Verfahren zur Herstellung eines Allergen-Extraktes und dessen Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung verbesserter therapeutischer und diagnostischer Allergen-Extrakte. Bei diesem Verfahren zur Herstellung der therapeutischen und diagnostischen Antigen- oder Allergen-Extrakte werden Substanzen, von denen bekannt ist, dass sie physiologisch aktive Prinzipien enthalten, die Allergene Reaktionen hervorrufen, extrahiert und behandelt, indem man ein aus wässriger Phase und aus bestimmten organischen Lösungsmitteln bestehendes Extraktionssystem anwendet, wobei das organische Lösungsmittel mit dem Allergen eine chemische Wechselwirkung eingeht und die Extraktionsflüssigkeit, die die aktiven Prinzipien enthält, von dem in dieser Flüssigkeit unlöslichen Material trennt und dann die Extraktionsflüssigkeit verdampft und entfernt,
wobei hiedurch das aktive Prinzip in Form eines trockenen Pulvers isoliert wird. Das trokkene Pulver kann dann weiter aufgearbeitet werden, wobei man einen allergenen Extrakt in einer bestimmten Form erhält. Die Form, in der der allergene Extrakt dann hergestellt wird, kann eine der vielen sein, die in der therapeutischen und diagnostischen Immunologie bekannt sind.
Es ist schon lange bekannt, dass verschiedene Individuen charakteristische allergene Reaktionen entwikkeln, wenn sie mit bestimmten natürlich vorkommenden oder synthetischen organischen Teilchen oder Materialien zusammenkommen. Insbesondere treten diese allergenen Reaktionen dann auf, wenn diese Teilchen eingeatmet werden. Beispiele für allergene Reaktionen sind: Niesen, Aktivierung der Schleimdrüsen, lokale Oedeme, Hautausschläge und Blutgefässerweiterungen.
Diese Reaktionen werden normalerweise Heuschnupfen genannt, und selbst dann wenn die Reaktionen des Körpers im allgemeinen nicht zu ernsthaften Schäden führen, können dennoch Komplikationen auftreten, und zwar sowohl physiologischer Art als auch psychologischer Art. Bei einem kleinen Kind führt die ständige Anwesenheit allergener Bedingungen oft zu einer dauernden Deformierung des Körpers, und insbesondere die Gesichtszüge können verändert werden. Es sei auch auf die psychologischen Einflüsse eines ständig vorhandenen Unbehagens hingewiesen. Asthmatische Zustände sind auch mit allergenen Reaktionen eng verbunden, und sie können auch zu wesentlich schwerwiegenderen Komplikationen führen. Die medizinische Wissenschaft anerkennt nun die Heuschnupfenkrankheit als ein ernstes Leiden, das mit Sorgfalt und gründlich behandelt werden muss.
In dieser Beziehung wurde schon vor einiger Zeit bekannt, dass Extrakte der oben angegebenen allergenisch aktiven oder antigenisch aktiven Substanzen bei einer subkutanen Injektion diese allergenen Reaktionen lindern können. Der genaue physiologische Mechanismus dieser Behandlung, die in der Fachwelt als Hyposensitivierung bezeichnet wird, wurde bisher noch nicht vollständig und befriedigend erklärt. Verschiedene Theorien wurden jedoch aufgestellt, die Erklärungsversuche sind.
Eine derartige Theorie nimmt an, dass die Bildung von sogenannten blockierenden oder neutralisierenden Antikörpern durch die Injektion der Extrakte hervorgerufen wird, während eine andere Theorie behauptet, dass eine derartige Behandlung die Bildung einer Vereinigung zwischen dem Antigen oder dem Allergen und dem Antikörper in dem freizirkulierenden Blut eher begünstigt, als dies in dem unter Schockeinwirkung stehenden Gewebe möglich ist.
Bei der Herstellung von derartigen Allergen-Extrakten war es bisher üblich, die angreifende organische Substanz, die die allergene Reaktion hervorruft, einfach mit einer physiologisch annehmbaren wässrigen Extraktionsflüssigkeit zu extrahieren, beispielsweise einer Salzlösung oder leicht alkalischen Salzlösung. Nach der Abtrennung der Extraktionsflüssigkeit von dem Rückstand wurde diese Lösung, die das aktive Prinzip enthielt, sterilisiert und einfach als solche verwendet, nachdem man natürlich eine geeignete Serienverdünnung dieser Lösung durchgeführt hatte. Bei derartigen Extraktionsverfahren wird die physiologisch annehmbare Extraktionsflüssigkeit ausgewählt, und man nimmt an, dass sie die strukturelle Unangreifbarkeit des Antigenmoleküls schützt.
In neuerer Zeit wurde jedoch ein Verfahren entwickelt, das zu vollständigeren wirksameren Allergen Extrakten führt. Dieses Verfahren ist in den USA-Patentschriften Nrn. 3 148 121 sowie 3 148 122 beschrieben. Das dort beschriebene Verfahren umfasst in kurzen Zügen die Behandlung der gesamten nicht entfetteten allergenen Substanz mit einer wässrigen Extraktionsflüssigkeit, die ein heterocyclisches tertiäres Amin enthält, worauf dann die flüssige Phase, die das aktive Prinzip enthält, von dem Rückstand entfernt wird und der Rückstand verworfen wird. Dann wird zur Entfernung des heterocyclischen tertiären Amins von dem aktiven Prinzip Wasser und eine Alaunlösung zu dem Extrakt zugegeben, damit das aktive Prinzip daraus ausgefällt wird.
Das gefällte Material wird dann mehrere Male mit Wasser gewaschen, um das gesamte heterocyclische tertiäre Amin und den Überschuss an Alaun zu entfernen, und dann wird das ausgefällte Material schliesslich in einem physiologischen annehmbaren Trägermaterial erneut suspendiert, beispielsweise in einer Phosphatpufferlösung.
Anfänglich wurde angenommen, dass die Zugabe des heterocyclischen tertiären Amins bei dem Verfahren nur zu einem vollständigeren Allergen-Extrakt führte, da die aminlöslichen Bestandteile in dem Extrakt zusätzlich zu den wasserlöslischen eiweiss artigen oder kohlehydratartigen Fraktionen enthalten waren. Jetzt nimmt man aber an, dass die reaktive chemische Struktur des heterocyclischen tertiären Amins eine strukturelle Modifizierung des Antigenmoleküls hervorrufen kann, die zu einem allergenen Behandlungsextrakt führt, der wirksamer ist und ziemlich frei von konstitutionellen Nebenreaktionen.
Obwohl diese Extraktion unter Anwesenheit eines heterocyclischen Amins und die Fällung mit Alaun zu Allergen-Extrakten führt, die in der Folge auf Grund der Tatsache, dass Pyridin das bevorzugte heterocyclische Amin ist, das bei dem Verfahren angewandt wird, PEAP-Extrakte genannt werden, und obwohl dieses Verfahren wirksam ist und gewisse Vorteile aufweist, hat es sich dennoch während der letzten Jahre herausgestellt, dass bestimmte Einschränkungen bestehen. In diesem Zusammenhang wurde gefunden, dass diese Art des Extraktes nicht zu Hauttestzwecken verwendet werden kann. Dies ist für den Arzt, der klinisch Allergien behandelt, im allgemeinen nicht wünschenswert, da diese Ärzte es vorziehen, den gleichen Extrakt sowohl für die Diagnose als auch für die Behandlung verwenden zu können.
Wenn nämlich bei einem Behandlungsverfahren der gleiche Extrakt sowohl für die Hauttestung als auch für die Behandlung verwendet wird, dann geht man sicher, dass bei der Behandlung genau dasjenige Antigen angewandt wird, von dem sich herausgestellt hat, dass es zu der allergenen Hautreaktion führt. Die oben beschriebene Einschränkung der PEAP Extrakte dürfte auf die Unlöslichkeit des Niederschlages und/oder die Bildung eines Komplexes zwischen dem mit dem heterocyclischen tertiären Amin extrahierten Antigen und dem Alaun, der zur Fällung des Antigens aus der Extraktionsflüssigkeit verwendet wird, zurückzuführen sein.
