Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Reaktionsproduktes aus L-Asparaginamidohydrolase und einem Kohlehydrat.
L-Asparaginamidohydrolase, die auch als L-Asparaginase bezeichnet wird, ist ein Enzym, das die Aminosäure L-Asparagin selektiv hydrolysiert. Dieses Enzym ist in kleinen Mengen im Handel erhältlich ist jedoch ausserordentlich teuer.
Das Enzym zersetzt ausser L-Asparagin und kleine Mengen an Glutamin keine anderen bekannten Aminosäuren und ist daher bei biochemischen Versuchen und Synthesen sehr gut zur selektiven Ausschaltung von freiem L-Asparagin aus Mischungen von Aminosäuren, sogar in Anwesenheit von lebendem Gewebe und lebenden Zellen, geeignet. Es wurde vor kurzem gefunden, dass bestimmte Krebszellen nicht die Fähigkeit besitzen, L-Asparagin zu bilden, sondern diese Aminosäure aus anderen Quellen beziehen müssen. Versuche haben gezeigt, dass diese Zellen, wenn man ihnen L-Asparagin entzieht, in grossen Mengen absterben, während andere Zellen unbeeinflusst bleiben. Es ist daher möglich, diese Zellen durch Verabreichung von L-Asparaginase anzugreifen.
Ein Nachteil der Anwendung von L-Asparaginase besteht darin, dass die bisher verfügbaren Enzympräpa rate unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen, wenn sie Menschen verabreicht werden. So können z.B. bei dem Patienten Fieber oder andere Nebenwirkungen auftreten, wenn er mit diesem Material behandelt wird. Aus diesem Grunde kann es sich als unmöglich erweisen, dem Patienten das Enzym in solchen Konzentrationen zu verabreichen, die ausreichen, um den L-Asparagin-Spiegel des Patienten so stark zu senken, dass die empfindlichen Krebszellen abgetötet werden.
Ausserdem kann die L-Asparaginase ihre Wirksamkeit bei Zimmertemperaturen in spürbarem Masse verlieren. Da das Enzym selten ist und bei der Verabreichung an Patienten unerwünschte Nebenwirkungen hervorruft, besteht ein Bedarf an einem Material, das L Asparagin selektiv zerstört, jedoch stabiler ist und zur Verringerung der Nebenwirkungen in kleineren Mengen verabfolgt werden kann, so dass sowohl pyrogene Reaktionen wie auch ein Verbrauch der teuren L-Asparaginase möglichst gering gehalten werden können.
Es kann auch ein unlösliches, gegenüber L-Asparagin wirksames Material extracorporal zur Behandlung von Blut oder anderen Körperflüssigkeiten angewendet werden, wobei das Blut zur Zerstörung des L-Asparagins durch das Material geleitet und dann in den Körper zurückgeführt wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist nun ein Verfahren zur Herstellung eines Reaktionsproduktes, das aus 1 Gew.-Teil LvAsparaginamidohydrolase und 1 bis 500 Gew.-Teilen eines Kohlenhydrates, welche chemisch aneinander gebunden sind, besteht. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man ein Kohlehydrat unter alkalischen Bedingungen mit Bromcyan und 1 bis 500 Gew.-Teile des erhaltenen Umsetzungsproduktes mit 1 Gew.-Teil LzAsparaginamidobydrolase umsetzt.
Vorzugsweise sind jeweils 5 bis 50 Gew.-Teile des Kohlehydrates an 1 Gew.-Teil L-Asparaginase gebunden.
L-Asparaginase wird aus dem Mikroorganismus E. Coli oder anderen Mikroorganismen sowie aus anderen bekannten pflanzlichen oder tierischen Quellen, wie z.B.
Meerschweinchenseruin, gewonnen.
