Verfahren zur Herstellung neuer Tetrakosapeptide
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des Tetrakosapeptids der Formel L-Seryl-L tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutaminyl-(oder L-glutamyl)-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl - L-tryptophyl glycyl-L-lySyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lySyl-L- arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl- L-lysyl - L-valyl - L-ty- rosyl-L-prolin.
Die neuen Verbindungen sowie ihre Säureadditionssalze haben eine hohe adrenocorticotrope Wirksamkeit und können in der Human- und Veterinärmedizin als reine, einheitliche Stoffe anstelle von ACTH verwendet werden. Die Verbindungen können ferner als Zwischenprodukte zur Herstellung von Heilmitteln, die eine längere Kette von Aminosäure aufweisen, wie der adrenocorticotropen Hormone selbst, verwendet werden.
Die neuen Tetrakosapeptide können nach den für die Peptidherstellung bekannten Methoden, z. B. der Carbodiimidmethode, der Azidmethode, der Methode abtivierten Ester oder der Anhydridmethode, erhalten werden, wobei die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Aminosäuren L-Serin, L Tyrosin, L-Serin, L-Methionin, L-Glutamin (oder L Glutaminsäure), L-Histidin, L-Phenylalanin, L-Arginin, L-Tryptophan, Glycin, L-Lysin, L-Prolin, L-Valin, Glycin, L-Lysin, L-Lysin, L-Arginin, L-Arginin, L-Prolin, L-Valin, L-Lysin, L-Valin, L-Tyrosin und L-Prolin in der angegebenen Reihenfolge unter intermediärem Schutz der Amino- bzw. Carboxylgruppen miteinander vereinigt. In den Fig. 1 bis 3 sind Ausführungsformen des Verfahrens dargestellt. BOC bedeutet die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, tBu die tertiäre-Butylgruppe, iBu die Isobutylgruppe, Z die Carbobenzyloxygruppe, PZ die para-Phenylazobenzyloxycarbonylgruppe, T den Trityl (Triphenylmethyl-)rest.
Das gemäss Fig. 1 als Ausgangsstoff verwendete Decapeptid kann nach dem Verfahren des Patentes Nr. 408 948 hergestellt werden; das Tetradecapeptid erhält man beispielsweise nach dem Schema der Fig. 2. Das in Fig. 3 als Ausgangsstoff verwendete Tetrapeptidderivat BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-NH-NH2 kann gemäss dem Verfahren des Patentes Nr. 408 948 hergestellt werden, das Hexapeptidderivat Z-Glu(OtBu)-His Phe-Arg-(NO2)-Try-Gly-OH gemäss dem Verfahren des Patentes Nr. 427 842.
Die an der Reaktion nicht beteiligten freien funktionellen Gruppen können mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste geschützt werden, die Carboxylgruppe vorzugsweise durch Veresterung, z. B. mit Methanol, tert.-Butanol, Benzylalkohol, p Nitrobenzylalkohol, die Aminogruppe beispielsweise durch Einführung des Tosyl-, Tritylrestes oder der Carbobenzoxygruppe oder farbiger Schutzgruppen, wie der p-Phenylazobenzyloxycarbonylgruppe und der p-(p' Methoxy-phenylazo)-benzyloxycarbonylgruppe, oder insbesondere des tert.-Butyloxycarbonylrestes. Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanidinogruppierung des Arginins ist die Nitrogruppe geeignet; die genannte Aminogruppe des Arginins muss aber bei der Reaktion nicht notwendig geschützt werden.
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<tb> Fig. 3
Die Umwandlung einer geschützten NH2-Gruppe in eine freie Gruppe sowie die Überführung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens zur Herstellung der Tetrakosapeptide und Zwischenprodukte kann nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln erfolgen.
Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren Salze gewinnen.
Die verfahrensgemäss erhaltenen Tetrakosapeptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial.
Die chromatographischen Systeme werden wie folgt bezeichnet: System 43: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (100:40:55).
System 45: sek.-Butanol-3 O/o Ammoniak (100:44).
System 49: sek.-Butanol-Triäthylamin-Diäthyl barbitursäure-Wasser-Isopropanol (100:0,8:1,8 g:60:10).
System 54: sek.-Butanol-Isopropanol-Monochlor essigsäure-Wasser (70:10:3 g:40).
System 100: Sithylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser (60:20:6:11).
System 102: Äthylacetat-Methyläthylketon-Ameisen säure-Wasser (50:30:10:10).
Beispiel 1 PZ-Lys-(BOC)-Pro- Val-Gly-NH-NH2
1,15 g (1,5 mMol) PZ-Lys-(BOC)-Pro-Val-Gly LOCHS (Patent Nr. 427 841) werden in 15 ml absolutem Methanol mit 0,6 ml Hydrazinhydrat während einer Stunde am Rückfluss gekocht. Das Lösungsmittel dampft man im Vakuum zur Trockene ein und fällt das Hydrazid mit viel Äther aus. Das anfänglich gallertige Produkt wird beim Zerkratzen fest. Man filtriert ab und wäscht auf der Nutsche gut mit Äther nach. Nach dem Trocknen über Schwefelsäure gewinnt man 1,1 g PZ Tetrapeptidhydrazid, F. 130-1310.
Eine Probe aus heissem Wasser umkristallisiert zeigt den gleichen Schmelzpunkt. Das Hydrazid ist in der Kälte noch in 250/oiger Essigsäure gut löslich.
Beispiel 2 Z-Arg-(NO2)-Pro-OCH3
3,06 g (23,7 mMol) Prolinmethylester in 20 ml Acetonitril gibt man zur Lösung von 7,18 g (20,3 mMol) Carbobenzoxy-nitro-L-arginin in 20 ml Dimethylformamid, kühlt mit Eiskochsalz auf - 50 bis - 100 und versetzt hierauf mit der Lösung von 4,9 g Dicyclohexylcarbodiimid in 12 ml Dimethylformamid : Acetonitril = 1:1.
Die Reaktionslösung wird noch mit 20 ml eiskaltem Acetonitril verdünnt und 17 Stunden bei 0 belassen.
Der gebildete Harnstoff wird abfiltriert, mit Acetonnitril gewaschen und zur Lösung 5 Tropfen Eisessig gegeben. Nach 30 Minuten dampft man das Lösungsmittel zur Trockene ein, nimmt den Verdampfungsrückstand in Essigester auf, filtriert nochmals durch Watte vom abgeschiedenen Harnstoff ab und wäscht die Essigesterlösung 3mal mit 10 ml l-n. Salzsäure, 2mal mit Wasser, so lange mit 1-n. Natriumbicarbonatlösung, bis beimAnsäuern der alk. Auszüge keine Trübung mehr feststellbar ist, und zum Schluss mit Wasser neutral.
Beim Eindampfen der getrockneten Essigesterlösung auf ein kleines Volumen fällt der Carbobenzoxydipeptid- ester beinahe quantitativ aus. Ausbeute: 6,16 g (65,5 O/o d. Th.), F. 155-1570 (Sintern 153 ).
Beispiel 3 H-Arg-(NO2)-Pro-OCH3
8,4 g Z-Arg-(NO2)-Pro-OCH3 werden unter Erwärmen in 27 ml Eisessig in der Wärme gelöst und bei Zimmertemperatur mit 27 ml - 4-n. Bromwasserstoff Eisessiglösung versetzt. Nach einer Stunde dampft man im Vakuum bei 400 auf ein kleines Volumen ein und fällt das Decarbobenzoxylösungsprodukt mit viel absolutem Äther aus. Das anfänglich klebrige Produkt wird so lange mit absolutem Äther behandelt, bis ein feines Pulver resultiert. Zur weiteren Reinigung wird das Dihydrobromid des Dipeptidesters noch einmal aus Methanol/Äther umgefällt. Die leicht gelb gefärbte Verbindung nimmt man in 4 ml Wasser auf, gibt dazu 150 ml Chloroform und kühlt das Gemisch im Eisbad auf 0 ab.
