Procédé de synthèse de stéroïdes
La présente invention a pour objet un procédé de préparation de nouvelles 9a-halogéno-l lp-hydroxy-A8-A- norandrostène-2,17-diones de formule
EMI1.1
dans laquelle X est un atome d'halogène, caractérisé en ce qu'on soumet une 9a-halogéno-l l-hydroxy-A-nor- progestérone à l'action d'un micro-organisme du genre fusarium ou de ses enzymes.
Les composés de formule ci-dessus peuvent être utilisés pour la préparation, par traitement avec un agent réducteur, des 9a - halogéno -ss3 -A- norandrostène-2ss, 11 ss,
17P-triols correspondants.
En outre, les composés de formule ci-dessus, ainsi que leurs produits de réduction, peuvent être transformés en leurs dérivés. 11ss-acyloxy, repsectivement 11ss-hydroxy2ss,17ss-diacyloxy ou 2ss,11ss,17ss-triacyloxy, par réaction avec un agent acylant.
Les groupes acyles et acyloxy préférés sont ceux des acides hydrocarbonocarboxyliques ayant moins que 12 atomes de carbone, par exemple les acides alca niques inférieurs (par exemple l'acide acétique, propionique, butyrique ou tert.-pentanoïque), les acides alcé noïques inférieurs, les acides arylcarboxyliques monocycliques (par exemple l'acide benzoïque ou toluique), les acides arylalcanoïques inférieurs monocycliques (par exemple l'acide phénacétique ou B-phénylpropionique), les acides cycloalcanes carboxyliques et les acides cycloalcènes carboxyliques.
Les nouveaux composés de la présente invention sont des substances pharmacologiquement actives qui possèdent une activité anti-androgène (c'est-à-dire qu'ils inhibent l'action des androgènes), et qu'on peut utiliser pour le traitement d'états tels que l'acné hyperandrogène.
On peut mettre en composition les composés pour une telle administration, la concentration et/ou le dosage étant basés sur l'activité du composé particulier et les besoins du patient.
Pour mettre en oeuvre le procédé selon la présente invention, on soumet la matière de départ à l'action des enzymes d'un micro-organisme du genre fusarium dans des conditions d'oxydation. La meilleure manière de conduire cette oxydation est soit d'introduire le réactif de départ dans une culture aérobie du micro-organisme, soit en réunissant dans un milieu aqueux les composés, l'air et des enzymes de cellule du micro-organisme qui ne sont pas en voie de prolifération.
En général, les conditions de culture du micro-organisme pour les buts de la présente invention sont (à part l'inclusion du réactif de départ à convertir) les mêmes que celles pour la culture de divers autres micro-organismes pour la préparation d'antibiotiques et substances analogues. On cultive le micro-organisme dans un milieu aérobie, en contact avec (dans ou sur) un milieu de fermentation approprié. Un milieu approprié comprend essentiellement une source de carbone et d'énergie. Cette dernière peut être un hydrate de carbone, par exemple la mélasse, le glucose, le maltose, l'amidon ou la dextrine, un acide gras, une graisse et/ou le composé luimème. Cependant, de préférence, le milieu inclut une source de carbone assimilable et d'énergie en plus du stéroïde.
Parmi les graisses qu'on peut utiliser pour le but de la présente invention, on peut citer l'huile de saindoux, l'huile de soya, l'huile de lin, l'huile de graines de coton, l'huile d'arachide, I'huile de noix - de coco, l'huile de mais, l'huile de ricin, l'huile de sésame, I'huile de palme brute, le suif de mouton fantaisie (fancy),
I'huile de baleine, l'huile d'olive, la tristéarine, la tripalmitine, la tri-oléine et la trilaurine. Parmi les acides gras qu'on peut utiliser pour le but de la présente invention, on peut citer l'acide stéarique, l'acide palmitique, l'acide oléique, l'acide linoléique et l'acide myristique.
La source de facteur azoté pouvant être utilisée pour les buts de la présente invention peut être organique (par exemple la farine de graines de soya, la liqueur cornsteep , l'extrait de levure, l'extrait de viande et/ou des produits solubles de distillerie) ou synthétiques (c'està-dire composés de composés organiques ou inorganiques synthétisables simples, tels que les sels d'ammonium, des nitrates d'alcali, des amino-acides ou l'urée).
Pendant la fermentation on doit maintenir une source d'air stérile adéquate, par exemple par des méthodes classiques d'exposition d'une grande surface du milieu à l'air ou par l'utilisation d'une culture aérée submergée.
