Die vorliegende Erfindung betrifft ein wertvolles diagnostisches Verfahren zur Bestimmung eines serologisch reaktiven Materials, sowie eine Reagenzgarnitur zur Durchführung dieses Verfahrens.
Die Diagnose von pathologischen oder anderen Zuständen in Menschen und Tieren wird oft unter Anwendung von immunologischen Prinzipien durchgeführt. Diese Prinzipien werden zum Nachweis von Antikörpern oder Antigenen in den Körperflüssigkeiten des Lebewesens benützt. Ein Antigen ist eine fremde Substanz, welche, wenn sie dem Lebewesen appliziert wird, die Bildung von gewissen löslichen und als Antikörper bezeichnete Substanzen bewirkt. Irgendeine Substanz wie z.B. ein Protein, welche normal nicht in einem bestimmten Lebewesen vorhanden ist, kann die Bildung von Antikörpern verursachen, wenn sie dem Lebewesen unter geeigneten Bedingungen appliziert wird.
Nach ihrer Bildung reagieren die Antikörper mit den Antigenen und schützen auf diese Weise, im Fall eines Bakterienoder Virus-Fremdkörpers, gegen Infektionen.
Immunologische Testverfahren beruhen auf der Antigen Antikörper-Reaktion, welche sich gewöhnlich durch Unlöslichkeit oder Agglutination manifestiert.
Im allgemeinen wird die Anwesenheit eines Antigens oder eines Antikörpers dadurch bestätigt oder bestimmt, dass man den entsprechenden Antikörper oder das entsprechende Antigen einer Körperflüssigkeit des Lebewesens, meistens Urin, Blutserum oder einen speziell behandelten Blutextrakt, zugibt.
Es können jedoch auch andere Körperflüssigkeiten verwendet werden. Man stellt die Anwesenheit des Antikörpers oder des Antigens in der Körperflüssigkeit des Lebewesens fest, wenn sich ein unlöslicher Antigen-Antikörperkomplex bildet.
Weil einige Komplexe sich nur sehr langsam bilden und sehr geringe Teilchengrössen besitzen, ist es notwendig Träger zu benützen, um sie sichtbar zu machen. Als Träger werden unter anderem Erythrocyten von Mensch und Schaf, Bakterien, Bentonit, Latexteilchen wie z.B. Polystyrol, anionische phenolische Harze und fein verteilte diazotierte Aminocellulose verwendet.
Die bekannten Träger, welche die serologisch reaktiven Materialien physikalisch binden, sind in ihren Anwendung möglichkeiten und ihrer Brauchbarkeit für immunologische Diagnoseverfahren beschränkt. weil sie eine Anzahl Nachteile aufweisen. Einige der wichtigsten Nachteile sind in vielen Fällen ein Mangel an Empfindlichkeit und oft eine geringe Stabilität. Diese Mängel sind vor allem dadurch verursacht, dass, wenn Latexteilchen mit dem serologisch reaktiven Material überzogen sind, sich ein Gleichgewicht zwischen dem freien und dem gebundenen Material einstellt. Dies hat eine kompetitive Hemmung der Reaktion zwischen dem freien und dem an die Latexteilchen gebundenen Antikörper oder Antigen und dem entsprechenden Antigen oder Antikörper zur Folge.
Weiterhin können viele negativ geladene Proteine nicht physikalisch an inerte Latexteilchen gebunden werden, ohne dass Hydrolyse oder enzymatischer Abbau eintritt. Dieses Verfahren kann Konformationsänderungen der Struktur verursachen, die für die Spezifität der Reaktion nachteilig sein können. Ferner eignen sich kleine Peptide nicht zu einer physikalischen Beschichtung von inerten Polymeren. Hierdurch wird die Anwendung dieses Verfahrens auf viele immunologische Diagnosemethoden vereitelt.
Aus diesem Grund besteht ein Bedürfnis für einen serologisch inerten Träger, welcher mit einem breiten Spektrum von serologisch reaktiven Materialien ein diagnostisch verwendbares Reagenz bilden kann, das stabil, spezifisch und empfindlich ist und eine leicht nachweisbare visuelle Bewertung in sehr kurzer Zeit ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung eines serologisch reaktiven Materials in menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, dass man die Testflüssigkeit mit einer wässrigen Suspension eines wasserunlöslichen immunoligischen Diagnose-Reagenzes mit einem etwa dem von Wasser entsprechenden spezifischen Gewicht in Form von serologisch inerten Teilchen eines Latex, an welche über Amidbindungen ein serologisch reaktives Material gebunden ist, zusammen bringt und eine allfällige Agglutination feststellt.
Weiter betrifft die vorliegende Erfindung eine Reagenziengarnitur zur Ausführung eines Verfahrens, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie aus einem Behälter besteht, der ein wasserunlösliches immunologisches Diagnose-Reagenz mit einem etwa dem von Wasser entsprechenden spezifischen Gewicht in Form von serologisch inerten Latex-Teilchen, an die über Amidbindungen ein serologisch reaktives Material gebunden ist, enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Testflüssigkeit vor dem Vermischen mit der wässrigen Suspension des wasserunlöslichen immunologischen Diagnose-Reagenz mit Anti-Serum für das zu bestimmende serologisch reaktive Material gemischt.
Es wurde festgestellt, dass viele serologisch reaktive Materialien, wie z.B. Polysaccharide, intakte Proteinmoleküle und Peptide, welche bisher nicht befriedigend physikalisch an Latexpolymerträger gebunden werden konnten, auf chemische Weise durch Ausbildung einer Amidbindung an eine gewisse Gruppe von serologisch inerten Latexpolymerträgern kovalent gebunden werden können.
Der Ausdruck < serologisch reaktive Materialien bezieht sich auf solche Materialien, die für eine serologische Bestimmung von entscheidender Bedeutung sind, d.h. die Anwesenheit dieser Materialien ist der bestimmende Faktor im serologischen Testverfahren. Diese Materialien können in Körperflüssigkeiten von Mensch und Tier unter Verwendung von immunologischen Prinzipien nachgewiesen werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung eignen sich alle serologisch reaktive Materialien, welche durch Bildung einer Amidbindung in Gegenwart von Carbodiimid als Kondensationsmittel an serologisch inerte Trägerteilchen aus Latex chemisch gebunden werden.
Besonders geeignete serologisch reaktive Materialien sind isolierte Antikörper von Mensch und Tier, Serumbestandteile, Toxine, Bakterien- und Virus-Komponenten, Hormone, Enzyme, Alkaloide, Zell- und Gewebeextrakte, Substanzen mit kleinem Molekulargewicht wie z.B. Insulin, Angiotensin und Urokinase usw.