Unter intensivem Umschwenken gibt man in Portionen so lange festes Kaliumcarbonat dazu, bis alles Wasser verbraucht ist und sich das Kaliumcarbonat fest abscheidet. Das Kaliumcarbonat wird noch ein zweites Mal mit frischem Chloroform extrahiert, die vereinigten Chloroformextrakte über wasserfreiem Kaliumcarbonat getrocknet und durch eine G4-Glasfilternutsche durch wenig Cellit filtriert. Nach dem Verdampfen des Chloroforms bei 40 erhält man 5,5 g (90 O/o d. Th.) Nitro-Larginyl-prolin-methylester. Die Verbindung wird ohne weitere Umsetzung weiterverarbeitet.
Beispiel 4
Z-A (NO2)-Arg (NO2)-Pro-OCH3
8,34 g (25,2mMol) H-Arg(NO2)-Pro-OCH3 in 25 ml frisch destilliertem Dimethylformamid werden mit der Lösung von 8,92 g (25,2 mMol) Z-Arg(NO2)-OH vereinigt, mit 50 ml Acetonitril verdünnt und im Kältebad auf - 100 gekühlt. Nach 30minütigem Stehen bei dieser Temperatur gibt man unter Rühren 5,71 g (27,7 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 12,5 ml eiskaltem Acetonitril, dazu und lässt 22 Stunden bei 0 reagieren.
Der Harnstoff wird abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum bis auf ein kleines Volumen eingedampft. Den sirupösen Rückstand nimmt man in Chloroform auf, wäscht 3mal mit 10 ml 1-n. Salzsäure, 2mal mit 10 ml Wasser und so lange mit 1-n. Natriumbicarbonat und 1-n. Sodalösung, bis beim Ansäuern der alkalischen Auszüge keine Fällung bzw. Trübung mehr nachweisbar ist. Zum Schluss werden die Chloroformauszüge mit Wasser neutral gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhält man 10,4 g (62 O/o) rohen Carbobenzoxy-tripeptidester.
Eine Probe des Rohproduktes mit 2-n. Bromwasserstoff-Eisessiglösung, eine Stunde bei Zimmertemperatur gespalten, zeigt im Papierchromatogramm in den Systemen 54 und 49 neben dem Tripeptid noch weitere Men gen von Nitroarginin und einem andern Nebenprodukt.
Zur Reinigung werden 4,6 g Rohprodukt aus 140 ml n-Butanol kristallisiert. Ausbeute: 2,2 g reiner Carbobenzoxy-tripeptidester, F. = 1200 (Zers.).
[α]D26 = 43,90 + 10 (c = 1,032 in Methanol).
Im UV-Spektrum zeigt der Carbobenzoxy-tripeptidester bei 271 m das für Nitroarginin charakteristische Maximum (E = 32 200).
Beispiel 5
H-A rg(NQ)-Arg(NQ)-Prn-OCH3
2,19 g (3,3 mMol) Z-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-OCH3 werden in 13,2 ml 2-n. Bromwasserstoffsäure-Eisessiglösung während 1 Stunde bei Zimmertemperatur decarbobenzoxyliert. Nach dem Verdampfen der überschüssigen Säure fällt man das Decarbobenzoxylierungsprodukt mit viel absolutem Äther aus. Das Rohprodukt nimmt man in 2 ml Wasser auf, extrahiert 2mal mit frischem Essigester, wäscht die Essigesterphasen noch einmal mit Wasser und gibt die vereinigten wässrigen Lösungen auf eine lonenaustauschersäule Merck II. Den freien Tripeptidester eluiert man mit 200 ml Wasser und dampft das Wasser im Vakuum bei 40 ab. Ausbeute: 1,3 g (74 % d. Th.).
Im Papierchromatogramm in den Systemen 43, 49 und 54 gibt der freie Tripeptidester mit Ninhydrin nur je einen positiven Fleck. Rf. 43/0,42; 49/0,67 und 54/0,49.
Beispiel 6
T-Lys(BOC)-A rg(NO2)-A rg (NO2)-Pro-OCH3
1,07 g (2,01 mMol) H-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro- OCH3 in 16,5 ml Dimethylformamid/Acetonitril 1:1 werden auf -10 gekühlt. Unter intensivem Rühren trägt man rasch 1,44 g T-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OH (Patent Nr. 427 841) in die Lösung ein, verdünnt mit
10 ml vorgekühltem Acetonitril und gibt nach 10 Minuten 456 mg (2,2 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 5 ml eiskaltem Acetonitril dazu. Nach 20stündiger Re aktionszeit bei 0 filtriert man vom Harnstoff ab und dampft das Lösungsmittel im Vakuum bei 400 ab. Den nicht umgesetzten Tripeptidester fällt man mit viel Essigester aus, dampft hierauf die Essigesterlösung zur Trockene ein und nimmt den Verdampfungsrückstand in wenig Aceton auf.
Nach dem Filtrieren durch Watte wird der N-Trityl-pentapeptidester mit viel Äther ausgefällt.
Eine mit wasserfreier Trifluoressigsäure gespaltene Probe des Trityl-pentapeptidesters zeigt im Papierchromatogramm im System 49 neben dem Pentapeptidme thylester Rf. 0,29 noch sehr wenig der beiden Ausgangs materialien. (Dipeptid-H-Lys-Lys-OH [Rf. = 0,12] und
Tripeptidester Nitro-arginyl-nitro-arginyl-prolinmethyl ester [Rf. = 0,53].)
Zur Analyse werden 200 mg nach Craig zwischen
80 % Methanol und Chloroform:Tetrachlorkohlenstoff
1:1 über 100 Stufen multiplikativ verteilt. Die Haupt menge der Substanz (180 mg) befindet sich in den Ele menten 16-28. Diese werden vereinigt und noch einmal aus Aceton/Äther umgefällt. F. 134-136 .
[α]D26 = -41,2 # 0,4 (c = 2,709 in Methanol).
UV-Spektrum: #max 271 m # = 32 500 in Fein sprit.
Beispiel 7 H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-A rg (NO2)-A rg (NO2)-
Pro-OCH3
1,46 g (1,19 mMol) Na-Trityl-pentapeptidmethyl- ester (Beispiel 6) werden in 50 ml 750/oige Essigsäure während 45 Minuten bei 30 gespalten, dann bei 30 die Essigsäure im Hochvakuum abgedampft und der Verdampfungsrückstand zwischen 1%ige Essigsäure und Äther verteilt. Nach dem Verdampfen der Ätherlösung gewinnt man in quantitativer Ausbeute das Triphenylcarbinol. Die Essigsäurelösung wird ebenfalls im Hochvakuum bei 400 verdampft und der Rückstand im Scheidetrichter zwischen n-Butanol und N-Sodalösung verteilt. Der pH der wässrigen Phase muss pH 8,5 sein.
Die Butanolauszüge wäscht man mit Wasser neutral und trocknet sie über Natriumsulfat. Ausbeute: 1,03 g (880/oig).
Die Verbindung wird ohne weitere Reinigung direkt weiter verarbeitet.
Beispiel 8
PZ-Lys(BOC)-Pro- Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-
A rg (NO2)-A rg (NO2)-Pro-OCH3
900 mg (1,2 mMol) PZ-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly- hydrazid werden in 10 ml Dimethylformamid auf -10 gekühlt, dann lässt man langsam 4 ml 1-n. Salzsäure einlaufen und tropft anschliessend bei 100 unter gutem Rühren 1,4 ml eiskalte 1-n. Natriumnitritlösung dazu.
