Verfahren und Vorrichtung zum Nachweisen von Agglutinationen in einer Reaktionszone
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweisen von Agglutinationen in einer Reaktionszone durch Abtasten der Zone mit einem Energiestrahl und insbesondere kann sie die Anzeige von Agglutinationsvorgängen in Blutproben betreffen.
Untersuchungen auf Agglutinations- oder Zus ammen- ballungsvorgänge werden im allgemeinen im Laboratorium bei der Blutuntersuchung und Blutgruppenbestimmung vorgenommen. Diese Bestimmungen werden allge- mein von Hand d auf einem Objektträger eines Mikro- skops oder in leinemTeströhrchen durchgeführt. Mit dem zu untersuchenden Blut oder der sonstigen biologischen Flüssigkeit kann ein geeignetes Reagens vermischt werden und nach Ablauf der erforderlichen Reaktionszeit wird die Probe visuell untersucht und mit einer Standardprobe verglichen, um festzustellen, ob eine wesentliche Zusammenballung oder Agglutination eingetreten ist. Dieses Vorgehen ist zeitraubend und subjektiv.
Es hängt daher in hohem Masse von der Aufmerksamkeit des Beobachters und seinem fehlerlosen Arbeiten ab. Es sind bereits verschiedene elektronische Einrichtungen für die Untersuchung von biologischen Proben, etwa bei der Blutkörperchenzählung, bekannt geworden. Diese Einrichtungen lassen sich jedoch nicht für die tÇberwa- chung von Agglutinationsvorgängen verwenden, weil sie im Grunde Teilchenzähler darstellen, und das blosse Zählen von Teilchen gibt keine Hinweise für das Einsetzen von Agglutination oder Zusammenballung von Zellen. Übliche elektronische Teilchenzähieinrichtungen finden sich in den USA-Patentschriften 2 494 441, 2 570 442, 2 731 202, 2 927 219 und 2 948 470.
Mit der Erfindung soll ein zuverlässiges selbsttätiges Verfahren und eine Vorrichtung zum Nachweisen von Agglutinationsreaktionen angegeben werden.
Das neue Verfahren zum Nachweisen von Agglutinationen in einer Reaktionszone durch Abtasten der Zone mit einem Energiestrahl ist dadurch gekennzeichnet, dass man zunächst ein erstes Signal erzeugt, das von der Modulation des Energiestrahls durch unterschiedliche Absorption des Strahls in der Reaktionszone abhängt, dass dann ein zweites Signal erzeugt wird, welches dem Betrag der Änderung des ersten Signals entspricht und ein Mass für die Aggititinationsdichte in der Reaktionszone darstellt, und dass schliesslich das zweite Signal mit einem vorgegebenen Standard verglichen wird, das einer bestimmten Agglutin ationsdichte entspricht, um das Auftreten einer Agglutination mit einer der bestimmten Dichte mindestens gleichen Dichte in der Reaktionszone nachzuweisen.
Der Strahl kann ein Licht- oder ein Elektronenstrahl sein und wird durch Unterschiede der Absorption, die er in dem Reaktionsbereich erleidet, moduliert. Die eigentliche Agglutination oder Zusammenballung führt im allgemeinen zu deutlichen Grenzlinien in Idem abgesltasteten Bereich zwischen Zellenzusammenballung und der Umgehungsfläche und diese Grenzlinien können eine merkliche Modulation des Abtaststrahls hervorrufen, wenn er die Grenzlinien überstreicht; dadurch wird insbesondere eine deutliche Änderung der Stärke des von dem Abtaststrahl erzeugten Signals verursacht.
Der Anderungsbetrag des erzeugten Signals kann in üblicher Weise durch eine Differenzierschaltung ermittelt werden, deren Ausgangsgrösse durch Scheitel Ispannunlgsmesser, Oszilloskop, Oszillograph, Triggerschaltung, Integrierschaltung oder ähnliche Anzeigeeinrichtungen sichtbar gemacht werden kann. Die Anzeigeeinrichtung kann auch mit einer Triggerschaltung ausgerüstet werden, die durch Ausgangssignale aus der Differenzierschaltung betätigt wird, die aus einer Änderung des Betrages des erzeugten Signals herrühren und die oberhalb einer vorgegebenen Minimaländerung liegen, wobei darunter liegende Signale unterdrückt werden.
Das Anzeigesystem kann ferner mit einer Integrierschaltung versehen sein, in der Signale summiert werden, die von der Differenzierschaltung hergeleitet sind um das Auftreten von Agglutinationen festzustellen. Die Arbeitsparameter oder die untere Triggerschwelle für die Differenzierschaltung können dabei veränderbar sein, um unterschiedliche Arten oder Zustände von Agglutinationsreaktionen festzustellen.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird insbesondere in einer Vorrichtung durchgeführt, die aus einer Einrichtung mit einem Energiestrahl zum Abtasten der Reaktionszone besteht sowie einem mit der Abtasteinrichtung verbundenen Signalerzeuger zum Erzeugen eines ersten, der Modulation des Abtaststrahls entsprechenden Signals, einer Differenziereinrichtung, die mit dem Signalerzeuger verbunden ist, um aus dem ersten Signal das zweite Signal herzuleiten, das dem Betrag der Änderung des ersten Signals entspricht und aus einer mit der Differenziereinrichtung verbundenen Anzeigeeinrichtung zum Liefern einer Anzeige, die der Grösse des zweiten Signals entspricht, wodurch dieses mit dem vorgegebenen Standardsignal vergleichbar wird.