Besonders geeignete Materialien für die erfindungsgemässen diagnostischen Bestimmungsmethoden sind menschliches Choriongonadotropin, menschliches Gamma-Globulin und menschliches Albumin.
Die Menge an serologisch reaktivem Material, das an die serologisch inerten Latexpolymer-Träger gebunden ist, beträgt in der Regel 0,01 bis 15,0 Gewichtsprozent. Jedoch wird jedes einzelne serologisch reaktive Material in einer Menge benützt, welche sich in einem diagnostischen Test am zweckmässigsten erweist. Aus diesem Grunde wird jedes Material mit dem Träger in einem Verhältnis kombiniert, welches den jeweiligen spezifischen Anforderungen am besten entspricht. Die vorliegende Erfindung umfasst deshalb die Verwendung einer solchen Menge an serologisch reaktivem Material in Kombination mit einem serologisch inerten Latexpolymer-Träger, die geeignet ist, ein für derartige diagnostische Zwecke nützliches Reagens zu liefern.
Die Ausdrücke eserologisch inerte Latexpolymere oder serologisch inerte Latexpolymer-Träger" umfassen wasserunlösliche Latexpolymere mit einer Teilchengrösse von ungefähr 0,01 bis 0,9 p und einem etwa dem von Wasser entsprechenden spezifischen Gewicht. Dies hat zur Folge, dass nach der Bindung an das serologisch reaktive Material das spe zifische Gewicht der Teilchen ungefähr 1,0 beträgt, wodurch erreicht wird, dass diese Teilchen in einer wässrigen Suspension verbleiben. Die Teilchen müssen den immunologischen diagnostischen Tests gegenüber inert sein und auch eine genügende Ladungsdichte an der Oberfläche besitzen, damit nach der Bindung mit dem serologisch reaktiven Material ihre abstossende Kräfte gross genug sind, um eine Agglutination zu verhindern.
Weiter müssen die Teilchen reaktive Gruppen besitzen, welche fähig sind eine Amidbindung mit dem serologisch reaktiven Material durch Kondensation einer primären oder sekundären Aminogruppe mit einer Carboxylgruppe zu bilden. Aus diesem Grunde können die Polymer-Träger entweder Carboxylgruppen, Aminogruppen sowie Gruppen, welche in diese umwandelbar sind oder irgendeine Kombination dieser Gruppen enthalten. Besonders geeignete Gruppen am Polymer-Träger sind solche, welche ein aktives Wasserstoffatom besitzen, wie z.B. -COOH, CO-NH2, eine Nitrilgruppe, eine sekundäre Aminogruppe, eine primäre Aminogruppe oder irgendeine Kombination derartiger Gruppen.
Die chemische Umsetzung zur Ausbildung der Amidbindung kann in Gegenwart eines wasserlöslichen Carbodiimids als Kondensationsmittel durchgeführt werden. Der Grad der Bindung des serologisch reaktiven Materials an den Trägern mittels Carbidiimiden ist abhängig von der Dichte der reaktiven Gruppen in dem Polymeren. Die Dichte der reaktiven Gruppen ist für die Durchführbarkeit der Erfindung solange nicht massgebend, als eine ausreichende Menge davon vorhanden ist, um die Bindung einer genügenden Menge von dem serologisch reaktiven Material zu gewährleisten und ein in einem diagnostischen Test nutzbares Reagenz zu liefern.
Besonders geeignete Trägerteilchen sind diejenigen, welchen Form einer wässrigen Latexsuspension mit einer Feststoffkonzentration von 40% bis 60% im Handel erhältlich sind.
Für die Zwecke dieser Erfindung eignen sich viele Arten von Latexpolymeren, vorausgesetzt, dass sie die oben erwähnten Kriterien erfüllen. Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung aller geeigneten Latexpolymeren.
Ganz besonders geeignete Latexpolymere sind carboxylierte Copolymere aus Butadien und Styrol, carboxylierte Polystyrole, carboxylierte Polystyrole mit Aminogruppen, Acrylsäure-Polymere, Methacrylsäure-Polymere, Mischpolymere aus Acrylnitril, Butadien und Styrol, Polyvinylacetatacrylate, Polyvinylpyridine, Vinychlorid-Acrylate u. dgl. Einige im Handel erhältliche Polymere, welche im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Amsco Res 4150, Amsco Res 3011 (American Mineral Spirits Co.); Dow Latex 815, Dow Latex 816, Dow Latex 620, Dow Latex 859 (The Dow Chemical Co.); Hycar 1512, Hycar 1877X8, Hycar 2600 x 120 (Goodrich Chemical Co.); Gelva 900, Lytron 612, Lytron 624 (Monsanto); Rhoplex LC40 3216, Amberlite Ultrafine (Rohm and Haas).
Bei der kovalenten Bindung von serologisch reaktiven Materialien an Trägerteilchen werden wasserlösliche Monocarbodiimide der allgemeinen Formel R-N=C=N-R' worin R und R' ein 5 oder 6gliedriger Cycloalkylrest, ein Alkylrest mit 2 bis 12 Kohlenstoffatome wie z.B. Äthyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sec.-Butyl, Isobutyl, tert.-Butyl, Amyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl und Dodecyl; ein monoarylsubstituierter niederer Alkylrest, wie z.B. Benzyl, a- und ss-Phenyläthyl; ein Monoarylrest, wie z.B.
Phenyl; Morpholinyl; Piperidyl; ein Morpholinyl-substituierter niederer Alkylrest, wie z.B. Äthylmorpholinyl; ein Piperidyl-substi tuierter niederer Alkylrest wie z.B. Äthylpiperidyl; ein Dinieder alkylamino-niederer alkylrest; und ein Pyridyl-substituierter niederer alkylrest-wie z.B. oL, ss und y Methyl- oder Äthylpyridyl bedeutet, sowie Säureadditionssalze und quaternäre Amine davon, als Kondensationsmittel benützt.
Die Carbodiimide können gemäss dem allgemeinen Verfahren von E. Schmidt, F. Hitzler und E. Lahde, Ber. 71, 1933 (1938) durch Oxydation der entsprechenden Thioharnstoffen mit Quecksilberoxyd in Aceton hergestellt werden. Die symmetrischen Thioharnstoffe können durch Umsetzung des entsprechenden Amins mit Schwefelkohlenstoff erhalten werden.
Die unsymmetrischen Thiohamstoffe können durch Umsetzung eines Amins mit einem Isothiocyanat hergestellt werden. Die Carbodiimide können auch aus den entsprechenden Harnstoffen erhalten werden.