Ausserdem sind die Arbeitsverfahren, die bei der Herstellung von PEAP-Antigenen unter Anwendung der bisher bekannten Verfahren erforderlich sind, ziemlich langdauernd, und die Ausbeuten lassen zu wünschen übrig. Die Ausbeuten liegen im allgemeinen bei etwa 50 S der Protein-Stickstoffeinheiten (PNU), die ursprünglich extrahiert wurden.
Ziel der vorliegenden Erfindung war es, einen vielseitiger anwendbaren und wirksameren Allergen-Extrakt herzustellen als die Produkte, die bisher mit Hilfe der bekannten wässrigen Extraktionsverfahren und PEAP-Extraktionsverfahren erhältlich waren.
Ferner war man bestrebt, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung allergener Testextrakte und langwirksamer Behandlungsextrakte zu entwickeln, bei dem ein übliches Allergen-Extraktionsverfahren anwendbar ist.
Ferner sollte ein wässrig-organisches Lösungsmittel-Ex- traktionsverfahren angewandt werden, durch das im wesentlichen alle antigenen Materialien bei der Aufarbeitung desselben gewonnen werden können.
Es wurde gefunden, dass diese Vorteile dadurch erreicht werden können, dass man (1) die allergen aktive Substanz mit einer Extraktionsflüssigkeit extrahiert, die eine Mischung aus einer wässrigen Phase und einem organischen Lösungsmittel ist, wobei die aktiven Prinzipien in der Extraktionsflüssigkeit gelöst und mit ihr behandelt werden, wobei ein Rückstand aus inaktiven unlöslichen Materialien verbleibt, dann (2) die flüssige Phase abtrennt, die die Extraktionsflüssigkeit und die aktiven Prinzipien aus dem unlöslichen Rückstand enthält und (3) die aktiven Prinzipien aus der Extraktionsflüssigkeit durch Abdampfverfahren abtrennt, wobei ein beständiger, im wesentlichen trockener allergen aktiver, pulverförmiger Extrakt zurückbleibt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Extraktes einer Substanz, die allergisches Reagieren hervorrufen kann, wobei der Extrakt das physiologisch aktive Prinzip des Allergens enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man das Allergen enthaltende Material mit einer Extraktionsflüssigkeit vermischt, die Wasser und ein basischen Stickstoff enthaltendes organisches Lösungsmittel, das mit dem Allergien eine chemische Wechselwirkung eingeht, enthält, dass die Extraktionsflüssigkeit von dem darin unlöslichen Material entfernt wird, man das unlösliche Material verwirft und die extrahierte Flüssigkeit eindampft, damit man das aktive Prinzip dieser Substanz in Form eines stabilen allergen-aktiven Pulvers erhält.
Vorzugsweise ist das beim erfindungsgemässen Verfahren angewandte, basischen Stickstoff enthaltende organische Lösungsmittel ein heterocyclisches tertiäres Amin, insbesondere eines mit einem Siedepunkt von unter 1200 C, beispielsweise Pyridin, Chinolin, Lutidin, Collidin oder Picolin. Die Extraktionsflüssigkeit kann einen pH-Wert von 7,5 bis 12 aufweisen, und das Abdampfen derselben kann dadurch erreicht werden, dass man sie auf eine Temperatur von etwa 50 bis 850 C erhitzt. Das Abdampfen der Extraktionsflüssigkeit kann unter vermindertem Druck oder durch Sprühtrocknen erreicht werden.
Die Art der chemischen Wechselwirkung, die zwischen dem Allergen und dem basischen Stickstoff enthaltenden organischen Lösungsmittel stattfindet, ist noch nicht ganz geklärt. In einigen Fällen jedenfalls dürfte zwischen dem Antigen und dem organischen Lösungsmittel eine Komplexreaktion ablaufen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Extraktes, der die Form eines stabilen allergen aktiven Pulvers aufweist, zur Herstellung eines Testextraktes. Bei dieser Verwendung wird das Pulver in einer physiologisch annehmbaren Flüssigkeit in der erforderlichen Konzentration gelöst oder suspendiert.
Bei dieser speziellen Verwendung des allergen aktiven Pulvers wird als physiologisch annehmbare Flüssigkeit vorzugsweise ein wässriges Lösungsmittelsystem verwendet. Die dabei erhaltene Flüssigkeit kann sterilisiert werden, beispielsweise indem man sie durch ein Bakterienfilter filtriert. Man kann dem so erhaltenen Testextrakt auch eine Aluminiumverbindung zugeben, vorzugsweise Kaliumaluminiumsulfat, wodurch die aktiven Prinzipien des Extraktes in eine unlösliche Form übergeführt werden. Die so unlöslich gemachten aktiven Prinzipien können dann isoliert und in einer physiologisch annehmbaren wässrigen Flüssigkeit erneut suspendiert werden.
Zum Vergleich des erfindungsgemässen Verfahrens mit dem bisher bekannten Verfahren sei nochmals darauf hingewiesen, dass bei dem bisher bekannten PEAP Verfahren ein Alaunfällungsschritt als wesentlicher Schritt bei dem Herstellungsverfahren für den Allergen Extrakt angewandt wurde, denn nur unter Anwendung dieses Fällungsschrittes in dem bisher bekannten Verfahren konnten die aktiven Prinzipien von dem physiologisch unerwünschten tertiären Amin der Extraktionsflüssigkeit getrennt werden.
Es wurde nun unerwarteterweise gefunden, dass dieser Schritt, d. h. die Fällung des Antigens aus der wässrigen Lösung, die das heterocyclische tertiäre Amin enthält, unter Verwendung von Alaun vollständig umgangen werden kann, obwohl gerade dieser Fällungsschritt bisher für das PEAP-Verfahren als wesentlich angesehen wurde. Diese Umgehung des Fällungsschrittes wird erreicht, indem man die aktiven Prinzipien aus der Extraktionsflüssigkeit durch ein Abdampfverfahren abtrennt, ehe die aktiven Prinzipien bis zur endgültigen Dosierungsform verdünnt werden. Der Abdampfschritt wird in der Folge näher beschrieben.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist auf alle allergen aktiven Substanzen anwendbar, sowohl auf solche natürlichen Ursprungs als auch auf synthetisch hergestellte. Zu derartigen Substanzen gehören verschiedene Staubarten, wie z. B. üblicher Staub, der sich in Wohnungen findet und mit Hilfe von Staubsaugern eingesammelt wird, sowie Staubarten, die in Herstellungsbetrieben auftreten, wie z. B. Sägemehl. Ferner gehören zu den allergen aktiven Substanzen Epithelzellen wie z. B.
Materialien, die von Katzen, Hunden, Pferden oder Kaninchen abgestossen werden, Federn, wie z. B. Gänse federn und Hühnerfedern, Samen, wie z. B. Baumwollsamen und Kapok, Insekten sowie von Insekten stammende Produkte, wie z. B. Bienen, Hornissen, Moskitos und deren Sekrete, Pollen von Bäumen, Gräsern und Unkräutern, wie z. B. Ambrosiaceae, Obstgartengras, Ahornbäumen, P appelbäumen, ferner Schimmelarten, wie z. B. Aspergillus niger und Alternaria, komplexe synthetische Chemikalien, wie z. B. Antibiotika und ähnliche Materialien.
Bezugnehmend auf die Extraktionsflüssigkeit, die am Anfang verwendet wird, um die aktiven Prinzipien oder die allergenaktiven Substanzen zu lösen, zu behandeln und von den inaktiven Rückständen zu entfernen, die dann verworfen werden, wurde nun gefunden, dass die beim erfindungsgemässen Verfahren bevorzugt verwendete Flüssigkeit eine Mischung einer wässrigen Phase und einer organischen Lösungsmittelphase enthält. Dieser zuletzt genannte Bestandteil der Extraktionsflüssigkeit kann ein basisches stickstoffenthaltendes Lösungsmittel enthalten, das einen Siedepunkt aufweist, der ausreichend tief ist, so dass eine Verdampfung dieses Lösungsmittels möglich ist, ohne dass die strukturelle Integrität des behandelten Allergens zerstört wird.
