Die Erfindung bezieht sich auf ein enzymhaltiges Gemisch zur Mundpflege und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Gemisches.
Die Nützlichkeit proteolytischer und amylytischer Enzyme zum Verflüssigen, Auflösen und Entfernen eiweiss- und kohlenhydrathaltiger Rückstände auf Gewebeoberflächen wird immer eingehender erkannt. Beispielsweise herrscht heute Übereinstimmung, dass die wichtigste Ursache des Kariesbeginns in der Gärung von Zucker zu Säure durch Einwirkung von Bakterien in der unmittelbaren Umgebung der Zähne liegt. Die unmittelbare Umgebung der Zähne ist der Zahnbelag, der neben weicher, äusserer, am Zahn haftender Substanz auch eine festhaftende Schicht umfasst. Der Zahnbelag enthält über 70% Bakterien, während der Rest Speichel und Speisereste sind. Man hat festgestellt, dass eingenommener Zucker rasch durch den Zahnbelag diffundiert, und dass praktisch alle Bakterien des Zahnbelages Zukker in Säure umwandeln können.
Wenn die so gebildete Säure den kritischen pH-Wert von 5 oder darunter erreicht, wird der Schmelz aufgelöst. Es ist klar, dass das Auflösen des Schmelzes zur Kariesbildung führt.
Die Säurekonzentration ist von verschiedenen Faktoren abhängig. Obwohl praktisch alle Bakterien im Zahnbelag aus Zucker Säure bilden, schwankt die Säurebildungsgeschwindigkeit. So bilden z. B. Streptococcen am raschesten Säure, wobei jedoch bei niedriger pH-Werten die Geschwindigkeit abnimmt. Lactobazillen setzen bei einer niedrigeren Geschwindigkeit ein, produzieren aber noch bei pH 4 Säure.
Andere Organismen im Zahnbelag, wie Staphylococcen und Fadenbakterien, bilden Säure in einer niedrigeren Geschwindigkeit.
Der wichtigste Faktor, der das Entkalken oder Auflösen des Schmelzes durch Säure im Zahnbelag bestimmt, ist dessen Dicke. Man hat festgestellt, dass der pH an der schmelzberührenden Seite des Zahnbelages niedriger ist als auf der mit dem Speichel in Berührung stehenden Oberfläche, was teilweise der Pufferkapazität des Speichels zugeschrieben wird. Es wurde ferner beobachtet, dass je dicker der Zahnbelag, desto niedriger der pH-Wert seiner schmelzberührenden Oberfläche ist. Dick ist der Zahnbelag an Stellen, wie den Zahnzwischenräumen, wo die Säurebildung durch Speisereste begünstigt wird, dünn ist er über glatten Oberflächen, welche auf natürliche Weise gereinigt werden. Demzufolge sind die Zahnzwischenräume kariesanfälliger als die glatten Zahnflächen.
Die Zahnbelagbildung ist ein ständiger Vorgang und wiederholt sich rasch selbst nach mechanischer Reinigung. Kann man die Zahnbelagdicke jedoch minimal halten, dann hat die gebildete Säure einen höheren pH-Wert und diffundiert leichter in den Speichel.
Zu den Problemen, die vom Zahnbelag herrühren, kommen noch die mit dem Gesundheitszustand des Zahnfleisches und der Kieferknochenstruktur in der Mundhöhle zusammenhängenden Probleme. Zahnsteinbildung ist der grösste Einzelfaktor in der Äthiologie marginaler Gingivitis und Periodontitis. Allerdings ist der genaue Mechanismus der Zahnsteinbildung noch nicht bekannt.
Die wichtigsten vorgebrachten Theorien können in eine bakteriologische und eine physico-chemische Gruppe eingeteilt werden. Nach der bakteriologischen Theorie bilden die Organismen im Mund eine lokale Alkalinität und die Zersetzung der Speichelproteine in ihrer unmittelbaren Umgebung. Die Änderungen der lokalen Umgebung wiederum verursachen das Ausfällen von Salzen aus dem Speichel. Die verantwortlichen Organismen sind fadenförmig und gehören zu den Leptotrichia und Actinomyces. Die physicochemischen Theorien berücksichtigen hingegen andere Faktoren, wie Kohlensäureverlust, Ammoniakbildung, Proteindenaturierung oder -Zersetzung, Änderungen der Oberflächenspannung und der kolloiden Eigenschaften. Alle diese Faktoren haben eines gemeinsam: Sie benötigen eine organische Unterlage zur Ablagerung der ausgefällten Mineralien.
Eine solche liefert der oben erwähnte Zahnbelag, sei er vollständig ausgebildet oder im Anfangsstadium als schleimiger Speichelüberzug auf den Zahnflächen.
Sein Vermindern oder Ausschalten würde daher das Anwachsen des Zahnsteins herabsetzen und zur allgemeinen Hygiene der Schleimhaut und Kieferknochen beitragen.
Ein weiteres Problem im Zusammenhang mit der Mundhygiene ist die Ansammlung von Speiseresten und normal abgestossenen toten Zellen aus Schleimhaut, Zunge und geschützten Teilen der Mundhöhle. Speisereste bestehen im wesentlichen aus eiweiss- und kohlenhydrathaltigem Material, das einen idealen Nährboden für Mundbakterien bietet.
Die Reizstoffe aus der Verwesung und Gärung infolge von Bakterieneinwirkung auf Speisereste beeinträchtigen die Gesundheit der Mundgewebe. Abfallzellen aus normalem gesundem Gewebe im Mund fallen täglich in einem solchen Mass an, dass sie ein wichtiges Element des Rückstandes im Mund bilden, der - wenn nicht entfernt - zur Vermehrung der Mikroorganismen in der Mundhöhle beiträgt.
Zweck der Erfindung ist die Schaffung von Gemischen zur Mundpflege zwecks Kontrolle, Entfernung und Verhütung von Zahnbelag, Zahnstein und Speiseresten von den Zähnen und der Schleimhaut und ein Verfahren zur Herstellung solcher Gemische. Ein erfindungsgemässes Gemisch ist dadurch gekennzeichnet, dass es als wirksame Komponenten bakteriell erzeugte und vorzugsweise von Bacillus subtilis erzeugte Protease und Amylase enthält. Eine solche Mischung von Protease und Amylase hat sich als ausgezeichnet für die Mundhygiene erwiesen.
Die im Mund vorliegenden Speisereste bestehen vor allem aus stärke- und eiweisshaltigem Material, wie oben erwähnt, während die Geweberückstände eiweisshaltig sind. Die Proteasen im erfindungsgemässen Gemisch hydrolysieren spezifisch die eiweisshaltigen Stoffe im Mund, während die Amylasen die stärkehaltigen Stoffe hydrolysieren. Demzufolge hydrolysieren Protease und Amylase kombiniert den grössten Teil der in Speise- und Geweberückständen enthaltenen Bestandteile. Insbesondere eignen sich die aus Bakterien gewonnenen Enzyme, die insbesondere in der USA-Patentschrift Nr. 3 031 380 beschrieben sind und die'wegen ihrer verhältnismässig hohen Ungefährlichkeit, grossen Wirksamkeit und anderen Eigenschaften zur Verwendung in Mundpflegemitteln bevorzugt werden.
Proteasen und Amylasen hydrolysieren teilweise die Speise- und Gewebereste zwischen den Zähnen, wodurch diese Reste gelockert werden und sich durch Spülen oder Bürsten leicht aus dem Mund entfernen lassen. Die dazu vorgesehenen Proteasen und Amylasen hydrolysieren vorzugsweise Speise- und Gewebereste, während sie das lebende Zahnfleisch und die Schleimhaut nicht angreifen. Die Eigenschaft, Speise- und necrotische Gewebereste bevorzugt zu hydrolysieren, ohne das lebende Gaumengewebe und die Mundschleimhaut anzugreifen, wurde besonders bei Protease und Amylase festgestellt, die aus Bacillus substilis gewonnen wurden.
Die wichtige Protease-Amylase-Komponente kann in verschiedener Form zur Zahnpflege dienen. Die Enzyme können als Pulver mit geeigneten Aroma- und /oder Farbstoffen vorliegen. Das Pulver wird in Wasser gelöst und die erhaltene Lösung als Mundwasser verwendet.
Die Protease-Amylase-Komponente kann auch in Form einer stabilisierten Lösung vorliegen, die unmittelbar als Mundwasser dient.
Ferner kann die hydrolytische Wirkung der Enzyme durch Zähnebürsten unterstützt werden, wobei man die Protease Amylase-Komponente in eine stabilisierte Zahnpastenrezeptur oder in ein Zahnpulvergemisch einbringt.
Als weitere brauchbare Präparatform zum längeren Einwirken auf die Zähne lässt sich Protease-Amylase in verhältnismässig geringen Konzentrationen in eine bonbonartige Lutschtablette einarbeiten, die man langsam im Mund zergehen lässt. Eine innige Berührung der Enzyme mit den Zähnen lässt sich auch durch Einbringen der Protease-Amy lase-Komponente in eine Gummigrundlage zur Herstellung von Kaugummi erzielen. Die mechanische Wirkung des Kauens ergänzt die hydrolytische Wirkung der Protease Amylase-Komponente und begünstigt somit die Entfernung von Speise- und Geweberesten von den Zähnen.
