. Unter diesen neuen Derivaten zeigen diejenigen mit 6-10 Kohlenstoffatomen in der Alkylgruppe eine besonders hohe Aktivität als antagonistische Inhibitoren für PDE. Ferner sind die genannten Derivate, da ihre Protein-Kinase aktivierenden Eigenschaften drastisch reduziert sind, nicht mehr als aktives c-AMP wirksam, auch wenn sie an einem lebenden Organismus verabreicht werden. Mit anderen Worten können bei der Verabreichung der genannten Derivate Nebenwirkungen, die durch eine direkte Erhöhung des c-AMP-Spiegels bewirkt werden, weitgehend vermieden werden.
Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Verbindungen sind nützlich bei der Behandlung der verschiedensten Krankheitszustände, inklusive Metabolische und endokrine Störungen, da sie fähig sind den intrazellulären Spiegel von Vermittlern von Hormoneffekten zu erhöhen. Sie zeigen eine hohe biologische Aktivität und Selektivität in Bezug auf verschiedene Gewebsarten. Darüberhinaus zeigen sie eine hohe Stabilität gegenüber abbauenden Enzymen, z.B. cyclischer Phosphodiesterase.
Daraus folgt, dass die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Verbindungen nützlich sind für die Behandlung von z.B. bronchialem Asthma, refraktorischem kongestivem Herzversagen, Diabetes mellitus, Pseudohypoparathyroidismus, Fettleibigkeit, einigen neoplastischen Manifestationen, vasopressin-resistentem Diabetes insipidus, und von weiteren Störungen, die auf eine Fehlfunktion der Nebenniere zurückgeführt werden können.
Die erfindungsgemäss erzeugten Verbindungen der Formel I können in pharmazeutischen Zusammensetzungen, die eine genannte Verbindung als aktive Komponente in Mischung mit einem pharmazeutisch verwendbaren nichttoxischen Trägerstoff enthalten, verwendet werden.
Als pharmazeutisch verwendbare Trägerstoffe zur Herstellung der genannten Kompositionen kommen Feststoffe, Flüssigkeiten oder Gase in Frage. Demzufolge können die Kompositionen in Form von Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvern, Lösungen, Suspensionen, Elixieren, Aerosolen oder ähnlichen vorliegen.
Geeignete Trägerstoffe sind z. B. verschiedene Öle, wie Petroleum tierische, pflanzliche oder synthetische Öle, wie Erdnuss öl, Sojaöl, Mineralöl, Sesamöl oder ähnliche. Wasser, Salzlösungen, wässrige Dextrose und Glykole sind die bevorzugten flüssigen Trägerstoffe, besonders für die Anwendung in Injektionslösungen. Geeignete Feststoffe sind Stärke, Cellulose, Talk, Glucose, Lactose, Saccharose, Gelatine, Malz, Reis, Mehl, Kalk, Silicagel, Magnesiumstearat, Natriumstearat, Glycerinmonostearat, Natriumchlorid, getrocknete Magermilch, Glyce rin, Propylenglykol, Wasser und ähnliche. Die genannten Kompositionen enthalten in jedem Fall eine wirksame Dosis der aktiven Verbindung zusammen mit einem geeigneten Trägerstoff, so dass ein Produkt erhalten wird, das sich zur Verabreichung eignet.
Die wirksame Dosis der genannten Verbindungen zur Behandlung biologischer Störungen kann im allgemeinen zwischen ca. 1 mg und 100 mg per kg Körpergewicht variieren, wobei eine Verabreichung ein oder mehrmals täglich erfolgen kann. Die wirksame Verbindung kann in irgendeiner geeigneten Art, parenteral oder oral und in irgendeiner geeigneten Verabreichungsform wie isotonischen Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Kapseln und ähnliche verabreicht werden (siehe z. B.
US-Patent 3 872 084).
Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten c-AMP-Derivate der Gruppe I zeigen eine sehr hohe antiasthmatische Aktivität und demzufolge können sie Theophyllin oder dessen Derivate, das bis heute weit verabreicht als antiasthmatisches Mittel ist, ersetzen.
Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten c-AMP-Derivate der Gruppe II sind antagonistische Inhibitoren für PDE und sind den bekannten c-AMP-Derivaten in bezug auf Membran-Permeabilität weit überlegen. Beim Auftragen von pharmazeutischen Präparaten, die die genannten Derivate als Wirkstoff enthalten, auf Haut, die von Scabies oder einer ähnlichen Hautkrankheit befallen ist, werden die genannten Derivate der Gruppe II gut absorbiert und erzielen damit eine gute Heilungswirkung. Ferner treten die genannten Derivate bei Verabreichung am lebenden Organismus auch bei niedrigen Konzentrationen rasch in die Zellen ein und sind damit gut wirksam.
Die heute am meisten verbreitete Behandlungsmethode für Scabies besteht in einer Hemmung von PDE und in einer Erhöhung des intracellulären c-AMP-Spiegels. Deshalb sind die genannten erfindungsgemässen c-AMP-Derivate sehr geeignet für die Behandlung von Scabies.
Die Synthese der neuen 8-substituierten c-AMP-Derivate soll nun durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert werden.