Diese Siedepunktsbegrenzung wird in der Folge noch näher erläutert, wenn der Abdampfungsschritt genauer beschrieben wird. Allgemein gesprochen sei jedoch darauf hingewiesen, dass das organische Lösungsmittel einen Siedepunkt von weniger als etwa 1200 C aufweist sen soll, ausgenommen dann, wenn ein Abdampfverfahren, wie z. B. eine Sprühtrocknung, angewandt wird, bei dem das Allergen nur momentan höheren Temperaturen unterworfen wird. Vorzugsweise enthält der organische Lösungsmittelanteil der Extraktionsflüssigkeit ein Amin und insbesondere ein heterocyclisches tertiäres Amin, wie z. B. Pyridin, Pyridinderivate, beispielsweise Lutidin, Chinolin, Collidin, Picolin und ähnliche Materialien. Zusätzlich zu der Eigenschaft, dass das organische Lösungsmittel einen entsprechenden Siedepunkt haben soll, soll es auch noch vorzugsweise mit Wasser mischbar sein.
Obwohl der genaue chemische Einfluss des organischen Lösungsmittels auf das Antigenmolekül oder dessen Struktur nicht mit einem bestimmten Grad an Sicherheit bekannt ist, wird dennoch angenommen, dass die stark polare oder basische Natur der oben angegebenen Lösungsmittel dazu führt, dass diese mit dem Antigen reagieren, um eine Verbindung mit demselben zu bilden, oder dass sie in irgendeiner Weise die komplexe Molekularstruktur des Proteins, Kohlehydrats, Lipoproteins oder Polypeptides, die die Basis für die allergene Natur der den Patienten störenden Substanz darstellen, ändern.
Die Extraktionsflüssigkeit, d. h. die wässrige Phase, kann lediglich destilliertes Wasser sein, oder vorzugsweise eine Salzlösung oder eine alkalische wässrige Lösung. In dieser Beziehung können Natriumbicarbonat, Natriumchlorid, Natriumhydroxyd und Phosphatpuffer oder ähnliche Materialien verwendet werden. Wenn Substanzen, die eine alkalische Natur aufweisen, wie z. B. heterocyclische tertiäre Amine, in der Extraktionsflüssigkeit verwendet werden, dann kann dieser zweite wässrige Bestandteil auch aus einem Puffer bestehen, der den pH-Wert auf einen neutraleren Wert einstellt.
Der erhaltene pH-Wert der schliesslich verwendeten Extraktionsflüssigkeit wird eingestellt, indem man die das organische Amin enthaltende Lösungsmittelphase und die wässrige Phase vermischt. Dabei kann der pH-Wert im Bereich von 7,5 bis 12,0 liegen, und vorzugsweise wird er auf den engeren pH-Bereich von 9,0 bis 12 eingestellt. Da eine grosse Vielzahl an allergenen Substanzen mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens gewonnen werden kann, kann der pH-Wert der Extraktionsflüssigkeit und die Zusammensetzung derselben ziemlich variiert werden. Beispielsweise ist es bekannt, dass die Pollen von Ambrioceae (ragweed) einen Gehalt an einem hohen und toxischen Fett oder Lipoid aufweisen, das gegebenenfalls wesentlich an der allergenen Natur dieser Substanz beteiligt ist.
Wenn man die Pollen dieses Unkrautes extrahiert, kann es möglich sein, dass es wünschenswert ist, das Verhältnis der organischen Lösungsmittelphase zur wässrigen Phase zu erhöhen, um sicherzugehen, dass das gesamte Lipoidmaterial in Lösung geht. Es hat sich jedoch herausgestellt, dass gleiche Anteile an organischer Lösungsmittelphase und wässriger Phase in der Extraktionsflüssigkeit zu einer weiten Anwendungsfähigkeit derselben führen.
Das Extraktionsverfahren wird im allgemeinen so durchgeführt, dass man die die Krankheit hervorrufende allergene Substanz mit der Extraktionsflüssigkeit vermischt, nachdem vorher verunreinigende Bestandteile physikalisch entfernt wurden. Dann lässt man die Mischung bei einer Temperatur von etwa 20 bis 250 C bis zu 11 Tage lang entweder unter Rührung oder ohne Rühren stehen. Der Rückstand wird dann von der flüssigen Phase getrennt, die zu diesem Zeitpunkt die behandelten und in Lösung gebrachten aktiven allergenen Prinzipien enthält, indem man den unlöslichen Rückstand sich absetzen lässt, die Mischung filtriert oder ein Filtrationsverfahren durchführt, beispielsweise eine Vakuumfiltration.
Der Rückstand wird dann verworfen, und die erhaltene flüssige Phase ist eine klare, oft leicht bernsteinfarben oder grüngefärbte Lösung des Reaktionsproduktes der das organische Lösungsmittel enthaltenden wässrigen Extraktionsflüssigkeit und des Antigens.
In der Arbeitsstufe, die nun in der Folge beschrieben wird, unterscheidet sich das erfindungsgemässe Verfahren besonders deutlich von dem bisher bekannten PEAP-Verfahren, bei dem Kaliumaluminiumsulfat, nämlich Alaun, dann der Lösung zugegeben wird, um eine Fällung zu erreichen, und damit eine Entfernung des Antigenprinzips oder aktiven allergenen Prinzips von der physiologisch nicht annehmbaren Extraktionsflüssigkeit zu bewirken.
Der Unterschied des erfindungsgemässen Verfahrens von dem bisher bekannten PEAP Verfahren besteht darin, dass die Abtrennung des aktiven Prinzips aus der Extraktionsflüssigkeit durch Eindampfverfahren erreicht wird, d. h. die flüssige Phase wird einem solchen physikalischen Zustand unterworfen, der bewirkt, dass die flüssige Phase in eine Gasphase umgewandelt wird, und dass die nichtflüchtigen aktiven Prinzipien abgetrennt werden, indem man die gasförmige Phase von den aktiven Prinzipien abdiffundieren lässt oder entfernt.
Dieser wichtige Abdampfungsschritt des erfindungsgemässen Verfahrens kann nach bekannten Methoden durchgeführt werden, die dazu dienen, um ein Lösungsmittelsystem von einer in diesem gelösten Substanz zu befreien. Beispiele für derartige Methoden sind unter anderem die Gefriertrocknung, die Sprühtrocknung, die Vakuumtrocknung, die Anwendung eines rotierenden Vakuumtrocknungsapparates und ähnliche Methoden.
Die Temperaturen, die bei diesem Trockenschritt angewandt werden, können von dem Minimum, das benötigt wird, um die Extraktionsflüssigkeit bei dem angewandten Druck zu entfernen, bis zu einer Temperatur von etwa 950 C liegen. Die zuletzt genannte Temperatur ist diejenige, die bei Sprühtrocknungsverfahren angewandt wird, wo ein thermisch labiles Antigen nur momentan einer derartig hohen Temperatur unterworfen wird. Der Druck, der in dem Abdampfungssystem angewandt wird, hängt in gleicher Weise von dem speziellen Verfahren, das angewandt wird, ab, und er kann im Bereich von Atmosphärendruck oder etwas darüber liegendem Druck bis hinunter zu 30 mm Quecksilbersäule variieren, wobei der zuletzt genannte Druck derjenige ist, der bei Gefriertrocknungsverfahren angewandt wird.
Es wurde auch gefunden, dass zur Entfernung der letzten Spuren der wässrig-organischen, zur Extraktion verwendeten Flüssigkeit es vorteilhaft ist, das im wesentlichen trockene teilchenförmige Antigen, das man nach dem Abdampfverfahren erhalten hat, in einem Vakuumexsikkator etwa 24 Stunden lang stehen zu lassen. Dieser Arbeitsschritt kann bei Zimmertemperatur oder bei einer Temperatur von bis zu 450 C durchgeführt werden. Das Ergebnis des obigen Arbeitsverfahrens ist ein trockenes, teilchenförmiges, allergen-aktives oder antigen-aktives Material, das mit einer sehr reaktiven Extraktionsflüssigkeit behandelt worden war, und im wesentlichen alle aktiven Prinzipien der ursprünglichen angreifenden Substanz enthält, und ausserdem ist dieser Antigenextrakt bezüglich des schliesslich beabsichtigten Verwendungszweckes sehr variabel, wie später noch näher beschrieben werden wird.