Ausführungsbeispiele der Erfindung werden in der nachfolgenden Beschreibung in Verbindung mit den Zeichnungen, in denen gleiche Bauelemente durch die gleichen Bezugszahlen bezeichnet sind, beschrieben; im einzelnen stellen die Zeichnungen dar:
Fig. 1 eine schematische Übersicht über eine Ausführungsform der Erfindung;
Fig. 2 eine schematische Darstellung einer Ausbildungsmöglichkeit des Anzeigeteils der Ausführungsform nach Fig. 1 ;
Fig. 3 eine Draufsicht auf eine Probe, in der keine Agglutination zwischen Untersuchungssubstanz und Reagens stattgefunden hat;
Fig. 3A eine Spannungs-Zeit-Kurve eines an einer Stelle der Einrichtung nach Filg. 1 auftretenden Signals beim Abtasten der Probe nach Fig. 3;
Fig. 3B eine weitere Spannungs-Zeit-Kurve des an einer anderen Stelle der Einrichtung nach Fig. 1 auftre tenden Signals beim m Abtasten der Probe nach Fig. 3;
Fig. 3C eine dritte Spannungs-Zeit-Xurve des an einer dritten Stelle der Einrichtung nach Fig. 1 auftretenden Signals bein Abtasten der Probe nach Fig. 3;
Fig. 4 eine Draufsicht auf eine Probe, in der Agglutinationen zwischen Untersuchungssubstanz und Reagens stattgefunden haben; Fig. 4A eine SpannuRgs-Zeit-Kurve des an einer Stelle der Einrichtung nach Fig. 1 auftreten, den Signals beim Abtasten der Probe nach Fig. 4;
Fig. 4B eine weitere Spannungs-Zeit-Kurve des an einer anderen Stelle der Einrichtung nach Fig. 1 auftretenden Signals beim Abtasten der Probe nach Fig. 4;
Fig. 4C eine dritte Spannungs-Zeit-Kurve des an einer dritten Stelle der Einrichtung nach Fig. 1 auftretenden Signals beim Abtasten der Probe nach Fig. 4;
Fig. 5 eine Kurve der Spannung gegen die Zeit für das in der Integrierschaitung nach Fig. 2 gebildete Signal.
Fig. 1 zeigt ein Gerät 8 zum selbsttätigen Nachweisen von Agglutinationen in der Reaktionszone von selbsttätig hergestellten Proben 24. Die Proben 24 können auch von Hand zubereitet und von Hand durch geeignete Gerätschaften weiterbewegt werden.
Bei dem Gerät 8 nach Fig. 1 werden die Proben 24 auf einer Folie 12 gefördert, die aus einem zähen, biegsamen, lichtdurchlässigen Material, etwa aus Polyäthylen, besteht. Die Folie 12 wird von einer Vorratswalze 10 durch motorgetriebene Zuführungswalzen 14 abge wiclselt. Ein Quantum Reagens 18 wird von einem Ausgabegerät 16 auf die Folie 12 gegeben, und von dem Ausgabegerät 20 wird eine kleine Menge der zu untersuchenden biologischen Substanz 22, also z. B. Blut, in das Reagens 18 getropft. Dann läuft die Probe in den Abtastbereich des Abtaststrahlgeräts 26 hinein, nachdem in einer dazwischen liegenden, ausreichend langen Zeit die etwa auftretende Agglutinationsreaktion ablaufen konnte. Die Folie 12 fördert dann die Probe aus dem Abtastgerät 26 weiter und mittels der Wegführwalzen 25 in den Abfallbehälter 27.
In Fig. 1 ist die Einrichtung mit dem Abtaststrahl nach Art eines Lichtmikroskops dargestellt ; statt dessen können aber auch andere Abtasteinrichtungen, etwa mit einem Elektronenstrahl eines Elektronenmikroskops oder einer Bildröhre, benutzt werden. Die Abtasteinrichtung 26 weist eine Lichtquelle 29, ein Mikroskop bzw. ein Reduzierelement 30 und eine photoelektrische Zelle 34 auf. Die Photozelle 34, etwa eine Photomultiplierzelle, ist in einem Gehäuse 32 angeordnet und fängt den Teil des Strahls auf, der durch die abgetastete Reaktionszone der Probe 24 hindurchgetreten ist. Die Ausgangsgrösse der Abtasteinrichtung 26 ist ein Mass für die Absorptionsunterschiede innerhalb des durch den Kegel 33 dargestellten Strahls in der Reaktionszone.
