Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Mastitis-lmmunoglobulin, das sich zur Behandlung von Kühen, Mutterschafen und Mutterziegen gegen Mastitis eignet, wobei die Behandlung entweder therapeutisch oder prophylaktisch erfolgen kann.
Mastitis ist eine der bei Kühen am häufigsten auftretenden Krankheiten. Neben den schweren Verlusten, die Milcherzeuger und folglich die Milchindustrie als Folge kranker Euter und einer verminderten Milchproduktion erleiden.
stellt auch die Verwendung einer infizierten Milch ein ernstes Gesundheitsproblem dar.
Es ist daher nicht überraschend, dass man sich bereits während der letzten 10-15 Jahre in der ganzen Welt mit der Erforschung der Bekämpfung der Mastitis befasste. Obwohl Antibiotika in grossen Mengen zur Bekämpfung und zur Verhindening dieser Krankheit eingesetzt werden und auch hygienische Massnahmen angewendet und Impfungen durchgeführt werden, so nimmt dennoch diese Krankheit in steigendem Masse zu.
Eine aktive Immunität durch systematisches Impfen der Kühe mit einem Impfstoff lässt sich nicht erreichen. Impfstoffe können in dem Blut zirkulierende Antikörper erzeugen. Jedoch können die Sera Agglutinin oder Precipitin in dem Blut nicht von dem Euter aufgenommen werden, so dass sie nicht dazu geeignet sind. Mastitis zu verhindern.
Antibiotika sind nur als Additive von Wert und sind allein nicht dazu in der Lage. Mastitis zu bekämpfen. und zwar infolge verschiedener Nachteile.
Schmalbandantibiotika. beispielsweise Penicillin. sind heute von geringerem Wert, da ihre Wirkung auf bestimmte Organismengruppen beschränkt ist, beispielsweise auf grampositive Organismen. während Mastitis eine komplizierte Infektionskrankheit darstellt. Dies gilt sowohl für Penicillin G.
das halbsynthetische Penicillin. als auch für andere Schmalbandantibiotika.
Die verfügbaren Breitbandantibiotika oder Kombinationen von Schmalbandantibiotika mit Breitbandantibiotika sind ebenfalls nicht immer wirksam und ausserdem zu teuer, um in breitem Umfange eingesetzt werden zu können. Nicht alle Breitbandantibiotika können miteinander vermischt werden. und zwar wegen ihrer antagonistischen Wirkung. Andere Breitbandantibiotika eignen sich nicht für eine Verabreichung in die Euter.
Die verbreitete Verwendung von Antibiotika hat Gegeninfektionen sowie die Entwicklung resistenter Organismen, die zuvor empfindlich waren, zur Folge. Dies gilt sowohl für die Schmalband- als auch für die Breitbandantibiotika.
Zusätzlich ist die Abscheidung von Antibiotika in die Milch unerwünscht.
Das Problem der Mastitis tritt auch bei anderen Tieren auf, insbesondere Mutterschafen und Mutterziegen. Ist daher im folgenden von Kühen die Rede, so sollen darunter auch Mutterschafe und Mutterziegen verstanden werden.
Es bestand daher ein grosser Bedarf für Produkte, die sich in wirtschaftlicher Weise herstellen lassen und zur Verwendung für eine Bekämpfung von Mastitis von Kühen geeignet sind. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, ein solches Produkt. nämlich Mastitis-lmmunoglobulin. herzustellen.
Immunoglobulin ist bekanntlich ein Gamma-Globulin, welches Träger der Antikörper-Funktion ist.
Das Verfahren zur Herstellung von Mastitis-lmmunoglobulin nach der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet. dass man Kühe. Ziegen oder Schafe mit Mastitis-Erregern infiziert. das Blut der entsprechende Antikörper enthaltenden infizierten Tiere sammelt, mit einem Antikoagulans und einem Antihaemolytikum zusammenbringt, zur Trennung des Plasmas von den Blutkörperchen zentrifugiert, das Plasma mit einem Blutkoagulans behandelt, das geronnene Material vom Serum abtrennt und das Gamma-Globulin als Träger der Antikörper-Funktion sodann durch Ausfällen von den übrigen Bestandteilen des Serums abtrennt.
Mit Vorteil wird Blut von einer Vielzahl von Kiihen verwendet, so dass ein vielseitig wirkendes Produkt entsteht.
Das erfindungsgemäss erhaltene Produkt kann zur Behandlung von Mastitis von Kühen verwendet werden, wobei Gamma-Globuline in die Euter von Kühen eingeführt werden. Zusammen mit dem erfindungsgemäss hergestellten Immunoglobulin können eines oder mehrere antimikrobielle Mit tel verwendet werden.
Wird das Euter einer Kuh beispielsweise mittels eines spe zifischen grampositiven Organismus, der Mastitis verursacht, infiziert, dann kann der Organismus in wirksamer Weise nach einer von verschiedenen Methoden behandelt werden.
Es kann ein Immunoglobulin verwendet werden. das den Antikörper für diesen spezifischen grampositiven Organismus oder für diese spezifischen grampositiven Organismen enthält. Ist die Konzentration des spezifischen Antikörpers in dem Immunoglobulin hoch genug. um eine pharmakologi- sche Wirkung zu erzeugen. dann kann das Immunoglobulin auch allein ohne weitere Additive verwendet werden.
Die bevorzugte Art und Weise, in der die vorstehend geschilderten Globuline hergestellt werden, wird nachstehend näher erläutert:
Das Blutserum von normalen Tieren enthält eine grosse Menge an Proteinen, unter anderem Albumin und Globulin.
Das Globulin besteht aus verschiedenen Komponenten. beispielsweise dem Gamma-Globulin. mit welchem Antikörper, falls solche vorhanden sind. gekuppelt sind.
Antikörper können sich in dem Körper eines Tieres cnt- wickeln, falls ein derartiges Tier infiziert wird. Antikörper können sich auch dann entwickeln. wenn das Tier mit einem
Impfstoff geimpft wird, der von dem Organismus abstammt.
welcher den spezifischen Krankheitszustand verursacht.
oder dann. wenn ein derartiges Tier kontinuierlich in kurzen Zeitintervallen mit grossen Dosen des spezifischen. die Infizierung verursachenden Organismus gespritzt wird. Die zuletzt genannte Bedingung hat im allgemeinen einen hyperimmunen Zustand zur Folge. Das Serum. das von einem hyperimmunen Tier erhalten wird, ist von erheblichem therapeutischen Wert und lässt sich auch zur Einstellung einer passiven Immunität verwenden. Dieses Serum kann zur Herstcllung von Immunoglobulin herangezogen werden.
