Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Gewinnung folgender drei dimerer Alkaloide von Vinca rosea L.
(Catharanthus roseus G. Don) in Form der Basen oder von Salzen; Vincaleukoblastin (VLB; allgemein bekannter Name: vinblastine; im weiteren Vinblastin), Leurosin (VLR; allgemein bekannter Name: vinleurosine; im weiteren Vinleurosin) und Leurocristin (VCR; allgemein bekannter Name: vincristine; im weiteren Vincristin).
In letzter Zeit arbeiten die Pharmakologen in aller Welt mit beträchtlicher Intensität an der Herstellung zytostatisch wirkender, zur medizinischen Behandlung von Krebskranken geeigneten Verbindungen. Zu den bedeutendsten Ergebnissen dieser Forschungen gehört die Auffindung der dimeren Alkaloide von Vinca rosea L. und deren Einführung in die Therapie. Diese Präparate haben sich seit nun schon beinahe einem Jahrzehnt in der klinischen Praxis auf dem Gebiet der Onkologie als die verhältnismässig wirksamsten Mittel erwiesen.
Das Vinblastin ist ein seit 1959 bekanntes Oncolyticum, dessen klinische Anwendung eine beträchtliche Verminderung der Zahl der weissen Blutkörperchen im Blut zur Folge hat. Es erwies sich als wirksam bei der Hodgkin-Krankheit, bei akuter Leukämie und auch bei resistentem Choriocarcinom [z.B.
Johnson, I.S., Wright, H.F., Svoboda G.H. und Vlantis, J Cancer Res. 20 (1960) 1016].
Die Wirkung des Vinleurosins ist noch weniger bekannt.
Das Wirkungsgebiet scheint das gleiche wie das des Vinblastins zu sein [Johnson u.M.: Cancer Res. 23 (1963) 1390; Antitumoral effects of Vinca rosea alkaloids. Proceedings first symposium of the G. E. A. Excerpta Medica Foundation, Amsterdam 1966].
Vincristin wurde erstmals von G. H. Svoboda beschrieben bzw. isoliert [Svoboda, G. H.: Alkaloids of Vinca rosea (Catharanthus roseus) IX. Extraction and Characterisation of Leurosidine and Leurocristine. Lloydia 24 (1961)173-178].
Es stellte sich bald heraus, dass dieses neue Alkaloid, obgleich es hinsichtlich seiner Wirkung dem früher aufgefundenen Vinblastin gleicht, vom pharmakologischen Standpunkt aus wesentlich vorteilhafter ist. Bei In-vitro-Versuchen unterbindet Vincristin die Mitose neuplastischer Zellen in der Metaphase [z.B. Cardinali, G., Aboul Enein, M. I. M.: Studies on the Antimitotic Action of Leurocristine (Vincristine). Blood 21 (1963) 102]. Bei der klinischen Anwendung hat sich Vincristin im Vergleich zu den bisher bekannten Chemotherapeutica in Fällen von akuter Leukämie im Kindesalter als sehr vorteilhaft erwiesen. Während früher bei den meisten Fällen dieser Krankheit keine therapeutischen Erfolge erzielt werden konnten, kann jetzt durch Vincristin ungefähr in der Hälfte der Fälle eine völlige Remission erreicht werden [z.B. Haggard, M.
E.: Vincristine (NSC-67574/ therapy for Acute Leukemia in Children. Canc. Chemother. Rep. 52 (1968) 477], dem Vincristine kommt also eine lebensrettende Bedeutung zu. Bei bösartigen Hartgeschwulsterkrankungen im Kindesalter konnten ebenfalls in 65 von 94 Fällen eine bedeutende Regression erreicht werden [Selavry, O., Holland, J. F. und Wolman, I. J.: Canc. Chemother. Rep. 52 (1968) 497].
Die vom pharmakologischen Standpunkt aus in Frage kommenden dimeren Alkaloide von Vinca rosea, Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin, sind Minor-Alkaloide der Pflanze, d.h.
von den mehr als 60 in der Pflanze vorkommenden Alkaloiden gerade solche, die nur in sehr geringen Mengen zugegen sind.
Vinblastin und Vinleurosin machen zusammen nur 1-2% der Menge der Gesamt-Alkaloide der Pflanze aus, Vincristin kommt sogar nur in noch um zwei Grössenordnungen geringeren Konzentrationen vor. Es ist daher verständlich, dass deren Abtrennung von den anderen Alkaloiden, Gewinnung und Herstellung in einer für Arzneimittel zu fordernden Reinheit ein sehr sorgfältiges Verfahren erfordert, das wesentlich komplizierter als die für die Abtrennung der Alkaloide bekannten Methoden ist.
Es sind zahlreiche Verfahren zur Gewinnung von Vinblastin und Vinleurosin sowie Vincristin bekannt [Nobel, R. L. und Mitarb.: Ann. N.Y. Acad. Sci. 76 (1958) 882; britische Patentschrift Nr. 870 723; US-Patentschrift Nr. 3 097 131 und 3 205 220; Svoboda, G. H. und Mitarb.: J. Am. Assoc. Sci. ed.
