Procédé de synthèse d'un stéroïde
La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un nouveau stéroide de formule:
EMI1.1
caractérisé en ce que l'on met en contact la 17a-hydroxy
A-norprogestérone avec le micro-organisme Colletotri chum linicola, ou ses enzymes, dans des conditions oxydantes pour obtenir le composé de formule:
EMI1.2
puis on traite le composé de formule II avec un agent acylant en présence d'un catalyseur basique pour former un 15ester de ce composé et l'on chauffe cet ester en présence d'une base.
L'invention s'étend à l'utilisation du stéroide de formule I, obtenu conformément au procédé ci-dessus, pour la préparation des 17a-esters de ce stéroide par traitement avec un agent acylant.
Les agents acylants préférés sont ceux provenant d'acides hydrocarbyl-carboxyliques ayant moins de 12 atomes de carbone et incluent des acides tels que les acides alcanoiques inférieurs (par exemple acétique, propionique, butyrique et tert-pentanoïque), les acides alcé noïques inférieurs, les acides aryl-carboxyliques monocycliques (par exemple l'acide benzoïque et toluique), les acides aryliques monocycliques alcanoiques inférieurs (par exemple l'acide phénacétique et l'acide ,13-phényl- propionique), les acides cycloalcane-carboxyliques et les acides cycloalcène-carboxyliques.
Les radicaux acyles préférés représentés par R' incluent aussi ceux qui sont dérivés d'acides d'hydrocarbure-sulfoniques ayant moins de 12 atomes de carbone et incluent des acides tels que les acides (alcane inférieur) sulfoniques, (par exemple l'acide méthanesulfonique et l'acide éthanesulfonique), les acides (alcène inférieur)sulfoniques, les acides arylsulfoniques monocycliques (par exemple l'acide benzènesulfonique et l'acide p-toluène-sulfonique), les acides (aryl monocycliques) (alcane inférieur) sulfonique (par exemple l'acide phénylméthane-sulfonique), les acides cycloalcane- sulfoniques et les acides cycloalcène-sulfoniques.
Les nouveaux composés de formules I et II sont physiologiquement actifs et possèdent une activité antiandrogénique, c'est-à-dire qu'ils inhibent l'action des androgènes et que l'on peut les utiliser pour le traitement d'états tels que l'acné hyperandrogénique. On peut mettre les composés dans une composition pour une administra tion de ce genre, la concentration et/ou le dosage étant basés sur l'activité du composé particulier.
Pour la préparation du composé de formule I, on soumet la 17a-hydroxy-A-norprogestérone à l'action de Colletotrichunt linicola, ou à l'action de ses enzymes, dans des conditions oxydantes. On peut conduire cette oxydation de la manière la plus avantageuse en incluant soit la 17a-hydroxy-A-norprogestérone dans une culture aérobie du micro-organisme, soit en réunissant dans un milieu aqueux les composés, I'air et les enzymes de cellules du micro-organisme qui ne sont pas en voie de prolifération.
En général, les conditions de culture du micro-organisme dans le but de la présente invention sont (à part l'inclusion de la 17a-hydroxy-A-norprogestérone) les mêmes que celles pour la culture de divers autres microorganismes pour la préparation d'antibiotiques, de vitamine B1 et de substances analogues. On cultive le microorganisme dans des conditions aérobies en contact avec un milieu de fermentation approprié (dans ou sur celuici). Un milieu approprié comprend essentiellement une source de carbone et d'énergie. Cette dernière peut être un hydrate de carbone, par exemple la mélasse, le glucose, le maltose, I'amidon et la dextrine, un acide gras, une graisse et/ou le composé lui-même. Cependant, de préférence, le milieu inclut une source de carbone et d'énergie assimilable en plus du stéroide.
Parmi les graisses que l'on peut utiliser pour le but de la présente invention se trouvent l'huile de saindoux, I'huile de soja,
I'huile de lin, I'huile de graines de coton, I'huile d'arachides, l'huile de noix de coco, l'huile de maïs, I'huile de ricin, I'huile de sésame, I'huile de palme brute, le suif de mouton raffiné, I'huile de baleine, I'huile d'olives, la tristéarine, la tripalmitine, la trioléine et la trilaurine.
Parmi les acides gras que l'on peut utiliser pour les buts de la présente invention se trouvent l'acide stéarique,
I'acide palmitique, I'acide oléique, I'acide linoléique et l'acide myristique.