Nach 30 Sekunden beginnt sich das Azid als klebrige Verbindung abzuscheiden. Man lässt noch 3 Minuten bei -10 reagieren und versetzt hierauf das Reaktionsgemisch mit 150 ml Eiswasser. Das klebrige schlecht filtrierbare Azid wird mit eiskaltem Essigester extrahiert und die Essigesterphasen mit Wasser neutral gewaschen (3mal), dann in der Kälte über Magnesiumsulfat getrocknet und durch eine kalte G4-Glasnutsche in die eisgekühlte Lösung von 1,03 g ( # 1 mMol) H Lys(BOC) -Lys(BOC) -Arg(NO2) -Arg(NO2) - Pro - OCH3 filtriert. Man lässt 22 Stunden bei 0 und 3 Stunden bei 30 reagieren. Die Reaktionslösung wird mit Wasser (40 ml), 4mal mit 10 ml 1%iger Essigsäurelösung, 5mal mit 10 ml 1-n.
Natriumbicarbonatlösung und zum Schluss mit Wasser und ges. Kochsalzlösung gewaschen.
Beim Eindampfen der getrockneten Lösung fällt das Nonapeptidderivat aus. Ausbeute: 1,70 g Rohprodukt.
Zur weiteren Reinigung nimmt man 1,52 g Rohprodukt in wenig Chloroform auf und filtriert durch eine Säule von 45 g Silikagel. Einmaliges Umfällen des Eluates aus 10 ml Chloroform mit Äther ergibt 1,06 g PZ Nonapeptidmethylester. F. 134-140 (Zers.).
Im Dünnschichtchromatogramm (Kieselgel G; Merck) im System Dioxan : Wasser = 9:1 ist nur eine Substanz mit dem Rf.-Wert 0,75 nachweisbar. In den Systemen Chloroform:Aceton 7:3 und Benzol:Aceton
1:1 bleibt die Verbindung am Start. Die Substanz schmilzt, aus Acetonitril kristallisiert, bei 136-138 ; im UV-Spektrum in Äthanol weist sie Maxima auf bei # = 272 m (# = 26 600) und # = 320 m (# = 22 400).
Beispiel 9
PZ-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)
A rg (NO2)-A rg (NO2)-Pro-OH
1,06 g (0,62 mMol) PZ-Nonapeptidester (Beispiel 8) in 6 ml 750/oigem Dioxan werden mit 1,24 ml 1,95-n.
Natronlauge während 15 Minuten bei Zimmertempera tur verseift. Anschliessend giesst man die Reaktionslösung in 110 ml Eiswasser, die 2,5 ml 1-n. Salzsäure enthalten, und filtriert die flockige Ausfällung durch eine G3-Glasfritte. Den Niederschlag wäscht man gut mit Wasser und trocknet ihn über Phosphorpentoxyd im Hochvakuum. Ausbeute: 970 mg amorphes Produkt.
Rf. = 0,52 im Dünnschichtchromatogramm für Dioxan: Wasser = 9:1.
200 mg im System Methanol : Wasser : Chloroform : Tetrachlorkohlenstoff = 8:2:5:5 über 121 Stufen verteilt geben 162 mg reines Peptidderivat K = 0,65.
UV-Spektrum: #max 320 m # = 21 700 und 271 m # = 37 200 in Feinsprit.
Die Substanz schmilzt, aus Acetonitril kristallisiert, bei 140-145 (Zers.).
Beispiel 10
PZ-Val-Lys(BOC)-OH
4,75 g (13,4 mMol) PZ-Valin in 65 ml absolutem Dioxan werden in Eiswasser so gekühlt, dass ein Teil des Dioxans fest ist. Dann gibt man 3,45 ml (14,4 mMol) N-Tributylamin und nach weitern 5 Minuten 1,38 ml (13,4mMol) Chlorameisensäureäthylester dazu und lässt 15 Minuten unter Kühlung reagieren.
Vorgängig werden 4 g (17,2 mMol) N6-BOC-Lysin unter Rühren langsam in 32 ml Wasser, das 2,45 ml (17,2 mMol) N-Triäthylamin enthält, eingetragen. Die letzten Portionen des Ne-BOC-Lysins lösen sich nicht mehr gut. Beim Abkühlen mit Eis scheidet sich wieder wenig feste Substanz aus der wässrigen Lösung aus.
Diese Lösung gibt man rasch unter intensivem Rühren und Kühlen zu der frisch zubereiteten Lösung des gemischten Anhydrids und lässt 30 Minuten bei Zimmertemperatur reagieren. Die Reaktionslösung wird im Vakuum bei 40 auf ein kleines Volumen eingedampft, unter Eiskühlung mit 100ml Wasser und 40ml 100/oiger Zitronensäurelösung versetzt. Die schmierige Ausfällung wird beim Zerkratzen mit Äther fest. Das rohe PZ Valyl-N#-BOC-Lysin wird abfiltriert, mit viel Wasser und Äther gewaschen und bei 50 im Hochvakuum getrocknet. Ausbeute: 4,41 g; F. 167-1690 (Sintern 1650).
Die Ätherphase wird abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Beim Abdampfen des Äthers scheiden sich noch weitere 1,07 g PZ-Dipeptid aus. F. 167-1690.
Die Gesamtausbeute beträgt 5,48 g (70 % d. Th.).
Die Analysenfraktion schmilzt nach einmaligem Kristallisieren aus Essigester bei 167-169 .
Das UV-Spektrum in Feinsprit zeigt bei #max 230 m # = 13 400 und #max 322 m # = 23 000.
Beispiel 11
ZVal-Tyr-Pro-OtBu Zu Zu 11,25 g (27,4 mMol) Carbobenzoxy-valyl-tyrosin (Patent Nr. 358 431) in 100 ml frisch destilliertem Acetonitril gibt man die Lösung von 4,65 g (27,4 mMol) Prolin-tert.-butylester in 25 ml Acetonitril und kühlt im Eisbad auf 0 ab. Dann gibt man die Lösung von 6,21 g Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml kaltem Acetonitril dazu und lässt 15 Stunden bei 0 reagieren. Der auskristallisierte Harnstoff wird abfiltriert (90 0/0 d. Th.) und die Reaktionslösung mit 1 ml Eisessig versetzt.
Nach 15 Minuten dampft man das Acetonitril im Vakuum ab, nimmt den Verdampfungsrückstand in Essigester auf und filtriert nochmals vom ausgeschiedenen Harnstoff ab. Die Essigesterlösung wird 2mal mit 10 ml eiskalter 2-n. Salzsäure extrahiert, anschliessend so lange mit 2-n. Sodalösung - bis angesäuerte Proben keine Ausfällung mehr anzeigen - und zum Schluss mit Wasser neutral gewaschen. Die Essigesterextrakte trocknet man über Natriumsulfat und dampft das Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab. Ausbeute: 14,1 g (88 /o d. Th.) amorphen Carbobenzoxy-tripeptidester.
Der Carbobenzoxytripeptidester ist in den meisten organischen Lösungsmitteln, ausser Äther, Petroläther und Benzol, gut löslich. Er wird ohne weitere Reinigung direkt weiter verarbeitet.
Beispiel 12 H- Val-Tyr-Pro-OtB u
14,13 g (24,9 mMol) Z-Val-Tyr-Pro-OtBu werden in 250 ml 900/oigem Methanol, enthaltend 4,5 ml Eisessig, in Gegenwart von 2 g 100/oigem Pd-Kohlekatalysator hydrogenolytisch gespalten. Das gebildete Kohlendioxyd wird mit Kalilauge in einer zweiten, dazwischen geschalteten Hydrierente absorbiert. Nach 2 Stunden ist die Wasserstoffaufnahme beendet. Die vom Katalysator befreite Lösung dampft man im Vakuum bei 40 zur Trockene ein und verteilt den Verdampfungsrückstand zwischen 200 ml Essigester und 2mal 20 ml eiskalter 2-n. Sodalösung. Die Sodalösungen werden nochmals mit frischem Essigester extrahiert, die Essigesterphasen mit Wasser neutral gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum gewinnt man 7,69 g (71 0/o d.
Th.) freier Tripeptidester.
