Verfahren zur Herstellung einer entzündungshemmenden Substanz
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer entzündungshemmenden Substanz, die als Zygosporin A bezeichnet wird.
Als entzündungswidrige Mittel wurden bis anhin hauptsächlich Adrenocorticoide, wie z. B. Cortison, Hydrocortison, Prednison und Prednisolon, verwendet.
Diese Adrenocorticoide weisen jedoch im allgemeinen unerwünschte Nebenwirkungen auf, wenn sie während langer Zeit kontinuierlich verabreicht werden. Infolge der mit den Adrenocorticoiden verbundenen Nachteilen wurden gewisse nichtadrenocorticoide entzündungswidrige Mittel vorgeschlagen und entwickelt. Diese nichtadrenocorticoiden Verbindungen sind hinsichtlich ihrer entzündungswidrigen Wirkung den erwähnten Adrenocorticoiden jedoch im allgemeinen unterlegen.
Es erschien daher als wünschenswert, andere nichtadrenocorticoide Verbindungen zu entwickeln, die eine ebenso starke entzündungshemmende Wirkung wie die Adrenocorticoide aufweisen.
Im Verlauf der Suche nach neuen Gärungsprodukten wurde festgestellt, dass die Arten Zygosporium, MFC-61 2, das, wie weiser angeführt, als Zygosporium masonii bestimmt wurde, und MFC-702, das als Zygosporium mycophilum identifiziert wurde, in der Sammlung des Forschungslaboratoriums der Firma Shionogi & Co., Ltd., Osaka, Japan, und bei der American Type Culture Collection unter den Nummern ATCC 20011 und 20012 eingetragen, eine kristalline Substanz erzeugen, die eine starke entzündungshemmende Wirkung aufweist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung einer entzündungshemmenden Substanz, dem Zygosporin A. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass ein Zygosporin erzeugender Stamm von Zygosporium masonii oder Zygosporium mycophilum oder deren Mutanten in einem wässrigen Nährmilieu unter aeroben Bedingungen gezüchtet und die entzündungshemmende Substanz aus der Gärungsbouillon gewonnen wird.
Zygosporium MFC-612 wurde aus einer Probe von toten Blättern von Daphniphyllum macropodum, die 1965 in Kyoto gesammelt wurde, isoliert und zeigt folgende morphologische Merkmale.
Das Wachstum auf Kartoffel-Saccharose-Agar ist mittelmässig und die Kolonie weiss und filzähnlich mit einer dunkelgrauen zentralen Strangpartie, auf der die Sporenbildung erfolgt. Die Konidienfäden sind aufrecht und bestehen aus drei Teilen: 1. Einem aufrechten Grundast, der aus 1-3 Zellen besteht, eine fahlbraune Färbung hat und 5-20 auf
2-2,5 Mikron gross ist.
2. Einem mittleren Teil, der vom Grundast getragen wird und eine aufrechte Kette von 2-4 Ende am
Ende miteinander verbundenen Bläschen bildet.
Jedes Bläschen ist dunkelbraun, 7-12 Mikron lang, von vorn gesehen gespalten, unten 2 Mikron und oben 4 Mikron breit. Von der Seite gesehen, sieht es ungefähr wie die Klinge eines Gartenmessers mit einem 2-4 Mikron langen Schnabel aus. Die Seiten wand ist dick, ausser dort, wo das nächste Bläschen angegliedert ist. Der Schnabel trägt zwei aus Sporen entstandenen Zellen, die divergierend, nach oben gebogen, eiförmig-spitz, hyalin und 46 auf 2 bis
2,5 Mikron gross sind.
3. Einer langen hyalinen apikalen Hyphe am Ende des
Konidienfadens, die 20-30 auf 1-2 Mikron gross, kontinuierlich und oben geschwollen ist und eine ovale Knolle von etwa 2,5-3,5 Mikron Durch messer bildet. Die Konidien werden einzeln aus der
Spitze jeder aus Sporen entstandenen Zelle erzeugt und sind trocken, oval, hyalin, mit zarten Tuberkeln versehen und 6-9 auf 4-6 Mikron gross.
Auf Grund dieser Merkmale wurde das Zygosporium MFC-612 als das Zygosporium masonii Hughes (S.J.Hughes: Mycol. Pap., C. M. 1., 44, 15 [1951]) bestimmt. Der gegenwärtig isolierte Stamm, nämlich Zygosporium masonii MFC-612, wurde bei der American Type Culture Collection deponiert und mit der Nummer ATCC 20011 versehen. Vorzugsweise wird das Zygosporium masonii MFC-612 (ATCC Nr. 20011) auf Kartoffel-Rüben-Agar, das sich alle 3 Monate verpflanzt, bei 100 C aufbewahrt.
Anderseits wurde das Zygosporium MFC-702 aus einer Probe von toten Blättern von Osmanthus ilicifolius, die 1966 in Asakawa, Tokyo, gesammelt wurde, isoliert und zeigt folgende Merkmale.
Das Wachstum auf Kartoffel-Saccharose-Agar ist verhältnismässig langsam und die Kolonie fahlbraun.
Die Myzelen bestehen aus Hyalinen bis Subhyalinen, verzweigtkettigen und durch eine Trennwand getrennte Hyphen, die 1-3 Mikron breit sind. Sicheln werden unmittelbar vom Myzel als Seitenast getragen. Der Stengel, der das Bläschen stützt, ist zylinderförmig, 4-16 auf 2-3 Mikron gross, durch 0-1 Trennwand getrennt und braun. Das Bläschen ist dunkelbraun und obpyriform und bildet einen einseitigen Schnabel in der Spitze, 13 bis 15 Mikron lang, 6-8 Mikron in der grössten Breite, von vorne gesehen, und 4-5 bis 6 Mikron in der grössten Breite, von der Seite gesehen. Drei divergierende, aus Sporen entstandene Zellen an der Spitze des Schnabels sind Hyalin, eiförmig-spitz, manchmal gebogen und 4 bis 6 auf 3-4 Mikron gross.
Die sterile Zelle, die sich an der Spitze des Bläschens befindet, ist zylinderförmig mit einem runden, leicht geschwollenen und oft zerrissenen Ende und 5-8 auf 2-3 Mikron gross. Die Konidien werden an der Spitze jeder aus Sporen entstandenen Zelle erzeugt und sind oval und 8 bis 10 auf 6 bis 7 Mikron gross.