La source des facteurs azotés que l'on peut utiliser pour la présente invention peut être organique (par exemple la farine de graines de soja, la liqueur cornsteep , l'extrait de levure, I'extrait de viande et/ou les produits solubles de distillerie) ou synthétique (c'est-àdire contenant des composés inorganiques ou organiques synthétisables simples, tels que des sels d'ammonium, des nitrates alcalins, des acides aminés ou l'urée).
On doit maintenir une source d'air stérile adéquate pendant la fermentation, par exemple par les procédés classiques d'exposition d'une large surface du milieu à l'air ou par l'utilisation d'une culture aérée submergée.
On peut additioner le composé à la culture pendant la période d'incubation, ou l'inclure dans le milieu avant la stérilisation ou l'inoculation. La gamme préférée (mais non limitatrice) de la concentration du composé dans la culture est environ 0,01 6/o à environ 0,1 6/o. La période de culture (ou plutôt de temps pendant lequel on soumet le composé à l'action de l'enzyme) peut varier beau
coup, une gamme comprise entre environ 24 et 96 h est possible mais non limitatrice. Ce procédé microbien permet d'obtenir la 15a,17a-dihydroxy-A-norprogestérone qui est un nouveau composé de la présente invention.
On acyle ce composé l5,17a-dihydroxy par exemple
en le traitant avec un halogénure d'acyle ou l'anhydride
d'acide d'un acide hydrocarbyl-carboxylique ayant moins
de 12 atomes de carbone ou un acide hydrocarbyl-sulfonique ayant moins de 12 atomes de carbone, en pré-
sence d'un catalyseur basique, et on obtient un 15amonosulfonyloxyester. On chauffe cet ester avec une base telle que la collidine et on obtient la 17a-hydroxy-14déshydro-A-norprogestérone de formule I, que l'on peut estérifier par un traitement avec un agent d'acylation en présence d'un acide fort pour obtenir les 17a-esters de formule II.
Les exemples suivants illustrent l'invention (toutes les températures sont en o C).
Exemple 1:
15a,17a-d ihyd roxy-A -norprogestérone
A) La fermentation
On met en suspension la croissance de surface provenant de culture oblique de Colletotrichum linicola (NCTC-1194) sur l'agar-agar vieux de 15 jours, les cultures obliques contenant comme milieu nutritif (A)
Grammes
glucose 10
extrait de levure 2,5
K2HPO4 1
agar-agar 20
eau distillée jusqu'à 1 litre dans 5ml d'une solution de sulfate de sodium lauryl aqueuse à 0,01 /o. On utilise des portions d'un ml de suspension pour inoculer 8 flacons Erlenmeyer de 250ml, chacun contenant 50 ml du milieu stérilisé B suivant:
:
Grammes
dextrose 10
liqueur cornsteep 6 NH4H2PO4 3
extrait de levure 2,5
CaCO3 2,5
eau distillée jusqu'à 1 litre
Après 72 h d'incubation à 250 C avec une agitation continue rotative (280 cycles/mn; course de 5 cm), on effectue des transferts de 10 6/o (vol/vol) dans 34 flacons Erlenmeyer de 250 mi contenant chacun 50 mi de milieu B fraîchement stérilisé. Après encore 24 h d'incubation, en utilisant les mêmes conditions que décrites plus haut, on additionne 300 microgrammes par ml de stéroide en additionnant à chaque flacon 0,25 ml d'une solution stérile (60 mg/ml) de 17ff-hydroxy-A-norpro- gestérone dans le N,N-diméthylformamide.
On fermente
au total 510 mg.
Après approximativement encore 4h d'incubation, en utilisant les conditions décrites plus haut, on réunit les contenus des flacons puis filtre le bouillon à travers un tampon de clarification Seitz . On lave les flacons, le mycélium et le tampon avec des portions successives de 50 ml d'eau chaude. Le filtrat et les eaux de lavage
réunis ont un volume de 2000 ml.
B) Isolement
On extrait trois fois au chloroforme le filtrat obtenu
au stade A. On lave trois fois les extraits chioroformi-
ques avec de l'eau, les sèche sur du sulfate de sodium et
les évapore à sec. On cristallise le résidu dans de l'acé-
tone/isopropyléther pour obtenir environ 282 mg de 15α,17α-dihydroxy-A-norprogestérone, qui fond à 200202,50 C.
