Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung und chemischen Reinigung von Amphoterizin B, das zu den makroliden Heptaenantibiotika gehört.
Das Amphoterizin B findet Verwendung in der medizinischen Praxis bei der Behandlung tiefer Mykosen und anderer Pilzerkrankungen.
Es sind Verfahren zur Gewinnung und chemischen Reinigung von Amphoterizin B, bekannt z.B. ein Verfahren, das darin besteht, dass man das Rohantibiotikum, gelöst in Dime thylformamid, mit Wasser ausfällt, dann den Niederschlag abfiltriert, mit Azeton wäscht und unter Vakuum trocknet. In einem anderen Verfahren löst man das Rohantibiotikum in wässerigem Isopropylalkohol bei einem pH-Wert von 2-3 auf, filtriert den nichtgelösten Niederschlag ab, neutralisiert die Lösung auf einen pH-Wert von 5-7, filtriert den entstandenen Niederschlag des Antibiotikums ab, wäscht es mit Azeton und trocknet unter Vakuum.
Es ist auch ein Verfahren bekannt, in welchem man das Rohantibiotikum aus einer Methanollösung von Kalziumchlorid mit Wasser umfällt und anschliessend dieses wäscht und trocknet. Die Aktivität des nach den genannten Verfahren erhaltenen Endproduktes beträgt 750 mkg/mg.
Ein Nachteil der genannten Verfahren ist, dass keines von diesen eine Reinigung des Amphoterizins B von dem dieses begleitenden inaktiven Heptaen vorsieht. Das letztere bildet sich zusammen mit dem Antibiotikum im Prozess der Fermentation des Produzenten Actinomyces lnodosus. Der genannte Umstand verschlechtert die Qualität des Endproduktes.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, den genannten Nachteil zu vermeiden.
In Übereinstimmung mit dem Ziel wurde die Aufgabe gestellt, durch die Wahl einer neuen wässerig - organischen Komposition und eines entsprechenden technologischen Verfahrens die Qualität des Endproduktes zu erhöhen.
Diese Aufgabe wurde dadurch gelöst, dass man in dem Verfahren zur Gewinnung und chemischen Reinigung von Amphoterizin B durch dessen Ausfällen mit Wasser aus Rohantibiotikumlösung in Dimethylformamid unter anschliessendem Waschen mit einem organischen Lösungsmittel erfindungsgemäss der Rohantibiotikumslösung in Dimethylformamid 0,5 Volumen destilliertes Wasser, bezogen auf das Volumen des Dimethylformamids, zusetzt, das erhaltene Gemisch auf einen pH-Wert von 2,0-3,6 ansäuert, wobei eine Salzbildung stattfindet, die ausgefallenen Verunreinigungen abtrennt, dem Filtrat Wasser in einem Volumen zusetzt, das dem Ausgangslösungsmittel gleich ist, dann den pH-Wert des Gemisches auf 6,5-7,0 bringt, wobei das Amphoterizin B aus seinem Salz freigesetzt wird, und das Endprodukt abtrennt, welches mit wässerigem n - Propanol und Azeton gewaschen und getrocknet wird.
Man bereitet zweckmässig die Rohantibiotikumlösung in Dimethylformamid durch Vermischen von I Gewichtsteil Rohantibiotikum mit 10-20 Volumen Dimethylformamid unter anschliessenden Ansäuern des erhaltenen Gemisches mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 7-7,5.
Das Ansäuern des Gemisches auf einen pH-Wert von 23,6 führt man zweckmässig mit 10%iger wässeriger Salzsäurelösung durch. Das Alkalisieren des Gemisches auf einen pH Wert von 6,5-7,0 führt man zweckmässig mit 1048iger wässeriger Ätznatronlösung durch. Man verwendet zweckmässig zum Waschen des Endproduktes 50%ige wässerige n-Propanollösung.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird zweckmässig wie folgt durchgeführt. Das Ausgangs-Rohamphoterizin B löst man in Dimethylformamid auf. Man bereitet zweckmässig eine Suspension von Rohamphoterizin B in Dimethylformamid. Dazu mischt man 1 Gewichtsteil Rohamphoterizin B mit 10 - 20 Volumen Dimethylformamid. Dann säuert man unter Rühren das Gemisch mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 7 - 7,5 an. Das Gemisch wird noch 1,5 - 2 Stunden bis zur vollständigen Auflösung der Heptaene gerührt. Dann giesst man langsam unter Rühren destilliertes Wasser in einer Menge von 0,5 Volumen zù, bezogen auf das Volumen des eingesetzten Dimethylformamids. Man stellt das Gemisch auf einen pH-Wert von 2,0-3,6 mit 10%iger Salzsäurelösung ein.