Auf Grund dieser Merkmale wurde das Zygosporium MFC-702 als Zygosporium mycophilum (Vuill.) Sacc. (S. J. Hughes: Mycol. Pap., C. M. I., 44, 9 [1951]) identifiziert. Der gegenwärtig isolierte Stamm, nämlich Zygosporium mycophilum MFC-702, wurde bei der American Type Culture Collection deponiert und erhielt die Nummer ATCC 20012. Vorzugsweise wird das Zygosporium mycophilum MFC-70Q (ATCC Nr. 20012) auf Kartoffel-Saccharose-Agar unter den oben beim Zygosporium masonii MFC-612 (ATCC Nr. 20011) angegebenen Bedingungen aufbewahrt.
Es soll festgehalten werden, dass die erfindungsgemässe Herstellung von Zygosporin A nicht auf die Verwendung der oben beschriebenen beiden Stämme, nämlich Zygosporium masonii MFC-612 (ATCC Nr. 20011) und Zygosporium mycophilum MFC-702 (ATCC Nr. 20012), beschränkt ist. Das erfindungsgemässe Verfahren verwendet auch andere Stämme, die mit der Art der obigen typischen Stämme übereinstimmen. Sie soll auch die Verwendung natürlicher oder künstlicher Mutationen oder Variationen, die von den oben beschriebenen Organismen aus erzeugt werden, einschliessen. Die künstliche Erzeugung von Mutationen oder Variationen kann nach einem herkömmlichen Verfahren, wie z. B. Röntgenstrahlen, ultraviolette Bestrahlung und Stickstoffsenfen, bewirkt werden.
Gemäss einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die entzündungshemmende Substanz Zygosporin A bei der Züchtung des Zygosporin-erzeugenden Stamms Zygosporium masonii oder Zygosporium mycophilum in einem wässrigen Nährmilieu bei einer Temperatur von etwa 25 bis etwa 320 C, vorzugsweise 27-29 C, unter aeroben Bedingungen erzeugt. Die Zusammensetzung des Nährmilieus kann innerhalb eines sehr weiten Rahmens variieren. Wesentlich sind eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Elemente. Beispiele geeigneter Kohlenstoffquellen sind Stärke, Glucose, Glycerin, Dextrin, Maltose, Fructose, Saccharose, Lactose, Mannitol und Melassen.
Zu den geeigneten Stickstoffquellen für das Gärungsverfahren gehören Eleischextrakte, Pepton, Maiswasser, Sojabohnenmehl, Erdnussmehl, Weizengluten, Baumwollsamenmehl, Casaminosäure (Säurehydrolysat von Casein), NZ-Amin (enzymatisches Hydrolysat von Casein), Hefeextrakte, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumchlorid. Beispiele geeigneter Quellen anorganischer Elemente sind Mineralsalze, wie z. B. Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat und Kaliumphosphat. Das Nährmilieu kann vor der Impfung des Mikroorganismus auf etwa pH 7,0 eingestellt werden oder nicht. Bei übermässiger Schaumbildung können Antischaummittel, wie z. B. Pflanzenöle, Schmalzöl und Polypropylenglycol, dem Gärungsmilieu vor oder im Verlauf der Gärung beigefügt werden.
Die maximale Ausbeute an der entzündungshemmenden Substanz Zygosporin A kann unter optimalen Temperatur- und Ventilationsbedingungen in etwa 50 bis etwa 150 und gewöhnlich in etwa 70 bis etwa 100 Stunden Gärung erzielt werden.
Im allgemeinen sammelt sich die erfindungsgemäss erzeugte Substanz Zygosporin A in erster Linie im Gärungsmilieu an. Nach dem Wachstum des Mikroorganismus wird das Myzel unter Verwendung einer herkömmlichen Ausrüstung, wie z. B. Filterpressen und Schleudervorrichtungen, aus der Gärungsbouillon entfernt, worauf Zygosporin A nach einem herkömmlichen Trennverfahren, wie z. B. Extraktion mit einem Lösungsmittel, und einem Adsorptionsverfahren aus dem Filtrat rückgewonnen wird. Gegebenenfalls können die gesammelten Myzelen ebenfalls den Extraktionsverfahren mit einem Lösungsmittel unterzogen werden, da das aktive Produkt bis zu einem gewissen Grad in den Myzelen enthalten ist.
Zu den geeigneten Lösungsmitteln zur Extraktion und zum Eluieren des Wirkstoffs gehören Methanol, Methanol, Propanol, Butanol, Aceton, Dimethylformamid, Dioxan, Tetrahydrofuran, Äther, Äthylacetat, Butylacetat, Amylacetat, Chloroform, Methylenchlorid, Dichloräthan, Trichloräthan, Benzol und dergleichen. Beispiele geeigneter Adsorbentien sind Celite (eine Art Diatomäenerde, Hyflo-Super-Cel (eine Art Diatomäenerde), Kieselsäure, Silicagel, Aktivkohle und dergleichen. Gewöhnlich wird eine Kombination einer Extraktion mit einem Lösungsmittel und einer Kristallisation durch Konzentration verwendet. Zum Beispiel wird das Filtrat der Kulturbouillon mit einem geeigneten mit Wasser unvermischbaren organischen Lösungsmittel, wie z.
B. Äthylacetat und Chloroform, extrahiert und der Extrakt konzentriert, um den Wirkstoff in Form roher Kristalle zu fällen.
Der auf diese Weise erzielte rohe Wirkstoff wird nach herkömmlichen Verfahren, wie z. B. Umkristallisieren, Chromatographie und dergleichen, weiter gereinigt. Beispiele geeigneter Lösungsmittel für die Umkristallisation sind Aceton, Methanol und Äthanol. Die bevorzugten Adsorbentien für die Chromatographie sind Kieselsäure, Silicagel und dergleichen.
Die erfindungsgemäss erhaltene entzündungshemmende Substanz Zygosporin A besteht aus farblosen nadelartigen Kristallen, die unter Zersetzung bei 268 bis 2700 C schmelzen, wenn sie aus Aceton umkristallisiert werden. Sie ist in Methanol, Äthanol, Chloroform, Methylenchlorid, Aceton, Dimethylformamid, Dioxan, Äthylacetat und Pyridin löslich, in Äther und Benzol leicht löslich und in Petroläther und Wasser unlöslich.
Sie verhält sich als neutrale Substanz.
Die Elementaranalyse von Zygosporin A ergibt:
Kohlenstoff 71,00 %
Wasserstoff 7,29 %
Sauerstoff 18,93 %
Stickstoff 2,76 %
Die Verbindung weist ein Molekulargewicht von etwa 500 auf, durch die Methode der Herabsetzung des Dampfdrucks bestimmt. Nach der Massenspektrometrie beträgt das Molekulargewicht 507. Aus den Ergebnissen der obigen Analysen geht hervor, dass die Verbindung die Molekül formel C30H370FN aufweist.
Die spezifische Drehung von Zygosporin A ist [ ]25 - 7,50 (+ 0,60) (c = 0,55 % in Dioxan). Zygosporin A zeigt kein charakteristisches Absorptionsband im Ultraviolettbereich.