Im Papierchromatogramm in den Systemen 43, 45 und 54 wandert der Tripeptidester mit der Lösungsmittelfront und gibt mit Ninhydrin und Paulyreagens je 1 Fleck.
Beispiel 13
PZ-Val-Lys(BOC)- Val-Tyr-Pro-OtBu
Die Lösung von 10,36 g (17,7 mMol) PZ-Val Lys(BOC)-OH und 7,69 g (17,7 mMol) H-Val-Tyr-Pro OtBu in 140 ml frisch destilliertem Dimethylformamid wird bei 0 mit 4,2 g Dicyclohexylcarbodiimid (15%iger Überschuss) in 12 ml Dimethylformamid versetzt und 2 Tage bei 0 belassen. Die vom Harnstoff befreite Lösung lässt man noch weitere 30 Minuten mit 0,5 ml Eisessig stehen, dampft das Lösungsmittel im Vakuum bis auf ein kleines Volumen ab und nimmt den sirupösen Rückstand in viel Essigester auf. Die Essigesterphase wird 4mal mit 25 ml 0,2-n. Ammoniumhydroxydlösung, 2mal mit 30 ml Wasser, 2mal mit 30 ml eiskalter 100/oiger Zitronensäurelösung und zum Schluss mit Wasser neutral gewaschen.
Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat und Verdampfen des Lösungsmittels erhält man 17 g rohes amorphes Reaktionsprodukt. Zur weitern Reinigung gibt man das Rohprodukt, in 100 ml Chloroform gelöst, auf eine mit 100/oigem Wasser desaktivierte Silikagelsäule (570 g; ° 5,6 cm, h = 41 cm).
Mit Chloroform eluiert, wandert die orangerote Zone nur langsam, während mit Chloroform : Essigester 2:1 sich 2 Fraktionen auswaschen lassen.
Die erste Fraktion 4,8 g ist noch stark mit Dicyclohexylharnstoff und PZ-Dipeptid verunreinigt und lässt sich aus Acetonitril nur in schlechter Ausbeute kristallisieren, während die zweite Fraktion (7,2 g) aus 200 ml Acetonitril als gallertiges Produkt wieder ausfällt. Ausbeute: 5,1 g, PZ-Pentapeptidester, F. 154-i580.
Die Analysenfraktion schmilzt nach einer weitern Kristallisation bei 157-159 .
Im UV-Spektrum (in Feinsprit aufgenommen) zeigt die Verbindung 2 Maxima bei 227 m und 322 m mit den Werten 20 700 und 21 100.
Im Dünnschichtchromatogramm (Kieselgel G; Merck) sind die Rf.-Werte: 0,23 (Chloroform:Aceton = 95:5) und 0,60 (Benzol:Aceton = 1:1).
Beispiel 14
H-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu
1,4 g PZ-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu werden in 100 ml Methanol in Gegenwart von 400 mg 100/oigem Palladiumkohlekatalysator während 6 Stunden bei 5 Atm mit Wasserstoff im Autoklaven geschüttelt Man filtriert vom Katalysator ab, wäscht ihn wiederholt mit Methanol und dampft das Lösungsmittel im Vakuum ab. Der Verdampfungsrückstand wird mit viel Äther zerkratzt und im Hochvakuum getrocknet. Es resultiert ein feines amorphes Pulver. Ausbeute: 980 mg.
In den Systemen 54 und 49 wandert die Verbindung mit der Lösungsmittelfront.
Im Dünnschichtchromatogramm (Kieselgel G) im System Dioxan : Wasser = 9:1 ist der Rf.-Wert 0,65.
Beispiel 15
PZ-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)
Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr
Pro-OtBu
276 mg (0,16 mMol) PZ-Lys-Pro-Val-Gly-Lys (BOC)-Lys(BOC)-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-OCH3 (über Phosphorpentoxyd im Hochvakuum bei 800 getrocknet) werden im Gemisch 1 ml abs. Dimethylformamid, 2 ml abs. Tetrahydrofuran gelöst und im Eiskochsalz-Kältebad auf 100 gekühlt. Dann gibt man 0,16 mMol Tri äthylamin in 1,6 ml Tetrahydrofuran dazu und nach weitern 5 Minuten 0,16 mMol Chlorameisensäureisobutylester in 1,6 ml abs. Tetrahydrofuran. Man lässt 15 Minuten im Kältebad reagieren und gibt dann 140 mg H-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu, gelöst in 2 ml abs.
Tetrahydrofuran, dazu. Man rührt noch 15 Minuten im Eisbad und anschliessend eine Stunde bei Zimmertemperatur, dann dampft man das Lösungsmittel im Vakuum bei 400 ab und fällt das Reaktionsprodukt mit viel Äther aus. Das getrocknete Rohprodukt (395 mg) wird in 4 ml alkoholfreiem Chloroform auf eine Alu- miniumoxydsäule (Aktivität III; 40 g) gegeben und mit 100 ml Chloroform durchgewaschen. Die gelbe Zone mit dem Peptidderivat wandert dabei nur langsam. Anschliessend wird mit 80 ml Chloroform:Methanol = 95:5 durchgewaschen. Dabei lassen sich 290 mg chromatographisch einheitliches Produkt eluieren. Rf. =0,75, Dioxan : Wasser = 9:1 im Dünnschichtchromatogramm.
Die Substanz schmilzt, aus Acetonitril kristallisiert, bei 160-165 . Das UV-Spektrum in Äthanol weist Maxima bei ;1 (8=36800) undM9m (8= 20 400) auf.
Beispiel 16
H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-
Arg-Arg-Pro- rg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu,
3 CH3COOH
320 mg PZ-Tetradecapeptid-tert.-butylester (Beispiel 14) werden in 6 ml 900/oiger Essigsäure und in Gegenwart von 100 mg 10%igem Palladiumkohlekatalysator während 5 Stunden bei 5 Atm. mit Wasserstoff geschüttelt. Anschliessend füllt man die Reaktionslösung in eine Hydrierente und schüttelt noch weitere 17 Stunden mit 100 mg frischem Pd-Katalysator unter Normalbedingungen weiter. Zur Absorption des gebildeten Kohlendioxyds wird noch eine 2. Hydrierente mit Kalilauge dazwischengeschaltet. Den abfiltrierten Katalysator wäscht man gut mit 90%iger Essigsäure und Methanol und dampft das Lösungsmittel im Vakuum zur Trockne ein. Nach dem Trocknen erhält man 220 mg eines weissen amorphen Pulvers.
Das UV-Spektrum zeigt in Feinsprit bei 278 m das für Tyrosin charakteristische Maximum (# = 1500).
Im Papierchromatogramm in den Systemen 49, 50 und 54 wandert die Verbindung mit der Lösungsmittelwand und gibt positive Reaktionen mit Ninhydrin, Pauly- und Sakaguchi-Reagens.
Beispiel 17
BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try
Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)
A rg-A rg-Prn-Val-Lys()3OC)-Val-Tyr-Pm-OiBu
210 mg Tetradecapeptid-tert.-butylester (Beispiel
16) werden bei 0 in 10 ml l/ro-n. Salzsäure rasch gelöst und die resultierende Lösung im Hochvakuum lyophil getrocknet. Den feinen weissen Rückstand trocknet man noch 2 Stunden bei 50 im Hochvakuum über Phosphorpentoxyd. Gleichzeitig werden 160 mg (0,11 niMol) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu Glu(OtBu) -His -Phe -Arg-Try- Gly-OH (Patent Nr. 408 948) in der Wärme in 1 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst, wieder auf Zimmertemperatur abgekühlt und zum Trihydrochlorid des Tetradecapeptides gegeben.
Man verdünnt mit weitern 2,5 ml Dimethylformamid und erhält nach 10-15 Minuten eine klare Lösung. Nach 2stündigem Stehen im Eisbad gibt man 42 mg (0,2 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 0,6 ml eiskaltem Acetonitril dazu, lässt 13 Stunden bei 0 und 48 Stunden bei Zimmertemperatur reagieren. Das rohe Reaktionsprodukt wird dann mit viel Essigester ausgefällt und im Hochvakuum bei 40 getrocknet, Rohausbeute: 330 mg.