48 (1959) 659; ungarische Patentschrift Nr. 153 200 und
154 7.15; belgische Patentschrift Nr. 624 046], die alle auf einem sauren oder basischen Aufschluss der getrockneten Droge bzw. auf einer sauren oder basischen Vorbehandlung, auf der Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, auf der bei einem oder zwei verschiedenen pH-Werten erfolgenden Überführung der Alkaloide aus wässriger Lösung in das organische Lösungsmittel und schliesslich auf der chromatographischen Fraktionierung des in das organische Lösungsmittel überführten Alkaloidgemisches beruhen.
Obwohl im Verlaufe der weiteren Entwicklung die drei pharmakologisch verwendbaren dimeren Alkaloide mit den angeführten Methoden in immer besserer Qualität und immer besseren Ausbeuten aus der Droge isoliert werden konnten, bereitet der mehrfache Phasenwechsel, aber hauptsächlich die komplizierte chromatographische Trennung noch immer Schwierigkeiten bei der technischen Anwendung dieser Verfahren. Die Kompliziertheit der chromatographischen Trennung ist leicht an der Tatsache zu erkennen, dass die drei dimeren Alkaloide Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin, deren Anteil an der mehr als 60 Alkaloide enthaltenden Gesamtalkaloidmenge 1-2% beträgt, angereichert werden müssen, danach zu isolieren und schliesslich in einer der Verwendung als Arzneimittel entsprechenden Reinheit herzustellen sind.
Die chromatographische Trennung der Gesamt-Alkaloide ist eine sehr umständliche, langwierige und grosse Sorgfalt beanspruchende Operation und erfordert chromatographische Trennsäulen von sehr grossen Dimensionen. Die Grösse der chromatographischen Einrichtung wird ausser durch die Masse der Trennsäule auch gut durch die Menge des zur Trennung zu verwendenden Al203 gekennzeichnet: nach der ungarischen Patentschrift Nr. 154 715 sind zur Gewinnung von aus einer Tonne Droge erhaltbaren 150 g Vinblastin 240 kg Al203 notwendig.
Die Erfindung ermöglicht gegenüber den bisher bekannten Verfahren eine wesentliche Vereinfachung bzw. eine Ausschaltung der Nachteile der auf mehrfachem Phasenwechsel und auf einer komplizierten chromatographischen Trennung beruhenden Verfahren, eine beträchtliche Verminderung der Ausmasse der chromatographischen Einrichtung und weiterhin die gleichzeitige Gewinnung der drei darzustellenden dimeren Alkaloide in besseren Ausbeuten als bisher und in entsprechender Qualität. Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass aus dem aus der Droge hergestellten, grosse Mengen roher Alkaloide enthaltenden Gemisch ein - überwiegend aus Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin bestehendes - Alkaloid Salz unmittelbar abzuscheiden ist, aus dem auf verhältnismässig einfache Weise die obigen Komponenten zu gewinnen sind.
Während der Versuche wurde nämlich festgestellt, dass diese drei dimeren Alkaloide abweichend von dem bisherigen Verfahren auf wesentlich einfachere Art zu gewinnen sind, wenn diese vor der chromatographischen Trennung angereichert werden und man dieses angereicherte, die gewünschten dimeren Alkaloide zu etwa 70% enthaltende Alkaloid-Konzentrat chromatographiert. Die Anreicherung ist derart auszuführen, dass die Droge mit neutralem, wässrigem Methanol ausgelaugt wird, ohne die Droge vor oder während der Extraktion einer basischen oder sauren Behandlung zu unterwerfen.
Aus dieser heiklen, sich leicht zersetzenden, bei der Aufarbeitung des Auszuges gewonnenen Alkaloidmasse können die drei dimeren Alkaloide vom überwiegenden Teil der begleitenden Alkaloide in Form von Säureadditionssalzen, vorteilhafterweise in Form der Sulfatsalze, abgetrennt werden. Auf diese Weise ist die Konzentration dieser Verbindungen 30-40 mal höher als in den bei den bisher bekannten Verfahren zur chromatographischen Fraktionierung kommenden Alkaloid Gemischen. Die chromatographische Trennung ist somit viel einfacher und mit wesentlich kleiner dimensionierten Trennsäulen zu erreichen, weil die gewünschten dimeren Alkaloide von nur in kleinen Mengen vorliegendem Begleitmaterial abzutrennen sind.
Die vorteilhafte Vereinfachung und die Verkleinerung der Säulenausmasse bei der nach dem erfindungsgemässen Verfahren auszuführenden chromatographischen Trennung kann wieder am einfachsten durch die AhOs-Menge gekennzeichnet werden, die für die Fraktionierung des aus einer Tonne der Droge zu erhaltenden Alkaloid-Gemisches erforderlich ist: diese Menge beträgt bei dem erfindungsgemässen Verfahren etwa 20 kg, während bisher 240 kg benötigt wurden.