Man sieht auch, dass bei diesem Verfahren praktisch kein allergenaktives Material verloren gegangen ist, während bei dem bekannten Verfahren, bei dem eine Alaunfällung aus dem wässrig-organischen Lösungsmittelextrakt durchgeführt wird, ein wesentlicher Anteil des ursprünglich extrahierten Proteinstickstoffes verloren geht. So ist es gelungen, die Ausbeute und die Vollständigkeit der Extraktion durch das erfindungsgemässe Verfahren wesentlich zu erhöhen.
Es sei ferner darauf hingewiesen, dass das erfindungsgemässe Verfahren in keiner Weise auf komplizierte natürlich vorkommende Antigenmischungen eingeschränkt ist, sondern dass es auch bei einem Extrakt angewandt werden kann, der einem Arbeitsverfahren unterworfen worden war, durch das die verschiedenen Antigenfraktionen getrennt werden, bevor die Behandlung und/oder der Abdampfschritt durchgeführt wird.
In dieser Stufe kann der trockene teilchenförmige oder pulverförmige Extrakt weiter verarbeitet werden, um einen allergenen Extrakt in einer der verschiedenen Formen, in denen die allergenen Extrakte eingesetzt werden, zu erhalten. So kann das Pulver einfach mit einem physiologisch annehmbaren wässrigen Lösungsmittelsystem behandelt werden und sowohl als diagnostischer Hauttestungsextrakt als auch als Extrakt zur hyposensitivierenden Behandlung verwendet werden.
Derartige physiologisch annehmbare Flüssigkeiten sind beispielsweise gepufferte Kochsalz-Lösung oder Evan Lösung, Coca-Lösung, die Natriumbicarbonat, Natriumchlorid und Phenol enthalten, oder eine Glycero Kochsalz-Lösung oder Stier-Lösung, Rohrzucker-Lösung oder Ungar-Lösung, phosphatgepufferte Lösungen und ähnliche Materialien. Diese Lösungen weisen im allgemeinen einen pH-Wert von um 7 auf und können einen pH-Wert von bis zu 7,5 besitzen.
Ein zweites Verfahren zur weiteren Aufarbeitung des trockenen pulverförmigen Extraktes kann so durchgeführt werden, dass man denselben mit einer wässrigen Lösung behandelt und dann eine Aluminiumverbindung zusetzt, beispielsweise Kaliumalaun oder Aluminiumhydroxyd, um das Antigen in eine unlösliche Form überzuführen und eine therapeutische Dosierungsform zu gewinnen, bei der die Freisetzung der aktiven Komponente langsam erfolgt. In dieser Beziehung wurde unerwarteterweise gefunden, dass der unlöslich gemachte Niederschlag, oder das Absorptionsprodukt, bei dem der wässrige Extrakt, der aus den nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten gewonnenen Extrakt bereitet wurde, wesentlich besser ist als die bisher mit Alaun gefällten Antigene, die aus entfetteten, rein wässrigen extrahierten Lösungen ausgefällt worden waren.
Während die bisher bekannten Präparate ein gelatineartiges Aussehen haben und pharmazeutisch nicht an nehmbar sind, sind die unter Verwendung der erfindungsgemäss hergestellten Extrakte erzeugten Präparate homogene Suspensionen eines teilchenförmigen Materials und haben ein pharmazeutisch angenehmes Aussehen.
Es sei darauf hingewiesen, dass es auch nicht zu erwarten ist, dass die Ausbeute des Niederschlages aus dem wiedervereinigten Extrakt bei der Verwendung einer Aluminiumverbindung, um das Antigen unlöslich zu machen, wesentlich höher ist als diejenige, die bei dem bisher bekannten PEAP-Verfahren erhalten wurde.
Beispielsweise können Ausbeuten von etwa 40 bis 50 % erreicht werden, wenn man das bisher bekannte PEAP Verfahren anwendet, während beim erfindungsgemässen Verfahren Ausbeuten von etwa 80 bis 90 % erhalten werden. Diese Ausbeute ist auf den Proteinstickstoffgehalt berechnet und die Extraktionsflüssigkeit, im Vergleich zu dem Proteinstickstoffgehalt, in dem unlöslich gemachten Niederschlag oder dem Absorptionsprodukt.
Bei diesem unlöslich machenden Arbeitsverfahren kann eine stöchiometrische Menge an Aluminiumverbindung zugegeben werden, und die Suspension kann auf ihre geeignete Stärke einfach durch zusätzliche wässrige Flüssigkeit verdünnt werden. Es ist auch möglich, einen Überschuss an Aluminiumverbindung zuzusetzen und das gefällte oder absorbierte Produkt von dem darüberstehenden Material zu entfernen, zu waschen und erneut in einer physiologisch annehmbaren wässrigen Flüssigkeit zu suspendieren.
Um sicherzugehen, dass der allergene Extrakt steril ist, ist es üblich, eine Lösung, die einen thermisch empfindlichen Antigenextrakt enthält, durch ein Bakterienfilter zu filtrieren, wobei derartige Bakterienfilter üblicherweise Seitzfilter, Mikroporfilter, Millipore -Filter oder Membranfilter genannt werden. Derartige Arbeitsverfahren sind bekannt und in vielen Literaturstellen beschrieben. Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens kann eine derartige Sterilisierung in jeder beliebigen flüssigen Phase erreicht werden, solange das Antigen sich in Lösung befindet. Beispielsweise kann entweder der anfängliche wässrig-organische Lösungsmittelextrakt oder der wässrige wieder hergestellte Extrakt durch Filtrieren sterilisiert werden.
Natürlich sieht man, dass durch das Sprühtrocknungsverfahren eine Sterilisierung des erhaltenen Produktes erreicht werden kann, so dass dann ein derartiger Filtrierungsschritt nicht mehr notwendig ist.
Bezugnehmend auf die Art der Verwendung des nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Präparates sei darauf hingewiesen, dass derartige Arbeitsverfahren ebenso für den Fachmann bekannt sind und im wesentlichen in zwei Kategorien zerfallen. Diese sind: (1) Testextrakte oder diagnostische Extrakte und (2) B ehandlungsextrakte oder therapeutische Extrakte.
Die Testextrakte oder diagnostischen Extrakte weisen in erster Linie eine wässrige Natur auf und werden so verwendet, dass man einen Tropfen des speziellen Extraktes auf die Haut des zu testenden Menschen oder Tieres aufbringt und die Oberfläche der Haut unter dem Extrakt aufschürft. Nach einem ziemlich kurzen Zeitraum entsteht ein Hautausschlag oder eine Hautreaktion, und diese zeigt deutlich an, dass die getestete Person auf das spezielle Antigen, das in dem Test verwendet wird, allergisch ist. Andere Testverfahren sind die intrakutane Injektion des Extraktes und die nachfolgende Beobachtung eines Knötchens. Testungen der Bindehaut, Riechtests und Einatmungstests können auch verwendet werden, indem man das trockene Pulver einsetzt, das von der anfänglichen Extraktion stammt, und manchmal wird behauptet, dass derartige Tests charakteristischer und genauer sind als die Hauttestung.
Die zweite Kategorie dieser Extrakte, nämlich die B ehandlungsextrakte oder therapeutischen Extrakte, können wässrige Extrakte, aluminiumgefällte Extrakte, Depotextrakte und ähnliche Extrakte sein. Die Anwendung derartiger Behandlungesextrakte besteht darin, dass man subkutan eine ausserordentlich verdünnte Lösung des Antigens injiziert und dann täglich oder wöchentlich Injektionen mit allmählich ansteigenden Konzentrationen durchführt. Auf Grund der sehr weiten Bereiche der Empfindlichkeit der verschiedenen Personen und der verschiedenen Freisetzungseigenschaften der verschiedenen therapeutischen Formen des Antigens wird vom Arzt ein bestimmtes Behandlungsschema je nach der zu behandelnden Person ausgewählt.
Bezüglich der Dosierung und der Wirksamkeit des Extraktes können die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Materialien konzentriert oder verdünnt werden, bis man eine bestimmte Grundstärke des anfänglichen Extraktes erhält und die gewünschte Endstärke des endgültigen Extraktes. Das üblichste, jedoch nicht vollständig zufriedenstellende Verfahren zur Standartisierung der Extrakte besteht darin, dass man die Lösung auf ihre Protein-Stickstoffeinheiten analysiert (PNU). Der Nachteil dieses Verfahrens ist offensichtlich derjenige, dass alle Antigenen-Fraktionen des Extraktes nicht notwendigerweise Eiweissnatur besitzen müssen, sondern auch Kohlehydrate, Lipoide oder andere, nicht Stickstoff enthaltende Moleküle sein können.