Beispiel 1
In 60 ml wasserfreiem Methanol wurden 400 mg (18 mMol) metallisches Natrium aufgelöst und 3,4 ml (24 mMol) n-Hexylmercaptan wurden zu der Lösung gegeben. Das Gemisch wurde während ca. 30 min bei Raumtemperatur gerührt, worauf 2,46 g (6 mMol) 8-Brom-c-AMP zugegeben wurden und das Gemisch unter Umrühren während 1 h auf Rückflusstemperatur erhitzt wurde. Das erhaltene Reaktionsprodukt wurde bei 40" C eingeengt und 60 ml kaltes Wasser wurden zum Rückstand gegeben. Anschliessend wurd durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure und Umrühren das pH auf 6 eingestellt. Das Gemisch wurde zweimal mit je 100 ml Aether extrahiert, die wässrige Phase wurde filtriert und das Filtrat wurde abgekühlt und mit konzentrierter Salzsäure versetzt, wodurch das pH auf 2 eingestellt wurde. Das Gemisch wurde anschliessend abgekühlt und gerührt, damit Kristallisation eintritt.
Der gebildete kristalline Niederschlag wurde anschliessend abfiltriert und mit kleinen Anteilen von kaltem Aethylalkohol und Aether gewaschen um den Geruch von Thiol zu entfernen. Die Kristalle wurden anschliessend bei Raumtemperatur und vermindertem Druck getrocknet, wobei man 2,16 g (81% Ausbeute) von 8-n Hexylmercapto-c-AMP in Form von Kristallen erhielt, deren Untersuchung die folgenden Analysendaten lieferte:
Zersetzung: 225" C. pH,,
U.V.Absorptionsmaximum: R max 285 mk, A max3 282 mm,
285 mH mm 19,400, E2so/E260 = 0,48, E280/E260 = 2,36 pH2
Papierchromatographie (n-Butanol:
:Essigsäure:Wasser = 4:1:5 (obere Schicht)):
R-Wert = 0,65 Elementaranalyse als Ct6H24NsO6SP: Gefunden: C, 43,24, H, 5,95, N, 15,57, S, 7,02, P, 6,73% Berechnet: C, 43,14, H, 5,43, N, 15,72, S, 7,20, P, 6,95%.
Beispiel 2
In 80 ml Aethylalkohol wurden 400 mg (18 mMol) metallisches Natrium gelöst, worauf 4,2 ml (24 mMol) n-Octylmercaptan zur Lösung gegeben wurden. Das Gemisch wurde während 30 min bei Raumtemperatur gerührt, worauf 2,46 g (6 mMol) 8 Brom-c-AMP zugegeben wurden und worauf das Gemisch unter Umrühren während 3 h auf Rückflusstemperatur erhitzt wurde. In derselben Weise wie in Beispiel 1 beschrieben wurde das erhaltene Reaktionsprodukt nachbehandelt, wobei man 2,32 g (82% Ausbeute) von kristallinem 8-n-Octylmercapto-c AMP erhielt, dessen Analysendaten die folgenden sind:
Zersetzung: 223 C.
UV-Abosrptionsmaximum:
A pH2 285 mlt, A pHo3 282 mlc, E 285 mXe 18,400, max max pH2
E2so/E260 = 0,48, E280/E260 = 2,70
Papierchromatographie (n-Butanol: Essigsä re:Wasser = 4:1:5 obere Schicht): Rf-Wert = 0,65 Elementaranalyse als C1,,H28N5O6SP: Gefunden: C, 45,43, H, 6,34, N, 14,80, S, 6,52, P, 6,38% Berechnet: C, 45,66, H, 5,96, N, 14,79, S, 6,77, P, 6,54%.
Beispiel 3
Bei analogem Vorgehen wie in Beispiel 2, jedoch unter Verwendung von 3,8 ml (24 mMol) n-Heptylmercaptan, anstelle von 4,2 ml n-Octylmercaptan, erhielt man 2,26 g (82So Ausbeute) von kristallinem 8-n-Heptylmercapto-c-AMP, dessen Analysendaten die folgenden sind:
Zersetzungspunkt: 2280 C
UV-Absorptionsmaximum:
A pH2 285mtcIA. 282mr285 mCC 19,300, max max pH2 E2so/E260 = 0,47, E280/E260 = 2,45
Papierchromatographie (n-Butanol:Essigsäure:Wasser = 4:1:5 obere Schicht) Rf-Wert = 0,65 Elementaranalyse als Cs,H24NsO6SP: Gefunden: C, 44,45, H, 5,98, N, 15,13, S, 6,78, P, 6,65% Berechnet: C, 44,44, H, 5,70, N, 15,24, S, 6,98, P, 6,74%.
Beispiel 4
In 100 ml wasserfreiem t-Butylalkohol wurden 620 mg (20 mMol) metallisches Kalium unter Erhitzen auf 40 C gelöst. Anschliessend wurden 5,0 ml (24 mMol) n-Decylmercaptan zu der Lösung gegeben und das Gemisch während ca.
20 min gerührt. Anschliessend wurden 2,46 g (6 mMol) 8 Brom-c-AMP zum Gemisch gegeben und das Gemisch während 1 h auf Rückflusstemperatur erhitzt. Das erhaltene Reaktionsprodukt wurde wie in Beispiel 1 beschrieben nachbehandelt, wobei man 2,60 g (86 % Ausbeute) von kristallinem 8-n-Decylmercapto-c-AMP erhielt, dessen Analysendaten die folgende sind:
Zersetzung: 227 C
UV'Absorptionsmaximum: # pH2 285 m , APmax3 282 m,u, epH m 17,800, max
Papierchromatographie (n-Butanol:Essigsäure:Wasser = 4:1:5 obere Schicht)
Rf-Wert = 0,75 Elementaranalyse als C20H32NsO6SP: Gefunden: C, 47,64, H, 6,58, N, 13,86, S, 6,25, P, 6,07% Berechnet: C, 47,90, H, 6,43, N, 13,96, S, 6,39, P, 6,18%.