Die Erfindung ist also ein Verfahren zur selektiven Gewinnung von drei dimeren Alkaloiden aus Vinca rosea L., Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin, oder deren Säureadditionssalzen durch Auslaugen der Droge mit wässrigem Methanol, Einengung des Auszuges bis praktisch zur Methanol-Freiheit, Ansäuern der eingeengten Lösung, Filtration von den durch Ansäuern gefällten Begleitstoffen, Auslaugung der sauren, wässrigen Lösung unter Verwendung von mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln, Alkalisierung der die Alkaloide enthaltenden sauren, wässrigen Phase, Ausziehen der Alkaloide mit mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln und Eindampfen der wasserfreien, organischen Lösung bis zur Trockne unter Erhalt eines Alkaloid-Gemisches und Gewinnung der Alkaloide durch Chromatographieren mit teilweise desaktiviertem Apo3, dadurch gekennzeichnet,
dass die Droge mit neutralem Methanol ausgelaugt wird und das Alkaloid-Gemisch in höchstens 10% Säure enthaltendem Äthanol gelöst wird und das Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin in Form von Säureadditionssalzen kristallisiert und das nach Filtrierung noch geringe Mengen von Begleitstoffen enthaltende Salzgemisch entweder a) in Form der Säureadditionssalze oder b) in Form der nach Alkalisierung der Säureadditionssalze freigesetzten Basen an mit Wasser teilweise desaktiviertem Al203 chromatographiert, danach fraktioniert eluiert wird, und aus den Eluatfraktionen Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin oder deren Säureadditionssalze gewonnen werden.
Die praktische Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens erfolgt vorteilhafterweise auf folgende Art:
Man laugt die gemahlene Droge (Vinca rosea L.) mit 5 bis 20%, vorteilhafterweise 10%, Wasser enthaltendem Methanol mehrmals aus und engt die filtrierten und vereinigten Auszüge unter vermindertem Druck bis zur Entfernung von praktisch des ganzen Methanols ein. Danach wird der wässrige Rückstand zur Entfernung der nicht zu den Alkaloiden gehörenden Begleitkomponenten mit verdünnter Schwefelsäure angesäuert und der entstehende Niederschlag abfiltriert. Die saure wässrige Lösung wird mehrmals mit Benzol ausgelaugt, danach die abgetrennte, saure wässrige Phase alkalisch gemacht und die alkalische wässrige Lösung ebenfalls mit Benzol mehrmals bis zur Alkaloid-Freiheit ausgelaugt.
Die bei dem Auslaugen der alkalischen wässrigen Lösung erhaltenen, vereinigten benzolischen Lösungen werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhält so ein braunes amorphes Alkaloid-Gemisch von lockerer Struktur. Das Alkaloid Gemisch wird in höchstens 10% Schwefelsäure enthaltender äthanolischer Lösung aufgelöst, wobei zugleich der pH-Wert der Lösung auf 4,0-5,0 eingestellt wird. Die Lösung wird mit Kristallen der dimeren Alkaloidsulfate angeimpft und die Kristallisation durch Ankratzen der Gefässwand in Gang gebracht, danach lässt man 2 Tage lang bei Zimmertemperatur kristallisieren. Das ausgeschiedene und abfiltrierte, aus den Sulfaten von Vinblastin, Vinleurosin, Vincristin und begleitenden Alkaloiden bestehende Kristallgemisch wird gelöst und direkt chromatographiert.
Zum Lösen und zur Eluierung wird eine Methylenchlorid-Chloroform-Mischung im Verhältnis 2:1, zur chromatographischen Trennung eine mit Wasser teilweise inaktiviertes Al203 enthaltende Trennsäule verwendet. Die Fraktionen 1 bis 3 enthalten den überwiegenden Teil der noch zugegenen Begleitalkaloide, die Fraktionen 2 bis 9 Vinblastin und Vinleurosin. Vincristin beginnt in Spuren in der 9. Fraktion zu erscheinen und die Elution ist mit der 18. Fraktion beendet.
Die Vinblastin und Vinleurosin enthaltenden Fraktionen werden zur Trockne eingedampft, danach löst man den Rückstand in Äthanol und nach dem Auskristallisieren des Vinleurosins wird Vinblastin aus der Mutterlauge mit höchstens 10% Schwefelsäure enthaltendem Äthanol in Form des Sulfates ausgefällt, abfiltriert und danach zur weiteren Reinigung umkristallisiert.
Die das Vincristin enthaltenden Fraktionen können auch aufgearbeitet werden, indem man den Trockenrückstand in Äthanol löst und das Vincristin auskristallisieren lässt, welches auf gleiche Weise wie oben, in verdünnter äthanolischer Schwefelsäure gelöst, durch Abscheiden des kristallinen Sulfates gereinigt wird.
Man kann auch so verfahren, dass man die Alkaloid-Basen chromatographiert. In diesem Fall wird das aus den Sulfaten von Vinblastin, Vinleurosin, Vincristin und Begleitalkaloiden bestehende Kristallgemisch in Wasser gelöst und die Lösung mit Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,0-9,0 eingestellt.
Aus der alkalischen Lösung werden die Alkaloid-Basen mit Chloroform wiederholt ausgeschüttelt, die vereinigten Chloroform-Lösungen mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, abfiltriert und danach unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Das hauptsächlich die drei dimeren Alkaloide enthaltende Alkaloid-Basen-Gemisch wird in einer Benzol und Chloroform im Verhältnis 1:1 enthaltenden Mischung gelöst und an einer Trennsäule an mit Wasser teilweise inaktiviertem Al2O3 chromatographiert. Zur Eluierung wird ein Lösungsmittelgemisch gleicher Zusammensetzung verwendet. Die Fraktionen 1 bis 10 enthalten Vinblastin und Vinleurosin, die Fraktionen 13 bis 17 Vincristin. Die Aufarbeitung der auf papierbzw. dünnschichtchromatographischem Wege identifizierten Vinblastin und Vinleurosin bzw.
Vincristin enthaltenden Fraktionen erfolgt auf die weiter oben bereits beschriebene Weise.