Obwohl sich die oben erwähnten Arten von Präparaten für die Anwendung von Enzymen auf lebende Gewebe zur Entfernung von daran haftenden eiweiss- und kohlenhydrathaltigen Rückständen eignen, hat man von der Verwendung solcher Enzyme in Handelsprodukten bisher abgesehen, weil es nicht möglich war, die aktiven Stoffe in einen flüssigen Träger derart einzuarbeiten, dass ihre Enzymaktivität während der normalen Lagerzeit solcher Produkte erhalten blieben. Vom Zeitpunkt der Herstellung an kann sich die Lagerzeit bis zu zwei Jahren erstrecken, bevor das Produkt tatsächlich verbraucht wird. In wässriger oder zum Teil wässriger Lösung gelöst erleiden alle Enzyme eine rasche Autolyse oder Selbstzersetzung. Unter diesen Umständen verlieren die Enzyme rasch ihre Aktivität und werden durch Selbstverdauung abgebaut.
Natürlich sinkt die Enzymaktivität eines Produktes in einem solchen Falle rasch auf einen Punkt, wo es seine Wirksamkeit verloren hat. Diese Enzyme, insbesondere solche bakteriellen Ursprungs, werden auch durch Gegenwart hoher Konzentrationen von Hydroxylionen (wie sie in wässriger Lösung vorkommen) inhibiert oder inaktiviert, und es -ist daher ein schwieriges Problem, die Enzymaktivität über längere Zeit aufrechtzuerhalten.
Wegen der Autolyse von Enzymen in flüssigen, wässrigen Lösungen enthalten die gegenwärtigen Handelsprodukte solche hydrolytische Enzyme gewöhnlich in trockener Form, trotzdem die flüssige Form vielfach erwünschter wäre und zahlreiche flüssige Pasten- und Creme-Produkte sich durch Enzymzusatz verbessern liessen.
Enzymzusatz zu trockenen Rezepturen ist ferner untor- teilhaft, weil die Enzyme nicht leicht wasserlöslich sind, und sich ihre Lösungsdauer häufig über die zur Verfügung stehende Einwirkungszeit auf die eiweiss- und kohlehydrathaltigen Rückstände hinauszieht.
Dementsprechend umfassf die Erfindung ferner ein Verfahren zur Herstellung von oben beschriebenen enzymhaltigen Gemischen, welches erlaubt, Produkte zu bilden, in denen die Enzyme gelöst in flüssiger Lösung vorliegen und ihre Aktivität darin lange Zeit beibehalten.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man insbesondere von Bacillus subtilis erzeugte Protease und Amylase in entionisiertem Wasser mit löslichem
Calciumsalz löst und die Lösung mit einer solchen Menge eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels vermischt, die dem endgültigen Gemisch einen Wassergehalt bis zu 15 Gewichtsprozent gibt. In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 in einem Diagramm den Einfluss der Wasserkonzentration auf die Aktivität von Proteasen in flüssiger Lösung und
Fig. 2 in einem Diagramm die Enzymaktivität oder Lagerfähigkeit von stabilisierten Lösungen.
Allgemein gehört die Klasse der zur Mundhygiene ge eigneten bakteriellen Proteasen der Endopeptidase-Gruppe an. Als Endopeptidasen bezeichnet man solche Proteasen, welche die inneren Peptidbindungen im Eiweissmolekül hydrolysieren, im Gegensatz zu den Proteasen, welche die einer freien polaren Gruppe, wie -COOH, benachbarten Peptidbindungen hydrolysieren. Die Endopeptidasen fallen in eine der folgenden Kategorien:
1. Tierische Endopeptidasen: Trypsin, Chymotrypsin, Cathepsine,
2. Pflanzliche Endopeptidasen: Papain, Ficin, Bromelin,
3. Bakterielle und Schimmel-Endopeptidasen.
Obschon alle angeführten Endopeptidasen Proteine hydrolysieren, hat sich herausgestellt, dass sich die vom Bacillus subtilis erzeugte Protease für Präparate der Mundhygiene besonders gut eignet.
Die Bacillus substilis-Protease zeigt einen breiten Sicherheitsbereich, weist ein pH-Optimum von etwa 7 auf (entsprechend dem pH im Mund) und kann in Pulverform erhalten werden. Die Eigenschaften der Bacillus subtilis-Protease sind von Ramon und Richou in Compt. rend. 220. 341 (1945) beschrieben worden. Ein Verfahren zur Erzeugung von Bacillus subtilis-Protease beschreibt die USA-Patentschrift Nr. 3 031 380.
Es wurde festgestellt, dass sich Proteaseaktivitäten im Bereich von 100 bis über etwa 100 000 Einheiten zur Verwendung in Präparaten zur Mundhygiene eignen. Als Einheit der Proteaseaktivität definiert man jene Proteasemenge, die unter den Bedingungen der modifizierten Kunitz-Methode auf einem Caseinsubstrat 0,5 y in Trichloressigsäure lösliches Tyrosin bildet. Einzelheiten der Kunitz-Methode geben Northrup und Kunitz in J. Gen. Physiol., 16.313 (1933), und ebenfalls einzeln in J. Gen. Physiol., 22, 79 (1939).
Die jeweilige Protease-Konzentration in einem gegebenen Präparat hängt von der vorgesehenen Einwirkungszeit auf die zu hydrolysierenden Speisereste ab. So wird z. B. eine in einem Präparat zur Gebissreinigung enthaltene Protease in verhältnismässig geringer Aktivität von etwa 100 Einheiten angewandt, da eine längere Einwirkungsdauer des Präparates auf Speise- und Geweberückstände (gewöhnlich über Nacht) zur Verfügung steht. Wo die Einwirkungszeit verhältnismässig kurz ist, wie bei einem Mundwasser zur Spülung des Mundes, setzt man höhere Proteaseaktivitäten von im allgemeinen bis zu 100 000 Einheiten ein.
Wie oben erwähnt, lassen sich Präparate mit aus Bacillus subtilis gewonnener Protease mit hohen Proteaseaktivitäten (über 100 000 Einheiten) unbedenklich verwenden, da die Protease vorzugsweise die denaturierten Proteine in Speise- und Geweberückständen hydrolysiert, während sie Zahnfleisch und Schleimhaut nicht angreift.
In den erfindungsgemässen Präparaten zur Mundhygiene wird ferner von Bacillus subtilis erzeugte Amylase angewandt.
Die Bacillus subtilis-Amylase, wie die Protease, zeigt ein pH Optimum von 6,5 bis 7,0, welches etwa dem pH im Mund entspricht. Die Eigenschaften der B acillus subtilis-Amylase sind von Hopkins und Kulka in J. Inst., Brewing, 48, 170 (1942) beschrieben worden. Ein Verfahren zur Erzeugung von Bacillus subtilis-Amylase ist in der USA-Patentschrift Nr. 3 031 380 angegeben.
Es hat sich gezeigt, dass die bevorzugte Amylaseaktivität für die Verwendung in Präparaten zur Mundhygiene nicht unter 25% derjenigen der Protease liegt, auf Grund von willkürlichen (und nicht verwandten) Verfahren zur Bestimmurig dieser Arten der Enzymhydrolyse. Eine Einheit der Amylaseaktivität ist definiert als jene Amylasemenge, die unter den Bedingungen der modifizierten Bernfeld-Methode 0,4 mg Maltosehydrat auf einem Stärkesubstrat erzeugt. Einzelheiten der modifizierten Bernfeld-Methode sind von P. Bernfeld in Collowick & Kaplans Methods in Enzymology, Seite 149, 1955, Acad. Press, New York, beschrieben worden.
Wie bei der Protease werden in der Regel auch niedere Amylase-Aktivitäten in Präparaten dort angewandt, wo sie längere Zeit auf die Zähne einwirken, z. B. bei Reinigungsmitteln für Gebisse. In ähnlicher Weise werden höhere Amylaseaktivitäten (bis etwa 100 000 Einheiten) im allgemeinen in Präparaten angewandt, die nur verhältnismässig kurze Zeit auf die Zähne einwirken, z. B. bei Mundwassern.
Bezüglich der Methoden zur Stabilisierung flüssiger, die erwähnten Enzyme enthaltender Präparate wurde festgestellt, dass insbesondere die von Bacillus subtilis erzeugte Protease und Amylase ihre ursprüngliche Aktivität selbst in gelöster Form beibehalten, wenn sie in einem Lösungsmittel aus einer organischen Flüssigkeit in Gegenwart einer beschränkten Menge Wasser gelöst werden.
Als organische Lösungsmittel eignen sich Poyalkohole, wie Glycerin und Polypropylenglycerin am besten aus Stabilisierung solcher Enzymlösungen. Immerhin eignet sich jede organische Flüssigkeit, sofern die Enzyme darin löslich sind, diese ihrerseits in Wasser löslich ist und sie kein Ausfällen der Enzyme verursacht. So ist z. B. Azeton, obwohl es eine nicht polare wasserlösliche, organische Flüssigkeit ist, nicht geeignet, weil es die Enzyme aus den Lösungen ausfällt.
Ebenfalls enthalten die prosthetischen Gruppen der vom Bacillus subtilis nach der USA-Patentschrift Nr. 3 031 380 erzeugten Enzyme Zink, weshalb keine Chelatbildner anwesend sein dürfen. Überdies hat sich gezeigt, dass die Gegenwart von Calciumionen eine wichtige Rolle zur Aufrechterhaltung der Enzymstabilität oder Aktivität in Lösung spielt.