Verglichen mit freier L-Asparaginase weist die covalent gebundene L-Asparaginase eine erheblich grössere Stabilität bei Zimmertemperaturen oder warmen Temperaturen auf. Ausserdem kann das Reaktionsprodukt unlöslich sein, so dass es in vielen Fällen nach der Verwendung wiedergewonnen werden kann.
Es können verschiedene I(ohlehydrate, wie Cellulose, Dextran, vernetzte Dextrane, wie Sephadex, und andere unlösliche Polysaccharide, verwendet werden.
Wenn der gewählte Träger, welcher chemisch an die L-Asparaginase gebunden wird, unlöslich ist, wird die L-Asparaginase unlöslich, während das Präparat weiterhin die Fähigkeit besitzt, L-Asparagin zu zerstören. Die Wirksamkeit des chemisch gebundenen Materials bei der Zerstörung von L-Asparagin kann erheblich höher sein als die einer entsprechenden Menge an freier L-Asparaginase unter vergleichbaren Bedingungen.
Die Umsetzung mit Bromcyan erfolgt unter alkalischen Bedingungen, z.B. einem pH-Wert von wenigstens 7,5 und vorzugsweise mehr als 11.
Vorzugsweise ist das verfahrensgemässe Reaktionsprodukt unlöslich in dem Medium, in dem es verwendet werden soll, z.B. Wasser, Blut oder andere wässrige Lösungen oder Dispersionen, z.B. solchen, die mit Körperflüssigkeiten isotonisch sind. Die Verfahrensprodukte können als deutlich erkennbare zerkleinerte Teilchen oder auch in sehr fein zerteilter Form vorliegen, wie z.B. in kolloidalen Suspensionen. Besonders bevorzugt werden kolloidale Suspensionen des chemisch gebundenen L-Asparaginase-Präparates mit einer Teilchengrösse von weniger als etwa 2 > , die Menschen oder Tieren un- mittelbar verabreicht werden können. Es können gege- benenfalls zur direkten Verabreichung auch lösliche Formen des Verfahrensproduktes hergestellt werden, indem man als Trägermaterial lösliche Kohlehydrate verwendet.
Wie bereits ausgeführt, können die Verfahrensprodukte verwendet werden, um den L-Asparaginase-Spiegel von Blut, Körperflüssigkeiten oder Reaktionslösungen ausserhalb des Körpers zu senken, indem man Blut oder dgl. durch ein Bett des unlöslichen Verfahrensproduktes leitet. Zu diesem Zwecke werden im allgemeinen grössere Teilchen - im sichtbaren Bereich - bevorzugt. Ein extracorporaler Kreislauf kann hergestellt werden, indem man das zerteilte Verfahrensprodukt lose in eine Patrone füllt und dann Blut oder eine andere Lösung über eine Leitung zu einem Ende der Patrone und durch das Verfahrensprodukt leitet und am anderen Ende durch eine Austrittsleitung abzieht. Falls erwünscht, kann das Blut unmittelbar von der zu behandelnden Person in die Vorrichtung fliessen und nach der Behandlung zurückgeführt werden.
Es können auch bekannte Reaktionskolonnen mit dem Verfahrensprodukt gefüllt werden, oder das Verfahrensprodukt wird auf eine Matrix, wie z.B. Siliconkautschuk, imprägniert und dann in eine Schlauchleitung gegeben, durch die die zu behandelnde Flüssigkeit strömt.
Beispiel I
Es wurden 2 g Cyanogenbromid (Bromcyan) in 50 ccm destilliertem Wasser gelöst, das durch Zusatz von wässriger Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 11,5 gebracht worden war. Dann wurden 2 g Cellulose zugegeben, die vorher 10 Tage bei 40 in einer 5M Natriumhydroxydlösung gequollen worden war, und die Suspension wurde etwa 30 Minuten magnetisch gerührt.