Einzelheiten des erfindungsgemässen Verfahrens sind den folgenden Beispielen zu entnehmen:
Beispiel 1
100 kg der getrockneten, hauptsächlich aus Blättern bestehenden, gemahlenen Pflanze Vinca rosea L. (Catharanthus roseus G. Don) werden einmal mit 600 1 und zweimal mit je 400 1 90 %igem wässrigem Methanol ausgelaugt. Die filtrierten und vereinigten methanolischen Auszüge werden unter vermindertem Druck - praktisch bis zur Methanol-Freiheit - auf 140 bis 150 1 eingeengt. Danach säuert man zur Entfernung der verschiedenen extrahierten, nicht zu den Alkaloiden gehörenden Verbindungen mit dem gleichen Volumen 5 %iger wässriger Schwefelsäure bis zu einem pH-Wert von 2 an und filtriert den gebildeten, dunkelfarbigen Niederschlag ab.
Die filtrierte saure wässrige Lösung wird dreimal mit je 500 1 Benzol ausgelaugt und danach der pH-Wert der die Alkaloide enthaltenden, abgesonderten sauren wässrigen Phase mit konzentrierter wässriger Ammoniumhydroxid-Lösung auf 8,59,0 eingestellt. Danach laugt man die alkalische wässrige Lösung bis zur Alkaloid-Freiheit drei- bis viermal mit je 600 1 Benzol aus. Die vereinigte benzolische Lösung wird mit wasserfreiem Natriumsulfat oder Kaliumcarbonat getrocknet und danach filtrierte benzolische Lösung unter vermindertem Druck eingedampft. Es werden etwa 700 g eines braunen Alkaloid-Gemisches von lockerer Struktur erhalten.
Das Alkaloid-Gemisch wird in höchstens 10% Schwefelsäure enthaltendem Äthanol gelöst, wobei darauf zu achten ist, dass der pH-Wert der Lösung zwischen 4,0-5,0 liegt. Die Lösung wird mit Vinblastinsulfat-Kristallen eingedampft und die Kristallabscheidung beginnt bald nach dem Ankratzen der Gefässwand. Man lässt zwei Tage lang bei Zimmertemperatur kristallisieren und filtriert danach die ausgeschiedenen Kristalle auf einem Glasfilter ab.
Die Ausbeute beträgt, abhängig von der Qualität der Droge, 20-100 g eines aus Vinblastin-, Vinleurosin- und Vincristinsulfat sowie aus den Sulfaten der Begleitalkaloide bestehenden Kristallgemisches. Das Kristallgemisch der rohen Alkaloid Sulfate wird in einem Methylenchlorid und Chloroform im Verhältnis 2:1 enthaltenden Gemisch gelöst, und zwar werden 7 ml pro g angewandt. Diese Lösung wird an einer mit der hundertfachen Menge, mit Wasser teilweise desaktiviertem Al203 gefüllten Säule chromatographiert und danach mit einem Methylenchlorid und Chloroform im Verhältnis 2 1 enthaltenden Gemisch eluiert. Es werden Fraktionen von 30-50 ml aufgefangen. Die ersten drei Fraktionen enthalten den überwiegenden Teil der Begleitalkaloide. Vinblastin und Vinleurosin werden in der 2. bis 9. Fraktion erhalten.
Vincristin beginnt in Spuren in der 9. Fraktion zu erscheinen und wird bis zur 18. Fraktion eluiert. Die auf papier- bzw. dünnschichtchromatographischem Wege identifizierten Vinblastin und Vinleurosin bzw. Vincristin enthaltenden Fraktionen werden getrennt zur Trockne eingedampft. Ausbeute: 15-75 g eines Vinblastin und Vinleurosin bzw. 0,6-3,0 g eines Vincristin enthaltenden amorphen Trockenrückstandes.
Der Vinblastin und Vinleurosin enthaltende Trockenrückstand wird in der 15-fachen Menge wässrigen Äthanols gelöst.
Das Vinleurosin kristallisiert aus und wird abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Ausbeute: abhängig von der Qualität des Rohproduktes, 5-17 g Vinleurosin. Fp.: 2022050C; [a]2D6 = +720(CHCl3).
Die Mutterlauge des Vinleurosins, die nun nur noch Vinblastin enthält, wird mit wasserfreiem Äthanol auf das zweifache Volumen verdünnt und der pH-Wert der Lösung mit äthanolischer Schwefelsäurelösung auf 4,0 eingestellt. Die Kristallisation des Vinblastinsulfates beginnt schon während der Zugabe der äthanolischen Schwefelsäure. Man lässt dann 16 Stunden im Kühlschrank kristallisieren. Ausbeute: abhängig von der Qualität des Rohstoffes, 15-70 g rohes Vinblastinsulfat.
Das getrocknete und pulverisierte rohe Vinblastinsulfat wird bei Zimmertemperatur in der 20-fachen Menge wasserfreien Methanols gelöst und zu der filtrierten Lösung das vierfache Volumen wasserfreien Äthanols zugegeben. Zur vollständigen Kristallisation des Vinblastins lässt man die Lösung 16 Stunden im Kühlschrank stehen. Bei der Umkristallisation ist eine 90%ige Ausbeute zu erreichen. Ausbeute: abhängig von der Qualität des Rohstoffes, 13-63 g Vinblastinsulfat; [a]26 = -28 (CHCl3).