Zu diesem Zweck gibt man vorzugsweise lösliche Calciumsalze, wie Calciumlactat oder Calciumchlorid in einer Menge von 0,05 bis etwa 0,5 Gewichtsprozent der stabilisierten Lösung zu.
Es ist ferner von Vorteil, das pH des Präparates im Bereich von 6 bis 8 zu halten, da die grösste Aktivität der Bacillus subtilis-Enzyme in diesem Bereich liegt. Zu diesem Zweck lassen sich geeignete bekannte Puffersubstanzen, wie Milchsäure und Natriumbicarbonat, verwenden, trotzdem in einigen Präparaten, d. h. jenen mit dem endgültigen pH im gewünschten Bereich, dies nicht erforderlich ist.
Der Begriff flüssige Enzympräparate soll hier selbst halbflüssige , wie Zahnpaste, umfassen. Die einzige Bedingung zur Bezeichnung der vorliegenden Präparate als flüssige Enzympräparate, ist das Vorliegen des Enzyms im eigentlich gelösten Zustand darin.
Man hat auch festgestellt, dass bei Verwendung von oberflächenaktiven Stoffen in den stabilisierten Präparaten nichtionische bevorzugt sind, weil ionische Detergentien anscheinend die prosthetischen Gruppen der vom Bacillus subtilis erzeugten Enzyme stören. Es ist dagegen möglich, ionische oberflächenaktive Stoffe in niedrigen Konzentrationen, d. h.
unter 0,5 % einzusetzen, um so Kombinationen nichtionischer und ionischer oberflächenaktiver Stoffe zu ermöglichen, um das erwünschte Schäumen einer Zahnpaste zu erzielen.
Fig. 1 zeigt, dass die Verminderung des Wassergehaltes die Aktivität proteolytischer Enzyme in deren Lösung stabilisiert. Umgekehrt zeigt Fig. 1 auch die gegensätzliche Wirkung höherer Wasserkonzentrationen in solchen Lösungen.
Die Versuchslösungen enthielten Protease gelöst in Glycerin Wasser-Lösungen. Ein Studium der Fig. 1 zeigt, dass bei der Senkung des Wassergehaltes der Lösung auf unter 30% die Aktivität der darin gelösten proteolytischen Enzyme während einer Dauer von mindestens 3 Monaten unvermindert blieb. Anderseits wurde durch Steigerung des Wassergehaltes, z. B. auf 65%, die Aktivität des proteolytischen Enzyms nach 3 Monaten auf unter 30% der ursprünglichen Aktivität herabgesetzt. Noch geringere Glycerinkonzentrationen und noch grössere Wassergehalte bewirken noch krassere Verluste an Enzymaktivität.
Nach Fig. 1 lässt sich feststellen, dass eine Senkung des Wassergehaltes unter 30% die Enzymstabilität auf eine Dauer von mindestens 3 Monaten verlängert. Weitere Versuche haben ergeben, dass stärkere Senkung des Wassergehaltes die Enzymstabilität noch mehr steigert. Eine Verminderung des Wassergehaltes auf unter 15% bewirkt z. B. eine gleichbleibende Enzymaktivität während 24 Monaten und länger. Zwei Jahre werden als genügende Lagerzeit für die hier vorgesehenen Präparate betrachtet, womit gemäss einer besonderen Ausführungsform erfindungsgemässe flüssige Präparate auf einen Wassergehalt von höchstens 15% eingeschränkt werden.
Völlige Wasserfreiheit der flüssigen Präparate ist aus ästhetischen Gründen nicht erwünscht, da etwas Wasser in den flüssigen Rezepturen ein ansehnlicheres und geschmacklich ansprechenderes Produkt liefert.
Beispiel 1
Ein Mundwasserkonzentrat enthielt folgende Bestandteile:
Enzyme (Protease- und
Amylasegemisch) 1,4 Gewichtsprozent
Calciumchlorid 0,5 Gewichtsprozent
Natriumchlorid 0,5 Gewichtsprozent
Destilliertes Wasser 7,0 Gewichtsprozent
Geschmackstoffe 1,1 Gewichtsprozent
Saccharin 1,0 Gewichtsprozent Äthanol 3,8 Gewichtsprozent
Glycerin 84,7 Gewichtsprozent
Das obige Konzentrat wurde Stabilitätsprüfungen über Zeiträume von mehr als drei Jahren unterworfen und Lösungen, die mehrere Monate vor Gebrauch hergestellt wurden, in kontrollierten Versuchen geprüft.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse der während eines Zeitraumes von 39 Monaten durchgeführten Stabilitätsprüfungen. Die ausgezogene Kurve zeigt die Proteaseaktivität, während die gestrichelte Kurve die Amylaseaktivität bedeutet. Wie die Figur zeigt, wurde kein Verlust der Proteaseaktivität und ein nur 7 %iger Verlust der Amylaseaktivität während der ersten zwei Jahre beobachtet. Nach dieser Zeit allerdings fielen die Enzymaktivitäten sehr rasch ab. Die Probe des in den obigen Versuchen verwendeten Mundwasserkonzentrates wurden während der ganzen Zeit ohne Kühlung in einem Laboratorium ohne Klimaanlage in Honolulu, Hawaii aufbewahrt.
Die mittlere Feuchtigkeit im Laboratorium schwankte zwischen 70 und 85% bei einer mittleren Temperatur von 22 bis 29"C.
Zusätzlich wurden Mundwasserkonzentrate praktisch der gleichen Rezeptur wie oben mindestens einige Monate nach ihrer Herstellung in doppelten Blindversuchen geprüft. Diese geprüften Mundwasser wiesen Protease- und Amylaseaktivitäten von je 5000 Einheiten/Milligramm auf. In einem ersten Versuch an 50 Personen, wobei die eine Hälfte ein mit Ausnahme des aktiven Enzymbestandteiles dem Enzymmundwasserkonzentrat identisches Placebo verwendete, zeigten die Versuchspersonen bei Verwendung der Enzymlösung eine 56 %ige Verminderung des Zahnbelages nach vier Wochen verglichen mit der anderen Hälfte. In einem weiteren Versuch wurden 14 Personen in einer Anfangsprophylaxe aller Zahnbelag entfernt.
Nach Verwendung der Enzymlösung zeigte sich eine 32 XOige Hemmung der Zahnbelagbildung nach zwei Wochen verglichen mit dem Rest der Gruppe.
Es sei bemerkt, dass sich die stabilisierten Enzymkonzentrate als solche aufbewahren lassen und später zu irgendwelchen enzymatisch wirksamen Produkten rezeptieren lassen. Es ist lediglich darauf zu achten, dass das verdünnte Produkt nach seiner Herstellung kurzfristig verbraucht wird.
Beispiel 2
Eine Zahnpasta wurde nach der folgenden Rezeptur zum Studium der Wirksamkeit hergestellt:
Bakteriell erzeugte Enzyme 2,00 Gewichtsprozent
Glycerin 40,00Gewichtsprozent
Propylenglycol 5,26 Gewichtsprozent
Konservierungsmittel 0,20 Gewichtsprozent
Entionisiertes Wasser 8,00 Gewichtsprozent
Natriumchlorid und
Calciumlactat 0,30 Gewichtsprozent
Caciumcarbonat 32,54 Gewichtsprozent
Sorbit, kristallin 8,30 Gewichtsprozent
Aroma- und Farbstoffe 0,40 Gewichtsprozent
Quarzstaub 3,00 Gewichtsprozent
Aus Versuchsgründen enthielt diese Rezeptur absichtlich kein Schaummittel und weniger Aroma, so dass ausser dem üblichen Scheuermittel Calciumcarbonat das Gemisch bakteriell erzeugter Protease und Amylase den einzigen aktiven Bestandteil darstellte.
Femer stellte man ein dem aktiven Präparat identisches Placebo ohne Enzymkomponente her. Die Produkte wurden derart codifiziert, dass weder der Untersuchende noch die Versuchspersonen das Produkt identifizieren konnten.
Insgesamt 70 Personen wurden in diesen Versuch einbezogen und aus Patienten praktizierender Zahnärzte ausgewählt. Die Versuchspersonen wurden willkürlich in zwei Gruppen von je 35 geteilt und als Gruppe A und Gruppe B bezeichnet. Eine Person zog sich von den Versuchen zurück und die Angaben sieben weiterer wurden nicht ausgewertet, weil sie vor dem Versuch nicht genügend Zahnbelag aufwiesen, um eine statistisch brauchbare Aussage zu geben. Die Ergebnisse erfassen also 30 Personen in Gruppe A (7 männliche und 23 weibliche Personen) und 32 Personen in Gruppe B (11 männliche und 21 weigliche Personen) im Alter zwischen 14 und 56 Jahren, wobei Gruppe A ein mittleres Alter von 29,6 und Gruppe B von 27,7 Jahren aufwies.
Den Versuchspersonen wurde eine Zahnpastatube und eine Zahnbürste (Oral B, medium) übergeben, wobei die eine Gruppe das enzymhaltige Produkt (Code PB 125) und die andere Gruppe das Placebo (Code PB 066) erhielt. Sie wurden angewiesen ausschliesslich die Versuchspaste und die übergebene Bürste anzuwenden, einmal am Morgen und einmal am Abend, und nach Gebrauch möglichst wenig zu spülen (um so von der Wirkung des Enzymrückstandes zu profitieren). Die Dosierung bei Verwendung der übergebenen Bürste wurde im Durchschnitt auf ein Gramm berechnet.
