Verfahren zur Herstellung einer stabilen Lösung der Albumin und a- und ss-Globulinfraktion des Blutplasmas bzw. Blutserums
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Herstellung einer stabilen Lösung der Albumin und a- und ss-Globulinfraktion des Blutplasmas bzw. Blutserums. Diese Fraktionen gelangen in der medizinischen Praxis zur Verwendung.
Verfahren zur Bereitung von stabilen Lösungen der Eiweisskörper aus dem Blutplasma oder dem Blutserum, das keine Hämopigmente enthält, z. B. Verfahren zur Bereitung von stabiler Lösung der Eiweisskörper aus dem Plasma durch die äthanolische Kaltfraktionierung, sind bekannt. Wenn bei diesem Verfahren dem Plasma das Äthanol bis zu einer Endkonzentration des Äthanols von 8 % hinzugefügt wird, fällt die Fraktion des Fibrinogens aus. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren getrennt. Der darüberstehenden Lösung gibt man Äthanol bis zu einer Konzentration von 25 % zu. Dabei fällt die Fraktion der Gamma Globuline aus. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in die so erhaltene Lösung Äthanol bis zu einer Konzentration von 40% bei einem pH-Wert von 4,8 zugegeben. Dabei fällt ein Niederschlag von Eiweisskörpern aus, der aus dem Albumin sowie den a und ss-Globulinen besteht.
Der Niederschlag wird lyophil getrocknet und zur Herstellung von Endprodukten mit dem apyrogenen destilliertem Wasser unter Zugabe von Stabilisatoren verdünnt (H W. Krijnen, G. G. A.
Mastenbrock Vox Song 2, 6, p. 405, 1957).
Ein Nachteil des genannten Verfahrens ist die Notwendigkeit, einen Rohstoff zu verwenden, der keine Hämopigmente enthält.
Ferner sind Verfahren zur Herstellung von Albumin aus Lösungen, die Hämopigmente enthalten, durch das Ausfällen der Hämopigmente mit den Ionen der Schwermetalle, insbesondere des Zinks, (J. Amer. chem. Soc. 72, 465, 1950; 75, 5859, 1953; 78, 1353, 1956), bereits bekannt.
Ein Nachteil der bekannten Verfahren ist die Schwierigkeit der Reinigung des Endproduktes von den Ionen der Schwermetalle, was deren Anwendung zu Produktionszwekken begrenzt.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Beseitigung der genannten Nachteile.
In Übereinstimmung mit dem genannten Ziel wurde die Aufgabe gestellt, durch die Wahl entsprechender Bedingungen für das Denaturieren der wärmelabilen Globuline und die Zerstörung der Hämopigmente eine stabile Lösung der Plasmaeiweisskörper, die von den wärmelabilen Globulinen und Hämopigmenten frei ist, aus Lösungen herzustellen, die Hämopigmente enthalten.
Diese Aufgabe wurde dadurch gelöst, dass stabile Lösungen der Albumin sowie der a- und ss-Globulinfraktion erhalten wurden, indem Hämopigmente enthaltenden Albumin sowie a- und ss-Globuline enthaltenden Fraktionen Wasserstoffperoxid bis zu einer bestimmten Endkonzentration in der Lösung zugegeben wird und in dieser Lösung die wärmelabilen Globuline und die Hämopigmente denaturiert und vom erwünschten Endprodukt abgetrennt werden.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer stabilen Lösung der Albumin und a- und ss-Globulinfraktion, die bei der Fraktionierung der Eiweisskörper des Blutplasmas bzw. Blutserums erhalten wird, das sich dadurch auszeichnet, dass als Ausgangsrohstoff Plasma bzw. Serum, das Hämopigmente enthält, benutzt wird und dass zu der abgetrennten Albumin und a- und ss-Globulin Fraktion, die noch Hämopigment enthält, Wasserstoffperoxid bis zu einer Endkonzentration in der Lösung von 0,01 bis 0,1 Ges. % bei einer Temperatur von höchstens 70" C hinzufügt, wird man die Lösung bei dieser Temperatur während 2 bis 10 Stunden stehenlässt und anschliessend denaturierte wärmelabile Globuline und die zerstörten Hämopigmente von der Lösung abscheidet.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann wie folgt durchgeführt werden.