Beispiel 18 H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-A rg-Try-Gly-Lys
Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val
Tyr-Pro-OH, CH3COOH
100 mg rohes geschütztes Tetrakosapeptid (Beispiel 17), das noch mit Ausgangspeptiden verunreinigt ist, werden 1 Stunde bei Zimmertemperatur mit 2 ml wasserfreier Trifluoressigsäure behandelt. Die überschüssige Säure wird bei Zimmertemperatur im Vakuum abgedampft und der resultierende Rückstand mit viel absolutem Äther zerkratzt. Das amorphe Spaltprodukt wird in 4,5 ml 0,5-n. Essigsäure einer kontinuierlichen Hochspannungselektrophorese unterworfen (700 Volt; 30 mA), Auftragsgeschwindigkeit: 1 ml/h. Total werden 23 Fraktionen aufgefangen.
Die Fraktionen 1-9, 10, 1213, 14-15, 16 und 17-23 werden eingedampft. Die elektrophoretische Analyse zeigt, dass in den Fraktionen 1L15 die Hauptmenge des gewünschten Tetrakosapeptides enthalten ist. Zur weitern Reinigung gibt man die vereinigten Fraktionen 1215, in 2 ml llioo molarem Ammoniumacetatpuffer gelöst, auf eine Carboxymethylcellulosesäule ( 1 cm; 1,16 cm; 2,5 g). Die Carboxymethylcellulose wird mit 100 ml l/roo mol. Ammonium acetatpuffer in die Säule eingefüllt und noch mit weitern 50 ml des gleichen Puffers durchgewaschen.
Das Peptid wird dann mit Ammoniumacetatpuffer (pH = 5,4) steigender Molarität (0,1 m-0,7 m) von der Säule eluiert.
Es werden Fraktionen von 10 ml Volumen mit einem automatischen Fraktionensammler aufgefangen.
Nach 15 Fraktionen ist das Peptid wieder quant. von der Säule getrennt. Man erhält total 15 Fraktionen. Die Gläschen 10-13 enthalten elektrophoretisch reines Tetrakosapeptid. Der zurückgelegte Weg nach einer Stunde bei 3000 Volt und pH 1,9 beträgt 13-17 cm.
Im In-vitro-Test nach Saffran und Schally zeigt das erhaltene Peptid eine starke ACTH-Aktivität.
Process for the production of new tetrakosapeptides
The invention relates to a process for the preparation of the tetrakosapeptide of the formula L-Seryl-L tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutaminyl- (or L-glutamyl) -L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl - L-tryptophyl glycyl-L-lySyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lySyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl - L-tyrosyl-L-proline.
The new compounds and their acid addition salts have a high adrenocorticotropic activity and can be used in human and veterinary medicine as pure, uniform substances instead of ACTH. The compounds can also be used as intermediates in the manufacture of medicaments having a longer chain of amino acids, such as the adrenocorticotropic hormones themselves.
The new tetrakosapeptides can be prepared according to the methods known for peptide production, e.g. B. the carbodiimide method, the azide method, the abtivated ester method or the anhydride method, the amino acids being linked in the order mentioned individually or after prior formation of smaller peptide units.
The method according to the invention is characterized in that the amino acids L-serine, L-tyrosine, L-serine, L-methionine, L-glutamine (or L-glutamic acid), L-histidine, L-phenylalanine, L-arginine, L-tryptophan , Glycine, L-lysine, L-proline, L-valine, glycine, L-lysine, L-lysine, L-arginine, L-arginine, L-proline, L-valine, L-lysine, L-valine, L -Tyrosine and L-proline combined with one another in the specified order with intermediate protection of the amino or carboxyl groups. In Figs. 1 to 3 embodiments of the method are shown. BOC means the tert-butyloxycarbonyl group, tBu the tertiary-butyl group, iBu the isobutyl group, Z the carbobenzyloxy group, PZ the para-phenylazobenzyloxycarbonyl group, T the trityl (triphenylmethyl) radical.
The decapeptide used as the starting material according to FIG. 1 can be produced by the method of patent no. 408 948; the tetradecapeptide is obtained, for example, according to the scheme in FIG. 2. The tetrapeptide derivative BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-NH-NH2 used as the starting material in FIG. 3 can be prepared according to the method of Patent No. 408 948, the hexapeptide derivative Z-Glu (OtBu) -His Phe-Arg- (NO2) -Try-Gly-OH according to the method of patent no. 427 842.
The free functional groups that are not involved in the reaction can be protected by means of radicals which can be easily split off by hydrolysis or reduction; the carboxyl group is preferably protected by esterification, e.g. B. with methanol, tert-butanol, benzyl alcohol, p-nitrobenzyl alcohol, the amino group, for example by introducing the tosyl, trityl or carbobenzoxy group or colored protective groups, such as the p-phenylazobenzyloxycarbonyl group and the p- (p 'methoxyphenylazo) -benzyloxycarbonyl group , or in particular of the tert-butyloxycarbonyl radical. The nitro group is suitable for protecting the amino group in the guanidino grouping of arginine; However, the said amino group of arginine does not necessarily have to be protected during the reaction.
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<tb> Fig. 3
The conversion of a protected NH2 group into a free group and the conversion of a functionally modified carboxyl group into a free carboxyl group in the course of the process for the preparation of the tetrakosapeptides and intermediates can be carried out by methods known per se by treatment with hydrolyzing or reducing agents.
Depending on the procedure, the new compounds are obtained in the form of bases or their salts. The bases can be obtained from the salts in a manner known per se. From the latter, in turn, salts can be obtained by reaction with acids.
The tetrakosapeptides obtained according to the method can be used in the form of pharmaceutical preparations. These contain the peptides in a mixture with a pharmaceutical, organic or inorganic carrier material suitable for enteral or parenteral administration.
The chromatographic systems are designated as follows: System 43: tert-amyl alcohol-isopropanol-water (100: 40: 55).
System 45: sec-butanol-3 O / o ammonia (100: 44).
System 49: sec-butanol-triethylamine-diethyl barbituric acid-water-isopropanol (100: 0.8: 1.8 g: 60: 10).
System 54: sec-butanol-isopropanol-monochloroacetic acid-water (70: 10: 3 g: 40).
System 100: sithylacetate-pyridine-acetic acid-water (60: 20: 6: 11).
System 102: ethyl acetate-methyl ethyl ketone-formic acid-water (50: 30: 10: 10).
Example 1 PZ-Lys- (BOC) -Pro-Val-Gly-NH-NH2
1.15 g (1.5 mmol) of PZ-Lys- (BOC) -Pro-Val-Gly LOCHS (Patent No. 427 841) are refluxed in 15 ml of absolute methanol with 0.6 ml of hydrazine hydrate for one hour. The solvent is evaporated to dryness in vacuo and the hydrazide is precipitated with a lot of ether. The initially gelatinous product solidifies when scratched. It is filtered off and washed well on the suction filter with ether. After drying over sulfuric acid, 1.1 g of PZ tetrapeptide hydrazide, mp 130-1310, are obtained.
A sample recrystallized from hot water shows the same melting point. The hydrazide is still readily soluble in 250% acetic acid in the cold.
Example 2 Z-Arg- (NO2) -Pro-OCH3
3.06 g (23.7 mmol) of proline methyl ester in 20 ml of acetonitrile are added to the solution of 7.18 g (20.3 mmol) of carbobenzoxy-nitro-L-arginine in 20 ml of dimethylformamide, and the mixture is cooled with ice table salt - 50 to - 100 and then mixed with the solution of 4.9 g of dicyclohexylcarbodiimide in 12 ml of dimethylformamide: acetonitrile = 1: 1.
The reaction solution is diluted with 20 ml of ice-cold acetonitrile and left at 0 for 17 hours.