On peut ajouter le composé à la culture pendant la période d'incubation, ou l'introduire dans le milieu avant la stérilisation ou l'inoculation. La concentration préférée (mais non limitée) du composé dans la culture est d'environ 0,01 % à environ 0,1 %. Le temps de culture (ou plutôt le temps pendant lequel on soumet le composé à l'action de l'enzyme) peut varier beaucoup, la gamme pouvant être de 24 à 96 heures, mais pas forcément dans ces limites.
On peut utiliser les 9cr-halogéno-11B-hydroxy-113-A- norandrostène-2,17-diones de l'invention, non seulement pour leur activité anti-androgène, mais comme produits intermédiaires pour la préparation des 9a-halogéno-A8- A-norandroslène-2B.1Ig,l7B-trioles qui sont utiles comme agents anaboliques.
En faisant réagir la 9a-halogéno-llp-hydroxy-A3-A- norandrostène-2,17-dione avec un agent réducteur, par exemple le borohydrure de sodium à haute température, on isole le 9u-halogénotriol. On peut acyler ce composé en utilisant un anhydride d'acide et une base organique, par exemple l'anhydride acétique et la pyridine pour obtenir les dérivés 2,17-di-acyloxy de l'invention. Lorsqu'on utilise des conditions d'acylation plus fortes, par exemple un anhydride d'acide et l'acide perchlorique, etc., on obtient les dérivés 2,11, 17-triacyloxy.
L'exemple suivant illustre l'invention; toutes les températures sont en degrés centigrades sauf indication contraire.
Exemple: 9 -fluoro-ll p-hydroxy-A3-A-
norandrostène-2, 17-dione
A) Fermentation: la croissance de surface de chacune de deux cultures obliques sur agar-agar de deux semaines de fusarium javanicum var. ensiforme (QM524) (Army Quatermaster, Natick, Mass.). On met en suspension les cultures obliques contenant comme milieu nutritif A)
Glucose . 10 grammes
Extrait de levure - 2,5 grammes
K2HPO4 1 gramme
Eau distillée jusqu'à @ 1 litre dans 5 mi de solution aqueuse de sulfate de sodiumlauryle à 0,01 %.
On utilise des portions de 1 ml de cette suspension pour inoculer six flacons Erlenmeyer de 250 ml contenant chacun 50ml du milieu stérilisé B):
Dextrose - 10 grammes
Liqueur cornsteep 6 grammes
NH4H2PO4 - 3 grammes
Extrait de levure 2,5 grammes
CaCO3 2,5 grammes
Eau distillée jusqu'à. 1 litre
Après 72 heures d'incubation à 250 C avec une agitation rotative continue (280 tours/minute; rayon de 51 mm), on effectue des transferts de 10 % (volume/ volume) dans 34 flacons Erlenmeyer de 250 ml contenant 50 ml du milieu B fraîchement stérilisé plus 300 micro-grammes/ml de 9α-fluoro-11ss-hydroxy-Ä-nonprogres- térone.
On ajoute le stéroïde en ajoutant à chaque flacon 0,25 mi d'une solution stérile (60 mg/ml) du stéroïde dans le N,N-diméthylformamide. On fermente au total 510 mg.
Après encore 72 heures d'incubation, en utilisant les conditions décrites ci-dessus, on réunit les contenus des flacons et filtre le bouillon à travers un tampon clarificateur Seitz . On lave les flacons, le mycélium et le tampon avec des portions successives de 50ml d'eau chaude. Le filtrat et les eaux de lavage réunis ont un volume de 2000 mi.
B) Isolement: on extrait le filtrat ainsi obtenu trois fois avec des portions de 600 ml de chloroforme. On lave les extraits chloroformiques trois fois avec des portions de 600 ml d'eau, les sèche sur du sulfate de sodium et les évapore à sec. Après avoir cristallisé le résidu dans un mélange d'acétone et d'isopropyléther, on obtient 254 mg de 9 -fluoro-ll,8-hydroxy-A3-A-norandrostène-2,17-dione qui fond à 243-2440 C.
On décrit dans les préparations ci-après comment les composés obtenus par le procédé selon l'invention peuvent être acylés et réduits.
A. 9α-fluoro-11ss-acétoxy-# -A-norandrostène-
2,17-dione
On ajoute une solution de 0,0033 ml d'acide perchlorique dans 0,3 ml d'anhydride acétique à 450 mg de 9 - fluoro- l l ,3-hydroxy-A3-A-norandrostène-2,17-dione dans 10ml d'anhydride acétique. On agite le mélange réactionnel à la température ordinaire pendant 0,5 heure puis le verse dans un mélange de glace et d'eau et l'extrait au chloroforme. On lave les extraits chloroformiques avec une solution saturée de bicarbonate de sodium, une solution de sel à 8 /o, les sèche sir du sulfate de sodium et les évapore à sec pour obtenir la 9α-fluoro-11ss-acé- toxy-A3-A-norandrostène-2,17-dione.