Beispiel 5
Bei analogem Vorgehen wie in Beispiel 4, jedoch unter Verwendung von 5,7 ml (24 mMol) n-Dodecylmercaptan, anstelle von 5,0 ml n-Decylmercaptan, erhielt man 2,70 g (85 % Ausbeute) von kristallinem 8-n-Dodecylmercapto-c-AMP, mit den folgenden Analysendaten:
Zersetzung: 2280 C
UV-Absorptionsmaximum: # pH2 285 m ,# pHa13 282 m ,# 285 m 17,800, max max pH2 E250/E260 = 0,53, E280/E260 = 2,70
Papierchromatographie (n-Butanol:Essigsäure:Wasser = 4:1:5 obere Schicht): Rf-Wert = 0,80 Elementaranalyse als C22H36NsO6SP: Gefunden: C, 49,60, H, 6,85, N, 13,02, S, 5,95, P, 5,76% Berechnet: C, 49,90, H, 6,85, N, 13,22, S, 6,05, P, 5,89%.
Beispiel 6
Bei analogem Vorgehen wie in Beispiel 2, jedoch unter Verwendung von 5,7 ml (30 mMol) n-Nonylmercaptan, anstelle von 4,2 ml n-Octylmercaptan, erhielt man 2,49 g (85 % Ausbeute), von kristallinem 8-n-Nonylmercapto-c-AMP, mit den folgenden Analysendaten:
Zersetzung: 2250 C
UV-Absorptionsmaximum: 285 m , A PH13 282 mu, e PH2 18,200, E2so/E260 = 0,49, E2so/E260 = 2,70
Papierchromatographie (n-Butanol:Essigsäure:Wasser = 4:1:5 obere Schicht): Rf-Wert = 0,68 Elementaranalyse: Gefunden: C, 46,70, H, 6,45, N, 14,20, S, 6,48, P, 6,22% Berechnet: C, 46,81, H, 6,20, N, 14,37, S, 6,57, P, 6,35%.
Beispiel 7
Bei analogem Vorgehen wie in Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von 5,4 ml (24 mMol) n-Undecylmercaptan, anstelle von 3,4 ml n-Hexylmercaptan, erhielt man 2,32 g (75 % Ausbeute) von kristallinem 8-n-Undecylmercapto-n-AMP, mit den folgenden Analysendaten:
Zersetzung: 2270 C
UV-Absorptionsmaximum: A pH2 285 m ,# PH13 282 m,ez e 285 mA 17,800, max max pH2 E2so/E260 = 0,52, E280/E260 = 2,68
Papierchromatographie (n-Butanol:Essigsäure:Wasser = 4:1:5 obere Schicht): Rf-Wert = 0,75 Elementaranalyse als C2sH34NsO6SP: Gefunden: C, 48,83, H, 6,80, N, 13,67, S, 6,09, P, 6,12%.
Berechnet: C, 48,92, H, 6,65, N, 13,58, S, 6,22, P, 6,01%.
** WARNING ** Beginning of DESC field could overlap end of CLMS **.
PATENT CLAIMS 1. Process for the preparation of a compound of formula I.
EMI1.1
and their non-toxic salts, in which n is an integer from 5 to 12, characterized in that an 8 halo-cycl.- adenosine monophosphate of the general formula
EMI1.2
wherein X represents a halogen atom, or an inorganic or organic salt thereof with an alkali metal salt of a linear alkyl mercaptan of the general formula
CH3 (CH2) n SH where n is an integer from 5 to 12, is converted.
2. The method according to claim 1, characterized in that the reaction is carried out in the presence of an alcohol as solvent.
3. The method according to claim 1, characterized in that the alkali metal salt of the linear alkyl mercaptan is used in a ratio of 1 to 10 moles per mole of the 8-halogenocyclic adenosine monophosphate.
4. The method according to claim 1, characterized in that the reaction is carried out at the boiling point of the solvent used.
5. The method according to claim 1, characterized in that the reaction time is 1 to 5 hours.
The present invention relates to a process for the preparation of cyclic 8-linear alkyl mercapto adenosine monophosphates of the following formula I, which exhibit excellent biological and pharmacological activities
EMI1.3
wherein n represents an integer from 5 to 12.
In 1957, Sutherland et al. found that when epinephrine and glucagon act on liver cells of higher animals, a low molecular weight nucleotide is formed that can activate kinases. This substance was later identified as adenosine 3 ', 5'-cyclic monophosphate (hereinafter referred to as c-AMP). The c-AMP is known today as a secondary intracellular messenger of the activities of hormones in higher animals. This means that when a particular hormone is bound to a hormone receptor on a target cell, an adenylate cyclase is activated to increase the level of c-AMP. When the c-AMP level increases, the c-AMP-dependent protein kinases are activated and a large number of biological reactions are set in motion.
In some cases the unmasking of nucleohistones is stimulated and thus the formation of various enzymes (proteins) is stimulated. In other cases, stored glucose or glycogen phosphorylase is activated, thus accelerating glycogenolysis. A number of other biological reactions are determined by the level of c-AMP. Asthma can be mentioned as one of these biological reactions. The main cause of asthma is a reduction in the reactivity of the ss-adrenergic receptor (one of the hormone receptors) of the respiratory smooth muscle. The steroid exhibits the activity of increasing the reactivity of the badrenergic receptor, and theophylline has the activity of antagonizing and blocking c-AMP-decomposing enzymes (phosphodiesterase for c-AMP: hereinafter referred to as PDE).