Ein hyperimmunes Serum wird in universeller Weise durch künstliche Immunisierung von Tieren durch wieder holte Injektionen eines spezifischen Bakteriums oder seines Toxoids in kurzen Intervallen unter Verwendung zunehmend höherer Dosen hergestellt. Die Intervalle zwischen den Injektionen schwanken von 4-14 Tagen. wobei gewöhn lich ein Minimum von 4-8 Injektionen erforderlich ist. Man kann die Injektionen entweder auf subkutanem, intramuskulä rem oder intravenösem Wege durchführen.
Eine Blutprobe wird 8-14 Tage nach der letzten Injek tion entnommen, worauf das Serum auf das Vorliegen spezifi scher agglutinierender Antikörper sowie ihrer Gehalte unter sucht wird. Ist die Blutprobe unbefriedigend. dann wird das ganze Verfahren der Hyperimmunisierung wiederholt. Zur
Stimulierung der Erzeugung höherer Gehalte an agglutinie renden Antikörpern können Adjuvantien verwendet werden (beispielsweise Freundsche vollständige oder unvollständige
Adjuvantien). Mit der Hilfe von Adjuvantien können die agg lutinierenden, jedoch nicht in notwendiger Weise die immuni sierenden Antikörper auf das bis zu Zehnfache gesteigert werden.
Ist der Gehalt am agglutinierenden Antikörpern zufrie- denstellend, dann kann das Tier auf sterilem Wege ausbluten gelassen werden.
Die Hauptvorteile einer künstlichen Hyperimmunisierung sind folgende: a) Nur ein Organismentyp (Serotyp oder Variante) oder ein Toxoid wird pro Tier verwendet. Ein monovalentes homologes Hyperimmunserum wird daher im allgemeinen in einem Tier erzeugt.
Im Falle von beispielsweise Staphylococcus aureus sind als eine der vielen Ursachen von Mastitis einige hundert Serotypen und mehr als 80 Phagetypen bekannt.
Zur Herstellung eines polyvalenten Hyperimmunserums gegen eine Gruppe von homologen Organismen (beispielsweise Staph. aureus) sollten wenigstens 20-30 Tiere verwendet werden, während wenigstens 100 Tiere zur Erzeugung eines polyvalenten Hyperimmunserums gegen die Vielzahl der heterologen Bakterien eingesetzt werden sollten.
b) Abgetötete Kulturen oder Toxoide werden zur Verhinderung des Todes von Tieren, die hyperimmunisiert werden, eingesetzt. Durch Töten der pathogenen Bakterien werden grosse Teile der natürlichen virulenten Faktoren, von denen bis heute wenig bekannt ist. zerstört, was eine Erzeugung von unvollständigen Antikörpern zur Folge hat. Das gleiche gilt für die Toxoide.
c) Das Ansprechen auf eine künstliche Immunisierung schwankt von Tier zu Tier.
d) Bei einer künstlichen Hyperimmunisierung stirbt in der Regel eine grosse Anzahl von Tieren an einem Schock, und zwar insbesondere während der späteren Stufen der Immunisierung, wobei die Grösse der eingesetzten Dosen eine Rolle spielt.
Diese Nachteile werden in erheblichem Ausmasse dann vermieden, wenn das Blut einer grossen Anzahl von Tieren aus verschiedenen Gegenden, die an der chronischen Form von Mastitis leiden, gesammelt wird. Ein derartiges gesammeltes Hyperimmunserum enthält vollständige natürliche Antikörper gegen heterologe Gruppen von Bakterien sowie gegen die heterologen Typen innerhalb einer Gruppe, die für die verschiedenen Formen der Krankheit verantwortlich sind.
Es wurde gefunden, dass das gesammelte Blut von in einem Schlachthaus geschlachteten Tieren eine zufriedenstellende Quelle für ein Blut natürlich infizierter Tiere sein kann.
Auch wurde festgestellt, dass das polyvalente heterologe Hyperimmunserum, das von gesammelten Blut von Tieren abstammt, die an chronischer Mastitis litten, besser ist als dasjenige eines einzigen Tieres.
Das heterologe Hyperimmunserum, aus welchem das gewünschte Immunoglobulin hergestellt werden soll, kann in zweckmässiger Weise aus dem gesammelten Blut in der nachstehend geschilderten Weise erzeugt werden.
Im Gegensatz zu dem Blut von Pferden erzeugt das Blut von Rindern, falls es auf natürliche Weise gerinnen lassen wird, sehr wenig Serum (10-20%), wobei sehr leicht eine Hämolyse eintritt. Zur Beseitigung dieser Probleme wird das gesammelte Blut in Natriumcitrat (Antikoagulans) und Dextrose (Antihämolytikum) in einer Endkonzentration von jeweils 0,5% eingebracht. Das Plasma wird von den Blutzellen durch Zentrifugieren abgetrennt. Auf diese Weise werden wenigstens 60% Plasma gewonnen. Aus dem Plasma wird das Serum in der Weise erhalten, dass CaCl2 in einer Konzentration von 3,75 gll dem Plasma zugesetzt wird, was die Bildung eines Gels zur Folge hat. Das Gel wird in kleine Portionen aufgeschnitten und durch ein Käsetuch gesiebt, um das geronnene Fibrin und Fibrinogen von dem Serum abzutrennen.
Die Serumausbeute beträgt + 50% des ursprünglichen Blutvolumens.
Das Serum wird anschliessend auf das Vorliegen von spezifischen Agglutininen unter Verwendung von 40 repräsentati ven Bakterienkulturen getestet. Von diesen Kulturen seien folgende erwähnt: Staph. aureus, Strept. agalactiae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, E. coli und Salmonella. Ein zufriedenstellendes Serum wird anschliessend zur Erzeugung des Immunoglobulins verwendet.
Das Gamma-Globulin mit welchem die Antikörper verknüpft sind, wird aus dem Serum mit (NH4)2SO4 ausgefällt, und zwar durch langsames Eintropfen einer 50zeigen (NH4)2SO4-Lösung in ein gleiches Serumvolumen. Auf diese Weise wird eine Endkonzentration von 25% (NH4).SO4 erzielt. Der (N H4)2SO4-Gamma-Globulin-Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt und in ein spezielles Zellulosegehäuse überführt, in welchem er gegen kaltes fliessendes Wasser zur Entfernung des (NH4),SO4 dialysiert wird. Die Dialyse dauert 6-8 Tage. Anschliessend wird das Dialysat mit einer 2zeigen BaCI,-Lösung auf das Vorliegen von (NH4)2SO4 getestet.
Das (NH4)2SO4-freie konzentrierte Immunoglobulin wird mit 1500 Upm zur Entfernung von aus grossen Molekülen bestehenden Proteinverunreinigungen zentrifugiert und durch Filtration sterilisiert.