Bezüglich der Wirksamkeit des Extraktes besteht die übliche Ausführung darin, dass man die Behandlungsextrakte in Konzentrationen von 10 bis etwa 5000 PNU standartisiert, je nach dem Zusammenhang zwischen den antigenen Eigenschaften und dem Gehalt an Proteinstickstoff. Behandlungsextrakte werden im allgemeinen so eingestellt, dass sie 10 bis 20000 PNU aufweisen, wobei die Extrakte geringerer Konzentration in den Anfangsphasen der Hyposensitivierungstherapie eingesetzt werden und die stärkeren Extrakte zu Erreichung oder Aufrechterhaltungsdosierung in grösseren Zeitintervallen angewandt werden.
Die Erfindung sei nun anhand von Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1
Herstellung eines trockenen pulverförmigen Extraktes
Eine Extraktionsflüssigkeit, die eine Mischung von 25 ml Pyridin und 250 ml 0,1 normaler Natronlauge enthält, wurde hergestellt, und 50 g einer Mischung der Pollen von hohen und niedrigen Ambriosaceae (high ragweed, low ragweed) wurden zugegeben. Man liess die Mischung 5 Tage lang bei Zimmertemperatur stehen, wobei während dieser Zeit hie und da einmal gerührt oder geschüttelt wurde. Die klare überstehende flüssige Phase enthielt das aktive Prinzip der Pollen und wurde dekantiert, und der Rückstand wurde verworfen.
Das überstehende Material wurde dann in einen Vakuumrotationseindampfer (Schnellverdampfer) gegeben, der mit einem Kühler ausgestattet war, und man erhitzte auf 500 C, bis die flüssige Phase entfernt worden war. Man erhielt dabei ein im wesentlichen trokkenes bräunliches Pulver. Das Pulver wurde dann in einen Vakuumexsikkator gegeben, und man liess es unter Vakuum über Nacht stehen. Das so erhaltene fliessfähige Pulver enthielt keine Spuren an Lösungsmittel.
Beispiel 2
Herstellung eines diagnostischen Extraktes
Eine Lösung, die das Pollenantigen der in Beispiel 1 beschriebenen Pflanze enthielt, wobei der Gehalt an Antigen 10000 PNU pro ml war, wurde hergestellt, indem man 393,2 mg des getrockneten Pulvers, das nach Beispiel 1 hergestellt worden war, zu 100 ml Wasser bei 500 C zugab. Der pH-Wert der erhaltenen Lösung war 7,4. Diese Lösung wurde dann durch ein Milliporfilter filtriert, um sie zu sterilisieren. Das Filtrat wurde analysiert, und es zeigte sich, dass es 9100 PNU pro ml des speziellen Antigens enthielt.
Die oben beschriebene Lösung wurde dann mit destilliertem Wasser unter sterilen Bedingungen verdünnt, bis sie 1000 PNU pro ml enthielt. Dann wurde ein intrakutaner Test durchgeführt, wobei hiezu 4 Personen verwendet wurden, von denen man wusste, dass sie gegenüber den Pollen dieser speziellen Pflanze empfindlich sind. Eine zweite Lösung, die einen Gehalt an 5000 PNU/ml aufweist, wurde hergestellt, und es wurden intrakutane Hauttests mit zwei Personen durchgeführt, von denen man wusste, dass sie normal reagierten und nicht allergisch gegen die Pollen der genannten Pflanze waren. Die dabei erhaltenen Ergebnisse werden in der Tabelle 1 veranschaulicht. Von den in dieser Tabelle angeführten Patienten wusste man, dass die Patienten 1 bis 4 gegenüber den Pollen empfindlich waren, während die Patienten 5 und 6 gegenüber den Pollen nicht empfindlich waren.
In Tabelle 1 erfolgte die Beurteilung der Reaktionen der einzelnen Personen nach dem folgenden Schema: 0 = negative Reaktion, keine Hautreaktion (wheal) 1+ = schwache Reaktion 5 mm Hautreaktion mit Ery them (Hautrötung) 2 + = mässige Reaktion 10 mm Hautreaktion mit Ery them 3+ = deutliche Reaktion 15 mm Hautreaktion mit Ery them und Pseudopodie (Erhebung der Haut) und
Jucken möglich 4+ = deutliche Reaktion, 20 mm Hautreaktion mit Ery them, Erhebung der Haut, Jucken und Schmerzen
Tabelle 1
Empfindlichkeit
Patient 1000 PNU/ml. 5000 PNU/m1.
1 2+
2 2+
3 3+
4 2+
5 0
6 0
Beispiel 3
Das Verfahren des Beispiels 1 wurde durchgeführt, wobei man einen trockenen pulverförmigen Extrakt der Pollen der gleichen Pflanze herstellte. Dieser wurde mit destilliertem Wasser unter sterilen Bedingungen behandelt und bis zur jeweiligen Verdünnung verdünnt. Dieser Extrakt ist geeignet für die Hyposensitivierungstherapie von Personen, die gegen die Pollen dieser Pflanze allergisch sind und zur Diagnose von Allergien nach den Hauttests.
Beispiel 4-8
Die Beispiele 1-3 wurden wiederholt, mit Ausnahme dessen, dass Haushaltsstaub, von Pferden abgestossene Materialien, Hühnerfedern, Kückenfedern, stechende Insekten, ein bestimmtes Gras (Zittergras Phleum pratense; timothy grass) und Birkenpollen anstelle der in Beispiel 1 verwendeten Pollen eingesetzt wurden. Derartige Extrakte werden zur Diagnose von allergischen Reaktionen durch Hauttestung oder zur Hyposensitivierungstherapie verwendet. Die trockenen Pulver können auch zur Diagnose von allergischen Reaktionen nach den Testmethoden der Bindehauttestung und des Riechtestes verwendet werden.
Beispiel 9
Etwa 100 ml des in destilliertem Wasser aufgenommenen Extraktes des Beispiels 3 wurden auf einen pH-Wert von 6,2 durch die Zugabe von verdünnter Schwefelsäure gebracht. Etwa 50 ml einer sterilen 2%igen Kaliumaluminiumsulfatlösung wurden langsam unter ständigem Rühren zugegeben. Der erhaltene Niederschlag wurde von der darüberstehenden Flüssigkeit durch Zentrifugieren entfernt, er wurde mit aus destilliertem Wasser hergestellter Kochsalzlösung gewaschen und erneut in einem Phosphatpuffer suspendiert, der einen pH-Wert von etwa 7,0 besass. Die erhaltene Ausbeute betrug etwa 80%. Diese allergen-aktive Suspension ist als langsam freisetzender Extrakt zur Hyposensitivierungs-Therapiebehandlung geeignet.
PATENTANSPRUCH 1
Verfahren zur Herstellung eines Extraktes einer Substanz, die allergisches Reagieren hervorrufen kann, wobei der Extrakt das physiologisch aktive Prinzip des Allergens enthält, dadurch gekennzeichnet, dass man das das Allergen enthaltende Material mit einer Extraktionsflüssigkeit vermischt, die Wasser und ein basischen Stickstoff enthaltendes organisches Lösungsmittel, das mit dem Allergen eine chemische Wechselwirkung eingeht, enthält, dass die Extraktionsflüssigkeit von dem darin unlöslichen Material entfernt wird, man das unlösliche Material verwirft und die extrahierte Flüssigkeit eindampft, damit man das aktive Prinzip dieser Substanz in Form eines stabilen allergen-aktiven Pulvers erhält.
UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel ein heterocyclisches tertiäres Amin ist.
2. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das heterocyclische tertiäre Amin einen Siedepunkt von unter 1200 C aufweist.
3. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das heterocyclische tertiäre Amin Pyridin, Chinolin, Lutidin, Collidin oder Picolin ist.
4. Verfahren nach Patentanspruch I oder einem der Unteransprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktionsflüssigkeit einen pH-Wert von 7,5 bis 12 aufweist.
