Zur Züchtung von Gewebezellen und Mikroorganismen sind in den letzten Jahren eine Reihe von Apparaten und Vorrichtungen entwickelt worden. Vielfach geht die Züchtung von Gewebezellen mit derjenigen von Mikroorganismen - wie.z.B.
der Züchtung von Viren Hand in Hand. Die entsprechenden Apparate werden jeweils dem gewünschten Verfahren angepasst.
Sowohl Gewebezellen als auch Mikroorganismen werden für verschiedene Zwecke gezüchtet. So werden unter anderem Gewebezellen in Substraten gezüchtet, d. h. künstlich vermehrt um anschliessend mit den für eine Vermehrung vorgesehenen Viren angeimpft zu werden. Die Viren ihrerseits vermehren sich -quasi als Parasiten- auf den lebenden Zellen und können anschliessend an diese Vermehrung zur Herstellung von Vaccinen geerntet werden. Gewebezellen werden aber auch an und für sich gezüchtet - sei es zur Herstellung von Enzymen oder für die Erzeugung von Proteinen.
Das hier gefundene Verfahren mit der zugehörigen apparativen Vorrichtung eignet sich insbesondere für die Herstellung sogenannter diploider Zellen. Diploide Zellen werden vor allem für die Herstellung von Human-Vaccinen gezüchtet.
Sie allein können und dürfen für die Herstellung von Virus Vaccinen verwendet werden, welche in der Human-Medizin zur Anwendung gelangen.
Diploide Zellen haben die Eigenschaft, dass sie sich in ihrer ursprünglichen Form, d. h. eben der diploiden Form, nur auf einem festen Träger vermehren und nur in einer einzelligen Schicht. Eine solche Schicht nennt sich Monolayer und ist in der Literatur ausgiebig beschrieben.
Die einfachste Apparatur und das einfachste Verfahren zur Erzeugung solcher diploiden Zellen besteht darin, dass die entsprechende Züchtung in einer Glasflasche mit flachem Boden durchgeführt wird. Die für die Züchtung benötigte Flüssigkeit, welche vielfach eine komplizierte Zusammensetzung aus Serum, Vitaminen, Salzen, Antibiotika usw. aufweist, wird in die Flaschen eingefüllt und mit den zu züchtenden Gewebezellen angeimpft. Die angeimpften Zellen sinken langsam auf den Boden der Flasche, setzen sich dort fest und beginnen sich unter geeigneten Bedingungen flächenmässig zu vermehren. Nachdem der ganze Flaschenboden überdeckt ist, können die Zellen geerntet werden - z. B. durch Ausgiessen des überstehenden Substrates und anschliessendes Auskratzen der Zellen - oder aber die Zelldecke verbleibt auf dem Flaschenboden und wird direkt mit einer Virus-Suspension sekundär angeimpft.
Die Viren dringen in die Zellen ein und vermehren sich dort in bekannter Weise und können anschliessend selbst geerntet werden. Die Ernte sowohl der Zellen als auch der Viren ist eine nicht sehr einfache Angelegenheit. Oft haften die Organismen ziemlich fest auf der Unterlage und die sterile Entfernung ist umständlich.
Wie erwähnt, vermehren sich diploide Zellen auf einer Oberfläche nur in einer einzelligen Schicht. Es ist leicht ersichtlich, dass demzufolge grosse Flächen notwendig sind, um nur relativ kleine Zellsubstanzmengen-zu züchten. Es wurden dann verschiedene Apparate-Typen entwickelt, welche diesem Übelstand Rechnung tragen. Gefässe mit übereinanderliegenden Glas- oder Metallscheiben, liegende Gefässe mit horizontaler Achse und vertikalen rotierenden Scheiben usw. Alle diese Apparate haben aber Nachteile: entweder sie sind schwer zu reinigen, d. h. von der Zellsubstanz zu befreien oder die Flächen sind relativ klein, wie dies beispielsweise bei den sogenannten < cRoller-Tube -Apparaten der Fall ist, bei welchen eine Anzahl zylindrischer Gläser in ein grosses Rad eingesteckt und langsam rotiert werden.