Das infrarote Absorptionsspektrum von Zygosporin A, als Kaliumbromidscheibe bestimmt, zeigt folgende Frequenzen (S = stark): 3404(S), 3240, 1742(S), 1703(S), 1693(S), 1645, 1605, 1498, 1456, 1427, 1375, 1351, 1277, 1233(S), 1178, 1127, 1049(S), 1039, 1009(S), 962 (S), 936, 907(S), 780, 751(S), 726 und 706(S) cm-l (in Fig. 1 der beiliegenden Zeichnungen gezeigt). Bei Verwendung einer Chloroformlösung zeigt das Spektrum folgende Frequenzen (S = stark): 3409(S), 1742(S), 1702(S), 1605, 1495, 1455, 1435, 1371, 1350, 1322, 1302, 1270, 1111, 1069, 1043, 1006(S), 966(S) und 911(S) cm-1 (in Fig.2 der beiliegenden Zeichnungen gezeigt).
Das in Deuterochloroform (CD13) bestimmte kernmagnetische Resonanzspektrum von Zygosporin A (Fig. 3) zeigt folgende Signale (s = Singlett, d = Doublet, m = Multiplet, J = Kupplungskonstante):
9,07 (d, J = 6,8, CH3, 8,82 (d, J = 6,3, CH3),
EMI3.1
5,42 (s), 4,95 (m, 1 H), 4,75 (m), 4,43 (m),
4,02 (d, J = 3,1), 3,70 (d, J = 3,1) und
2,77 (m) z in ppm (in Fig. 3 der beiliegenden Zeichnungen gezeigt).
Das auf diese Weise erzeugte Zygosporin A weist eine hochgradige entzündungshemmende Wirkung auf.
Zum Beispiel wurde die Wirkung von Zygosporin A gegen Oedem bei Ratten bei oraler Verabreichung untersucht; die Ergebnisse sind zusammen mit denjenigen eines im Handel erhältlichen entzündungshemmenden Mittels, nämlich Phenylbutazon, in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
Hemmende Wirkung gegen Oedem
Hemmung von Oedem in Prozent Dosis Zeitdauer nach der Verabreichung des Versuchsverbindung (mg/kg) entzündungshemmenden Mittels (in Stunden)
2 3
Zygosporin A 5,0 80,6 82,7
Zygosporin A 2,5 44,3 32,7
Zygosporin A 1,0 19,7 2,0
Phenylbutazon 50,0 13,7 16,8
Anmerkung: Die Ratten wurden mit der Versuchsverbindung oral vorbehandelt, worauf ihnen das entzündungshemmende Mittel, 1 % iges Carrageenin, subkutan verabreicht wurde. Das hervorgerufene Oedem wurde gemessen und mit dem ohne Vorbehandlung hervorgerufenen verglichen. Die hemmende Wirkung gegen Oedem wird als prozentuale Hemmung ausgedrückt.
Aus der obigen Tabelle 1 geht hervor, dass die hemmende Wirkung von Zygosporin A gegen Oedem bei oraler Verabreichung etwa 50 Mal grösser als diejenige von Phenylbutazon ist.
Die hemmende Wirkung von Zygosporin A gegen Oedem wurde ferner bei Ratten bei subkutaner Verabreichung untersucht; die Ergebnisse und die mit Phenylbutazon erzielten sind in der nachstehenden Tabelle 2 wiedergegeben.
Tabelle 2
Hemmende Wirkung gegen Oedem
Hemmung von Oedem in Prozent Dosis Zeitdauer nach der Verabreichung des Versuchsverbindung (mg/kg) entzündungshemmenden Mittels (in Stunden)
2 3
Zygosporin A 0,5 80,7 73,4
Zygosporin A 0,25 64,1 50,4
Zygosporin A 0,1 36,9 20,8
Phenylbutazon 100 45,9 46,3
Phenylbutazon 50 28,9 34,1
Anmerkung: Die Ratten wurden mit der Testverbindung subkutan vorbehandelt, worauf ihnen das entzündungshemmende Mittel, nämlich 1 % iges Carrageenin, subkutan verabreicht wurde. Das erzeugte Oedem wurde gemessen und mit dem ohne Vorbehandlung hervorgerufenen verglichen. Die hemmende Wirkung gegen Oedem wird als prozentuale Hemmung ausgedrückt.
Aus der obigen Tabelle 1 geht hervor, dass die hemmende Wirkung von Zygosporin A gegen Oedem bei subkutaner Verabreichung etwa 500mal grösser als diejenige von Phenylbutazon ist.
Dann wurde die hemmende Wirkung von Zygosporin A gegen Abszesse bei Ratten untersucht: die Ergebnisse werden in den nachfolgenden Tabellen 3 und 4 gezeigt und mit den mit Phenylbutazon erzielten verglichen.
Tabelle 3
Hemmende Wirkung gegen Abszesse
Abszess Gesamtdosis Versuchsverbindung (mg/kg) Mittleres Gewicht Hemmung (mg) (%)
Kontrollversuch - 2096 + 129
Zygosporin A 5 1310 + 86 37,5
Zygosporin A 10 976 + 70 53,4
Phenylbutazon 25 1815 + 98 13,4
Anmerkung: Der Abszess wurde durch die subkutane Injektion von 2 % igem Carrageein in die Kreuzbeingegend von Ratten hervorgerufen. Dann wurden die Versuchsverbindungen oral verabreicht. Die Hälfte der Gesamtdosis wurde unmittelbar nach der Einspritzung und die zweite Hälfte 3 Stunden später verabreicht. Die Ratten wurden 24 Stunden nach der injektion getötet und der Abszess seziert und gewogen.
Tabelle 4
Hemmende Wirkung gegen Abszesse
Abszess
Gesamtdosis Versuchsverbindung (mg/kg) Mittleres Gewicht Hemmung (mg) (%)
Kontrollversuch - 1991 + 87
Zygosporin A 1 1728 ,1106 13,2
Zygosporin A 2,5 1532 + 76 23,1
Phenylbutazon 50 1516, 112 23,9
Anmerkung: Der Abszess wurde durch die subkutane Injektion von 2 %igem Carrageenin in die Kreuzbeingegend von Ratten hervorgerufen. Dann wurden die Versuchsverbindungen oral verabreicht. Die Hälfte der Gesamtdosis wurde unmittelbar nach der Einspritzung und die zweite Hälfte 3 Stunden später verabreicht. Die Ratten wurden 24 Stunden nach der Einspritzung getötet und der Abszess seziert und gewogen.
Aus den obigen Tabellen 3 und 4 geht hervor, dass Zygosporin A bei oraler Verabreichung in seiner hemmenden Wirkung gegen Abszesse etwa 20mal wirksamer als Phenylbutazon ist.