Beim Wechsel wurde den Versuchspersonen, die Code Nr.
PB 125 erhalten hatten, nun Code Nr. 066 überreicht (deren Tube sich deutlich von der vorangehenden unterschied), worauf sie angewiesen wurden die erste Tube nicht mehr zu verwenden; analog wurden der anderen Gruppe Tuben mit dem Code Nr. PB 125 zum Ersatz der Tube Nr. 066 überreicht.
Auswertung
Die Versuchspersonen wurden zu Beginn untersucht und je 12 Vorderzähne vollständig gereinigt und der Zahnbelag entfernt. Als Mass nach subjektiver Schätzung diente eine Skala von 0 bis 5 unter Verwendung einer Nachweislösung.
Vorgedruckte Karten mit je einem Feld für die 12 Vorderzähne dienten zum Festhalten des auf jedem einzelnen Zahn vorhandenen Belags. Ein Wert von 2 bedeutete, dass 40% der Zahnoberfläche einen Belag aufwiesen, während ein Wert von 5 einer vollständigen (100%) Bedeckung der Zahnoberfläche mit Belag entsprach. Das Total der Angaben für die 12 Zähne ergab die Belagszahl der Versuchsperson, so dass z. B. eine Belagszahl von 30 bedeutete, dass 50% der gesamten Oberfläche der 12 Vorderzähne einen Belag aufwies (30 geteilt durch den Maximalwert von 60). Überdies wurden Farbphotographien von jeder Versuchsperson nach jeder Untersuchung hergestellt.
Nach zwei Wochen wurde eine zweite Untersuchung vorgenommen, der Belag vollständig entfernt und die Gruppen vertauscht. Auf Grund der Entfernung des Zahnbelages wurde eine Wartezeit zwischen der ersten und zweiten Hälfte der Untersuchung als nicht notwendig erachtet, da jede Enzymrestaktivität innerhalb einiger Stunden abgeklungen war.
Die dritte und letzte Untersuchung wurde am Ende der zwei ten zweiwöchigen Dauer vorgenommen. Die drei Unter buchungen an allen Versuchspersonen wurden alle zur gleichen Tageszeit durchgeführt. Die Ergebnisse wurden auf Karten mit Name, Alter und Geschlecht der Versuchsperson übertragen und die Farbbilder in Dreierserien der Nummer der Versuchsperson in ein Album geklebt.
Erbegnisse:
Wie der Versuchablauf andeutet, war das Hauptziel dieser vorläufigen Untersuchung die Bestimmung des Ausmasses, in welchem eine bestimmte enzymhaltige Zahnpasta die Zahnbelagbildung verzögern würde. Dies wird als strengere Prüfung betrachtet, als eine, deren Messung die Verzögerung der Belagsbildung zusammen mit der Auflösung des vorhandenen Belages bestimmt. Die Enzymwirkung lässt sich augenfälliger demonstrieren, wenn genügend Substrat zur Verdauung vorliegt, als nur in niedriger Konzentration.
Demnach würde ein Versuch ohne vorherige Entfernung des Zahnbelages eine grössere statistische Aussage erwarten lassen, als einer, bei welchen kein Zahnbelag (Substrat) zu Beginn vorhanden ist.
In dieser Untersuchung erhielt Gruppe A das enzymhaltige Produkt, während der ersten Hälfte, und Gruppe B das Placebo. Die Zahl der Versuchspersonen mit einer abnehmenden Zahnbelagbildung bei Verwendung des Produktes verglichen mit dem Placebo, sowie die prozentuale Abnahme sind in Tabelle I zusammengestellt. Alle ausser drei Versuchspersonen zeigten einen Rückgang der Belagsbildung bei Verwenudung des Produktes, wobei das Mittel für Gruppe A 48,3 %, für GruppeB 58,2% aufwies, was einemGesamtmittel von 53,7% entsprach. Drei Versuchspersonen zeigten niedrigere Belagszahlen nach dem Gebrauch des Placebo als nach Gebrauch des Produktes mit einer mittleren Abnahme von 4,6 Punkten, oder 32,2%.
Tabelle
Analyse der Einzelresultate
Gruppe Gruppe kombi
A B niert Anzahl der Versuchspersonen 30 32 62 Anzahl mit niedrigeren Belagszahlen mit Produkt als mit Placebo 28 31 59 Mittelwert bei Versuchspersonen mit Produkt 12,4 10,5 11,4 Mittelwert dieser Versuchspersonen mit Produkt 24,0 25,1 24,6 Prozentuale Verzögerung mit Produkt 48,3% 58,2% 53,7% Anzahl mit niedrigeren Belagszahlen mit Placebo als mit Produkt 2 1 3 Mittelwert dieser Versuchspersonen mit Placebo 4,5 20 9,7 Mittelwert dieser Versuchspersonen mit Produkt 11,0 21 14,3 Prozentuale Verzögerung mit Placebo 50,0% 4,8% 32,2%
Die Angaben der Gruppenergebnisse aus diesem Versuch sind in Tabellen II und III zusammengefasst.
Tabelle II vergleicht Ergebnisse mit Belagszahlen vor der Entfernung des Belages und gilt als bezeichnend für die erste Hälfte der Untersuchung, da festgestellte Belagszahlen vor Versuchsbeginn verglichen werden. Während dieser ersten Hälfte zeigte die Produktgruppe eine Belagsverzögerung von 55,6% verglichen mit der Kontrollgruppe. Nach Vertauschen des Produktes mit Placebo erhöhte sich die Belagsbildung der Gruppe A innerhalb von zwei Wochen auf 84,5% der Gruppenzahl vor Versuchsbeginn. Die Verwendung von Placebo bei Gruppe B ergab praktisch keine Verzögerung der Belagsbildung, wogegen nach dem Wechsel auf das Produkt eine 55,4 %ige Verzögerung beobachtet wurde, verglichen mit den Zahlen vor Versuchsbeginn.
Tabelle II
Analyse der Gruppenresultate gegenüber den
Voruntersuchungszahlen
Gruppe Gruppe
A B Mittlere Voruntersuchungsbelagszahl 28,5 24,5 Mittlere Zahl nach den ersten zwei Wochen 12,3 24,2 Mittlere Zahl nach den zweiten zwei Wochen 22,7 10,8 Prozentuale Änderung mit Produkt -56,8 % -55,9% mit Placebo +84,6% - 1,2%
Produkt gegenüber Placebo in der ersten Hälfte -55,6%
Tabelle III zeigt die Ergebnisse jeder Gruppe beim Vergleich mittlerer Belagszahlen nach zweiwöchigem Gebrauch des Produktes mit den Zahlen nach zweiwöchigem Gebrauch des Placebos.
In dieser Analyse war die durchschnittliche Verbesserung der Belagsverzögerung in den entsprechenden Gruppen 51,1% und verglichen mit den entsprechenden Kontrollgruppen eine Verzögerung von 50,5 %.
Tabelle III
Analyse der Gruppenergebnisse
Gruppe Gruppe kombi
A B niert Anzahl Versuchspersonen 30 32 62 Gesamtbelagszahlen mit Produkt 369 346 715 Mittel 12,3 10,8 11,5 Gesamtbelagszahlen mit Placebo 682 775 1457 Mittel 22,7 24,2 23,5 Mittlere Verbesserung in der Gruppe 10,4 13,4 12,0 Prozent 46,2% 55,4% 51,1% Mittlere Verbesserung gegenüber der Kontrollgruppe 11,9 11,9 11,9 Prozent 49,0% 52,5 % 50,5 %
Ein ähniiches Resultat ergibt die Analyse von 10 Versuchspersonen in jeder Gruppe, deren ursprüngliche Belagszahlen in beiden Gruppen das gleiche Mittel zeigten und so einen Vergleich zwischen den ausgeglichenen Gruppen bezüg lich der ungefähren Häufigkeit der Belagsbildung (Tabelle IV) erlaubten.
Hier zeigten die kleineren Gruppen eine 53,9 bzw. 59,3 %ige Verzögerung und in der ersten Hälfte der Produktgruppe ein 57,2%ige Verbesserung verglichen mit der Kontrollgruppe.
Tabelle IV
Analyse der Ergebnisse an zehn Versuchspersonen in jeder Gruppe, deren mittlere Zahlen gleich waren (ausgeglichene Gruppen)
Gruppe Gruppe
A B Anzahl Versuchspersonen 10 10 Mittlere ursprüngliche Belagszahl 32,7 32,7 Mittlere Belagszahl nach den ersten zwei Wochen 13,4 31,3 Mittlere Belagszahl nach den zweiten zwei Wochen 26,3 12,7 Verzögerung durch das Produkt in der Gruppe 12,9 18,6
Verzögerung in der Gruppe 53,9% 59,3% Verzögerung des Produktes gegenüber der Kontrollgruppe 17,9 13,6 Verzögerung gegenüber der Kontrollgruppe 57,2% 51,7% Schlussfolgerung:
:
Dieser doppelte Austausch-Blindversuch zeigte, dass eine Zahnpaste, worin aus Bacillus subtilis gewonnene Protease und Amylase den einzigen Wirkstoff bildet eine deutliche Wirksamkeit bei der Verzögerung der Zahnbelagbildung aufweist, verglichen mit den ursprünglichen Belagszahlen und mit der Verwendung von Placebo, mit einer über 50 %igen Hemmung der Belagsbildung verglichen mit diesen beiden.
