Verfahren zur Anreicherung von L-Asparaginase
L-Asparaginase in Form eines mehr oder weniger rohen Enzympräparates ist bekannt. Sie wurde nach gebäuchlichen Methoden der Enzymchemie aus tierischen oder pflanzlichen Materialien extrahiert und angereichert. Das Enzym spaltet die Amidbindung im L-Asparagin, wobei L-Asparaginsäure und Ammoniak entstehen. Man kann das Ammoniak mit Nesslers Reagens colorimetrisch bestimmen und hat dadurch eine Messmethode für L-Asparaginase [Cancer Research 26, 2213-17 (1966)].
Da die L-Asparaginase-Einheit noch nicht völlig übereinstimmend definiert worden ist, soll sie hier wie folgt festgelegt werden:
Eine Einheit (30-Minuteneinheit) L-Asparaginase ist diejenige Menge, die bei 370 C und bei pH 7,2 während 30 Minuten ein , Mol Ammoniak aus L-Asparagin abspaltet. Soweit aus der Literatur ersichtlich, sind bisher L-Asparaginase-Präparate beschrieben worden, welche maximal zirka 1000 E/mg enthalten [Biochemistry 6, 721(1967)].
Die Herstellung erfolgt u.a. aus E. coli-Zellen, aus denen man das Enzym durch Behandlung mit Ultraschall freisetzte und die rohen Lösungen mit Ammoniumsulfat partiell sättigte. Hiebei wird das Enzym ausgesalzen und kann dann durch in der Enzymchemie übliche Säulenchromatographie weiter angereichert werden. L-Asparaginase hat nach der Injektion eine Wirkung gegen solche Geschwülste, die zu ihrem Wachstum L-Asparagin benötigen. Sie wird in steigendem Masse klinisch angewendet, ohne dass es bisher möglich wäre, die hierfür erforderlichen Mengen zur Verfügung zu stellen [Proc. N.A.S. 56, 1516-19 1966)]. Sie hat zur Bekämpfung des malignen Wachstums in der Medizin grosse Bedeutung bekommen.
Es wurde nun gefunden, dass man L-Asparaginase anreichern bzw. kristallisierte L-Asparaginase gewinnen kann, wenn man gemäss der Erfindung vorzugsweise nach Abtrennnung der Pyrogene, die rohen wässrigen Lösungen der L-Asparaginase gegebenenfalls nach Zusatz von Harnstoff oder anderen Amiden, die Wasserstoffbrückenbindungen lösen, mit Polyalkylenglykol versetzt und die so gewonnenen L-Asparaginase enthaltenden Niederschläge isoliert und gegebenenfalls weiterreinigt.
Sofern man nur in den rohen wässerigen L-Aspara ginase-Lösungen mit Polyalkylenglykol Niederschläge erzeugt und die nach an sich bekannten Methoden zerlegt, geht man bei dem erfindungsgemässen Verfahren so vor, dass man die rohen Enzymlösungen, die 1 bis 30, vorzugsweise 1 bis 10%, L-Asparaginase enthalten, mit wässerigen Lösungen des Polyalkylenglykols, vorzugsweise von Polyäthylenglykol versetzt. Hiebei liegt die optimale Konzentration der Fällungslösung bei 40 bis 60% Äthylenglykol; es können jedoch auch Lösungen wesentlich niedrigerer Konzentration verwendet werden. Das optimale Molekulargewicht des verwendeten Polyäthylenglykols liegt zwischen 1000 und 5000.
Niedrigere und höhere Molekulargewichte sind weniger gut geeignet. Die genannten wässerigen Polyäthylenglykollösungen werden bis zu einer Endkonzentration von 15 bis 40%, vorzugsweise 18 bis 30%, zugesetzt.
Das sich bildende Sediment schleudert man ab, zur überstehenden klaren Lösung gibt man weitere Polyäthylenglykollösung, schleudert erneut ab und wiederholt diesen Vorgang beliebig oft. Einige der bei dieser Fraktionierung anfallenden Niederschläge enthalten überwiegend biologisch aktives Material neben geringen Mengen inerter Proteine. Die Reinigung der Niederschläge von anhaftendem Polyäthylengylkol kann so erfolgen, dass man sie in Wasser löst, die Lösung von unlöslichen Bestandteilen befreit und mit einem Überschuss Aceton fällt.
Hiebei flockt L-Asparaginase aus, während Polyäthylenglykol in Lösung bleibt. Es ist auch möglich, mit anderen Lösungsmitteln zu fällen, wie z. B. mit niederen Alkoholen. Andererseits kann man aus der Lösung des Niederschlages das Polyäthylenglykol auch mit solchen Lösungsmitteln, die das Enzym nicht denaturieren und die nicht mit Wasser mischbar sind, extrahieren, zum Beispiel mit Diisopropyläther. Weiterhin ist es möglich, aus dem gelösten Niederschlag das Polyäthylenglykol, das ein Molekulargewicht von 10000 nicht überschreiten soll. durch Dialyse zu entfernen und das Enzym durch Gefriertrocknung der nicht dialysablen Anteile zu gewinnen. Es ist auch möglich, den Niederschlag zu trocknen und dann mit Aceton oder anderen Lösungsmitteln zu extrahieren.
Zweckmässig führt man diese Operationen bei einer Temperatur. die zwischen 0 und + 400 C liegen kann, aus. Die Fällung des Enzyms aus den wässerigen Lösungen ist unabhängig vom pH-Wert. Man arbeitet zweckmässig in pH-Bereichen zwischen 4 und 10.
Auch andere Polyglykole, z. B. Polypropylenglykol, sind zur Durchführung des Verfahrens geeignet.
Von einer amerikanischen Arbeitsgruppe wurde im Jahre 1967 ein Verfahren zur teilweisen Fraktionierung von Serum bzw. Plasma mit Polyäthylenglykol beschrieben (Fed. Proc. 1967 s. 3218).
Die selektive Ausfällung eines bestimmten Enzyms wie z. B. der L-Asparaginase mit Polyäthylenglykollö- sungen ist bisher jedoch ohne Analogie in der Enzymchemie.
Den Vorteil des neuen Verfahrens gegenüber den bisher bekannten Methoden, z. B. der bekannten Fällung mit Ammonsulfat, zur Anreicherung von L-Asparaginase ist in den folgenden Punkten zu sehen:
1. Man kann praktisch beliebige Mengen Rohasparaginase einsetzen, ohne dabei die Ausbeuten zu ver schlechtem.
2. Man arbeitet in sehr konzentrierten wässerigen Lösungen. Dadurch kann das Enzym leicht durch Fällung mit Lösungsmitteln oder durch Gefriertrocknung in angereicherter Form gewonnen werden.
3. Man kann überschüssiges Polyäthylenglykol leicht mit Lösungsmitteln entfernen.
4. Das Verfahren stellt einen wesentlichen Schritt auf dem Wege zur Gewinnung kristallisierter Asparaginase dar.
Die beschriebene Methode führt in zwei Fällungsschritten von der Roh-Asparaginase mit zirka 3 bis 4 i.E./mg Substanz zu Produkten von einem Reinheitsgrad von 70 bis 80 i.E./mg Substanz.
Für die klinische Anwendung der L-Asparaginase ist es nun notwendig den praktisch erreichbaren Reinheitsgrad dem maximalen Wert anzunähern. Dabei muss das Verfahren zur Errreichung dieses Zieles auf technische Dimensionen übertragbar sein.
Es wurde nun weiters gefunden, dass man die Selektivität der Polyäthylenglykolfällung erheblich verbessern kann. wenn man zur L-Asparaginaselösung vor der Fällung Harnstoff oder andere Amide zusetzt, die Wasserstoffbrückenbindungen spalten.
Aus dieser Lösung wird die L-Asparaginase erst bei relativ hohen Konzentrationen von etwa 150 bis 200g Polyäthylenglykol/Liter Lösung ausgefällt, während die inerten Proteine und sonstige Verunreinigungen bei sehr viel niedrigeren, und zwar bei den gleichen Konzentrationen wie bei der Fällung aus harnstofffreier Lösung gefällt werden.
Zweckmässig führt man diese Operationen bei einer Temperatur. die zwischen - 4 und + 400 C liegen kann, aus. Die Fällung des Enzyms aus den wässerigen Lösungen ist im pH-Bereich von 6 bis 10 vom pH-Wert unabhängig.
Der im Sediment der Polyäthylenglykolfällung verbleibende Harnstoff kann z. B. durch Aufnahme des Sedimentes in Wasser und nachfolgende erneute Poly äthylenglykolfällung entfernt werden.
Anstelle von Harnstoff können auch andere Amide, die Wasserstoffbrückenbindungen lösen, z. B. Guanidin, Formamid, Acetamid und andere wasserlösliche Amide, verwendet werden. Über die deaggregierende Wirkung von Harnstoff und anderen Amiden auf Proteine wird an vielen Stellen berichtet [z. B. J. Biol. Chem. 123 (1938), Seite 543].
Der Vorteil des genannten zusätzlichen Verfahrensschrittes besteht in folgenden Punkten:
1. Man gelangt mit zwei Fällungsschritten zu einem Reinheitsgrad der L-Asparaginase, wie er im technischen Massstab bisher nicht möglich war.
2. Durch die lösungsvermittelnde Eigenschaft von z. B. Harnstoff kann in höher konzentrierten wässerigen L-Asparaginase-Lösungen gearbeitet werden, wodurch das technische Verfahren erheblich an Einfachheit gewinnt.