Der Querschnitt des Abtaststrahls ist, verglichen mit den Agglutinationsbereichen, verhältnismässig klein, um eine genauere Messung zu ermöglichen. Die Absorptionsunterschiede können durch die Messung beliebiger repräsentativer Merkmale ermittelt werden, etwa durch Bestimmung der Transmission, des Reflektionsgrades usw.
Die Ausgangsgrösse des Abtastgeräts 26 wird zu einem Signalgeber 36 über Zuleitungen 35 weitergeleitet. Zu dem Signalgeber 36 gehören Schaltungselemente zum Erzeugen eines elektrischen Signals, das ein Mass für die Modulation des Abtaststrahls infolge der Strahlabsorptionsunterschiede in der Reaktionszone, die von der Photozelle 34 ermittelt werden, darstellt. In dem Slgnalgeber 36 können eine Spannungsquelle für die Photozelle 34 enthalten sein, ferner passende Belastungswiderstände, Verstärker und zugehörige Spannungs- oder Stromquellen.
Im Signalerzeuger 36 wird ein erstes Signal gebildet, das über die Leitungen 37 und die Anschlüsse 38 der Differenzierschaltung 40, die einen Kondensator 42 und einen Widerstand 44 aufweist, zugeführt wird. Die Differenzierschaltung 40 bildet ein zweites Signal, das ein Mass für die Änderung des ersten Signals darstellt, welches von dem Signalerzeuger 36 geliefert wurde. Dieses zweite Signal ist ein Mass für die Schärfe der Grenzlinie, d. h. des Übergangs zwischen verschiedenen Flä chenteilen in der Probe 24, und d des Ausmasses einer Agglutination in der abgetasteten Reaktionszone. Dieses abgeleitete Signal wird dem Anzeigegerät 48 über Leitungen 45 und Anschlüsse 46 zugeführt.
Als Anzeigegerät 48 dient ein Scheitelspannungsmesser oder ein Oszilloskop, die eine sichtbare Anzeige der Grösse des gebildeten zweiten Signals im Vergleich zu einem vorgegebenen Standardsignal 50 ermöglichen, das der Abtastsignalgrösse beim Auftreten einer wesentlichen Agglutination entspricht. Das Anzeigegerät 48 kann auch als Triggerschaltung oder als Integrierschaltung ausgeführt sein, die jeweils mit elektrischen Mitteln eine Anzeige und einen Vergleich mit einem vorgegebenen Standard herbeiführt, der einer wesentlichen Agglutination entspricht.
In Fig. 2 ist eine besonders zweckmässige Ausführungsform 48A des Anzeigeteils 48 des Geräts 8 nach Fig. 1 dargestellt. Der Anzeigeteil 48A weist eine Verarbeitungsschaltung 56A auf, in der Verstärker, Triggerkreise, Rücklaufsehaltungen und freikippendeMultivibra- toren und ähnliche Schaltungselemente enthalten sind, um das Signal aus der Differenzierschaltung 40 für den Vergleich mit dem vorgegebenen Agglutinations-Standardsignal zu verarbeiten. Der Anzeigeteil 48A ist nach Art einer Integrierschaltung aufgebaut und enthält daher ein Integriernetzwerk 64A.
Das Integriernetzwerk 64A ist mit der Verarbeitungsschaltung 56A über Leitungen 57A und Anschlüsse 62A verbunden. Ein Diodengleichrichter 60A liegt zwischen der Verarbeitungsschaltung 56A und dem Integriernetzwerk 64A und leitet diesem einseitig gerichtete, gleichgerichtete Signale zu, die darin summiert werden können. Zu diesem Integriernetzwerk 64A gehört ein Widerstand 66A und ein zwischen Anschlüssen 70A liegender Kondensator 68A. Der integrierte Ausgang des Integriernetzwerks 64A wird über Leitungen 67A einer Anzeigeanordnung 74A zugeleitet, die als elektronisches Voltmeter mit vernachlässigbarem Arbeitsstrom ausgeführt ist, zum Aufrechterhalten der im Kondensator 68A gespeicherten Ladung.
Wie erwähnt, lassen sich in die Verarbeitungsschaltung 56A Verstärker zum Verstärken schwacher Signale und verschiedene Signalübertragungs- und -verstärkungselemente einbauen, z. B. Trigger- oder Rücklaufschaltungen oder freischwingende Multivibratoren. Ein zwischen dem Voltmeter 74A und dem Kondensator 68A angeordneter Schalter 72A erlaubt die Entladung des Integriemetzwerks 64A, um es für das nächste Arbeitsspiel einzustellen.
Arbeitsweise
Die Arbeitsweise des in den Fig. 1 und 2 dargestellten Geräts 8 wird nun in Verbindung mit den Fig. 3 bis 5 beschrieben. In den Fig. 3 und 4 ist schematisch das Bild einer Probe 24 wiedergegeben, wie es in einem Mikroskop mässiger Vergrösserung erscheint. Die Probe 76a (Fig. 3) zeigt keine Agglutination, während bei der Probe 76b (Fig. 4) agglutinierte Bereiche erkennbar sind.