The urea formed is filtered off, washed with acetonitrile and 5 drops of glacial acetic acid are added to the solution. After 30 minutes, the solvent is evaporated to dryness, the evaporation residue is taken up in ethyl acetate, the urea which has separated out is filtered off again through cotton wool and the ethyl acetate solution is washed 3 times with 10 ml l-n. Hydrochloric acid, twice with water, as long as 1-n. Sodium bicarbonate solution until acidifying the alk. Extracts are no longer cloudy, and finally neutral with water.
When the dried ethyl acetate solution is evaporated to a small volume, the carbobenzoxydipeptide ester precipitates out almost quantitatively. Yield: 6.16 g (65.5 o / o of theory), mp 155-1570 (sintering 153).
Example 3 H-Arg- (NO2) -Pro-OCH3
8.4 g of Z-Arg- (NO2) -Pro-OCH3 are dissolved while warming in 27 ml of glacial acetic acid and at room temperature with 27 ml - 4-n. Hydrogen bromide glacial acetic acid solution added. After one hour, the mixture is evaporated to a small volume in vacuo at 400 and the decarbobenzoxy solution product is precipitated with a lot of absolute ether. The initially sticky product is treated with absolute ether until a fine powder results. For further purification, the dihydrobromide of the dipeptide ester is reprecipitated from methanol / ether. The slightly yellow colored compound is taken up in 4 ml of water, 150 ml of chloroform are added and the mixture is cooled to 0 in an ice bath.
While swirling vigorously, add solid potassium carbonate in portions until all the water is used up and the potassium carbonate separates out firmly. The potassium carbonate is extracted a second time with fresh chloroform, the combined chloroform extracts are dried over anhydrous potassium carbonate and filtered through a G4 glass suction filter through a little cellite. After evaporation of the chloroform at 40, 5.5 g (90% of the theory) of nitro-larginyl-proline methyl ester are obtained. The connection is processed further without any further conversion.
Example 4
Z-A (NO2) -Arg (NO2) -Pro-OCH3
8.34 g (25.2 mmol) of H-Arg (NO2) -Pro-OCH3 in 25 ml of freshly distilled dimethylformamide are combined with the solution of 8.92 g (25.2 mmol) of Z-Arg (NO2) -OH, diluted with 50 ml acetonitrile and cooled to - 100 in a cold bath. After standing at this temperature for 30 minutes, 5.71 g (27.7 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide, dissolved in 12.5 ml of ice-cold acetonitrile, are added with stirring, and the mixture is left to react at 0 for 22 hours.
The urea is filtered off and the solvent is evaporated to a small volume in vacuo. The syrupy residue is taken up in chloroform, washed 3 times with 10 ml of 1-n. Hydrochloric acid, twice with 10 ml of water and for so long with 1-n. Sodium bicarbonate and 1-n. Soda solution until no more precipitation or turbidity can be detected when the alkaline extracts are acidified. Finally, the chloroform extracts are washed neutral with water and dried over sodium sulfate. After evaporation of the solvent, 10.4 g (62 o / o) of crude carbobenzoxy tripeptide ester are obtained.
A sample of the crude product with 2-n. Hydrogen bromide-glacial acetic acid solution, cleaved for one hour at room temperature, shows in the paper chromatogram in systems 54 and 49, in addition to the tripeptide, further Men conditions of nitroarginine and another by-product.
For purification, 4.6 g of crude product are crystallized from 140 ml of n-butanol. Yield: 2.2 g of pure carbobenzoxy tripeptide ester, m.p. = 1200 (decomp.).
[α] 26 D = 43.90 + 10 (c = 1.032 in methanol).
In the UV spectrum, the carbobenzoxy tripeptide ester shows the maximum characteristic of nitroarginine at 271 m (E = 32,200).
Example 5
H-A rg (NQ) -Arg (NQ) -Prn-OCH3
2.19 g (3.3 mmol) of Z-Arg (NO2) -Arg (NO2) -Pro-OCH3 are in 13.2 ml of 2-n. Hydrobromic acid-glacial acetic acid solution decarbobenzoxylated for 1 hour at room temperature. After the excess acid has evaporated, the decarbobenzoxylation product is precipitated with a large amount of absolute ether. The crude product is taken up in 2 ml of water, extracted twice with fresh ethyl acetate, the ethyl acetate phases are washed once more with water and the combined aqueous solutions are applied to a Merck II ion exchange column. The free tripeptide ester is eluted with 200 ml of water and the water is evaporated in vacuo at 40 off. Yield: 1.3 g (74% of theory).
In the paper chromatogram in systems 43, 49 and 54, the free tripeptide ester with ninhydrin only gives one positive spot each. Rf. 43 / 0.42; 49 / 0.67 and 54 / 0.49.
Example 6
T-Lys (BOC) -A rg (NO2) -A rg (NO2) -Pro-OCH3
1.07 g (2.01 mmol) of H-Arg (NO2) -Arg (NO2) -Pro-OCH3 in 16.5 ml of dimethylformamide / acetonitrile 1: 1 are cooled to -10. While stirring vigorously, 1.44 g of T-Lys (BOC) -Lys (BOC) -OH (Patent No. 427 841) are quickly added to the solution, diluted with
10 ml of pre-cooled acetonitrile and after 10 minutes 456 mg (2.2 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide in 5 ml of ice-cold acetonitrile are added. After a reaction time of 20 hours at 0, the urea is filtered off and the solvent is evaporated off in vacuo at 400. The unconverted tripeptide ester is precipitated with a lot of ethyl acetate, the ethyl acetate solution is then evaporated to dryness and the evaporation residue is taken up in a little acetone.
After filtering through cotton wool, the N-trityl-pentapeptide ester is precipitated with a lot of ether.
A sample of the trityl pentapeptide ester cleaved with anhydrous trifluoroacetic acid shows, in the paper chromatogram in system 49, in addition to the pentapeptide methyl ester Rf. 0.29, very little of the two starting materials. (Dipeptide-H-Lys-Lys-OH [Rf. = 0.12] and
Tripeptide ester nitro-arginyl-nitro-arginyl-proline methyl ester [Rf. = 0.53].)
For analysis, 200 mg according to Craig are between
80% methanol and chloroform: carbon tetrachloride
1: 1 distributed multiplicatively over 100 levels. The main amount of the substance (180 mg) is in elements 16-28. These are combined and reprecipitated again from acetone / ether. F. 134-136.
[α] D26 = -41.2 # 0.4 (c = 2.709 in methanol).
UV spectrum: #max 271 m # = 32 500 in fine fuel
Example 7 H-Lys (BOC) -Lys (BOC) -A rg (NO2) -A rg (NO2) -
Pro-OCH3
1.46 g (1.19 mmol) of sodium trityl pentapeptide methyl ester (Example 6) are cleaved in 50 ml of 750% acetic acid for 45 minutes at 30, then at 30 the acetic acid is evaporated in a high vacuum and the evaporation residue is between 1% ige acetic acid and ether distributed. After the ether solution has evaporated, the triphenylcarbinol is obtained in quantitative yield. The acetic acid solution is also evaporated in a high vacuum at 400 and the residue is divided between n-butanol and N-soda solution in a separating funnel. The pH of the aqueous phase must be 8.5.
The butanol extracts are washed neutral with water and dried over sodium sulfate. Yield: 1.03 g (880%).
The compound is processed further directly without further purification.
Example 8
PZ-Lys (BOC) -Pro- Val-Gly-Lys (BOC) -Lys (BOC) -
A rg (NO2) -A rg (NO2) -Pro-OCH3
900 mg (1.2 mmol) of PZ-Lys (BOC) -Pro-Val-Gly- hydrazide are cooled to -10 ml in 10 ml of dimethylformamide, then 4 ml of 1-n are slowly allowed. Run in hydrochloric acid and then drop 1.4 ml of ice-cold 1-n at 100 with thorough stirring. Add sodium nitrite solution.