3. Die Ergebnisse einer Polyäthylenglykolfällung werden in Gegenwart von z. B. Harnstoff trotz wechselnder Beschaffenheit der Rohasparaginase besser reproduzierbar.
4. Das Verfahren stellt einen sehr wesentlichen Schritt auf dem Wege zur Gewinnung kristallisierter Asparaginase dar. Es gelingt mit den dafür üblichen Methoden der Proteinchemie, z. B. durch Fällung mit MgSO4, (NH4?3SOS, Aceton usw., das Enzym zur Kristallisation zu bringen.
Weiters wurde nun gefunden, dass man die Reinheit der L-Asparaginase noch mehr verbessern kann, wenn man das mittels Polyäthylenglykol-Fällung auf eine Aktivität von 100 bis 150 U/mg Protein vorgereinigte Enzym einer Fällung beim isoelektrischen Punkt des Enzyms unterwirft.
An seinem isoellektrischen Punkt von etwa pH 4,9 hat das Enzym eine geringere Löslichkeit als alle übrigen in der Lösung noch vorhandenen Proteine. Dies führt zur Ausflockung der L-Asparaginase, welche man durch Zugabe von geringen Mengen Polyäthylenglykol oder von wassermischbaren organischen Lösungsmitteln unterstützen kann. Zweckmässig führt man diese Operationen durch, indem man den pH-Wert auf etwa 4,9 bis 5,5 einstellt und die Fällung bei niedrigen Temperaturen vornimmt.
Der Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens gegenüber der erwähnten reinen oder modifizierten Poly äthylenglykol-Methode liegt in folgendem:
1. Man benötigt keine oder nur geringe Mengen an Fällungsmitteln.
2. Man gelangt ausgehend von einer spez. Aktivität der L-Asparaginase um 100 bis 150U/mg Protein zu einer spez. Aktivität bis zu 190 U/mg Protein.
3. Die Methode liefert das Ausgangsprodukt für die Kristallisation der L-Asparaginase.
Bei der Herstellung von L-Asparaginase-Präparaten z. B. aus E. coli nach Methoden, die von Campbell et. al.
[Biochemistry 6 (1967), Seite 721 bis 730, dort weitere Literatur] beschrieben worden sind, werden Pyrogene der Colizellen in das Endprodukt eingeschleppt.
Ebenso ist es möglich, dass während der Aufarbeitung. die zum grössten Teil im wässerigen Medium geschehen muss, Verunreinigungen in die L-Asparaginasepräparation gelangen, die pyrogen wirken. Trotz vieler Bemühungen ist es bisher nicht gelungen, pyrogenfreie L-Asparaginase zu erhalten. Auch die üblichen Methoden zur Entfernung der Pyrogene, wie die Filtration über Klärschichten, Adsorptionsmethoden mit Hydroxylapatit, Aluminiumhydroxyd, Silikaten, ferner mit Kunstharzen, führten zu keinem Erfolg. Selbst die Chromatographie an Dextrangelen ohne ionisierte Gruppen oder an Diäthylaminoäthyl-Cellulose nach Campbell war vergeblich.
Es wurde nun gefunden, dass man die Pyrogene aus rohen L-Asparaginasepräparaten mit Hilfe von Diäthylaminoäthyl-dextrangelen (DEAE-Dextrangel) entfernen kann, indem man das Enzym in Puffern niedriger Ionenstärke löst, die so erhaltene Lösung entweder nach der chromatographischen Methodik auf eine Säule des gequollenen und mit demselben Puffer äquilibrierten Dextrangels gibt und die L-Asparaginase durch steigende Salzkonzentration fraktioniert und eluiert oder sie nach der Batch-Methode mit dem Dextrangel versetzt, die Suspension filtriert oder zentrifugiert und das an das Gel gebundene Enzym mit geeigneten Puffern höherer Salzkonzentration eluiert.
Bei dem chromatographischen Verfahren löst man das rohe Enzympräparat in etwa 0,02 M-Puffern, vorzugsweise Ammoniumacetat- oder Formiat-Puffern, im neutralen oder leicht alkalischen Bereich, etwa pH 7 bis 8,5, auf, wobei die entstehende Lösung nicht zu konzentriert sein darf. Vorzugsweise werden 1- bis 2%ige Lösungen des Enzyms verwendet.
Das Dextrangel wird zuvor in demselben Puffer gequollen und durch mehrmaligen Wechsel des Puffers äquilibriert. Es wird hierauf in Chromatographiesäulen gefüllt, wobei das Verhältnis von Durchmesser zu Betthöhe 1: 3 bis 1: 30 beträgt. Die Enzymlösung wird auf die Säule gegeben, wobei die Durchlaufgeschwindigkeit 2 bis 4 ml/Stunde und pro cm2 Querschnitt der Säule beträgt. Die Elution wird mit steigendem Salzgehalt des Puffers durchgeführt, am besten mit einem linearen Gradienten; es ist jedoch ebenso möglich, die Konzentration des Elutionsmittels stufenweise zu erhöhen. Das Enzym wird von Acetationen bei Konzentrationen von 0,08 M und höher eluiert.
Die Reinigung lässt sich auch im Batch-Verfahren durchführen, indem man die Enzymlösung zu dem gequollenen DEAE-Dextrangel gibt und das pH auf 7,5 einstellt. Das Enzym wird hiebei von dem Gel absorbiert und kann nach gründlichem Auswaschen des Gels auf einer Nutsche oder mit Hilfe einer Zentrifuge von Salzlösungen geeigneter Konzentration eluiert werden. Der Vorteil dieses Verfahrens gegenüber dem Säulenverfahren ist, dass man einfach mit grossen Mengen arbeiten kann. Der Nachteil besteht in der weniger exakt möglichen Trennung von Begleitsubstanzen und der zur Elution nötigen grösseren Flüssigkeitsmenge.
Die Isolierung der L-Asparaginase aus der Lösung in fester Form kann nach bekannten Methoden, wie z. B. der Gefriertrocknung, gegebenenfalls nach Dialyse oder durch Fällung mit Polyäthylenglykol oder Aceton geschehen.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhält man, ausgehend von Präparaten mit etwa 20 bis 100U/mg Reinpräparate mit 180 bis 220U/mg Protein, die frei von pyrogenen Begleitstoffen sind. Diese Präparate sind zur Anwendung in der Chemotherapie geeignet.
Eine weitere Methode zu einer weitgehenden Befreiung der L-Asparaginase von Pyrogenen besteht darin, dass man die Enzymlösung, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,5 bis 15%, in Gegenwart einer Aminosäure, vorzugsweise Glycin, bei einem pH-Wert zwischen 7,0 und 9,2, vorzugsweise zwischen 8 und 9 auf 40 bis 610 C erhitzt, die Lösung von ausgefallenen Begleitstoffen befreit und anschliessend eine Fällung bei pH 4,5 bis 5,5 mit Polyäthylenglykol-Lösung durchgeführt.
Zur Durchführung dieses erfindungsgemässen Verfahrens wird zu den 0,5- bis 15%igen Lösungen der L-Asparaginase eine Aminosäure vorzugsweise Glycin, in Mengen von 1 bis 10% bei Temperaturen von -10 bis +650 C zugesetzt. Der pH-Wert dieser Lösung wird auf 8 bis 9 eingestellt. Zweckmässig wird die Lösung sodann bei +500 C über 1 bis 5 Tage gehalten. Die überstehende Lösung wird auf pH 5,2 eingestellt und mit Polyäthylenglykol gefällt. Das so erhaltene Material besteht aus angereicherter, pyrogenfreier bzw. pyrogenarmer L-Asparaginase.
Dieses Verfahren bietet folgende Vorteile:
1. Die Pyrogene lassen sich zuverlässiger als nach den bisher bekannten Methoden entfernen,
2. Gleichzeitig mit der Entfernung der Pyrogene wird die spezifische Aktivität des Enzyms L-Asparaginase erheblich erhöht.
Auch ein weiteres Verfahren zur Herstellung pyrogenfreier L-Asparaginase macht sich die Stabilisierungswirkung des Glycins zunutze, u.zw. wird bei diesem Verfahren das Enzym in Gegenwart einer Aminosäure, insbesonderen von Glycin, und eines niederen aliphatischen Alkohols, vorzugsweise Methanol, bei einem pH-Wert zwischen 7.0 und 9,2 auf 40 bis 610 C erhitzt, die Lösung von ausgefallenen Begleitstoffen befreit und anschliessend eine Fällung bei pH 4,5 bis 5,5 mit Poly äthylenglykol-Lösung durchgeführt. Ein Zusatz von 4 bis 40%, vorzugsweise 10%, eines niederen aliphatischen Alkohols, vorzugsweise Methanol, führt zu einer weitgehenden Denaturierung der Fremdproteine.
Dieses Verfahren bietet die Möglichkeit schwer zu entfernende inerte Begleitproteine der L-Asparaginase, welchen eine hohe antigene Wirkung zugeschrieben wird, zu beseitigen.
Zur Durchführung dieses erfindungsgemässen Verfahrens werden L-Asparaginasen. vorzugsweise solche, die mit Polyäthylenglycol bis zu einem Reinheitsgrad von etwa 160 bis 200U/mg gebracht worden sind, in eine 0.5- bis 15'70ige wässerige Lösung gebracht. Es werden z. B. 10 Vol.-% Methanol und etwa 3 Gew.-% Glycin hinzugegeben. Der pH-Wert wird auf 8 bis 9 eingestellt. Zweckmässig wird die Lösung dann bei +500 C über 1 bis 5 Tage gehalten. Die überstehende Lösung wird auf pH 5,2 eingestellt und mit Polyäthylenglykol gefällt. Das so erhaltene Material besteht aus angereicherter, pyrogenfreier bzw. pyrogenarmer L-Asparaginase.