Die hemmende Wirkung von Zygosporin A gegen Granulation wurde durch orale Verabreichung an 6 aufeinanderfolgenden Tagen untersucht; die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen 5 und 6 angeführt und mit den mit Phenylbutazon erzielten verglichen.
Tabelle 5
Hemmende Wirkung gegen Granulation
Granulom Hemmung Versuchsverbindung Tägliche Dosis mittleres Gewicht der Granulation (mg/kg) (mg) (%)
Kontrollversuch - 277,6 + 15,1
Zygosporin A 1 264,6 + 19,3 4,7
Zygosporin A 2,5 265,1 ist 20,5 4,5
Phenylbutazon 25 235,6 + 15,8 15,1
Anmerkung: Die Granulome wurden hervorgerufen, indem mit Carrageenin durchtränkte Kügelchen aus Filterpapier in die lacterovetrale Gegend von Ratten gesteckt wurden. Dann wurden die Versuchsverbindungen 6 Tage einmal im Tag oral verabreicht. 20 Stunden nach der letzten Verabreichung wurden die Ratten getötet, und das Granulom wurde seziert und gewogen.
Tabelle 6
Hemmende Wirkung gegen Granulation
Granulom Dosis . Granulom Hemmung Versuchsverbindung Tägliche Dosis mittleres Gewicht der Granulation (mg) (mg) (%)
Kontrollversuch - 294 + 8,4
Zygosporin A 5 263,9 + 16,9 10
Phenylbutazon 50 199,5 i 11,5 34
Anmerkung: Die Granulome wurden hervorgerufen, indem mit Carrageenin durchtränkte Kügelchen aus Filterpapier in die lacterovetrale Gegend von Ratten eingelegt wurden. Dann wurden die Versuchsverbindungen 6 Tage einmal im Tag oral verabreicht. 20 Stunden nach der letzten Verabreichung wurden die Ratten getötet, und das Granulom wurde seziert und gewogen.
Aus den Tabellen 5 und 6 geht hervor, dass die hemmende Wirkung von Zygosporin A mindestens das Mehrfache von der von Phenylbutazon ist.
Ferner wurde die hemmende Wirkung von Zygosporin A gegen lokale Exudation bei Ratten bestimmt; die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 7 wiedergegeben und mit den mit Phenylbutazon erzielten verglichen.
Tabelle 7
Hemmende Wirkung gegen Exudation Versuchsverbindung Dosis (mg/kg) Volumen des Exudats (ml)
Kontrollversuch - 53,9 + 3,5
Zygosporin A 50 6,8 + 0,6
Zygosporin A 5 15,7 + 0,8
Zygosporin A 0,5 26,2 t 3,0
Phenylbutazon 50 27,6 + 1,7
Phenylbutazon 5 43,9 + 4,9
Anmerkung: Am ersten Tag wurden 20 ml Stickstoffgas in die Ratten subkutan injiziert, um einen Beutel zu bilden, in welchem 0,5 ml 10 W iges Krotonöl injiziert wurden. Am 6. Tag wurde die Versuchsverbindung lokal in den Beutel injiziert. Am 11. Tag wurden die Ratten getötet, und das Volumen des Exudats wurde gemessen.
Aus der obigen Tabelle geht hervor, dass die hemmende Wirkung von Zygosporin A gegen Exudation ungefähr 100mal grösser als die von Phenylbutazon ist.
Die akute Toxizität von Zygosporin A wurde bei Mäusen untersucht; die mittlere letale Dosis, das heisst der Wert LD50, beträgt subkutan 1,85 mg/kg und oral 36,0 mg/kg.
Somit ist Zygosporin A im Vergleich zu einem im Handel erhältlichen nichtadrenocortikalen entzündungshemmenden Mittel bemerkenswert wirksam. Daher kann es als wirksames nichtadrenocortikales entzündungshemmendes Mittel verwendet werden.
Der Wirkstoff Zygosporin A wird in einer Einheitsdosierungsform mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger dem lebenden Organismus zur Bekämpfung verschiedener Entzündungen und Oedeme, z. B. Rheumatismen, verabreicht. Normalerweise wird das Präparat oral verabreicht, obwohl es ebenso wirksam ist, wenn es auf eine andere Weise verabreicht wird.
Zu den verschiedenen festen Trägern, die verwendet werden können, gehören z. B. Lactose, Mannitol, Maisstärke, Talk und Magnesiumstearat sowie andere Tablettenhilfsstoffe und Füller. Gegebenenfalls können gewisse andere Ingredienzien, wie z. B. Hydrocortison, Prednisolon, Aminopyrin, Chloroquine, Phenylbutazon und dergleichen, mit dem erwähnten Wirkstoff vermischt werden.
Folgende Beispiele sollen die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung veranschaulichen.
Beispiel 1
Eine Samenkultur wird nach folgendem Dreistufenverfahren hergestellt: 1. Eine schräg im Reagensglas angelegte Kartoffel
Saccharose-Agar-Kultur wird erzeugt, indem 1,5%
Agar in ein Kartoffel-Saccharose-Milieu gegeben wer den, das aus (durch 20minutiges Kochen von 200 g geschnittenen Kartoffeln in 500 ml Wasser erzeug tem) Kartoffelsaft, 10 g Saccharose und genügendem
Wasser, damit man im Ganzen 1 Liter erhält, besteht. Zygosporium masonii MFC-6t12 (ATCC
Nr. 20011) wird in die Kultur geimpft und 7 bis
10 Tage bei 27-28 C gezüchtet, bis die Sporen bildung zu Ende ist.
2. 100 ml Kartoffel-Saccharose-Milieu, das dieselbe
Zusammensetzung wir das oben beschriebene auf weist, werden in einen 500-ml-Kolben gegeben, sterilisiert und mit einer geeigneten Menge Sporen aus der obigen Kultur geimpft. Die Zucht erfolgt
3 Tage bei 27-280 C unter Schütteln.
3. 50 ml der Kulturbouillon werden in 500 ml eines neuen Kartoffel-Saccharose-Milieus gegeben, das aus den oben beschriebenen Materialien besteht, in einen 2-Liter-Kolben gegossen und vorgängig sterili siert. Die Zucht erfolgt 4 Tage bei 27-280 C, und die auf diese Weise erzielte Kulturbouillon wird als
Impfmaterial verwendet.
20 Liter Kartoffel-Saccharose-Milieu der oben beschriebenen Zusammensetzung werden in ein 30-Liter Gärungsgefäss gegeben, sterilisiert und mit 500 ml des oben hergestellten Impfmaterials geimpft. Die Zucht erfolgt 4 Tage bei 27-28 C unter Rühren (250 Umdrehungen/min), bei Lüftung (20 Liter/min) und bei einem Druck von 0,5 bis 0,7 kg/cm2.