Wie bereits erwähnt, sind wasserlösliche Carbodiimide besonders geeignet für den Zweck der vorliegenden Erfindung. Wenn das Carbodiimid eine terminale Aminogruppe besitzt, kann es durch Bildung eines Säureadditionssalzes mit einer Halogenwasserstoffsäure wie HCI, HBr oder HI, Schwefelsäure, Sulfonsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und Phosphonsäure wasserlöslich gemacht werden. Auch tertiäre Aminogruppen können durch Quaternisierung mit einem geeigneten Quaternisierungsmittel wie Methyltosylat, Methylbromid, Methyliodid, Benzylbromid, Äthyliodid, Äthylbromid, Benzyliodid, Äthyltosylat, Methylsulfat, Äthylsulfat usw. wasserlöslich gemacht werden.
Das serologisch reaktive Material kann in wässrigem Medium, vorzugsweise bei Zimmertemperatur (200C bis 25"C) mit dem Träger zur Reaktion gebracht werden. Die Tempe ratur kann jed-h auch zwischen 5"C und 40"C liegen. Um das serologisch reaktive Material mit Sicherheit an den Träger zu binden, wird eine derartige Menge an Kondensationsmittel benützt, die genügt, alle möglichen Amidbindungen mit Gewissheit zu bilden.
Im allgemeinen kann das Gewicht eines wasserlöslichen Carbodiimides 0,05 bis 2,0 Prozent des Gewichts der Teilchen betragen, jedoch wird in der Regel 1% benützt.
Der pH-Wert der Reaktionen ist wichtig. Er darf nicht so gewählt werden, dass ein Protein-Reaktionspartner denaturiert wird. In der Regel liegt der pH-Wert zwischen 5 und 7,5.
Dieser pH-Wert wird unter Verwendung von geeigneten üblichen anorganischen Puffer-Systemen wie Phosphatpuffer u.
dgl., aufrechterhalten.
Die Reaktion ist innerhalb 5 Minuten bis 24 Stunden, gewöhnlich in 4 bis 5 Stunden, vollständig abgelaufen.
Das Endprodukt ist ein wasserunlösliches Material, welches in einer wässrigen Pufferlösung vom pH-Wert 5,0 bis 8,5 suspendiert ist, wobei der pH-Wert der Lösung von dem im einzelnen verwendeten System und von den Anforderungen an die Stabilität des serologisch reaktiven Materials abhängig ist. Das spezifische Gewicht des Produktes entspricht etwa demjenigen vom Wasser, wodurch eine stabile Suspension des Produkts erreicht wird. Die Produkte können z.B. durch Zentrifugieren in Form weisser, etwas thixotropischer viskoser tonartiger Materialien isoliert werden.
Chemisch gesehen ist das Produkt eine Einzelschicht von serologisch reaktiven Material, welches auf Teilchen des serologisch inerten Trägers mittels einer Amidbindung kondensiert ist.
Ausser allfälligen Verunreinigungen, welche nicht auf die Spezifität der Reaktion einwirken, ist das serologisch reaktive Material der einzige aktive Bestandteil in dem Produkt.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung eignen sich alle Produkte, welche aus den die oben erwähnten Kriterien erfüllenden Reaktionspartnern hergestellt werden und welche selbst wiederum diesen bereits angegebenen Kriterien entsprechen.
Als Beispiele für spezifische Produkte können menschliches Choriongonadotropin, welches über eine Amidbindung an ein carboxyliertes Copolymer aus Butadiene und Styrol mit einem Monomerenverhältnis von 45% Butadien und 55% Styrol, sowie einer Dichte von Carboxylgruppen zwischen 1 und 5 Gewichtsprozent (gewöhnlich 3 Gewichtsprozent), gebunden ist, sowie menschliches Albumin, welches über eine Amidbindung an ein carboxyliertes Copolymer aus Butadiene und Styrol mit einem Monomerenverhältnis von 45% Butadiene und 55% Styrol, sowie eine Dichte von Carboxylgruppen zwischen 1 und 5 Gewichtsprozent (gewöhnlich 3 Gewichtsprozenten), gebunden ist, genannt werden.
Nach seiner Herstellung kann das Produkt in spezifischen diagnostischen Tests, welche auf immunologischen Prinzipien aufgebaut sind, verwendet werden.
Das Produkt kann in jeder vom spezifischen Test abhängigen Konzentration benützt werden, jedoch sind Konzentrationen zwischen 1 und 2,5 Gewichtsprozent geeignet, wobei eine Konzentration von 1,3 Gewichtsprozent bevorzugt ist. So kann z.B. das durch Bindung von menschlichem Choriongonadotropin an Trägerteilchen erhaltene Produkt als diagnostisches Reagenz zur Feststellung der Schwangerschaft der Frau verwendet werden. Dies kann zum Beispiel dadurch erreicht werden, dass man einen Tropfen einer Harnprobe auf ein sauberes Glasplättchen bringt, einen Tropfen anti-menschliches Choriongonadotropin-Serum zusetzt und schliesslich einen Tropfen des menschlichen Choriongonadotropin-Trägers in wässriger Suspension zugibt. Nach 2 Minuten wird das Testergebnis festgestellt. Die Genauigkeit beträgt 90 bis 98%.
Die Vorteile einer solchen Methode sind ihre Einfachheit, Schnelligkeit, Genauigkeit und die Vermeidung falscher positiver Ergebnisse. Der Grund hierfür ist, dass keine durch eine nichtspezifische Beschichtung verursachte Einwirkung von anderer Proteinen stattfindet.
Weiter kann z.B. das durch Bindung von Gammaglobulin auf Trägerteilchen erhaltene Produkt als diagnostisches Reagenz zur Feststellung, ob ein Patient unter rheumatischer Arthritis leidet, dienen. Dies kann z.B. dadurch erreicht werden, dass man das gepufferte Testserum auf ein Glasplättchen bringt u. einen Tropfen des Gammaglobulin-Träger Reagenzes in wässriger Suspension zusetzt. Die Ergebnisse werden nach einer Minute festgestellt und besitzen eine 80%ige Genauigkeit.
Die in derartigen immunologischen Testverfahren nutzbaren Reagenzien können vorteilhaft für kommerzielle Zwecke beispielsweise in eine diagnostische Testgarnitur mit zwei Behältern, der eine für das geeignete Antiserum und der andere für das durch eine Amidbindung an einen serologisch inerten Träger gebundene serologisch reaktive Material in wässriger Suspension, abgepackt werden. Die wässrige Suspension des durch eine Amidbindung an einen serologisch inerten Träger gebundene serologisch reaktive Material kann in irgendeiner Konzentration vorhanden sein. Jedoch ist eine Konzentration von 1,0 bis 2,5 Gewichtsprozent bevorzugt.