After 30 seconds the azide begins to deposit as a sticky compound. The reaction mixture is left to react for a further 3 minutes at -10 and 150 ml of ice water are then added to the reaction mixture. The sticky azide, which is difficult to filter, is extracted with ice-cold ethyl acetate and the ethyl acetate phases are washed neutral with water (3 times), then dried in the cold over magnesium sulfate and passed through a cold G4 glass suction filter into the ice-cooled solution of 1.03 g (# 1 mmol) H Lys (BOC) -Lys (BOC) -Arg (NO2) -Arg (NO2) - Pro - OCH3 filtered. The reaction is allowed to react at 0 for 22 hours and at 30 for 3 hours. The reaction solution is with water (40 ml), 4 times with 10 ml of 1% acetic acid solution, 5 times with 10 ml of 1-n.
Sodium bicarbonate solution and finally with water and sat. Washed saline.
When the dried solution is evaporated, the nonapeptide derivative precipitates. Yield: 1.70 g of crude product.
For further purification, 1.52 g of crude product are taken up in a little chloroform and filtered through a column of 45 g of silica gel. Single reprecipitation of the eluate from 10 ml of chloroform with ether yields 1.06 g of PZ nonapeptide methyl ester. F. 134-140 (dec.).
In the thin layer chromatogram (silica gel G; Merck) in the system dioxane: water = 9: 1, only one substance with the Rf. value 0.75 can be detected. In the systems chloroform: acetone 7: 3 and benzene: acetone
The connection remains 1: 1 at the start. The substance melts, crystallized from acetonitrile, at 136-138; in the UV spectrum in ethanol it shows maxima at # = 272 m (# = 26 600) and # = 320 m (# = 22 400).
Example 9
PZ-Lys (BOC) -Pro-Val-Gly-Lys (BOC) -Lys (BOC)
A rg (NO2) -A rg (NO2) -Pro-OH
1.06 g (0.62 mmol) of PZ nonapeptide ester (Example 8) in 6 ml of 750% dioxane are mixed with 1.24 ml of 1.95-n.
Sodium hydroxide solution saponified for 15 minutes at room temperature. The reaction solution is then poured into 110 ml of ice water, the 2.5 ml of 1-n. Contain hydrochloric acid, and filter the flaky precipitate through a G3 glass frit. The precipitate is washed well with water and dried over phosphorus pentoxide in a high vacuum. Yield: 970 mg of amorphous product.
Rf. = 0.52 in the thin layer chromatogram for dioxane: water = 9: 1.
200 mg in the system methanol: water: chloroform: carbon tetrachloride = 8: 2: 5: 5 distributed over 121 levels give 162 mg of pure peptide derivative K = 0.65.
UV spectrum: #max 320 m # = 21 700 and 271 m # = 37 200 in fine spirits.
The substance melts, crystallized from acetonitrile, at 140-145 (dec.).
Example 10
PZ-Val-Lys (BOC) -OH
4.75 g (13.4 mmol) of PZ-valine in 65 ml of absolute dioxane are cooled in ice water so that part of the dioxane is solid. Then 3.45 ml (14.4 mmol) of N-tributylamine and, after a further 5 minutes, 1.38 ml (13.4 mmol) of ethyl chloroformate are added and the mixture is left to react for 15 minutes while cooling.
Before this, 4 g (17.2 mmol) of N6-BOC-lysine are slowly introduced into 32 ml of water containing 2.45 ml (17.2 mmol) of N-triethylamine with stirring. The last servings of Ne-BOC-Lysine no longer dissolve well. When cooling with ice, little solid substance separates out of the aqueous solution.
This solution is quickly added with vigorous stirring and cooling to the freshly prepared solution of the mixed anhydride and allowed to react for 30 minutes at room temperature. The reaction solution is evaporated to a small volume in vacuo at 40, and 100 ml of water and 40 ml of 100% citric acid solution are added while cooling with ice. The greasy precipitate solidifies when scratched with ether. The crude PZ Valyl-N # -BOC-Lysine is filtered off, washed with plenty of water and ether and dried at 50 in a high vacuum. Yield: 4.41 g; F. 167-1690 (sintering 1650).
The ether phase is separated off and dried over sodium sulfate. When the ether evaporates, another 1.07 g of PZ dipeptide precipitate. F. 167-1690.
The total yield is 5.48 g (70% of theory).
After crystallizing once from ethyl acetate, the analysis fraction melts at 167-169.
The UV spectrum in fine spirits shows at #max 230 m # = 13,400 and #max 322 m # = 23,000.
Example 11
ZVal-Tyr-Pro-OtBu To 11.25 g (27.4 mmol) of carbobenzoxy-valyl-tyrosine (Patent No. 358 431) in 100 ml of freshly distilled acetonitrile are added the solution of 4.65 g (27.4 mmol) mmol) of proline tert-butyl ester in 25 ml of acetonitrile and cools to 0 in an ice bath. The solution of 6.21 g of dicyclohexylcarbodiimide in 10 ml of cold acetonitrile is then added and the mixture is left to react at 0 for 15 hours. The urea which has crystallized out is filtered off (90% of theory) and 1 ml of glacial acetic acid is added to the reaction solution.
After 15 minutes, the acetonitrile is evaporated off in vacuo, the evaporation residue is taken up in ethyl acetate and the urea which has separated out is filtered off again. The ethyl acetate solution is 2 times with 10 ml of ice-cold 2-n. Hydrochloric acid extracted, then so long with 2-n. Soda solution - until acidified samples no longer show any precipitation - and finally washed neutral with water. The ethyl acetate extracts are dried over sodium sulfate and the solvent is evaporated off under reduced pressure. Yield: 14.1 g (88 / o of theory) of amorphous carbobenzoxy tripeptide ester.
The carbobenzoxy tripeptide ester is readily soluble in most organic solvents, with the exception of ether, petroleum ether and benzene. It is processed further without further purification.
Example 12 H-Val-Tyr-Pro-OtB u
14.13 g (24.9 mmol) of Z-Val-Tyr-Pro-OtBu are cleaved hydrogenolytically in 250 ml of 900% methanol containing 4.5 ml of glacial acetic acid in the presence of 2 g of 100% Pd carbon catalyst. The carbon dioxide formed is absorbed with potassium hydroxide in a second hydrogen duck connected in between. The uptake of hydrogen has ended after 2 hours. The solution freed from the catalyst is evaporated to dryness in vacuo at 40 and the evaporation residue is distributed between 200 ml of ethyl acetate and 2 times 20 ml of ice-cold 2-n. Soda solution. The soda solutions are extracted again with fresh ethyl acetate, the ethyl acetate phases are washed neutral with water and dried over sodium sulfate. After evaporation of the solvent in vacuo, 7.69 g (710 / o d.
Th.) Free tripeptide ester.
In the paper chromatogram in systems 43, 45 and 54, the tripeptide ester migrates with the solvent front and gives 1 spot each with ninhydrin and Pauly reagent.
Example 13
PZ-Val-Lys (BOC) - Val-Tyr-Pro-OtBu
The solution of 10.36 g (17.7 mmol) of PZ-Val Lys (BOC) -OH and 7.69 g (17.7 mmol) of H-Val-Tyr-Pro OtBu in 140 ml of freshly distilled dimethylformamide is at 0 4.2 g of dicyclohexylcarbodiimide (15% excess) in 12 ml of dimethylformamide are added and the mixture is left at 0 for 2 days. The solution freed from urea is left to stand for a further 30 minutes with 0.5 ml of glacial acetic acid, the solvent is evaporated to a small volume in vacuo and the syrupy residue is taken up in a large amount of ethyl acetate. The ethyl acetate phase is 4 times with 25 ml 0.2-n. Ammonium hydroxide solution, washed twice with 30 ml of water, twice with 30 ml of ice-cold 100% citric acid solution and finally with water until neutral.