500 g Celite (Diatomäenerde) werden in die Kulturbouillon gegeben und ausgeschleudert, um (1,1 kg einschliesslich des Celits) Myzelen und 17 Liter oben schwimmende Flüssigkeit zu erzielen.
Den Myzelen werden 1,5 Liter Methanol beigefügt, und das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Filtrieren wird das Filtrat unter vermindertem Druck konzentriert und der Rückstand mit Athylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser, 2n Natriumcarbonatlösung und wiederum mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bei 50-600 C verdampft, wobei ein öliger Rückstand zurückbleibt, der durch Behandlung mit Aceton kristallisiert wird; man erhält 18,1 mg Zygosporin A.
Anderseits werden die 17 Liter oben schwimmende Flüssigkeit dreimal mit je 7 Liter Äthylacetat extrahiert.
Der etwa 20 Liter ausmachende Extrakt wird mit Wasser, mit 2n Natriumcarbonatlösung und wiederum mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bei 50-600C verdampft. Der Rückstand wird mit Äther oder Aceton behandelt, wobei man 277 mg kristallines Zygosporin A erhält.
Durch Umkristallisieren aus Aceton wird reines Zygosporin A, F = 268-2700 C, in Form von farblosen Nadeln erzielt.
Beispiel 2
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird mit Zygosporium mycophilum MFC-702 (ATCC Nur.20012) anstelle von Zygosporium masonii MFC-612 (ATCC Nr. 20011) durchgeführt; Zygosporin A wird bei ungefähr gleicher Ausbeute wie in Beispiel 1 aus der Kulturbouillon rückgewonnen.
Beispiel 3
Eine Samenkultur wird nach folgenden Dreistufenverfahren hergestellt: 1. Eine schräg im Reagensglas angelegte Kartoffel
Saccharose-Agar-Kultur wird aus 200 g Kartoffeln,
10 g Saccharose, 5 g Agar und 1 Liter Wasser erzeugt. Die Kultur wird mit Zygosporium masonli MFC > 612 (ATCC Nr. 20011) geimpft und 7 Tage bei 280 C gezüchtet.
2. 100 ml eines 3,0% Glucose, 2,0% Pepton und 0,5 %
Natriumchlorid (pH 6,0) enthaltenden wässrigen
Nährmilieus werden in einen 500-ml-Kolben gege ben, sterilisiert und mit einer geeigneten Menge
Sporen aus der obigen Kultur geimpft. Die Zucht wird 4 Tage bei 280 C unter Schütteln (140 Bewe gungen in der Minute mit einer Amplitude von
7 cm) durchgeführt.
3. 30 ml Kulturbouillon werden in 700 ml eines neuen
Nährmilieus gegeben, das aus den gleichen Materia lien wie in obigem Verfahren 2 besteht, in einen
2-Liter-Kolben gegossen und vorgängig sterilisiert.
Die Zucht erfolgt 3 Tage bei 280 C unter Schütteln (300 Umdrehungen/min), und die auf diese Weise erzielte Kulturbouillon wird als Impfmaterial ver wendet.
70 Liter eines 3,0% Glucose, 2% Pepton und 0,5 % Natriumchlorid (pH 6,8) enthaltenden wässrigen Nährmilieus werden in einem 100-Liter-Behälter gegeben.
84 g P-2000 (Polypropylenglycol, ein von der Firma The Dow Chemical Company hergestelltes Antischaummittel) werden beigefügt, und das Gemisch wird sterilisiert. Das Milieu wird mit 2,1 Liter des oben beschriebenen Impfmaterials geimpft und die Zucht 3 Tage bei 280 C unter Rühren (370-380 Umdrehungen/min), unter Lüftung (70 Liter/min) und bei einem Druck von 0,7 kg/cm2 durchgeführt.
Die Kulturbouillon wird ausgeschleudert, um die Myzelen zu entfernen, und die 67 Liter oben schwimmende Flüssigkeit werden zweimal mit je 20 Liter Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck verdampft, wobei man 5,7 g rohes Zygosporin A erhält. Durch Umkristallisieren aus Aceton werden 5,4 g reines Zygosporin A, F = 268-2700 C (Zers.) in Form von farblosen Nadeln erzielt.
Process for the preparation of an anti-inflammatory substance
The present invention relates to a method of making an anti-inflammatory substance called zygosporin A.
Up to now mainly adrenocorticoids have been used as anti-inflammatory agents, e.g. B. cortisone, hydrocortisone, prednisone and prednisolone are used.
However, these adrenocorticoids generally have undesirable side effects when continuously administered for a long time. As a result of the disadvantages associated with adrenocorticoids, certain non-adrenocorticoid anti-inflammatory agents have been proposed and developed. However, these non-adrenocorticoid compounds are generally inferior to the aforementioned adrenocorticoids with regard to their anti-inflammatory action.
It has therefore appeared desirable to develop other non-adrenocorticoid compounds that have as potent anti-inflammatory activity as the adrenocorticoid.
In the course of the search for new fermentation products, it was found that the species Zygosporium, MFC-61 2, which, as more wisely stated, was identified as Zygosporium masonii, and MFC-702, which was identified as Zygosporium mycophilum, in the collection of the research laboratory of Shionogi & Co., Ltd., Osaka, Japan, and registered with the American Type Culture Collection under numbers ATCC 20011 and 20012, produce a crystalline substance that has a strong anti-inflammatory effect.
The present invention thus relates to a method for producing an anti-inflammatory substance, the zygosporin A. This method is characterized in that a zygosporin-producing strain of Zygosporium masonii or Zygosporium mycophilum or their mutants is cultured in an aqueous nutrient medium under aerobic conditions and the anti-inflammatory substance is obtained from the fermentation broth.
Zygosporium MFC-612 was isolated from a sample of dead leaves of Daphniphyllum macropodum collected in Kyoto in 1965 and shows the following morphological features.
The growth on potato-sucrose agar is mediocre and the colony is white and felt-like with a dark gray central part of the cord on which spore formation occurs. The conidia threads are upright and consist of three parts: 1. An upright basal branch, which consists of 1-3 cells, has a pale brown color and 5-20
2-2.5 microns in size.
2. A middle part, which is carried by the base branch and an upright chain from 2-4 ends at the
Forms connected vesicles at the end.
Each vesicle is dark brown, 7-12 microns long, split when viewed from the front, 2 microns wide at the bottom and 4 microns wide at the top. Seen from the side, it looks somewhat like the blade of a garden knife with a 2-4 micron long beak. The side wall is thick, except where the next vesicle is attached. The beak bears two cells formed from spores, which are divergent, curved upwards, ovate-pointed, hyaline and 46 to 2 bis
2.5 microns in size.