Beispiel I
377,000 internationale Einheiten von menschlichem Choriongonadotropin-Pulver in 65 ml einer sterilen Salzlösung gelöst, während 1 Stunde auf 80"C erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. 60 ml der gekühlten menschliches Choriongonadotropin enthaltenden Lösung werden schnell in einen Reaktionskolben, welcher 300 ml carboxyliertes Latex aus Styrol und Butadiene (Dow No. 816) mit einem pH-Wert von 9,3, einem spezifischen Gewicht von 1.030 und einer Viskosität von 100 Cps (gemessen in einem Brookfield No. 1 bei 20 Upm) enthält, gegossen. Die Latexkonzentration wird auf 78-82 mg/ml eingestellt. Sobald das menschliche Choriongonadotropin gleichmässig im Latex verteilt ist, wird eine Lösung von 1,8 g 1-Cyclohexyl-3-[2-mor- pholinyl-(4)-äthyl]-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat in 180 ml Wasser zugegeben.
Die Reagenzien werden während 2 Stunden bei Raumtemperatur gemischt und danach bei 25,000 g und bei 10 C zentrifugiert.
Die überstehende Lösung wird abgegossen und die erhaltenen Latexkugeln während 10 Minuten in ungefähr 400 ml Wasser gemahlen und bei 10"C während 1,5 Stunden bei 25,000 g zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird dann verworfen und die Kugeln in 400 ml eines Puffers, welcher 0,1 M Tris-HCl, 0,85 ProzentNaC1 und 0,1 Me-Amino-n-capronsäure enthält und ein pH-Wert von 8,2 besitzt, erneut suspendiert. Die gepufferte Mischung wird gemahlen und bei 100C während 1,5 Stunden bei 25.000 g zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird abgegossen und die Latexkugeln zurückgewonnen. Die Kugeln besitzen eine durchschnittliche Grösse von ungefähr 0,20 - 0,25 p ,enthalten 0,75 Gewichtsprozent menschliches Choriongonadotropin und haben ein spezifisches Gewicht von 1,01.
Das Produkt eignet sich für die Verpackung in eine diagnostische Testgarnitur, welche zwei Behälter besitzt, wovon einer den gepufferten menschlichen Choriongonadotropin Träger u. der andere anti-menschliches Choriongonadotropin.
Serum enthält. Die geeignete Menge des menschlichen Choriongonadotropin-Trägers im entsprechenden Behälter der Testgarnitur ist 2,2 ml und die Konzentration 13,5 mg/ml in einem aus Tris-HC1, NaCI und e-Amino-n-Capronsäure bestehenden Puffer vom pH-Wert 8,2 und 0,01 Prozent Thimerosal. Das anti-menschliche Choriongonadotropin-Serum wird in einem Verhältnis von ungefähr 1 zu 60, in eine 0,1 M Tris, 0,85 Prozent NaCI, 0,1 M e-Amino-n-Capronsäure, 1 Prozent Rinderalbumin und 0,1 Prozent Na N2 enthaltende, gepufferte Lösung vom pH-Wert 7,9 - 8,2, verdünnt.
Das anti-menschliche Choriongonadotropin-Serum wird durch bekannte Methoden von Kaninchen erhalten. Zu diesem Zweck werden die Kaninchen mit menschlichem Choriongonadotropin immunisiert, das anti-Serum gewonnen, der Titer bestimmt und schliesslich zur Verwendung aufbewahrt.
Beispiel 2
2 ml einer 6-prozentigen Suspension menschlichen Albumins wird mit 50 ml destilliertem Wasser verdünnt und während 10 Minuten gerührt. Es werden 8 ml carboxyliertes Copolymer aus Butadiene und Styrol sowie 50 Prozent Feststoffe (Dow 816) zugesetzt und weitere 37 ml eines 0,1 M Phosphat- puffers vom pH-Wert 5,5 zugegeben. Die Mischung wird während 10 Minuten gerührt und es werden 160 ml einer l-prozentigen wässrigen Lösung von 1-Cyclohexyl-3-[2-mor- pholinyl-(4)-äthylj-carbodiimid-metlio-p.toluolsulfonat zugefügt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Das Produkt wird durch zentrifugieren in Form einer tonartigen, weissen Masse, welche aus Teilchen mit einer Teilchengrösse von ungefähr 0,2 p besteht, ein spezifisches Gewicht von 1,01 besitzt und 10 Gewichtsprozent menschliches Albumin enthält, zurückgewonnen.
Das Produkt wird in einer mit 0,1 M Tris-HCI auf einen pH-Wert von 7,2-7,4 gepufferten Salzlösung suspendiert, die 0,1% Carboxymethylcellulose enthält. Es entsteht eine milchige weisse Suspension, welche sich für die Verpackung in diagnostischen Garnituren eignet.
Das Produkt wird in eine diagnostische Testgarnitur mit zwei Behältern, wovon einer eine gepufferte, wässrige Albumin-Träger Suspension in einer Konzentration von 1,8 mg/ml und der andere genau verdünntes anti-menschliches Albumin Serum von der Ziege enthält. Jeder Behälter enthält ungefähr
1 bis 2 ml Reagenz.
Die gemäss diesem Beispiel hergestellten Reagenzien können in dem auf menschliches Albumin in Mekonium gerichteten Test wie folgt verwendet werden:
2 ml anti-menschliches Albumin-Serum werden in ein Reagenzglas gegeben, dann wird unter Rühren 1 ml Mekonium (Volumenverhältnis 1: 50) in Kochsalzlösung zugegeben und während 10 Minuten bei 370C inkubiert. Es werden dann zwei Tropfen der Albumin-Träger Suspension unter Rühren zugesetzt. Nach einer Stunde bei 370C werden die Ergebnisse des Tests abgelesen. Eine Agglutination zeigt, dass weniger als 16 p/ml Albumin in dem Mekonium anwesend waren und keine Agglutination zeigt, dass Albumin in einer Konzentration von 16 ,a/ml oder höher vorhanden war.
Diese Menge menschliches Albumin in Mekonium ist ungewöhnlich hoch und es können weitere Tests durchgeführt werden, um das Vorhandensein eines anormalen oder kranken Zustandes wie z.B. zystische Fibrose festzustellen.
Beispiel 3
Denaturiertes Gammaglobulin wird hergestellt, indem man eine Cohn Fraktion II in einer Konzentration yon 1 Prozent in destilliertem Wasser suspendiert. Die Suspension wird über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen und dann während 30 Minuten bei 10.000 Upm zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird abgegossen und durch Whatman Papier No. 1 filtriert.