Der Ausgangsrohstoff, das retroplazentare und Abortserum hämolysiertes Plasma des Spender-, Kadaverblutes und andere Rohstoffarten, unterzieht man einer Fraktionierung nach einem beliebigen Verfahren bis zur Herstellung einer Fraktion, die Albumin, a- und ss-Globuline und Hämopigmente enthält. Die getrennte Fraktion wird von den Fraktionierungsmitteln (im Falle der Verwendung von Salzen) befreit und durch destilliertes Wasser vorzugsweise bis zu einer Konzentration von 6% Eiweisskörper in der Lösung verdünnt. Zu der Lösung fügt man das Wasserstoffperoxid bis zu dessen Endkonzentration in der Lösung von 0,01 bis 0,1% bei einer Temperatur von höchstens 70" C hinzu und hält bei dieser Temperatur während 2-10 Stunden.
Das Erwärmen unter den genannten Bedingungen übt eine denaturierende Wirkung auf die wärmelabilen Globuline und den Eiweissteil der Hämopigmente aus, was zur Zerstörung des Komplexes von Globin mit dem Häm führt.
Die Anwesenheit von Wasserstoffperoxid bewirkt eine Zerstörung des Häms, das Freiwerden des Eisens und dessen Oxydation zur dreiwertigen Form. Beim Erwärmen fällt ein Niederschlag der denaturierten Globuline und Hämopigmente aus, der durch Zentrifugieren getrennt wird.
Die erhaltene Lösung enthält mindestens 70% Albumin und höchstens 30% stabile a- und ss-Globuline, wobei sie keine Hämopigmente enthält. Die genannte Lösung enthält 4,3 bis 4,8 % Eiweisskörper und weniger als 1 % Äthanol.
Zur Bereitung einer Lösung mit grösserem Gehalt an Eiweisskörpern wird das Verhältnis zwischen der Menge der Ausgangsfraktion des Albumins und der a- und ss-Globuline und der Menge der Lösungsflüssigkeit verändert oder die Konzentration des Zielproduktes nach beliebigen bekannten Verfahren erhöht.
Das erfindungsgemässe Verfahren macht es möglich, aus der erhaltenen Lösung der Plasmaeiweisskörper reines Albumin zu trennen. Dazu bringt man den pH-Wert der von den Hämopigmenten gereinigten Lösung auf 4,7-4,8 und gibt Alkohol bis zu dessen Konzentration in der Lösung von 18 % zu. Den ausgefallenen Niederschlag trennt man durch Zentrifugieren, bringt den pH-Wert der erhaltenen Lösung auf 5,2 und gibt Äthanol bis zu dessen Konzentration in der Lösung von 40% zu. Dabei fällt reines Albumin zum Niederschlag aus, das bis zur Endform nach den allgemeinbekannten Verfahren behandelt wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren macht es möglich, eine stabile Lösung von Plasmaeiweisskörpern, die keine Hämopigmente und wärmelabile Globuline enthält, aus Eiweisslösungen mit einem beliebigen Gehalt an Hämopigmenten zu erhalten.
In der erhaltenen stabilen Lösung der Plasmaeiweisskörper liegt der Gehalt an Natriumchlorid viermal niedriger als im Spenderserum.
Die Isoonki der Lösung in den Fällen, die die Verwen dung von Lösung mit einem niedrigen Gehalt an Natrium chlorid (für die Heilbehandlung von Nierenerkrankungen) erfordern, wird durch die Einführung von Glukose in die Lö sung herbeigeführt. Bei der Therapie von Erkrankungen, die Einführung von Chloriden in den Organismus nicht begrenzen, wird die Isoonki der Lösung durch die Einführung ent sprechender Menge von Natriumchlorid oder anderen Salzen herbeigeführt.
Zum besseren Verstehen der vorliegenden Erfindung werden nachstehend folgende Beispiele für die Durchführung des Verfahrens zur Bereitung von stabiler Lösung der Plasmaei weisskörper aus Lösungen angeführt, die Hämopigmente ent halten.
Beispiel 1
Man verwendet retroplazentares Serum, das eine erhöhte
Menge von Hämopigmenten enthält. Man kühlt das Serum auf 0 C und giesst unter ständigem Rühren 53 %iges Äthanol, das auf eine Temperatur von -15 " C abgekühlt ist, in einer
Menge von 180 ml je Liter Ausgangsplasma hinzu. In dem
Gemisch wird eine Konzentration des Alkohols von 8 % her beigeführt. Die Temperatur des Gemisches sinkt dabei auf -3" C. Unter diesen Bedingungen trennen sich Gerinnsel und Schleim. Das Gemisch wird zentrifugiert, der Nieder schlag abgetrennt und dem Zentrifugat 53 %iger Alkohol, der auf eine Temperatur von 150 C abgekühlt ist, in einer Menge von 720 ml je Liter Ausgangsplasma zugegeben.