Die als Ausgangsmaterial verwendete Roh-L-Asparaginase wird wie folgt gewonnen: 1 0%ige Maisquellwasserlösung (bezogen auf Trokkensubstanz) wird mit 2n Kalilauge auf pH 7,0 eingestellt, 20 Minuten auf 1200 C erhitzt und nach Abkühlung in der Überlaufzentrifuge geklärt. 30 Liter dieser klaren Maisquellwasserlösung werden mit 170 Liter Leitungswasser verdünnt. Nach Zusatz und Lösung von 1,20 kg Natriumlactat und 400 g Ammoniumsulfat wird die erhaltene Nährlösung in einem Fermenter 40 Minuten bei 1100 C sterilisiert, anschliessend abgekühlt und dann mit 500 cm3 einer 18 Stunden bei 300 C gewachsenen Scbüttelkultur von Escherichia coli ATCC 9637 in Nährbouillon beimpft. Der Fermentationsansatz wird bei 300 C mit 80 Liter Luft/min bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet.
Nach einer Wachstumszeit von 17 Stunden werden die Bakterien, welche L-Asparaginase enthalten, in der Überlaufzentrifuge abgetrennt und in 20 Liter destilliertem Wasser resuspendiert. In diese Suspension lässt man unter Rühren 80 Liter Aceton einlaufen, trennt die ausgeflockten Bakterien in der Überlaufzentrifuge ab und resuspendiert die Zellmasse wiederum im 20 Liter destilliertem Wasser. Zur Extraktion der L-Asparaginase aus den Bakterienzellen wird die Suspension 4,5 Stunden bei 300 C gerührt. Während dieser Zeit wird das pH durch Zusätze von In Natronlauge bei 7,5 bis 7,8 gehalten. Durch Abtrennung der extrahierten Bakterienzellen in der Überlaufzentrifuge erhält man zirka 17 Liter einer klaren Lösung, aus der man neben anderen Zellinhaltsstoffen die L-Asparaginase durch Zusatz von 68 Liter Aceton ausfällt.
Die entstandene Fällung wird isoliert, mit Aceton nachgewaschen und im Vakuum bei 25 bis 300 C getrocknet. Die so erhaltene Roh-L-Asparaginase hat eine enzymatische Aktivität von zirka 100 Einheiten (30-Minuteneinheiten) pro mg.
Das so erhaltene Ausgangsmaterial kann gegebenenfalls wie folgt vorgereinigt werden:
50 g Rohasparaginase mit einer Aktivität von 100 E/mg werden in 1000 ml m/15 Trispuffer vom pH 8,5 unter Rühren bei Raumtemperatur gelöst. Die Lösung wird in Anteilen von jeweils 100 ml im Wasserbad für 15 Minuten auf 59,50 C erwärmt, wobei eine starke Ausflockung von inaktiven Proteinen eintritt, während das Enzym unverändert in Lösung bleibt. Die vereinigten Denaturierungsansätze werden abgekühlt und bei 6000 min klargeschleudert. Die Lösung besitzt eine spezifische Aktivität von 200-300 E/mg Protein. Sie wird hier als Lösung A bezeichnet.
Lösung A kann in Anlehnung an die bekannte Fraktionierung von Enzymen mit Lösungsmitteln fBiochem. J. 48, 42-48 (1951)] mit Aceton fraktioniert werden, wobei die L-Asparaginase in dem Niederschlag, der beim Einstellen der Lösung von 30 auf 50% Aceton ausfällt, enthalten ist. Man gelangt auf diese Weise zu Präparaten mit zirka 500 E/mg.
Bei dem erfindungsgemässen Verfahren kann man entweder von einer Rohasparaginase mit zirka 100 E/mg ausgehen oder von einem angereicherten Präparat. Besonders zweckmässig als Ausgangsmaterial für die Fraktionierung mit Polyäthylenglykol hat sich Lösung A erwiesen oder die daraus durch Acetonfraktionierung zugängliche L-Asparaginase. Die Fraktioniergrenzen sind nicht konstant, da sie von der Art der Verunreinigungen abhängen. Es ist jedoch durch einen einfachen Vorverversuch möglich, diese Grenzen zu ermitteln.
Beispiele: Fällung mit Polyalkylenglykol:
Beispiel I
1000 ml Lösung A (gewonnen aus 50 g roher L-Asparaginase mit einer Aktivität von 112 E/mg) wurden auf 30 C gekühlt und mit 500 ml 50%iger Polyäthylenglykol lösung versetzt. Das Sediment wurde durch Zentrifugieren gewonnen.
Die anfallende L-Asparaginase erhielt die Bezeichnung Fraktion 1 . Aus der überstehenden Lösung von Fraktion 1(1468 ml) wurde mit 100ml 50%iger Poly- äthylenglykollösung weiteres Material ausgefällt und aufgearbeitet. Ausfällung = Fraktion 2. Die überstehende Lösung von Fraktion 2 (1550 ml) wurde erneut mit 100 ml Polyäthylenglykollösung versetzt und aufgearbeitet. Ausfällung = Fraktion 3. Auf analogem Wege wurde Fraktion 4 gewonnen. Die bei dieser Fraktionierung er zielten Reinheitsgrade und Ausbeuten gehen aus der folgenden Tabelle hervor:
Fraktions- Ausbeute % Einheiten,bezo
Nr. in g E/mg gen auf eingesetzte
Roh-Asparaginase
1 1,46 230 6
2 2,43 1050 43
3 1,40 1240 29
4 0,64 310 4
Beispiel 2
100 g Rohasparaginase mit 103 E/mg wurden in 2 Liter Wasser gelöst und durch Zentrifugieren geklärt.
Die Lösung wurde mit ln KOH auf pH 8,5 eingestellt und mit Polyäthylenglykollösung analog Beispiel 1 fraktioniert. Die dabei erhaltenen Fraktionen 2 und 3 wurden vereinigt. Ausbeute 12,0g. Einheiten/mg 765. Ausbeute bezogen auf eingesetzte Einheiten 88% d. Th.
Beispiel 3
Die vereinigten Sedimente der in Beispiel 2 gewonnenen Fraktionen 2 und 3 wurden in 400 ml Wasser gelöst und erneut einer Fraktionierung mit Polyäthylenglykollösung unterzogen. Die so erhaltenen Sedimente der Fraktion 2 und 3 wurden zweimal in trockenem, tiefgekühlten Aceton dispergiert, zentrifugiert, in Wasser gelöst, über eine Seitz-K3-Schicht filtriert und lyophilisiert.
Ausbeute 4,40 g; Einheiten/mg 1730; Ausbeute bezogen auf 100 g Roh-Asparaginase 74%.
Beispiel 4
5,0 g einer aus Lösung A durch Fraktionierung mit Aceton vorgereinigten L-Asparaginase mit 576 E/mg wurden in 100ml Wasser gelöst und mit Polyäthylenglykollösung, wie in Beispiel 1 beschrieben, fraktioniert.
Die bei dieser Fraktionierung erzielten Reinheitsgrade und Ausbeuten geben aus der folgenden Tabelle hervor: Fraktions- Ausbeute % Einheiten,bezo Nr. in g E/mg gen auf eingesetzte
Roh-Asparaginase
1 1,381 790 38
2 0,362 1930 24
3 0,155 640 3
4 1,00 180 6 Zusatz von Harnstoff oder anderen Amiden:
Beispiel 5
5 kg Roh-Asparaginase (hergestellt in der beschriebenen Weise) werden bei Zimmertemperatur in 40 Liter destilliertes Wasser eingetragen. Der pH-Wert der langsam entstehenden Lösung wird mit etwa 1,5 Litern ln NaOH auf 8,5 bis 8,9 eingestellt. Danach wird Harnstoff bis zu einer Konzentration von etwa 3 Mol/Liter dazugegeben. Die Temperatur der Lösung sinkt dabei um etwa 100 C. Es wird noch eine Stunde gerührt und die entstehende Lösung bei 40 C 16 bis 24 Stunden aufbewahrt.
Nach dieser Zeit wird Fraktion I durch Zugabe von 25 bis 30 Litern einer 50%igen Polyäthylenglykollösung gefällt. Fraktion I wird verworfen. Fraktion II wird durch Zugabe von weiteren 15 Litern 50%iger Polyäthylenglykollösung gefällt. Fraktion II enthält die Hauptaktivität. Durch Zugabe von weiteren 15 Litern der Polyäthylenglykollösung zu dem Überstand aus Fraktion II wird Fraktion III gewonnen, die etwa 20 bis 25% der angesetzten Asparaginase-Aktivität enthält.