20 ml einer 1:10 wässrigen Suspension von Acrylnitril Latex (Hycar-Latex 1571) werden mit 20 ml denaturiertem 1 prozentigem Gammaglobulin (hergestellt wie vorstehend beschrieben) gemischt. Dann werden 10 ml einer l-prozentigen Lösung von l-Cyclohexyl-3-[2-morpholinyl-(4)-äthyl]-carbo- diimid-metho-p-toluolsulfonat zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird während 10 Minuten in einem Wasserbad bei einer Temperatur von 560C erhitzt. Die erhaltene Suspension wird während einer Stunde bei 15.000 Upm zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird abgegossen und der Rückstand in 50 ml von 0,1 M Glycin-Kochsalz-Puffer vom pH-Wert 8,2 wieder suspendiert.
Die Suspension wird nochmals zentrifugiert und der Rückstand in Form eines Materials, welches aus weissen tonartigen Teilchen mit einer Durchschnittsgrösse von 0,09 p besteht, 0,01 bis 1 Prozent Gammaglobulin enthält und ein spezifisches Gewicht von 1,01 besitzt, zurückgewonnen.
Die Gammaglobulin-Träger-Teilchen werden in einen 0,1 M Glycin-Kochsalz-Puffer vom pH-Wert 8,2 suspendiert und in einem diagnostischen immunologischen Test für rheuma ähnliche Arthritis wie folgt verwendet:
50 Mikroliter Testserum werden auf ein sauberes Glasplättchen aufgetragen. Es wird ein Tropfen 0,1 M Glycin Kochsalz-Puffer vom pH-Wert 8,2 zugegeben und mit einem Holzstäbchen gemischt. Dann werden zwei Tropfen des hergestellten Reagenzes zugefügt und die Reagenzien nochmals gemischt. Das Plättchen wird während einer Minute leicht geschaukelt. Schliesslich wird das Ergebnis des Tests beobachtet. Eine Agglutination am Plättchen ist ein Zeichen, dass das Serum einen Rheumatoid-Faktor enthält, keine Agglutination zeigt, dass das Serum von diesem Faktor frei ist.
PATENTANSPRUCH I
Verfahren zur Bestimmung eines serologisch reaktiven Materials in menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, dass man die Testflüssigkeit mit einer wässrigen Suspension eines wasserunlöslichen immunologischen Diagnose-Reagenzes mit einem etwa dem von Wasser entsprechenden spezifischen Gewicht in Form von serologisch inerten Teilchen eines Latex, an welche über Amidbindungen ein serologisch reaktives Material gebunden ist, zusammen bringt und eine allfällige Agglutination feststellt.
UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man die Testflüssigkeit vor dem Vermischen mit der wässrigen Suspension des wasserunlöslichen immunologischen Diagnose-Reagenz mit Anti-Serum für das zu bestimmende serologisch reaktive Material mischt.
2. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das an die inerten Latex-Teilchen gebundene serologisch reaktive Material menschliches Choriongonadotropin ist.
3. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das an die inerten Latex-Teilchen gebundene serologisch reaktive Material menschliches Albumin ist.
4. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das an die inerten Latex-Teilchen gebundene serologisch reaktive Material denaturiertes Gammaglobulin ist.
5. Verfahren nach Patentanspruch I oder einem der Unteransprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die serologisch inerten Latex-Teilchen ein etwa dem von Wasser entsprechendes spezifisches Gewicht und eine Teilchengrösse von ungefähr 0,01 bis 0,9 > besitzt.
6. Verfahren nach Patentanspruch I oder einem der Unteransprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge des an die serologisch inerten Latex-Teilchen gebundene serologisch aktive Material 0,01 bis 15,0 Gewichtsprozent beträgt.
7. Verfahren nach Patentanspruch I oder einem der Unteransprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die serologisch inerten Latex-Teilchen aus einem wasserunlöslichen Copolymer aus Styrol und Butadien, welches reaktive Carboxylgruppen besitzt, bestehen.
8. Verfahren nach Patentanspruch I oder einem der Unteransprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die serologisch inerten Latex-Teilchen aus einem wasserunlöslichen Mischpolymer aus Acrylnitril, Butadien und Styrol bestehen.
PATENTANSPRUCH II
Reagenziengarnitur zur Ausführung des Verfahrens gemäss Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einem Behälter besteht, der ein wasserunlösliches immunologisches Diagnose-Reagenz mit einem etwa dem von Wasser entsprechenden spezifischen Gewicht in Form von serologisch inerten Latex-Teilchen, an die über Amidbindungen ein serologisch reaktives Material gebunden ist, enthält.
UNTERANSPRÜCHE
9. Reagenziengarnitur nach Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen zweiten Behälter mit Anti Serum für das zu bestimmende serologisch reaktive Material enthält.
10. Reagenziengarnitur nach Patentanspruch II oder Unteranspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Behälter ein diagnostisches Reagenz bestehend aus Teilchen eines wasserunlöslichen carboxylierten Copolymer aus Styrol und Butadien mit einem etwa dem von Wasser entsprechenden spezifischen Gewicht und einer Teilchengrösse von 0,01 bis 0,9 ,a, an die über Amidbindungen menschliches Choriongonadotropin gebunden ist, enthält und der zweite Behälter antimenschliches Choriongonadotropin-Serum enthält.
11. Reagenziengarnitur nach Patentanspruch II oder Unteranspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Behälter
**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.
The present invention relates to a valuable diagnostic method for determining a serologically reactive material, as well as a reagent set for carrying out this method.
Diagnosis of pathological or other conditions in humans and animals is often made using immunological principles. These principles are used to detect antibodies or antigens in the body fluids of the living being. An antigen is a foreign substance which, when applied to the living being, causes the formation of certain soluble substances known as antibodies. Any substance such as a protein which is not normally present in a certain living being can cause the formation of antibodies if it is applied to the living being under suitable conditions.
After their formation, the antibodies react with the antigens and in this way protect against infections in the case of a bacterial or virus foreign body.
Immunological test methods rely on the antigen-antibody response, which is usually manifested by insolubility or agglutination.
In general, the presence of an antigen or an antibody is confirmed or determined by adding the corresponding antibody or the corresponding antigen to a body fluid of the living being, usually urine, blood serum or a specially treated blood extract.
However, other body fluids can also be used. The presence of the antibody or antigen in the body fluid of the living being is determined when an insoluble antigen-antibody complex is formed.
Because some complexes form very slowly and have very small particle sizes, it is necessary to use carriers to visualize them. Among other things, erythrocytes from humans and sheep, bacteria, bentonite, latex particles such as e.g. Polystyrene, anionic phenolic resins and finely divided diazotized aminocellulose are used.
The known carriers, which physically bind the serologically reactive materials, are limited in their application possibilities and their usefulness for immunological diagnostic methods. because they have a number of disadvantages. Some of the main drawbacks in many cases are a lack of sensitivity and often poor stability. These deficiencies are mainly caused by the fact that when latex particles are coated with the serologically reactive material, a balance is established between the free and the bound material. This results in a competitive inhibition of the reaction between the free antibody or antigen bound to the latex particles and the corresponding antigen or antibody.
