CA3058810A1

CA3058810A1 - Immunotherapie anti-tumorale basee sur des levures

Info

Publication number: CA3058810A1
Application number: CA3058810A
Authority: CA
Inventors: Clement De Obaldia; Pierre-Yves NOGUE
Original assignee: Inovactis
Current assignee: Inovactis
Priority date: 2017-04-04
Filing date: 2018-04-04
Publication date: 2018-10-11
Also published as: FR3064644A1; JP2020512824A; CN110799637A; US20200197499A1; WO2018185431A1; EP3607047A1

Abstract

La présente invention est relative à un procédé de préparation d'une levure immunothérapeutique, ladite levure immunothérapeutique exprimant à sa paroi un ou plusieurs antigène(s) de tumeur, ainsi qu'à des levures immunothérapeutiques susceptibles d'être obtenues par la mise en uvre du procédé de l'invention.

Description

wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 Immunothérapie anti-tumorale basée sur des levures La présente invention est relative à un procédé de préparation d'une levure immunothérapeutique, ladite levure immunothérapeutique exprimant à sa paroi un ou plusieurs antigène(s) de tumeur, ainsi qu'à des levures immunothérapeutiques susceptibles d'être obtenues par la mise en oeuvre du procédé de l'invention.
ART ANTERIEUR
Le traitement du cancer est un domaine regroupant différents axes thérapeutiques parmi lesquels se trouvent les immunothérapies. Parmi les immunothérapies, se distinguent les immunothérapies passives et les immunothérapies actives, ces dernières pouvant être ciblées ou non ciblées. L'un des avantages des immunothérapies actives réside dans le fait qu'elles peuvent passer la barrière hémato-encéphalique contrairement aux thérapies de type chimiothérapie.
Il a en effet été démontré que les lymphocytes étaient capables de migrer à
travers la barrière hémato-encéphalique (Larochelle C., Alvarez 31, Prat A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis. FEBS Lett. 2011 Dec 1; 585(23):3770-80).
Outre cet avantage de passage de la barrière hémato-encéphalique, les immunothérapies présentent de manière générale moins d'effets indésirables que les thérapies anti-cancéreuses traditionnelles, ce qui est particulièrement vérifié pour les immunothérapies ciblées. C'est pourquoi, les immunothérapies sont particulièrement appropriées dans le traitement de cancers de haut grade au stade métastatique, grade III ou IV
chez des patients déjà très affaiblis.
Des immunothérapies actives non ciblées, comme les anticorps anti-PD-1 et ou les anticorps anti-CTLA4, améliorent significativement la survie médiane des patients.
Cependant, ces traitements bénéficient à un faible pourcentage de patients et s'accompagnent d'effets secondaires immunologiques non négligeables comme les maladies auto-immunes. Pour s'affranchir des risques de maladies auto-immunes et améliorer leur efficacité, des immunothérapies actives ciblées dirigées contre un antigène tumoral défini ont été développées. Les cellules dendritiques sont des acteurs majeurs de ces nouvelles immunothérapies car elles coordonnent à la fois une réponse immunitaire innée et une réponse adaptative contre les cellules cancéreuses. Un des objectifs des immunothérapies actives ciblées est donc de stimuler ces cellules dendritiques pour

2 wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 générer des lymphocytes T actifs contre la tumeur, des lymphocytes T tueurs ou lymphocytes T cytotoxiques. L'action de ces lymphocytes T est d'induire à la fois une régression de la taille de la tumeur, pouvant aller jusqu'à la disparition de la tumeur, et d'induire une mémoire immunologique, limitant les rechutes.
La levure Saccharomyces cerevisiae a été utilisée avec succès comme vecteur d'immunothérapies actives ciblées, car elle constitue un excellent adjuvant pour l'induction des cellules dendritiques, qui activent à leur tour les lymphocytes T
cytotoxiques pour détruire les cellules cancéreuses. Pour permettre l'activation des cellules dendritiques, la levure doit produire l'antigène tumoral à cibler. Le brevet US
5 830 463 décrit l'utilisation d'une levure non pathogène, génétiquement modifiée pour exprimer au moins un composé capable de moduler la réponse immunitaire et démontre que cette levure génétiquement modifiée est efficace pour stimuler aussi bien la réponse cellulaire que la réponse humorale, lorsque la levure est administrée à un mammifère. Le brevet US 8 734 778 décrit des levures capables d'exprimer divers antigènes de tumeur dans leur cytosol, lesdites levures entières étant tuées par la chaleur avant injection. La demande de brevet U52008/0171059 décrit l'utilisation de levures exprimant un antigène tumoral à leur surface plutôt que dans le cytosol.
Néanmoins, il existe un besoin de nouvelles thérapies anticancéreuses efficaces et/ou qui présenteraient des effets secondaires indésirables moindres, notamment par rapport aux levures immunothérapeutiques existantes.
Les inventeurs ont observé de manière inattendue qu'une levure génétiquement modifiée pour exprimer à sa paroi un ou plusieurs antigène(s) de tumeur et ayant été
perméabilisée permet de stimuler efficacement les lymphocytes T cytotoxiques contre la tumeur.
RESUME DE L'INVENTION
La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une levure immunothérapeutique, ledit procédé comprenant les étapes de:
a) obtenir une levure génétiquement modifiée qui exprime à sa paroi un ou plusieurs antigène(s) de tumeur et éventuellement un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques ;
b) perméabiliser la levure génétiquement modifiée afin d'obtenir une levure immunothérapeutique, éventuellement inactiver la levure avant ou après l'étape de perméabilisation.

3 wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 Un autre objet de l'invention consiste en une levure immunothérapeutique susceptible d'être obtenue par la mise en uvre du procédé de préparation selon l'invention.
Un autre objet de l'invention concerne une levure immunothérapeutique génétiquement modifiée et perméabilisée qui exprime à sa paroi :
(i) un ou plusieurs antigène(s) de tumeur, de préférence choisi(s) parmi Melan-A, Tyrosinase, gp100, MAGE-B1, MAGEA1, MAGEA10, MAGEA11, MAGEA12, MAGEA2, MAGEA2B, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA8, MAGEA9, MAGEB1; MAGEB10, MAGEB16, MAGEB18, MAGEB2, MAGEB3, MAGEB4, MAGEB5, MAGEB6, MAGEB6B, New York Esophageal 1 antigène (NY-ESO-1), MAGEC1, MAGEC2, L-antigène (LAGE), TRP-1, TRP-2, P53, KRAS, CEA, WT1, MUC1, SART3, SURVIVIN 2B, RNF43/TOMM34, TGFBRII, HER2/neu, BRAF, PI3K, APC, BAX, beta2-microglobuline, télomérase ou NRAS ; et (ii) éventuellement un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques.
Un autre objet de l'invention consiste en une composition immunothérapeutique comprenant une levure immunothérapeutique selon l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Un autre objet de l'invention concerne une levure selon l'invention ou une composition selon l'invention pour son utilisation comme médicament, notamment pour son utilisation dans le traitement ou la prévention du cancer.
DESCRIPTION DETAILLEE
Définitions On entend par peptide une séquence d'acides aminés qui comprend généralement de 2 à 9 acides aminés. On entend par polypeptide une séquence d'acides aminés qui comprend généralement de 10 à 100 acides aminés. On entend par protéine une séquence d'acides aminés qui comprend généralement plus de 100 acides aminés.
On entend par levure tout champignon unicellulaire, ou tout micro-organisme eucaryote composé d'une paroi cellulaire, d'une membrane cytosplasmique, d'un noyau et de mitochondries, capable d'une reproduction asexuée par bourgeonnement ou pas scission. Parmi les levures bien connues, se trouvent les ascomycètes (Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula), les basidiomycètes (Sporobolomyces) et les deutéromycètes. Le terme levure(s) s'entend aussi bien au singulier qu'au pluriel.

4 wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 On entend par levure génétiquement modifiée , une levure dont le patrimoine génétique est artificiellement modifié par l'introduction d'une ou plusieurs séquences nucléiques (ou transgène(s)), de manière transitoire ou définitive, de façon à
produire un ou plusieurs peptides, polypeptides et/ou protéines dans ladite levure. Les transgènes peuvent dériver de séquences nucléiques de la même espèce que la levure génétiquement modifiée (e.g. le polypeptide d'ancrage), d'une autre espère de levure que la levure génétiquement modifiée (e.g. le polypeptide d'ancrage) ou d'une autre espèce procaryote ou eucaryote (e.g. l'antigène de tumeur). Dans le cadre de l'invention, le transgène peut, par exemple, coder une ou plusieurs protéine(s) de fusion de formule (la) :
[protéine ou polypeptide de ciblage des cellules dendritiques]-[antigène de tumeur]x-[linker peptidique]nr[polypeptide ou protéine d'ancrage à la paroi de la levure génétiquement modifiée] (la) ; n est égal à 0 ou 1, m est égal à 0 ou 1, et x est un entier allant de 1 à 300, de préférence allant de 1 à 50, de préférence allant de 1 à
9, de préférence allant de 1 à 5.
Ainsi, une levure génétiquement modifiée qui exprime à sa paroi un ou plusieurs antigène(s) de tumeur est une levure dont le patrimoine génétique est artificiellement modifié par l'introduction d'une ou plusieurs séquence(s) nucléique(s) codant un ou plusieurs antigène(s) de tumeur à la paroi de ladite levure, par exemple codant une protéine de fusion de formule (la). Dans la présente description, les termes levure génétiquement modifiée et levure modifiée sont interchangeables.
On entend par antigène(s) de tumeur , tout ou partie d'une protéine issue d'une protéine tumorale et susceptible de déclencher une réponse immunitaire humorale et/ou cellulaire contre une tumeur. Avantageusement, le ou les antigène(s) de tumeur sont/est choisi(s) parmi Melan-A, Tyrosinase, gp100, MAGE-B1, MAGEA1, MAGEA10, MAGEA11, MAGEA12, MAGEA2, MAGEA2B, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA8, MAGEA9, MAGEB1; MAGEB10, MAGEB16, MAGEB18, MAGEB2, MAGEB3, MAGEB4, MAGEB5, MAGEB6, MAGEB6B, New York Esophageal 1 antigène (NY-ESO-1), MAGEC1, MAGEC2, L-antigène (LAGE), TRP-1, TRP-2, P53, KRAS, CEA, VVT1, MUC1, SART3, SURVIVIN 2B, RNF43/TOMM34, TGFBRII, HER2/neu, BRAF, PI3K, APC, Be, beta2-microglobuline, télomérase ou NRAS.
L'ovalbumine, qui n'est pas un antigène de tumeur au sens de l'invention, est utilisée comme antigène modèle dans de très nombreuses expérimentations, car les épitopes de la protéine ovalbumine se lient au CMH I et CMH II chez la souris. Les épitopes de l'ovalbumine sont parmi les mieux caractérisés pour leur immunogénicité très spécifique, wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 c'est à dire leur capacité à déclencher une réponse immunitaire ciblée contre ces épitopes. Pour caractériser une réponse immunitaire in vivo spécifique, on dispose de souris transgéniques OT-1 dont les lymphocytes T sont OVA-spécifiques et reconnaissent spécifiquement les résidus OVA 257-264. La réponse immunitaire spécifique peut être