Die Mischung wurde filtriert und der Filterrückstand mit Wasser und dann mit einer 0,5-molaren Natriumbicar bonatlösung gewaschen und anschliessend mit einem Borsäure-Natriumhydroxyd-Puffermittel bei einem pH Wert von 8,5. Der Rückstand wurde durch erneutes Suspensieren in Aceton und durch Absaugen getrocknet.
Darauf wurden 50 mg des so erhaltenen Materials, dessen Struktur zur Zeit noch unbestimmt ist, zu einer Lösung von 2 mg L-Asparaginase gegeben, die in 3 ccm des gleichen Boratpuffers mit einem pH-Wert von 8,5 suspendiert war. Die Mischung wurde 16 Stunden gerührt und dabei auf 40 gehalten.
Das so erhaltene Material bestand aus chemisch an L-Asparaginase gebundener Cellulose, was dadurch bewiesen werden kann, dass sich die vorhandene L-Asparaginase-Wirksamkeit nicht von der Cellulose abwaschen liess.
Die Stabilität der oben beschriebenen, covalent gebundenen Cellulose-Asparaginase wurde mit freier L Asparaginase in einem gepufferten Blutmedium verglichen, das aus 9 Vol.-Teilen einer wässrigen Lösung von NaH2PO4 und Na2HPOA mit einem pH-Wert von 7 und 1 Vol.-Teil menschlichem Blut bestand. Freie Asparaginase u. Proteinverurtreinigungen wurden der Mischung in einer Menge von 0,6 mg pro ccm zugesetzt, während die Konzentration der covalent gebundenen Aspa raginase in einem anderen Teil der Mischung 0,04 mg pro ccm betrug.
Beide Mischungen wurden bei 370 gelagert, und ihre Stabilität wurde gemessen, indem man ihre Fähigkeit, L-Asparagin auch nach Ablauf bestimmter Zeiten unter Bildung von Ammoniak und Asparaginsäure zu zersetzen, mit ihrer Wirksamkeit unmittelbar nach Suspension in dem Puffer-Blut-Medium verglich.
Jeden Tag wurden die freie und covalent gebundene L-Asparaginase enthaltenden Mischungen in folgender Weise auf ihre Asparaginase-Wirksamkeit untersucht: Es wurden jeweils 1 ccm der zu prüfenden Mischung mit 1,7 ccm einer wässrigen 0,04M-Lösung von L-Asparagin, die mit einer 0,2M-Kaliumphthalat-Lösung auf einen pH-Wert von 8,6 gepuffert worden war, vermischt.
Die so erhaltene Mischung wurde 30 Minuten bei 370 inkubiert und dann mit 0,5 ccm 25%iger Trichloressigsäure versetzt, um eine weitere Reaktion zu verhindern.
Dann wurde die Mischung zentrifugiert, und 0,5 ccm der so erhaltenen klaren Lösung wurden zur kolorimetrischen Bestimmung des anwesenden Ammoniaks in eine Mischung aus 7 ccm Wasser und 0,5 ccm Nessler Reagenz gegeben. Die Konzentration des anwesenden Ammoniaks wurde anhand einer mit Nessler-Reagenz behandelten Standardmischung errechnet.
Es wurde die folgenden Ergebnisse erzielt, die in Mikromol Ammoniak ausgedrückt werden, das durch Zersetzung des L-Asparagins erzeugt wird.
Die nachstehenden Ergebnisse zeigen den Prozentsatz an während der einzelnen Tage gewonnenem Ammoniak, bezogen auf das während des ersten Tages erhaltene Ammoniak.
Zeit in Tagen 1 2 3 4 5 6 7 Wirksamkeit einer Mischung mit covalent gebundener Cellulose Alsparaginase, % 100 87 2011 163 177 157 99 Wirksamkeit einer Mischung mit L-Asparaginase, % 100 93 102 1315 93 54 46
Beispiel 2
Es wurde 1 g Cyanogenbromid in 25 ccm destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert durch tropfenweise Zugabe von 2M-Natriumhydroxylösung auf 11,5 eingestellt. Dann wurde 1 g eines wasserlöslichen Dextrans mit einem Molekulargewicht von 70000 zugesetzt und die Mischung etwa 45 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt.