Die Alkoholkonzentration in der Lösung erreicht 25 %, die Temperatur des Gemisches sinkt aufS C. Unter den genannten Bedingungen fällt die das Gamma-Globulin enthaltende Fraktion aus, die durch Zentrifugieren getrennt wird. Zu dem erhaltenen Zentrifugat gibt man 1n-HCl bis zu einem pH Wert von 6,0 zu und trennt den sich bildenden Niederschlag durch Zentrifugieren. Zu dem Zentrifugat gibt man das auf eine Temperatur von -15" C abgekühlte 96 %ige Äthanol in einer Menge von 200 ml je Liter Zentrifugat bis zu einer Endkonzentration des Alkohols in der Lösung von 40% zu.
Durch die Zugabe von 1n-HCl senkt man den pH-Wert auf 4,8.
Den sich bildenden Niederschlag trennt man durch Zentrifugieren und löst in vierfachem Volumen von apyrogenem destilliertem Wasser, das 0,3 % Natriumkaprylat und 3 % Glukose enthält. Die Auflösung wird unter intensivem Rühren innerhalb 3040 Minuten durchgeführt. Das erhaltene Gemisch wird zentrifugiert, der Niederschlag entfernt und dem Zentrifugat ln-NaOH bis zu einem pH-Wert von 7,2 zugegeben.
Die erhalten Lösung wird auf eine Temperatur von 65" C erwärmt, dann die 10 iOige Lösung von Wasserstoffperoxid bis zu dessen Endkonzentration in der Lösung von 0,05 %hinzu gefügt und die Lösung bei einer Temperatur von 65" C innerhalb 10 Stunden stehengelassen, wodurch der Restgehalt an Alkohol 1 % nicht übersteigt. Nach der Abkühlung der Lösung wird ln-HCl bis zu einem pH-Wert von 5,1 zugegeben. Dabei fällt ein Niederschlag aus, der abfiltriert wird.
Zu der Lösung gibt man ln-NaOH bis zu einem pH-Wert von 7,0-7,4 zu. Die erhaltene von dem Hepatitisvirus freie Lösung, die keine Hämopigmente und instabile Globuline enthält, wird geklärt, durch Filtration sterilisiert und dann auf Flankons abgefüllt.
Beispiel 2
Als Ausgangsrohstoff verwendet man natives Spenderplasma mit einem erhöhten Gehalt an Hämopigmenten.
Die Fraktionierung wird wie in dem Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die erhaltene Fraktion, die Albumin, aund ss-Globuline, Hämopigmente enthält, löst man in vierfachem Volumen von apyrogenem destilliertem Wasser, das 0,3 % Natriumkaprylat und 3 % Glukose enthält. Die Auflösung wird unter intensivem Rühren innerhalb 30-40 Minuten durchgeführt. Das erhaltene Gemisch wird zentrifugiert und dem Zentrifugat ln-NaOH bis zu einem pH-Wert von 7,2 zugegeben.
Die erhaltene Lösung wird auf eine Temperatur von 60 C erwärmt, dann die 10 %ige Lösung von Wasserstoffperoxid bis zu dessen Endkonzentration in der Lösung von 0,03 % zugegeben und die Lösung bei einer Temperatur von 60 C innerhalb 2 Stunden stehengelassen. Nach der Abkühlung der Lösung wird ln-HCI bis zu einem pH-Wert von 5,1 hinzugefügt. Dabei fällt ein Niederschlag aus, der abfiltriert wird. Zu der Lösung fügt man ln-NaOH bis zu einem pH-Wert von 7,0-7,4 hinzu. Man erhält eine Lösung, die 4,34,8 % Eiweisskörper enthält.
Die erhaltene Lösung, die keine Hämopigmente und instabile Globuline enthält, wird geklärt durch Filtration sterilisiert auf Flankons abgefüllt und einer Pasteurisierung bei einer Temperatur von 60 C innerhalb 10 Stunden zur Inaktivierung von Virus hepatitis infectiosa unterzogen.