5 également étudiée in vitro avec la lignée cellulaire hybridome B3Z de lymphocytes T
spécifiques de l'épitope OVA 257-264.
On entend par exprimé à la paroi le fait d'être présenté à la paroi de la levure. Dans le cadre de l'invention un antigène exprimé à la paroi est un antigène ancré à
la paroi de la levure, par exemple via une protéine ou un polypeptide d'ancrage.
On entend par levure perméabilisée , une levure qui a subi un traitement chimique, enzymatique ou mécanique, visant à perméabiliser (ou perforer) sa paroi et/ou sa membrane cytoplasmique. Les moyens pour perméabiliser la paroi et/ou la membrane cytoplasmique d'une levure sont bien connus de l'homme du métier et peuvent être utilisés sans difficulté particulière pour obtenir les levures perméabilisées.
La perméabilisation d'une levure entière permet l'accès aux protéines contenues dans son cytosol (Optimization of permeabilization process of yeast cells for catalase activity using response surface methodology, Trawczynska et al, 2015) et/ou dans son périplasme. Les traitements permettant de perméabiliser la membrane cytoplasmique modifient la membrane cytoplasmique de la levure en formant des pores qui permettent la diffusion libre de petites molécules comme les produits ou les substrats d'enzymes, mais maintiennent l'essentiel des protéines dans le cytosol (Parmjit S. Panesar , Reeba Panesar, Ram S. Singh and Manav B. Bera, 2007. Permeabilization of Yeast Cells with Organic Solvents for B-galactosidase Activity. Research Journal of Microbiology, 2: 34-41).
La paroi de la levure est naturellement perméable aux protéines jusqu'à
environ 70 kDa.
Ainsi, le terme perméabiliser selon l'invention s'entend également comme une augmentation de la perméabilité de la paroi de la levure.
Par exemple, il est possible de déterminer si une levure est perméabilisée ou pas en mesurant l'absorbance à 405nm d'une levure incubée avec du p-nitrophenylphosphate (pNPP) pendant 30 min. Dans ces conditions, une levure est perméabilisée lorsqu'elle présente une absorbance à 405nm supérieure ou égale à 0,1, par exemple supérieure ou égale à 0,2. Le pNPP est le substrat d'une enzyme, la phosphatase alcaline, qui est naturellement présente dans le cytosol de la levure. Le pNPP ne pénètre pas dans le cytosol d'une levure non-perméabilisée. Par contre, lorsque la levure est perméabilisée, le pNPP peut rentrer dans la levure et être hydrolysé par la phosphatase alcaline présente dans le cytosol. Le pNPP hydrolysé prend alors une couleur jaune lisible par l'absorbance

6 wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 à 405 nm (A rapid method for determination of acid phosphatase activity of whole yeast cells, Galabova et al, June 2008, Letters in Applied Microbiology 16(3):161 -163).
L'Exemple 9 présente le protocole détaillé d'un test permettant de déterminer si une levure est perméabilisée ou pas.
On entend par levure immunothérapeutique , une levure capable d'induire une réponse immunitaire humorale ou cellulaire chez l'homme ou l'animal, permettant ainsi de traiter ou de prévenir le cancer.
Procédé de préparation des levures La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une levure immunothérapeutique, ledit procédé comprenant les étapes de:
a) obtenir une levure génétiquement modifiée qui exprime à sa paroi un ou plusieurs antigène(s) de tumeur et éventuellement un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques ;
b) perméabiliser la levure génétiquement modifiée afin d'obtenir une levure immunothérapeutique, éventuellement inactiver la levure avant ou après l'étape de pernnéabilisation.
Lorsque le procédé comprend une étape d'inactivation, les étapes d'inactivation et de perméabilisation peuvent être faites dans n'importe quel ordre.
Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention comprend les étapes de:
a) obtenir une levure génétiquement modifiée qui exprime à sa paroi un ou plusieurs antigène(s) de tumeur et éventuellement un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques ;
b) inactiver la levure génétiquement modifiée ; et c) perméabiliser la levure génétiquement modifiée inactivée afin d'obtenir une levure immunothérapeutique.
Selon un autre mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention comprend les étapes de :
a) obtenir une levure génétiquement modifiée qui exprime à sa paroi un ou plusieurs antigène(s) de tumeur et éventuellement un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques ;
b) perméabiliser la levure génétiquement modifiée ; et c) inactiver la levure génétiquement modifiée perméabilisée afin d'obtenir une levure immunothérapeutique.

7 wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 Avantageusement, le ou les antigène(s) de tumeur, exprimés à la paroi de la levure sont orientés vers le milieu extérieur de la levure et non vers le périplasme de la levure. Une orientation vers l'extérieur de la levure permet, après phagocytose des levures, la dégradation plus rapide des antigènes de tumeur par les protéases des cellules dendritiques, ce qui facilite ainsi la cross-présentation des antigènes de tumeur aux lymphocytes tueurs (Howland, Wittrup, Antigen Release Kinetics in the Phagosome Are Critical to Cross-Presentation Efficiency, 3 Immunol. 2008 February 1; 180(3) :1576).
L'étape d'inactivation vise à inactiver les levures. On entend par inactiver une levure un traitement qui consiste à stopper la croissance par division cellulaire de la levure.
L'inactivation d'une levure peut être réalisée par tout moyen connu de l'homme du métier pour inactiver des micro-organismes. Avantageusement, l'inactivation permet également de fixer la levure. Avantageusement, la levure est inactivée avec du paraformaldéhyde (PFA) à raison de 0,5% dans du PBS (v/v).
L'étape de perméabilisation est réalisée au moyen d'un traitement chimique, enzymatique ou mécanique, entrainant la perméabilisation de la paroi et/ou de la membrane cytoplasmique.
Dans un mode de réalisation particulier, la levure génétiquement modifiée est perméabilisée avec un solvant, par exemple un solvant polaire. Le solvant peut être choisi parmi, l'éthanol, le sorbitol, le 2-mercaptoethanol, le benzène, le n-butanol, le n-propanol, le triton X-100, l'isopropanol, le méthanol, le toluène, l'acétone ou un mélange de lithium acétate et de soude. Dans un autre mode de réalisation particulier, la levure génétiquement modifiée est perméabilisée avec une enzyme, par exemple la f3-1,3-glucanase (Glu). Dans un autre mode de réalisation particulier, la levure génétiquement modifiée est perméabilisée mécaniquement en soumettant la levure à des cycles de congélations/décongélations (Hong-wei Zhao et al., 2011, Biotechnology 8t Biotechnological Equipment). Dans un mode de réalisation préféré, la levure génétiquement modifiée est perméabilisée avec de l'éthanol ou de l'isopropanol, par exemple avec un mélange de 50% d'éthanol et 50 % d'eau (volume à volume ;
v/v), par exemple pendant environ 15 minutes, environ 20 minutes ou environ 25 minutes.
Dans un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, l'étape a) est :
obtenir une levure génétiquement modifiée qui exprime à sa paroi une ou plusieurs protéines de fusion de formule (la) : [protéine ou polypeptide de ciblage des cellules dendritiques]-[antigène de tumeur]x-[linker peptidique],-[polypeptide ou protéine d'ancrage à la paroi de la levure génétiquement modifiée] (la) ; n est égal à
0 ou 1, m est égal à 0 ou 1, et x est un entier allant de 1 à 300, de préférence allant de 1 à 50, de

8 wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 préférence allant de 1 à 9, de préférence allant de 1 à 5, par exemple de 1 à
4, de 1 à 3, de 1 à 2, par exemple égal à 1, égal à 2, égal à 3, égal à 4, égal à 5.
Dans le cadre de la présente description, lorsque x est un entier supérieur à
1, c'est-à-dire lorsque x est un entier allant de 2 à 300, les antigènes de tumeur peuvent être identiques ou différents. Par exemple, les antigènes de tumeur peuvent être tous différents.
Dans le cadre de la présente description, lorsque x est un entier supérieur à
1, c'est-à-dire lorsque x est un entier allant de 2 à 300, les antigènes de tumeur peuvent être séparés ou pas par un peptide de liaison.
Dans le cadre de la présente description, lorsque x est un entier supérieur à
1, c'est-à-dire lorsque x est un entier allant de 2 à 300, les antigènes de tumeur peuvent être identiques ou différents. Par exemple, lorsque x=2, les antigènes de tumeur peuvent être deux antigènes MAGEA1 ou un antigène MAGEA1 et un antigène MAGEA2. Dans ce mode de réalisation, les antigènes de tumeur peuvent être mis l'un après l'autre ou séparés par une séquence peptidique qui relie lesdits antigènes de tumeur entre eux.
Les protéines de fusion sont largement décrites dans l'art antérieur. Une protéine de fusion est une protéine obtenue par la combinaison de différents peptides, polypeptides et/ou protéines. Les protéines de fusion peuvent également être appelées protéines chimères.
Dans un mode de réalisation particulier, l'étape a) comprend les étapes de :
al) introduire dans une levure un ou plusieurs vecteur(s) comprenant chacun une séquence nucléique de formule (lia) ou (lib) :
[séquence nucléique codant un polypeptide d'adressage à la paroi de la levure génétiquement modifiée]-[séquence nucléique codant un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques],-[séquence nucléique codant un antigène de tumeur]-[séquence [séquence nucléique codant un linker peptidique],-[séquence nucléique codant un polypeptide ou une protéine d'ancrage à la paroi de la levure génétiquement modifiée]
(lia), n est égal à 0 ou 1, m est égal à 0 ou 1, et x est un entier allant de 1 à 300, de préférence allant de 1 à 50, de préférence allant de 1 à 9, de préférence allant de 1 à 5, par exemple de 1 à 4, de 1 à 3, de 1 à 2, par exemple égal à 1, égal à 2, égal à 3, égal à
4, égal à 5 ;
[séquence nucléique codant un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques]-[séquence nucléique codant un antigène de tumeur]-{séquence nucléique codant un linker peptidique],-[séquence nucléique codant un polypeptide ou une protéine d'ancrage à la paroi de la levure génétiquement modifiée]-[séquence nucléique codant un polypeptide d'adressage à la paroi de la levure génétiquement modifiée] (IIb), n est égal