Eine Standardisierung des erhaltenen Präparates kann nach den folgenden Methoden erzielt werden: a) lmmunoelektrophorese zur Bestimmung der Gamma Globulin-Konzentration.
b) Bestimmung der Gesamtprotein-Konzentration.
c) Wachstumsinhibierungstest.
d) Agglutinierungs-Antikörpergehalt.
e) Sterilitätstest.
f) Sicherheitstest.
Je nach den Ergebnissen von a, b, c und d kann das konzentrierte Produkt in einer Phosphatpuffersalzlösung auf die erforderliche Endkonzentration verdünnt werden. Die Endzubereitung enthält im allgemeinen 10-12% Protein, mehr als 900in Gamma-Globulin und minimal 1 :6400 Agglutinine und weist eine in vitro-Wachstumsinhibierungs-Konzentration von I (Verdünnung pro ml) auf. Die empfohlene Dosis ist folgende: 20 ml des Endproduktes pro Viertel einer Kuh, die weniger als 11 I Milch pro Tag erzeugt, und 40 ml für höher-produzierende Tiere.
Die Sterilitätstests können auf Blutagar-Platten durchgeführt werden, während die Sicherheit der Produkte z. B. in der Weise getestet wird, dass die doppelte Menge der empfohlenen Dosis in ein junges Kalb oder in ein Viertel eines normalen Euters eingespritzt wird.
Das Produkt wird vorzugsweise in einer gefriergetrockneten Form in den Handel gebracht und mit einem Verdünnungsmittel (Wasser), das 0,25% Phenol als Konservierungsmittel enthält, nur für eine vorbeugende Behandlung von Mastitis verwendet, während zur Behandlung einer klinischen Mastitis pro Dose 0,25% Phenol plus 200 000 1. U. Penicillin G und 250 mg Dihydrostreptomycin verwendet werden.
Die Behandlung von Mastitis einer Kuh kann entweder therapeutisch oder prophylaktisch erfolgen. Das Produkt kann durch Infusion in das Euter durch den Zitzenkanal verabreicht werden.
Die Ergebnisse eines Tests unter Verwendung eines Mastitis-lmmunoglobulins sind nachstehend angegeben. Bei der Durchführung dieses einen Tests wurden drei infizierte Kühe mit drei verschiedenen Antibiotika behandelt. Es wurde keine Verbesserung festgestellt. Die Kühe wurden anschliessend mit einer Kombination aus Mastitis-lmmunoglobulin behandelt. Innerhalb von 3 Tagen wurde ein Ansprechen festgestellt. Nach 10 Tagen waren alle Kühe vollständig geheilt.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung wenigstens eine begrenzte Periode einer passiven Immunität gegenüber Mastitis zur Folge hat. Ferner wirkt die künstliche oder natürliche Infektion einer Kuh während einer derartigen Periode einer passiven Immunität als Verstärkung, woraus eine erhaltene aktive Immunität zu ersehen ist.
Beispiel Isolation des Antikörpers
Insgesamt 20 1 Blut werden von einer Anzahl von Kühen gesammelt, die an verschiedenen Typen chronischer Mastitis leiden. 170 ml einer 50%oigen Lösung von Natriumcitrat in einer 50%igen wässrigen Dextrose werden zugesetzt. Die Mischung wird in das Laboratorium überführt und in einer kontinuierlich arbeitenden Zentrifuge bei 3000 Upm während einer Zeitspanne von 30 Minuten zur Abtrennung der roten Blutzellen von dem Plasma zentrifugiert.
Das Plasma wird mit 3,75 g Calciumchlorid pro Liter zur Koagulierung behandelt. Das gebildete Koagulatgel wird aufgebrochen und auf ein Tuch gegeben, damit das Serum ablau fen und gesammelt werden kann. Dann wird Ammoniumsulfat dazu verwendet, das Protein aus dem Serum auszufällen.
Unter Verwendung wechselnder Mengen an Ammoniumsulfat werden Probefällungen durchgeführt. Der Proteinniederschlag wird durch Elektrophorese analysiert. Es wrden folgende Ergebnisse erhalten: % (NH4),SO4. Gesamt- Albumin α-11- berechnet auf das protein. % Ge- Globulin Globulin Serumvolumen g g samt g "/" Gcs g 1 Ges 8,6 8,6 0.64 7.8 1.56 18,1 6,40 74,1 25% 9,5 0,24 2,5 1,46 15,4 7.80 82,1 20% 10,6 0,23 2.2 0,72 6,8 9,62 91.0
25 g Ammoniumsulfat pro 100 ml Serum werden dazu verwendet, die Hauptausfällung des y-Globulins durchzuführen.
Das Globulin wird 8 Stunden später abzentrifugiert, in Säcke aus regenerierter Zellulosefolie gegeben und bei 4 C mit laufendem Leitungswasser während einer Zeitspanne von 5-7 Tagen und anschliessend mit einer 0,8%igen wässrigen NaCI-Lösung während einer Zeitspanne von 2 Tagen dialysiert. Auf diese Weise wird das Ammoniumsulfat entfernt.
Das erhaltene Produkt kann auf einen Feststoffgehalt von 15-16% konzentriert werden, filtriert werden und anschliessend durch Agglutination standardisiert werden. Dann können Wachstumsinhibierungs-Tests bei verschiedenen Verdünnungsgraden des Produktes durchgeführt werden.
Diese Testmethode ist bekannt. Im vorliegenden Falle wird 1 ml des Produktes in ein erstes Rohr gegeben, das 199 ml Wasser enthält. 1 ml dieser Lösung in ein drittes Rohr geschüttet werden. das 199 ml Wasser enthält usw. Insgesamt werden 13 Rohre verwendet.
Tests:
Das Ergebnis der Agglutinierungs-Tests geht aus der Tabelle I hervor. In dieser Tabelle bezieht sich die Verdünnung auf die Anzahl von Teilen Wasser, das 1 Teil des Produktes enthält.
+ bedeutet Agglutinierung. während N verdeutlich, dass keine Agglutinierung stattgefunden hat.
Die Agglutinierungs-Tests des Serums vor der Ausfällung des Immunoglobulins (50 /Oige Konzentration) und des vollständig konzentrierten Immunoglobulins sind in der Tabelle II zusammengefasst. Es ist darauf hinzuweisen, dass ein derartiges Produkt, wie aus den Tabellen zu ersehen ist. eine polyvalente Natur besitzt.
Tabelle I Mikro- 50 100 200 400 800 1600 3200 6400 12800 25600 51200 102400 Verorga- gleich nismus E.coli 2+ 2+ 2+ 2+ 2t N N N N N N N N Staph.
aureus 3+ 3+ 2+ 2+ 2+ + N N N N N N N E. coli 3+ 2+ 2+ 2+ 2+ 24 2+ 2+ 2+ 2-1 21 2 N + Bacillus sp. 3+ 3+ 2+ 2+ 2+ N N N N N N N N E. coli 4+ 3+ 3+ 3+ 3+ 2+ + N N N N N N Staph.
aureus 3+ 3+ 2+ N N N N N N N N N N -C-Bacillus 3+ 3+ 3+ 2+ 2+ t + N N N N N N Staph.
aureus 3+ 3+ 2+ 2+ + + N N N N N N N Staph.
aureus 4+ 4+ 4+ 4+ 2+ 2 2+ + 4 t N N N Staph.