Nach dieser Zeit wurde das Reaktionsprodukt durch Zugabe von Aceton ausgefällt, filtriert und mit frischem Aceton gewaschen.
Nun wurden 100 mg des so erhaltenen filtrierten Produktes mit 0,1 ccm eines handelsüblichen L-Asparaginasepräparates und 5 ccm einer wässrigen 0,lM-Natriumbicarbonatlösung gemischt. Die Mischung wurde unter Rühren etwa 12 Stunden auf 40 gehalten und lieferte eine Lösung von chemisch an Dextran gebundener L-Asparaginase.
Die so erhaltene Lösung wurde dann durch eine Agarose-Kolonne geleitet, die auf 40 gekühlt worden war, und es wurde die chemisch gebundene Dextran Asparaginase-Verbindung isoliert. Fraktionen, die dieses Material enthält, wurden dann in folgender Weise auf ihre Wirksamkeit bei der Zersetzung von L-Asparagin untersucht:
Die aus der Reaktionskolonne gewonnene Lösung, die die chemisch gebundene Dextran-Asparaginase enthielt, wurde gefriergetrocknet und dann erneut in einer Borsäure-Natriumhydroxyd-Pufferlösung mit einem pH- Wert von 8,4 gelöst. Darauf wurde 1 ccm dieser Mischung mit 1,7 ccm einer wässrigen 0,4M-Lösung von L-Asparagin, die mit 0,2M-Kaliumphthalatlösung auf einen pH-Wert von 8,6 gepuffert worden war, vermischt.
Das so erhaltene Material wurde 15 Minuten bei 370 inkubiert, worauf 0,5 ccm 25%ige Trichloressigsäure zugesetzt wurden, um eine weitere Reaktion zu unterbinden.
Die Mischung wurde zentrifugiert, und dann wurde 1z; ccm der so erhaltenen klaren Lösung zur kolorimetrischen Bestimmung des Ammoniakgehaltes zu 7 ccm Wasser und 0,5 ccm Nessler-Reagenz gegeben. Die Am moniakkonzentration wurde unter Bezug auf eine mit dem Nessler-Reagenz behandelte Standardmischung errechnet.
Es zeigte sich, dass unter diesen Bedingungen in der Minute 32,5 Mikromol Ammoniak pro mg Protein gebildet wurden.
The present invention relates to a process for producing a reaction product of L-asparagine amidohydrolase and a carbohydrate.
L-asparagine amidohydrolase, also known as L-asparaginase, is an enzyme that selectively hydrolyzes the amino acid L-asparagine. This enzyme is commercially available in small quantities, but it is extremely expensive.
Apart from L-asparagine and small amounts of glutamine, the enzyme does not decompose any other known amino acids and is therefore very suitable for the selective elimination of free L-asparagine from mixtures of amino acids, even in the presence of living tissue and living cells, in biochemical experiments and syntheses . It has recently been found that certain cancer cells do not have the ability to produce L-asparagine and must obtain this amino acid from other sources. Experiments have shown that if L-asparagine is withdrawn from them, these cells die off in large quantities, while other cells remain unaffected. It is therefore possible to attack these cells by administering L-asparaginase.
A disadvantage of the use of L-asparaginase is that the enzyme preparations currently available cause undesirable side effects when administered to humans. E.g. the patient will experience fever or other side effects when treated with this material. For this reason, it may prove impossible to give the patient the enzyme in concentrations sufficient to lower the patient's L-asparagine levels enough to kill the sensitive cancer cells.
In addition, L-asparaginase can lose its effectiveness to a noticeable extent at room temperatures. Since the enzyme is rare and causes undesirable side effects when administered to patients, there is a need for a material that selectively destroys L asparagine, but is more stable and can be administered in smaller amounts to reduce side effects, so that both pyrogenic reactions and consumption of the expensive L-asparaginase can be kept as low as possible.