Fraktion II wird in etwa 2,5 Liter destilliertes Wasser aufgenommen. Durch Zugabe von 250 ml einer 50%igen Polyäthylenglykollösung wird Fraktion Ia ausgefällt; durch weitere Zugabe von 250ml Polyäthylenglykollösung Fraktion IIa. In gleicher Weise werden Fraktion IIIa und IVa gewonnen. Die bei dieser Fraktionierung erzielten Reinheitsgrade und Ausbeuten gehen aus der folgenden Tabelle hervor: E/ )/o E/mg J/o der enzymatischen
Fraktions- Ausbeute E/mg Aktivitat, bezogen Nr. in g (1-Minuten- auf eingesetzte
Roh-Asparaginase
Ia 1,6 19,4 0,3
IIa 8,1 100,0 8,0
IIIa 23,0 144,0 31,2
IVa 16,2 74,0 11,5
Va 18,9 25,0 4,6
55,6
Beispiel 6
Es wird wie in Beispiel 5 verfahren, jedoch wird die Konzentration an Harnstoff auf etwa 6 Mol/Liter erhöht.
Die anschliessende Standzeit der Lösung beträgt dabei nur 2 Stunden. Die Ausbeuten sind mit denen aus Beispiel 5 weitgehend übereinstimmend.
Beispiel 7
Es wird wie in Beispiel 5 verfahren, jedoch wird anstelle von Harnstoff Guanidinhydrochlorid bis zu einer Konzentration von etwa 2 Mol/Liter zugegeben. Die Standzeit der Lösung beträgt 2 Stunden. Die Ausbeuten entsprechen denen aus Beispiel 5.
Fällung am isoelektrischen Punkt:
Beispiel 8
100g L-Asparaginase mit einer spez. Aktivität von etwa 100 U/mg Protein werden in 1000 cm3 destilliertem Wasser bei Zimmertemperatur gelöst. Während des Lösungsvorgangs wird der pH-Wert mit in NaOH auf 8,5 bis 8,9 eingestellt. Das dann verbleibende Unlösliche wird 10 Minuten bei 6000 um/min abzentrifugiert. Der pH-Wert des klaren Überstandes wird im Eisbad langsam auf pH 7 bis 6,8 gebracht. Ein sich dort abscheidendes öliges Sediment wird 25 Minuten bei 6000 um/min abzentrifugiert. Der klare Überstand dieser Zentrifugation wird mit 1n HCI auf pH 5,3 eingestellt. Danach werden stufenweise je 25 ml einer 50%igen Polyäthylenglykollösung hinzugegeben und jeweils bei 6000 um/min über 10 Minuten abzentrifugiert. Man erhält auf diese Weise etwa 5 bis 6 Fraktionen, wobei die Hauptaktivität mit der höchsten spez.
Aktivität in Fraktion 3 bis 5 enthalten ist. Ausbeute: 60 bis 70%.
Beispiel 9
Es wird wie in Beispiel 8 verfahren, jedoch wird anstelle von Polyäthylenglykol kaltes Aceton in 4 Schritten bis zu 20% des Lösungsvolumens hinzugegeben. Die Ausbeuten sind denen aus Beispiel 8 ähnlich.
Beispiel 10
Es wird wie in Beispiel 8 verfahren, jedoch wird anstelle von Polyäthylenglykol Äthylalkohol in 5 Schritten bis zu 20% des Lösungsvolumens hinzugegeben. Die Ausbeuten sind denen aus Beispiel 8 ähnlich.
Beispiel 11
100g L-Asparaginase mit einer spez. Aktivität von 140 U/mg Protein werden in 500 ml Wasser gelöst, der pH-Wert der Lösung wird mit in NaOH auf 8,5 eingestellt Ungelöst gebliebene Substanz wird bei 6000 um/min über 15 Minuten abzentrifugiert. Der pH-Wert der klaren Lösung wird bei 40 C und mit 1n HCI auf pH 6,8 eingestellt und der dabei auftretende Niederschlag abzentrifugiert. Der klare Überstand nach der Zentrifugation wird mit 1n HC1 langsam auf pH 5,0 bis 5,1 eingestellt und bei 40 C über mehrere Stunden belassen. Der danach aufgetretene Niederschlag wird abzentrifugiert.
Er enthält die L-Asparaginase mit einer Ausbeute von 60 bis 80% der eingesetzten Aktivität und mit einer maximalen spez. Aktivität bis zu 190 U/mg Protein.
Gewinnung von kristallisierter L-Asparaginase:
Beispiel 12
200 g Rohasparaginase mit einer Aktivität von 97 E/mg werden in 4000 ml Glykokollpuffer, pH 8,5 (Biochemisches Taschenbuch, Seite 91, 1964) gelöst und portionsweise 30 Minuten auf 600 C erhitzt. Hiebei flockt inaktives Protein aus, während das Enzym unver ändert in Lösung bleibt. Der Ansatz wird bei 6000 um/ min klargeschleudert und mit Aceton fraktioniert. Der bei Zugabe von 40 bis 45% Aceton ausfallende Anteil beträgt 16,4 g. Er enthält 863 E/mg.
9,3 g dieser angereicherten Asparaginase werden in 190 ml 3molarer Harnstofflösung gelöst, mit Natronlauge auf pH 8,5 eingestellt und mit Polyäthylenglykol (50%ige wässerige Lösung) fraktioniert. Die nach Zugabe von 22 bis 30ml anfallende Fraktion wird gewonnen und wie üblich aufgearbeitet. Ausbeute 2,1 g; E/mg: 3130.
Eine Lösung von 4,0 g dieser Probe in 40 ml bidestilliertem Wasser wird mit 1-n Salzsäure auf pH 5,2 eingestellt und mit Polyäthylenglykollösung fraktioniert. Der nach Zugabe von 12,5 bis 15 ml ausfallende Anteil wird nach 20minütigem Stehen bei Raumtemperatur abgeschleudert und nach zweistündigem Stehen unter Aceton mit weiterem Aceton gewaschen. Ausbeute: 1,2 g; E/mg: 6110.
Flache Prismen. Braunfärbung bei 2250 C, Sintern ab 2600 C, Schäumen ab 2700 C und vollständige Zersetzung ab 2740 C.
Die so erhaltenen Kristalle werden aus wässerigen Lösungen durch Zusatz organischer Lösungsmittel, wie Aceton oder Alkohol oder durch Zugabe von Polyäthylenglykol umkristallisiert.
Die Kristalle zeigen folgende Analysenergebnisse:
Wassergehalt: 12,5% (Die HO-Gehaltsbestimmung erfolgte durch 6stündiges Trocknen im Hockvakuum bei 1100 C in einer Spezial-Trockenpistole nach J. Unterzaucher [Mikrochem. 18, 315 (1935)]. Auf Gewichtskonstanz wurde durch fortgesetzte Trocknung geprüft.)
Glührückstand: 0,11% (Die Bestimmung des Aschegehaltes von Proteinen erfolgte nach F. Pregl und H. Roth [Quantitative organische Mikroanalyse, S. 174, Springer, Wien, (1949)]).
Proteingehalt: 88,0% Die Proteinbestimmung erfolgte nach Trichloressigsäurefällung nach der BIURET-Methode [T.E. Weiselbaum, Am. J. Clin. Path. (Techn. Sec.), 10, 40 (1946)]). Gesamtvolumen: 4 ml (davon 2 ml Biuret-Reagens): E l46emnS 12,3 = mg Protein/ml Testlösung.
Die Sedimentationskonstante zeigte einen Wert von S20 < = 4,33.
Fig. 1 zeigt das IR-Spektrum der kristallisierten L-Asparaginase, aufgenommen nach der KBr-Technik.
In Fig. 2 ist das UV-Spektrum des Präparates gezeigt. Messgerät: Zeiss Spektralphotometer PMQ II (Verstärkung l/1/I); Schichtdicke: 1 cm; Konzentration: jeweils 1 mg HG- und salzfr. Präparat pro ml.
Als Lösungsmittel diente ein pH 7-Phosphatpuffer (Merck Titrisol) Nr. 9887.
Fig. 3 ist eine Wiedergabe der Kristallaufnahme von L-Asparaginase.
Abtrennung der Pyrogene:
Beispiel 13
30 g DEAE-Dextrangel (Diäthylaminoäthyldextrangel = DEAE-Sephadex A 50 3, Handelsprodukt der Aktiebolaget Pharmacia, Uppsala, Schweden) wird in der üblichen Weise vorbehandelt, mit 0,02 M-Glycin, 0,02 M Ammoniumformiatpuffer pH 7,8 äquilibriert und in eine Säule mit 3,2 cm Durchmesser eingelüllt. Betthöhe: 90 cm. 500 mg rohe L-Asparaginase mit 100 U/mg werden in 50ml obigen Puffers gelöst und auf die Säule aufgetragen. Anschliessend wird das Enzym mit einem linearen Gradienten von 2 Litern des obigen Puffers zu 2 Litern 0,02 M-Glycin, 1 M-Ammoniumformiat pH 7,5 eluiert. Die asparaginasehaltigen Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Ausbeute: 1,03 g mit 27 800 U = 83% der eingesetzten Aktivität. Die spez.
Aktivität, auf Protein bezogen, beträgt 210 U/mg.
Pyrogentest am Kaninchen: 5 Kaninchen wurden 200 U/kg Tier gegeben. Der Mittelwert der Temperaturerhöhung betrug 0,480 C.
Die Ausgangs substanz zeigte unter gleichen Bedingungen eine Temperaturerhöhung um 1,60 C.