Epidermidis 3+ 3+ 3+ 2+ 2+ N N N N N N N N Staph.
aureus 4+ 4+ 4+ 3+ 3+ 2+ + t + N N N N Strept.
Agalactiae 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 2+ 2+ + + N N N N Mikro- 50 100 200 400 800 1600 3200 6400 12800 25600 51200 102400 Verorga- gleich nisinus Staph.
Epidermidis 3+ 3+ 3+ 3+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ N N N N Pseudomonas 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 3+ 2+ + N N N N N Staph.
aureus 3+ 3+ 3+ 3+ + -t + + N N N N N Staph.
aureus 4+ 4+ 4+ 3+ 3+ 3+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ + N Staph.
aureus 3+ 3+ 3+ 3+ 2+ 2+ 2+ + N N N N N Staph.
aureus 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 2+ 2+ 2+ N N N N Staph.
Epidermidis 3+ + + + t + N N N N N N N Staph.
Epidermidis 3+ 3+ 3+ 3+ 2+ + + + + N N N N Streptococcus 3+ 3+ 3+ 2+ 2t- + + N N N N N N Staph.
aureus 3+ 2+ 2+ 2+ + + N N N N N N N Staph.
aureus 3+ 3+ 3+ 3+ N N N N N N N N N Staph.
Epidermidis 3+ 3+ 3+ 3+ 2+ 2+ + + + N N N N Staph.
Epidermidis 3+ 3+ + - N N N N N N N N N
Tabelle II
Agglutinierung Mikro- Serum vor der Produkt, 50% Konzentriertes organismus Auslälung konzentriert Produkt - Bacillus 200 800 1 600 Streptococcus 400 6 400 51 200 Staph. aureus 3 200 102 400 102 400 Staph. aureus 3 200 25 600 12 800 Staph. aureus 3 200 6 400 25 600 E. coli 6400 6 400 12800 E. coli 200 800 1 600 +Bacihus 6 400 12 800 3 200 +Bacillus 6400 3200 12800 Staph. Epidermidis 400 100 800 Staph. Epidermidis 1 600 200 6 400 Staph. aureus 3 200 200 400 Staph. aureus 1 600 400 800 Klebsiella 3 200 3 200 25 600 Staph. aureus 1 600 800 1 600 Staph. aureus 3 200 400 6 400 Staph. Epidermidis 25 600 400 102 400 Staph.
Epidermidis 12800 6400 102400 Staph. aureus 3 200 800 25 600 Staph. aureus 25 600 800 102 400 Pseudomonas 15 600 6400 51 200 Streptococcus 25 600 12 800 102 400 Staph. aureus 25 600 800 51 200 Staph. Epidermidia 12 800 1 600 25 600
Die antibakterielle Aktivität des Produkts geht aus der Tabelle III hervor. Die verwendeten Mikroorganismen sind die Standardmikroorganismen, die für ungefähr 90% aller Fälle von Mastitis verantwortlich sind.
In dieser Tabelle bedeuten:
Die Überschrift (1) bedeutet das in dem Rohr sichtbare Wachstum.
Die Überschrift (2) bedeutet das Wachstum. das nur auf Blutagarplatten sichtbar ist.
+und N haben dieselben Bedeutungen wie in Tabelle 1.
Ig steht für Immunoglobulin.
P steht für Penicillin G bei einer Konzentration von 5 Gamma pro 0,025 mm (mil).
S steht für Dihydrostreptomycin mit einer Konzentration von 125 Gamma pro 0.025 mm (mil).
Man sieht, dass das Immunoglobulin bakteriostatisch ist.
Wird es mit Penicillin und Dihydrostreptomycin vermischt.
dann wird eine erhöhte bakterizide Wirkung erzielt. und zwar im Vergleich zu dem Fall. dass diese zwei Antibiotika ohne Immunoglobulin eingesetzt werden.
Tabelle 111 Mikro- Anzahl lmmuno- lmmuno penielin Ver.
organismus der Or. globuin Penicllin Dihydro- gleich.
ldentifi- ganismen im Serum streptomy- strcp- nur zierung pro zuge ein tomycin Serum setztem im Serum ml
1% 5% 10% 10% 1G
5 u P/125 S
1 21 2 1 2 1 2 1 2 1 2 Staph. aureus 150 t N N N t N N t 2 Staph.
epidermis 580 + N + N + N N N + 2+ Staph.
epidermis 123 t N N + N t 34 24 Streptococcus 700 t t t t N N N N 2t Staph.
epidermis 240 2+ N + N N N N N 24 Staph.
epidermis 30 2 t N N t N N 24 Staph.
epidermis 60 2+ N N + N N @ 2 Staph. aureus 520 2+ + N N 2 N N N 3+ 34 Staph. aureus 270 2+ N N N + N + N + 3 Staph.aureus 320 2t t 3t N N N + 2 Staph, aureus 250 3+ N + 2+ N + 2+ 4+ +Bacillus Sp. 1000 2+ 2+ 2+ 2+ 3+ 3+ Pseudomonas 1500 + 2+ 2+ 2+ 2+ 3+ Staph. aureus 800 2+ N t N t N N N N 2 E. coli 280 N 2+ 24 + . 2 Staph. aureus 200 2t t N t N N N N Staph. aureus 300 t 4 + N 1 2+ 3+ Staph. aureus 114 3+ N + N t N N 3+ 44 E.
coli 1000 2t 3t 3t 2t 2t 3t Staph. aureus 2190 2t N N 2+ N N 3t 3+ E. coli 1000 3+ 2+ 2t t t 24 Staph. aureus 2500 3+ 3+ 3+ N N N N 3+ -C-Bacillus 390 3+ 3+ 3+ 24 24 34 Staph. aureus 2500 3+ 3+ 3t t t 3 Staph. aureus 1850 N 3t 3+ N N N t 34 Staph.
epidermidis 1000 2+ N t N + N N N N 34 Streptococcus 400 2+ 2+ 3+ N N N N 2+ Das gemäss dem Beispiel hergestellte Produkt kann gefriergetrocknet und in Flaschen gelagert werden. Zur Herstellung einer Zubereitung für eine Verabreichung kann das Produkt mit 25 ml sterilem Wasser und 0,25% Phenol (als Konservierungsmittel). 200 000 Internationalen Einheiten Penicillin G und 250 mg Dihydrostreptomycinsulfat vermischt werden.