An insoluble material effective against L-asparagine can also be used extracorporeally for the treatment of blood or other body fluids, the blood being passed through the material to destroy the L-asparagine and then returned to the body.
The present invention now relates to a process for the production of a reaction product which consists of 1 part by weight of LvAsparaginamidohydrolase and 1 to 500 parts by weight of a carbohydrate, which are chemically bonded to one another. The process is characterized in that a carbohydrate is reacted under alkaline conditions with cyanogen bromide and 1 to 500 parts by weight of the resulting reaction product with 1 part by weight of LzAsparaginamidobydrolase.
Preferably, in each case 5 to 50 parts by weight of the carbohydrate are bound to 1 part by weight of L-asparaginase.
L-asparaginase is produced from the microorganism E. Coli or other microorganisms as well as from other known vegetable or animal sources, such as e.g.
Guinea pig seruin, won.
Compared to free L-asparaginase, the covalently bound L-asparaginase has a considerably greater stability at room or warm temperatures. In addition, the reaction product can be insoluble, so that in many cases it can be recovered after use.
Various hydrates such as cellulose, dextran, crosslinked dextrans such as Sephadex, and other insoluble polysaccharides can be used.
If the chosen carrier, which is chemically bound to the L-asparaginase, is insoluble, the L-asparaginase becomes insoluble, while the preparation continues to have the ability to destroy L-asparagine. The effectiveness of the chemically bound material in destroying L-asparagine can be significantly higher than that of a corresponding amount of free L-asparaginase under comparable conditions.
The reaction with cyanogen bromide takes place under alkaline conditions, e.g. a pH of at least 7.5 and preferably more than 11.
Preferably the reaction product of the process is insoluble in the medium in which it is to be used, e.g. Water, blood or other aqueous solutions or dispersions, e.g. those that are isotonic with body fluids. The process products can be present as clearly recognizable comminuted particles or in very finely divided form, e.g. in colloidal suspensions. Colloidal suspensions of the chemically bound L-asparaginase preparation with a particle size of less than about 2, which can be administered directly to humans or animals, are particularly preferred. If necessary, soluble forms of the process product can also be produced for direct administration by using soluble carbohydrates as the carrier material.
As already stated, the products of the process can be used to lower the L-asparaginase level of blood, body fluids or reaction solutions outside the body by passing blood or the like through a bed of the insoluble product. For this purpose, larger particles - in the visible range - are generally preferred. An extracorporeal circuit can be established by loosely filling the divided process product into a cartridge and then passing blood or other solution through a line to one end of the cartridge and through the process product and withdrawing it at the other end through an exit line. If desired, the blood can flow directly from the person to be treated into the device and be returned after the treatment.
Known reaction columns can also be filled with the process product, or the process product is deposited on a matrix, e.g. Silicone rubber, impregnated and then placed in a hose line through which the liquid to be treated flows.
Example I.
2 g of cyanogen bromide (cyanogen bromide) were dissolved in 50 cc of distilled water which had been brought to a pH of 11.5 by adding aqueous sodium hydroxide solution. Then 2 g of cellulose, which had previously been swollen for 10 days at 40 in a 5M sodium hydroxide solution, were added, and the suspension was stirred magnetically for about 30 minutes.
The mixture was filtered and the filter residue was washed with water and then with a 0.5 molar sodium bicarbonate solution and then with a boric acid-sodium hydroxide buffering agent at a pH of 8.5. The residue was dried by resuspending in acetone and by suction.
Then 50 mg of the material thus obtained, the structure of which is still undetermined at the moment, was added to a solution of 2 mg of L-asparaginase which was suspended in 3 cc of the same borate buffer with a pH of 8.5. The mixture was stirred and held at 40 for 16 hours.