Beispiel 3
Stabilisierte Zahnpasta
Bacillus subtilis-Protease kombiniert mit Amylase 1,00%
Glycerin* 19,55% Sorbitlösung (70% Sorbit, 30% OJo H2O)* 15,00% Sorbitkristallin 8,30%
Propylenglycol 5,25%
Destilliertes Wasser 8,00%
Salze (NaCl und Calciumlactat) 0,20 %
Calciumcarbonat 33,00%
Polysorbat (nichtionisches Detergens,
Schaummittel) 5,00%
Aroma-, Farb- und Schutzstoffe 1,70%
Verdickungsmittel (Quarzstaub) 3,00% * Glycerin kann allein anstelle von Glycerin und Sorbit verwendet wer den. In diesem Falle beträgt sein Anteil 39,55%.
Die Zahnpastarezeptur nach Beispiel 3 ist eine stabilisierte Enzymmischung. Stabilisierung in diesem Zusammenhang bedeutet, dass die Enzymaktivität der Zahnpasta auf praktisch 100% der ursprünglichen Enzymaktivität bei der Herstellung verbleibt. Daher behält eine nach Beispiel 3 zusammengesetzte Zahnpasta ihre ursprüngliche Enzyme aktivität während einer Dauer von etwa 24 Monaten.
Diese Stabilisierung erzielt man durch sorgfältige Dosierung des Wassergehaltes im Enzymgemisch. Mit einem Wassergehalt unter 15 % erreicht man eine langanhaltende Enzymstabilität und biologische Aktivität.
Die folgenden Beispiele sind typische Rezepturen trockener Mundpflegemittel, die ein Protease-Amylase-Gemisch als hydrolytischen Enzymbestandteil enthalten:
Beispiel 4
Zahnpulver
Bacillus subtilis-Protease und -Amylase 1,0 %
Gefällte Kreide 92,4%
Calciumlactat 0,1%
Zahnseife, nichtionische 5,0%
Aroma- und Farbstoffe usw. 1,5 %
Beispiel 5
Atemdesodorisierende Tablette
Bacillus subtilis-Protease und -Amylase 1,0%
Calciumlactat 0,1%
Mannit 97,4%
Aromastoffe 1,5%
Durch langsames Zergehenlassen im Mund unterstützt diese Tablette die Entfernung von Speise- und Geweberesten, die oft Ursache eines schlechten Mundgeruches sind, oder dazu beitragen.
Beispiel 6
Gebissreiniger
Bacillus subtilis-Protease (106 E./g) mit Amylase 2,5 %
Calciumlactat 0,1%
Schäumendes Salz (NaHCO3 + Zitronensäure) 96,4%
Aroma-, Farbstoffe usw. 1,0%
Ein Gramm des Pulvers nach Beispiel 6 liefert etwa 25 000 Einheiten Proteasenaktivität und 6000 Einheiten Amylaseaktivität. Das obige Gemisch wird in Wasser gelöst und bildet eine schäumende Lösung, die man mit Vorteil als Gebissreinigungslösung verwendet.
Es sei bemerkt, dass sich andere wirksame Rezepturen für Mundpflegemittel nach der Erfindung herstellen lassen.
Die vom Bacillus subtilis erzeugte Protease und Amylase sind z. B. als feines Pulver erhältlich.Dieses Enzympulver kann in eine Kaugummi-Grundlage z. B. Chicle , in bekannter Weise eingearbeitet werden. Dieser verarbeitete enzymhaltige Kaugummi kann dann gekaut werden, wodurch man eine länger dauernde Enzymwirkung in der Mundhöhle erreicht. In gleicher Weise lassen sich Enzympulver auch in bonbonartige Lutschtabletten verarbeiten, die man im Mund langsam zergehen lässt.
PATENTANSPRUCH I
Gemisch zur Mundpflege, dadurch gekennzeichnet, dass es als wirksame Komponenten bakteriell erzeugte Protease und Amylase enthält.
UNTERANSPRÜCHE
1. Gemisch nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es von Bacillus subtilis erzeugte Protease und Amylase enthält.
2. Gemisch nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass es ein stabilisiertes enzymhaltiges Mundwasser ist, das Eiweiss- und Kohlenhydratreste in der Mundhöhle hydrolysiert und von Bacillus subtilis erzeugte Protease und Amylase gelöst in einer bis zu 15 Gewichtsprozent entionisiertes Wasser enthaltenden Lösung enthält, die ausserdem Calciumsalze, ein wasserlösliches organisches Lösungsmittel, Konservierungsmittel und Aromastoffe enthält.
3. Gemisch nach Unteranspruch 2, gekennzeichnet durch einen Polyalkohol als organisches Lösungsmittel.
4. Gemisch nach Unteranspruch 3, gekennzeichnet durch Glycerin, Sorbit oder deren Gemische als Polyalkoholkomponente.
5. Gemisch nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass es eine stabilisierte Enzymzahnpasta zur Verhinderung der Zahnbelagsbildung ist, die vom Bacillus subtilis erzeugte Protease und Amylase, bis zu 15 Gewichtsprozent der endgültigen Zusammensetzung entionisiertes Wasser, lösliche Calciumsalze, organisches Lösungsmittel, ein oberflächenaktives Mittel, ein Scheuermittel, ein Konservierungsmittel, Aromastoffe und ein Verdickungsmittel enthält.
6. Gemisch nach Unteranspruch 5, gekennzeichnet durch einen Polyalkohol als organisches Lösungsmittel.
7. Gemisch nach Unteranspruch 6, gekennzeichnet durch Glycerin, Sorbit oder deren Gemische als Polyalkoholkomponente.
8. Gemisch nach Unteranspruch 5, 6.oder 7, gekennzeichnet durch ein nichtionogenes oberflächenaktives Mittel.
9. Gemisch nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Zahnpulver zur Entfernung von Eiweissund Kohlenhydratrückständen aus dem Mund ist, das vom Bacillus subtilis erzeugte Protease und Anylase, ein wasserlösliches Calciumsalz, Zahnseife, ein Scheuermittel, Aromaund Farbstoffe enthält.
10. Gemisch nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Tablette oder Lutschtablette zum Auflösen von Eiweiss- und Kohlenhydratrückständen im Mund und zum Bekämpfen von schlechtem Mundgeruch ist, das vom Bacillus subtilis erzeugte Protease und Amylase, ein wasserlösliches Calciumsalz, Natriumchlorid, Mannit, Aromaund Farbstoffe enthält.
11. Gemisch nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Kaugummi zur verlängerten Enzymaktivität in der Mundhöhle ist, der vom Bacillus subtilis erzeugte Protease und Amylase, gemischt in einer Kaugummi-Grundlage, und Aromastoffe enthält.
12. Gemisch nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass es ein schäumendes gebissreinigendes Gemisch zur Entfernung von Eiweiss- und Kohlenhydratrückständen von Gebissen ist, das von Bacillus subtilis erzeugte Protease und Amylase, ein wasserlösliches Calciumsalz, Natriumbicarbonat, eine wasserfreie Säure, Aroma- und Farbstoffe enthält.
PATENTANSPRUCH II
Verfahren zur Herstellung eines Gemisches nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man Protease und Amylase in entionisiertem Wasser mit löslichem Calciumsalz löst und die Lösung mit einer solchen Menge eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels vermischt, die dem endgültigen Gemisch einen Wassergehalt bis zu 15 Gewichtsprozent gibt.
UNTERANSPRÜCHE
13. Verfahren nach Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Polyalkohol als organisches Lösungsmittel verwendet.
14. Verfahren nach Unteranspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man Glycerin, Sorbit oder deren Gemische verwendet.
15. Verfahren nach Patentanspruch II oder einem der Unteransprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass man von Bacillus subtilis erzeugte Protease und Amylase verwendet.
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The invention relates to an enzyme-containing mixture for oral care and a method for producing such a mixture.
The usefulness of proteolytic and amylytic enzymes for liquefying, dissolving and removing residues containing protein and carbohydrates on tissue surfaces is increasingly recognized. For example, there is now consensus that the most important cause of the onset of tooth decay is the fermentation of sugar into acid through the action of bacteria in the immediate vicinity of the teeth. The immediate vicinity of the teeth is the dental plaque, which, in addition to soft, external substance that adheres to the tooth, also includes a firmly adhering layer. Dental plaque contains over 70% bacteria, while the remainder is saliva and food particles. It has been found that ingested sugar quickly diffuses through the dental plaque and that practically all bacteria in the dental plaque can convert sugar into acid.
When the acid thus formed reaches the critical pH of 5 or below, the enamel is dissolved. It is clear that the dissolution of the enamel leads to the formation of tooth decay.
The acid concentration depends on various factors. Although practically all bacteria in plaque form acid from sugar, the rate at which it is formed fluctuates. So form z. B. Streptococci acid most rapidly, but the rate decreases at lower pH values. Lactobacilli onset at a slower rate, but still produce acid at pH 4.