In zweckmässiger Weise liegt das Immunoglobulin als reines konzentriertes polyvalentes Produkt vor, vorzugsweise zu mehr als 80% in der Form von γ-Globulin, während 15,5% (g/V) Proteinfeststoffe vorhanden sind. Die minimalen Aggiutininwerte liegen bei 1 :6400 und die minimalen Wachstumskonzentrationen gegen verschiedene Mikroorganismen, wie beispielsweise Staphylococci, Streptococci, E. coli, Klebsiella, Aerobacter und Pseudomonas, bei I : 100
Eine Zubereitung, die der erwähnten ähnelt. jedoch keine Antibiotika enthält, kann für eine passive Immunität gegen Kälbermastitis verwendet werden und besitzt den Vor teil. dass den Tieren kein Antibiotikum verabreicht wird.
Die Zubereitungen werden vorzugsweise in einem Kühlraum bei 4 "C gelagert und können für eine Infusion in das Euter durch den Zitzenkanal verwendet werden, und zwar für eine Behandlung gegen eine Kälbermastitis sowie zur Erzeugung einer passiven Immunität.
Im allgemeinen können 10-50 ml pro Viertel eines Euters infusiert werden, wodurch im allgemeinen ein Schutz von wenigstens 6-8 Wochen erzielt wird.
Es ist zu empfehlen, die Milch, die aus einem mit Immunoglobulin plus einem Antibiotikum behandelten Euterviertel er halten wird, und zwar bis zu einer Zeitspanne von 24 Stunden nach der Behandlung, zu verwerfen. Wird kein Antibiotikum verwendet, dann braucht die Milch nicht verworfen zu werden. Soll eine Mastitis behandelt werden, dann ist es zu empfehlen, eine Probe der infizierten Milch in einem Laboratorium zu analysieren, um festzustellen, welche Mikroorganismen (beispielsweise grampositive oder graninegative oder Hefen oder Fungi) die Mastitis verursachen. Dann kann ein geeignetes Antibiotikum oder eine geeignete Antifungusverbindung dem Immunoglobulin vor der Infusion zugesetzt werden.
Die Ergebnisse, die bei der Behandlung von Kühen gegen Mastitis erhalten werden, sind ausgezeichnet.
Wenn auch die Wirkung des Antikörpers gegenwärtig noch nicht vollständig zu verstehen ist, so nimmt man dennoch an, dass die Wirkung auf eine Immobilisierung und Wachstumsinhibierung von Makroorganismen in Verbindung mit einer erhöhten Phagocytosis zurückzuführen ist.
Zahlreiche Versuche haben gezeigt, dass gesunde Kühe, die mit dem Antikörper behandelt werden, nur geringfügige Reizungen zeigen, die nach 3 bis 5 Tagen vollständig verschwunden sind.
Eine andere geeignete antibiotische Substanz kann anstelle oder zusätzlich zu dem oben angegebenen Antibiotikum zusammen mit dem Mastitis-lmmunoglobulin verwendet werden.
Im allgemeinen wird mit Penicillin G ein in vivo-Wirkungsgradindex von ungefähr 40010, mit halbsynthetischen Penicillen oder einer Kombination aus Penicillin G plus Streptomycin ein Index von ungefähr 500/o, mit F Furazolidon, einer Kombination aus Erythromycin und Noviobiocin oder einer Kombination aus Neomycin und Bacitracin ein Index von ungefähr 70 /0 und mit Chloramphenicol ein Index von ungefähr 90 /0 erzielt.
Unter Verwendung eines Immunoglobulins, das aus dem gesammelten Blut von geschlachteten Kühen gewonnen worden ist, wurde ein Versuch unter Verwendung von Mutterschafen und Mutterziegen, die an Mastitis litten, mit denselben guten Erfolgen durchgeführt.
PATENTANSPRUCH 1
Verfahren zur Herstellung von Mastitis-lmmunoglobulin, dadurch gekennzeichnet, dass man Kühe, Ziegen oder Schafe mit Mastitis-Erregern infiziert, das Blut der entsprechende Antikörper enthaltenden infizierten Tiere sammelt, mit einem Antikoagulans und einem Antihaemolytikum zusammenbringt, zur Trennung des Plasmas von den Blutkörperchen zentrifugiert, das Plasma mit einem Blutkoagulans behandelt, das geronnene Material vom Serum abtrennt und das Gamma-Globulin als Träger der Antikörper-Funktion sodann durch Ausfällen von den übrigen Bestandteilen des Serums abtrennt.
UNTERANSPRÜCH E
1. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Tiere auf natürliche Art infiziert, um einen hyperimmunen Zustand zu erreichen,
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Tiere künstlich infiziert, um einen hyperimmunen Zustand zu erreichen.
3. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass das Blut von geschlachteten Tieren gesammelt wird.
4. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass das Blut durch Ausbluten von lebenden Tieren gewonnen wird.
5. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass das Blut einer bestimmten Anzahl von Tieren gesammelt wird und das Immunoglobulin aus diesem gesammelten Blut hergestellt wird.
PATENTANSPRUCH 11
Mastitis-lmmunoglobulin, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch I.
The invention relates to a process for the production of mastitis immunoglobulin which is suitable for treating cows, ewes and goats against mastitis, the treatment being either therapeutic or prophylactic.
Mastitis is one of the most common diseases in cows. In addition to the heavy losses suffered by milk producers and consequently the dairy industry as a result of sick udders and reduced milk production.
the use of an infected milk is also a serious health problem.
It is therefore not surprising that research into the control of mastitis has been around the world for the past 10-15 years. Although antibiotics are used in large quantities to combat and prevent this disease, and hygienic measures are also used and vaccinations are carried out, this disease is still increasing.
Active immunity cannot be achieved by systematically inoculating the cows with a vaccine. Vaccines can produce antibodies circulating in the blood. However, the sera agglutinin or precipitin in the blood cannot be taken up by the udder, so that they are not suitable for this. Prevent mastitis.
Antibiotics are only of value as additives and cannot do so on their own. Fight mastitis. due to various disadvantages.
Narrow-band antibiotics. for example penicillin. are of less value today because their effects are limited to certain groups of organisms, such as gram-positive organisms. while mastitis is a complex infectious disease. This applies to both penicillin G.
the semi-synthetic penicillin. as well as other narrow-band antibiotics.
The available broad-spectrum antibiotics or combinations of narrow-band antibiotics with broad-spectrum antibiotics are also not always effective and, moreover, too expensive to be able to be used on a broad scale. Not all broad spectrum antibiotics can be mixed together. because of their antagonistic effect. Other broad spectrum antibiotics are unsuitable for udder administration.
The widespread use of antibiotics results in counter-infections and the development of resistant organisms that were previously sensitive. This applies to both the narrowband and broadband antibiotics.
In addition, the excretion of antibiotics in the milk is undesirable.