Fig. 3 zeigt mehrere dunkle Flecken 78a und 80a, die durch Inhomogenitäten oder Variationen der Schichtdicke hervorgerufen sind. Derartige dunklere Bereiche stellen aber keine Agglutinationen dar, denn sie weisen keine wohldefinierten Berandungen oder scharfe Abgren- zungen gegenüber dem restlichen Felde der Probe 76a auf. Bei der Probe 76b (Fig. 4), die deutliche Agglutination aufweist, sind die Begrenzungslinien der Bereiche 78b und 80b gut ausgebildet, wodurch sie scharf gegen über dem umgebenden Bereich der Probe 76b abgegrenzt sind. Derartige scharfe Abgrenzungen führen zu kräftigen Unterschieden der Ausgangsgrösse am Gerät 8, wenn jede Probe abgetastet wird, und es ergeben sich starke Änderungen des von dem Abtaststrahl erzeugten Signals.
(Die Fig. 3A, 3B und 3C betreffen die Probe 76a (Fig. 3) und geben die Signale wieder, die in den verschiedenen Teilen des Systems 8 bei Abtastung der Probe 76a entstehen. Die von Fig. 3 bis zu Fig. 3C durchlaufenden vertikalen Linien 82a und 84a verbinden einander entsprechende Teile dieser Figuren miteinander.
Fig. 3A gibt ein Bild des Signalverlaufs S38a an den Anschlüssen 38 in Fig. 1, wie er vom Signalerzeuger 36 bei der Abtastbewegung des Abtaststrahls längs der Linie 81a (Fig. 3) produziert wird. E38a ist die Spannungsachse (Ordinate), T38a die Zeitachse (Abszisse).
Ordinaten und Abszissen der Diagramme 3A, 3B, 3C und 4A, 4B, 4C sind in ähnlicher Weise mit Bezugszeichen versehen, die die Bezeichnung der Anschlüsse enthalten, an denen die jeweiligen Signale auftreten. Die teilweise Absorption oder Abdeckung des Strahls durch die Bereiche 78a und 80a moduliert den Strahl, so dass das Ausgangssignal S38a entsteht. Das Signal S38a besitzt eine beträchtliche Amplitude, weist aber nur schwach geneigte Flanken auf, was für den allmählichen Übergang zwischen den Bereichen 78a und 80a und den übrigen Teilen der Probe 76a spricht.
Die Fig. 4A, die bei Abtastung der Probe 76b (Fig. 4) entsteht, zeigt ein Signal S38b, dessen Amplitude etwa gleich derjenigen des Signals S38a (Fig. 3A) ist, dessen Flanke aber an den Stellen 86b, 88b, 90b und 92b sehr viel steiler ist; diese Stellen entsprechen den Punkten, an denen der längs der Linie 81b (Fig. 4) verlaufende Abtaststrahl die scharf ausgeprägten Grenzlinien der Bereiche 78b und 80b überschreitet. Die Neigung des Signals S38b an diesen Grenzlinien in Abhängigkeit von der Zeit ist verhältnismässig steil im Vergleich zu Signal S38a (Fig. 3A).
Wenn die Signale S38a und S38b der Differenzierschaltung 40 (Fig. 1) zugeführt werden, ergeben sich zweite Signale S46a und S46b, die dem Betrag der Anderung der ersten Signale entsprechen, welche die Abgrenzung der Flächen 78a, 78b und 80a, 80b gegenüber dem Rest der Proben 76a und 76b anzeigen. Das Signal S46a (Fig. 3B) ist demnach zu vernachlässigen gegen über dem Signal S46b, das sich durch scharfe Impulse in Fig. 4B auszeichnet. Die Stärke der Signale S46a und S46b ist demnach ein Anzeichen für die Schärfe der Abgrenzung und der Anhäufung von Agglutinationen in der abgetasteten Reaktionszone. Die Signale S46a und S46b können auf einem oszilloskopartigen Anzeigegerät 48 (Fig. 1) im Vergleich mit einer Standardlinie 50 dargestellt werden, die als Mass für eine wesentliche Agglutination anzusehen ist.
Wenn das Signal S46 sich über die Standardlinie 50 erhebt, erkennt selbst ein nicht speziell geschulter Beobachter sofort, dass die gerade abgetastete Probe agglutiniert ist.
In einem weiterentwickelten Gerät nach Fig. 2 wird das Signal S46 über die Anschlüsse 46A, die Verarbeitungsschaltung 56A, den Gleichrichter 60A und die Anschlüsse 62A auf das Integriernetzwerk 64A geleitet.
Die Signale S46a und S46b werden von der Diode 60A gleichgerichtet und aus einem nach zwei Seiten gerichteten Signal in ein nach einer Seite gerichtetes Signal (S62a und S62b, Fig. 3C und 4C) umgewandelt. Die Signale S62a und S62b werden anschliessend dem Kondensator 68A des Integriernetzwerkes 64A zugeleitet, dessen zeitlicher Ladungsverlauf (Ordinate E70A=Ladung; Abszisse T70A= Zeit) an den Anschlüssen 70A in Fig. 5 dargestellt ist. Jedesmal wenn der Abtaststrahl eine deutliche Begrenzungslinie, wie sie etwa die Bereiche 78b und 80b umgibt, überschreitet, nimmt die Ladung des Kondensators 68A stufenweise (94) zu.