5. Verfahren nach Unteranspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktionsflüssigkeit ein alkalisches Pyridin enthaltendes Lösungsmittelsystem ist.
6. Verfahren nach Patentanspruch I oder einem der Unteransprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Abdampfen der Extraktionsflüssigkeit dadurch
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Process for the production of an allergen extract and its use
The present invention relates to a process for the preparation of improved therapeutic and diagnostic allergen extracts. In this process for the preparation of the therapeutic and diagnostic antigen or allergen extracts, substances which are known to contain physiologically active principles that cause allergenic reactions are extracted and treated by extracting from an aqueous phase and from certain organic solvents applies an existing extraction system, whereby the organic solvent enters into a chemical interaction with the allergen and separates the extraction liquid, which contains the active principles, from the material insoluble in this liquid and then evaporates and removes the extraction liquid,
whereby the active principle is isolated in the form of a dry powder. The dry powder can then be worked up further to obtain an allergenic extract in a specific form. The form in which the allergenic extract is then produced can be any of the many known in therapeutic and diagnostic immunology.
It has long been known that different individuals develop characteristic allergenic reactions when they come into contact with certain naturally occurring or synthetic organic particles or materials. In particular, these allergenic reactions occur when these particles are inhaled. Examples of allergenic reactions are: sneezing, activation of the mucous glands, local edema, skin rashes and dilation of blood vessels.
These reactions are usually called hay fever, and even when the body's reactions generally do not cause serious harm, complications, both physiological and psychological, can arise. In a young child, the constant presence of allergenic conditions often leads to permanent deformation of the body, and especially facial features can be changed. Also note the psychological influences of constant discomfort. Asthmatic conditions are also closely linked to allergenic reactions, and they can lead to much more serious complications as well. Medical science now recognizes hay fever as a serious condition that needs to be treated carefully and thoroughly.
In this regard, it was known some time ago that extracts of the above-mentioned allergenically active or antigenically active substances can relieve these allergenic reactions when injected subcutaneously. The exact physiological mechanism of this treatment, which is referred to as hyposensitization in the specialist field, has not yet been fully and satisfactorily explained. However, various theories have been put forward which are attempted explanations.
One such theory assumes that the formation of so-called blocking or neutralizing antibodies is caused by the injection of the extracts, while another theory asserts that such treatment causes the formation of an association between the antigen or allergen and the antibody in the free circulating blood more favored than is possible in the tissue under shock.
In the production of such allergen extracts, it has hitherto been customary to simply extract the attacking organic substance which causes the allergenic reaction with a physiologically acceptable aqueous extraction liquid, for example a salt solution or slightly alkaline salt solution. After the extraction liquid had been separated from the residue, this solution, which contained the active principle, was sterilized and simply used as such, after, of course, a suitable serial dilution of this solution had been carried out. In such extraction methods, the physiologically acceptable extraction liquid is selected and is believed to protect the structural invulnerability of the antigen molecule.
More recently, however, a process has been developed that results in more complete, more effective allergen extracts. This process is described in U.S. Patent Nos. 3,148,121 and 3,148,122. The process described there briefly comprises the treatment of the entire non-defatted allergenic substance with an aqueous extraction liquid containing a heterocyclic tertiary amine, whereupon the liquid phase, which contains the active principle, is removed from the residue and the residue is discarded . Then, to remove the heterocyclic tertiary amine from the active principle, water and an alum solution are added to the extract so that the active principle is precipitated therefrom.
The precipitated material is then washed several times with water to remove all of the heterocyclic tertiary amine and excess alum, and then the precipitated material is finally resuspended in a physiologically acceptable carrier material such as a phosphate buffer solution.
Initially it was assumed that the addition of the heterocyclic tertiary amine in the process only resulted in a more complete allergen extract, since the amine-soluble constituents were contained in the extract in addition to the water-soluble protein-like or carbohydrate-like fractions. However, it is now believed that the reactive chemical structure of the heterocyclic tertiary amine can cause structural modification of the antigen molecule resulting in an allergenic treatment extract that is more effective and fairly free of constitutional side reactions.
Although this extraction in the presence of a heterocyclic amine and the precipitation with alum leads to allergen extracts which are subsequently called PEAP extracts due to the fact that pyridine is the preferred heterocyclic amine used in the process, and Although this method is effective and has certain advantages, it has nonetheless emerged over the past few years that there are certain limitations. In this context, it has been found that this type of extract cannot be used for skin testing purposes. This is generally undesirable to the clinician treating allergies as these clinicians prefer to be able to use the same extract for both diagnosis and treatment.
If the same extract is used for both skin testing and treatment in a treatment process, then you can be sure that the treatment used is exactly the antigen that has been found to cause the allergenic skin reaction. The above-described limitation of the PEAP extracts may be due to the insolubility of the precipitate and / or the formation of a complex between the antigen extracted with the heterocyclic tertiary amine and the alum used to precipitate the antigen from the extraction liquid.
In addition, the procedures involved in the production of PEAP antigens using the previously known methods are rather lengthy and the yields leave something to be desired. The yields are generally around 50% of the protein nitrogen units (PNU) originally extracted.
The aim of the present invention was to produce a more versatile and more effective allergen extract than the products that were previously obtainable with the aid of the known aqueous extraction processes and PEAP extraction processes.
Furthermore, efforts have been made to develop an improved process for the production of allergenic test extracts and long-acting treatment extracts in which a conventional allergen extraction process can be used.
Furthermore, an aqueous-organic solvent extraction process should be used, by means of which essentially all antigenic materials can be obtained in the processing of the same.
It has been found that these advantages can be achieved by (1) extracting the allergenically active substance with an extraction liquid which is a mixture of an aqueous phase and an organic solvent, the active principles being dissolved in and with the extraction liquid are treated, leaving a residue of inactive insoluble materials, then (2) separating the liquid phase containing the extraction liquid and the active principles from the insoluble residue and (3) separating the active principles from the extraction liquid by evaporation processes, with a stable , essentially dry, allergenic, powdery extract remains.
The present invention relates to a process for the preparation of an extract of a substance that can cause allergic reactions, the extract containing the physiologically active principle of the allergen, which is characterized in that the allergen-containing material is mixed with an extraction liquid that contains water and an organic solvent containing basic nitrogen, which chemically interacts with the allergy, that the extraction liquid is removed from the material insoluble in it, the insoluble material is discarded and the extracted liquid is evaporated so that the active principle of this substance is in the form of a stable allergen-active powder.
The basic nitrogen-containing organic solvent used in the process according to the invention is preferably a heterocyclic tertiary amine, in particular one with a boiling point below 1200 ° C., for example pyridine, quinoline, lutidine, collidine or picoline. The extraction liquid can have a pH of 7.5 to 12 and its evaporation can be achieved by heating it to a temperature of about 50 to 850.degree. Evaporation of the extraction liquid can be achieved under reduced pressure or by spray drying.
The nature of the chemical interaction that takes place between the allergen and the basic nitrogen-containing organic solvent is not yet fully understood. In some cases, a complex reaction is likely to take place between the antigen and the organic solvent.
Another object of the invention is the use of the extract produced by the process according to the invention, which is in the form of a stable allergenic powder, for producing a test extract. In this use, the powder is dissolved or suspended in a physiologically acceptable liquid in the required concentration.
In this particular use of the allergenic powder, an aqueous solvent system is preferably used as the physiologically acceptable liquid. The liquid obtained in this way can be sterilized, for example by filtering it through a bacterial filter. An aluminum compound, preferably potassium aluminum sulfate, can also be added to the test extract obtained in this way, as a result of which the active principles of the extract are converted into an insoluble form. The active principles so insolubilized can then be isolated and resuspended in a physiologically acceptable aqueous liquid.
To compare the process according to the invention with the previously known process, it should be pointed out again that in the previously known PEAP process, an alum precipitation step was used as an essential step in the manufacturing process for the allergen extract, because only by using this precipitation step in the previously known process could the active principles are separated from the physiologically undesirable tertiary amine of the extraction liquid.
It has now been unexpectedly found that this step, i.e. H. the precipitation of the antigen from the aqueous solution containing the heterocyclic tertiary amine can be completely bypassed using alum, although this precipitation step has so far been regarded as essential for the PEAP process. This bypassing the precipitation step is achieved by separating the active principles from the extraction liquid by an evaporation process before the active principles are diluted to the final dosage form. The evaporation step is described in more detail below.