Other organisms in plaque, such as staphylococci and filamentous bacteria, produce acid at a slower rate.
The most important factor that determines the decalcification or dissolution of the enamel by acid in the plaque is its thickness. It has been found that the pH on the enamel-contacting side of the dental plaque is lower than on the surface in contact with the saliva, which is partly ascribed to the buffering capacity of the saliva. It has also been observed that the thicker the plaque, the lower the pH of its enamel-contacting surface. The plaque is thick in places such as the spaces between the teeth, where acid formation is promoted by food residues; it is thin over smooth surfaces that are cleaned naturally. As a result, the interdental spaces are more prone to caries than the smooth tooth surfaces.
The formation of plaque is a constant process and repeats itself quickly even after mechanical cleaning. However, if the plaque thickness can be kept to a minimum, then the acid formed has a higher pH value and diffuses more easily into the saliva.
In addition to the problems caused by plaque, there are problems related to the health of the gums and the structure of the jawbone in the oral cavity. Tartar formation is the single largest factor in the etiology of marginal gingivitis and periodontitis. However, the exact mechanism of tartar formation is not yet known.
The main theories put forward can be divided into a bacteriological and a physico-chemical group. According to the bacteriological theory, the organisms in the mouth form a local alkalinity and the decomposition of the salivary proteins in their immediate vicinity. The changes in the local environment in turn cause the precipitation of salts from the saliva. The responsible organisms are thread-like and belong to the Leptotrichia and Actinomyces. The physicochemical theories, however, take into account other factors such as carbon dioxide loss, ammonia formation, protein denaturation or decomposition, changes in surface tension and colloidal properties. All of these factors have one thing in common: they need an organic base to deposit the precipitated minerals.
This is what the above-mentioned plaque provides, be it fully formed or in the initial stage as a slimy saliva coating on the tooth surfaces.
Its reduction or elimination would therefore reduce the accumulation of tartar and contribute to the general hygiene of the mucous membrane and jawbone.
Another problem related to oral hygiene is the accumulation of food debris and normally shed dead cells from the mucous membrane, tongue and protected parts of the oral cavity. Food residues essentially consist of protein and carbohydrate-containing material, which provide an ideal breeding ground for oral bacteria.
The irritants from putrefaction and fermentation due to bacterial action on food debris adversely affect oral tissue health. Waste cells from normal, healthy tissue in the mouth accumulate daily to such an extent that they form an important element of the residue in the mouth, which - if not removed - contributes to the multiplication of microorganisms in the oral cavity.
The purpose of the invention is to provide mixtures for oral care for the purpose of controlling, removing and preventing plaque, tartar and food debris from teeth and mucous membranes, and a method for preparing such mixtures. A mixture according to the invention is characterized in that it contains protease and amylase produced by bacteria and preferably produced by Bacillus subtilis as active components. Such a mixture of protease and amylase has been found to be excellent for oral hygiene.
The leftovers in the mouth consist mainly of starchy and proteinaceous material, as mentioned above, while the tissue residues contain protein. The proteases in the mixture according to the invention specifically hydrolyze the protein-containing substances in the mouth, while the amylases hydrolyze the starch-containing substances. As a result, protease and amylase combined hydrolyze most of the components contained in food and tissue residues. The enzymes obtained from bacteria, which are described in particular in US Pat. No. 3,031,380 and which are preferred for use in oral care products because of their relatively high harmlessness, great effectiveness and other properties, are particularly suitable.
Proteases and amylases partially hydrolyze the food and tissue residues between the teeth, which loosens these residues and can be easily removed from the mouth by rinsing or brushing. The proteases and amylases provided for this purpose preferentially hydrolyze food and tissue residues, while they do not attack the living gums or the mucous membrane. The property of preferentially hydrolyzing food and necrotic tissue residues without attacking the living palate tissue and the oral mucosa was found particularly in the case of protease and amylase, which were obtained from Bacillus substilis.
The important protease amylase component can be used in various forms for dental care. The enzymes can be in the form of a powder with suitable flavorings and / or colorings. The powder is dissolved in water and the resulting solution is used as a mouthwash.
The protease-amylase component can also be in the form of a stabilized solution that is used directly as a mouthwash.
Furthermore, the hydrolytic effect of the enzymes can be supported by toothbrushes, whereby the protease amylase component is introduced into a stabilized toothpaste formulation or into a tooth powder mixture.
Another useful preparation form for prolonged exposure to the teeth is protease amylase in relatively low concentrations in a candy-like lozenge that is slowly allowed to dissolve in the mouth. Intimate contact of the enzymes with the teeth can also be achieved by incorporating the protease amylase component into a gum base for the production of chewing gum. The mechanical effect of chewing supplements the hydrolytic effect of the protease amylase component and thus promotes the removal of food and tissue residues from the teeth.
Although the above-mentioned types of preparations are suitable for the application of enzymes to living tissue to remove protein and carbohydrate-containing residues adhering to them, the use of such enzymes in commercial products has hitherto been refrained from because it was not possible to use the active substances in incorporate a liquid carrier in such a way that their enzyme activity is maintained during the normal shelf life of such products. From the time of manufacture, the storage time can extend up to two years before the product is actually consumed. When dissolved in aqueous or partially aqueous solution, all enzymes undergo rapid autolysis or self-decomposition. Under these circumstances, the enzymes quickly lose their activity and are broken down by self-digestion.
Of course, in such a case the enzyme activity of a product quickly drops to a point where it has lost its effectiveness. These enzymes, especially those of bacterial origin, are also inhibited or inactivated by the presence of high concentrations of hydroxyl ions (such as those found in aqueous solution), and it is therefore a difficult problem to maintain enzyme activity for long periods of time.
Because of the autolysis of enzymes in liquid, aqueous solutions, the current commercial products usually contain such hydrolytic enzymes in dry form, although the liquid form would be much more desirable and numerous liquid paste and cream products could be improved by adding enzymes.
Adding enzymes to dry formulations is also disadvantageous because the enzymes are not easily soluble in water and the duration of their dissolution often extends beyond the time available to act on the residues containing protein and carbohydrates.
Accordingly, the invention further comprises a process for the preparation of the above-described enzyme-containing mixtures which allows products to be formed in which the enzymes are dissolved in liquid solution and retain their activity therein for a long time.
The method according to the invention is characterized in that protease and amylase produced in particular by Bacillus subtilis in deionized water with soluble
Dissolves calcium salt and mixes the solution with an amount of a water-soluble organic solvent that gives the final mixture a water content of up to 15 percent by weight. In the drawings show:
1 shows in a diagram the influence of the water concentration on the activity of proteases in liquid solution and
2 shows a diagram of the enzyme activity or shelf life of stabilized solutions.
In general, the class of bacterial proteases suitable for oral hygiene belongs to the endopeptidase group. Endopeptidases are proteases which hydrolyze the inner peptide bonds in the protein molecule, in contrast to proteases which hydrolyze the peptide bonds adjacent to a free polar group, such as -COOH. The endopeptidases fall into one of the following categories:
1. Animal endopeptidases: trypsin, chymotrypsin, cathepsins,
2. Plant endopeptidases: papain, ficin, bromelin,
3. Bacterial and mold endopeptidases.
Although all of the endopeptidases listed hydrolyze proteins, it has been found that the protease produced by Bacillus subtilis is particularly suitable for oral hygiene preparations.
The Bacillus substilis protease shows a broad safety range, has an optimum pH of about 7 (corresponding to the pH in the mouth) and can be obtained in powder form. The properties of the Bacillus subtilis protease are from Ramon and Richou in Compt. rend. 220, 341 (1945). One method for producing Bacillus subtilis protease is described in U.S. Patent No. 3,031,380.
It has been found that protease activities in the range of 100 to over about 100,000 units are suitable for use in oral hygiene preparations. The unit of protease activity is defined as the amount of protease that forms tyrosine soluble in trichloroacetic acid on a casein substrate under the conditions of the modified Kunitz method. Northrup and Kunitz give details of the Kunitz method in J. Gen. Physiol., 16.313 (1933), and also individually in J. Gen. Physiol., 22, 79 (1939).
The respective protease concentration in a given preparation depends on the intended exposure time to the food residues to be hydrolyzed. So z. B. a protease contained in a preparation for cleaning teeth applied in a relatively low activity of about 100 units, since a longer exposure of the preparation to food and tissue residues (usually overnight) is available. Where the exposure time is relatively short, such as a mouthwash for rinsing the mouth, higher protease activities of generally up to 100,000 units are used.
As mentioned above, preparations with protease obtained from Bacillus subtilis with high protease activities (over 100,000 units) can be used safely, since the protease preferentially hydrolyses the denatured proteins in food and tissue residues, while it does not attack the gums and mucous membranes.
Amylase produced by Bacillus subtilis is also used in the oral hygiene preparations according to the invention.
The Bacillus subtilis amylase, like the protease, has an optimum pH of 6.5 to 7.0, which roughly corresponds to the pH in the mouth. The properties of the Bacillus subtilis amylase have been described by Hopkins and Kulka in J. Inst., Brewing, 48, 170 (1942). One method for producing Bacillus subtilis amylase is given in U.S. Patent No. 3,031,380.