Furthermore, many negatively charged proteins cannot be physically bound to inert latex particles without hydrolysis or enzymatic degradation occurring. This procedure can cause conformational changes in the structure which can be detrimental to the specificity of the reaction. Furthermore, small peptides are not suitable for a physical coating of inert polymers. This prevents the application of this method to many immunological diagnostic methods.
For this reason, there is a need for a serologically inert carrier which can form a diagnostically useful reagent with a wide range of serologically reactive materials that is stable, specific, and sensitive, and allows easily detectable visual assessment in a very short time.
The present invention relates to a method for determining a serologically reactive material in human or animal body fluids, characterized in that the test fluid is mixed with an aqueous suspension of a water-insoluble immunological diagnostic reagent with a specific gravity corresponding approximately to that of water in the form of serologically inert particles Brings together latex, to which a serologically reactive material is bound via amide bonds, and detects any agglutination.
The present invention further relates to a reagent set for carrying out a method, which is characterized in that it consists of a container which contains a water-insoluble immunological diagnostic reagent with a specific weight approximately corresponding to that of water in the form of serologically inert latex particles which is bound to a serologically reactive material via amide bonds. In a preferred embodiment, the test liquid is mixed with anti-serum for the serologically reactive material to be determined before mixing with the aqueous suspension of the water-insoluble immunological diagnostic reagent.
It has been found that many serologically reactive materials, e.g. Polysaccharides, intact protein molecules and peptides, which hitherto could not be satisfactorily bound physically to latex polymer carriers, can be covalently bound to a certain group of serologically inert latex polymer carriers in a chemical manner by forming an amide bond.
The term <serologically reactive materials refers to those materials that are critical to a serological determination, i.e. the presence of these materials is the determining factor in the serological test procedure. These materials can be detected in human and animal body fluids using immunological principles. For the purposes of the present invention, all serologically reactive materials are suitable which are chemically bonded to serologically inert carrier particles made of latex by the formation of an amide bond in the presence of carbodiimide as a condensing agent.
Particularly suitable serologically reactive materials are isolated antibodies from humans and animals, serum components, toxins, bacterial and virus components, hormones, enzymes, alkaloids, cell and tissue extracts, substances with a small molecular weight such as e.g. Insulin, angiotensin and urokinase etc.
Particularly suitable materials for the diagnostic determination methods according to the invention are human chorionic gonadotropin, human gamma globulin and human albumin.
The amount of serologically reactive material bound to the serologically inert latex polymer carrier is typically from 0.01 to 15.0 percent by weight. However, each serologically reactive material is used in an amount that is most useful in a diagnostic test. For this reason, each material is combined with the carrier in a ratio that best suits the specific requirements. The present invention therefore encompasses the use of such an amount of serologically reactive material in combination with a serologically inert latex polymer carrier that is suitable to provide a reagent useful for such diagnostic purposes.
The terms "serologically inert latex polymers or serologically inert latex polymer carriers" encompass water-insoluble latex polymers having a particle size of approximately 0.01-0.9 μm and a specific gravity approximately that of water. This has the consequence that after binding to the serologically reactive material, the specific weight of the particles is approximately 1.0, which means that these particles remain in an aqueous suspension.The particles must be inert to the immunological diagnostic tests and also have a sufficient charge density on the surface so that after the Binding with the serologically reactive material, their repulsive forces are large enough to prevent agglutination.
Furthermore, the particles must have reactive groups which are capable of forming an amide bond with the serologically reactive material by condensation of a primary or secondary amino group with a carboxyl group. For this reason, the polymer carriers can contain either carboxyl groups, amino groups and groups which can be converted into them, or any combination of these groups. Particularly suitable groups on the polymer support are those which have an active hydrogen atom, e.g. -COOH, CO-NH2, a nitrile group, a secondary amino group, a primary amino group, or any combination of such groups.
The chemical reaction to form the amide bond can be carried out in the presence of a water-soluble carbodiimide as a condensing agent. The degree of binding of the serologically reactive material to the carrier by means of carbidiimides depends on the density of the reactive groups in the polymer. The density of the reactive groups is not decisive for the feasibility of the invention as long as a sufficient amount thereof is present to ensure the binding of a sufficient amount of the serologically reactive material and to provide a reagent which can be used in a diagnostic test.
Particularly suitable carrier particles are those which are commercially available in the form of an aqueous latex suspension with a solids concentration of 40% to 60%.
Many types of latex polymers are suitable for the purposes of this invention provided they meet the criteria mentioned above. The present invention encompasses the use of all suitable latex polymers.
Very particularly suitable latex polymers are carboxylated copolymers of butadiene and styrene, carboxylated polystyrenes, carboxylated polystyrenes with amino groups, acrylic acid polymers, methacrylic acid polymers, mixed polymers of acrylonitrile, butadiene and styrene, polyvinyl acetate acrylates, polyvinyl pyridines, vinyl chloride acrylates and the like. The like. Some commercially available polymers which can be used in connection with the present invention are Amsco Res 4150, Amsco Res 3011 (American Mineral Spirits Co.); Dow Latex 815, Dow Latex 816, Dow Latex 620, Dow Latex 859 (The Dow Chemical Co.); Hycar 1512, Hycar 1877X8, Hycar 2600 x 120 (Goodrich Chemical Co.); Gelva 900, Lytron 612, Lytron 624 (Monsanto); Rhoplex LC40 3216, Amberlite Ultrafine (Rohm and Haas).
When serologically reactive materials are covalently bonded to carrier particles, water-soluble monocarbodiimides of the general formula R-N = C = N-R 'in which R and R' are a 5 or 6-membered cycloalkyl radical, an alkyl radical with 2 to 12 carbon atoms, e.g. Ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl, isobutyl, tert-butyl, amyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl and dodecyl; a monoaryl-substituted lower alkyl radical, e.g. Benzyl, a- and ss-phenylethyl; a monoaryl radical, e.g.
Phenyl; Morpholinyl; Piperidyl; a morpholinyl-substituted lower alkyl radical, e.g. Ethylmorpholinyl; a piperidyl-substituted lower alkyl radical such as e.g. Ethylpiperidyl; a di-lower alkylamino-lower alkyl radical; and a pyridyl-substituted lower alkyl radical - e.g. oL, ss and y denote methyl or ethyl pyridyl, as well as acid addition salts and quaternary amines thereof, used as condensing agents.
The carbodiimides can be prepared according to the general method of E. Schmidt, F. Hitzler and E. Lahde, Ber. 71, 1933 (1938) by oxidizing the corresponding thioureas with mercury oxide in acetone. The symmetrical thioureas can be obtained by reacting the corresponding amine with carbon disulfide.