On prépare l'échantillon analytique par recristallisation dans du méthanol/éther isopropylique; il fond à 206-2080C et a un [a]2D = + 260 (EtOH); XKBr 2,89, 5,90 (sh.), 5,98 et 6,20 ; XEtOH 234 met (15.800); TMCl 9,20 (s, 18-Me), 8,82 (s, 19-Me), 7,70 (s, 21-Me), 6,02 (m, l5-H) et 4,27 (s, 3-H).
Anal. Calc. pour C20H2804 (332,42): C 72,26; H 8,49
Trouvé: C 72,42; H 8,52 15α-mésyloxy-17α-hydroxy-A-norprogestérone
On traite une solution de 100 mg de 15a-17a-dihydroxy-A-norprogestérone dans 2,5ml de pyridine à 60 C avec 0,15 ml de chlorure de mésyle et laisse à cette température pendant une nuit. On dilue le mélange réactionnel avec de l'eau et l'extrait au chloroforme. On lave les extraits chloroformiques avec de l'acide chlorhydrique 2N, une solution de sel à 8 /o, les sèche sur du sulfate de sodium et les évapore à sec. On cristallise le résidu dans de l'acétone-Hexane pour obtenir environ 72 mg de 15α-mésyloxy-17α-hydroxy-A-norprogestérone qui fond à 156-1570 C avec décomposition.
On prépare l'échantillon analytique par recristallisation dans de l'acétone/hexane; il fond à 157-1580 C avec décomposition et a un XKBr 2,92, 5,88, 6,01, 6,20 et 8,56 ; XEtOH 233 mu (16.900); cDMsl 9,21 (s, 18-Me), 8,82 (s, 19-Me), 7,73 (s, 21-Me), 6,98 (s, 15a-mésylate), 5,03 (mW 1/2 20 C.p.s. 15B-H) et 4,25 (s, 3-H).
Anal. calc. pour C2tH3nO6S (410,54): S 7,81
Trouvé: S 8,21 17α-hydroxy-14-déshydro-A-norprogestérone
On chauffe au reflux pendant 0,5 h une solution de 100 mg de 15α-mésyloxy-17α-hydroxy-A-norprogestérone dans 5 ml de collidine. On dilue le mélange réactionnel avec du chloroforme et le lave avec de l'acide chlorhydrique 2N, une solution de sel à 8 /o, le sèche sur du sulfate de sodium et l'évapore à sec pour obtenir la 17ahydroxy-14-déshydro-A-norprogestérone.
Ce composé peut être utilisé comme suit:
17a-acétoxy-14-déshydrn-A -norprogestérone
On additionne une solution de 0,0033 ml d'acide perchlorique dans 0,3 ml d'anhydride acétique à 500 mg de 1 7a-hydroxy- 14-déshydro-A-norprogestérone dans 10 ml d'anhydride acétique. On agite le mélange réactionnel à la température ordinaire pendant 30mn puis le verse dans un mélange d'eau et de glace et l'extrait au chloroforme. On lave les extraits chloroformiques avec une solution de bicarbonate de sodium saturée, une solution de sel à 8 /o, les sèche sur du sulfate de sodium et évapore à sec pour obtenir le 17α-ester désiré.
Method of synthesizing a steroid
The present invention relates to a process for preparing a novel steroid of formula:
EMI1.1
characterized in that the 17a-hydroxy is brought into contact
A-norprogesterone with the microorganism Colletotri chum linicola, or its enzymes, under oxidizing conditions to obtain the compound of formula:
EMI1.2
then the compound of formula II is treated with an acylating agent in the presence of a basic catalyst to form an ester thereof and this ester is heated in the presence of a base.
The invention extends to the use of the steroid of formula I, obtained according to the above process, for the preparation of the 17α-esters of this steroid by treatment with an acylating agent.
Preferred acylating agents are those derived from hydrocarbyl carboxylic acids having less than 12 carbon atoms and include acids such as lower alkanoic acids (eg acetic, propionic, butyric and tert-pentanoic), lower alkanoic acids, monocyclic aryl carboxylic acids (eg benzoic and toluic acid), monocyclic lower alkanoic aryl acids (eg phenacetic acid and, 13-phenyl-propionic acid), cycloalkane carboxylic acids and acids cycloalkene carboxylic acids.