Beispiel 4
30 g DEAE-Dextrangel werden in der üblichen Weise vorbehandelt und mit 0,05 M-Ammoniumacetat pH 7,5 äquilibriert und in eine Säule mit 3,2 cm Durchmesser eingefüllt. Betthöhe 95 cm. 500 mg rohe L-Asparaginase mit 39,7 U/mg werden in 50 ml 0,05 M-Ammoniumacetat pH 7,5 gelöst und auf die Säule aufgetragen. Die Elution erfolgt mit einem linearen Gradienten von 2 Litern 0,05 M-Ammoniumacetat pH 7,5 zu 2 Litern 1 M -Ammoniumacetat pH 7,5. Die asparaginasehaltigen Fraktionen werden vereinigt. Ausbeute 18 600 U = 94% der eingesetzten Aktivität. Spezifische Aktivität: 200 U/mg Protein.
Pyrogentest am Kaninchen: Bei 300 U/mg Tier betrug der Mittelwert der Temperaturerhöhung 0,40 C.
Die Ausgangssubstanz zeigte bei 200 U/kg Tier eine Temperaturerhöhung um 1,60 C.
Zum Vergleich sei ein Reinigungsversuch mit Di äthylaminoäthyl-Cellulose angeführt:
30 g DEAE-Cellulose wurden mit 0,05 M-Ammoniumacetat pH 7,5 äquilibriert und in eine Säule eingefüllt. 500 mg rohe L-Asparaginase (34 U/mg) wurden in 50 ml des obigen Puffers gelöst, auf die Säule aufgetragen und mit einem linearen Gradienten von 1 Liter 0,05 Ammoniumacetat pH 7,5 zu 1 Liter 0,5 M-Ammoniumacetat pH 7,5 eluiert.
Ausbeute: 14000 U = 82% der Aktivität mit 89 U/mg Protein.
Pyrogentest am Kaninchen: Bei 200U/kg Tier betrug der Mittelwert der Temperaturerhöhung 1,00 C.
Die Ausgangssubstanz zeigte unter gleichen Bedingungen eine Temperaturerhöhung um 1,80 C.
Auch andere Versuchsbedingungen erbrachten keine weitergehende Entfernung der Pyrogene, woraus die Überlegenheit des erfindungsgemässen Verfahrens klar hervorgeht.
Beispiel 15
490g DEAE-Dextrangel wurden wie üblich vorbehandelt und mit 0,05 M-Ammoniumacetat pH 7,5 äquilibriert, dem Merthiolat in einer Konzentration von 20 mg/Liter zugesetzt war. Die Suspension wurde in eine auf 40 C gekühlte Säule mit dem Durchmesser von 20 cm gegeben. Betthöhe: 65 cm. 9,8 g einer Rohasparaginase mit 45 U/mg wurden in 880ml 0,02 M-Ammoniumacetat pH 7,5 gelöst und auf die Säule gegeben.
Elution mit linearem Gradienten von 10 Litern 0,05 M Ammoniumacetat pH 7,5 zu 10 Litern 0,5 M-Ammoniumacetat pH 7,5. Die asparaginasehaltigen Fraktionen wurden vereinigt. Ausbeute: 365 000 U = 81% der eingesetzten Menge.
Spezifischer Pyrogentest am Kaninchen: Bei 200 U/kg Tier betrug der Mittelwert der Temperaturerhöhung 0,330 C.
Die Ausgangssubstanz zeigte unter gleichen Bedingungen eine Temperaturerhöhung um 1,80 C.
Beispiel 16
Zu 10g DEAE-Dextrangel, äquilibriert in 0,05 M Ammoniumacetat-Lösung pH 7,5, wird eine Lösung von 100 mg L-Asparaginase mit 39,7 U/mg in 100 ml 0,05 M Ammoniumacetat-Lösung pH 7,5 gegeben. Der Ansatz wird 15 Minuten gerührt und dann abgesaugt. Der Rückstand wird nacheinander mit Puffern verschiedener Ionenstärke eluiert (s. Tabelle). Die bei niedriger Ionenstärke bereits eluierten L-Asparaginaseanteile sind pyrogenhaltig, während die mit stärkeren Puffern eluierten Anteile pyrogenfrei sind. Die Ausbeuten sind aus der Tabelle zu ersehen.
Akti- Aus- Pyro Puffer vität beute gität
U C/c T!Tier (,C) 0,05 M-Ammoniumacetat pH 7,5 5010 24 1,1 0,10 M-Ammoniumacetat pH 7,5 3820 18 1,2 0,20 M-Ammoniumacetat pH 7,5 7850 37 0,9 0,40 M-Ammoniumacetat pH 7,5 4060 19 0,3 0,80 M-Ammoniumacetat pH 7,5 520 2 0,3
Beispiel 17
100g Asparaginase mit einer spezifischen Aktivität von 100 U/mg werden in einem Liter Wasser gelöst. Es werden etwa 40 g Glycin hinzugegeben und die Lösung auf pH 8,9 eingestellt. Die Lösung wird 90 Stunden bei +500 C gehalten, das danach ausgefällte Protein bei 6000 U/Minute 20 Minuten zentrifugiert. Das klare Zentrifugat wird mit 2n HCI auf pH 5,2 eingestellt und mit 50% iger Polyäthylenglykol-Lösung fraktioniert gefällt.
Der nach Zugabe von etwa 200 ml Polyäthylenglykol ausfallende Anteil wird abgeschleudert, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Ausbeute: etwa 35 g mit 200 bis 220 U/mg Substanz. Aus der Fig. 4 geht der minimale Pyrogengehalt des Produktes hervor.
Beispiel 18
Es wird wie in Beispiel 17 verfahren, jedoch wird die Lösung der L-Asparaginase 24 Stunden auf 600 C erhitzt.
Beispiel 19
Es wird wie in Beispiel 17 verfahren, der pH-Wert der Lösung jedoch auf etwa 8,2 eingestellt.
Beispiel 20
Es wird wie in Beispiel 18 verfahren, jedoch werden nur 20 g Glycin zu der Lösung der L-Asparaginase gegeben.
Beispiel 21
100g L-Asparaginase mit einer spez. Aktivität von
100 U/mg werden in einem Liter Wasser gelöst. Es werden 100 m Methanol und 40 g Glycin hinzugegeben und die Lösung auf pH 8,9 eingestellt. Die Lösung wird 90 Stunden bei +500 C gehalten, das danach ausgefällte Protein bei 6000 U/Min. 20 Minuten zentrifugiert. Das klare Zentrifugat wird mit 2n HCI auf pH 5,2 eingestellt und mit 50%iger Polyäthylenglykol-Lösung fraktioniert gefällt. Der nach Zugabe von etwa 200 ml Polyäthylenglykol ausfallende Anteil wird abgeschleudert, mit Ace ton gewaschen und getrocknet. Ausbeute: etwa 33 g mit
200 bis 235 U/mg Substanz.
Beispiel 22
Es wird wie in Beispiel 21 verfahren, jedoch werden 200 ml Methanol zugesetzt.
Beispiel 23
Es wird wie in Beispiel 21 verfahren, jedoch werden der Lösung 100 ml Äthanol zugesetzt.
Method for the enrichment of L-asparaginase
L-asparaginase in the form of a more or less crude enzyme preparation is known. It was extracted and enriched from animal or vegetable materials using conventional enzyme chemistry methods. The enzyme cleaves the amide bond in L-asparagine, producing L-aspartic acid and ammonia. The ammonia can be determined colorimetrically with Nessler's reagent and thereby has a measuring method for L-asparaginase [Cancer Research 26, 2213-17 (1966)].
Since the L-asparaginase unit has not yet been fully defined, it should be defined here as follows:
One unit (30-minute unit) of L-asparaginase is that amount which splits off one mol of ammonia from L-asparagine over 30 minutes at 370 ° C. and at pH 7.2. As far as can be seen from the literature, L-asparaginase preparations have so far been described which contain a maximum of approximately 1000 U / mg [Biochemistry 6, 721 (1967)].
The production takes place i.a. from E. coli cells, from which the enzyme was released by treatment with ultrasound and the crude solutions were partially saturated with ammonium sulfate. The enzyme is salted out and can then be further enriched by column chromatography, which is common in enzyme chemistry. L-asparaginase has an effect after the injection against those tumors that need L-asparagine to grow. It is used clinically to an increasing extent, without it being possible to date to provide the quantities required for this [Proc. N.A.S. 56, 1516-19 1966)]. It has become of great importance in medicine for combating malignant growth.
It has now been found that L-asparaginase can be enriched or crystallized L-asparaginase can be obtained if, according to the invention, preferably after separation of the pyrogens, the crude aqueous solutions of L-asparaginase, optionally after addition of urea or other amides, form the hydrogen bonds dissolve, mixed with polyalkylene glycol and the precipitates containing L-asparaginase obtained in this way are isolated and optionally further purified.
If one generates precipitates only in the crude aqueous L-asparaginase solutions with polyalkylene glycol and breaks them down according to methods known per se, the method according to the invention is such that the crude enzyme solutions containing 1 to 30, preferably 1 to 10 %, L-asparaginase, mixed with aqueous solutions of polyalkylene glycol, preferably polyethylene glycol. The optimal concentration of the precipitation solution is 40 to 60% ethylene glycol; however, solutions of much lower concentration can also be used. The optimal molecular weight of the polyethylene glycol used is between 1000 and 5000.
Lower and higher molecular weights are less suitable. The aforementioned aqueous polyethylene glycol solutions are added up to a final concentration of 15 to 40%, preferably 18 to 30%.
The sediment that forms is thrown off, further polyethylene glycol solution is added to the clear solution that remains, is thrown off again and this process is repeated as often as desired. Some of the precipitates resulting from this fractionation mainly contain biologically active material in addition to small amounts of inert proteins. The precipitates can be cleaned of adhering polyethylene glycol by dissolving them in water, removing insoluble constituents from the solution and precipitating with an excess of acetone.