B. 9α-bromo-11ss-acétoxy-# -A-norandrostène-
2,17-dione; 9α-chloro-11ss-acétoxy-# -A-norandrostène-
2,17-dione
En procédant comme dans A mais en substituant la 9 -bromo-1 lss-hydroxy-A3-A-norandrostène-2,17-dione et la 9 -chloro-11,3-hydroxy-A3-A-norandrostène-2,17- dione à la 9α-fluoro-11ss-hydroxy-# -A-norandrostène- 2, 17-dione, on obtient la 9α-bromo-11ss-acétoxy-# -A- norandrostène-2,17-dione et la 9a- chloro -11(3 -acétoxy- # -A-norandrostène-2,17-dione.
C. 9α-fluoro-# -A-norandrostène-2ss,11ss,17ss-triol
On chauffe au reflux pendant 16 heures un mélange de 100 mg de 9α-fluoro-11ss-hydroxy-# -A-norandrostène- 2,17-dione et 150mg de borohydrure de sodium dans 2 ml d'une solution d'hydroxyde de sodium 2 N et 25 ml de méthanol, le verse dans l'eau, l'acidifie et l'extrait au chloroforme. On lave les extraits chloroformiques avec une solution de sel à 8 /o, les sèche sur du sulfate de sodium et les évapore à sec. Après avoir cristallisé le résidu dans de l'acétate d'éthyle, on obtient 20mg de 9α-fluoro-# -A-norandrostène-2ss,11ss,17ss-triol qui fond à 200-2010 C.
On obtient l'échantillon analytique par recristallisation dans de l'acétate d'éthyle, il fond à 2072080 C et a un #d2DMSOTMS = 9,13 (s, 18-Me), 8,63 (s, 19-Me) et 4,72 (s, 3-H).
Analyse:
Calculé pour C18H27O3F (310,40):
C = 69,65; H = 8,77
Trouvé: C = 69,69; H = 8,79
D. 2,17-diacétate de 9 -fluoro-A3-A-norandrostène-
2ss,11ss,17ss-triol
En procédant comme dans A mais en substituant le 9α-fluoro-# -A-norandrostène-2ss,11ss,17ss-triol à la 9a fluoro-11ss-hydroxy-# -A-norandrostène-2,17-dione, on obtient le 2,17-diacétate de 9α-fluoro-# -A-norandro- stène-2ss,11ss,17ss-triol.
E. 2,11,17-triacétate de 9a-fluoro-A3-A-norandrostène-
2ss,11ss,17ss-triol
En procédant comme dans A mais en substituant le 9α-fluoro-# -A-norandrostène-2ss,11ss,17ss-triol ou le 2,17-diacétate de 9α-fluoro-# -A-norandrostène-2ss,11ss, 17ss-triol à la 9α-fluoro-# -A-norandrostène- 2,17-dione, on obtient le 2,11,17-triacétate de 9 -fluoro # -A-norandrostène-2ss,11ss,17ss-triol.
Synthesis process of steroids
The present invention relates to a process for the preparation of new 9a-halo-lp-hydroxy-A8-A-norandrostene-2,17-diones of formula
EMI1.1
in which X is a halogen atom, characterized in that a 9a-halo-1-hydroxy-A-nor-progesterone is subjected to the action of a microorganism of the genus fusarium or of its enzymes.
The compounds of the above formula can be used for the preparation, by treatment with a reducing agent, of 9a - halo -ss3 -A-norandrostene-2ss, 11 ss,
Corresponding 17P-triols.
In addition, the compounds of the above formula, as well as their reduction products, can be converted into their derivatives. 11ss-acyloxy, respectively 11ss-hydroxy2ss, 17ss-diacyloxy or 2ss, 11ss, 17ss-triacyloxy, by reaction with an acylating agent.
Preferred acyl and acyloxy groups are those of hydrocarbonocarboxylic acids having less than 12 carbon atoms, for example lower alkaline acids (for example acetic, propionic, butyric or tert.-pentanoic acid), lower alkene acids, monocyclic arylcarboxylic acids (eg benzoic or toluic acid), monocyclic lower arylalkanoic acids (eg phenacetic or B-phenylpropionic acid), cycloalkane carboxylic acids and cycloalkene carboxylic acids.