3. A long hyaline apical hypha at the end of the
Conidial thread that is 20-30 by 1-2 microns in size, continuous and swollen at the top and forms an oval tuber about 2.5-3.5 microns in diameter. The conidia are separated from the
The tips of each cell formed from spores are dry, oval, hyaline, provided with delicate tubercles and 6-9 by 4-6 microns in size.
On the basis of these characteristics, the Zygosporium MFC-612 was determined to be the Zygosporium masonii Hughes (S.J. Hughes: Mycol. Pap., C. M. 1., 44, 15 [1951]). The currently isolated strain, Zygosporium masonii MFC-612, has been deposited with the American Type Culture Collection and given the number ATCC 20011. The Zygosporium masonii MFC-612 (ATCC No. 20011) is preferably stored at 100 ° C. on potato and beet agar, which transplants every 3 months.
On the other hand, Zygosporium MFC-702 was isolated from a sample of dead leaves of Osmanthus ilicifolius collected in Asakawa, Tokyo, in 1966, and shows the following characteristics.
Growth on potato-sucrose agar is relatively slow and the colony is pale brown.
The mycelia consist of hyalines to subhyalines, branched-chain hyphae that are separated by a partition and are 1-3 microns wide. Sickles are borne directly by the mycelium as a side branch. The stem that supports the vesicle is cylindrical, 4-16 by 2-3 microns in size, separated by a 0-1 partition, and brown. The vesicle is dark brown and obpyriform and forms a unilateral beak at the tip, 13 to 15 microns long, 6-8 microns in the greatest width when viewed from the front, and 4-5 to 6 microns in the greatest width when viewed from the side . Three divergent, spore-formed cells at the tip of the beak are hyaline, ovoid-pointed, sometimes curved, and 4 to 6 by 3-4 microns in size.
The sterile cell, located at the apex of the vesicle, is cylindrical in shape with a round, slightly swollen, and often torn end, and is 5-8 by 2-3 microns in size. The conidia are created at the tip of each spore-formed cell and are oval and 8 to 10 by 6 to 7 microns in size.
Because of these characteristics, the Zygosporium MFC-702 was named Zygosporium mycophilum (Vuill.) Sacc. (Hughes, S. J.: Mycol. Pap., C. M. I., 44, 9 [1951]). The currently isolated strain, Zygosporium mycophilum MFC-702, has been deposited with the American Type Culture Collection and assigned the number ATCC 20012. Preferably, the Zygosporium mycophilum MFC-70Q (ATCC No. 20012) on potato-sucrose agar among the above in the Zygosporium masonii MFC-612 (ATCC No. 20011) specified conditions.
It should be noted that the inventive production of Zygosporin A is not limited to the use of the two strains described above, namely Zygosporium masonii MFC-612 (ATCC No. 20011) and Zygosporium mycophilum MFC-702 (ATCC No. 20012). The method according to the invention also uses other strains which correspond to the type of the above typical strains. It is also intended to include the use of natural or artificial mutations or variations produced by the organisms described above. Artificially generating mutations or variations can be performed by a conventional method such as e.g. B. X-rays, ultraviolet radiation and nitrogen mustards can be effected.
According to one embodiment of the present invention, the anti-inflammatory substance zygosporin A is produced in the cultivation of the zygosporin-producing strain Zygosporium masonii or Zygosporium mycophilum in an aqueous nutrient medium at a temperature of about 25 to about 320 C, preferably 27-29 C, under aerobic conditions . The composition of the nutrient environment can vary within a very wide range. A carbon source, a nitrogen source and inorganic elements are essential. Examples of suitable carbon sources are starch, glucose, glycerine, dextrin, maltose, fructose, sucrose, lactose, mannitol and molasses.
Suitable nitrogen sources for the fermentation process include potash extracts, peptone, corn water, soybean meal, peanut flour, wheat gluten, cottonseed meal, casamino acid (acid hydrolyzate of casein), NZ-amine (enzymatic hydrolyzate of casein), yeast extracts, ammonium sulfate, and ammonium chloride. Examples of suitable sources of inorganic elements are mineral salts, such as e.g. B. sodium chloride, potassium chloride, calcium carbonate and potassium phosphate. The nutrient environment may or may not be adjusted to around pH 7.0 prior to inoculation of the microorganism. In the case of excessive foaming, antifoam agents such as B. vegetable oils, lard oil and polypropylene glycol, are added to the fermentation medium before or during fermentation.
The maximum yield of the anti-inflammatory substance zygosporin A can be obtained in about 50 to about 150, and usually about 70 to about 100 hours of fermentation under optimal temperature and ventilation conditions.
In general, the substance zygosporin A produced according to the invention accumulates primarily in the fermentation medium. After the microorganism has grown, the mycelium is removed using conventional equipment such as B. filter presses and centrifuges, removed from the fermentation broth, whereupon Zygosporin A after a conventional separation process, such as. B. extraction with a solvent, and an adsorption process from the filtrate is recovered. If necessary, the collected mycelia can also be subjected to the extraction processes with a solvent, since the active product is contained in the mycelia to some extent.
Suitable solvents for extraction and elution of the active ingredient include methanol, methanol, propanol, butanol, acetone, dimethylformamide, dioxane, tetrahydrofuran, ether, ethyl acetate, butyl acetate, amyl acetate, chloroform, methylene chloride, dichloroethane, trichloroethane, benzene and the like. Examples of suitable adsorbents are Celite (a kind of diatomaceous earth, Hyflo-Super-Cel (a kind of diatomaceous earth), silica, silica gel, activated carbon, and the like. Usually, a combination of extraction with a solvent and crystallization by concentration is used. For example, the filtrate is used the culture broth with a suitable water-immiscible organic solvent, such as.
B. ethyl acetate and chloroform, extracted and the extract concentrated to precipitate the active ingredient in the form of crude crystals.
The raw active ingredient obtained in this way is according to conventional methods, such as. B. recrystallization, chromatography and the like, further purified. Examples of suitable solvents for the recrystallization are acetone, methanol and ethanol. The preferred adsorbents for chromatography are silica, silica gel and the like.
The anti-inflammatory substance zygosporin A obtained according to the invention consists of colorless needle-like crystals which melt with decomposition at 268 to 2700 ° C. when they are recrystallized from acetone. It is soluble in methanol, ethanol, chloroform, methylene chloride, acetone, dimethylformamide, dioxane, ethyl acetate and pyridine, easily soluble in ether and benzene and insoluble in petroleum ether and water.
It behaves as a neutral substance.
The elemental analysis of zygosporin A shows:
Carbon 71.00%
Hydrogen 7.29%
Oxygen 18.93%
Nitrogen 2.76%
The compound has a molecular weight of about 500 as determined by the vapor pressure depressurization method. According to the mass spectrometry, the molecular weight is 507. From the results of the above analyzes, it is found that the compound has the molecular formula C30H370FN.