Gegenstand dieser Erfindung ist ein mit einer apparativen Vorrichtung verbundenes Verfahren, welches auf einfache Weise Züchtung auf einer grossen Oberfläche, automatische Ernte ohne Öffnung des Apparates und Arbeiten unter absoluter Sterilität gestattet.
Es ist ein Verfahren zur Züchtung von Gewebezellen und Mikroorganismen in einem mit rotierbaren Flächen versehenen Behälter, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Animpfung der Zellen und Mikroorganismen bei kleiner Tourenzahl der Flächen erfolgt und deren Auswaschung bei einer erhöhten Tourenzahl.
Bei der Durchführung des Verfahrens wird am besten wie folgt vorgegangen:
Das zur Züchtung der Zellen verwendete Substrat wird in einen Apparat eingefüllt, in welchem sich eine mit verschiedenen Tourenzahlen rotierbare, geeignete Haftfläche befindet.
Die Haftfläche ist so ausgebildet, dass diese teilweise in das Substrat ragt, teilweise in den Gasraum des Gefässes. Während der Impf- und Wachstumsperiode wird die Tourenzahl sehr klein gehalten, so dass sich die Zellen festsetzen können.
Nach beendetem Wachstum kann das Substrat abgelassen, Vi rus-Impfmateriaf zugegeben und die Viren direkt auf der Zellschicht gezüchtet werden. Für die Ernte wird die Tourenzahl der Haftfläche so weit gesteigert, bis sich das Zellmaterial durch Reibung mit der Flüssigkeit von dieser Haftfläche löst und entleert werden kann.
Sofern Zellen gezüchtet werden, welche sehr stark haften, wird vor der Ernte dem Substrat am besten eine körnige Substanz zugegeben wie z. B. Quarzsand, Kunststoffgranulat, Kieselgur usw. Durch die erhöhte Reibung durch solche Substanzen können auch fest haftende Zellen - vor oder nach der Virus-Impfung - von der Haftfläche entfernt werden. Die Zugabe von solchen Granulaten ist auch geeignet, eine gute Reinigung des gesamten Apparates zu bewerkstelligen, so dass dieser vor dem nächsten Ansatz nicht demontiert werden muss.
Es versteht sich von selbst, dass das ganze Prozedere im allgemeinen unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden muss, so wie in der übrigen Fermentiertechnik bekannt. Die Drehrichtung der Haftfläche kann geändert werden, wenn dies z.B. für die gute Entfernung der Zellen und der Granulate nötig ist.
Ebenfalls Gegenstand dieser Erfindung ist eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens, die dadurch gekennzeichnet ist, dass in einem Behälter eine spiralförmig aufgewickelte Fläche so angeordnet ist, dass diese Fläche um ihre horizontale Achse rotiert werden kann.
Unter Bezugnahme auf Fig. 1 werden nun bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beschrieben:
In einem für die Fermentation, d. h. die Züchtung geeigneten Behälter, ist eine in horizontaler Lage eingebaute Spirale 1 aus Metall, Glas oder Kunststoff eingebaut, welche an der Aussenseite 2 und an der Innenseite 3 offen ist. Wird diese spiralförmige Fläche um ihre Längsachse 4 rotiert, so durchströmt das Kultursubstrat die gesamte Oberfläche der Spirale
1, indem die Flüssigkeit bei 2 einströmt und bei 3 die Spirale verlässt. Die Kulturflüssigkeit wird nur so hoch ion den Behälter eingefüllt, dass genügend Gasraum im Behälter zur Verfügung steht, um eine einwandfreie Begasung des Substrates zu gewährleisten.