It has been found that the preferred amylase activity for use in oral hygiene preparations is no less than 25% of that of the protease due to arbitrary (and unrelated) methods of determining these types of enzyme hydrolysis. One unit of amylase activity is defined as that amount of amylase which, under the conditions of the modified Bernfeld method, produces 0.4 mg of maltose hydrate on a starch substrate. Details of the modified Bernfeld method are from P. Bernfeld in Collowick & Kaplans Methods in Enzymology, page 149, 1955, Acad. Press, New York.
As with the protease, low amylase activities are usually also used in preparations where they act on the teeth for a longer period of time, e.g. B. in cleaning agents for dentures. Similarly, higher amylase activities (up to about 100,000 units) are generally used in preparations that only act on the teeth for a relatively short time, e.g. B. mouthwashes.
Regarding the methods of stabilizing liquid preparations containing the enzymes mentioned, it has been found that particularly the protease and amylase produced by Bacillus subtilis maintain their original activity even in dissolved form when they are dissolved in a solvent from an organic liquid in the presence of a limited amount of water will.
As organic solvents, polyalcohols such as glycerine and polypropylene glycerine are best from stabilizing such enzyme solutions. After all, any organic liquid is suitable as long as the enzymes are soluble in it, this in turn is soluble in water and it does not cause the enzymes to precipitate. So is z. B. acetone, although it is a non-polar water-soluble, organic liquid, is not suitable because it precipitates the enzymes from the solutions.
The prosthetic groups of the enzymes produced by Bacillus subtilis according to US Pat. No. 3,031,380 also contain zinc, which is why no chelating agents may be present. In addition, the presence of calcium ions has been shown to play an important role in maintaining enzyme stability or activity in solution.
For this purpose, soluble calcium salts such as calcium lactate or calcium chloride are preferably added in an amount of from 0.05 to about 0.5 percent by weight of the stabilized solution.
It is also advantageous to keep the pH of the preparation in the range from 6 to 8, since the greatest activity of the Bacillus subtilis enzymes is in this range. Suitable known buffer substances such as lactic acid and sodium bicarbonate can be used for this purpose, however in some preparations, i.e. H. those with the final pH in the desired range, this is not required.
The term liquid enzyme preparations is intended to include even semi-liquid products such as toothpaste. The only condition for designating the present preparations as liquid enzyme preparations is the presence of the enzyme in the actually dissolved state.
It has also been found that nonionics are preferred when surfactants are used in the stabilized preparations because ionic detergents appear to interfere with the prosthetic groups of the enzymes produced by Bacillus subtilis. On the other hand, it is possible to use ionic surfactants in low concentrations, i. H.
to use less than 0.5% in order to enable combinations of nonionic and ionic surface-active substances to achieve the desired foaming of a toothpaste.
1 shows that the reduction in the water content stabilizes the activity of proteolytic enzymes in their solution. Conversely, FIG. 1 also shows the opposite effect of higher water concentrations in such solutions.
The test solutions contained protease dissolved in glycerol water solutions. A study of FIG. 1 shows that when the water content of the solution was reduced to below 30%, the activity of the proteolytic enzymes dissolved therein remained undiminished for a period of at least 3 months. On the other hand, by increasing the water content, e.g. B. to 65%, the activity of the proteolytic enzyme after 3 months is reduced to below 30% of the original activity. Even lower glycerol concentrations and even higher water contents cause even more blatant losses in enzyme activity.
According to FIG. 1, it can be determined that a reduction in the water content below 30% extends the enzyme stability to a period of at least 3 months. Further tests have shown that a greater reduction in the water content increases the enzyme stability even more. A reduction in the water content to below 15% causes z. B. a constant enzyme activity for 24 months and longer. Two years are considered to be sufficient storage time for the preparations provided here, whereby, according to a particular embodiment, liquid preparations according to the invention are limited to a water content of at most 15%.
Complete freedom from water in the liquid preparations is undesirable for aesthetic reasons, since a little water in the liquid formulations provides a more attractive and tastefully more appealing product.
example 1
A mouthwash concentrate contained the following ingredients:
Enzymes (protease and
Amylase mixture) 1.4 percent by weight
Calcium chloride 0.5 percent by weight
Sodium chloride 0.5 weight percent
Distilled water 7.0 weight percent
Flavors 1.1 percent by weight
Saccharin 1.0 percent by weight, ethanol 3.8 percent by weight
Glycerin 84.7 percent by weight
The above concentrate was subjected to stability tests over periods of more than three years and solutions which were prepared several months before use were tested in controlled trials.
Fig. 2 shows the results of the stability tests carried out over a period of 39 months. The solid curve shows the protease activity, while the dashed curve shows the amylase activity. As the figure shows, no loss of protease activity and only a 7% loss of amylase activity was observed during the first two years. After this time, however, the enzyme activities fell off very quickly. The sample of the mouthwash concentrate used in the above experiments was kept without refrigeration in a laboratory without air conditioning in Honolulu, Hawaii throughout the period.
The mean humidity in the laboratory fluctuated between 70 and 85% with an average temperature of 22 to 29 "C.
In addition, mouthwash concentrates of practically the same formulation as above were tested in double blind tests at least a few months after their preparation. These mouthwashes tested had protease and amylase activities of 5000 units / milligram each. In a first test on 50 people, one half of whom used a placebo that was identical to the enzyme mouthwash concentrate with the exception of the active enzyme component, the test subjects showed a 56% reduction in plaque after four weeks compared with the other half when using the enzyme solution. In a further experiment, 14 people were removed all dental plaque in an initial prophylaxis.
After using the enzyme solution, there was a 32% inhibition of plaque formation after two weeks compared with the rest of the group.
It should be noted that the stabilized enzyme concentrates can be stored as such and later formulated into any enzymatically active product. It is only necessary to ensure that the diluted product is consumed shortly after its manufacture.
Example 2
A toothpaste was made using the following recipe to study effectiveness:
Bacterially produced enzymes 2.00 weight percent
Glycerin 40.00 percent by weight
Propylene glycol 5.26 weight percent
Preservative 0.20 weight percent
Deionized water 8.00 weight percent
Sodium chloride and
Calcium lactate 0.30 percent by weight
Calcium carbonate 32.54 weight percent
Sorbitol, crystalline 8.30 percent by weight
Flavors and colors 0.40 percent by weight
Fused silica 3.00 percent by weight
For experimental reasons, this formulation intentionally contained no foam concentrate and less flavor, so that apart from the usual abrasive calcium carbonate, the mixture of bacterially produced protease and amylase was the only active ingredient.
Furthermore, a placebo that was identical to the active preparation was produced without an enzyme component. The products were codified in such a way that neither the investigator nor the test persons could identify the product.
A total of 70 people were included in this trial and selected from patients of practicing dentists. The subjects were randomly divided into two groups of 35 each and designated Group A and Group B. One person withdrew from the experiments and the information provided by seven others were not evaluated because they did not have enough plaque before the experiment to give a statistically useful statement. The results include 30 people in group A (7 males and 23 females) and 32 people in group B (11 males and 21 females) between the ages of 14 and 56, with group A having a mean age of 29.6 and Group B was 27.7 years old.
The test subjects were given a tube of toothpaste and a toothbrush (Oral B, medium), one group receiving the enzyme-containing product (code PB 125) and the other group receiving the placebo (code PB 066). They were instructed to use the test paste and the brush provided, once in the morning and once in the evening, and to rinse as little as possible after use (in order to benefit from the effect of the enzyme residue). The dosage using the given brush was calculated to be an average of one gram.
When changing, the test subjects were given code no.
PB 125, now handed over code no. 066 (the tube of which was clearly different from the previous one), upon which they were instructed not to use the first tube; Similarly, tubes with the code No. PB 125 were given to the other group to replace tube No. 066.
evaluation
The test subjects were examined at the beginning and 12 front teeth each were completely cleaned and the dental plaque removed. A scale from 0 to 5 using a detection solution was used as a measure of subjective estimation.
Pre-printed cards, each with a field for the 12 front teeth, were used to record the plaque on each individual tooth. A value of 2 means that 40% of the tooth surface had a coating, while a value of 5 corresponds to a complete (100%) coverage of the tooth surface with coating. The total of the information for the 12 teeth gave the test subject's number of deposits. B. a coating number of 30 meant that 50% of the total surface of the 12 front teeth had a coating (30 divided by the maximum value of 60). In addition, color photographs were taken of each subject after each examination.
After two weeks, a second examination was carried out, the covering was completely removed and the groups switched. Due to the removal of the dental plaque, a waiting time between the first and second half of the examination was not considered necessary, since any residual enzyme activity had subsided within a few hours.
The third and final examination was done at the end of the second two-week period. The three sub-bookings on all subjects were all carried out at the same time of day. The results were transferred to cards with the name, age and gender of the test person and the color pictures in three series of the test person's number were stuck into an album.
Results:
As the experimental procedure suggests, the main objective of this preliminary study was to determine the extent to which a particular enzyme-containing toothpaste would retard plaque formation. This is viewed as a stricter test, as one whose measurement determines the delay in deposit formation along with the dissolution of the existing deposit. The enzyme effect can be demonstrated more clearly if there is enough substrate for digestion than only in low concentration.
Accordingly, an attempt without prior removal of the dental plaque would lead to a greater statistical statement than one in which no dental plaque (substrate) is present at the beginning.