The unsymmetrical thioureas can be produced by reacting an amine with an isothiocyanate. The carbodiimides can also be obtained from the corresponding ureas.
As already mentioned, water-soluble carbodiimides are particularly suitable for the purpose of the present invention. When the carbodiimide has a terminal amino group, it can be made water-soluble by forming an acid addition salt with a hydrohalic acid such as HCl, HBr or HI, sulfuric acid, sulfonic acid, nitric acid, phosphoric acid and phosphonic acid. Tertiary amino groups can also be made water-soluble by quaternizing with a suitable quaternizing agent such as methyl tosylate, methyl bromide, methyl iodide, benzyl bromide, ethyl iodide, ethyl bromide, benzyl iodide, ethyl tosylate, methyl sulfate, ethyl sulfate, etc.
The serologically reactive material can be reacted with the carrier in an aqueous medium, preferably at room temperature (200 ° C. to 25 ° C.). The temperature can also be between 5 ° C. and 40 ° C. Around the serologically reactive material To bond with certainty to the support, such an amount of condensing agent is used that is sufficient to form all possible amide bonds with certainty.
In general, the weight of a water soluble carbodiimide can be 0.05 to 2.0 percent of the weight of the particles, but 1% is typically used.
The pH of the reactions is important. It must not be chosen in such a way that a protein reaction partner is denatured. Usually the pH is between 5 and 7.5.
This pH value is measured using suitable conventional inorganic buffer systems such as phosphate buffer and the like.
like., maintained.
The reaction is complete in 5 minutes to 24 hours, usually in 4 to 5 hours.
The end product is a water-insoluble material which is suspended in an aqueous buffer solution with a pH of 5.0 to 8.5, the pH of the solution depending on the particular system used and the requirements for the stability of the serologically reactive material is dependent. The specific weight of the product roughly corresponds to that of water, which results in a stable suspension of the product. The products can e.g. isolated by centrifugation in the form of white, somewhat thixotropic viscous clay-like materials.
From a chemical point of view, the product is a single layer of serologically reactive material which is condensed onto particles of the serologically inert carrier by means of an amide bond.
Apart from any impurities that do not affect the specificity of the reaction, the serologically reactive material is the only active ingredient in the product.
For the purposes of the present invention, all products are suitable which are produced from the reactants which meet the criteria mentioned above and which in turn meet these criteria already given.
As examples of specific products, human chorionic gonadotropin, which is bound via an amide bond to a carboxylated copolymer of butadiene and styrene with a monomer ratio of 45% butadiene and 55% styrene, and a density of carboxyl groups between 1 and 5 percent by weight (usually 3 percent by weight) as well as human albumin, which is bound via an amide bond to a carboxylated copolymer of butadienes and styrene with a monomer ratio of 45% butadienes and 55% styrene, and a density of carboxyl groups between 1 and 5 percent by weight (usually 3 percent by weight) will.
Once manufactured, the product can be used in specific diagnostic tests based on immunological principles.
The product can be used in any concentration depending on the specific test, but concentrations between 1 and 2.5 percent by weight are suitable, with a concentration of 1.3 percent by weight being preferred. E.g. the product obtained by binding human chorionic gonadotropin to carrier particles can be used as a diagnostic reagent for determining the pregnancy of the woman. This can be achieved, for example, by placing a drop of a urine sample on a clean glass slide, adding a drop of anti-human chorionic gonadotropin serum and finally adding a drop of the human chorionic gonadotropin carrier in aqueous suspension. The test result is determined after 2 minutes. The accuracy is 90 to 98%.
The advantages of such a method are its simplicity, speed, accuracy and avoidance of false positives. The reason for this is that there is no exposure to other proteins caused by a non-specific coating.
Further e.g. the product obtained by binding gamma globulin on carrier particles can serve as a diagnostic reagent for determining whether a patient suffers from rheumatoid arthritis. This can e.g. can be achieved by placing the buffered test serum on a glass slide and the like. one drop of the gamma globulin carrier reagent in aqueous suspension is added. The results are found after one minute and are 80% accurate.
The reagents that can be used in such immunological test methods can advantageously for commercial purposes, for example, be packaged in a diagnostic test kit with two containers, one for the suitable antiserum and the other for the serologically reactive material bound by an amide bond to a serologically inert carrier in aqueous suspension . The aqueous suspension of the serologically reactive material bound by an amide bond to a serologically inert carrier can be present in any concentration. However, a concentration of 1.0 to 2.5 percent by weight is preferred.
Example I.
377,000 international units of human chorionic gonadotropin powder are dissolved in 65 ml of sterile saline solution, heated to 80 "C for 1 hour and then cooled to room temperature. 60 ml of the cooled solution containing human chorionic gonadotropin are quickly transferred to a reaction flask which contains 300 ml of carboxylated latex Styrene and butadienes (Dow No. 816) with a pH of 9.3, a specific gravity of 1030 and a viscosity of 100 cps (measured in a Brookfield No. 1 at 20 rpm). The latex concentration is increased 78-82 mg / ml. As soon as the human chorionic gonadotropin is evenly distributed in the latex, a solution of 1.8 g of 1-cyclohexyl-3- [2-morpholinyl- (4) -ethyl] -carbodiimide-metho- p-toluenesulfonate in 180 ml of water was added.
The reagents are mixed for 2 hours at room temperature and then centrifuged at 25,000 g and 10 ° C.
The supernatant solution is poured off and the latex spheres obtained are ground for 10 minutes in approximately 400 ml of water and centrifuged at 10 ° C. for 1.5 hours at 25,000 g. The supernatant solution is then discarded and the spheres in 400 ml of a buffer containing 0 , Contains 1 M Tris-HCl, 0.85 percent NaCl and 0.1 Me-amino-n-caproic acid and has a pH of 8.2, resuspended The buffered mixture is milled and at 100 ° C. for 1.5 hours centrifuged at 25,000 g. The supernatant solution is poured off and the latex spheres recovered. The spheres have an average size of about 0.20-0.25 p, contain 0.75 percent by weight of human chorionic gonadotropin and have a specific gravity of 1.01.
The product is suitable for packaging in a diagnostic test kit which has two containers, one of which is the buffered human chorionic gonadotropin carrier and the like. the other anti-human chorionic gonadotropin.
Contains serum. The appropriate amount of the human chorionic gonadotropin carrier in the corresponding container of the test kit is 2.2 ml and the concentration is 13.5 mg / ml in a pH value 8 buffer consisting of Tris-HCl, NaCl and e-amino-n-caproic acid , 2 and 0.01 percent thimerosal. The anti-human chorionic gonadotropin serum is in a ratio of approximately 1 to 60, in a 0.1 M Tris, 0.85 percent NaCl, 0.1 M e-amino-n-caproic acid, 1 percent bovine albumin and 0.1 Buffered solution of pH 7.9 - 8.2 containing percent Na N2, diluted.