Preferred acyl radicals represented by R 'also include those which are derived from hydrocarbon sulfonic acids having less than 12 carbon atoms and include acids such as (lower alkane) sulfonic acids, (eg methanesulfonic acid and ethanesulfonic acid), (lower alkene) sulfonic acids, monocyclic arylsulfonic acids (e.g. benzenesulfonic acid and p-toluenesulfonic acid), (monocyclic aryl) (lower alkane) sulfonic acids (e.g. example phenylmethanesulfonic acid), cycloalkanesulfonic acids and cycloalkenesulfonic acids.
The new compounds of formulas I and II are physiologically active and possess antiandrogenic activity, i.e. they inhibit the action of androgens and can be used for the treatment of conditions such as hyperandrogenic acne. The compounds can be put into a composition for such administration, the concentration and / or dosage being based on the activity of the particular compound.
For the preparation of the compound of formula I, 17α-hydroxy-A-norprogesterone is subjected to the action of Colletotrichunt linicola, or to the action of its enzymes, under oxidizing conditions. This oxidation can be carried out most advantageously by including either 17α-hydroxy-A-norprogesterone in an aerobic culture of the microorganism, or by combining in an aqueous medium the compounds, air and enzymes of cells of the organism. microorganism that is not in the process of proliferation.
In general, the conditions for culturing the microorganism for the purpose of the present invention are (apart from the inclusion of 17α-hydroxy-A-norprogesterone) the same as those for growing various other microorganisms for the preparation of antibiotics, vitamin B1 and the like. The microorganism is grown under aerobic conditions in contact with a suitable fermentation medium (in or on it). A suitable medium essentially comprises a source of carbon and energy. The latter can be a carbohydrate, for example molasses, glucose, maltose, starch and dextrin, a fatty acid, a fat and / or the compound itself. Preferably, however, the medium includes a source of carbon and assimilable energy in addition to the steroid.
Among the fats which can be used for the purpose of the present invention are lard oil, soybean oil,
Linseed Oil, Cottonseed Oil, Peanut Oil, Coconut Oil, Corn Oil, Castor Oil, Sesame Oil, Oil palm, refined sheep tallow, whale oil, olive oil, tristearin, tripalmitin, triolein and trilaurin.
Among the fatty acids which can be used for the purposes of the present invention are stearic acid,
Palmitic acid, oleic acid, linoleic acid and myristic acid.
The source of the nitrogenous factors which can be used for the present invention can be organic (for example soybean meal, cornsteep liquor, yeast extract, meat extract and / or soluble products of soybean. distillery) or synthetic (that is, containing simple synthesizable inorganic or organic compounds, such as ammonium salts, alkali nitrates, amino acids or urea).
An adequate source of sterile air must be maintained during fermentation, for example by conventional methods of exposing a large area of the medium to air or by the use of submerged aerated culture.
The compound can be added to the culture during the incubation period, or included in the medium before sterilization or inoculation. The preferred (but not limiting) range of the concentration of the compound in the culture is about 0.01 6 / o to about 0.1 6 / o. The cultivation period (or rather the time during which the compound is subjected to the action of the enzyme) can vary greatly.
suddenly, a range between about 24 and 96 h is possible but not limiting. This microbial process makes it possible to obtain 15a, 17a-dihydroxy-A-norprogesterone which is a new compound of the present invention.
This compound 15,17a-dihydroxy is acylated for example
by treating it with an acyl halide or anhydride
acid of a hydrocarbyl-carboxylic acid having less
of 12 carbon atoms or a hydrocarbylsulphonic acid having less than 12 carbon atoms, pre-
sence of a basic catalyst, and an amonosulfonyloxyester is obtained. This ester is heated with a base such as collidine and the 17α-hydroxy-14dehydro-A-norprogesterone of formula I is obtained, which can be esterified by treatment with an acylating agent in the presence of a strong acid. to obtain the 17a-esters of formula II.
The following examples illustrate the invention (all temperatures are in o C).