The specific rotation of zygosporin A is [] 25 - 7.50 (+ 0.60) (c = 0.55% in dioxane). Zygosporin A does not show a characteristic absorption band in the ultraviolet range.
The infrared absorption spectrum of Zygosporin A, determined as a potassium bromide disk, shows the following frequencies (S = strong): 3404 (S), 3240, 1742 (S), 1703 (S), 1693 (S), 1645, 1605, 1498, 1456, 1427, 1375, 1351, 1277, 1233 (S), 1178, 1127, 1049 (S), 1039, 1009 (S), 962 (S), 936, 907 (S), 780, 751 (S), 726 and 706 (S) cm-1 (shown in Figure 1 of the accompanying drawings). When using a chloroform solution, the spectrum shows the following frequencies (S = strong): 3409 (S), 1742 (S), 1702 (S), 1605, 1495, 1455, 1435, 1371, 1350, 1322, 1302, 1270, 1111, 1069, 1043, 1006 (S), 966 (S) and 911 (S) cm-1 (shown in Figure 2 of the accompanying drawings).
The nuclear magnetic resonance spectrum of zygosporin A (Fig. 3) determined in deuterochloroform (CD13) shows the following signals (s = singlet, d = doublet, m = multiplet, J = coupling constant):
9.07 (d, J = 6.8, CH3, 8.82 (d, J = 6.3, CH3),
EMI3.1
5.42 (s), 4.95 (m, 1H), 4.75 (m), 4.43 (m),
4.02 (d, J = 3.1), 3.70 (d, J = 3.1) and
2.77 (m) z in ppm (shown in Figure 3 of the accompanying drawings).
The zygosporin A produced in this way has a high level of anti-inflammatory effect.
For example, the effect of zygosporin A against edema in rats when administered orally has been studied; the results are shown in Table 1 below, along with those of a commercially available anti-inflammatory agent, namely phenylbutazone.
Table 1
Inhibitory effect against edema
Inhibition of edema in percent Dose Duration after administration of the test compound (mg / kg) anti-inflammatory agent (in hours)
2 3
Zygosporin A 5.0 80.6 82.7
Zygosporin A 2.5 44.3 32.7
Zygosporin A 1.0 19.7 2.0
Phenylbutazone 50.0 13.7 16.8
Note: The rats were pretreated orally with the test compound, after which the anti-inflammatory agent, 1% carrageenin, was administered subcutaneously. The edema produced was measured and compared with that produced without pretreatment. The edema inhibitory effect is expressed as a percentage inhibition.
It can be seen from Table 1 above that the inhibitory effect of zygosporin A against edema when administered orally is about 50 times greater than that of phenylbutazone.
The inhibitory effect of zygosporin A against edema was also studied in rats when administered subcutaneously; the results and those obtained with phenylbutazone are shown in Table 2 below.
Table 2
Inhibitory effect against edema
Inhibition of edema in percent Dose Duration after administration of the test compound (mg / kg) anti-inflammatory agent (in hours)
2 3
Zygosporin A 0.5 80.7 73.4
Zygosporin A 0.25 64.1 50.4
Zygosporin A 0.1 36.9 20.8
Phenylbutazone 100 45.9 46.3
Phenylbutazone 50 28.9 34.1
Note: The rats were pretreated subcutaneously with the test compound and then administered subcutaneously the anti-inflammatory agent, namely 1% carrageenin. The edema produced was measured and compared with that produced without pretreatment. The edema inhibitory effect is expressed as a percentage inhibition.
From Table 1 above, it can be seen that the inhibitory effect of zygosporin A against edema when administered subcutaneously is about 500 times greater than that of phenylbutazone.
Then the inhibitory effect of zygosporin A against abscesses in rats was examined: the results are shown in Tables 3 and 4 below and compared with those obtained with phenylbutazone.
Table 3
Inhibitory effect against abscesses
Abscess Total Dose Test Compound (mg / kg) Mean Weight Inhibition (mg) (%)
Control attempt - 2096 + 129
Zygosporin A 5 1310 + 86 37.5
Zygosporin A 10 976 + 70 53.4
Phenylbutazone 25 1815 + 98 13.4
Note: The abscess was caused by subcutaneous injection of 2% carrageein into the sacrum area of rats. Then the test compounds were administered orally. Half of the total dose was given immediately after injection and the second half 3 hours later. The rats were sacrificed 24 hours after injection and the abscess dissected and weighed.
Table 4
Inhibitory effect against abscesses
abscess
Total dose of test compound (mg / kg) Mean weight inhibition (mg) (%)
Control experiment - 1991 + 87
Zygosporin A 1 1728, 1106 13.2
Zygosporin A 2.5 1532 + 76 23.1
Phenylbutazone 50 1516, 112 23.9
Note: The abscess was caused by the subcutaneous injection of 2% carrageenin into the sacrum area of rats. Then the test compounds were administered orally. Half of the total dose was given immediately after injection and the second half 3 hours later. The rats were sacrificed 24 hours after injection and the abscess dissected and weighed.
It can be seen from Tables 3 and 4 above that zygosporin A, when administered orally, is about 20 times more effective than phenylbutazone in its inhibitory effect against abscesses.
The inhibitory effect of zygosporin A against granulation was examined by oral administration for 6 consecutive days; the results are given in Tables 5 and 6 below and compared with those obtained with phenylbutazone.
Table 5
Inhibitory effect against granulation
Granuloma inhibition test compound daily dose mean weight of granulation (mg / kg) (mg) (%)
Control trial - 277.6 + 15.1
Zygosporin A 1 264.6 + 19.3 4.7
Zygosporin A 2.5 265.1 is 20.5 4.5
Phenylbutazone 25 235.6 + 15.8 15.1
Note: The granulomas were produced by inserting carrageenin-soaked filter paper beads into the lacterovetral region of rats. Then, the test compounds were orally administered once a day for 6 days. Twenty hours after the last administration, the rats were sacrificed and the granuloma was dissected and weighed.
Table 6
Inhibitory effect against granulation
Granuloma dose. Granuloma inhibition test compound daily dose mean weight of granulation (mg) (mg) (%)
Control attempt - 294 + 8.4
Zygosporin A 5 263.9 + 16.9 10
Phenylbutazone 50 199.5 i 11.5 34
Note: The granulomas were produced by placing carrageenin-soaked filter paper beads in the lacterovetral region of rats. Then, the test compounds were orally administered once a day for 6 days. Twenty hours after the last administration, the rats were sacrificed and the granuloma was dissected and weighed.