Both of these chemicals cause an increase in the c-AMP level (A. Szentivanyi, J. Allergy, 42, 203-232 (1968)). It is also assumed that scabies, a skin disease, is also caused by a reduction in c AMP levels. This disease is based on an overproduction of abnormal epithelial cells that are rich in glycogen and the disease is characterized by the fact that the function of the hormone receptors has changed and consequently SS-adrenergic promoters, adenylate cyclase activators and NaF are ineffective (JJ Voorhees et al. Arch Dermatol., 105, 695 (1972)). To date, a number of diseases are known to be caused by a disruption of the c-AMP balance.
The c-AMP is converted to 5'-adenosine monophosphate by phosphodiesterase. In other words, the intracellular level of c-AMP is controlled by the difference in the activities of the synthesizing enzyme, adenylate cyclase and the degrading enzyme PDE. The biological activity of intracellular c-AMP manifests itself in the protein kinases. With these facts in mind, we examined the 8-substituted c-AMP derivatives with the aim of finding pharmacologically active compounds
compounds useful in the treatment and control of diseases caused by abnormal levels of c-AMP. Briefly, 8-substituted derivatives that met some or all of the following conditions were synthesized:
1. Stability to the action of PDE.
2. Specific inhibition of PDE (effect as a competitive inhibitor of PDE).
3. Excellent membrane permeability.
4. Activation of protein kinases.
In the course of our work on chemical syntheses and biological tests, a new biological fact was found, and based on this, we were able to synthesize new c-AMP derivatives with excellent properties that are not found in any of the previously known compounds.
Some of the 8-substituted c-AMP derivatives are known.
These known derivatives are classified as follows. In this classification, alkyl derivatives in which a linear alkyl group is bonded to the carbon atom in the 8-position via an amino or thio group were classified as alkylamino or
Alkylthio derivatives called.
1. 8-Halogen-substituted derivatives (including Cl and Br derivatives) 2. 8-Alkylamino derivatives (including NH2, CH3NH and CH3CH2NH derivatives) 3. 8-Alkylthio derivatives (including CH3S and CH2CH2S derivatives) .
As can be seen from the above, the number of carbon atoms in the alkyl group is up to two in each of the known 8-alkyl-substituted c-AMP derivatives.
In carrying out the synthesis of 8-alkyl-substituted c-AMP in which the number of carbon atoms in the alkyl group was increased, it was found that new derivatives in which the number of carbon atoms is 6 or more, namely, CH3 (CH2) sS -Derivatives and higher alkyl-substituted derivatives have a much greater PDE-inhibiting activity than the derivatives known to date. Further, it has been found that novel derivatives in which the number of carbon atoms of the alkyl group is 10 or more, namely, CH3 (CH2) 9S derivatives and higher alkyl-substituted derivatives, have PD inhibitory activity and show excellent membrane permeability in the living cell.
The new c-AMP derivatives, as they were also synthesized by us outside of the process according to the invention, which contain a linear alkyl group with 3-13 carbon atoms (i.e.
n in the general formula given above is therefore between 2 and 12) as a substituent in the 8-position bound via an amino or thio group, are above all active as PDE inhibitors in vivo and cause an increase in the intracellular level of c-AMP. Furthermore, all of the new substances synthesized by us are not broken down by c-AMP PDE, but are stable to the action of PDE. The data on the major biochemical properties of these new compounds are illustrated in Table 1 below.
For the sake of simplicity, the new derivatives prepared by the process according to the invention are divided into the following two groups according to their activities: Group I 8-CH3 (CH2) nS-c-AMP, where n is 5 to 8.
Group II 8-CH3 (CH2) n -S-c-AMP, where n is 9-12.
Group I derivatives with an alkyl group of 5-9 carbon atoms have greatly increased PDE-inhibiting activity compared to the known c-AMP derivatives in which n is between 2 and 4. Furthermore, this inhibitor activity is significantly greater than that of the known theophylline. Theophylline and its derivatives are used as anti-asthmatic agents. The new c-AMP derivatives of group I are intended to replace these known anti-asthma active substances.
Group II derivatives show increased membrane permeability compared to known derivatives. From test results in which protein kinases were used, it was found that the derivatives of this group did not have any kinase-activating properties. In short, the derivatives of said group are PDE inhibitors with excellent membrane permeability.
As mentioned above, scabies, a disease caused by a reduction in c-AMP levels, is characterized in that the functions of both the hormone receptor and adenylate cyclase are altered and generally cannot be restored to their original form. Inhibition of PDE can be considered as a means of increasing the intracellular c-AMP level. In this context, the mentioned derivatives of group II are suitable because of their inhibitory properties for PDE and their excellent membrane permeability. Accordingly, when an ointment containing a Group II derivative is applied to skin affected by scabies, a sufficient healing effect can be expected.
The biological tests carried out with the new c-AMP derivatives and the results obtained will be presented below.
1. Tests using CHO-Ki cell cultures:
In 1971 A.W. Hsie and T.T. Puck found that when N6, O2'-dibutyryl-c-AMP in a concentration of 10-3 mol / liter was added to a medium containing a cell culture (CHO-Ki) derived from the Chinese hamster, CHO Ki reversible from the epitherial one Form was converted to the fibrobrast form (Proc. Nat. Acd. Sci. US., 68,358-361).
The authors mentioned then found that N6, O2, -di-butyryl-c-AMP has an inhibitory effect on PDE, increases the intracellular c-AMP level and activates protein kinases.