The novel compounds of the present invention are pharmacologically active substances which possess anti-androgenic activity (i.e., they inhibit the action of androgens), and which can be used for the treatment of conditions. such as hyperandrogenic acne.
Compounds can be compounded for such administration, the concentration and / or dosage being based on the activity of the particular compound and the needs of the patient.
In order to carry out the process according to the present invention, the starting material is subjected to the action of the enzymes of a microorganism of the genus fusarium under oxidative conditions. The best way to carry out this oxidation is either to introduce the starting reagent into an aerobic culture of the microorganism, or by bringing together in an aqueous medium the compounds, air and cell enzymes of the microorganism which are not not in the process of proliferation.
In general, the conditions for culturing the microorganism for the purposes of the present invention are (apart from the inclusion of the starting reagent to be converted) the same as those for culturing various other microorganisms for the preparation of. antibiotics and similar substances. The microorganism is cultured in an aerobic medium, in contact with (in or on) a suitable fermentation medium. A suitable medium essentially comprises a source of carbon and energy. The latter can be a carbohydrate, for example molasses, glucose, maltose, starch or dextrin, a fatty acid, a fat and / or the compound itself. Preferably, however, the medium includes a source of assimilable carbon and energy in addition to the steroid.
Among the fats which can be used for the purpose of the present invention, mention may be made of lard oil, soybean oil, linseed oil, cottonseed oil, olive oil. peanut, coconut oil, corn oil, castor oil, sesame oil, crude palm oil, fancy sheep tallow,
Whale oil, olive oil, tristearin, tripalmitin, triolein and trilaurine. Among the fatty acids which can be used for the purpose of the present invention, mention may be made of stearic acid, palmitic acid, oleic acid, linoleic acid and myristic acid.
The source of nitrogen factor which can be used for the purposes of the present invention can be organic (e.g. soybean meal, cornsteep liquor, yeast extract, meat extract and / or soluble products of distillery) or synthetic (i.e. compounds of simple synthesizable organic or inorganic compounds, such as ammonium salts, alkali nitrates, amino acids or urea).
During fermentation an adequate source of sterile air should be maintained, for example by conventional methods of exposing a large area of the medium to air or by the use of submerged aerated culture.
The compound can be added to the culture during the incubation period, or introduced into the medium prior to sterilization or inoculation. The preferred (but not limited) concentration of the compound in the culture is from about 0.01% to about 0.1%. The culture time (or rather the time during which the compound is subjected to the action of the enzyme) can vary a lot, the range being 24 to 96 hours, but not necessarily within these limits.
The 9cr-halo-11B-hydroxy-113-A-norandrostene-2,17-diones of the invention can be used, not only for their anti-androgenic activity, but as intermediates for the preparation of 9a-halo-A8. - A-norandroslene-2B.1Ig, 17B-trioles which are useful as anabolic agents.
By reacting 9α-halo-11p-hydroxy-A3-A-norandrostene-2,17-dione with a reducing agent, for example sodium borohydride at high temperature, the 9u-halotriol is isolated. This compound can be acylated using an acid anhydride and an organic base, for example acetic anhydride and pyridine to obtain the 2,17-di-acyloxy derivatives of the invention. When using stronger acylation conditions, for example acid anhydride and perchloric acid, etc., the 2,11,17-triacyloxy derivatives are obtained.
The following example illustrates the invention; all temperatures are in degrees centigrade unless otherwise specified.
Example: 9 -fluoro-ll p-hydroxy-A3-A-
norandrostene-2, 17-dione
A) Fermentation: the surface growth of each of two oblique cultures on two-week agar-agar of Fusarium javanicum var. ensiforme (QM524) (Army Quatermaster, Natick, Mass.). Slant cultures containing as nutrient medium A) are suspended
Glucose. 10 grams
Yeast extract - 2.5 grams
K2HPO4 1 gram
Distilled water to @ 1 liter in 5 ml of 0.01% aqueous sodium lauryl sulfate solution.
1 ml portions of this suspension are used to inoculate six 250 ml Erlenmeyer flasks each containing 50 ml of sterilized medium B):
Dextrose - 10 grams
Cornsteep liqueur 6 grams
NH4H2PO4 - 3 grams
Yeast extract 2.5 grams
CaCO3 2.5 grams
Distilled water up to. 1 litre
After 72 hours of incubation at 250 ° C. with continuous rotary agitation (280 revolutions / minute; radius of 51 mm), transfers of 10% (volume / volume) are carried out in 34 250 ml Erlenmeyer flasks containing 50 ml of the medium. Freshly sterilized B plus 300 micrograms / ml 9 α -fluoro-11ss-hydroxy-Ä-nonprogresterone.