Der ausgefallene Niederschlag, der im wesentlichen aus inaktivem Heptaen besteht, wird durch Filtration oder Schleudern abgetrennt und verworfen. Der klaren Lösung giesst man unter Rühren destilliertes Wasser in einer Menge von 1 Volumen zu, bezogen auf das Volumen des Dimethylformamids. Man stellt das Gemisch auf pH von 6,5 - 7,0 durch Zugabe 10%iger Ätznatronlösung ein und filtriert oder schleudert die entstandene Suspension des Antibiotikums. Die erhaltene Paste wäscht man mit 50%iger wässeriger n-Propylalkohollösung, dann mit Azeton und trocknet unter Vakuum. Man erhält Amphoterizin B mit einer spezifischen Aktivität von über 750 mkg/mg, einem Aschegehalt von weniger als 05%.
Das erfindungsgemässe Verfahren macht es möglich, Amphoterizin B hohen Reinheitsgrades zu erhalten, das zur Herstellung von Injektionsarzneiformen bestimmt ist.
Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen für die Durchführung des Verfahrens zur Herstellung von Amphoterizin B näher erläutert.
Beispiel I
25 g Rohamphoterizin B mit einer spezifischen biologischen Aktivität von 500 mkg/mg einer Extinktion E }7cOm = 1100 und einem Gehalt an Amphoterizin A weniger als 5% mischt man mit 500 ml Dimethylformamid bei einer Temperatur von 20"C. Unter Rühren bringt man das Gemisch auf einen pH-Wert von 7,2 mit konzentrierter Salzsäure. Das Gemisch rührt man noch 1,5 Stunden. Der erhaltenen Lösung giesst man langsam während 1 Stunde unter Rühren 250 ml destilliertes Wasser zu. Man stellt ein pH des Gemisches von 3,2 durch Zugabe 10%iger Salzsäurelösung ein.
Der ausgefallene Niederschlag wird unter Vakuum abfiltriert und verworfen. Der klaren Lösung giesst man unter Rühren 500 ml destilliertes Wasser zu. Man stellt im Gemisch ein pH von 6,5 durch Zugabe 1 0%iger wässeriger Ätznatronlösung ein und schleudert die entstandene Suspension. Die erhaltene Paste des Antibiotikums wäscht man unter Rühren mit 500 ml 50Sigen wässerigen n-Propylalkohols während 2 Stunden bei Zimmertemperatur. Nach beendetem Waschen wird die Paste geschleudert, mit Azeton gewaschen, filtriert und unter Vakuum bei einem Restdruck von 10 Torr und einer Temperatur von 200C getrocknet. Das Gewicht des Fertigproduktes beträgt 8,0 g, die spezifische biologische Aktivität des Pulvers 800 mkg/mg und die Extinktion E l ' m = 1500.
Die Ausbeute an Amphoterizin B, bezogen auf die im Rohprodukt enthaltene Aktivität, beträgt 51cd.
Beispiel 2
100 g Rohamphoterizin B mit einer spezifischen biologischen Aktivität von 500 mgk/mg, einer Extinktion E:e, = 1150 und einem Gehalt an Amphoterizin A weniger als 5% bringt man in einen mit einem Rührwerk versehenen emaillierten Apparat ein. Man giesst 1 Liter Dimethylformamid zu und bringt unter Rühren den pH-Wert des Gemisches auf 7.0 durch Zugabe konzentrierter Salzsäure. Das Gemisch rührt man noch 2 Stunden. Der erhaltenen Lösung giesst maa langsam während 1,5 Stunden unter Rühren 0,5 Liter destilliertes Wasser zu. Man stellt im Gemisch ein pH von 2,8 durch Zugabe konzentrierter Salzsäure ein. Der ausgefallene Niederschlag wird durch Schleudern abgetrennt und verworfen. Der klaren Lösung im emaillierten Apparat giesst man unter Rühren 1 Liter destilliertes Wasser zu.