Wenn die Gesamtladung 96 des Kondensators 68A (abzulesen am Voltmeter 74A in Fig. 2) einen vorbestimmten Normbetrag erreicht, der einer wesentlichen Agglutination entspricht, empfängt der Beobachter eine eindeutige Mitteilung über das Auftreten von Agglutinationen. Da die Anzeige des Voltmeters 74A auf einer Anzahl Abtastungen (in einem vielzeiligen Raster) beruhen kann, verändert das Auftreten einer einzelnen Störung, etwa einer Luftblase, den Betrag der Ausgangsgrösse nicht wesentlich. Mit dem Schalter 72A wird der Kondensator 68A nach dem Erreichen der Standardspannung 96 entladen, so dass das Voltmeter 74 für die Überwachung der nächsten Probe neueingestellt ist. Der Schalter 72A kann von Hand oder automatisch betätigt werden.
Die Oszilloskopanzeige 48 in Fig. 1 ergibt eine sichtbare Darstellung der Höhe des abgeleiteten Signals S46 und erlaubt einen visuellen Vergleich mit der vorgegebenen Standardlinie 50. Das Integriernetzwerk 48A nach Fig. 2 liefert einen elektrischen Vergleich zwischen der Höhe des von der Differenzierschaltung 40 gelieferten Signals S46 und einem vorgegebenen Standardsignal, das einer wesentlichen Agglutination entspricht.
Ein elektrischer Vergleich zwischen der Höhe des abgeleiteten zweiten Signals und dem vorgegebenen Standardsignal kann auch mittels einer (nicht besonders gezeichneten) Triggerschaltung erfolgen; die Linien 98a und 98b in den Fig. 3B und 4B sollen das andeuten. Die Triggerschaltung kann beispielsweise entsprechend der Thyratronschaltung nach S. 193-202 Electronics in Industry (3. Auflage, McGraw-Hill Book Company, Copyright 1955, 1956) aufgebaut sein. Dort werden auch einige der hier erwähnten elektronischen Elemente beschrieben.
Die Triggerschaltung unterdrückt Signale, die unterhalb einer festgelegten, durch die Linien 98a und 98b angedeuteten Minimalhöhe bleiben und überträgt nur darüber hinaus reichende Signale. Damit wird auf elektrischem Wege sowohl eine Anzeige wie ein Vergleich mit einem vorgegebenen Standard erreicht, und die Ausgangsgrösse der Triggerschaltung kann unmittelbar auf einem Registrierblatt und/oder durch eine Anzeigelampe sichtbar gemacht werden. Die Signale S46b in Fig. 4B übersteigen die vorgegebene minimale Triggerspannung 98b und betätigen daher die angeschlossene Anzeigeeinrichtung. Das Signal S46a (Fig. 3B) mit geringer Amplitude wird unterdrückt.
Die erwähnten Standards und Minimumstandards können durch Anwendung einer einstellbaren Differenzierschaltung 40 mit (nicht gezeichneten) variablen Schaltelementen verändert werden. Damit können Parameter und Empfindlichkeit der Differenzierschaltung 40 und die Arbeitsschwelle des Gerätes eingestellt werden, um unterschiedlichen Arten oder Zuständen der Agglutinationsreaktion nachzuweisen, um Hintergrundstörungen abzuschirmen oder bestimmte Arten von Begrenzungen auszuwählen. Ein geschulter Benutzer kann das Gerät 8 so einstellen, dass er ein bestimmtes Ausmass an Agglutination für eine bestimmte Probenart nachzuweisen vermag. Wenn die Arbeitsschwelle eingestellt ist, arbeitet das Gerät routinemässig und weist gleichmässig alle Proben dieser Art nach.
Die Ablesungen des Geräts sind sehr viel gleichmässiger und zuverlässiger als vi suelle Vergleiche, selbst wenn diese von einem sehr ge übten und erfahrenen Beobachter vorgenommen wer den. Die Ablesungen unterscheiden sich in kennzeichnender Weise von denen elektronischer Zähler, wie sie für das Zählen von Bakterien oder Blutkörperchen benutzt werden, denn das Arbeitskriterium bei der Erfin dung ist die relative Schärfe der Abgrenzung verschie dener Bereiche gegeneinander und nicht nur die unter schiedliche Lichtmenge, die in verschiedenen Bereichen absorbiert wird, oder die absolute Grösse der Licht intensität.
Method and device for the detection of agglutinations in a reaction zone
The invention relates to a method of detecting agglutination in a reaction zone by scanning the zone with an energy beam, and in particular it can relate to the indication of agglutination processes in blood samples.