The steroid is added by adding to each vial 0.25 ml of a sterile solution (60 mg / ml) of the steroid in N, N-dimethylformamide. A total of 510 mg is fermented.
After a further 72 hours of incubation, using the conditions described above, the contents of the vials are combined and the broth filtered through Seitz clarifying buffer. The bottles, the mycelium and the buffer are washed with successive portions of 50 ml of hot water. The combined filtrate and washings have a volume of 2000 ml.
B) Isolation: the filtrate thus obtained is extracted three times with 600 ml portions of chloroform. The chloroform extracts were washed three times with 600 ml portions of water, dried over sodium sulfate and evaporated to dryness. After crystallizing the residue from a mixture of acetone and isopropyl ether, 254 mg of 9 -fluoro-11,8-hydroxy-A3-A-norandrostene-2,17-dione are obtained which melts at 243-2440 C.
How the compounds obtained by the process according to the invention can be acylated and reduced is described in the preparations below.
A. 9 α -fluoro-11ss-acetoxy- # -A-norandrostene-
2,17-dione
A solution of 0.0033 ml of perchloric acid in 0.3 ml of acetic anhydride is added to 450 mg of 9 - fluoro- ll, 3-hydroxy-A3-A-norandrostene-2,17-dione in 10 ml of acetic anhydride. The reaction mixture was stirred at room temperature for 0.5 hour then poured into a mixture of ice and water and extracted with chloroform. The chloroform extracts are washed with saturated sodium bicarbonate solution, 8% salt solution, dried with sodium sulfate and evaporated to dryness to obtain 9 α -fluoro-11ss-acetoxy-A3. -A-norandrostene-2,17-dione.
B. 9 α -bromo-11ss-acetoxy- # -A-norandrostene-
2,17-dione; 9 α -chloro-11ss-acetoxy- # -A-norandrostene-
2,17-dione
By proceeding as in A but substituting 9 -bromo-1 lss-hydroxy-A3-A-norandrostene-2,17-dione and 9 -chloro-11,3-hydroxy-A3-A-norandrostene-2,17 - dione with 9 α -fluoro-11ss-hydroxy- # -A-norandrostene- 2, 17-dione, we obtain 9 α -bromo-11ss-acetoxy- # -A- norandrostene-2,17-dione and 9a-chloro -11 (3 -acetoxy- # -A-norandrostene-2,17-dione.
C. 9 α -fluoro- # -A-norandrostene-2ss, 11ss, 17ss-triol
A mixture of 100 mg of 9 α -fluoro-11ss-hydroxy- # -A-norandrostene-2,17-dione and 150 mg of sodium borohydride in 2 ml of a sodium hydroxide solution is heated under reflux for 16 hours. 2N sodium and 25 ml of methanol, poured into water, acidified and extracted with chloroform. The chloroform extracts are washed with an 8% salt solution, dried over sodium sulfate and evaporated to dryness. After having crystallized the residue from ethyl acetate, 20 mg of 9 α -fluoro- # -A-norandrostene-2ss, 11ss, 17ss-triol are obtained which melts at 200-2010 C.
The analytical sample is obtained by recrystallization from ethyl acetate, it melts at 2072080 C and has a # d2DMSOTMS = 9.13 (s, 18-Me), 8.63 (s, 19-Me) and 4.72 (s, 3-H).
Analysis:
Calculated for C18H27O3F (310.40):
C, 69.65; H = 8.77
Found: C, 69.69; H = 8.79
D. 9 -fluoro-A3-A-norandrostene- 2,17-diacetate
2ss, 11ss, 17ss-triol
Proceeding as in A but substituting 9 α -fluoro- # -A-norandrostene-2ss, 11ss, 17ss-triol for 9a fluoro-11ss-hydroxy- # -A-norandrostene-2,17-dione, one obtains 9 α -fluoro- # -A-norandro-stene-2ss, 11ss, 17ss-triol 2,17-diacetate.
E. 9α-Fluoro-A3-A-norandrostene- 2,11,17-triacetate
2ss, 11ss, 17ss-triol
By proceeding as in A but substituting the 9 α -fluoro- # -A-norandrostene-2ss, 11ss, 17ss-triol or the 2,17-diacetate of 9 α -fluoro- # -A-norandrostene-2ss, 11ss, 17ss-triol with 9 α -fluoro- # -A-norandrostene-2,17-dione, 9 -fluoro # -A-norandrostene-2ss, 11ss, 17ss-triol 2,11,17-triacetate is obtained.