Zum Zwecke der Identifizierung wird Vinblastin in die Base überführt und aus dieser durch Umkristallisation in Äther Vinblastin-Ätherat hergestellt. Fp.: 201-211 C; [a]26 = + 420 (CHCl3).
Der auf chromatographischem Wege abgetrennte, Vincristin enthaltende amorphe Trockenrückstand von 0,6-3,0 g wird in der 10-fachen Menge wasserfreien Äthanols gelöst und der pH-Wert der Lösung mit äthanolischer Schwefelsäure auf 4,0 eingestellt. Zur vollständigen Kristallisation des Vincristinsulfates lässt man die Lösung 16 Stunden im Kühlschrank stehen.
Die Menge des abfiltrierten, rohen Vincristinsulfates beträgt 60-70% des gelösten, Vincristin enthaltenden amorphen Trockenrückstandes.
Zur Umkristallisation löst man das rohe Vincristinsulfat in möglichst wenig Äthanol gibt danach die vierfache Menge an Äthanol zu, lässt die Lösung zur Auskristallisation 16 Stunden im Kühlschrank stehen und filtriert. Ausbeute: 0,3-1,5 g Vincristinsulfat. Fp.: 21 8-220'C.
Man kann auch so verfahren, dass der auf chromatographischem Wege abgetrennte, Vincristin enthaltende amorphe Trockenrückstand von 0,6-3,0 gin der 5- bis 10-fachen Menge wasserfreien Methanols gelöst und die Vincristinbase zur Kristallisation gebracht wird, die auf die gleiche Art wie oben beschrieben in wasserfreiem Äthanol gelöst und durch Abscheidung als kristallines Sulfat gereinigt wird.
Beispiel 2
Das nach Beispiel 1 gewonnene, abhängig von der Qualität der Droge aus 20-100 g der Sulfate von Vinleurosin, Vinblastin, Vincristin und Begleitalkaloiden bestehende rohe Kristallgemisch wird in Wasser gelöst und die Lösung mit Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,0-9,0 eingestellt. Die Alkaloide werden viermal mit je 11 Chloroform aus der Lösung ausgeschüttelt, die vereinigten Chloroformlösungen mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert und danach unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Ausbeute: 1680 g eines Gemisches der Alkaloid-Basen.
Diese Masse wird in der 3- bis fachen Menge eines aus Benzol und Chloroform im Verhältnis 1:1 bestehenden Gemisches gelöst und danach an einer mit etwa der 40-fachen Menge eines durch Wasser teilweise desaktivierten Al203 gefüllten Säule chromatographiert. Als Elutionsgemisch wird Benzol-Chloroform im Verhältnis 1:1 angewandt.
Nach dem Ablaufen der ersten 2 bis 10 1 des Eluats, die nur geringe Mengen von Begleitalkaloiden enthalten, werden Fraktionen von 0,6-3,0 1 aufgefangen. Die Fraktionen 1-10 enthalten Vinblastin und Vinleurosin, die Fraktionen 11 und 12 sind schon vinblastin- und vinleurosinfrei. Danach wird, abhängig von der Menge des aufgegebenen Kristallgemisches weiter mit 3 bis 18 1 des aus Benzol und Chloroform im Verhältnis 1:1 bestehenden Gemisches eluiert, wobei man Fraktionen von 0,6 bis 3,6 1 auffängt. Die Fraktionen 13-17 enthalten Vincristin.
Die Aufarbeitung der auf papier- bzw. dünnschichtchromatographischem Wege identifizierten Vinblastin und Vinleurosin bzw. Vincristin enthaltenden Fraktionen wird auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise durchgeführt.
The invention relates to a process for the selective production of the following three dimeric alkaloids from Vinca rosea L.
(Catharanthus roseus G. Don) in the form of bases or salts; Vincaleukoblastin (VLB; commonly known name: vinblastine; hereinafter Vinblastin), Leurosin (VLR; commonly known name: vinleurosine; hereinafter Vinleurosine) and Leurocristin (VCR; commonly known name: vincristine; hereinafter Vincristine).
Recently, pharmacologists around the world have been working at considerable intensity to produce cytostatic compounds suitable for the medical treatment of cancer patients. One of the most important results of this research is the discovery of the dimeric alkaloids of Vinca rosea L. and their introduction into therapy. These preparations have been shown to be relatively the most effective agents in clinical practice in the oncology field for nearly a decade.
Vinblastine is an oncolytic drug known since 1959, the clinical application of which results in a considerable reduction in the number of white blood cells in the blood. It was shown to be effective in Hodgkin's disease, acute leukemia and also resistant choriocarcinoma [e.g.
Johnson, I.S., Wright, H.F., Svoboda G.H. and Vlantis, J Cancer Res. 20 (1960) 1016].
The effects of vinleurosine are even less known.
The area of action seems to be the same as that of vinblastine [Johnson and M .: Cancer Res. 23 (1963) 1390; Antitumoral effects of Vinca rosea alkaloids. Proceedings first symposium of the G. E. A. Excerpta Medica Foundation, Amsterdam 1966].
Vincristine was first described or isolated by G. H. Svoboda [Svoboda, G. H .: Alkaloids of Vinca rosea (Catharanthus roseus) IX. Extraction and Characterization of Leurosidine and Leurocristine. Lloydia 24 (1961) 173-178].