The problem of mastitis also occurs in other animals, particularly ewes and mother goats. Therefore, if cows are mentioned in the following, this should also include ewes and goats.
There was therefore a great need for products which can be produced in an economical manner and which are suitable for use in combating mastitis in cows. The present invention enables such a product. namely, mastitis immunoglobulin. to manufacture.
As is known, immunoglobulin is a gamma globulin which carries the antibody function.
The method for producing mastitis immunoglobulin according to the present invention is characterized. that you have cows. Goats or sheep infected with mastitis pathogens. collects the blood of the infected animals containing the appropriate antibodies, brings it together with an anticoagulant and an antihaemolytic, centrifuges it to separate the plasma from the blood cells, treats the plasma with a blood coagulant, separates the coagulated material from the serum and the gamma globulin as a carrier for the antibody The function is then separated from the other components of the serum by precipitation.
Blood from a large number of cows is advantageously used, so that a versatile product is created.
The product obtained according to the invention can be used for the treatment of mastitis of cows, whereby gamma globulins are introduced into the udders of cows. One or more antimicrobial agents can be used together with the immunoglobulin prepared according to the invention.
For example, if a cow's udder is infected by a specific gram-positive organism that causes mastitis, then the organism can be effectively treated by one of several methods.
An immunoglobulin can be used. which contains the antibody for that specific gram-positive organism or for these specific gram-positive organisms. Is the concentration of the specific antibody in the immunoglobulin high enough. to produce a pharmacological effect. then the immunoglobulin can also be used alone without further additives.
The preferred way in which the globulins described above are produced is explained in more detail below:
The blood serum of normal animals contains a large amount of proteins, including albumin and globulin.
The globulin consists of different components. for example gamma globulin. with which antibody, if any. are coupled.
Antibodies can develop in an animal's body if such an animal becomes infected. Antibodies can develop even then. when the animal is with one
Vaccine that is derived from the organism.
which causes the specific disease state.
or then. when such an animal is continuous at short time intervals with large doses of the specific. the organism causing the infection is injected. The latter condition generally results in a hyperimmune state. The serum. obtained from a hyperimmune animal is of considerable therapeutic value and can also be used to establish passive immunity. This serum can be used to produce immunoglobulin.
A hyperimmune serum is made in a universal manner by artificial immunization of animals by repeated injections of a specific bacterium or its toxoid at short intervals using increasingly higher doses. The intervals between injections vary from 4-14 days. usually requiring a minimum of 4-8 injections. The injections can be made either subcutaneously, intramuscularly, or intravenously.
A blood sample is taken 8-14 days after the last injection, whereupon the serum is examined for the presence of specific agglutinating antibodies and their levels. Is the blood sample unsatisfactory? then the whole process of hyperimmunization is repeated. To
To stimulate the production of higher levels of agglutinating antibodies, adjuvants can be used (e.g. Freundsche complete or incomplete
Adjuvants). With the help of adjuvants, the agglutinating, but not necessarily the immunizing antibodies can be increased up to ten times.
If the level of agglutinating antibodies is satisfactory, the animal can be allowed to bleed out sterile.
The main advantages of artificial hyperimmunization are as follows: a) Only one type of organism (serotype or variant) or toxoid is used per animal. A monovalent homologous hyperimmune serum is therefore generally produced in an animal.
In the case of, for example, Staphylococcus aureus, as one of the many causes of mastitis, several hundred serotypes and more than 80 phage types are known.
At least 20-30 animals should be used to produce a polyvalent hyperimmune serum against a group of homologous organisms (e.g. Staph. Aureus), while at least 100 animals should be used to produce a polyvalent hyperimmune serum against the large number of heterologous bacteria.
b) Killed cultures or toxoids are used to prevent the death of animals that are hyperimmunized. By killing the pathogenic bacteria, large parts of the natural virulent factors, of which little is known to date, are eliminated. destroyed, resulting in the generation of incomplete antibodies. The same goes for the toxoids.
c) The response to artificial immunization varies from animal to animal.
d) In the case of artificial hyperimmunization, a large number of animals usually die of shock, in particular during the later stages of immunization, the size of the doses used playing a role.
These disadvantages are avoided to a considerable extent when the blood of a large number of animals from different areas suffering from the chronic form of mastitis is collected. Such pooled hyperimmune serum contains complete natural antibodies against heterologous groups of bacteria as well as against the heterologous types within a group responsible for the various forms of the disease.
It has been found that the blood collected from animals slaughtered in a slaughterhouse can be a satisfactory source of blood from naturally infected animals.
It was also found that the hyperimmune polyvalent heterologous serum derived from blood collected from animals suffering from chronic mastitis is better than that of a single animal.
The heterologous hyperimmune serum from which the desired immunoglobulin is to be produced can expediently be produced from the collected blood in the manner described below.
In contrast to the blood of horses, the blood of cattle, if allowed to clot naturally, produces very little serum (10-20%) with hemolysis very easily occurring. To eliminate these problems, the collected blood is placed in sodium citrate (anticoagulant) and dextrose (antihemolytic) in a final concentration of 0.5% each. The plasma is separated from the blood cells by centrifugation. In this way at least 60% plasma is obtained. The serum is obtained from the plasma in such a way that CaCl2 is added to the plasma in a concentration of 3.75 μl, which results in the formation of a gel. The gel is cut into small portions and sifted through a cheesecloth to separate the coagulated fibrin and fibrinogen from the serum.
The serum yield is + 50% of the original blood volume.
The serum is then tested for the presence of specific agglutinins using 40 representative bacterial cultures. Of these cultures, the following are mentioned: Staph. aureus, Strept. agalactiae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, E. coli and Salmonella. A satisfactory serum is then used to generate the immunoglobulin.
The gamma globulin to which the antibodies are linked is precipitated from the serum with (NH4) 2SO4 by slowly dropping a (NH4) 2SO4 solution into an equal volume of serum. In this way a final concentration of 25% (NH4) .SO4 is achieved. The (N H4) 2SO4-gamma-globulin precipitate is separated off by filtration and transferred into a special cellulose housing, in which it is dialyzed against cold running water to remove the (NH4), SO4. Dialysis lasts 6-8 days. The dialysate is then tested for the presence of (NH4) 2SO4 with a 2-point BaCI, solution.
The (NH4) 2SO4-free concentrated immunoglobulin is centrifuged at 1500 rpm to remove protein impurities consisting of large molecules and sterilized by filtration.
The preparation obtained can be standardized using the following methods: a) Immunoelectrophoresis to determine the gamma globulin concentration.
b) Determination of the total protein concentration.
c) growth inhibition test.
d) agglutination antibody content.
e) sterility test.
f) Security test.