This test system was applied to the new derivatives synthesized by us to investigate the following two properties:
1. Ability to increase c-AMP levels in CHO-Ki cells.
2. Membrane permeability.
The tests were carried out in the following way, according to the modification of the method of Hsie and Puck: (1) To determine the ability to increase c-AMP levels, the new derivatives were added to the above medium at a concentration of 1 mmol / Liter or 10- 'mmol / liter and carried out a microscopic analysis after 24 h. As controls, the CHO-Ki cell medium, in the absence of any biological compound, and the CHO-Ki cell medium containing 10-3 mol / liter N6, O2'-dibutyryl-c-AMP were analyzed in the same manner.
(2) The membrane permeability was determined based on the inverse transformation. In particular, the new derivatives were added in concentrations of 10-3, 5 × 10-2, 10-1, 2 × 10-1, 5 × 10- or 1 mmol / liter to the above-mentioned medium. After 16 and 30 hours, microscopic analysis was carried out and the limiting inverse transformable concentration (hereinafter referred to as L.R.C.) was determined, whereupon the membrane permeability was determined based on the thus determined L.R.C. value.
The results obtained in these tests are shown in Tables 1 and 2 below.
Table 1 New c-AMP Known compounds 8-bromo-c-AMP according to the invention (8-Br-c-AMP) according to stability membrane-N6, O2'-dibutyryl-c-AMP c-AMP- compared to permea- [N6, O2'- (CH3CH2CH2CO) 2- c-AMP] Stability of inhibitor derivatives PDE * ability to effect (groups) *** Stability of inhibitor membrane PDE * to effect of permeability PDE **
PDE * compared to PDE ** *** known ++ + + + - + + derivatives with n 2 to 4 new ++ + + ++ + + ++ derivatives of group I new ++ ++ + + ++ + + Group II derivatives Explanations: *:
: Dll fraction obtained by partial purification of
Pig brain-derived phosphodiesterase was used as a standard enzyme, and the stability to PDE was determined by the degradation ratio at a concentration of 1 mmol / liter.
**: The inhibitory effect on PDE was determined in such a way that when the sample compound was added in the same molar concentration as that of the substrate (1 mmol / liter), the corresponding relative inhibition was measured, whereupon the inhibition constant (ki) according to the enzymological Method (Lineweaver-Burk plot) was calculated.
***: The membrane permeability was determined based on the minimum concentration that caused a re-transformation of CHO-Ki cell cultures (the re-transformation of CHO-Ki is determined by an increase in the c-
AMP level causes).
The symbols given in Table 1 represent results of comparisons of the properties mentioned between the new derivatives corresponding to the process according to the invention and the known compounds and have the following meaning: + +: The new derivative according to the invention is much more effective than the known compound.
+: The new derivative of the present invention is more effective than the known compound.
+: No substantial difference between the properties of the new derivative according to the invention and the known
Connection.
The known compound is more effective than the new derivative of the invention.
Table 2 Inverse transformation of cell cultures (CHOKi) by new 8-substituted c-AMP derivatives Compound Inverse transformation at 10-4 at 10-3 L.R.C.
Mole / liter mole / liter (10-3
Mol / liter)
4. 8-CH3 (CH2) 5S C A 0.3
5. 8-CH3 (CH2) 6S C A Q3
6. 8-CH3 (CH2), S A C (toxic) 0.02
7. 8-CH3 (CH2) 8S A C (toxic) 0.01
8. 8-CH3 (CH2) 9S A C (toxic) <0.005
9. 8-CH3 (CH2) oS AC (toxic) <0.005 10. 8-CH3 (CH2) 1tS AC (toxic) <0.005 Footnotes: A: greatest activity in the inverse transformation B: capable of inverse transformation C: none detectable inverse transformation
It is clear from the above test results that when the number of carbon atoms in the alkyl group is 9 or more in new derivatives prepared according to the present invention, the L.R.C. value decreases.
This seems to be due to the fact that as the number of methylene groups in the alkyl group increases (i.e., n in the above general formula becomes larger), the hydrophobic properties of the molecule are increased, thereby facilitating the passage through cell membranes. In other experiments it was found that the new derivatives with 8 or more carbon atoms in the alkyl group are no longer effective as c-AMP against protein kinases. In the case of these derivatives, the inverse transformation of CHO-Ki (increase in the intracellular c-AMP level) is caused only by the inhibition of PDE.
2. Tests using pig tail phosphodiesterase (PDE):
In general, c-AMP is degraded to 5'-AMP by the PDE present in the cells and thus loses an activity or function as c-AMP. Because of this degradation effect of PDE, c-AMP is often ineffective in various experiments and clinical tests. Accordingly, the first property of c-AMP derivatives that are to be effective must be required to have a high level of stability with respect to the action of PDE. On the other hand, they should also have a high inhibitory effect on the enzyme, i.e. Have PDE. Accordingly, we chose PDE as the standard enzyme, extracted from the brain of pigs, which was partially purified according to the method of Teo, Wang et al. This standard enzyme did not contain any other contaminating esterase (5'-nucleotidase).
The enzyme is purified by fractionation with ammonium sulfate and passage through a DEAE cellulose column, according to the modification of the method by T.S.
Teo, T.T. Wang et al. (J. Biol. Chemi., 248, 585). The reaction mixture (10 ml) contained 40 mmoles Tris-HCl (pH = 8.0), 3 mmoles, MgCl2, 0.34.0 mmoles c-AMP, 0.5 or 1.0 mmoles of the c-AMP derivative and 82 g of the enzyme. The reaction and analysis were carried out as described by Bucher and Sutherland in J. Biol. Chemi., 237, 1244 (1962) besh.