L-asparaginase flocculates, while polyethylene glycol remains in solution. It is also possible to precipitate with other solvents, such as. B. with lower alcohols. On the other hand, the polyethylene glycol can also be extracted from the solution of the precipitate with solvents which do not denature the enzyme and which are not miscible with water, for example with diisopropyl ether. It is also possible to remove the polyethylene glycol from the dissolved precipitate, which should not exceed a molecular weight of 10,000. to be removed by dialysis and the enzyme to be obtained by freeze-drying the non-dialysable components. It is also possible to dry the precipitate and then extract it with acetone or other solvents.
These operations are expediently carried out at one temperature. which can be between 0 and + 400 C. The precipitation of the enzyme from the aqueous solutions is independent of the pH value. It is advisable to work in pH ranges between 4 and 10.
Other polyglycols, e.g. B. polypropylene glycol, are suitable for performing the method.
In 1967, an American working group described a process for the partial fractionation of serum or plasma with polyethylene glycol (Fed. Proc. 1967 p. 3218).
The selective precipitation of a particular enzyme such as B. L-asparaginase with polyethylene glycol solutions is so far without analogy in enzyme chemistry.
The advantage of the new method over the previously known methods such. B. the known precipitation with ammonium sulfate, for the enrichment of L-asparaginase can be seen in the following points:
1. You can use practically any amount of crude asparaginase without ver deteriorating the yields.
2. One works in very concentrated aqueous solutions. As a result, the enzyme can easily be obtained in enriched form by precipitation with solvents or by freeze-drying.
3. You can easily remove excess polyethylene glycol with solvents.
4. The process is an essential step on the way to obtaining crystallized asparaginase.
The method described leads in two precipitation steps from the crude asparaginase with about 3 to 4 IU / mg substance to products with a purity of 70 to 80 IU / mg substance.
For the clinical use of L-asparaginase it is now necessary to approximate the practically achievable degree of purity to the maximum value. The process for achieving this goal must be transferable to technical dimensions.
It has now also been found that the selectivity of the polyethylene glycol precipitation can be improved considerably. if urea or other amides are added to the L-asparaginase solution before precipitation, which break the hydrogen bonds.
The L-asparaginase is only precipitated from this solution at relatively high concentrations of about 150 to 200 g polyethylene glycol / liter of solution, while the inert proteins and other impurities are precipitated at much lower concentrations, namely at the same concentrations as when precipitating from urea-free solution will.
These operations are expediently carried out at one temperature. which can be between - 4 and + 400 C. The precipitation of the enzyme from the aqueous solutions is independent of the pH in the pH range from 6 to 10.
The remaining in the sediment of the polyethylene glycol precipitation urea can, for. B. can be removed by taking up the sediment in water and subsequent renewed poly ethylene glycol precipitation.
Instead of urea, other amides that break hydrogen bonds, e.g. B. guanidine, formamide, acetamide and other water-soluble amides can be used. The deaggregating effect of urea and other amides on proteins is reported in many places [e.g. B. J. Biol. Chem. 123: 543 (1938)].
The advantage of the mentioned additional process step consists in the following points:
1. Two precipitation steps lead to a degree of purity of L-asparaginase that was previously not possible on an industrial scale.
2. Due to the solubilizing property of z. B. Urea can be worked in more concentrated aqueous L-asparaginase solutions, which makes the technical process considerably simpler.
3. The results of a polyethylene glycol precipitation are in the presence of z. B. Urea is more reproducible despite the changing nature of the raw asparaginase.
4. The process represents a very important step on the way to obtaining crystallized asparaginase. It is possible with the usual methods of protein chemistry, e.g. B. by precipitation with MgSO4, (NH4? 3SOS, acetone etc. to bring the enzyme to crystallization.
Furthermore, it has now been found that the purity of L-asparaginase can be improved even more if the enzyme, which has been pre-purified by means of polyethylene glycol precipitation to an activity of 100 to 150 U / mg protein, is subjected to precipitation at the isoelectric point of the enzyme.
At its isoelectric point of around pH 4.9, the enzyme has a lower solubility than all other proteins still present in the solution. This leads to the flocculation of L-asparaginase, which can be supported by adding small amounts of polyethylene glycol or water-miscible organic solvents. These operations are expediently carried out by adjusting the pH to about 4.9 to 5.5 and carrying out the precipitation at low temperatures.
The advantage of the process according to the invention over the aforementioned pure or modified polyethylene glycol method is as follows:
1. No or only small amounts of precipitants are required.
2. Starting from a spec. Activity of L-asparaginase around 100 to 150U / mg protein to a spec. Activity up to 190 U / mg protein.
3. The method provides the starting material for the crystallization of L-asparaginase.
In the manufacture of L-asparaginase preparations e.g. B. from E. coli using methods described by Campbell et. al.
[Biochemistry 6 (1967), pages 721 to 730, there further literature] have been described, pyrogens of the colic cells are introduced into the end product.
It is also possible that during work-up. which has to take place for the most part in an aqueous medium, impurities get into the L-asparaginase preparation, which have a pyrogenic effect. Despite many efforts, it has not yet been possible to obtain pyrogen-free L-asparaginase. The usual methods of removing the pyrogens, such as filtration through clarifying layers, adsorption methods with hydroxyapatite, aluminum hydroxide, silicates, and also with synthetic resins, were unsuccessful. Even chromatography on dextran gels without ionized groups or on diethylaminoethyl cellulose according to Campbell was in vain.
It has now been found that the pyrogens can be removed from crude L-asparaginase preparations with the help of diethylaminoethyl-dextran gels (DEAE-dextran gels) by dissolving the enzyme in buffers of low ionic strength, and the solution obtained in this way either by the chromatographic method on a column of the swollen dextran gel equilibrated with the same buffer and the L-asparaginase is fractionated and eluted by increasing salt concentration or it is mixed with the dextran gel according to the batch method, the suspension is filtered or centrifuged and the enzyme bound to the gel is eluted with suitable buffers of higher salt concentration .
In the chromatographic process, the crude enzyme preparation is dissolved in about 0.02 M buffers, preferably ammonium acetate or formate buffers, in the neutral or slightly alkaline range, about pH 7 to 8.5, the resulting solution not being too concentrated may be. Preferably 1 to 2% solutions of the enzyme are used.
The dextran gel is previously swollen in the same buffer and equilibrated by changing the buffer several times. It is then filled into chromatography columns, the ratio of diameter to bed height being 1: 3 to 1:30. The enzyme solution is added to the column, the flow rate being 2 to 4 ml / hour and per cm2 of cross section of the column. The elution is carried out with increasing salt content of the buffer, preferably with a linear gradient; however, it is also possible to gradually increase the concentration of the eluent. The enzyme is eluted from acetate ions at concentrations of 0.08 M and higher.
The cleaning can also be carried out in a batch process by adding the enzyme solution to the swollen DEAE dextran gel and adjusting the pH to 7.5. The enzyme is absorbed by the gel and can be eluted after thorough washing of the gel on a suction filter or with the aid of a centrifuge from salt solutions of suitable concentration. The advantage of this method over the column method is that you can easily work with large quantities. The disadvantage is the less precise possible separation of accompanying substances and the larger amount of liquid required for elution.
The isolation of L-asparaginase from the solution in solid form can be carried out by known methods, such as. B. the freeze-drying, optionally after dialysis or by precipitation with polyethylene glycol or acetone.
According to the process according to the invention, starting from preparations with about 20 to 100U / mg pure preparations with 180 to 220U / mg protein, which are free of pyrogenic accompanying substances, are obtained. These preparations are suitable for use in chemotherapy.
Another method for the extensive liberation of L-asparaginase from pyrogens consists in that the enzyme solution, preferably in a concentration of 0.5 to 15%, in the presence of an amino acid, preferably glycine, at a pH between 7.0 and 9.2, preferably between 8 and 9, heated to 40 to 610 C, the solution freed from precipitated accompanying substances and then a precipitation carried out at pH 4.5 to 5.5 with polyethylene glycol solution.
To carry out this process according to the invention, an amino acid, preferably glycine, is added to the 0.5 to 15% solutions of L-asparaginase, in amounts of 1 to 10% at temperatures from -10 to +650.degree. The pH of this solution is adjusted to 8 to 9. The solution is then expediently kept at +500 C for 1 to 5 days. The supernatant solution is adjusted to pH 5.2 and precipitated with polyethylene glycol. The material obtained in this way consists of enriched, pyrogen-free or low-pyrogen L-asparaginase.
This procedure offers the following advantages:
1. The pyrogens can be removed more reliably than by the previously known methods,
2. Simultaneously with the removal of the pyrogens, the specific activity of the enzyme L-asparaginase is increased considerably.
Another method for producing pyrogen-free L-asparaginase makes use of the stabilizing effect of glycine, u.zw. In this process, the enzyme is heated in the presence of an amino acid, in particular glycine, and a lower aliphatic alcohol, preferably methanol, at a pH between 7.0 and 9.2 to 40 to 610 ° C., the solution is freed from precipitated accompanying substances and then a precipitation carried out at pH 4.5 to 5.5 with poly ethylene glycol solution. An addition of 4 to 40%, preferably 10%, of a lower aliphatic alcohol, preferably methanol, leads to extensive denaturation of the foreign proteins.
This method offers the possibility of eliminating inert accompanying proteins of L-asparaginase which are difficult to remove and which are ascribed a high antigenic effect.