Depending on the results of a, b, c and d, the concentrated product can be diluted in a phosphate buffer salt solution to the required final concentration. The final preparation generally contains 10-12% protein, more than 900% gamma globulin and a minimum of 1: 6400 agglutinins and has an in vitro growth inhibition concentration of I (dilution per ml). The recommended dose is as follows: 20 ml of the end product per quarter of a cow producing less than 11 liters of milk per day and 40 ml for higher-producing animals.
The sterility tests can be carried out on blood agar plates, while the safety of the products e.g. B. Tested by injecting twice the recommended dose into a young calf or a quarter of a normal udder.
The product is preferably marketed in a freeze-dried form and used with a diluent (water) containing 0.25% phenol as a preservative only for preventive treatment of mastitis, while for treatment of clinical mastitis, 0.25 per dose % Phenol plus 200,000 1st U. Penicillin G and 250 mg dihydrostreptomycin can be used.
Treatment of mastitis in a cow can be either therapeutic or prophylactic. The product can be administered by infusion into the udder through the teat canal.
The results of a test using a mastitis immunoglobulin are shown below. In doing this one test, three infected cows were treated with three different antibiotics. No improvement was found. The cows were then treated with a combination of mastitis immunoglobulin. A response was noted within 3 days. After 10 days all cows were completely cured.
The results obtained show that the treatment results in at least a limited period of passive immunity to mastitis. Further, the artificial or natural infection of a cow during such a period of passive immunity acts as a reinforcement, from which an active immunity can be seen to be obtained.
Example isolation of the antibody
A total of 20 liters of blood is collected from a number of cows suffering from various types of chronic mastitis. 170 ml of a 50% strength solution of sodium citrate in a 50% strength aqueous dextrose are added. The mixture is transferred to the laboratory and centrifuged in a continuous centrifuge at 3000 rpm for a period of 30 minutes to separate the red blood cells from the plasma.
The plasma is treated with 3.75 g calcium chloride per liter for coagulation. The formed coagulum gel is broken open and placed on a cloth so that the serum can drain and be collected. Then ammonium sulfate is used to precipitate the protein from the serum.
Sample precipitations are carried out using varying amounts of ammonium sulfate. The protein precipitate is analyzed by electrophoresis. The following results would be obtained:% (NH4), SO4. Total albumin α-11 calculated on protein. % Ge Globulin Globulin Serum volume vs. total g "/" Gcs g 1 Ges 8.6 8.6 0.64 7.8 1.56 18.1 6.40 74.1 25% 9.5 0.24 2.5 1.46 15, 4 7.80 82.1 20% 10.6 0.23 2.2 0.72 6.8 9.62 91.0
25 g of ammonium sulfate per 100 ml of serum are used to carry out the main precipitation of the γ-globulin.
The globulin is centrifuged 8 hours later, placed in bags made of regenerated cellulose film and dialyzed at 4 ° C. with running tap water for a period of 5-7 days and then with a 0.8% strength aqueous NaCl solution for a period of 2 days. In this way the ammonium sulfate is removed.
The product obtained can be concentrated to a solids content of 15-16%, filtered and then standardized by agglutination. Then growth inhibition tests can be carried out at various degrees of dilution of the product.
This test method is known. In the present case, 1 ml of the product is placed in a first tube which contains 199 ml of water. 1 ml of this solution can be poured into a third tube. which contains 199 ml of water etc. A total of 13 tubes are used.
Testing:
The result of the agglutination tests is shown in Table I. In this table, the dilution refers to the number of parts of water that contains 1 part of the product.
+ means agglutination. while N makes it clear that no agglutination has taken place.
The agglutination tests of the serum prior to precipitation of the immunoglobulin (50% concentration) and the fully concentrated immunoglobulin are summarized in Table II. It should be noted that such a product, as can be seen from the tables. has a polyvalent nature.
Table I Micro- 50 100 200 400 800 1600 3200 6400 12800 25600 51200 102400 Verorga- nism E. coli 2+ 2+ 2+ 2+ 2t N N N N N N N N Staph.
aureus 3+ 3+ 2+ 2+ 2+ + N N N N N N N E. coli 3+ 2+ 2+ 2+ 2+ 24 2+ 2+ 2+ 2-1 21 2 N + Bacillus sp. 3+ 3+ 2+ 2+ 2+ N N N N N N N N E. coli 4+ 3+ 3+ 3+ 3+ 2+ + N N N N N N Staph.
aureus 3+ 3+ 2+ N N N N N N N N N N -C-Bacillus 3+ 3+ 3+ 2+ 2+ t + N N N N N N Staph.
aureus 3+ 3+ 2+ 2+ + + N N N N N N N Staph.
aureus 4+ 4+ 4+ 4+ 2+ 2 2+ + 4 t N N N Staph.
Epidermidis 3+ 3+ 3+ 2+ 2+ N N N N N N N N Staph.
aureus 4+ 4+ 4+ 3+ 3+ 2+ + t + N N N N Strept.
Agalactiae 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 2+ 2+ + + N N N N Micro- 50 100 200 400 800 1600 3200 6400 12800 25600 51200 102400 Verorga- nisinus Staph.
Epidermidis 3+ 3+ 3+ 3+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ N N N N Pseudomonas 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 3+ 2+ + N N N N N Staph.
aureus 3+ 3+ 3+ 3+ + -t + + N N N N N Staph.
aureus 4+ 4+ 4+ 3+ 3+ 3+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ + N Staph.
aureus 3+ 3+ 3+ 3+ 2+ 2+ 2+ + N N N N N Staph.
aureus 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 2+ 2+ 2+ N N N N Staph.
Epidermidis 3+ + + + t + N N N N N N N Staph.
Epidermidis 3+ 3+ 3+ 3+ 2+ + + + + N N N N Streptococcus 3+ 3+ 3+ 2+ 2t- + + N N N N N N Staph.
aureus 3+ 2+ 2+ 2+ + + N N N N N N N Staph.
aureus 3+ 3+ 3+ 3+ N N N N N N N N N Staph.
Epidermidis 3+ 3+ 3+ 3+ 2+ 2+ + + + N N N N Staph.
Epidermidis 3+ 3+ + - N N N N N N N N N
Table II
Agglutination micro serum in front of the product, 50% concentrated organism precipitation concentrated product - Bacillus 200 800 1 600 Streptococcus 400 6 400 51 200 Staph. aureus 3 200 102 400 102 400 Staph. aureus 3 200 25 600 12 800 Staph. aureus 3 200 6 400 25 600 E. coli 6400 6 400 12800 E. coli 200 800 1 600 + Bacihus 6 400 12 800 3 200 + Bacillus 6400 3200 12800 Staph. Epidermidis 400 100 800 Staph. Epidermidis 1 600 200 6 400 Staph. aureus 3 200 200 400 Staph. aureus 1 600 400 800 Klebsiella 3 200 3 200 25 600 Staph. aureus 1 600 800 1 600 Staph. aureus 3 200 400 6 400 Staph. Epidermidis 25 600 400 102 400 Staph.