The test results are shown in Table 3 below.
Table 3 Inhibitory effect of 8-substituted c-AMP derivatives on the hydrolysis of c-AMP by porcine brain phosphodiesterase compound inhibitor-inhibitor effect I effect II
Concentration Relative Inhibitor tration Inhibitor effect (mmol / liter) effect * constant im (%) (Ki) **
Reaction (mM) mixture c-AMP derivative 8-CH3 (CH2) 5S-c-AMP 1.0 1.0 92.4 0.019 8-CH3 (CH2) 6S-c-AMP 1.0 0.5 90 , 4 0.0095 8-CHa (CH2) 7S-c-AMP 1.0 1.0 95.0 0.016 8-CH3 (CH2) 8S-c-AMP 1.0 0.5 74.9 0.031 8-CH3 (CH2) 9S-c-AMP 1.0 0.5 68.2 0.046 8-CH3 (CH2) 10S-c-AMP 1.0 1.0 39.1 0.088 8-CH3 (CH2) 11S-c-AMP 1.0 1.0 26.4 0.14 Comments *:
The values were calculated according to the following equation: 100X (l-a / b) where a is the proportion of hydrolyzed c-AMP in the reaction mixture containing the inhibitor (the c-AMP
Derivative) and b denotes the proportion of hydrolyzed c
AMP in the reaction mixture containing no inhibitor represents.
**: Ki values were obtained from the slope of the Lineweaver-Burk
Plots and calculated from the intersection of the Dixon plot.
For the new alkylthio derivatives produced by the process according to the invention, it was found that the PDE inhibitory effect of 8-CH3 (CH2) n Sc-AMP derivatives in which n is 3 or 4 is comparable or slightly reduced , compared with that of known 8-CH3S-c-AMP and 8-CH3CH2S-c-AMP derivatives, while the PDE inhibitory effect of 8-CH3 (CH2) nS-c-AMP in which n is between 5 and 8 is much larger than that of the known alkylthio derivatives. The inhibitory activity constants of 8-CH3 (CH2) 6S-c-AMP were 9.3 mM and 9.5 mM, these values being the largest of all c-AMP derivatives synthesized to date.
To investigate the inhibitor mechanism of 8-substituted c-AMP derivatives, a Lineweaver-Burk plot was recorded for each derivative. For this, the reaction was carried out at a substrate concentration (c-AMP) of 0.3 to 4.0 mmol / liter and a derivative concentration of 0.5 mmol / liter. It has been found that all of the new derivatives corresponding to the process according to the invention have an antagonistic inhibitor mechanism. It was thus possible to prove that all new derivatives as synthesized by us have a specific inhibitory effect on the c-AMP-degrading enzyme, PDE.
In particular, the new derivatives of group II mentioned above, namely 8-CH3 (CH2) nS-c-AMP, in which n is between 5 and 8, show a higher antagonistic inhibitory action against PDE than any previously known c-AMP derivative . The new Group II derivatives are PDE inhibitors, all of which have a higher inhibitory effect than theophylline or its derivatives, which have heretofore been used as an anti-asthma agent. The derivatives of group II mentioned also only act as PDE inhibitors, since the activation effect on protein kinases is no longer present in any of the derivatives mentioned. It can therefore be expected that these new derivatives can replace theophylline as the main anti-asthma agent.
The invention relates to a process for the preparation of a compound of the formula I.
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and their non-toxic salts, in which n is an integer from 5 to 12, characterized in that an 8 halo-cycl.-adenosine monophosphate of the general formula
EMI5.2
wherein X represents a halogen atom, or an inorganic or organic salt thereof with an alkali metal salt, a linear alkyl mercaptan of the general formula CH3 (CH2) n SH wherein n is an integer from 5 to 12, is reacted.
An embodiment of the process according to the invention for the synthesis of the new c-AMP derivatives will be described in more detail below. The reaction is preferably carried out in an alcoholic solvent.
8-halo-cycl. AMP derivatives as used for the process according to the invention, e.g. 8-Bromo-c-AMP can be easily synthesized by treating c-AMP with bromine in acetic acid buffer (Ikehara, M. et al., Chem. Pharm. Bull., 17, 348 (1969)).
In this reaction, the 8-bromo-c-AMP can either be in free form or in the form of an inorganic salt such as e.g. B.
the sodium salt or a salt of an organic base such as triethylamine can be used. An alcohol is used as the solvent. An alkali metal salt of
Alkyl mercaptans are made in a conventional manner, e.g.
by reacting the alkali mercaptan in an alcohol solvent with an alkali metal alcoholate such as methoxy
Sodium or t-butoxy potassium. The proportion of the alkali metal salt of the alkyl mercaptan used is at least
1 mole, but preferably between 2 and 10 moles per mole of the
8-halogen-c-AMP. A larger excess of the alkali metal salt of the alkyl mercaptan is on the one hand for economic reasons
Reasons unfavorable and on the other hand, the further treatment of the product becomes problematic. The reaction is carried out at a temperature which corresponds to the boiling point of the solvent used.
The reaction time is strongly influenced by further reaction conditions, such as the proportion of the alkali metal salt of the alkyl mercaptan used and the type of solvent used, but generally good yields are obtained if the reaction time is between 1 and 5 hours. Too long a reaction time has the disadvantage that the desired product tends to decompose. The reaction product can easily be isolated as crystals of the free ester in a conventional manner, e.g. by concentrating the reaction mixture at 40 ° C. under reduced pressure, then adding cold water to the concentrate and adding concentrated hydrochloric acid to the solution with simultaneous cooling and stirring, whereby the pH is shifted to the acidic side.