To carry out this process according to the invention, L-asparaginases. preferably those which have been brought to a degree of purity of about 160 to 200U / mg with polyethylene glycol, brought into a 0.5- to 15.70 aqueous solution. There are z. B. 10 vol .-% methanol and about 3 wt .-% glycine added. The pH is adjusted to 8 to 9. The solution is then expediently kept at +500 C for 1 to 5 days. The supernatant solution is adjusted to pH 5.2 and precipitated with polyethylene glycol. The material obtained in this way consists of enriched, pyrogen-free or low-pyrogen L-asparaginase.
The raw L-asparaginase used as starting material is obtained as follows: 10% strength corn steep water solution (based on dry substance) is adjusted to pH 7.0 with 2N potassium hydroxide solution, heated to 1200 ° C. for 20 minutes and, after cooling, clarified in the overflow centrifuge. 30 liters of this clear corn steep water solution are diluted with 170 liters of tap water. After adding and dissolving 1.20 kg of sodium lactate and 400 g of ammonium sulfate, the nutrient solution obtained is sterilized in a fermenter for 40 minutes at 1100 C, then cooled and then mixed with 500 cm3 of a shake culture of Escherichia coli ATCC 9637 in nutrient broth that has grown for 18 hours at 300 C inoculates. The fermentation batch is aerated at 300 ° C. with 80 liters of air / min at 150 revolutions of the stirrer per minute.
After a growth time of 17 hours, the bacteria which contain L-asparaginase are separated off in the overflow centrifuge and resuspended in 20 liters of distilled water. 80 liters of acetone are run into this suspension with stirring, the flocculated bacteria are separated off in the overflow centrifuge and the cell mass is again resuspended in 20 liters of distilled water. The suspension is stirred at 300 ° C. for 4.5 hours to extract the L-asparaginase from the bacterial cells. During this time, the pH is kept at 7.5 to 7.8 by adding 1N sodium hydroxide solution. By separating the extracted bacterial cells in the overflow centrifuge, about 17 liters of a clear solution are obtained, from which L-asparaginase, along with other cell constituents, is precipitated by adding 68 liters of acetone.
The resulting precipitate is isolated, washed with acetone and dried at 25 to 300 ° C. in vacuo. The crude L-asparaginase thus obtained has an enzymatic activity of about 100 units (30-minute units) per mg.
The raw material obtained in this way can optionally be pre-cleaned as follows:
50 g of crude asparaginase with an activity of 100 U / mg are dissolved in 1000 ml of m / 15 Tris buffer with a pH of 8.5 with stirring at room temperature. The solution is heated in portions of 100 ml each in a water bath to 59.50 ° C. for 15 minutes, with strong flocculation of inactive proteins, while the enzyme remains unchanged in the solution. The combined denaturation batches are cooled and centrifuged clear at 6000 min. The solution has a specific activity of 200-300 U / mg protein. It is referred to here as solution A.
Solution A can be based on the known fractionation of enzymes with solvents fBiochem. J. 48, 42-48 (1951)] are fractionated with acetone, the L-asparaginase being contained in the precipitate which precipitates when the solution is adjusted from 30 to 50% acetone. In this way, preparations with around 500 U / mg are obtained.
In the method according to the invention, one can either start from a raw asparaginase with about 100 U / mg or from an enriched preparation. Solution A or the L-asparaginase accessible therefrom by acetone fractionation has proven to be particularly useful as a starting material for fractionation with polyethylene glycol. The fractionation limits are not constant as they depend on the type of impurities. However, it is possible to determine these limits with a simple preliminary experiment.
Examples: Precipitation with polyalkylene glycol:
Example I.
1000 ml of solution A (obtained from 50 g of crude L-asparaginase with an activity of 112 U / mg) were cooled to 30 ° C. and 500 ml of 50% strength polyethylene glycol solution were added. The sediment was collected by centrifugation.
The resulting L-asparaginase was designated fraction 1. Further material was precipitated and worked up from the supernatant solution of fraction 1 (1468 ml) with 100 ml of 50% strength polyethylene glycol solution. Precipitation = fraction 2. The supernatant solution from fraction 2 (1550 ml) was again admixed with 100 ml of polyethylene glycol solution and worked up. Precipitation = fraction 3. Fraction 4 was obtained in an analogous way. The degrees of purity and yields achieved in this fractionation are shown in the following table:
Fractional yield% units, based
No. in g U / mg gene on used
Raw asparaginase
1 1.46 230 6
2 2.43 1050 43
3 1.40 1240 29
4 0.64 310 4
Example 2
100 g of crude asparaginase at 103 U / mg was dissolved in 2 liters of water and clarified by centrifugation.
The solution was adjusted to pH 8.5 with 1N KOH and fractionated as in Example 1 with polyethylene glycol solution. The fractions 2 and 3 obtained in this way were combined. Yield 12.0g. Units / mg 765. Yield based on units used 88% of theory. Th.
Example 3
The combined sediments of fractions 2 and 3 obtained in Example 2 were dissolved in 400 ml of water and subjected again to fractionation with polyethylene glycol solution. The sediments of fraction 2 and 3 obtained in this way were dispersed twice in dry, frozen acetone, centrifuged, dissolved in water, filtered through a Seitz K3 layer and lyophilized.
Yield 4.40 g; Units / mg 1730; Yield based on 100 g of crude asparaginase 74%.
Example 4
5.0 g of an L-asparaginase with 576 U / mg, prepurified from solution A by fractionation with acetone, were dissolved in 100 ml of water and fractionated with polyethylene glycol solution as described in Example 1.
The degrees of purity and yields achieved in this fractionation are shown in the following table: Fractional yield% units, based on No. in g U / mg gen on used
Raw asparaginase
1 1.381 790 38
2 0.362 1930 24
3 0.155 640 3
4 1.00 180 6 Addition of urea or other amides:
Example 5
5 kg of crude asparaginase (prepared in the manner described) are introduced into 40 liters of distilled water at room temperature. The pH of the slowly developing solution is adjusted to 8.5 to 8.9 with about 1.5 liters of NaOH. Urea is then added to a concentration of about 3 mol / liter. The temperature of the solution drops by about 100 ° C. The mixture is stirred for a further hour and the resulting solution is stored at 40 ° C. for 16 to 24 hours.
After this time fraction I is precipitated by adding 25 to 30 liters of a 50% polyethylene glycol solution. Fraction I is discarded. Fraction II is precipitated by adding a further 15 liters of 50% polyethylene glycol solution. Fraction II contains the main activity. By adding a further 15 liters of the polyethylene glycol solution to the supernatant from fraction II, fraction III is obtained, which contains about 20 to 25% of the asparaginase activity.
Fraction II is taken up in about 2.5 liters of distilled water. Fraction Ia is precipitated by adding 250 ml of a 50% strength polyethylene glycol solution; by further addition of 250ml polyethylene glycol solution fraction IIa. Fractions IIIa and IVa are obtained in the same way. The degrees of purity and yields achieved in this fractionation are shown in the following table: E /) / o E / mg J / o of the enzymatic
Fractional yield E / mg of activity, based on number in g (1-minute to used
Raw asparaginase
Ia 1.6 19.4 0.3
IIa 8.1 100.0 8.0
IIIa 23.0 144.0 31.2
IVa 16.2 74.0 11.5
Va 18.9 25.0 4.6
55.6
Example 6
The procedure is as in Example 5, but the concentration of urea is increased to about 6 mol / liter.
The solution then stands for only 2 hours. The yields are largely identical to those from Example 5.
Example 7
The procedure is as in Example 5, but instead of urea guanidine hydrochloride is added up to a concentration of about 2 mol / liter. The solution can stand for 2 hours. The yields correspond to those from Example 5.
Precipitation at the isoelectric point:
Example 8
100g L-asparaginase with a spec. Activity of about 100 U / mg protein are dissolved in 1000 cm3 of distilled water at room temperature. During the dissolution process, the pH is adjusted to 8.5 to 8.9 with in NaOH. The insolubles then remaining are centrifuged off at 6000 μm / min for 10 minutes. The pH of the clear supernatant is slowly brought to pH 7 to 6.8 in an ice bath. An oily sediment which separates there is centrifuged off at 6000 μm / min for 25 minutes. The clear supernatant from this centrifugation is adjusted to pH 5.3 with 1N HCl. Thereafter, 25 ml of a 50% strength polyethylene glycol solution are added in stages and the mixture is centrifuged off at 6000 μm / min for 10 minutes. In this way, about 5 to 6 fractions are obtained, the main activity with the highest spec.
Activity in fraction 3 to 5 is included. Yield: 60 to 70%.
Example 9
The procedure is as in Example 8, but instead of polyethylene glycol, cold acetone is added in 4 steps up to 20% of the solution volume. The yields are similar to those from Example 8.
Example 10
The procedure is as in Example 8, but instead of polyethylene glycol, ethyl alcohol is added in 5 steps up to 20% of the solution volume. The yields are similar to those from Example 8.
Example 11
100g L-asparaginase with a spec. Activity of 140 U / mg protein are dissolved in 500 ml of water, the pH of the solution is adjusted to 8.5 with NaOH. Substance which has remained undissolved is centrifuged off at 6000 μm / min for 15 minutes. The pH of the clear solution is adjusted to pH 6.8 at 40 ° C. and with 1N HCl and the precipitate which occurs is centrifuged off. The clear supernatant after centrifugation is slowly adjusted to pH 5.0 to 5.1 with 1N HCl and left at 40 ° C. for several hours. The precipitate that has then occurred is centrifuged off.