The material obtained in this way consisted of cellulose chemically bound to L-asparaginase, which can be proven by the fact that the existing L-asparaginase activity could not be washed off by the cellulose.
The stability of the covalently bound cellulose asparaginase described above was compared with free L asparaginase in a buffered blood medium, which is composed of 9 parts by volume of an aqueous solution of NaH2PO4 and Na2HPOA with a pH of 7 and 1 part by volume of human There was blood. Free asparaginase & the like Protein purifications were added to the mixture in an amount of 0.6 mg per cc, while the concentration of covalently bound asparaginase in another part of the mixture was 0.04 mg per cc.
Both mixtures were stored at 370 and their stability was measured by comparing their ability to decompose L-asparagine to form ammonia and aspartic acid even after a certain period of time with their effectiveness immediately after suspension in the buffer blood medium.
Every day the mixtures containing free and covalently bound L-asparaginase were examined for their asparaginase activity in the following manner: In each case 1 cc of the mixture to be tested was mixed with 1.7 cc of an aqueous 0.04M solution of L-asparagine, the had been buffered to a pH of 8.6 with a 0.2M potassium phthalate solution.
The mixture obtained in this way was incubated for 30 minutes at 370 and then 0.5 cc of 25% strength trichloroacetic acid was added to prevent further reaction.
The mixture was then centrifuged, and 0.5 cc of the clear solution thus obtained were added to a mixture of 7 cc of water and 0.5 cc of Nessler reagent for the colorimetric determination of the ammonia present. The concentration of ammonia present was calculated using a standard mixture treated with Nessler reagent.
The following results were obtained, which are expressed in terms of micromoles of ammonia produced by the decomposition of L-asparagine.
The results below show the percentage of ammonia recovered during each day based on the ammonia obtained during the first day.
Time in days 1 2 3 4 5 6 7 Effectiveness of a mixture with covalently bound cellulose Alsparaginase,% 100 87 2011 163 177 157 99 Effectiveness of a mixture with L-asparaginase,% 100 93 102 1315 93 54 46
Example 2
1 g of cyanogen bromide was dissolved in 25 cc of distilled water and the pH was adjusted to 11.5 by adding 2M sodium hydroxide solution dropwise. Then 1 g of a water-soluble dextran with a molecular weight of 70,000 was added and the mixture was stirred for about 45 minutes at room temperature.
After this time the reaction product was precipitated by the addition of acetone, filtered and washed with fresh acetone.
100 mg of the filtered product obtained in this way were then mixed with 0.1 cc of a commercially available L-asparaginase preparation and 5 cc of an aqueous 0.1M sodium bicarbonate solution. The mixture was kept at 40 with stirring for about 12 hours and provided a solution of L-asparaginase chemically bound to dextran.
The resulting solution was then passed through an agarose column which had been cooled to 40, and the chemically bound dextran asparaginase compound was isolated. Fractions containing this material were then tested for their effectiveness in breaking down L-asparagine as follows:
The solution obtained from the reaction column, which contained the chemically bound dextran asparaginase, was freeze-dried and then redissolved in a boric acid-sodium hydroxide buffer solution with a pH of 8.4. 1 cc of this mixture was then mixed with 1.7 cc of an aqueous 0.4M solution of L-asparagine which had been buffered to a pH of 8.6 with 0.2M potassium phthalate solution.
The material thus obtained was incubated at 370 for 15 minutes, after which 0.5 cc of 25% strength trichloroacetic acid was added in order to prevent further reaction.
The mixture was centrifuged and then 1z; ccm of the clear solution thus obtained was added to 7 ccm of water and 0.5 ccm of Nessler reagent for the colorimetric determination of the ammonia content. The ammonia concentration was calculated with reference to a standard mixture treated with the Nessler reagent.
It was found that 32.5 micromoles of ammonia per mg of protein were formed per minute under these conditions.