The new 8-substituted c-AMP derivatives produced by the process according to the invention are very stable in vivo and act in vivo mainly as antagonistic inhibitors against the c-AMP-degrading enzyme PDE. Among these new derivatives, those having 6-10 carbon atoms in the alkyl group show particularly high activity as antagonistic inhibitors for PDE. Furthermore, since their protein kinase activating properties are drastically reduced, said derivatives are no longer effective as active c-AMP even when administered to a living organism. In other words, when the derivatives mentioned are administered, side effects which are caused by a direct increase in the c-AMP level can largely be avoided.
The compounds prepared by the process of the invention are useful in the treatment of a wide variety of disease states, including metabolic and endocrine disorders, since they are able to increase the intracellular level of mediators of hormonal effects. They show high biological activity and selectivity with respect to different types of tissue. In addition, they show a high stability towards degrading enzymes, e.g. cyclic phosphodiesterase.
It follows that the compounds prepared by the process of the invention are useful for the treatment of e.g. bronchial asthma, refractory congestive heart failure, diabetes mellitus, pseudohypoparathyroidism, obesity, some neoplastic manifestations, vasopressin-resistant diabetes insipidus, and other disorders attributable to adrenal dysfunction.
The compounds of the formula I produced according to the invention can be used in pharmaceutical compositions which contain a named compound as an active component in admixture with a pharmaceutically usable non-toxic carrier.
Solids, liquids or gases are suitable as pharmaceutically usable carrier substances for the production of the compositions mentioned. Accordingly, the compositions can be in the form of tablets, pills, capsules, powders, solutions, suspensions, elixirs, aerosols or the like.
Suitable carriers are e.g. B. various oils, such as petroleum, animal, vegetable or synthetic oils, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil or the like. Water, saline solutions, aqueous dextrose and glycols are the preferred liquid carriers, especially for use in injection solutions. Suitable solids are starch, cellulose, talc, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, lime, silica gel, magnesium stearate, sodium stearate, glycerol monostearate, sodium chloride, dried skimmed milk, glycerin, propylene glycol, water and the like. In each case, the compositions mentioned contain an effective dose of the active compound together with a suitable carrier so that a product is obtained which is suitable for administration.
The effective dose of the compounds mentioned for the treatment of biological disorders can generally vary between about 1 mg and 100 mg per kg of body weight, it being possible for them to be administered once or several times a day. The active compound can be administered in any suitable manner, parenterally or orally, and in any suitable administration form such as isotonic solutions, suspensions, tablets, capsules and the like (see e.g.
U.S. Patent 3,872,084).
The c-AMP derivatives of group I prepared by the process according to the invention show a very high antiasthmatic activity and consequently they can replace theophylline or its derivatives, which has been widely administered as an antiasthmatic agent to date.
The group II c-AMP derivatives prepared by the process according to the invention are antagonistic inhibitors for PDE and are far superior to the known c-AMP derivatives with regard to membrane permeability. When pharmaceutical preparations which contain the named derivatives as active ingredient are applied to skin infected with scabies or a similar skin disease, the named derivatives of group II are well absorbed and thus achieve a good healing effect. Furthermore, when administered to the living organism, the named derivatives enter the cells rapidly, even at low concentrations, and are therefore very effective.
The most widespread treatment method for scabies today is to inhibit PDE and to increase the intracellular c-AMP level. The c-AMP derivatives mentioned according to the invention are therefore very suitable for the treatment of scabies.
The synthesis of the new 8-substituted c-AMP derivatives will now be explained in more detail by the following examples.
example 1
In 60 ml of anhydrous methanol, 400 mg (18 mmol) of metallic sodium was dissolved, and 3.4 ml (24 mmol) of n-hexyl mercaptan was added to the solution. The mixture was stirred for about 30 minutes at room temperature, after which 2.46 g (6 mmol) of 8-bromo-c-AMP were added and the mixture was heated to reflux temperature with stirring for 1 hour. The reaction product obtained was concentrated at 40 ° C. and 60 ml of cold water were added to the residue. The pH was then adjusted to 6 by adding concentrated hydrochloric acid and stirring. The mixture was extracted twice with 100 ml of ether each time, and the aqueous phase was filtered and the filtrate was cooled, and concentrated hydrochloric acid was added to adjust the pH to 2. The mixture was then cooled and stirred to cause crystallization to occur.
The crystalline precipitate formed was then filtered off and washed with small portions of cold ethyl alcohol and ether in order to remove the odor of thiol. The crystals were then dried at room temperature and reduced pressure, giving 2.16 g (81% yield) of 8-n hexylmercapto-c-AMP in the form of crystals, the examination of which provided the following analytical data:
Decomposition: 225 "C. pH ,,
U.V. absorption maximum: R max 285 mk, A max3 282 mm,
285 mH mm 19.400, E2so / E260 = 0.48, E280 / E260 = 2.36 pH2
Paper chromatography (n-butanol:
: Acetic acid: water = 4: 1: 5 (upper layer)):
R value = 0.65 Elemental analysis as Ct6H24NsO6SP: Found: C, 43.24, H, 5.95, N, 15.57, S, 7.02, P, 6.73% Calculated: C, 43.14 , H, 5.43, N, 15.72, S, 7.20, P, 6.95%.