It contains L-asparaginase with a yield of 60 to 80% of the activity used and with a maximum spec. Activity up to 190 U / mg protein.
Obtaining crystallized L-asparaginase:
Example 12
200 g of crude asparaginase with an activity of 97 U / mg are dissolved in 4000 ml of glycocolla buffer, pH 8.5 (Biochemisches Taschenbuch, page 91, 1964) and heated in portions to 600 ° C. for 30 minutes. Inactive protein flocculates while the enzyme remains unchanged in solution. The batch is centrifuged clear at 6000 μm / min and fractionated with acetone. The fraction that precipitates when 40 to 45% acetone is added is 16.4 g. It contains 863 U / mg.
9.3 g of this enriched asparaginase are dissolved in 190 ml of 3 molar urea solution, adjusted to pH 8.5 with sodium hydroxide solution and fractionated with polyethylene glycol (50% aqueous solution). The fraction obtained after adding 22 to 30 ml is recovered and worked up as usual. Yield 2.1 g; U / mg: 3130.
A solution of 4.0 g of this sample in 40 ml of double-distilled water is adjusted to pH 5.2 with 1N hydrochloric acid and fractionated with polyethylene glycol solution. The portion which precipitates out after the addition of 12.5 to 15 ml is spun off after standing for 20 minutes at room temperature and, after standing for two hours under acetone, washed with more acetone. Yield: 1.2 g; U / mg: 6110.
Flat prisms. Brown coloring at 2250 C, sintering from 2600 C, foaming from 2700 C and complete decomposition from 2740 C.
The crystals thus obtained are recrystallized from aqueous solutions by adding organic solvents such as acetone or alcohol or by adding polyethylene glycol.
The crystals show the following analysis results:
Water content: 12.5% (The HO content was determined by drying for 6 hours in a high vacuum at 1100 ° C. in a special drying gun according to J. Unterzaucher [Mikrochem. 18, 315 (1935)]. The constant weight was checked by continued drying.)
Residue on ignition: 0.11% (the ash content of proteins was determined according to F. Pregl and H. Roth [quantitative organic microanalysis, p. 174, Springer, Vienna, (1949)]).
Protein content: 88.0% The protein was determined after trichloroacetic acid precipitation by the BIURET method [T.E. Weiselbaum, Am. J. Clin. Path. (Techn. Sec.), 10, 40 (1946)]). Total volume: 4 ml (of which 2 ml biuret reagent): El46emnS 12.3 = mg protein / ml test solution.
The sedimentation constant showed a value of S20 <= 4.33.
1 shows the IR spectrum of the crystallized L-asparaginase, recorded by the KBr technique.
The UV spectrum of the preparation is shown in FIG. Measuring device: Zeiss spectrophotometer PMQ II (gain 1/1 / I); Layer thickness: 1 cm; Concentration: 1 mg each of HG and salt fr. Preparation per ml.
A pH 7 phosphate buffer (Merck Titrisol) No. 9887 was used as the solvent.
Figure 3 is a reproduction of the crystal image of L-asparaginase.
Separation of the pyrogens:
Example 13
30 g DEAE-Dextrangel (diethylaminoethyldextrangel = DEAE-Sephadex A 50 3, commercial product of Aktiebolaget Pharmacia, Uppsala, Sweden) is pretreated in the usual way, equilibrated with 0.02 M glycine, 0.02 M ammonium formate buffer pH 7.8 and filled into a 3.2 cm diameter column. Bed height: 90 cm. 500 mg of crude L-asparaginase at 100 U / mg are dissolved in 50 ml of the above buffer and applied to the column. The enzyme is then eluted with a linear gradient of 2 liters of the above buffer to 2 liters of 0.02 M glycine, 1 M ammonium formate pH 7.5. The fractions containing asparaginase are combined and freeze-dried. Yield: 1.03 g with 27,800 U = 83% of the activity used. The spec.
Activity based on protein is 210 U / mg.
Pyrogen test on rabbits: 5 rabbits were given 200 U / kg animal. The mean value of the temperature increase was 0.480 C.
The starting substance showed a temperature increase of 1.60 C. under the same conditions.
Example 4
30 g DEAE dextran gel are pretreated in the usual way and equilibrated with 0.05 M ammonium acetate pH 7.5 and poured into a column 3.2 cm in diameter. Bed height 95 cm. 500 mg of crude L-asparaginase at 39.7 U / mg are dissolved in 50 ml of 0.05 M ammonium acetate pH 7.5 and applied to the column. Elution takes place with a linear gradient from 2 liters of 0.05 M ammonium acetate pH 7.5 to 2 liters of 1 M ammonium acetate pH 7.5. The asparaginase-containing fractions are combined. Yield 18,600 U = 94% of the activity used. Specific activity: 200 U / mg protein.
Pyrogen test on rabbits: at 300 U / mg animal, the mean value of the temperature increase was 0.40 C.
The starting substance showed a temperature increase of 1.60 C at 200 U / kg animal.
For comparison, a cleaning experiment with diethylaminoethyl cellulose is given:
30 g of DEAE cellulose were equilibrated with 0.05 M ammonium acetate pH 7.5 and filled into a column. 500 mg of crude L-asparaginase (34 U / mg) was dissolved in 50 ml of the above buffer, applied to the column and with a linear gradient of 1 liter of 0.05 ammonium acetate pH 7.5 to 1 liter of 0.5 M ammonium acetate pH 7.5 eluted.
Yield: 14,000 U = 82% of the activity with 89 U / mg protein.
Pyrogen test on rabbits: At 200U / kg animal, the mean value of the temperature increase was 1.00 C.
The starting substance showed a temperature increase of 1.80 ° C. under the same conditions.
Other test conditions also did not result in any further removal of the pyrogens, which clearly shows the superiority of the method according to the invention.
Example 15
490 g DEAE dextran gel were pretreated as usual and equilibrated with 0.05 M ammonium acetate pH 7.5 to which merthiolate was added at a concentration of 20 mg / liter. The suspension was placed in a column, cooled to 40 ° C., with a diameter of 20 cm. Bed height: 65 cm. 9.8 g of a crude asparaginase at 45 U / mg were dissolved in 880 ml of 0.02 M ammonium acetate pH 7.5 and applied to the column.
Elution with a linear gradient from 10 liters of 0.05 M ammonium acetate pH 7.5 to 10 liters of 0.5 M ammonium acetate pH 7.5. The asparaginase-containing fractions were pooled. Yield: 365,000 U = 81% of the amount used.
Specific pyrogen test on rabbits: At 200 U / kg animal, the mean value of the temperature increase was 0.330 C.
The starting substance showed a temperature increase of 1.80 ° C. under the same conditions.
Example 16
A solution of 100 mg L-asparaginase at 39.7 U / mg in 100 ml 0.05 M ammonium acetate solution pH 7.5 is added to 10 g DEAE dextran gel, equilibrated in 0.05 M ammonium acetate solution pH 7.5 given. The batch is stirred for 15 minutes and then filtered off with suction. The residue is eluted successively with buffers of different ionic strengths (see table). The L-asparaginase components already eluted at low ionic strength contain pyrogen, while the components eluted with stronger buffers are pyrogen-free. The yields can be seen from the table.
Active pyro buffer vity loot
UC / c T! Animal (, C) 0.05 M ammonium acetate pH 7.5 5010 24 1.1 0.10 M ammonium acetate pH 7.5 3820 18 1.2 0.20 M ammonium acetate pH 7.5 7850 37 0.9 0.40 M-ammonium acetate pH 7.5 4060 19 0.3 0.80 M-ammonium acetate pH 7.5 520 2 0.3
Example 17
100 g asparaginase with a specific activity of 100 U / mg are dissolved in one liter of water. About 40 g of glycine are added and the solution is adjusted to pH 8.9. The solution is kept at +500 ° C. for 90 hours, and the protein which is then precipitated is centrifuged at 6000 rpm for 20 minutes. The clear centrifugate is adjusted to pH 5.2 with 2N HCl and fractionated precipitated with 50% polyethylene glycol solution.
The portion which precipitates after the addition of about 200 ml of polyethylene glycol is spun off, washed with acetone and dried. Yield: about 35 g with 200 to 220 U / mg substance. 4 shows the minimum pyrogen content of the product.
Example 18
The procedure is as in Example 17, but the L-asparaginase solution is heated to 600 ° C. for 24 hours.
Example 19
The procedure is as in Example 17, but the pH of the solution is adjusted to about 8.2.
Example 20
The procedure is as in Example 18, but only 20 g of glycine are added to the L-asparaginase solution.
Example 21
100g L-asparaginase with a spec. Activity from
100 U / mg are dissolved in one liter of water. 100 ml of methanol and 40 g of glycine are added and the solution is adjusted to pH 8.9. The solution is kept at +500 ° C. for 90 hours, the protein which is then precipitated at 6000 rpm. Centrifuged for 20 minutes. The clear centrifugate is adjusted to pH 5.2 with 2N HCl and fractionated precipitated with 50% polyethylene glycol solution. The portion precipitated after the addition of about 200 ml of polyethylene glycol is centrifuged, washed with Ace ton and dried. Yield: about 33 g with
200 to 235 U / mg substance.
Example 22
The procedure is as in Example 21, but 200 ml of methanol are added.
Example 23
The procedure is as in Example 21, but 100 ml of ethanol are added to the solution.