It was soon found that this new alkaloid, although similar in effect to the previously discovered vinblastine, is much more beneficial from a pharmacological point of view. In in vitro experiments, vincristine inhibits mitosis of neoplastic cells in the metaphase [e.g. Cardinali, G., Aboul Enein, M. I. M .: Studies on the Antimitotic Action of Leurocristine (Vincristine). Blood 21 (1963) 102]. In clinical use, vincristine has proven to be very advantageous compared to the previously known chemotherapeutic agents in cases of acute leukemia in childhood. While previously no therapeutic success could be achieved in most cases of this disease, a complete remission can now be achieved with vincristine in approximately half of the cases [e.g. Haggard, M.
E .: Vincristine (NSC-67574 / therapy for Acute Leukemia in Children. Canc. Chemother. Rep. 52 (1968) 477], the vincristine is thus of a life-saving importance. In malignant hard tumor diseases in childhood, 65 of 94 cases a significant regression can be achieved [Selavry, O., Holland, JF and Wolman, IJ: Canc. Chemother. Rep. 52 (1968) 497].
The dimeric alkaloids of vinca rosea, vinblastine, vinleurosine and vincristine, from a pharmacological point of view, are minor alkaloids of the plant, i.
of the more than 60 alkaloids occurring in the plant, precisely those that are only present in very small quantities.
Vinblastine and vinleurosine together make up only 1-2% of the total amount of alkaloids in the plant, while vincristine is only found in concentrations that are two orders of magnitude lower. It is therefore understandable that their separation from the other alkaloids, their extraction and production in a purity which is required for pharmaceuticals requires a very careful process which is considerably more complicated than the known methods for separating the alkaloids.
There are numerous processes for the production of vinblastine and vinleurosine as well as vincristine known [Nobel, R. L. et al .: Ann. N.Y. Acad. Sci. 76 (1958) 882; British Patent No. 870,723; U.S. Patent Nos. 3,097,131 and 3,205,220; Svoboda, G. H. and coworkers: J. Am. Assoc. Sci. ed.
48 (1959) 659; Hungarian patent specification No. 153 200 and
154 7.15; Belgian Patent No. 624 046], all of which are based on an acidic or basic digestion of the dried drug or on an acidic or basic pretreatment, on extraction with a water-immiscible organic solvent at one or two different pH values the conversion of the alkaloids from aqueous solution into the organic solvent and finally on the chromatographic fractionation of the alkaloid mixture converted into the organic solvent.
Although, in the course of further development, the three pharmacologically usable dimeric alkaloids could be isolated from the drug with ever better quality and ever better yields using the methods mentioned, the multiple phase changes, but mainly the complicated chromatographic separation, still causes difficulties in the technical application of these Procedure. The complexity of the chromatographic separation can easily be seen from the fact that the three dimeric alkaloids vinblastine, vinleurosine and vincristine, which make up 1-2% of the total amount of alkaloid containing more than 60 alkaloids, have to be enriched, then isolated and finally in a purity corresponding to the use as a medicament are to be produced.
The chromatographic separation of the total alkaloids is a very cumbersome, lengthy and very careful operation and requires chromatographic separation columns of very large dimensions. The size of the chromatographic device is characterized not only by the mass of the separation column but also by the amount of Al203 to be used for separation: according to Hungarian patent specification No. 154 715, 240 kg of Al203 are necessary to obtain 150 g of vinblastine from one ton of drug.
Compared to the previously known methods, the invention enables a substantial simplification or elimination of the disadvantages of the method based on multiple phase changes and a complicated chromatographic separation, a considerable reduction in the dimensions of the chromatographic device and furthermore the simultaneous recovery of the three dimeric alkaloids to be represented in better Yields than before and in the appropriate quality. The invention is based on the knowledge that an alkaloid salt - consisting predominantly of vinblastine, vinleurosine and vincristine - is to be deposited directly from the mixture produced from the drug and containing large amounts of raw alkaloids, from which the above components can be obtained in a relatively simple manner .
During the experiments it was found that these three dimeric alkaloids, in contrast to the previous process, can be obtained in a much simpler way if they are enriched before the chromatographic separation and this enriched alkaloid concentrate containing about 70% of the desired dimeric alkaloids chromatographed. The enrichment must be carried out in such a way that the drug is leached with neutral, aqueous methanol without subjecting the drug to an alkaline or acidic treatment before or during the extraction.
The three dimeric alkaloids can be separated from the majority of the accompanying alkaloids in the form of acid addition salts, advantageously in the form of sulfate salts, from this delicate, easily decomposing alkaloid mass obtained during processing of the extract. In this way, the concentration of these compounds is 30-40 times higher than in the alkaloid mixtures used in the previously known processes for chromatographic fractionation. The chromatographic separation is thus much easier and can be achieved with separating columns of much smaller dimensions, because the desired dimeric alkaloids have to be separated from accompanying material that is only present in small amounts.
The advantageous simplification and reduction of the column dimensions in the chromatographic separation to be carried out according to the method according to the invention can again be most easily characterized by the amount of AhOs required for the fractionation of the alkaloid mixture to be obtained from one ton of the drug: this amount in the method according to the invention about 20 kg, while up to now 240 kg were required.