Example 2
400 mg (18 mmol) of metallic sodium were dissolved in 80 ml of ethyl alcohol, whereupon 4.2 ml (24 mmol) of n-octyl mercaptan were added to the solution. The mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, after which 2.46 g (6 mmol) of 8-bromo-c-AMP were added and the mixture was then heated to reflux with stirring for 3 hours. In the same manner as described in Example 1, the reaction product obtained was post-treated to obtain 2.32 g (82% yield) of crystalline 8-n-octylmercapto-c AMP, the analytical data of which are as follows:
Decomposition: 223 C.
UV absorption maximum:
A pH2 285 mlt, A pHo3 282 mlc, E 285 mXe 18,400, max max pH2
E2so / E260 = 0.48, E280 / E260 = 2.70
Paper chromatography (n-butanol: acetic acid: water = 4: 1: 5 upper layer): Rf value = 0.65 Elemental analysis as C1,, H28N5O6SP: Found: C, 45.43, H, 6.34, N, 14.80, S, 6.52, P, 6.38% Calculated: C, 45.66, H, 5.96, N, 14.79, S, 6.77, P, 6.54%.
Example 3
Using an analogous procedure as in Example 2, but using 3.8 ml (24 mmol) of n-heptyl mercaptan instead of 4.2 ml of n-octyl mercaptan, 2.26 g (82% yield) of crystalline 8-n- Heptylmercapto-c-AMP, the analytical data of which are as follows:
Decomposition point: 2280 C
UV absorption maximum:
A pH2 285mtcIA. 282mr285 mCC 19.300, max max pH2 E2so / E260 = 0.47, E280 / E260 = 2.45
Paper chromatography (n-butanol: acetic acid: water = 4: 1: 5 upper layer) Rf value = 0.65 Elemental analysis as Cs, H24NsO6SP: Found: C, 44.45, H, 5.98, N, 15.13 , S, 6.78, P, 6.65%. Calculated: C, 44.44, H, 5.70, N, 15.24, S, 6.98, P, 6.74%.
Example 4
In 100 ml of anhydrous t-butyl alcohol, 620 mg (20 mmol) of metallic potassium were dissolved while heating to 40.degree. Then 5.0 ml (24 mmol) of n-decyl mercaptan were added to the solution and the mixture was kept for approx.
Stirred for 20 min. Then 2.46 g (6 mmol) of 8 bromo-c-AMP were added to the mixture and the mixture was heated to reflux temperature for 1 h. The reaction product obtained was aftertreated as described in Example 1, giving 2.60 g (86% yield) of crystalline 8-n-decylmercapto-c-AMP, the analytical data of which are as follows:
Decomposition: 227 C
UV absorption maximum: # pH2 285 m, APmax3 282 m, u, epH m 17.800, max
Paper chromatography (n-butanol: acetic acid: water = 4: 1: 5 upper layer)
Rf value = 0.75 Elemental analysis as C20H32NsO6SP: Found: C, 47.64, H, 6.58, N, 13.86, S, 6.25, P, 6.07% Calculated: C, 47.90 , H, 6.43, N, 13.96, S, 6.39, P, 6.18%.
Example 5
Using a procedure analogous to Example 4, but using 5.7 ml (24 mmol) of n-dodecyl mercaptan instead of 5.0 ml of n-decyl mercaptan, 2.70 g (85% yield) of crystalline 8-n were obtained -Dodecylmercapto-c-AMP, with the following analysis data:
Decomposition: 2280 C
UV absorption maximum: # pH2 285 m, # pHa13 282 m, # 285 m 17.800, max max pH2 E250 / E260 = 0.53, E280 / E260 = 2.70
Paper chromatography (n-butanol: acetic acid: water = 4: 1: 5 upper layer): Rf value = 0.80 Elemental analysis as C22H36NsO6SP: Found: C, 49.60, H, 6.85, N, 13.02, S, 5.95, P, 5.76%. Calculated: C, 49.90, H, 6.85, N, 13.22, S, 6.05, P, 5.89%.
Example 6
Using an analogous procedure as in Example 2, but using 5.7 ml (30 mmol) of n-nonyl mercaptan instead of 4.2 ml of n-octyl mercaptan, 2.49 g (85% yield) of crystalline 8- n-Nonylmercapto-c-AMP, with the following analysis data:
Decomposition: 2250 C
UV absorption maximum: 285 m, A PH13 282 mu, e PH2 18.200, E2so / E260 = 0.49, E2so / E260 = 2.70
Paper chromatography (n-butanol: acetic acid: water = 4: 1: 5 upper layer): Rf value = 0.68 Elemental analysis: Found: C, 46.70, H, 6.45, N, 14.20, S, 6.48, P, 6.22% Calculated: C, 46.81, H, 6.20, N, 14.37, S, 6.57, P, 6.35%.
Example 7
Using an analogous procedure as in Example 1, but using 5.4 ml (24 mmol) of n-undecyl mercaptan instead of 3.4 ml of n-hexyl mercaptan, 2.32 g (75% yield) of crystalline 8-n were obtained -Undecylmercapto-n-AMP, with the following analysis data:
Decomposition: 2270 C
UV absorption maximum: A pH2 285 m, # PH13 282 m, ez e 285 mA 17.800, max max pH2 E2so / E260 = 0.52, E280 / E260 = 2.68
Paper chromatography (n-butanol: acetic acid: water = 4: 1: 5 upper layer): Rf value = 0.75 Elemental analysis as C2sH34NsO6SP: Found: C, 48.83, H, 6.80, N, 13.67, S, 6.09, P, 6.12%.
Calculated: C, 48.92, H, 6.65, N, 13.58, S, 6.22, P, 6.01%.