Man stellt im Gemisch ein pH von 6,8 durch Zugabe 10%iger wässeriger Ätznatronlösung ein und trennt den ausgefallenen Niederschlag des Antibiotikums durch Schleudern ab. Die erhaltene Paste wäscht man im emaillierten Apparat mit 2 Liter 50%igen wässerigen n-Propanols während 3 Stunden bei Zimmertemperatur. Nach beendetem Waschen schleudert man die Paste, wäscht mit Azeton, filtriert und trocknet unter Vakuum bei einem Restdruck von 10 Torr und einer Temperatur von 200C. Das Gewicht des Fertigproduktes beträgt 20 g die spezifische biologische Aktivität des Pulvers 900 mkg/mg und die Extinktion E 1% = 1500. Die Ausbeute an Amphoterizin B, bezogen auf die im Rohprodukt enthaltene Aktivität, beträgt 36%.
The present invention relates to a process for the production and chemical purification of amphotericine B, which belongs to the macrolid heptaene antibiotics.
Amphotericine B is used in medical practice in the treatment of deep mycoses and other fungal diseases.
Methods for the recovery and chemical purification of amphotericine B are known e.g. a process which consists in that the crude antibiotic, dissolved in dimethylformamide, is precipitated with water, then the precipitate is filtered off, washed with acetone and dried under vacuum. In another process, the crude antibiotic is dissolved in aqueous isopropyl alcohol at a pH of 2-3, the undissolved precipitate is filtered off, the solution is neutralized to a pH of 5-7, the precipitate of the antibiotic that has formed is filtered off and washed it with acetone and dry under vacuum.
A method is also known in which the raw antibiotic is reprecipitated from a methanol solution of calcium chloride with water and then washed and dried. The activity of the end product obtained by the processes mentioned is 750 mkg / mg.
A disadvantage of the processes mentioned is that none of them provide for a purification of the amphotericin B from the inactive heptaene accompanying it. The latter forms together with the antibiotic in the fermentation process of the producer Actinomyces lnodosus. The mentioned circumstance deteriorates the quality of the end product.
The aim of the present invention is to avoid the disadvantage mentioned.
In accordance with the goal, the task was set to increase the quality of the end product by choosing a new water-organic composition and a corresponding technological process.
This object was achieved in that in the process for the production and chemical purification of amphotericine B by precipitating it with water from crude antibiotic solution in dimethylformamide with subsequent washing with an organic solvent, according to the invention, the crude antibiotic solution in dimethylformamide 0.5 volume of distilled water, based on the Volume of the dimethylformamide, added, the resulting mixture acidified to a pH of 2.0-3.6, whereby salt formation takes place, the precipitated impurities are separated, water is added to the filtrate in a volume that is equal to the starting solvent, then the Bringing the pH of the mixture to 6.5-7.0, the amphotericine B being released from its salt, and separating the end product, which is washed with aqueous n-propanol and acetone and dried.
The raw antibiotic solution is expediently prepared in dimethylformamide by mixing 1 part by weight of raw antibiotic with 10-20 volumes of dimethylformamide and then acidifying the resulting mixture with hydrochloric acid to a pH of 7-7.5.
The acidification of the mixture to a pH of 23.6 is expediently carried out with a 10% aqueous hydrochloric acid solution. The alkalization of the mixture to a pH of 6.5-7.0 is expediently carried out with 1048 aqueous caustic soda solution. It is advisable to use 50% aqueous n-propanol solution for washing the end product.