Process for the preparation of a stable solution of the albumin and α- and β-globulin fractions of the blood plasma or blood serum
The present invention relates to a method for producing a stable solution of the albumin and α- and β-globulin fractions of blood plasma and blood serum, respectively. These fractions are used in medical practice.
Process for the preparation of stable solutions of the protein bodies from the blood plasma or the blood serum which does not contain any haemopigments, e.g. B. Processes for the preparation of stable solution of the protein bodies from the plasma by ethanolic cold fractionation are known. In this process, when the ethanol is added to the plasma to a final concentration of the ethanol of 8%, the fraction of the fibrinogen precipitates. The precipitate is separated by centrifugation. The above solution is added to ethanol up to a concentration of 25%. The fraction of gamma globulins is eliminated. The precipitate is centrifuged off and ethanol is added to the solution thus obtained up to a concentration of 40% at a pH of 4.8. A precipitate of protein bodies falls out, which consists of the albumin as well as the a and ss globulins.
The precipitate is dried lyophilically and diluted with the apyrogenic distilled water with the addition of stabilizers for the production of end products (H W. Krijnen, G. G. A.
Mastenbrock Vox Song 2, 6, p. 405, 1957).
A disadvantage of the process mentioned is the need to use a raw material that does not contain any hemopigments.
Processes for the production of albumin from solutions containing hemopigments are also possible by precipitating the hemopigments with the ions of heavy metals, in particular zinc, (J. Amer. Chem. Soc. 72, 465, 1950; 75, 5859, 1953; 78, 1353, 1956), already known.
A disadvantage of the known methods is the difficulty of cleaning the end product from the ions of the heavy metals, which limits their use for production purposes.
The aim of the present invention is to eliminate the drawbacks mentioned.
In accordance with the stated aim, the task was set to produce a stable solution of the plasma protein bodies, which is free from the heat-labile globulins and hemopigments, from solutions containing hemopigments by choosing appropriate conditions for the denaturation of the heat-labile globulins and the destruction of the hemopigments .
This object was achieved in that stable solutions of the albumin and the α- and β-globulin fraction were obtained by adding hemopigments-containing albumin and fractions containing α- and β-globulins hydrogen peroxide to a certain final concentration in the solution and in this solution the heat-labile globulins and the hemopigments are denatured and separated from the desired end product.
The invention relates to a method for producing a stable solution of the albumin and α- and β-globulin fraction, which is obtained in the fractionation of the protein bodies of the blood plasma or blood serum, which is characterized in that the starting raw material plasma or serum, the hemopigments contains, is used and that for the separated albumin and α- and β-globulin fraction, which still contains hemopigment, hydrogen peroxide up to a final concentration in the solution of 0.01 to 0.1% by weight at a temperature of at most 70 " C is added, the solution is left to stand at this temperature for 2 to 10 hours and then denatured heat-labile globulins and the destroyed haemopigments are separated from the solution.
The process according to the invention can be carried out as follows.
The starting raw material, the retroplacental and abortion serum hemolyzed plasma of the donor blood, carcass blood and other types of raw material, is subjected to a fractionation by any method up to the production of a fraction containing albumin, α- and ß-globulins and hemopigments. The separated fraction is freed from the fractionating agents (if salts are used) and diluted with distilled water, preferably up to a concentration of 6% protein bodies in the solution. The hydrogen peroxide is added to the solution up to its final concentration in the solution of 0.01 to 0.1% at a temperature of at most 70 ° C. and is kept at this temperature for 2-10 hours.
The heating under the conditions mentioned has a denaturing effect on the heat-labile globulins and the protein part of the hemopigments, which leads to the destruction of the complex of globin with the heme.
The presence of hydrogen peroxide causes the heme to be destroyed, the iron to be released and its oxidation to the trivalent form. When heated, a precipitate of the denatured globulins and hemopigments precipitates, which is separated by centrifugation.
The solution obtained contains at least 70% albumin and at most 30% stable α- and β-globulins, whereby it does not contain any hemopigments. The solution mentioned contains 4.3 to 4.8% protein and less than 1% ethanol.
To prepare a solution with a higher content of protein bodies, the ratio between the amount of the starting fraction of albumin and the α- and β-globulins and the amount of solution liquid is changed or the concentration of the target product is increased by any known method.