Die Drehung der Spirale kann dadurch erfolgen, dass. der ganze Behälter von aussen rotiert wird, oder aber die Spirale ist auf eine Achse 4 montiert, welche von aussen durch eine sterile Abdichtung 5 in Rotation versetzt werden kann. Diese zweite Art des Antriebs der Spirale 1 hat insofern einen Vorteil, als die für die Zufuhr von Flüssigkeiten und Gasen vorgesehenen Anschlüsse 6 statisch sind, d. h. nicht mitrotieren. Die Spirale 1 kann auf ihren Seitenflächen offen sein, wobei allerdings eine weniger klare Geometrie der Flüssigkeitsströmung vorhanden ist, als wenn sie durch die beiden seitlichen Abschlussplatten 7 abgeschlossen ist.
Der Behälter hat unten geeignete, sterile Abflussöffnungen für die Entleerung und die Ernte 8. Für die Rotation sind verschiedene Geschwindigkeiten vorgesehen, d. h. eine langsame für die Animpfung und für die Gewebevermehrung und eine grössere für die Auswaschung und die Ernte. Der ganze Apparat ist so konstruiert, dass er entweder gesamthaft im Autoklaven sterilisiert werden kann (unter Abkupplung des Antriebes) oder aber so, dass er direkt durch innere oder äussere Beheizung sterilisiert wird. Für kleinere Einheiten kann der Behälter die Form eines liegenden Glaszylinders 9 haben, der vermittels der Zugstangen 10 und den beiden Deckeln 11 verschlossen ist. Die Achse 4 kann vorzugsweise auch als Hohlkörper ausgebildet sein und zwar so, dass die Heizung und Kühlung durch die eingebauten Röhren 12 erfolgt.
Wird nun der beschriebene Apparat z. B. mit Gewebezellen angeimpft und mit einer entsprechenden Kulturflüssigkeit gefüllt, so wachsen die Zellen auf der Spiraloberfläche, wenn diese nur ganz langsam rotiert wird. Die Zellen können anschliessend durch schnelle Rotation entfernt- oder aber direkt mit den zu züchtenden Viren angeimpft werden. Die Auswaschung erfolgt wie oben beschrieben, dh. durch Rotation allein, oder aber durch Zusatz eines geeigneten abrasiven Mittels.
A number of apparatus and devices have been developed in recent years for growing tissue cells and microorganisms. In many cases, the cultivation of tissue cells goes hand in hand with that of microorganisms - such as e.g.
the breeding of viruses hand in hand. The corresponding equipment is adapted to the desired process.
Both tissue cells and microorganisms are grown for different purposes. For example, tissue cells are grown in substrates, i. H. Artificially multiplied in order to then be inoculated with the viruses intended for multiplication. The viruses in turn multiply - as it were as parasites - on the living cells and can then be harvested after this multiplication for the production of vaccines. However, tissue cells are also grown in and of themselves - be it for the production of enzymes or for the production of proteins.
The method found here with the associated apparatus is particularly suitable for the production of so-called diploid cells. Diploid cells are mainly grown for the production of human vaccines.
They alone can and may be used for the production of virus vaccines, which are used in human medicine.
Diploid cells have the property that they are in their original form, i.e. H. of the diploid form, multiply only on a solid support and only in a single-celled layer. Such a layer is called a monolayer and is extensively described in the literature.
The simplest apparatus and the simplest method for producing such diploid cells is that the corresponding cultivation is carried out in a glass bottle with a flat bottom. The liquid required for cultivation, which often has a complicated composition of serum, vitamins, salts, antibiotics, etc., is poured into the bottles and inoculated with the tissue cells to be cultivated. The inoculated cells slowly sink to the bottom of the bottle, settle there and begin to multiply under suitable conditions. After the entire bottom of the bottle is covered, the cells can be harvested - e.g. B. by pouring out the protruding substrate and then scraping out the cells - or the cell cover remains on the bottom of the bottle and is directly inoculated with a virus suspension.
The viruses penetrate the cells and multiply there in a known manner and can then be harvested themselves. Harvesting both cells and viruses is not a very simple matter. Often the organisms adhere quite firmly to the surface and sterile removal is cumbersome.