The process according to the invention is expediently carried out as follows. The starting crude amphoterizine B is dissolved in dimethylformamide. It is expedient to prepare a suspension of crude amphoterizine B in dimethylformamide. To this end, 1 part by weight of crude amphoterizine B is mixed with 10-20 volumes of dimethylformamide. The mixture is then acidified to a pH of 7-7.5 with concentrated hydrochloric acid while stirring. The mixture is stirred for a further 1.5-2 hours until the heptaenes have completely dissolved. Distilled water is then slowly poured in with stirring in an amount of 0.5 volume, based on the volume of the dimethylformamide used. The mixture is adjusted to a pH of 2.0-3.6 with 10% hydrochloric acid solution.
The deposited precipitate, which consists essentially of inactive heptaene, is separated off by filtration or centrifugation and discarded. The clear solution is poured with stirring distilled water in an amount of 1 volume, based on the volume of the dimethylformamide. The mixture is adjusted to pH 6.5-7.0 by adding 10% caustic soda solution, and the resulting suspension of the antibiotic is filtered or centrifuged. The paste obtained is washed with 50% aqueous n-propyl alcohol solution, then with acetone and dried under vacuum. Amphotericine B is obtained with a specific activity of over 750 mkg / mg, an ash content of less than 05%.
The process according to the invention makes it possible to obtain amphotericine B of a high degree of purity, which is intended for the production of injection medicament forms.
The invention is explained in more detail below with the aid of examples for carrying out the process for the preparation of amphotericine B.
Example I.
25 g of raw amphotericine B with a specific biological activity of 500 mkg / mg, an extinction E} 7cOm = 1100 and an amphotericine A content of less than 5% are mixed with 500 ml of dimethylformamide at a temperature of 20 ° C. This is brought about while stirring Mixture to pH 7.2 with concentrated hydrochloric acid. The mixture is stirred for a further 1.5 hours. 250 ml of distilled water are slowly poured into the resulting solution over a period of 1 hour with stirring. The pH of the mixture is adjusted to 3. 2 by adding 10% hydrochloric acid solution.
The deposited precipitate is filtered off under vacuum and discarded. 500 ml of distilled water are poured into the clear solution while stirring. A pH of 6.5 is set in the mixture by adding 10% strength aqueous caustic soda solution and the resulting suspension is centrifuged. The antibiotic paste obtained is washed with stirring with 500 ml of 50% aqueous n-propyl alcohol for 2 hours at room temperature. When the washing is complete, the paste is centrifuged, washed with acetone, filtered and dried under vacuum at a residual pressure of 10 torr and a temperature of 200.degree. The weight of the finished product is 8.0 g, the specific biological activity of the powder is 800 mkg / mg and the extinction E l'm = 1500.
The yield of amphotericine B, based on the activity contained in the crude product, is 51 cd.
Example 2
100 g of crude amphotericine B with a specific biological activity of 500 mgk / mg, an extinction E: e, = 1150 and an amphotericine A content of less than 5% are introduced into a glass-lined apparatus equipped with a stirrer. 1 liter of dimethylformamide is poured in and the pH of the mixture is brought to 7.0 by adding concentrated hydrochloric acid, while stirring. The mixture is stirred for a further 2 hours. The resulting solution is slowly poured in 0.5 liters of distilled water over 1.5 hours with stirring. A pH of 2.8 is set in the mixture by adding concentrated hydrochloric acid. The deposited precipitate is separated off by centrifugation and discarded. 1 liter of distilled water is poured into the clear solution in the enamelled apparatus while stirring.
A pH of 6.8 is set in the mixture by adding 10% strength aqueous caustic soda solution and the precipitate of the antibiotic which has precipitated is separated off by centrifuging. The paste obtained is washed in a glass-lined apparatus with 2 liters of 50% strength aqueous n-propanol for 3 hours at room temperature. When the washing is complete, the paste is centrifuged, washed with acetone, filtered and dried under vacuum at a residual pressure of 10 torr and a temperature of 200.degree. The weight of the finished product is 20 g, the specific biological activity of the powder is 900 mkg / mg and the extinction E 1% = 1500. The yield of amphotericine B, based on the activity contained in the crude product, is 36%.