Investigations on agglutination or aggregation processes are generally carried out in the laboratory during blood tests and blood group determination. These determinations are generally carried out by hand on a microscope slide or in a test tube. A suitable reagent can be mixed with the blood or other biological fluid to be examined and, after the required reaction time has elapsed, the sample is examined visually and compared with a standard sample in order to determine whether substantial agglutination or agglutination has occurred. This process is time consuming and subjective.
It therefore depends to a large extent on the observer's attention and error-free work. Various electronic devices for examining biological samples, for example for counting blood cells, have become known. However, these devices cannot be used to monitor agglutination processes because they are essentially particle counters, and simply counting particles does not give any indication of the onset of agglutination or agglutination of cells. Common electronic particle counters can be found in U.S. Patents 2,494,441, 2,570,442, 2,731,202, 2,927,219, and 2,948,470.
The invention is intended to provide a reliable, automatic method and a device for detecting agglutination reactions.
The new method for detecting agglutinations in a reaction zone by scanning the zone with an energy beam is characterized in that a first signal is first generated, which depends on the modulation of the energy beam by different absorption of the beam in the reaction zone, and then a second signal is generated, which corresponds to the amount of change in the first signal and is a measure of the agglutination density in the reaction zone, and that finally the second signal is compared with a predetermined standard that corresponds to a certain agglutination density in order to detect the occurrence of agglutination with a to detect at least the same density as the specific density in the reaction zone.
The beam can be a light or an electron beam and is modulated by differences in absorption it undergoes in the reaction area. The actual agglutination or agglutination generally results in distinct boundary lines in the scanned area between the cell agglomeration and the bypass area, and these boundary lines can cause a noticeable modulation of the scanning beam as it passes over the boundary lines; in particular, this causes a significant change in the strength of the signal generated by the scanning beam.
The amount of change in the generated signal can be determined in the usual way by a differentiating circuit, the output variable of which can be made visible by a peak voltage meter, oscilloscope, oscilloscope, trigger circuit, integrating circuit or similar display devices. The display device can also be equipped with a trigger circuit which is actuated by output signals from the differentiating circuit which result from a change in the amount of the generated signal and which are above a predetermined minimum change, with underlying signals being suppressed.
The display system can also be provided with an integrating circuit, in which signals are summed which are derived from the differentiating circuit in order to determine the occurrence of agglutinations. The working parameters or the lower trigger threshold for the differentiation circuit can be changed in order to determine different types or states of agglutination reactions.
The method according to the invention is carried out in particular in a device which consists of a device with an energy beam for scanning the reaction zone and a signal generator connected to the scanning device for generating a first signal corresponding to the modulation of the scanning beam, a differentiating device connected to the signal generator in order to derive the second signal from the first signal, which corresponds to the amount of change in the first signal, and from a display device connected to the differentiating device for providing a display which corresponds to the magnitude of the second signal, making it comparable with the predetermined standard signal.
Embodiments of the invention are described in the following description in conjunction with the drawings, in which the same components are denoted by the same reference numerals; the drawings show in detail:
1 shows a schematic overview of an embodiment of the invention;
FIG. 2 shows a schematic representation of a possible embodiment of the display part of the embodiment according to FIG. 1;
3 shows a plan view of a sample in which no agglutination between the substance to be examined and the reagent has taken place;
3A shows a voltage-time curve of a at one point in the device according to Filg. 1 occurring signal when scanning the sample of FIG. 3;
3B shows a further voltage-time curve of the signal occurring at another point in the device according to FIG. 1 when the sample according to FIG. 3 is scanned;
3C shows a third voltage-time curve of the signal occurring at a third point in the device according to FIG. 1 when the sample according to FIG. 3 is scanned;
4 shows a plan view of a sample in which agglutinations between the substance to be examined and the reagent have taken place; 4A shows a voltage-time curve of the signal occurring at one point in the device according to FIG. 1, the signal when the sample according to FIG. 4 is scanned;
FIG. 4B shows a further voltage-time curve of the signal occurring at a different point in the device according to FIG. 1 when the sample according to FIG. 4 is scanned;
4C shows a third voltage-time curve of the signal occurring at a third point in the device according to FIG. 1 when the sample according to FIG. 4 is scanned;
FIG. 5 is a graph of voltage versus time for the signal formed in the integrating circuit of FIG.
1 shows a device 8 for the automatic detection of agglutinations in the reaction zone of automatically produced samples 24. The samples 24 can also be prepared by hand and moved by hand using suitable equipment.
In the device 8 according to FIG. 1, the samples 24 are conveyed on a film 12 which is made of a tough, flexible, translucent material such as polyethylene. The film 12 is wound up from a supply roller 10 by motor-driven feed rollers 14. A quantum of reagent 18 is dispensed from an output device 16 onto the film 12, and a small amount of the biological substance 22 to be examined, ie e.g. B. blood, dropped into the reagent 18. The sample then runs into the scanning area of the scanning beam device 26 after the agglutination reaction which may have occurred has been able to take place in a sufficiently long time in between. The film 12 then conveys the sample further out of the scanning device 26 and into the waste container 27 by means of the removal rollers 25.