As mentioned, diploid cells only multiply in a single cell layer on a surface. It is easy to see that, as a result, large areas are necessary in order to only cultivate relatively small amounts of cell substance. Various types of apparatus were then developed which take this disadvantage into account. Vessels with glass or metal disks lying on top of one another, lying vessels with a horizontal axis and vertical rotating disks, etc. However, all these apparatuses have disadvantages: either they are difficult to clean, i. H. to free from the cell substance or the surfaces are relatively small, as is the case, for example, with the so-called <cRoller-Tube devices, in which a number of cylindrical glasses are inserted into a large wheel and slowly rotated.
The subject of this invention is a method associated with an apparatus, which allows cultivation on a large surface in a simple manner, automatic harvesting without opening the apparatus and work under absolute sterility.
It is a method for culturing tissue cells and microorganisms in a container provided with rotatable surfaces, which is characterized in that the cells and microorganisms are inoculated with a small number of revolutions of the surfaces and their washing out with an increased number of revolutions.
When performing the procedure, it is best to proceed as follows:
The substrate used to grow the cells is filled into an apparatus in which there is a suitable adhesive surface that can be rotated with different speeds.
The adhesive surface is designed so that it partially protrudes into the substrate, partially into the gas space of the vessel. During the vaccination and growth period, the number of revolutions is kept very small so that the cells can attach themselves.
When the growth is complete, the substrate can be drained off, virus inoculum can be added and the viruses can be grown directly on the cell layer. For the harvest, the number of revolutions of the adhesive surface is increased until the cell material is released from this adhesive surface by friction with the liquid and can be emptied.
If cells are grown which adhere very strongly, it is best to add a granular substance to the substrate before harvesting, e.g. B. quartz sand, plastic granulate, kieselguhr, etc. Due to the increased friction caused by such substances, firmly adhering cells - before or after the virus vaccination - can be removed from the adhesive surface. The addition of such granules is also suitable for cleaning the entire apparatus thoroughly so that it does not have to be dismantled before the next batch.
It goes without saying that the entire procedure must generally be carried out under sterile conditions, as is known in other fermentation technology. The direction of rotation of the adhesive surface can be changed, e.g. is necessary for the good removal of the cells and the granules.
This invention also relates to a device for carrying out the method, which is characterized in that a spiral-shaped surface is arranged in a container in such a way that this surface can be rotated about its horizontal axis.
Preferred embodiments of the invention will now be described with reference to FIG.
In one for fermentation, i.e. H. a container suitable for cultivation, a spiral 1 made of metal, glass or plastic is installed in a horizontal position, which is open on the outside 2 and on the inside 3. If this spiral surface is rotated around its longitudinal axis 4, the culture substrate flows through the entire surface of the spiral
1, in that the liquid flows in at 2 and leaves the spiral at 3. The culture liquid is only filled into the container so high that there is enough gas space available in the container to ensure proper aeration of the substrate.
The spiral can be rotated by rotating the entire container from the outside, or the spiral is mounted on an axle 4 which can be set in rotation from the outside by a sterile seal 5. This second type of drive of the spiral 1 has an advantage in that the connections 6 provided for the supply of liquids and gases are static; H. do not rotate. The spiral 1 can be open on its side surfaces, although the geometry of the liquid flow is less clear than when it is closed by the two lateral end plates 7.
The container has suitable, sterile drainage openings at the bottom for emptying and harvesting 8. Various speeds are provided for the rotation, i. H. a slow one for inoculation and tissue reproduction and a larger one for leaching and harvesting. The entire apparatus is designed in such a way that it can either be completely sterilized in the autoclave (by disconnecting the drive) or in such a way that it is sterilized directly by internal or external heating. For smaller units, the container can have the shape of a horizontal glass cylinder 9 which is closed by means of the tie rods 10 and the two lids 11. The axis 4 can preferably also be designed as a hollow body in such a way that the heating and cooling takes place through the built-in tubes 12.
If now the apparatus described z. B. inoculated with tissue cells and filled with an appropriate culture liquid, the cells grow on the spiral surface when it is rotated very slowly. The cells can then be removed by rapid rotation or they can be inoculated directly with the virus to be grown. The washing takes place as described above, ie. by rotation alone or by adding a suitable abrasive agent.