After drying with sodium sulfate and evaporation of the solvent, 17 g of crude amorphous reaction product are obtained. For further purification, the crude product, dissolved in 100 ml of chloroform, is placed on a silica gel column (570 g; ° 5.6 cm, h = 41 cm) deactivated with 100% water.
Eluted with chloroform, the orange-red zone migrates slowly, while 2 fractions can be washed out with chloroform: ethyl acetate 2: 1.
The first fraction, 4.8 g, is still heavily contaminated with dicyclohexylurea and PZ dipeptide and can only be crystallized in poor yield from acetonitrile, while the second fraction (7.2 g) from 200 ml of acetonitrile precipitates as a gelatinous product. Yield: 5.1 g, PZ pentapeptide ester, m.p. 154-1580.
The analysis fraction melts after a further crystallization at 157-159.
In the UV spectrum (recorded in fine spirits) the compound shows 2 maxima at 227 m and 322 m with the values 20 700 and 21 100.
In the thin-layer chromatogram (silica gel G; Merck) the Rf. values are: 0.23 (chloroform: acetone = 95: 5) and 0.60 (benzene: acetone = 1: 1).
Example 14
H-Val-Lys (BOC) -Val-Tyr-Pro-OtBu
1.4 g of PZ-Lys (BOC) -Val-Tyr-Pro-OtBu are shaken in 100 ml of methanol in the presence of 400 mg of 100% palladium-carbon catalyst for 6 hours at 5 atm with hydrogen in the autoclave. The catalyst is filtered off and washed repeat it with methanol and evaporate the solvent in vacuo. The evaporation residue is scratched with a lot of ether and dried in a high vacuum. A fine amorphous powder results. Yield: 980 mg.
In systems 54 and 49, the compound migrates with the solvent front.
In the thin-layer chromatogram (silica gel G) in the system dioxane: water = 9: 1, the Rf. value is 0.65.
Example 15
PZ-Lys (BOC) -Pro-Val-Gly-Lys (BOC) -Lys (BOC)
Arg (NO2) -Arg (NO2) -Pro-Val-Lys (BOC) -Val-Tyr
Pro-OtBu
276 mg (0.16 mmol) PZ-Lys-Pro-Val-Gly-Lys (BOC) -Lys (BOC) -Arg (NO2) -Arg (NO2) -Pro-OCH3 (dried over phosphorus pentoxide in a high vacuum at 800) are in the mixture 1 ml of abs. Dimethylformamide, 2 ml abs. Dissolved tetrahydrofuran and cooled to 100 in an ice-salt cold bath. Then 0.16 mmol of triethylamine in 1.6 ml of tetrahydrofuran are added and, after a further 5 minutes, 0.16 mmol of isobutyl chloroformate in 1.6 ml of abs. Tetrahydrofuran. The mixture is left to react for 15 minutes in the cold bath and then 140 mg of H-Val-Lys (BOC) -Val-Tyr-Pro-OtBu, dissolved in 2 ml of abs.
Tetrahydrofuran, in addition. The mixture is stirred for a further 15 minutes in an ice bath and then for one hour at room temperature, then the solvent is evaporated off in vacuo at 400 and the reaction product is precipitated with a lot of ether. The dried crude product (395 mg) is placed in 4 ml of alcohol-free chloroform on an aluminum oxide column (activity III; 40 g) and washed through with 100 ml of chloroform. The yellow zone with the peptide derivative only migrates slowly. It is then washed through with 80 ml of chloroform: methanol = 95: 5. 290 mg of chromatographically uniform product can be eluted. Rf. = 0.75, dioxane: water = 9: 1 in the thin-layer chromatogram.
The substance melts, crystallized from acetonitrile, at 160-165. The UV spectrum in ethanol shows maxima at; 1 (8 = 36800) and M9m (8 = 20 400).
Example 16
H-Lys (BOC) -Pro-Val-Gly-Lys (BOC) -Lys (BOC) -
Arg-Arg-Pro- rg-Pro-Val-Lys (BOC) -Val-Tyr-Pro-OtBu,
3 CH3COOH
320 mg of PZ-tetradecapeptide tert-butyl ester (Example 14) are dissolved in 6 ml of 900% acetic acid and in the presence of 100 mg of 10% palladium-carbon catalyst for 5 hours at 5 atm. shaken with hydrogen. The reaction solution is then filled into a hydrogenation duck and shaken for a further 17 hours with 100 mg of fresh Pd catalyst under normal conditions. A second hydrogen duck with potassium hydroxide solution is interposed to absorb the carbon dioxide formed. The filtered catalyst is washed well with 90% acetic acid and methanol and the solvent is evaporated to dryness in vacuo. After drying, 220 mg of a white amorphous powder are obtained.
The UV spectrum in fine spirits shows the maximum characteristic of tyrosine at 278 m (# = 1500).
In the paper chromatogram in systems 49, 50 and 54 the compound migrates with the solvent wall and gives positive reactions with ninhydrin, Pauly and Sakaguchi reagents.
Example 17
BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu (OtBu) -His-Phe-Arg-Try
Gly-Lys (BOC) -Pro-Val-Gly-Lys (BOC) -Lys (BOC)
A rg-A rg-Prn-Val-Lys () 3OC) -Val-Tyr-Pm-OiBu
210 mg tetradecapeptide tert-butyl ester (example
16) become l / ro-n at 0 in 10 ml. Hydrochloric acid dissolved quickly and the resulting solution dried lyophilically in a high vacuum. The fine white residue is dried over phosphorus pentoxide for a further 2 hours at 50 in a high vacuum. At the same time, 160 mg (0.11 niMol) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu Glu (OtBu) -His -Phe -Arg-Try-Gly-OH (Patent No. 408 948) in 1 ml freshly distilled dimethylformamide dissolved, cooled again to room temperature and added to the trihydrochloride of the tetradecapeptide.
It is diluted with a further 2.5 ml of dimethylformamide and a clear solution is obtained after 10-15 minutes. After standing for 2 hours in an ice bath, 42 mg (0.2 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide in 0.6 ml of ice-cold acetonitrile are added, and the mixture is left to react for 13 hours at 0 and 48 hours at room temperature. The crude reaction product is then precipitated with a lot of ethyl acetate and dried in a high vacuum at 40, crude yield: 330 mg.
Example 18 H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Ag-Try-Gly-Lys
Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val
Tyr-Pro-OH, CH3COOH
100 mg of crude protected tetrakosapeptide (Example 17), which is still contaminated with starting peptides, are treated with 2 ml of anhydrous trifluoroacetic acid for 1 hour at room temperature. The excess acid is evaporated off in vacuo at room temperature and the resulting residue is scratched with a lot of absolute ether. The amorphous cleavage product is in 4.5 ml 0.5-n. Acetic acid subjected to continuous high-voltage electrophoresis (700 volts; 30 mA), application rate: 1 ml / h. A total of 23 fractions are collected.
Fractions 1-9, 10, 1213, 14-15, 16 and 17-23 are evaporated. The electrophoretic analysis shows that fractions 1L15 contain the majority of the desired tetrakosapeptide. For further purification, the combined fractions 1215, dissolved in 2 ml of 100 molar ammonium acetate buffer, are applied to a carboxymethyl cellulose column (1 cm; 1.16 cm; 2.5 g). The carboxymethyl cellulose is 100 ml l / roo mol. Ammonium acetate buffer was poured into the column and washed through with a further 50 ml of the same buffer.
The peptide is then eluted from the column with ammonium acetate buffer (pH = 5.4) of increasing molarity (0.1m-0.7m).
Fractions of 10 ml volume are collected with an automatic fraction collector.
After 15 fractions the peptide is quant again. separated from the column. You get a total of 15 fractions. The vials 10-13 contain electrophoretically pure tetrakosapeptide. The distance covered after one hour at 3000 volts and pH 1.9 is 13-17 cm.
In the in vitro test according to Saffran and Schally, the peptide obtained shows a strong ACTH activity.