The anti-human chorionic gonadotropin serum is obtained from rabbits by known methods. For this purpose the rabbits are immunized with human chorionic gonadotropin, the anti-serum is obtained, the titer is determined and finally stored for use.
Example 2
2 ml of a 6 percent suspension of human albumin is diluted with 50 ml of distilled water and stirred for 10 minutes. 8 ml of carboxylated copolymer of butadienes and styrene and 50 percent solids (Dow 816) are added and a further 37 ml of a 0.1 M phosphate buffer with a pH of 5.5 are added. The mixture is stirred for 10 minutes and 160 ml of a 1 percent aqueous solution of 1-cyclohexyl-3- [2-morpholinyl- (4) -ethylj-carbodiimide-methyl-p-toluenesulfonate are added. The reaction mixture is stirred at room temperature overnight.
The product is recovered by centrifugation in the form of a clay-like, white mass which consists of particles with a particle size of approximately 0.2 p, a specific gravity of 1.01 and contains 10% by weight of human albumin.
The product is suspended in a saline solution which is buffered to pH 7.2-7.4 with 0.1 M Tris-HCl and contains 0.1% carboxymethyl cellulose. A milky white suspension is created, which is suitable for packaging in diagnostic sets.
The product is put into a diagnostic test kit with two containers, one of which contains a buffered, aqueous albumin carrier suspension at a concentration of 1.8 mg / ml and the other precisely diluted anti-human albumin serum from the goat. Each container contains approximately
1 to 2 ml of reagent.
The reagents prepared according to this example can be used in the assay for human albumin in meconium as follows:
2 ml of anti-human albumin serum are placed in a test tube, then 1 ml of meconium (volume ratio 1:50) in saline is added with stirring and incubated for 10 minutes at 370C. Two drops of the albumin-carrier suspension are then added with stirring. After one hour at 37 ° C., the results of the test are read. Agglutination shows that less than 16 p / ml albumin was present in the meconium and no agglutination shows that albumin was present at a concentration of 16. a / ml or higher.
The amount of human albumin in meconium is abnormally high and further tests can be done to determine the presence of an abnormal or diseased condition such as detect cystic fibrosis.
Example 3
Denatured gamma globulin is prepared by suspending a Cohn fraction II at a concentration of 1 percent in distilled water. The suspension is left to stand overnight at room temperature and then centrifuged for 30 minutes at 10,000 rpm. The supernatant solution is poured off and replaced by Whatman paper no. 1 filtered.
20 ml of a 1:10 aqueous suspension of acrylonitrile latex (Hycar latex 1571) are mixed with 20 ml of denatured 1 percent gamma globulin (prepared as described above). Then 10 ml of a 1 percent solution of 1-cyclohexyl-3- [2-morpholinyl- (4) -ethyl] -carbodiimide-metho-p-toluenesulfonate are added. The reaction mixture is heated in a water bath at a temperature of 560 ° C. for 10 minutes. The suspension obtained is centrifuged for one hour at 15,000 rpm. The supernatant solution is poured off and the residue is resuspended in 50 ml of 0.1 M glycine saline buffer of pH 8.2.
The suspension is centrifuged again and the residue is recovered in the form of a material which consists of white clay-like particles with an average size of 0.09 p, contains 0.01 to 1 percent gamma globulin and has a specific gravity of 1.01.
The gamma globulin carrier particles are suspended in 0.1 M glycine saline buffer, pH 8.2, and used in a diagnostic immunological test for rheumatoid arthritis as follows:
50 microliters of test serum are applied to a clean glass slide. A drop of 0.1 M glycine saline buffer of pH 8.2 is added and mixed with a wooden stick. Then two drops of the prepared reagent are added and the reagents are mixed again. The plate is rocked gently for one minute. Finally, the result of the test is observed. An agglutination on the platelet is a sign that the serum contains a rheumatoid factor, no agglutination shows that the serum is free of this factor.
PATENT CLAIM I
Method for determining a serologically reactive material in human or animal body fluids, characterized in that the test fluid is mixed with an aqueous suspension of a water-insoluble immunological diagnostic reagent with a specific gravity approximately corresponding to that of water in the form of serologically inert particles of a latex, to which A serologically reactive material is bound via amide bonds, brings it together and detects any agglutination.
SUBCLAIMS
1. The method according to claim I, characterized in that the test liquid is mixed before mixing with the aqueous suspension of the water-insoluble immunological diagnostic reagent with anti-serum for the serologically reactive material to be determined.
2. The method according to claim I or dependent claim 1, characterized in that the serologically reactive material bound to the inert latex particles is human chorionic gonadotropin.
3. The method according to claim I or dependent claim 1, characterized in that the serologically reactive material bound to the inert latex particles is human albumin.
4. The method according to claim I or dependent claim 1, characterized in that the serologically reactive material bound to the inert latex particles is denatured gamma globulin.
5. The method according to claim 1 or one of the subclaims 1 to 4, characterized in that the serologically inert latex particles have a specific weight approximately corresponding to that of water and a particle size of approximately 0.01 to 0.9>.
6. The method according to claim I or one of the dependent claims 1 to 4, characterized in that the amount of the serologically active material bound to the serologically inert latex particles is 0.01 to 15.0 percent by weight.
7. The method according to claim I or one of the dependent claims 1 to 4, characterized in that the serologically inert latex particles consist of a water-insoluble copolymer of styrene and butadiene which has reactive carboxyl groups.
8. The method according to claim I or one of the dependent claims 1 to 4, characterized in that the serologically inert latex particles consist of a water-insoluble copolymer of acrylonitrile, butadiene and styrene.
PATENT CLAIM II
Reagent set for carrying out the method according to claim 1, characterized in that it consists of a container which contains a water-insoluble immunological diagnostic reagent with a specific weight approximately corresponding to that of water in the form of serologically inert latex particles, to which a serologically reactive material is bound, contains.
SUBCLAIMS
9. reagent set according to claim II, characterized in that it contains a second container with anti-serum for the serologically reactive material to be determined.
10. Reagent set according to claim II or dependent claim 9, characterized in that the first container contains a diagnostic reagent consisting of particles of a water-insoluble carboxylated copolymer of styrene and butadiene with a specific weight approximately corresponding to that of water and a particle size of 0.01 to 0, 9, a, to which human chorionic gonadotropin is bound via amide bonds, and the second container contains anti-human chorionic gonadotropin serum.
11. reagent set according to claim II or dependent claim 9, characterized in that the first container
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