In Fig. 1 the device with the scanning beam is shown in the manner of a light microscope; Instead, however, other scanning devices, for example with an electron beam from an electron microscope or a picture tube, can also be used. The scanning device 26 has a light source 29, a microscope or a reducing element 30 and a photoelectric cell 34. The photocell 34, for example a photomultiplier cell, is arranged in a housing 32 and intercepts that part of the beam which has passed through the scanned reaction zone of the sample 24. The output variable of the scanning device 26 is a measure of the absorption differences within the beam represented by the cone 33 in the reaction zone.
The cross section of the scanning beam is comparatively small compared to the agglutination areas in order to enable a more precise measurement. The absorption differences can be determined by measuring any representative characteristics, for example by determining the transmission, the degree of reflection, etc.
The output variable of the scanning device 26 is forwarded to a signal generator 36 via feed lines 35. The signal generator 36 includes circuit elements for generating an electrical signal which represents a measure for the modulation of the scanning beam as a result of the beam absorption differences in the reaction zone, which are determined by the photocell 34. The signal generator 36 can contain a voltage source for the photocell 34, as well as suitable load resistors, amplifiers and associated voltage or current sources.
A first signal is formed in the signal generator 36 and is fed via the lines 37 and the connections 38 to the differentiating circuit 40, which has a capacitor 42 and a resistor 44. The differentiating circuit 40 forms a second signal which represents a measure of the change in the first signal which was supplied by the signal generator 36. This second signal is a measure of the sharpness of the boundary line, i. H. the transition between different surface parts in the sample 24, and d the extent of agglutination in the scanned reaction zone. This derived signal is fed to the display device 48 via lines 45 and connections 46.
A peak voltmeter or an oscilloscope is used as the display device 48 and enables a visible display of the size of the second signal formed in comparison to a predetermined standard signal 50 which corresponds to the scanning signal size when substantial agglutination occurs. The display device 48 can also be designed as a trigger circuit or as an integrating circuit, which in each case uses electrical means to bring about a display and a comparison with a predetermined standard that corresponds to a substantial agglutination.
In Fig. 2, a particularly useful embodiment 48A of the display part 48 of the device 8 according to FIG. 1 is shown. The display part 48A has a processing circuit 56A in which amplifiers, trigger circuits, flyback circuits and free-tilting multivibrators and similar circuit elements are included in order to process the signal from the differentiating circuit 40 for comparison with the predetermined agglutination standard signal. The display part 48A is constructed in the manner of an integrating circuit and therefore contains an integrating network 64A.
Integrating network 64A is connected to processing circuitry 56A by lines 57A and terminals 62A. A diode rectifier 60A is interposed between the processing circuit 56A and the integrating network 64A and provides unidirectional, rectified signals to the integrating network 64A which can be summed therein. This integrating network 64A includes a resistor 66A and a capacitor 68A connected between terminals 70A. The integrated output of the integrating network 64A is fed via lines 67A to a display arrangement 74A, which is implemented as an electronic voltmeter with negligible operating current, for maintaining the charge stored in capacitor 68A.
As mentioned, amplifiers for amplifying weak signals and various signal transmission and amplification elements can be incorporated in the processing circuit 56A, e.g. B. trigger or flyback circuits or free-running multivibrators. A switch 72A arranged between voltmeter 74A and capacitor 68A allows the integration network 64A to be discharged in order to set it for the next cycle.
Working method
The operation of the device 8 shown in FIGS. 1 and 2 will now be described in connection with FIGS. 3-5. In FIGS. 3 and 4, the image of a sample 24 is shown schematically as it appears in a microscope of moderate magnification. Sample 76a (FIG. 3) shows no agglutination, while agglutinated areas can be seen in sample 76b (FIG. 4).
3 shows several dark spots 78a and 80a which are caused by inhomogeneities or variations in the layer thickness. However, such darker areas do not represent agglutinations because they do not have any well-defined borders or sharp delimitations with respect to the remaining field of the sample 76a. In the case of the sample 76b (FIG. 4), which exhibits clear agglutination, the boundary lines of the areas 78b and 80b are well formed, as a result of which they are sharply delimited from the surrounding area of the sample 76b. Such sharp demarcations lead to significant differences in the output variable at the device 8 when each sample is scanned, and there are major changes in the signal generated by the scanning beam.
(FIGS. 3A, 3B and 3C relate to the sample 76a (FIG. 3) and represent the signals which arise in the various parts of the system 8 when the sample 76a is scanned. Those traversing from FIG. 3 to FIG. 3C vertical lines 82a and 84a interconnect corresponding parts of these figures.
3A shows an image of the signal waveform S38a at the connections 38 in FIG. 1, as it is produced by the signal generator 36 during the scanning movement of the scanning beam along the line 81a (FIG. 3). E38a is the voltage axis (ordinate), T38a the time axis (abscissa).