Example 1:
15a, 17a-d ihyd roxy-A -norprogesterone
A) Fermentation
Surface growth from oblique culture of Colletotrichum linicola (NCTC-1194) is suspended on 15 day old agar, with oblique cultures containing nutrient medium (A)
Grams
glucose 10
yeast extract 2.5
K2HPO4 1
agar-agar 20
distilled water up to 1 liter in 5ml of an aqueous sodium lauryl sulfate solution at 0.01 / o. One ml portions of the suspension are used to inoculate 8 250 ml Erlenmeyer flasks, each containing 50 ml of the following sterilized medium B:
:
Grams
dextrose 10
cornsteep liquor 6 NH4H2PO4 3
yeast extract 2.5
CaCO3 2.5
distilled water up to 1 liter
After 72 h of incubation at 250 ° C. with continuous rotary stirring (280 cycles / min; stroke of 5 cm), transfers of 10 6 / o (vol / vol) are carried out in 34 Erlenmeyer flasks of 250 mi each containing 50 mi of freshly sterilized B medium. After a further 24 h of incubation, using the same conditions as described above, 300 micrograms per ml of steroid are added by adding to each vial 0.25 ml of a sterile solution (60 mg / ml) of 17ff-hydroxy -A-norpro-gestone in N, N-dimethylformamide.
We ferment
in total 510 mg.
After approximately 4 more hours of incubation, using the conditions described above, the contents of the vials are combined and the broth filtered through Seitz clarification buffer. The vials, mycelium and buffer are washed with successive 50 ml portions of hot water. The filtrate and the washing water
combined have a volume of 2000 ml.
B) Isolation
The filtrate obtained is extracted three times with chloroform
in stage A. The chioroform extracts are washed three times
ques with water, dry them over sodium sulfate and
evaporates them to dryness. The residue is crystallized from ac-
tone / isopropylether to obtain about 282 mg of 15 α, 17 α -dihydroxy-A-norprogesterone, which melts at 200,202.50 C.
The analytical sample is prepared by recrystallization from methanol / isopropyl ether; it melts at 206-2080C and has an [a] 2D = + 260 (EtOH); XKBr 2.89, 5.90 (sh.), 5.98 and 6.20; XEtOH 234 met (15,800); TMCl 9.20 (s, 18-Me), 8.82 (s, 19-Me), 7.70 (s, 21-Me), 6.02 (m, l5-H) and 4.27 (s , 3-H).
Anal. Calc. for C20H2804 (332.42): C 72.26; H 8.49
Found: C 72.42; H 8.52 15 α -mesyloxy-17 α -hydroxy-A-norprogesterone
A solution of 100 mg of 15a-17a-dihydroxy-A-norprogesterone in 2.5 ml of pyridine at 60 ° C. is treated with 0.15 ml of mesyl chloride and left at this temperature overnight. The reaction mixture is diluted with water and extracted with chloroform. The chloroform extracts are washed with 2N hydrochloric acid, an 8% salt solution, dried over sodium sulfate and evaporated to dryness. The residue is crystallized from acetone-hexane to give about 72 mg of 15 α -mesyloxy-17 α -hydroxy-A-norprogesterone which melts at 156-1570 C with decomposition.
The analytical sample is prepared by recrystallization from acetone / hexane; it melts at 157-1580 C with decomposition and has an XKBr 2.92, 5.88, 6.01, 6.20 and 8.56; XEtOH 233 mu (16,900); cDMsl 9.21 (s, 18-Me), 8.82 (s, 19-Me), 7.73 (s, 21-Me), 6.98 (s, 15a-mesylate), 5.03 (mW 1/2 20 Cps 15B-H) and 4.25 (s, 3-H).
Anal. calc. for C2tH3nO6S (410.54): S 7.81
Found: S 8.21 17 α -hydroxy-14-dehydro-A-norprogesterone
A solution of 100 mg of 15 α -mesyloxy-17 α -hydroxy-A-norprogesterone in 5 ml of collidine is refluxed for 0.5 h. The reaction mixture is diluted with chloroform and washed with 2N hydrochloric acid, 8% salt solution, dried over sodium sulfate and evaporated to dryness to give 17ahydroxy-14-dehydro-. A-norprogesterone.
This compound can be used as follows:
17a-acetoxy-14-dehydrn-A -norprogesterone
A solution of 0.0033 ml of perchloric acid in 0.3 ml of acetic anhydride is added to 500 mg of 17α-hydroxy-14-dehydro-A-norprogesterone in 10 ml of acetic anhydride. The reaction mixture is stirred at room temperature for 30 minutes then poured into a mixture of water and ice and extracted with chloroform. The chloroform extracts are washed with saturated sodium bicarbonate solution, 8% salt solution, dried over sodium sulfate and evaporated to dryness to obtain the desired 17 α-ester.