In this study, Group A received the enzyme-containing product, during the first half, and Group B received the placebo. The number of test subjects with a decrease in plaque formation when using the product compared with the placebo, as well as the percentage decrease are summarized in Table I. All but three test persons showed a decrease in the formation of deposits when the product was used, the mean for group A being 48.3% and for group B 58.2%, which corresponded to an overall mean of 53.7%. Three test persons showed lower plaque numbers after using the placebo than after using the product with a mean decrease of 4.6 points, or 32.2%.
table
Analysis of the individual results
Group group combi
AB nated Number of test subjects 30 32 62 Number with lower numbers of deposits with product than with placebo 28 31 59 Average value for test subjects with product 12.4 10.5 11.4 Average value of these test subjects with product 24.0 25.1 24.6 Percentage delay with product 48.3% 58.2% 53.7% Number with lower coating numbers with placebo than with product 2 1 3 Mean value of these test persons with placebo 4.5 20 9.7 Mean value of these test persons with product 11.0 21 14.3 Percentage delay with placebo 50.0% 4.8% 32.2%
The details of the group results from this experiment are summarized in Tables II and III.
Table II compares results with the number of deposits prior to the removal of the deposit and is considered indicative of the first half of the study, since the number of deposits found is compared before the start of the test. During this first half, the product group showed a deceleration of 55.6% compared to the control group. After swapping the product with placebo, the formation of deposits in group A increased within two weeks to 84.5% of the group number before the start of the experiment. The use of placebo in group B resulted in virtually no delay in plaque formation, whereas after switching to the product a 55.4% delay was observed compared to the figures before the start of the experiment.
Table II
Analysis of the group results against the
Preliminary examination numbers
Group group
AB mean number of pre-examination layers 28.5 24.5 mean number after the first two weeks 12.3 24.2 mean number after the second two weeks 22.7 10.8 percent change with product -56.8% -55.9% with Placebo + 84.6% - 1.2%
Product versus placebo in the first half -55.6%
Table III shows the results of each group when comparing mean plaque numbers after two weeks of use of the product with the numbers after two weeks of use of the placebo.
In this analysis, the mean improvement in plaque delay in the respective groups was 51.1% and compared to the respective control groups, a delay of 50.5%.
Table III
Analysis of the group results
Group group combi
AB nated Number of test persons 30 32 62 Total number of layers with product 369 346 715 mean 12.3 10.8 11.5 Total number of layers with placebo 682 775 1457 mean 22.7 24.2 23.5 Mean improvement in the group 10.4 13.4 12.0 percent 46.2% 55.4% 51.1% Mean improvement compared to the control group 11.9 11.9 11.9 percent 49.0% 52.5% 50.5%
A similar result is obtained from the analysis of 10 test persons in each group, whose original plaque numbers showed the same mean in both groups and thus allowed a comparison between the balanced groups with regard to the approximate frequency of plaque formation (Table IV).
Here, the smaller groups showed a 53.9% and 59.3% delay and in the first half of the product group a 57.2% improvement compared to the control group.
Table IV
Analysis of the results on ten subjects in each group whose mean numbers were the same (balanced groups)
Group group
AB Number of test persons 10 10 Mean original number of layers 32.7 32.7 Mean number of layers after the first two weeks 13.4 31.3 Mean number of layers after the second two weeks 26.3 12.7 Delay caused by the product in the group 12.9 18.6
Delay in the group 53.9% 59.3% Delay of the product compared to the control group 17.9 13.6 Delay compared to the control group 57.2% 51.7% Conclusion:
:
This double replacement blind test showed that a toothpaste in which protease and amylase obtained from Bacillus subtilis are the only active ingredients has a significant effectiveness in delaying plaque formation, compared with the original plaque numbers and with the use of placebo, with a rate of over 50% igen inhibition of plaque formation compared to these two.
Example 3
Stabilized toothpaste
Bacillus subtilis protease combined with amylase 1.00%
Glycerin * 19.55% sorbitol solution (70% sorbitol, 30% OJo H2O) * 15.00% sorbitol crystalline 8.30%
Propylene glycol 5.25%
Distilled water 8.00%
Salts (NaCl and calcium lactate) 0.20%
Calcium carbonate 33.00%
Polysorbate (non-ionic detergent,
Foam concentrate) 5.00%
Flavor, color and protective substances 1.70%
Thickener (quartz dust) 3.00% * Glycerin can be used alone instead of glycerin and sorbitol. In this case his share is 39.55%.
The toothpaste formulation according to Example 3 is a stabilized enzyme mixture. Stabilization in this context means that the enzyme activity of the toothpaste remains practically 100% of the original enzyme activity during manufacture. A toothpaste composed according to Example 3 therefore retains its original enzyme activity for a period of about 24 months.
This stabilization is achieved by carefully metering the water content in the enzyme mixture. With a water content below 15%, long-lasting enzyme stability and biological activity are achieved.
The following examples are typical formulations of dry oral care products that contain a protease-amylase mixture as a hydrolytic enzyme component:
Example 4
Tooth powder
Bacillus subtilis protease and amylase 1.0%
Precipitated chalk 92.4%
Calcium lactate 0.1%
Dental soap, nonionic 5.0%
Flavors and colors etc. 1.5%
Example 5
Breath deodorizing tablet
Bacillus subtilis protease and amylase 1.0%
Calcium lactate 0.1%
Mannitol 97.4%
Flavorings 1.5%
By allowing it to dissolve slowly in the mouth, this tablet helps remove food and tissue residues that are often the cause of bad breath or contribute to it.
Example 6
Denture cleaner
Bacillus subtilis protease (106 U./g) with amylase 2.5%
Calcium lactate 0.1%
Foaming salt (NaHCO3 + citric acid) 96.4%
Flavors, colors, etc. 1.0%
One gram of the powder of Example 6 provides approximately 25,000 units of protease activity and 6,000 units of amylase activity. The above mixture is dissolved in water and forms a foaming solution, which is used with advantage as a denture cleaning solution.
It should be noted that other effective oral care formulations can be made in accordance with the invention.
The protease and amylase produced by Bacillus subtilis are e.g. Available as a fine powder. This enzyme powder can be incorporated into a chewing gum base e.g. B. Chicle, are incorporated in a known manner. This processed, enzyme-containing chewing gum can then be chewed, thereby providing a longer lasting enzyme action in the oral cavity. In the same way, enzyme powders can also be processed into candy-like lozenges that are slowly allowed to dissolve in the mouth.
PATENT CLAIM I
Mixture for oral care, characterized in that it contains bacterially produced protease and amylase as effective components.
SUBCLAIMS
1. Mixture according to claim 1, characterized in that it contains protease and amylase produced by Bacillus subtilis.
2. Mixture according to claim I, characterized in that it is a stabilized enzyme-containing mouthwash which hydrolyzes protein and carbohydrate residues in the oral cavity and contains protease and amylase produced by Bacillus subtilis dissolved in a solution containing up to 15 percent by weight of deionized water, which also contains Contains calcium salts, a water-soluble organic solvent, preservatives and flavorings.
3. Mixture according to dependent claim 2, characterized by a polyalcohol as the organic solvent.
4. Mixture according to dependent claim 3, characterized by glycerol, sorbitol or mixtures thereof as the polyalcohol component.
5. Mixture according to claim I, characterized in that it is a stabilized enzyme toothpaste to prevent plaque formation, the protease and amylase produced by Bacillus subtilis, up to 15 percent by weight of the final composition, deionized water, soluble calcium salts, organic solvent, a surface-active agent, contains an abrasive, a preservative, flavorings and a thickener.
6. Mixture according to dependent claim 5, characterized by a polyalcohol as the organic solvent.
7. Mixture according to dependent claim 6, characterized by glycerol, sorbitol or mixtures thereof as the polyalcohol component.
8. Mixture according to dependent claim 5, 6 or 7, characterized by a nonionic surface-active agent.
9. Mixture according to claim I, characterized in that it is a tooth powder for removing protein and carbohydrate residues from the mouth, containing the protease and anylase produced by Bacillus subtilis, a water-soluble calcium salt, dental soap, an abrasive, aroma and colorants.
10. Mixture according to claim I, characterized in that it is a tablet or lozenge to dissolve protein and carbohydrate residues in the mouth and to combat bad breath, the protease and amylase produced by Bacillus subtilis, a water-soluble calcium salt, sodium chloride, mannitol, Contains flavorings and colorings.
11. Mixture according to claim I, characterized in that it is a chewing gum for prolonged enzyme activity in the oral cavity, which contains protease and amylase produced by Bacillus subtilis, mixed in a chewing gum base, and flavorings.
12. Mixture according to claim I, characterized in that it is a foaming denture cleaning mixture for removing protein and carbohydrate residues from teeth, the protease and amylase produced by Bacillus subtilis, a water-soluble calcium salt, sodium bicarbonate, an anhydrous acid, flavorings and colorings contains.
PATENT CLAIM II
Process for the preparation of a mixture according to claim 1, characterized in that protease and amylase are dissolved in deionized water with a soluble calcium salt and the solution is mixed with an amount of a water-soluble organic solvent that gives the final mixture a water content of up to 15 percent by weight.
SUBCLAIMS
13. The method according to claim II, characterized in that a polyalcohol is used as the organic solvent.
14. The method according to dependent claim 13, characterized in that glycerol, sorbitol or mixtures thereof are used.
15. The method according to claim II or one of the dependent claims 13 or 14, characterized in that protease and amylase produced by Bacillus subtilis are used.
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