The method according to the invention can be applied to all allergenically active substances, both those of natural origin and those produced synthetically. Such substances include various types of dust such as B. common dust that is found in homes and is collected with the help of vacuum cleaners, as well as types of dust that occur in manufacturing companies such. B. sawdust. Furthermore, the allergenic substances include epithelial cells such. B.
Materials that are repelled by cats, dogs, horses or rabbits, feathers, e.g. B. goose feathers and chicken feathers, seeds, such as. B. cottonseed and kapok, insects and insect-derived products such. B. bees, hornets, mosquitoes and their secretions, pollen from trees, grasses and weeds, such as. B. Ambrosiaceae, orchard grass, maple trees, apple trees, and also types of mold, such as. Aspergillus niger and Alternaria, complex synthetic chemicals such as. B. Antibiotics and similar materials.
Referring to the extraction liquid, which is used at the beginning to dissolve the active principles or the allergenic substances, to treat and to remove from the inactive residues, which are then discarded, it has now been found that the liquid preferably used in the process according to the invention is a Contains mixture of an aqueous phase and an organic solvent phase. This last-mentioned constituent of the extraction liquid can contain a basic nitrogen-containing solvent which has a boiling point which is sufficiently low that this solvent can evaporate without the structural integrity of the allergen being treated being destroyed.
This boiling point limitation will be explained in more detail below when the evaporation step is described in more detail. Generally speaking, however, it should be noted that the organic solvent should have a boiling point of less than about 1200 C, except when an evaporation process, such as. B. spray drying is used, in which the allergen is only momentarily subjected to higher temperatures. Preferably, the organic solvent portion of the extraction liquid contains an amine and in particular a heterocyclic tertiary amine, such as. B. pyridine, pyridine derivatives such as lutidine, quinoline, collidine, picoline and similar materials. In addition to the property that the organic solvent should have a corresponding boiling point, it should also preferably be miscible with water.
Although the exact chemical influence of the organic solvent on the antigen molecule or its structure is not known with any degree of certainty, it is nevertheless assumed that the strongly polar or basic nature of the solvents indicated above causes them to react with the antigen to to form a compound with the same, or that they in any way alter the complex molecular structure of the protein, carbohydrate, lipoprotein or polypeptide which are the basis for the allergenic nature of the patient's offending substance.
The extraction liquid, d. H. the aqueous phase can be just distilled water, or preferably a salt solution or an alkaline aqueous solution. In this regard, sodium bicarbonate, sodium chloride, sodium hydroxide and phosphate buffer or similar materials can be used. When substances that have an alkaline nature, such as. B. heterocyclic tertiary amines, are used in the extraction liquid, then this second aqueous component can also consist of a buffer that adjusts the pH to a more neutral value.
The resulting pH of the extraction liquid that is finally used is adjusted by mixing the solvent phase containing the organic amine and the aqueous phase. The pH can be in the range from 7.5 to 12.0, and it is preferably adjusted to the narrower pH range from 9.0 to 12. Since a large number of allergenic substances can be obtained with the aid of the method according to the invention, the pH of the extraction liquid and the composition of the same can be varied considerably. For example, it is known that the pollen of Ambrioceae (ragweed) contain a high and toxic fat or lipoid, which may play a major role in the allergenic nature of this substance.
In extracting the pollen from these weeds it may be desirable to increase the ratio of the organic solvent phase to the aqueous phase to ensure that all of the lipoid material goes into solution. However, it has been found that the same proportions of organic solvent phase and aqueous phase in the extraction liquid lead to a wide range of applicability of the same.
The extraction process is generally carried out in such a way that the allergenic substance causing the disease is mixed with the extraction liquid after previously contaminating components have been physically removed. The mixture is then allowed to stand at a temperature of about 20 to 250 ° C. for up to 11 days, either with or without stirring. The residue is then separated from the liquid phase, which at that point contains the treated and solubilized active allergenic principles, by allowing the insoluble residue to settle, filtering the mixture or performing a filtration process such as vacuum filtration.
The residue is then discarded, and the liquid phase obtained is a clear, often slightly amber or green colored solution of the reaction product of the aqueous extraction liquid containing the organic solvent and the antigen.
In the working stage, which will now be described in the following, the process according to the invention differs particularly clearly from the previously known PEAP process, in which potassium aluminum sulfate, namely alum, is then added to the solution in order to achieve precipitation and thus removal the antigen principle or active allergenic principle of the physiologically unacceptable extraction liquid.
The difference between the process according to the invention and the previously known PEAP process is that the separation of the active principle from the extraction liquid is achieved by evaporation processes, i. H. the liquid phase is subjected to such a physical state that it causes the liquid phase to be converted into a gas phase and that the non-volatile active principles are separated by diffusing or removing the gaseous phase from the active principles.
This important evaporation step of the process according to the invention can be carried out according to known methods which serve to free a solvent system from a substance dissolved in it. Examples of such methods include freeze drying, spray drying, vacuum drying, the use of a rotating vacuum drying apparatus and similar methods.
The temperatures used in this drying step can range from the minimum required to remove the extraction liquid at the pressure used, up to a temperature of about 950 ° C. The latter temperature is that used in spray drying processes where a thermally labile antigen is only momentarily subjected to such a high temperature. The pressure used in the evaporation system depends equally on the particular process used and it can vary in the range of atmospheric pressure or slightly above it down to 30 mm of mercury, the latter being the pressure mentioned is that used in freeze drying processes.
It has also been found that, in order to remove the last traces of the aqueous-organic liquid used for the extraction, it is advantageous to leave the essentially dry particulate antigen obtained by the evaporation process in a vacuum desiccator for about 24 hours. This work step can be carried out at room temperature or at a temperature of up to 450 C. The result of the above procedure is a dry, particulate, allergen-active or antigen-active material which has been treated with a very reactive extraction liquid, and which contains essentially all of the active principles of the original offensive substance, and furthermore this antigen extract is as regards the final intended use very variable, as will be described in more detail later.
It can also be seen that practically no allergenic material was lost in this process, while in the known process in which alum precipitation is carried out from the aqueous-organic solvent extract, a substantial proportion of the originally extracted protein nitrogen is lost. It was thus possible to significantly increase the yield and the completeness of the extraction by the process according to the invention.
It should also be pointed out that the method according to the invention is in no way limited to complicated, naturally occurring antigen mixtures, but that it can also be applied to an extract that has been subjected to a working process by which the various antigen fractions are separated before the treatment and / or the evaporation step is carried out.
At this stage, the dry particulate or powdered extract can be further processed in order to obtain an allergenic extract in one of the various forms in which the allergenic extracts are used. Thus, the powder can easily be treated with a physiologically acceptable aqueous solvent system and used both as a diagnostic skin test extract and as an extract for hyposensitizing treatment.
Such physiologically acceptable liquids are, for example, buffered saline solution or Evan solution, coca solution containing sodium bicarbonate, sodium chloride and phenol, or a glycero saline solution or Taurus solution, cane sugar solution or Hungarian solution, phosphate buffered solutions and similar materials . These solutions generally have a pH of around 7 and can have a pH of up to 7.5.
A second method for further processing the dry powdery extract can be carried out by treating it with an aqueous solution and then adding an aluminum compound, for example potassium alum or aluminum hydroxide, in order to convert the antigen into an insoluble form and to obtain a therapeutic dosage form which the release of the active component takes place slowly. In this regard, it was unexpectedly found that the insolubilized precipitate, or the absorption product, in which the aqueous extract prepared from the extract obtained by the process according to the invention, is significantly better than the antigens previously precipitated with alum which were defatted from , pure aqueous extracted solutions had been precipitated.
While the previously known preparations have a gelatinous appearance and are pharmaceutically unacceptable, the preparations produced using the extracts prepared according to the invention are homogeneous suspensions of a particulate material and have a pharmaceutically pleasing appearance.
It should be pointed out that it is also not to be expected that the yield of the precipitate from the recombined extract when using an aluminum compound to make the antigen insoluble is significantly higher than that obtained with the previously known PEAP process has been.