It can be seen from Tables 5 and 6 that the inhibitory effect of zygosporin A is at least several times that of phenylbutazone.
The inhibitory effect of zygosporin A against local exudation in rats was also determined; the results are shown in Table 7 below and compared with those obtained with phenylbutazone.
Table 7
Inhibitory effect against exudation Test compound Dose (mg / kg) Volume of exudate (ml)
Control attempt - 53.9 + 3.5
Zygosporin A 50 6.8 + 0.6
Zygosporin A 5 15.7 + 0.8
Zygosporin A 0.5 26.2 t 3.0
Phenylbutazone 50 27.6 + 1.7
Phenylbutazone 5 43.9 + 4.9
Note: On the first day, 20 ml of nitrogen gas was subcutaneously injected into the rats to form a bag in which 0.5 ml of 10% croton oil was injected. On day 6, the test compound was injected locally into the bag. On day 11, the rats were sacrificed and the volume of exudate was measured.
From the table above, it can be seen that the inhibitory effect of zygosporin A against exudation is approximately 100 times greater than that of phenylbutazone.
The acute toxicity of zygosporin A was studied in mice; the mean lethal dose, i.e. the LD50 value, is 1.85 mg / kg subcutaneously and 36.0 mg / kg orally.
Thus, Zygosporin A is remarkably effective when compared to a commercially available non-adrenocortical anti-inflammatory agent. Therefore, it can be used as an effective non-adrenocortical anti-inflammatory agent.
The active ingredient Zygosporin A is administered in a unit dosage form with a suitable pharmaceutical carrier to the living organism for the control of various inflammations and edema, e.g. B. rheumatism administered. Usually the preparation is given orally, although it is just as effective when given by other means.
Various solid supports that can be used include e.g. B. lactose, mannitol, corn starch, talc and magnesium stearate and other tablet excipients and fillers. Optionally, certain other ingredients, such as e.g. B. hydrocortisone, prednisolone, aminopyrine, chloroquine, phenylbutazone and the like, are mixed with the active ingredient mentioned.
The following examples are intended to illustrate the preferred embodiments of the present invention.
example 1
A seed culture is produced using the following three-step process: 1. A potato placed at an angle in the test tube
Sucrose agar culture is generated by adding 1.5%
Agar in a potato-sucrose medium added to who made from (by boiling 200 g of cut potatoes in 500 ml of water for 20 minutes) potato juice, 10 g of sucrose and enough
Water, so that you get 1 liter in total. Zygosporium masonii MFC-6t12 (ATCC
No. 20011) is inoculated into the culture and 7 bis
Cultivated for 10 days at 27-28 C until spore formation has stopped.
2. 100 ml of potato-sucrose medium, the same
Composition as described above are placed in a 500 ml flask, sterilized and inoculated with an appropriate amount of spores from the above culture. Breeding takes place
3 days at 27-280 C with shaking.
3. 50 ml of the culture broth are placed in 500 ml of a new potato-sucrose medium, which consists of the materials described above, poured into a 2-liter flask and sterilized beforehand. Cultivation takes place for 4 days at 27-280 C, and the culture broth obtained in this way is called
Inoculation material used.
20 liters of potato-sucrose medium of the composition described above are placed in a 30-liter fermentation vessel, sterilized and inoculated with 500 ml of the inoculum prepared above. Cultivation takes place for 4 days at 27-28 C with stirring (250 revolutions / min), with ventilation (20 liters / min) and at a pressure of 0.5 to 0.7 kg / cm2.
500 g Celite (diatomaceous earth) are added to the culture broth and centrifuged in order to obtain (1.1 kg including the Celite) mycelia and 17 liters of liquid floating above.
1.5 liters of methanol are added to the mycelia and the mixture is stirred for 2 hours at room temperature. After filtering, the filtrate is concentrated under reduced pressure and the residue is extracted with ethyl acetate. The extract is washed with water, 2N sodium carbonate solution and again with water, dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated under reduced pressure at 50-600 ° C., leaving an oily residue which is crystallized by treatment with acetone; 18.1 mg of zygosporin A are obtained.
On the other hand, the 17 liters of liquid floating above are extracted three times with 7 liters of ethyl acetate each time.
The extract, which makes up about 20 liters, is washed with water, with 2N sodium carbonate solution and again with water, dried over anhydrous sodium sulphate and evaporated under reduced pressure at 50-600C. The residue is treated with ether or acetone, 277 mg of crystalline zygosporin A being obtained.
Pure zygosporin A, F = 268-2700 C, in the form of colorless needles is obtained by recrystallization from acetone.
Example 2
The procedure described in Example 1 is carried out with Zygosporium mycophilum MFC-702 (ATCC only 20012) instead of Zygosporium masonii MFC-612 (ATCC No. 20011); Zygosporin A is recovered from the culture broth with approximately the same yield as in Example 1.
Example 3
A seed culture is produced using the following three-step process: 1. A potato placed at an angle in the test tube
Sucrose agar culture is made from 200 g potatoes,
10 g sucrose, 5 g agar and 1 liter of water are produced. The culture is inoculated with Zygosporium masonli MFC> 612 (ATCC No. 20011) and grown at 280 ° C. for 7 days.
2. 100 ml of a 3.0% glucose, 2.0% peptone and 0.5%
Aqueous containing sodium chloride (pH 6.0)
Nutrient media are placed in a 500 ml flask, sterilized and mixed with an appropriate amount
Inoculated spores from the above culture. Cultivation is carried out for 4 days at 280 ° C. with shaking (140 movements per minute with an amplitude of
7 cm).
3. 30 ml of culture broth are added to 700 ml of a new one
Given a nutrient environment that consists of the same materia lien as in method 2 above, in one
2 liter flask poured and sterilized beforehand.
Cultivation is carried out for 3 days at 280 ° C. with shaking (300 revolutions / min), and the culture broth obtained in this way is used as inoculation material.
70 liters of an aqueous nutrient medium containing 3.0% glucose, 2% peptone and 0.5% sodium chloride (pH 6.8) are placed in a 100 liter container.
84 grams of P-2000 (polypropylene glycol, an anti-foam agent made by The Dow Chemical Company) is added and the mixture is sterilized. The medium is inoculated with 2.1 liters of the inoculation material described above and the culture is kept for 3 days at 280 C with stirring (370-380 revolutions / min), with ventilation (70 liters / min) and at a pressure of 0.7 kg / cm2 carried out.
The culture broth is centrifuged to remove the mycelia, and the 67 liters of liquid floating above are extracted twice with 20 liters of ethyl acetate each time. The extract is washed with water and evaporated under reduced pressure to give 5.7 g of crude Zygosporin A. Recrystallization from acetone gives 5.4 g of pure zygosporin A, F = 268-2700 C (decomp.) In the form of colorless needles.