The invention is therefore a process for the selective extraction of three dimeric alkaloids from Vinca rosea L., vinblastine, vinleurosine and vincristine, or their acid addition salts by leaching the drug with aqueous methanol, narrowing the extract to practically methanol-free, acidifying the concentrated solution Filtration of the accompanying substances precipitated by acidification, leaching of the acidic, aqueous solution using water-immiscible solvents, alkalization of the acidic, aqueous phase containing the alkaloids, extraction of the alkaloids with water-immiscible organic solvents and evaporation of the anhydrous, organic solvents Solution to dryness while obtaining an alkaloid mixture and obtaining the alkaloids by chromatography with partially deactivated Apo3, characterized in that
that the drug is leached with neutral methanol and the alkaloid mixture is dissolved in ethanol containing a maximum of 10% acid and the vinblastine, vinleurosine and vincristine crystallize in the form of acid addition salts and the salt mixture, which still contains small amounts of accompanying substances after filtration, is either a) in the form the acid addition salts or b) chromatographed in the form of the bases released after the alkalization of the acid addition salts on Al 2 O 3 partially deactivated with water, then eluted in a fractionated manner, and vinblastine, vinleurosine and vincristine or their acid addition salts are obtained from the eluate fractions.
The method according to the invention is advantageously carried out in the following manner:
The ground drug (Vinca rosea L.) is leached several times with 5 to 20%, advantageously 10%, water-containing methanol and the filtered and combined extracts are concentrated under reduced pressure until practically all of the methanol is removed. The aqueous residue is then acidified with dilute sulfuric acid to remove the accompanying components that do not belong to the alkaloids and the resulting precipitate is filtered off. The acidic aqueous solution is leached several times with benzene, then the separated, acidic aqueous phase is made alkaline and the alkaline aqueous solution is also leached several times with benzene until it is free from alkaloid.
The combined benzene solutions obtained on leaching the alkaline aqueous solution are evaporated to dryness under reduced pressure. A brown amorphous alkaloid mixture with a loose structure is obtained in this way. The alkaloid mixture is dissolved in an ethanolic solution containing a maximum of 10% sulfuric acid, the pH of the solution being adjusted to 4.0-5.0 at the same time. The solution is inoculated with crystals of the dimeric alkaloid sulphates and crystallization is initiated by scratching the wall of the vessel, after which it is left to crystallize for 2 days at room temperature. The precipitated and filtered crystal mixture consisting of the sulfates of vinblastine, vinleurosine, vincristine and accompanying alkaloids is dissolved and chromatographed directly.
A methylene chloride-chloroform mixture in a ratio of 2: 1 is used for dissolution and elution, and a separation column containing Al 2 O 3 which has been partially inactivated with water is used for chromatographic separation. Fractions 1 to 3 contain most of the accompanying alkaloids, fractions 2 to 9 contain vinblastine and vinleurosine. Vincristine begins to appear in traces in the 9th fraction and the elution is completed with the 18th fraction.
The fractions containing vinblastine and vinleurosine are evaporated to dryness, then the residue is dissolved in ethanol and after the vinleurosine has crystallized out, vinblastine is precipitated from the mother liquor with ethanol containing a maximum of 10% sulfuric acid in the form of the sulfate, filtered off and then recrystallized for further purification.
The fractions containing the vincristine can also be worked up by dissolving the dry residue in ethanol and allowing the vincristine to crystallize, which is purified in the same way as above, dissolved in dilute ethanolic sulfuric acid, by separating out the crystalline sulfate.
One can also proceed in such a way that the alkaloid bases are chromatographed. In this case, the crystal mixture consisting of the sulfates of vinblastine, vinleurosine, vincristine and accompanying alkaloids is dissolved in water and the solution is adjusted to a pH value of 8.0-9.0 with ammonia.
The alkaloid bases are repeatedly extracted from the alkaline solution with chloroform, the combined chloroform solutions are dried with anhydrous sodium sulfate, filtered off and then evaporated to dryness under reduced pressure. The alkaloid-base mixture, which mainly contains the three dimeric alkaloids, is dissolved in a mixture containing benzene and chloroform in a ratio of 1: 1 and chromatographed on a separation column on Al2O3 partially inactivated with water. A solvent mixture of the same composition is used for elution. Fractions 1 to 10 contain vinblastine and vinleurosine, fractions 13 to 17 contain vincristine. The processing of the on paper or vinblastine and vinleurosine or
Fractions containing vincristine are carried out in the manner already described above.
Details of the process according to the invention can be found in the following examples:
example 1
100 kg of the dried, ground plant Vinca rosea L. (Catharanthus roseus G. Don), consisting mainly of leaves, are leached once with 600 liters and twice with 400 liters of 90% aqueous methanol each time. The filtered and combined methanolic extracts are concentrated to 140 to 150 l under reduced pressure - practically until they are free of methanol. Thereafter, to remove the various extracted compounds that do not belong to the alkaloids, the mixture is acidified with the same volume of 5% strength aqueous sulfuric acid to a pH value of 2 and the dark-colored precipitate formed is filtered off.
The filtered acidic aqueous solution is leached three times with 500 l of benzene each time and then the pH of the separated acidic aqueous phase containing the alkaloids is adjusted to 8.59.0 with concentrated aqueous ammonium hydroxide solution. The alkaline aqueous solution is then leached three to four times with 600 liters of benzene each time until it is free from alkaloid. The combined benzene solution is dried with anhydrous sodium sulfate or potassium carbonate and then filtered benzene solution is evaporated under reduced pressure. About 700 g of a brown alkaloid mixture of loose structure are obtained.