For example, yields of about 40 to 50% can be achieved if the previously known PEAP process is used, while yields of about 80 to 90% are obtained in the process according to the invention. This yield is calculated on the protein nitrogen content and the extraction liquid, compared to the protein nitrogen content, in the insolubilized precipitate or the absorption product.
In this insolubilizing procedure, a stoichiometric amount of aluminum compound can be added and the suspension can be diluted to its appropriate strength simply by additional aqueous liquid. It is also possible to add an excess of aluminum compound and to remove the precipitated or absorbed product from the overlying material, wash and resuspend in a physiologically acceptable aqueous liquid.
To ensure that the allergenic extract is sterile, it is customary to filter a solution containing a thermally sensitive antigen extract through a bacterial filter, such bacterial filters usually being called Seitz filters, microporous filters, Millipore filters or membrane filters. Such working methods are known and described in many literature references. When carrying out the method according to the invention, such a sterilization can be achieved in any liquid phase as long as the antigen is in solution. For example, either the initial aqueous-organic solvent extract or the aqueous reconstituted extract can be sterilized by filtration.
Of course, it can be seen that the spray drying process can sterilize the product obtained, so that such a filtration step is then no longer necessary.
With regard to the type of use of the preparation produced by the method according to the invention, it should be pointed out that such working methods are also known to the person skilled in the art and essentially fall into two categories. These are: (1) test extracts or diagnostic extracts and (2) treatment extracts or therapeutic extracts.
The test extracts or diagnostic extracts are primarily aqueous in nature and are used in such a way that a drop of the special extract is applied to the skin of the human or animal to be tested and the surface of the skin beneath the extract is scraped. After a fairly short period of time, a rash or skin reaction will develop and this will clearly indicate that the person being tested is allergic to the particular antigen used in the test. Other test methods include injecting the extract intracutaneously and then observing a nodule. Conjunctival tests, smell tests, and inhalation tests can also be used using the dry powder obtained from the initial extraction, and it is sometimes claimed that such tests are more characteristic and accurate than skin testing.
The second category of these extracts, namely the treatment extracts or therapeutic extracts, can be aqueous extracts, aluminum-precipitated extracts, depot extracts and similar extracts. The use of such treatment extracts consists in injecting an extremely dilute solution of the antigen subcutaneously and then carrying out daily or weekly injections with gradually increasing concentrations. Because of the very wide ranges of sensitivity of different people and the different release properties of the different therapeutic forms of the antigen, a specific treatment regimen will be selected by the doctor depending on the person being treated.
With regard to the dosage and the effectiveness of the extract, the materials produced by the process according to the invention can be concentrated or diluted until a certain basic strength of the initial extract and the desired final strength of the final extract are obtained. The most common, but not entirely satisfactory, method of standardizing the extracts is to analyze the solution for its protein nitrogen units (PNU). The disadvantage of this method is obviously that all the antigen fractions of the extract do not necessarily have to be of protein nature, but can also be carbohydrates, lipoids or other molecules that do not contain nitrogen.
With regard to the effectiveness of the extract, the usual implementation consists in standardizing the treatment extracts in concentrations of 10 to about 5000 PNU, depending on the relationship between the antigenic properties and the protein nitrogen content. Treatment extracts are generally adjusted so that they have 10 to 20,000 PNU, the lower concentration extracts being used in the initial phases of hyposensitization therapy and the stronger extracts being used at longer time intervals to achieve or maintain the dosage.
The invention will now be explained in more detail using examples.
example 1
Production of a dry powdery extract
An extraction liquid containing a mixture of 25 ml of pyridine and 250 ml of 0.1 normal sodium hydroxide solution was prepared, and 50 g of a mixture of the pollen of high and low Ambriosaceae (high ragweed, low ragweed) was added. The mixture was left to stand for 5 days at room temperature, during which time it was occasionally stirred or shaken once. The clear supernatant liquid phase contained the active principle of pollen and was decanted and the residue discarded.
The supernatant material was then placed in a vacuum rotary evaporator (flash evaporator) equipped with a condenser and heated to 500 ° C. until the liquid phase had been removed. An essentially dry, brownish powder was obtained. The powder was then placed in a vacuum desiccator and left under vacuum overnight. The flowable powder thus obtained contained no traces of solvent.
Example 2
Production of a diagnostic extract
A solution containing the pollen antigen of the plant described in Example 1, the antigen content being 10,000 PNU per ml, was prepared by adding 393.2 mg of the dried powder which had been prepared according to Example 1 to 100 ml of water added at 500 C. The pH of the resulting solution was 7.4. This solution was then filtered through a Millipore filter to sterilize it. The filtrate was analyzed and found to contain 9,100 PNU per ml of the specific antigen.
The solution described above was then diluted with distilled water under sterile conditions until it contained 1000 PNU per ml. An intracutaneous test was then performed using 4 people who were known to be sensitive to the pollen of this particular plant. A second solution containing 5000 PNU / ml was prepared and intracutaneous skin tests were performed on two people who were known to have normal reactions and were not allergic to the pollen of the named plant. The results obtained are shown in Table 1. For the patients listed in this table, it was known that patients 1 to 4 were sensitive to pollen, while patients 5 and 6 were not sensitive to pollen.
In Table 1 the reactions of the individual persons were assessed according to the following scheme: 0 = negative reaction, no skin reaction (wheal) 1+ = weak reaction 5 mm skin reaction with Ery them (skin reddening) 2 + = moderate reaction 10 mm skin reaction with Ery them 3+ = clear reaction 15 mm skin reaction with erythem and pseudopodia (elevation of the skin) and
Itching possible 4+ = clear reaction, 20 mm skin reaction with erythema, elevation of the skin, itching and pain
Table 1
sensitivity
Patient 1000 PNU / ml. 5000 PNU / m1.
1 2+
2 2+
3 3+
4 2+
5 0
6 0
Example 3
The procedure of Example 1 was followed to prepare a dry powder extract of the pollen of the same plant. This was treated with distilled water under sterile conditions and diluted to the respective dilution. This extract is suitable for hyposensitization therapy for people who are allergic to the pollen of this plant and for diagnosing allergies after skin tests.
Example 4-8
Examples 1-3 were repeated except that household dust, horse repelled materials, chicken feathers, chick feathers, stinging insects, a certain grass (quivering grass Phleum pratense; timothy grass) and birch pollen were substituted for the pollen used in Example 1. Such extracts are used for the diagnosis of allergic reactions by skin testing or for hyposensitization therapy. The dry powders can also be used to diagnose allergic reactions using the test methods of conjunctival testing and the smell test.
Example 9
About 100 ml of the extract from Example 3 taken up in distilled water were brought to a pH of 6.2 by adding dilute sulfuric acid. About 50 ml of a sterile 2% potassium aluminum sulfate solution was slowly added with constant stirring. The resulting precipitate was removed from the overlying liquid by centrifugation, washed with saline solution prepared from distilled water, and resuspended in a phosphate buffer having a pH of about 7.0. The yield obtained was about 80%. This allergen-active suspension is suitable as a slow-releasing extract for hyposensitization therapy treatment.
PATENT CLAIM 1
Process for the preparation of an extract of a substance which can cause an allergic reaction, the extract containing the physiologically active principle of the allergen, characterized in that the material containing the allergen is mixed with an extraction liquid, the water and an organic solvent containing basic nitrogen, chemical interaction with the allergen includes removing the extraction liquid from the insoluble material, discarding the insoluble material and evaporating the extracted liquid so that the active principle of this substance is obtained in the form of a stable allergen-active powder.
SUBCLAIMS
1. The method according to claim I, characterized in that the organic solvent is a heterocyclic tertiary amine.
2. The method according to dependent claim 1, characterized in that the heterocyclic tertiary amine has a boiling point of below 1200C.
3. The method according to dependent claim 1, characterized in that the heterocyclic tertiary amine is pyridine, quinoline, lutidine, collidine or picoline.
4. The method according to claim I or one of the dependent claims 1 to 3, characterized in that the extraction liquid has a pH of 7.5 to 12.
5. The method according to dependent claim 3, characterized in that the extraction liquid is an alkaline pyridine-containing solvent system.
6. The method according to claim I or one of the dependent claims 1 to 3, characterized in that the evaporation of the extraction liquid thereby
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