Epidermidis 12800 6400 102400 Staph. aureus 3 200 800 25 600 Staph. aureus 25 600 800 102 400 Pseudomonas 15 600 6400 51 200 Streptococcus 25 600 12 800 102 400 Staph. aureus 25 600 800 51 200 Staph. Epidermidia 12 800 1 600 25 600
The antibacterial activity of the product is shown in Table III. The microorganisms used are the standard microorganisms responsible for approximately 90% of all mastitis cases.
In this table:
The heading (1) means the growth visible in the pipe.
The heading (2) means growth. which is only visible on blood agar plates.
+ and N have the same meanings as in Table 1.
Ig stands for immunoglobulin.
P stands for penicillin G at a concentration of 5 gamma per 0.025 mm (mil).
S stands for dihydrostreptomycin at a concentration of 125 gamma per 0.025 mm (mil).
It can be seen that the immunoglobulin is bacteriostatic.
It is mixed with penicillin and dihydrostreptomycin.
then an increased bactericidal effect is achieved. compared to the case. that these two antibiotics are used without immunoglobulin.
Table 111 micro- number immuno- immuno penielin ver.
organism of Or. globuin Penicllin Dihydro- equal.
Identifi- cations in the serum streptomy- strcp- only decoration per addition of a tomycin serum put ml in the serum
1% 5% 10% 10% 1G
5 u P / 125 S
1 21 2 1 2 1 2 1 2 1 2 Staph. aureus 150 t N N N t N N t 2 Staph.
epidermis 580 + N + N + N N N + 2+ Staph.
epidermis 123 t N N + N t 34 24 Streptococcus 700 t t t t N N N N 2t Staph.
epidermis 240 2+ N + N N N N N 24 Staph.
epidermis 30 2 t N N t N N 24 Staph.
epidermis 60 2+ N N + N N @ 2 Staph. aureus 520 2+ + N N 2 N N N 3+ 34 Staph. aureus 270 2+ NNN + N + N + 3 Staph. aureus 320 2t t 3t NNN + 2 Staph, aureus 250 3+ N + 2+ N + 2+ 4+ + Bacillus Sp. 1000 2+ 2+ 2+ 2+ 3+ 3+ Pseudomonas 1500 + 2+ 2+ 2+ 2+ 3+ Staph. aureus 800 2+ N t N t N N N N 2 E. coli 280 N 2+ 24 +. 2 staph. aureus 200 2t t N t N N N N Staph. aureus 300 t 4 + N 1 2+ 3+ Staph. aureus 114 3+ N + N t N N 3+ 44 E.
coli 1000 2t 3t 3t 2t 2t 3t Staph. aureus 2190 2t N N 2+ N N 3t 3+ E. coli 1000 3+ 2+ 2t t t 24 Staph. aureus 2500 3+ 3+ 3+ N N N N 3+ -C-Bacillus 390 3+ 3+ 3+ 24 24 34 Staph. aureus 2500 3+ 3+ 3t t t 3 Staph. aureus 1850 N 3t 3+ N N N t 34 Staph.
epidermidis 1000 2+ N t N + N N N N 34 Streptococcus 400 2+ 2+ 3+ N N N N 2+ The product made according to the example can be freeze-dried and stored in bottles. To prepare a preparation for administration, the product can be mixed with 25 ml of sterile water and 0.25% phenol (as a preservative). 200,000 international units of penicillin G and 250 mg of dihydrostreptomycin sulfate are mixed together.
Conveniently the immunoglobulin is in the form of a pure concentrated polyvalent product, preferably greater than 80% in the form of γ-globulin, while 15.5% (w / v) protein solids are present. The minimum agglutinin values are 1: 6400 and the minimum growth concentrations against various microorganisms, such as, for example, Staphylococci, Streptococci, E. coli, Klebsiella, Aerobacter and Pseudomonas, are I: 100
A preparation similar to the one mentioned. but does not contain antibiotics, can be used for passive immunity to calf mastitis and has the advantage. that the animals are not given antibiotics.
The preparations are preferably stored in a cold room at 4 "C and can be used for infusion into the udder through the teat canal for treatment against calf mastitis as well as for inducing passive immunity.
In general, 10-50 ml can be infused per quarter of an udder, generally providing protection for at least 6-8 weeks.
It is recommended that the milk obtained from an udder quarter treated with immunoglobulin plus an antibiotic be discarded for a period of up to 24 hours after treatment. If no antibiotic is used, the milk does not need to be discarded. If mastitis is to be treated, it is advisable to analyze a sample of the infected milk in a laboratory to determine which microorganisms (e.g. gram-positive or graninegative or yeast or fungi) are causing the mastitis. Then an appropriate antibiotic or antifungal compound can be added to the immunoglobulin prior to infusion.
The results obtained in treating cows for mastitis are excellent.
Even if the effect of the antibody is not yet fully understood, it is nevertheless assumed that the effect is due to an immobilization and growth inhibition of macroorganisms in connection with an increased phagocytosis.
Numerous tests have shown that healthy cows treated with the antibody show only minor irritation that has completely disappeared after 3 to 5 days.
Another suitable antibiotic substance can be used in place of or in addition to the antibiotic mentioned above together with the mastitis immunoglobulin.
In general, with penicillin G an in vivo efficiency index of about 40010, with semi-synthetic penicilli or a combination of penicillin G plus streptomycin an index of about 500 / o, with F furazolidone, a combination of erythromycin and noviobiocin or a combination of neomycin and Bacitracin has an index of about 70/0 and chloramphenicol has an index of about 90/0.
Using an immunoglobulin obtained from the blood collected from slaughtered cows, an experiment using ewes and goats suffering from mastitis was carried out with the same good results.
PATENT CLAIM 1
Process for the production of mastitis immunoglobulin, characterized in that cows, goats or sheep are infected with mastitis pathogens, the blood of the infected animals containing the corresponding antibodies is collected, combined with an anticoagulant and an antihaemolytic, and centrifuged to separate the plasma from the blood cells , treats the plasma with a blood coagulant, separates the coagulated material from the serum and then separates the gamma globulin as a carrier of the antibody function from the other components of the serum by precipitation.
SUBClaims E.
1. The method according to claim 1, characterized in that the animals are infected naturally in order to achieve a hyperimmune state,
2. The method according to claim 1, characterized in that the animals are artificially infected in order to achieve a hyperimmune state.
3. The method according to claim I, characterized in that the blood is collected from slaughtered animals.
4. The method according to claim I, characterized in that the blood is obtained by bleeding from living animals.
5. The method according to claim I, characterized in that the blood of a certain number of animals is collected and the immunoglobulin is produced from this collected blood.
PATENT CLAIM 11
Mastitis immunoglobulin, produced by the process according to claim I.