The alkaloid mixture is dissolved in ethanol containing a maximum of 10% sulfuric acid, making sure that the pH of the solution is between 4.0-5.0. The solution is evaporated with vinblastine sulfate crystals and the crystal separation begins soon after the vessel wall has been scratched. It is left to crystallize for two days at room temperature and then the precipitated crystals are filtered off on a glass filter.
The yield is, depending on the quality of the drug, 20-100 g of a crystal mixture consisting of vinblastine, vinleurosine and vincristine sulfate and the sulfates of the accompanying alkaloids. The crystal mixture of the crude alkaloid sulfates is dissolved in a mixture containing methylene chloride and chloroform in a ratio of 2: 1, 7 ml per g being used. This solution is chromatographed on a column filled with 100 times the amount of Al 2 O 3, which is partially deactivated, and then eluted with a mixture containing methylene chloride and chloroform in a ratio of 2 l. Fractions of 30-50 ml are collected. The first three fractions contain the majority of the accompanying alkaloids. Vinblastine and vinleurosine are obtained in the 2nd to 9th fractions.
Vincristine begins to appear in traces in the 9th fraction and is eluted up to the 18th fraction. The fractions containing vinblastine and vinleurosine or vincristine, identified by paper or thin-layer chromatography, are separately evaporated to dryness. Yield: 15-75 g of a vinblastine and vinleurosine or 0.6-3.0 g of an amorphous dry residue containing vincristine.
The dry residue containing vinblastine and vinleurosine is dissolved in 15 times the amount of aqueous ethanol.
The vinleurosine crystallizes out and is filtered off, washed and dried. Yield: depending on the quality of the raw product, 5-17 g vinleurosine. M.p .: 2022050C; [a] 2D6 = +720 (CHCl3).
The mother liquor of vinleurosine, which now only contains vinblastine, is diluted to twice its volume with anhydrous ethanol and the pH of the solution is adjusted to 4.0 with an ethanolic sulfuric acid solution. The crystallization of the vinblastine sulphate already begins during the addition of the ethanolic sulfuric acid. It is then left to crystallize in the refrigerator for 16 hours. Yield: depending on the quality of the raw material, 15-70 g of raw vinblastine sulfate.
The dried and pulverized raw vinblastine sulfate is dissolved in 20 times the amount of anhydrous methanol at room temperature and four times the volume of anhydrous ethanol is added to the filtered solution. For complete crystallization of the vinblastine, the solution is left to stand in the refrigerator for 16 hours. A 90% yield can be achieved in the case of recrystallization. Yield: depending on the quality of the raw material, 13-63 g of vinblastine sulfate; [a] 26 = -28 (CHCl3).
For the purpose of identification, vinblastine is converted into the base and produced from this by recrystallization in ether vinblastine etherate. M.p .: 201-211 C; [a] 26 = + 420 (CHCl3).
The amorphous dry residue of 0.6-3.0 g, which was separated by chromatography and contained vincristine, is dissolved in 10 times the amount of anhydrous ethanol and the pH of the solution is adjusted to 4.0 with ethanolic sulfuric acid. For complete crystallization of the vincristine sulfate, the solution is left in the refrigerator for 16 hours.
The amount of filtered, crude vincristine sulfate is 60-70% of the dissolved, vincristine-containing amorphous dry residue.
For recrystallization, the crude vincristine sulfate is dissolved in as little ethanol as possible, then four times the amount of ethanol is added, the solution is left to stand in the refrigerator for 16 hours to crystallize and filtered. Yield: 0.3-1.5 g of vincristine sulfate. M.p .: 21 8-220 ° C.
One can also proceed in such a way that the vincristine-containing amorphous dry residue of 0.6-3.0 g which has been separated off by chromatography is dissolved in 5 to 10 times the amount of anhydrous methanol and the vincristine base is brought to crystallization, which is carried out in the same way is dissolved as described above in anhydrous ethanol and purified by deposition as crystalline sulfate.
Example 2
The raw crystal mixture obtained according to Example 1, depending on the quality of the drug, consisting of 20-100 g of the sulfates of vinleurosine, vinblastine, vincristine and accompanying alkaloids, is dissolved in water and the solution is adjusted to a pH of 8.0-9 with ammonia , 0 set. The alkaloids are shaken out of the solution four times with 11 l of chloroform each time, the combined chloroform solutions are dried with anhydrous sodium sulfate and filtered and then evaporated to dryness under reduced pressure. Yield: 1680 g of a mixture of the alkaloid bases.
This mass is dissolved in 3 to 4 times the amount of a mixture consisting of benzene and chloroform in a ratio of 1: 1 and then chromatographed on a column filled with approximately 40 times the amount of an Al 2 O 3 partially deactivated by water. Benzene-chloroform in a ratio of 1: 1 is used as the elution mixture.
After the first 2 to 10 liters of the eluate, which contain only small amounts of accompanying alkaloids, have run off, fractions of 0.6-3.0 liters are collected. Fractions 1-10 contain vinblastine and vinleurosine, fractions 11 and 12 are free of vinblastine and vinleurosine. Then, depending on the amount of crystal mixture applied, the elution is continued with 3 to 18 liters of the mixture consisting of benzene and chloroform in a ratio of 1: 1, fractions of 0.6 to 3.6 liters being collected. Fractions 13-17 contain vincristine.
The vinblastine and vinleurosine or vincristine-containing fractions identified by paper or thin-layer chromatography are worked up in the manner described in Example 1.