The ordinates and abscissas of the diagrams 3A, 3B, 3C and 4A, 4B, 4C are similarly provided with reference symbols which contain the designation of the connections at which the respective signals occur. The partial absorption or covering of the beam by regions 78a and 80a modulates the beam to produce the output signal S38a. The signal S38a has a considerable amplitude, but has only slightly sloping edges, which speaks for the gradual transition between the regions 78a and 80a and the remaining parts of the sample 76a.
4A, which arises when the sample 76b (FIG. 4) is scanned, shows a signal S38b, the amplitude of which is approximately equal to that of the signal S38a (FIG. 3A), but whose edge is at the points 86b, 88b, 90b and 92b is much steeper; these locations correspond to the points at which the scanning beam running along the line 81b (FIG. 4) exceeds the sharply defined boundary lines of the regions 78b and 80b. The slope of the signal S38b at these boundary lines as a function of time is relatively steep compared to signal S38a (FIG. 3A).
If the signals S38a and S38b are fed to the differentiating circuit 40 (FIG. 1), the result is second signals S46a and S46b which correspond to the amount of change in the first signals which define the delimitation of the areas 78a, 78b and 80a, 80b from the rest of samples 76a and 76b. The signal S46a (FIG. 3B) is accordingly negligible compared to the signal S46b, which is characterized by sharp pulses in FIG. 4B. The strength of the signals S46a and S46b is accordingly an indication of the sharpness of the delimitation and the accumulation of agglutinations in the scanned reaction zone. The signals S46a and S46b can be displayed on an oscilloscope-like display device 48 (FIG. 1) in comparison with a standard line 50, which is to be regarded as a measure for a substantial agglutination.
If the signal S46 rises above the standard line 50, even a not specially trained observer will immediately recognize that the sample that has just been scanned is agglutinated.
In a further developed device according to FIG. 2, the signal S46 is passed via the connections 46A, the processing circuit 56A, the rectifier 60A and the connections 62A to the integration network 64A.
The signals S46a and S46b are rectified by the diode 60A and converted from a bidirectional signal to a unidirectional signal (S62a and S62b, FIGS. 3C and 4C). The signals S62a and S62b are then fed to the capacitor 68A of the integrating network 64A, whose charge curve over time (ordinate E70A = charge; abscissa T70A = time) is shown at connections 70A in FIG. Each time the scanning beam crosses a definite delimitation line such as that surrounding areas 78b and 80b, the charge on capacitor 68A gradually increases (94).
When the total charge 96 on capacitor 68A (read on voltmeter 74A in FIG. 2) reaches a predetermined standard amount corresponding to substantial agglutination, the observer will receive a definite notification of the occurrence of agglutination. Since the display of voltmeter 74A can be based on a number of scans (in a multi-line grid), the occurrence of a single fault, such as an air bubble, does not significantly change the magnitude of the output. The switch 72A is used to discharge the capacitor 68A after the standard voltage 96 is reached, so that the voltmeter 74 is reset for monitoring the next sample. The switch 72A can be operated manually or automatically.
The oscilloscope display 48 in FIG. 1 provides a visual representation of the level of the derived signal S46 and allows a visual comparison with the predetermined standard line 50. The integration network 48A of FIG. 2 provides an electrical comparison between the level of the signal S46 supplied by the differentiating circuit 40 and a predetermined standard signal corresponding to substantial agglutination.
An electrical comparison between the level of the derived second signal and the predetermined standard signal can also be made by means of a trigger circuit (not shown in particular); lines 98a and 98b in Figures 3B and 4B are intended to indicate this. The trigger circuit can for example be constructed in accordance with the thyratron circuit according to pp. 193-202 Electronics in Industry (3rd edition, McGraw-Hill Book Company, Copyright 1955, 1956). Some of the electronic elements mentioned here are also described there.
The trigger circuit suppresses signals which remain below a specified minimum level indicated by the lines 98a and 98b and only transmits signals which extend beyond this. In this way, both a display and a comparison with a predetermined standard are achieved electrically, and the output variable of the trigger circuit can be made visible directly on a registration sheet and / or by a display lamp. The signals S46b in FIG. 4B exceed the predetermined minimum trigger voltage 98b and therefore actuate the connected display device. The signal S46a (FIG. 3B) with a low amplitude is suppressed.
The standards and minimum standards mentioned can be changed by using an adjustable differentiating circuit 40 with variable switching elements (not shown). In this way, the parameters and sensitivity of the differentiating circuit 40 and the operating threshold of the device can be set in order to detect different types or states of the agglutination reaction, in order to screen out background disturbances or to select certain types of limitations. A trained user can set the device 8 so that he is able to detect a certain amount of agglutination for a certain type of sample. If the working threshold is set, the device works routinely and identifies all samples of this type evenly.
The readings from the device are much more consistent and reliable than visual comparisons, even when made by a very trained and experienced observer. The readings differ in a characteristic way from those of electronic counters, such as those used for counting bacteria or blood cells, because the working criterion in the invention is the relative sharpness of the delimitation of different areas from each other and not just the different amount of light that is absorbed in different areas, or the absolute size of the light intensity.