The method according to the invention makes it possible to separate pure albumin from the resulting solution of the plasma protein bodies. This is done by bringing the pH of the solution, which has been purified from the hemopigments, to 4.7-4.8 and adding alcohol up to its concentration in the solution of 18%. The deposited precipitate is separated by centrifugation, the pH of the solution obtained is brought to 5.2 and ethanol is added up to its concentration in the solution of 40%. In the process, pure albumin precipitates out, which is treated according to the generally known processes until its final form.
The method according to the invention makes it possible to obtain a stable solution of plasma protein bodies which does not contain any hemopigments and heat-labile globulins from protein solutions with any desired hemopigment content.
In the stable solution of the plasma protein bodies obtained, the sodium chloride content is four times lower than in the donor serum.
The isoonki of the solution in cases that require the use of a solution with a low content of sodium chloride (for the therapeutic treatment of kidney diseases) is brought about by the introduction of glucose into the solution. In the treatment of diseases that do not limit the introduction of chlorides into the body, the isoonki of the solution is brought about by the introduction of an appropriate amount of sodium chloride or other salts.
For a better understanding of the present invention, the following examples are given below for carrying out the method for preparing stable solution of plasma proteins from solutions containing hemopigments.
example 1
Retroplacental serum is used, which increases the blood pressure
Contains amount of hemopigments. The serum is cooled to 0 ° C. and 53% ethanol, which has cooled to a temperature of -15 ° C., is poured into a, with constant stirring
Add an amount of 180 ml per liter of starting plasma. By doing
A concentration of the alcohol of 8% is added to the mixture. The temperature of the mixture drops to -3 "C. Under these conditions, the clot and mucus separate. The mixture is centrifuged, the precipitate separated and the centrifugate 53% alcohol, which has cooled to a temperature of 150 C, in a Amount of 720 ml per liter of starting plasma was added.
The alcohol concentration in the solution reaches 25%, the temperature of the mixture drops to S C. Under the conditions mentioned, the fraction containing the gamma globulin precipitates and is separated by centrifugation. 1N HCl is added to the resulting centrifugate up to a pH of 6.0 and the precipitate which forms is separated off by centrifugation. The 96% ethanol, cooled to a temperature of -15 ° C., is added to the centrifugate in an amount of 200 ml per liter of centrifugate up to a final concentration of the alcohol in the solution of 40%.
The addition of 1N HCl lowers the pH to 4.8.
The precipitate which forms is separated by centrifugation and dissolved in four times the volume of pyrogenic distilled water containing 0.3% sodium caprylate and 3% glucose. The dissolution is carried out with vigorous stirring within 3040 minutes. The mixture obtained is centrifuged, the precipitate is removed and In-NaOH is added to the centrifugate up to a pH of 7.2.
The solution obtained is heated to a temperature of 65 "C, then the 10% solution of hydrogen peroxide is added up to its final concentration in the solution of 0.05% and the solution is left to stand at a temperature of 65" C within 10 hours, whereby the residual alcohol content does not exceed 1%. After the solution has cooled, In-HCl is added up to a pH of 5.1. A precipitate separates out and is filtered off.
In NaOH is added to the solution up to a pH of 7.0-7.4. The solution obtained, free from the hepatitis virus and containing no hemopigments and unstable globulins, is clarified, sterilized by filtration and then filled onto flankons.
Example 2
Native donor plasma with an increased content of hemopigments is used as the starting raw material.
The fractionation is carried out as described in Example 1. The fraction obtained, which contains albumin, α- and β-globulins, hemopigments, is dissolved in four times the volume of pyrogenic distilled water containing 0.3% sodium caprylate and 3% glucose. The dissolution is carried out with vigorous stirring within 30-40 minutes. The mixture obtained is centrifuged and In NaOH is added to the centrifugate up to a pH of 7.2.
The resulting solution is heated to a temperature of 60 ° C., then the 10% strength solution of hydrogen peroxide is added up to its final concentration in the solution of 0.03% and the solution is left to stand at a temperature of 60 ° C. for 2 hours. After the solution has cooled, In-HCl is added to a pH of 5.1. A precipitate separates out and is filtered off. In NaOH is added to the solution up to a pH of 7.0-7.4. A solution is obtained which contains 4.34.8% protein bodies.
The solution obtained, which does not contain any haemopigments and unstable globulins, is clarified by filtration, sterilized, bottled on Flankons and pasteurized at a temperature of 60 ° C. for 10 hours to inactivate virus hepatitis infectiosa.