9 wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 à 0 ou 1, m est égal à 0 ou 1, et x est un entier allant de 1 à 300, de préférence allant de 1 à 50, de préférence allant de 1 à 9, de préférence allant de 1 à 5, par exemple de 1 à 4, de 1 à 3, de 1 à 2, par exemple égal à 1, égal à 2, égal à 3, égal à 4, égal à
5 ;
afin d'obtenir une levure génétiquement modifiée capable d'exprimer à sa paroi une ou plusieurs protéine(s) de fusion de formule (la) :
[protéine ou polypeptide de ciblage des cellules dendritiques]-{antigène de tumeurlx-[linker peptidique]mlpolypeptide ou protéine d'ancrage à la paroi de la levure génétiquement modifiée] (la), n est égal à 0 ou 1, m est égal à 0 ou 1, et x est un entier allant de 1 à 300, de préférence allant de 1 à 50, de préférence allant de 1 à
9, de préférence allant de 1 à 5, par exemple de 1 à 4, de 1 à 3, de 1 à 2, par exemple égal à
1, égal à 2, égal à 3, égal à 4, égal à 5; et a2) cultiver la levure génétiquement modifiée dans des conditions adaptées pour l'expression de la ou des protéine(s) de fusion à la paroi de la levure génétiquement modifiée.
Au sens de la présente invention, le terme vecteur doit être pris dans son sens le plus large. En particulier, un vecteur désigne un véhicule utilisé pour introduire une séquence nucléotidique dans une levure, pour son expression, pour sa réplication et/ou pour son intégration dans le génome de ladite levure. Les différents types de vecteurs sont largement connus de l'homme de l'art et tous types de vecteurs peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention. Le ou les vecteur(s) sont aussi appelé(s) plasmide(s). Le ou les plasmides peuvent être linéarisés pour permettre la recombinaison homologue dans la levure, comme expliqué dans les exemples.
Les différentes séquences nucléiques peuvent être assemblées dans un vecteur par la technique Golden Gate. (Engel et al., 2008, PLos One et EP2395087). Cette technique permet de digérer et d'assembler simultanément et de manière directionnelle plusieurs séquences nucléiques en une seule réaction, grâce à l'utilisation d'enzymes de restriction de type Ils, des endonucléases qui reconnaissent des sites particuliers puis qui clivent des séquences nucléiques en dehors de leur site de reconnaissance. L'introduction dans le génome de la levure, des séquences nucléiques (i.e. du ou des vecteurs) est réalisée dans un mode réplicatif ou dans un mode intégratif. Dans un mode intégratif, les séquences nucléiques sont insérées dans le génome de la levure de manière stable. Dans un mode réplicatif, les séquences nucléiques sont insérées dans la levure de manière transitoire à
l'aide d'un plasmide réplicatif.
Le polypeptide d'adressage à la paroi de la levure génétiquement modifiée ou polypeptide d'adressage permet d'adresser la protéine de fusion (Ta) à la paroi de la levure génétiquement modifiée. Cet adressage à la paroi permet ensuite à la protéine de fusion de s'ancrer à la paroi de la levure génétiquement modifiée.
Avantageusement, la séquence nucléique codant le polypeptide d'adressage est située à l'extrémité -3' de la séquence nucléique (Ha) ou (IIb) codant la protéine de fusion (la). Ainsi, le polypeptide 5 d'adressage est avantageusement en N-terminal de la protéine de fusion (la). Dans un mode de réalisation particulier, le polypeptide d'adressage est naturellement présent dans le polypeptide ou la protéine d'ancrage (par exemple dans la séquence d'Aga2p). Dans un autre mode de réalisation particulier, le polypeptide d'adressage est rajouté
artificiellement à la séquence nucléique codant la protéine de fusion (la) lorsque le

10 polypeptide ou la protéine d'ancrage ne comprend pas naturellement de polypeptide d'adressage (par exemple dans la séquence Sed1p). Dans un mode de réalisation particulier, lorsque le polypeptide ou la protéine d'ancrage ne comprend pas naturellement de polypeptide d'adressage, le polypeptide d'adressage est le prepro alpha factor leader peptide issue de la phéromone de levure (Mf(alpha)1p). La séquence nucléique codant Mf(alpha)lp est SEQ ID N 12.
L'étape a2) peut être mise en oeuvre dans tout milieu de culture assurant la viabilité et la reproductibilité de la levure. Les milieux de culture des levures sont bien connus de l'homme du métier. Citons pour exemple, un milieu glucose ou un milieu galactose.
Dans un mode de réalisation particulier, le ou les vecteurs comprennent une séquence nucléique codant un linker peptidique faisant le lien entre la protéine ou le polypeptide d'ancrage et le ou les antigène(s) de tumeur. Ainsi, dans ce mode de réalisation, la séquence nucléique (Ha) ou (IIb) comprend une séquence nucléique codant le linker peptidique (i.e. m=1 pour la séquence nucléique codant le linker peptidique).
On entend par linker peptidique ou bras de liaison peptidique , une séquence d'acides aminés qui connecte un polypeptide ou protéine à un autre polypeptide ou protéine. Dans le cadre de l'invention, le linker peptidique connecte la protéine ou le polypeptide d'ancrage et le ou les antigène(s) de tumeur. Dans un mode de réalisation particulier, le linker peptidique est G4S, composé de 4 glycines et d'une sérine (GGGGS).
Le linker G4S est couramment utilisé dans l'ingénierie des protéines du fait de sa flexibilité
et de sa résistance aux protéases.
Le ou les vecteur(s) peu(ven)t aussi comprendre une séquence nucléique codant un tag protéique (ou tag), comme par exemple le tag c-myc. Ainsi, la protéine de fusion peut comprendre un tag à son extrémité. Le tag est utilisé pour permettre la détection du ou des antigène(s) exprimé(s) à la paroi des levures.

Dans un mode de réalisation particulier, la levure est choisie parmi le genre Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Ogataea ou Candida.
Avantageusement, la levure est choisie dans le genre Saccharomyces, de préférence Saccharomyces cerevisiae. Saccharomyces cerevisiae est particulièrement avantageux du fait des nombreux travaux montrant son innocuité pour l'homme ou l'animal. La levure INVSC1 (Life Technologies) en est un exemple. Saccharomyces cerevisiae est également bien connue pour sa tolérance lors de son administration chez l'homme ou l'animal.
Saccharomyces cerevisiae est notamment utilisée dans le traitement de rhinites ou rhinopharyngites chroniques, en association avec du souffre et des vitamines, dont le but est de réduire l'inflammation des muqueuses du nez et de la gorge. Cette levure est par ailleurs utilisée comme système de production, par exemple de vaccins, comme le vaccin anti-hépatite B.
La protéine ou le polypeptide d'ancrage permet de maintenir la protéine de fusion (la) au niveau de la paroi de la levure génétiquement modifiée. Avantageusement, la protéine ou le polypeptide d'ancrage est une protéine ou un polypeptide exprimé
naturellement au niveau de la paroi des levures. La protéine ou le polypeptide d'ancrage peut être choisi parmi une protéine ou un polypeptide naturellement exprimé par l'espèce de levure choisie ou une protéine ou polypeptide exogène, c'est-à-dire un polypeptide ou une protéine non exprimé(e) par l'espèce de levure choisie, par exemple un polypeptide ou une protéine naturellement exprimé(e) par une autre espèce de levure que l'espèce de levure choisie pour être génétiquement modifiée. Avantageusement, la protéine ou le polypeptide d'ancrage est un polypeptide ou une protéine de levure choisi(e) parmi Aga2p, Sed1p, Cwplp, Cwp2p, Flo1p C, Tip1p ou Tir1p/Srp1p. Dans un mode de réalisation préféré, la protéine ou le polypeptide d'ancrage est choisi(e) parmi Aga2p ou Sedlp. La séquence nucléique codant Aga2p est SEQ ID No :10 et la séquence nucléique codant Sed1p est SEQ ID No : 11.
Lorsque le polypeptide Aga2p est utilisé dans la protéine de fusion (La), il est nécessaire que la levure génétiquement modifiée exprime également Aga1p. En effet, Aga1p s'intègre dans la paroi de la levure et Aga2p se lie à Aga1p via un pont disulfure (voir Figure 1 et Figure 2). La levure choisie pour être génétiquement modifiée peut exprimer naturellement Aga1p. Néanmoins, lorsque la protéine ou le polypeptide d'ancrage est Aga2p, le procédé selon l'invention comprend de préférence l'introduction dans la levure d'une séquence nucléique codant Aga1p. Cette séquence nucléique codant Aga1p peut être portée par un vecteur de l'étape al.) ou par un autre vecteur qui est également introduit dans la levure. La séquence nucléique codant Aga1p est SEQ ID No: 9.

wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 Dans un mode de réalisation particulier, le ou les vecteurs utilisés à l'étape a), comprend/comprennent en outre une séquence nucléique codant une protéine ou un polypeptide de ciblage des cellules dendritiques. Ainsi, dans ce mode de réalisation, la séquence nucléique (lia) ou (llb) comprend séquence nucléique codant un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques (i.e. n=1 pour la séquence nucléique codant un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques).
On entend par protéine ou polypeptide de ciblage des cellules dendritiques , toute molécule de nature peptidique permettant le rapprochement entre la levure immunothérapeutique de l'invention et les cellules dendritiques de l'homme ou de l'animal. Ce rapprochement permet aux cellules dendritiques d'internaliser la levure immunothérapeutique et donc d'internaliser le ou les antigène(s) de tumeur, exprimés à
la paroi de ladite levure. En d'autres termes, la protéine ou le polypeptide de ciblage permet de faciliter l'interaction entre la levure immunothérapeutique et les cellules dendritiques de l'homme ou l'animal. Cette interaction facilite l'endocytose du ou des antigène(s) de tumeur et, par conséquent, la présentation de ce ou ces antigène(s) de tumeur par les cellules dendritiques aux lymphocytes T.
Les protéines ou polypeptides de ciblage des cellules dendritiques comprennent toutes protéines ou polypeptides capables de lier spécifiquement un récepteur endocytique des cellules dendritiques, par exemple le récepteur DEC205 (CD205).
Dans un mode de réalisation particulier, le polypeptide ou la protéine de ciblage des cellules dendritiques est choisi(e) parmi :
- un anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre (i.e. capable de se lier spécifiquement à) le récepteur DEC205 (CD205) ; ou -l'activateur du plasminogène (PLA) de la bactérie Yersinia pestis, ou une séquence dérivée de l'activateur du plasminogène (PLA) de la bactérie Yersinia pestis.
PLA
est connu pour se lier naturellement à CD205.
Un fragment d'anticorps peut être choisi parmi les fragments Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab1)2; les diabodies; les anticorps linéaires; les anticorps avec une seule chaine (e.g.
scFv), de préférence un fragment d'anticorps selon l'invention est un scFv, par exemple un scFv dirigé contre CD205 de séquence SEQ ID No: 13.
La protéine CD205 est une glycoprotéine membranaire intégrale de 205 kDa, homologue au récepteur du mannose des macrophages et aux récepteurs apparentés. CD205 un récepteur multilectine endocytique qui est utilisé par les cellules dendritiques et par les cellules épithéliales du thymus pour diriger les antigènes capturés dans les espaces extracellulaires vers un compartiment spécialisé de traitement des antigènes.
L'activateur wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 de plasminogène PLA de Yersinia pestis est une protéase qui joue un rôle important dans la progression de la bactérie. Il a été montré que Yersinia pestis était capable d'utiliser le récepteur DEC205 via l'activateur de plasminogène PLA pour se disséminer chez la souris (3 Biol Chem. 2008 Nov 14;283(46):31511-21).
Dans un mode de réalisation particulier, l'activateur du plasminogène (PLA) peut être la séquence entière correspondante ou une séquence partielle ou une séquence entière mutée ou encore une séquence partielle mutée. Les séquences partielles et/ou mutées de PLA sont aussi appelées des séquences dérivées de PLA.
Dans un mode de réalisation particulier, le ou les antigène(s) de tumeur, exprimés à la paroi des levures immunothérapeutiques sont choisis parmi des antigènes de tumeurs solides ou liquides, de préférence parmi des antigènes de tumeurs solides.
Avantageusement, le ou les antigène(s)de tumeur sont/est choisi(s) parmi Melan-A, Tyrosinase, gp100, MAGE-B1, MAGEA1, MAGEA10, MAGEAll, MAGEA12, MAGEA2, MAGEA2B, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA8, MAGEA9, MAGEB1; MAGEB10, MAGEB16, MAGEB18, MAGEB2, MAGEB3, MAGEB4, MAGEB5, MAGEB6, MAGEB6B, New York Esophageal 1 antigène (NY-ESO-1), MAGEC1, MAGEC2, L-antigène (LAGE), TRP-1, TRP-2, P53, KRAS, CEA, VVT1, MUC1, SART3, SURVIVIN 2B, RNF43/TOMM34, TGFBRII, HER2/neu, BRAF, PI3K, APC, BAX, beta2-microglobuline, télomérase ou NRAS.
Levure immunothérapeutique Un autre objet de l'invention est une levure immunothérapeutique, susceptible d'être obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention.
Un autre objet de l'invention est une levure immunothérapeutique génétiquement modifiée et perméabilisée qui exprime à sa paroi :
(i) un ou plusieurs antigène(s) de tumeur, de préférence choisi(s) parmi Melan-A, Tyrosinase, gp100, MAGE-B1, MAGEA1, MAGEA10, MAGEA11, MAGEA12, MAGEA2, MAGEA2B, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA8, MAGEA9, MAGEB1; MAGEB10, MAGEB16, MAGEB18, MAGEB2, MAGEB3, MAGEB4, MAGEB5, MAGEB6, MAGEB6B, New York Esophageal 1 antigène (NY-ESO-1), MAGEC1, MAGEC2, L-antigène (LAGE), TRP-1, TRP-2, P53, KRAS, CEA, WT1, MUC1, SART3, SURVIVIN 2B, RNF43/TOMM34, TGFBRII, HER2/neu, BRAF, PI3K, APC, BAX, beta2-microglobuline, télomérase ou NRAS ; et (ii) éventuellement un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques.
De préférence, la levure immunothérapeutique selon l'invention est génétiquement modifiée, perméabilisée et inactivée.

wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 Dans un mode de réalisation particulier, la levure de l'invention exprime à sa paroi une protéine de fusion de formule (la) :
[protéine ou polypeptide de ciblage des cellules dendritiques]-[antigène de tumeurh-[linker peptidiqueklpolypeptide ou protéine d'ancrage à la paroi de la levure génétiquement modifiée] (la) ;
n est égal à 0 ou 1, m est égal à 0 ou 1, et x est un entier allant de 1 à
300, de préférence allant de 1 à 50, de préférence allant de 1 à 9, de préférence allant de 1 à 5, par exemple de 1 à 4, de 1 à 3, de 1 à 2, par exemple égal à 1, égal à 2, égal à 3, égal à
4, égal à 5.
Dans un mode de réalisation particulier, l'agent de ciblage des cellules dendritiques est choisi parmi un anticorps capable de se lier spécifiquement à la protéine DEC205, un fragment d'anticorps capable de se lier spécifiquement à la protéine DEC205, l'activateur du plasminogène (PLA) de la bactérie Yersinia pestis, ou une séquence dérivée de l'activateur du plasminogène (PLA) de la bactérie Yersinia pestis. L'agent de ciblage des cellules dendritiques est décrit précédemment.
Comme décrit précédemment :
- lorsque x est un entier supérieur à 1, c'est-à-dire lorsque x est un entier allant de 2 à 300, les antigènes de tumeur peuvent être identiques ou différents. Par exemple, les antigènes de tumeur peuvent être tous différents.
- lorsque x est un entier supérieur à 1, c'est-à-dire lorsque x est un entier allant de 2 à 300, les antigènes de tumeur peuvent être séparés ou pas par un peptide de liaison ; et/ou - lorsque x est un entier supérieur à 1, c'est-à-dire lorsque x est un entier allant de 2 à 300, les antigènes de tumeur peuvent être identiques ou différents. Par exemple, lorsque x=2, les antigènes de tumeur peuvent être deux antigènes MAGEA1 ou un antigène MAGEA1 et un antigène MAGEA2. Dans ce mode de réalisation, les antigènes de tumeur peuvent être mis l'un après l'autre ou séparés par une séquence peptidique qui relie lesdits antigènes de tumeur entre eux.
Composition immunothérapeutique .. Un autre objet de l'invention est une composition immunothérapeutique comprenant une levure telle que décrite précédemment, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
On entend par composition immunothérapeutique , une composition destinée à
la prévention ou au traitement d'une pathologie, après administration chez l'homme ou chez l'animal, ladite composition comprenant un ou plusieurs composants capables de stimuler une réponse immunitaire humorale et/ou une réponse immunitaire à médiation cellulaire.

wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 Sont compris parmi les composants capables de stimuler une réponse immunitaire humorale et/ou une réponse immunitaire à médiation cellulaire, les antigènes de tumeurs, les microorganismes tels les virus, les bactéries ou les levures, mais également les lysats cellulaires, les cellules dendritiques, les lymphocytes cytotoxiques modifiés 5 génétiquement, les cytokines, les inhibiteurs de points de contrôle du système immunitaire.
Plus particulièrement, la composition immunothérapeutique selon l'invention est destinée à la prévention ou au traitement d'un cancer. En particulier, la composition immunothérapeutique est capable de stimuler une réponse immunitaire à
médiation 10 cellulaire. La réponse immunitaire à médiation cellulaire est caractérisée par l'intervention de cellules du système immunitaire développant une cytotoxicité directe, c'est-à-dire des cellules capables de détruire des cellules cibles exprimant un antigène du non soi. Les cellules du système immunitaire capables de cytotoxicité sont représentées par les cellules NK (Natural Killer) et les lymphocytes T cytotoxiques. Les lymphocytes T
cytotoxiques 15 sont un sous-groupe de lymphocytes T, capables d'induire la mort par apoptose des cellules infectées par un agent infectieux ou d'induire la mort des cellules cancéreuses.
Pour entraîner une réponse immunitaire, l'antigène doit être présenté aux lymphocytes TCD8+ (réponse cytolytique) ou lymphocytes TCD4+ (réponse auxiliaire) par une molécule du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), respectivement de classe I ou II, portée par une cellule présentatrice de l'antigène. Parmi les cellules présentatrices de l'antigène, les cellules dendritiques sont les plus performantes : elles ont la capacité non seulement d'activer des lymphocytes T naïfs, mais aussi d'induire une réponse humorale et cellulaire cytolytique par la présentation d'antigènes dans le contexte des molécules de classe I ou II du CMH. Les étapes du catabolisme de l'antigène sont strictement corrélées aux stades de la maturation des cellules dendritiques. Seules les cellules dendritiques immatures, concentrées dans les tissus périphériques, peuvent phagocyter et provoquer l'endocytose des antigènes solubles et particulaires, mais elles ne peuvent pas, à ce stade, les présenter aux lymphocytes T car les molécules du CMH sont retenues dans leurs lysosomes. En revanche, le processus de maturation de ces cellules dendritiques, contrôlé par des signaux inflammatoires et par le couple de molécules CD4O-L/CD40, s'accompagne de changements morphologiques, de la relocalisation des molécules de classe I et II du CMH à la membrane, de l'expression de molécules de co-stimulation lymphocytaire, et surtout de la migration des cellules dendritiques des tissus périphériques vers les ganglions et la rate. Dans ces organes, les cellules dendritiques wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 matures sont aptes à présenter aux lymphocytes T, l'antigène protéolysé en peptides et complexé aux molécules du CMH-I.
La levure immunothérapeutique contenue dans la composition immunothérapeutique est capable d'interagir avec les cellules dendritiques et de stimuler une réponse immunitaire à
médiation cellulaire par l'activation des lymphocytes T. De la réponse immunitaire découle alors une réponse physiologique qui se traduit par une régression de la taille de la tumeur visée. In vivo, chez l'animal, la taille d'une tumeur est mesurée en millimètre cube (mm3) et la régression de la taille d'une tumeur traitée par un moyen thérapeutique est le plus souvent évaluée en pourcentage par rapport à la taille d'une tumeur non traitée. Chez un patient humain, la régression de la taille d'une tumeur est mesurée en pourcentage par rapport à la tumeur initialement détectée et avant traitement.
On entend par véhicule pharmaceutiquement acceptable aussi appelé
excipient , tout composant, autre que le ou les principes actifs, qui est présent dans un médicament ou utilisé pour sa fabrication. La fonction d'un excipient est de transporter le/les principe(s) actif(s) contribuant ainsi à certaines propriétés du produit telle que la stabilité, le profil biopharmaceutique, l'aspect, l'acceptabilité pour le patient et/ou la facilité de fabrication. La formulation d'une composition immunothérapeutique comprend en général plusieurs excipients. On trouve des excipients hydrophiles comme l'eau (purifiée ou PPI), les alcools (l'éthanol, les glycols, le glycérol ou les polyéthylènes glycols), les agents gélifiants comme les gommes, les substances extraites d'algues, les protéines, la cellulose et ses dérivés et les gélifiants synthétiques. On trouve aussi des excipients lipophiles comme les glycérides d'origine naturelle ou hémi-synthétiques et les excipients lipophiles non glycériques tels que les acides gras, les alcools gras, les hydrocarbures et les silicones. On trouve aussi des excipients émulsifiants parmi lesquels les tensioactifs ioniques, anioniques, cationiques ou amphotères et les tensioactifs non ioniques. D'autres composants encore peuvent servir d'excipients, comme les sucres (saccharose, glucose, fructose, lactose, sorbitol, amidon) ou les produits minéraux comme les silices colloïdales, le talc, le kaolin ou encore l'oxyde de titane.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition immunothérapeutique de l'invention comprend également un agent thérapeutique. Avantageusement, l'agent thérapeutique est choisi parmi un polypeptide anticancéreux ou un agent chimiothérapeutique. Il peut également s'agir de polysaccharides, de dérivés lipidiques, de vitamines, d'acides nucléiques ou d'aptamères.

wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 Le polypeptide anticancéreux peut être choisi parmi les cytokines, les chimiokines, les hormones, les anticorps, les fragments d'anticorps, les agonistes, les antagonistes ou les facteurs de croissance. Cette liste est non exhaustive.
Les agents chimiothérapeutiques sont bien connus de l'homme du métier. Ils sont regroupés en plusieurs familles, que sont les agents alkylants, les agents du fuseau, les poisons du fuseau (vinca-alcaloïdes et apparentés) les stabilisants du fuseau (taxanes), les anti-métabolites, les inhibiteurs de protéasome ou encore les inhibiteurs des topo-isomérases. Avantageusement, l'agent chimiothérapeutique est choisi parmi le cyclophosphamide, le docétaxel (famille des taxanes), la doxorubicine (famille des anthracyclines), l'épirubicine (famille des anthracyclines), le fluoro-uracile (aussi appelé 5-FU), le méthotrexate, le paclitaxel (famille des taxanes), les anthracyclines, la capécitabine, l'éribuline, la gemcitabine ou la vinorelbine. Cette liste est non exhaustive.
L'invention a également pour objet une levure immunothérapeutique selon l'invention ou une composition immunothérapeutique selon l'invention pour son utilisation comme médicament, plus particulièrement pour son utilisation dans le traitement ou la prévention du cancer.
Par cancer , on entend un grand groupe de pathologies pouvant toucher n'importe quelle partie de l'organisme, dont l'une des caractéristiques communes est la prolifération rapide et non contrôlée de cellules anormales pouvant essaimer dans d'autres organes, formant ce que l'on appelle des métastases. Le terme cancer englobe les cancers solides et les cancers liquides aussi appelés cancers hématopoïétiques qui regroupent les leucémies et les lymphomes. Dans un mode de réalisation particulier, le cancer est un cancer solide. Les cancers solides peuvent se développer dans n'importe quel tissu. On distingue les carcinomes et les sarcomes. Dans un mode de réalisation préféré, le cancer est choisi parmi les mélanomes, les carcinomes épidermoïdes, les cancers du sein, les carcinomes de la tête et du cou, les carcinomes de la thyroïde, les sarcomes des tissus mous, les sarcomes des os, les cancers testiculaires, les cancers de la prostate, les cancers des ovaires, les cancers de la vessie, les cancers de la peau, les cancers du cerveau, les angiosarcomes, les hemangiosarcomes, les tumeurs des cellules mastoïdiennes, les cancers hépatiques, les cancers des poumons, les cancers pancréatiques, les cancers gastro-intestinaux, les carcinomes des cellules rénales et tous les cancers métastatiques qui dérivent de cette liste. Dans un mode de réalisation préféré
de l'invention, le cancer solide est un mélanome, qu'il soit un mélanome superficiel extensif, un mélanome nodulaire, un mélanome de Dubreuilh ou un mélanome acro-lentigineux et les formes métastasées pouvant être associées. Dans un autre mode wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 préféré de réalisation de l'invention, le cancer solide est un cancer du côlon.
Avantageusement, lorsque le cancer solide est un mélanome, la levure immunothérapeutique exprime à sa paroi un ou plusieurs antigène(s) choisi(s) parmi Melan-A, Tyrosinase, gp100, MAGE-B1, MAGEA1, MAGEA10, MAGEA11, MAGEA12, MAGEA2, MAGEA2B, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA8, MAGEA9, MAGEB1, MAGEB10, MAGEB16, MAGEB18, MAGEB2, MAGEB3, MAGEB4, MAGEB5, MAGEB6, MAGEB6B, New York Esophageal 1 antigène (NY-ES0-1), MAGEC1, MAGEC2, L antigène (LAGE), TRP-1 ou TRP-2. Lorsque le cancer solide est un cancer du côlon, la levure immunothérapeutique exprime avantageusement à sa paroi un ou plusieurs antigène(s) choisi(s) parmi P53, KRAS, CEA, VVT1, MUC1, SART3, SURVIVIN 2B, RNF43/TOMM34, TGFBRII, HER2/neu, BRAF, PI3K, APC, BAX, beta2-microglobuline, télomérase ou NRAS.
La levure immunothérapeutique ou la composition immunothérapeutique selon l'invention peut être administrée par voie d'injections, intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse ou encore sous-cutanée, par voie orale ou par voie respiratoire/pulmonaire.
En fonction du mode d'administration, la forme galénique sera adaptée. L'homme du métier sait comment adapter les formes galéniques qui se prêtent à la voie d'administration choisie. Par exemple, pour l'administration par voie orale, la forme galénique peut être choisie parmi des comprimés, y compris les comprimés orodispersibles, des capsules, des gélules, des solutions buvables. Pour l'administration par voie pulmonaire, la forme galénique peut être sous forme de spray ou de produits pour inhalation. Avantageusement, la levure immunothérapeutique ou la composition immunothérapeutique est administrée par injection sous-cutanée. Dans un mode de réalisation particulier, la levure ou la composition immunothérapeutique selon l'invention est administrée à l'homme ou à l'animal à raison d'une ou plusieurs doses par semaine, ou d'une ou plusieurs doses par mois, ladite dose allant de 0,1 à 200 YU
(Yeast Unit), de préférence de 0,1 à 2 YU, ou de 0,1 à 5 YU, ou de 0,1 à 10 YU, ou de 1 à 10 YU, de 10 à
20 YU, de 20 à 30 YU, de 30 à 40 YU, de 40 à 50 YU, ou de 50 et 100 YU, de 100 et 150 YU, ou de 150 YU et 200 YU, avec un YU égal à 107 levures.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 est un schéma qui illustre une levure exprimant à sa paroi le polypeptide MEQLESIINFEKLTEVVTSA (SEQ ID NO: 14) représentant l'antigène OVA1 issu de l'ovalbumine, ledit antigène étant exprimé à la paroi de la levure via le polypeptide d'ancrage Aga2p lié via un pont disulfure à Aga1p. L'antigène OVA1 est lié au polypeptide d'ancrage via un linker G4S, composé de 4 glycines et d'une sérine. C-myc est un tag wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 (étiquette) permettant de détecter et confirmer l'expression de l'antigène OVA1 à la paroi de la levure génétiquement modifiée.
La Figure 2 est un schéma qui illustre une levure exprimant à sa paroi le polypeptide MEQLESIINFEKLTEWTSA (SEQ ID NO: 14) représentant l'antigène OVA1 issu de l'ovalbumine, ledit antigène étant exprimé à la paroi de la levure via une protéine d'ancrage, Sed1p. L'antigène OVA1 est lié au polypeptide d'ancrage via un linker G4S, composé de 4 glycines et d'une sérine. C-myc est un tag (étiquette) permettant de détecter et confirmer l'expression de l'antigène OVA1 à la paroi de la levure génétiquement modifiée.
.. La Figure 3 est un schéma qui illustre une levure exprimant à sa paroi le polypeptide MEQLESIINFEKLTEWTSA (SEQ ID NO: 14) représentant l'antigène OVA1 issu de l'ovalbumine, ledit antigène étant exprimé à la paroi de la levure via le polypeptide d'ancrage Aga2p lié via un pont disulfure à Agalp. L'antigène OVA1 est fixé au polypeptide d'ancrage par un linker G4S, composé de 4 glycines et d'une sérine. La levure exprime également à sa paroi le fragment ScFv d'un anticorps dirigé contre le récepteur DEC205 (ScFv anti-DEC205). C-myc est un tag (étiquette) permettant de détecter et confirmer l'expression de l'antigène OVA1 à la paroi de la levure.
La Figure 4 est un schéma qui illustre une levure exprimant à sa paroi le polypeptide MEQLESIINFEKLTEWTSA (SEQ ID NO: 14) représentant l'antigène OVA1 issu de l'ovalbumine, ledit antigène étant exprimé à la paroi de la levure via une protéine d'ancrage, Sed1p. L'antigène OVA1 est lié au polypeptide d'ancrage par un linker G4S, composé de 4 glycines et d'une sérine. La levure exprime également à sa paroi le fragment ScFv d'un anticorps dirigé contre le récepteur DEC205 (ScFv anti-DEC205). C-myc est un tag (étiquette) permettant de détecter et confirmer l'expression de l'antigène OVA1 à la paroi de la levure.
La Figure 5 est un schéma qui illustre l'assemblage d'un vecteur avec des séquences nucléiques, par la méthode Golden Gate.
La Figure 6 est un schéma qui illustre un vecteur assemblé par la méthode Golden Gate.
La Figure 7 est un spectre de cytométrie de flux qui montre l'expression du peptide OVA1 à la paroi des levures à l'aide d'un anticorps dirigé contre le tag c-myc.
La Figure 8 est un diagramme qui montre l'activation des lymphocytes T CD8+
cytotoxiques après cross-présentation de l'antigène SIINFEKL (OVA 257-264) par les cellules dendritiques auxdits lymphocytes T CD8+ cytotoxiques, selon des doses croissantes d'antigène SIINFEKL (OVA 257-264) (de 0 nM à 10 nM). L'antigène SIINFEKL

wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 est libre c'est-à-dire non fixé à la paroi des levures et des levures sauvages sont utilisées comme adjuvant avec une MOI de 20 (Multiplicity of infection).
La Figure 9 est un diagramme qui montre l'activation des lymphocytes T CD8+
cytotoxiques après cross-présentation par les cellules dendritiques à l'aide de levures 5 perméabilisés ou non. A) les levures sauvages non perméabilisées (pointillé) et perméabilisées (hachuré), B) les levures expriment l'antigène OVA1 dans le cytosol non perméabilisées (pointillé) et perméabilisées (hachuré), C) les levures expriment OVA1 à la paroi via la protéine d'ancrage Sedlp non perméabilisées (pointillé) et perméabilisées (hachuré), D) les levures expriment l'antigène OVA1 et un fragment ScFv anti-DEC205 à
10 la paroi, à l'aide de la protéine d'ancrage Sed1p, E) les levures expriment l'antigène OVA1 et un fragment ScFv anti-DEC205 à la paroi, via le polypeptide d'ancrage Aga2p, avec un plasmide intégratif.
La Figure 10 est une courbe qui montre la croissance tumorale en millimètre cube (mm3) chez des souris après un challenge tumoral à 30 avec 5.105 cellules de mélanome B16-15 OVA (M05) injectées en sous-cutané. Les souris sauvages (WT pour Wild Type) sont représentées par des ronds. Les souris traitées avec des levures perméabilisées exprimant OVA1 fusionné au scFv anti-DEC-205 à leur paroi via la protéine d'ancrage Sed1p, sont représentées par des triangles. Une dose de 1 Y.U. (1.107 levures) a été
injectée trois fois, sept jours avant le challenge tumoral en intra-péritonéal, trois jours avant le 20 challenge tumoral en sous-cutané, puis trois jours après le challenge tumoral en sous-cutané.
La Figure 11 est une courbe qui montre le taux de survie des souris après le même challenge tumoral décrit pour la Figure 10. Les souris sauvages (VVT pour Wild Type) sont représentées par des ronds. Les souris traitées avec des levures perméabilisées exprimant OVA1 fusionné au scFv anti-DEC-205 à leur paroi via la protéine d'ancrage Sed1p, sont représentées par des triangles.
La Figure 12 est un schéma qui illustre une levure exprimant à sa paroi le polypeptide SPSYAYHQF (SEQ ID NO : 15) représentant l'antigène AH1A5 issu de AH-1, ledit antigène étant exprimé à la paroi de la levure via une protéine d'ancrage, Sedlp.
L'antigène AH1A5 est lié au polypeptide d'ancrage via un linker G4S, composé de 4 glycines et d'une sérine.
C-myc est un tag (étiquette) permettant de détecter et confirmer l'expression de l'antigène AH1A5 à la paroi de la levure génétiquement modifiée. La levure exprime également à sa paroi le fragment ScFv d'un anticorps dirigé contre le récepteur DEC205 (ScFv anti-DEC205 ou ScFv DEC205).

wo 2018/185431 21 PCT/FR2018/050837 La Figure 13 est un schéma qui illustre une levure exprimant à sa paroi le polypeptide TAPDNLGYM (SEQ ID NO: 16) représentant l'antigène TRP1, ledit antigène étant exprimé
à la paroi de la levure via une protéine d'ancrage, Sed1p. L'antigène TRP1 est lié au polypeptide d'ancrage via un linker G4S, composé de 4 glycines et d'une sérine. C-myc est un tag (étiquette) permettant de détecter et confirmer l'expression de l'antigène TRP1 à
la paroi de la levure génétiquement modifiée. La levure exprime également à sa paroi le fragment ScFv d'un anticorps dirigé contre le récepteur DEC205 (ScFv anti-DEC205 ou ScFv DEC205).
La Figure 14 est un schéma qui illustre une levure exprimant à sa paroi le polypeptide SVYDFFVWL (SEQ ID NO: 17) représentant l'antigène TRP2, ledit antigène étant exprimé
à la paroi de la levure via une protéine d'ancrage, Sed1p. L'antigène TRP2 est lié au polypeptide d'ancrage via un linker G4S, composé de 4 glycines et d'une sérine. C-myc est un tag (étiquette) permettant de détecter et confirmer l'expression de l'antigène TRP2 à
la paroi de la levure génétiquement modifiée. La levure exprime également à sa paroi le fragment ScFv d'un anticorps dirigé contre le récepteur DEC205 (ScFv anti-DEC205 ou ScFv DEC205).
La Figure 15 est un schéma qui illustre une levure exprimant à sa paroi les polypeptides TAPDNLGYM (SEQ ID NO: 16), MEQLESIINFEKLTEVVTSA (SEQ ID NO: 14) et SVYDFFVWL (SEQ ID NO : 17) représentant respectivement l'antigène TRP1, OVA1 et TRP2, lesdits antigènes étant exprimés à la paroi de la levure via une protéine d'ancrage, Sed1p. Les antigènes sont lié au polypeptide d'ancrage via un linker G4S, composé de 4 glycines et d'une sérine, et également séparés entre eux par un linker G4S. C-myc est un tag (étiquette) permettant de détecter et confirmer l'expression des antigènes à la paroi de la levure génétiquement modifiée. La levure exprime également à sa paroi le fragment ScFv d'un anticorps dirigé contre le récepteur DEC205 (ScFv anti-DEC205 ou ScFv DEC205).
La Figure 16 est un spectre de cytométrie de flux avec un anticorps anti-C-myc des levures exprimant à leur parois les antigènes AH1A5 (Figure 16A), TRP1 (Figure 16B), TRP2 (Figure 16C) ou OVA1-TRP1-TRP2 (Figure 16D).
La Figure 17 est un diagramme qui montre l'absorbance à 405nm de levures traitées de différentes manières et mises en contact avec du p-nitrophenylphosphate (pNPP). Le pNPP est le substrat d'une enzyme, la phosphatase alcaline, qui est naturellement présente dans le cytosol de la levure. Le pNPP ne pénètre pas dans le cytosol d'une levure non-perméabilisée. Par contre, lorsque la levure est perméabilisée, le pNPP
peut rentrer wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 dans la levure et être hydrolysé par la phosphatase alcaline présente dans le cytosol. Le pNPP hydrolysé prend alors une couleur jaune lisible par l'absorbance à 405 nm.
La Figure 18 est un diagramme qui montre l'absorbance à 405nm de levures traitées de différentes manières et mises en contact avec du p-nitrophenylphosphate (pNPP). Le pNPP est le substrat d'une enzyme, la phosphatase alcaline, qui est naturellement présente dans le cytosol de la levure. Le pNPP ne pénètre pas dans le cytosol d'une levure non-perméabilisée. Par contre, lorsque la levure est perméabilisée, le pNPP
peut rentrer dans la levure et être hydrolysé par la phosphatase alcaline présente dans le cytosol. Le pNPP hydrolysé prend alors une couleur jaune lisible par l'absorbance à 405 nm.
La Figure 19 est un diagramme qui montre l'activation des lymphocytes T CD8+
cytotoxiques après cross-présentation de levures exprimant à leur paroi l'antigène MEQLESIINFEKLTEVVTSA (SEQ ID NO: 14) en présence de cellules dendritiques. Les levures ont été traitées de différentes manières pour obtenir des cellules perméabilisées ou non-perméabilisées.
Les exemples indiqués ci-après présentent des modes de mise en oeuvre de l'invention, ces exemples sont donnés à titre d'illustration et ne sauraient limiter la portée des revendications.
EXEMPLES
Exemple 1: Construction des plasmides introduits dans les levures (figures 5 et 6) ;
Deux types de plasmides ont été créés par la société Abolis Biotechnologies (iSSB, Génopole, Evry, France), un plasmide intégratif et un plasmide réplicatif.
Pour le plasmide réplicatif, un fragment de plasmide épisomal contenant l'origine de réplication de levure 2 microns, le marqueur de sélection URA3 (SEQ ID N 4) et la résistance à l'ampicilline ont été assemblés par la méthode Gibson (Gibson Assembly Master Mix, NEB, Inc.) puis le plasmide a été transformé avec les inserts par Golden Gate selon le procédé décrit en figures 5 et 6.
Pour les plasmides intégratifs, deux plasmides contenant des sites de recombinaisons homologues avec le génome de la levure génétiquement modifiée, les marqueurs de sélection URA3 (SEQ ID N 4) et TRP1 (SEQ ID N 8), ainsi que le gène de résistance à la kanamycine, ont été transformés par Golden Gate selon le procédé illustré en figures 5 et 6.
Ces deux plasmides ont été assemblés par Golden Gate à partir des fragments suivants :

wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 - le promoteur inductible du gène de levure GAL1, synthétisé à partir de la séquence présente sur le chromosome II de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID
N 1).
- le terminateur du gène CYC1, un terminateur de gène très utilisé dans la communauté scientifique, extrait d'une "biobrick" de la "Parts Registry iGEM"
(SEQ
ID N 2). Il permet d'indiquer à une polynnérase la fin de la transcription du gène qui code pour la protéine recombinante exprimée dans la levure génétiquement modifiée.
- le terminateur synthétique T27, placé en amont du terminateur CYC1 pour augmenter la production des protéines recombinantes (SEQ ID N 3), a été
synthétisé à partir de la séquence du terminateur désigné T27 dans l'article Short Synthetic Terminators for Improved Heterologous Gene Expression in Yeast, Curran et al, ACS Synth Bio. 2015 Jul 17;4(7):824-32 . Il vient renforcer l'action du terminateur CYC1.
- le gène URA3 a été extrait du génome de la levure avec son promoteur et son terminateur (SEQ ID N 4) - l'antibiotique de résistance à la Kanamycine (Kan) et l'origine de réplication bactérienne pMB1 provient du plasmide pSB1K3 (SEQ ID N 5) - Le gène rapporteur fluorescent dans le jaune YFP N BBa_E0030, avec le promoteur pLAC N BBa_R0010 et le terminateur N BBa_B0015, proviennent tous du catalogue "parts registry iGEM".
- les sites d'insertion, nommés XI-2 UP (SEQ ID N 6) et XI-2 DOWN (SEQ ID N 7) dans l'article de Mikkelsen et al, 2012, ont été amplifiés depuis le génome de la levure.
Les séquences nucléotidiques nommées sites d'insertion permettent l'intégration chromosomique des séquences nucléotidiques recombinantes par recombinaison homologue dans la levure génétiquement modifiée (Microbial production of indolylglucosinolate through engineering of a multi-gene pathway in a versatile yeast expression platform, Metab Eng. 2012 Mar;14(2):104-11), Mikkelsen MD, Buron LD, Salomonsen B, Olsen CE, Hansen BG, Mortensen UH, Halkier BA.) Pour l'insertion par Golden Gate des séquences nucléiques codant les protéines de fusion dans les plasmides, les séquences nucléiques ont été synthétisées pour contenir des sites de clivage BsaI et des amorces complémentaires aux extrémités. Un exemple de couples d'amorces utilisés dans la mise en oeuvre de l'invention est : en 5' de l'insert, GGTCTCTAATG (SEQ ID NO: 18) et en 3' de l'insert, GAGTTGAGACC (SEQ ID NO: 19).

wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 Ces amorces sont uniquement compatibles avec les morceaux qui s'insèrent avant et après, de sorte que tous les fragments s'assemblent dans le bon ordre en les mélangeant dans une seule réaction par ligation (Figure 5 et Figure 6). L'insert est composé par exemple de - la séquence nucléique codant un polypeptide d'ancrage et d'adressage Aga2p, de la séquence nucléique codant le peptide OVA1 (modèle d'antigène de tumeur) et de la séquence codante c-myc, - la séquence nucléique codant un polypeptide d'ancrage Sedlp, la séquence nucléique codant le peptide AH1-A5 (antigène de cancer du côlon), la séquence codante c-myc, la séquence codant le polypeptide de ciblage ScFv DEC 205 et la séquence nucléique codant un polypeptide d'adressage issu de la protéine de phéromone de levure Mf(alpha)lp et nommé Pre pro alpha factor leader peptide , - la séquence nucléique codant un polypeptide d'ancrage Sedlp, la séquence nucléique codant le peptide TRP1 (antigène de mélanome), la séquence codante c-myc, la séquence codant le polypeptide de ciblage ScFv DEC 205 et la séquence nucléique codant un polypeptide d'adressage issu de la protéine de phéromone de levure Mf(alpha)1p et nommé Pre pro alpha factor leader peptide , - la séquence nucléique codant un polypeptide d'ancrage Sed1p, la séquence nucléique codant le peptide TRP2 (antigène de mélanome), la séquence codante c-myc, la séquence codant le polypeptide de ciblage ScFv DEC 205 et la séquence nucléique codant un polypeptide d'adressage issu de la protéine de phéromone de levure Mf(alpha)1p et nommé Pre pro alpha factor leader peptide , - la séquence nucléique codant un polypeptide d'ancrage Sedlp, la séquence nucléique codant les peptides OVA1, TRP1 et TRP2, de la séquence codante c-myc, la séquence codant le polypeptide de ciblage ScFv DEC 205 et la séquence nucléique codant un polypeptide d'adressage issu de la protéine de phéromone de levure Mf(alpha)1p et nommé Pre pro alpha factor leader peptide .
- la séquence nucléique codant un polypeptide d'adressage issu de la protéine de phéromone de levure Mf(alpha)1p et nommé Pre pro alpha factor leader peptide , de la séquence nucléique codant le peptide OVA1 et c-myc, et de la séquence nucléique codant la protéine d'ancrage Sed1p.
La méthode d'assemblage par Golden Gate a été la suivante :
On a mélangé 1 pL de T4 Ligase à ADN concentrée à 400,000 unités par mL avec 2 pL de wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 T4 DNA Ligase 10X buffer, 1 pL d'enzyme de restriction BsaI haute fidélité
concentrée à
20,000 unités par mL, 50 ng de chaque séquence nucléotidique insérée (séquences de 1 à 8), ainsi que 50 ng du plasmide recevant l'insert nucléotidique. Le milieu réactionnel a été complété jusqu'à 25 pL avec de l'eau dé-ionisée. Le milieu réactionnel a ensuite été
5 soumis à différents cycles de température pour permettre la réaction enzymatique de clivage par l'enzyme BsaI (cycles à 37 C) et la ligation des séquences nucléotidiques digérées ainsi que du plasmide digéré par l'enzyme T4 ligase (cycles à 16 C) selon ce protocole :
lère étape : 98 C pendant 2 minutes, 10 2ème étape (répétée 32 fois) :
37 C pendant 30 secondes 16 C pendant 30 secondes 3ème étape : 65 C pendant 10 minutes 4ème étape : 12 C pendant 10 minutes 15 Une transformation bactérienne a été effectuée avec la solution du Golden Gate obtenue après ces cycles de température. 10 pL du volume réactionnel ont été prélevés et mis en présence de 20 pL de bactéries compétentes E coli (E. coli DH5-Alpha High Efficiency, NEB, Inc.). Les bactéries ont été striées sur un milieu de culture contenant un antibiotique de sélection approprié, la Kanamycine ou l'Ampicilline. Après 24 heures de culture à 37 C, 20 une colonie isolée a été mise en culture liquide à 37 C dans un milieu contenant le même antibiotique de sélection que précédemment. Après 24 heures, 2mL de culture bactérienne ont été prélevés pour effectuer une purification des plasmides.
Tous les plasmides ont été vérifiés par une colonie PCR et séquencés par la méthode Sanger pour vérifier l'assemblage correct.
25 Les plasmides intégratifs ont ensuite été digérés par l'enzyme Avril pour les linéariser afin de permettre la recombinaison homologue. Par la suite, la levure S. cerevistae (Life Technologies SAS) a été transformée par la méthode du Lithium-Acétate avec ces plasmides intégratifs linéarisés (Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method, Methods Enzymol. 2002 ;350 :87-96, GieU et al). Brièvement, les levures ont été cultivées dans du YPAD (20 g/L
glucose, 10 g/L Yeast Extract, 20 g/L bacto-peptone) jusqu'en Log phase, puis collectées par centrifugation à 3000 g pendant 5 minutes, lavées à l'eau stérile, et transformées avec la solution suivante : 240 pL de PEG 4000 (50% (w/v)), 36 pL de LiAc 1.0 M, 50 pL
d'ADN
simple brin de sperme de saumon (2.0 mg/mL), 34 pL de plasmide à transformer.
Les levures suspendues dans cette solution de transformation ont été placées dans un bain à

wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 42 C pendant 25 minutes. Après centrifugation à 13,000 g pendant 1 minute, les levures ont été resuspendues dans du milieu YPAD pendant 1h, avant d'être striées sur une plaque contenant un milieu sélectif pour le plasmide inséré dans la levure.
L'insertion chromosomique a ensuite été vérifiée par extraction de génome des levures génétiquement modifiées et PCR spécifique de l'insert (Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications, Biotechniques 50 :325-328 (2011), Looke et al).
Brièvement, 100 pL de levures en culture à une densité optique DO= 0.4 à 600 nm ont été centrifugées, puis resuspendues dans 100 pL 200 mM lithium acétate (LiAc) 1% SDS
solution, mélangées au vortex, et incubées 5 minutes à 70 C. 300 pL d'éthanol 96% ont été ajoutées pour précipiter l'ADN la solution a été mélangée au vortex et centrifugée à
13,000 g pendant 3 minutes. Le surnageant a été retiré et le culot a été lavé
avec 500 pL
d'éthanol à 70%, puis re-suspendu dans 100 pL d'eau stérile. 1 pL de surnageant a été
utilisé ensuite pour les PCR en utilisant des amorces spécifiques à chaque insert génomique.
Exemple 2 : Préparation des levures immunothérapeutiques (figures 1 à 4) La levure Saccharomyces cerevistae INVSC1 (Life Technologies SAS), une levure quadruple auxotrophe (URA, TRP, HIS, LEU), a été utilisée dans tous les exemples cités.
La levure a été génétiquement modifiée pour exprimer un ou plusieurs antigène(s) de tumeur avec une protéine ou un polypeptide d'ancrage, un polypeptide d'adressage, et un peptide ou une protéine de ciblage après transformation avec les plasmides décrits à
l'exemple 1 par la méthode Lithium Acétate. Pour la sélection des levures recombinantes, un milieu sélectif sans les acides aminés URA ou TRP a été utilisé. La levure a d'abord été
cultivée à 30 C jusqu'en phase stationnaire dans un milieu sélectif comprenant : 20g/L
glucose, 6,7 g/L yeast nitrogen base sans acides aminés, 0,7 g/L de chaque acide aminé
parmi : Histidine, Leucine et Tryptophane. Les levures ont alors été
centrifugées pendant 5 minutes à 4000 rpm, lavées dans du PBS (Phosphate Buffer Saline), puis resuspendues dans un milieu sélectif inductif comprenant : 20g/L galactose, 6,7 g/L yeast nitrogen base sans acides aminés, 0,7 g/L de chacun des acides aminés suivants parmi :
Histidine, Leucine et Tryptophane. Les levures ont alors été placées en culture à 20 C
pendant 20h pour l'induction de l'expression des protéines recombinantes par le galactose.
Pour la perméabilisation, les levures ont été fixées à 0,5% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 10 minutes, lavées dans du PBS, puis elles ont été traitées par un mélange 50%
éthanol 50% eau v/v pendant 15 minutes et encore lavées au PBS.

wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 La Figure 1 montre l'exemple d'une levure génétiquement modifiée qui a été
transformée par un premier vecteur contenant la séquence nucléique codant l'antigène OVA1 fusionné
au tag c-myc et la séquence nucléique codant le polypeptide d'ancrage et d'adressage Aga2p (SEQ ID N 10). Aga2p a été relié par un pont disulfure à la protéine Aga1p (SEQ
ID N 9) qui s'est ancrée dans la paroi de la levure et qui a été produite à
partir d'un deuxième vecteur co-transformé avec le premier vecteur.
La Figure 2 montre l'exemple d'une levure génétiquement modifiée transformée par un vecteur unique contenant l'antigène OVA1 fusionné au tag c-myc et la protéine d'ancrage Sedlp (SEQ ID N 11).
La Figure 3 montre l'exemple d'une levure génétiquement modifiée par un premier vecteur contenant la séquence nucléique codant l'antigène OVA1 fusionné au polypeptide de ciblage ScFv DEC205, la séquence nucléique codant le tag c-myc et la séquence nucléique codant le polypeptide d'ancrage et d'adressage Aga2p. Aga2p a été
relié par un pont disulfure à la protéine Agalp qui s'est ancrée dans la paroi de la levure et qui a été
produite à partir d'un deuxième vecteur co-transformé dans la levure avec le premier vecteur.
La Figure 4 montre l'exemple d'une levure génétiquement modifiée qui a été
transformée par un vecteur unique contenant la séquence nucléique codant le polypeptide d'adressage en N-terminal prepro alpha factor leader peptide issue de la phéromone de levure Mf(alpha)1p (SEQ ID N 12), la séquence nucléique codant le polypeptide de ciblage scFv DEC205 (SEQ ID N 13), la séquence nucléique codant l'antigène OVA1 fusionné au tag c-myc et la séquence nucléique codant la protéine d'ancrage Sedlp.
Pour permettre un traitement adéquat de l'antigène par les cellules dendritiques lors des tests de cross-présentation, les séquences naturelles flanquantes de la protéine ovalbumine ont été ajoutées audit peptide par synthèse : MEQLESIINFEKLTEWTSA
(SEQ
ID N 14). Le peptide SIINFEKL associé aux séquences flanquantes représente OVA1. Un linker G4S a été placé entre la protéine ou le polypeptide d'ancrage et OVA1.
Ce linker est une chaine d'acides aminés, composée de 4 glycines et d'une sérine (GGGGS). Un tag protéique, le c-myc, a été également ajouté pour permettre la détection des complexes à
la surface des levures.
L'adressage de la protéine de fusion à la surface de la levure a nécessité un signal de sécrétion en N-terminal. Pour les protéines de fusion comprenant Aga2p, cette protéine contenait déjà le signal de sécrétion nécessaire. Pour les protéines de fusion utilisant Sedlp en C-terminal, un signal de sécrétion supplémentaire a été ajouté en N-terminal de la protéine de fusion, en utilisant le polypeptide d'adressage codé par la séquence wo 2018/185431 28 PCT/FR2018/050837 nucléique prepro alpha factor leader peptide issue de la phéromone de levure Mf(alpha)lp (SEQ ID N 12). Le polypeptide de ciblage ScFv anti-DEC205 a pu être ajouté
parmi les inserts (figures 3 et 4) (SEQ ID N 13) pour se fusionner avec l'antigène OVA1 exprimé à la surface en utilisant la technique du Golden Gate précédemment décrite.
Exemple 3 : Contrôle de l'expression d'un peptide à la surface des levures (Figure 71 L'expression du peptide OVA1 exprimé à la surface de la levure génétiquement modifiée a été vérifiée par cytométrie de flux spectrale, en utilisant des levures présentant le même antigène dans le cytosol comme contrôle négatif. Après l'induction dans le galactose décrite dans l'exemple 2, les levures à une concentration de 1.107 cellules par mL ont été
suspendues dans une solution de PFA à 2%. Elles ont ensuite été lavées dans du PBS
contenant 1% de BSA. Après lavage, elles ont été mises en culture pendant 1h à

température ambiante avec un anticorps primaire anti-c-myc au ratio de 1:100 (Myc.A7, Life technologies SAS). Après 3 lavages au PBS contenant 1% de BSA, elles ont été
incubées pendant 1h à température ambiante avec un anticorps secondaire anti-IgG1 au ratio de 1:50 (Goat anti-Mouse IgG1, PE-Texas red, Life technologies SAS).
Après lavage, elles ont été passées en cytométrie de flux spectrale dans le canal préférentiel PE-Texas red.
Les résultats sont présentés sur la Figure 7. Cette figure montre l'expression du peptide OVA1 à la surface des levures construites selon l'exemple décrit à la Figure 2. Un anticorps anti-c-myc permet de détecter les levures qui expriment à leur surface l'antigène ()VAL Dans le cas où les levures expriment l'antigène dans le cytosol, il n'y a aucune détection en cytométrie en flux. Dans le cas de la construction de la Figure 2, 50% des levures expriment OVA1 à leur surface.
Conclusion : La cytométrie de flux spectrale a démontré d'une part l'ancrage effectif de l'antigène OVA1 à la paroi des levures. D'autre part, dans les conditions expérimentales testées, l'anticorps de marquage de la protéine de fusion ne pouvait pas pénétrer à
l'intérieur des levures, ce qui a démontré la présentation de l'antigène OVA1 à l'extérieur de la levure.
Exemple 4: Mesure de l'activation des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques par présentation de l'antigène OVA1 libre par des cellules dendritiques en présence de levures sauvages Cet exemple montre la capacité de l'antigène OVA1 à activer les lymphocytes T
CD8+
indépendamment de son expression par une levure. L'antigène a été cross-présenté aux wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 lymphocytes T CD8+ par l'intermédiaire de cellules dendritiques. La mesure de l'activation des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques a été réalisée à l'aide d'un test colorimétrique utilisant le beta-galactosidase et un de ses substrats, le CPRG (Chlorophenol red-beta-galactopyranoside).
Le test nécessite, une source de cellules dendritiques, une source de lymphocytes T CD8+
et des levures modifiées de manière à exprimer un antigène à la surface, lesdites levures étant non perméabilisées. Les cellules dendritiques utilisées sont des cellules dendritiques murines issues de la lignée MutuDC (obtenus de l'Université de Lausanne).
Cette lignée provient de cellules dendritiques CD8a spléniques immortalisés qui conservent la capacité
de cross-présenter un antigène et d'activer les lymphocytes tueurs (LT). Les cellules de la lignée MutuDC ont été cultivées dans un milieu RPMI 1640 supplémenté par 10%
FCS, HEPES, 50 pM 2-mercaptoethanol, 50 [Jiml pénicilline, et 50 pg/ml streptomycine, à 37 C
avec 5% de CO2.
Les lymphocytes T utilisés proviennent de l'hybridome B3Z. L'hybridome B3Z, une lignée spécifique pour le peptide OVA 257-264 (SIINFEKL), a été offerte par l'Institut Curie (Paris V). Ces cellules ont la particularité de produire de la beta galactosidase sous contrôle d'un promoteur IL2 (Inter-leukine 2). Les cellules B3Z ont été cultivées dans un milieu RPMI
1640 supplémenté par 10% FCS, du Glutamax, HEPES, 50 pM 2-mercaptoethanol, 50 U/ml pénicilline, et 50 pg/ml streptomycine, à 37 C avec 5% de CO2.
Le peptide OVA 257-264 (SIINFEKL) a été mélangé aux cellules dendritiques pendant 5h en présence des levures sauvages. Les cellules dendritiques ont été réparties à raison de 50 000 cellules par puit dans des plaques 96 puits à fond rond. Ensuite, les lymphocytes de la lignée B3Z ont été ajoutés à raison de 100 000 par puit pendant 18h à 37 C et 5%
de CO2. Les plaques ont été ensuite lavées et l'activité de la bêta-galactosidase produite par les lymphocytes T a été mesurée après addition de 120 pL de tampon de lyse qui contient du PBS, 9 mM MgCl2, 0.125% NP40 et 0.15 mM chlorophenol red-beta-galactopyranoside). Après le changement de couleur vers le rouge, la fluorescence dans le rouge à 580 nm a été lue en utilisant un lecteur de plaque ClarioStar. La Figure 8 montre la capacité de l'antigène OVA 257-264 (SIINFEKL) à induire l'activation des lymphocytes T CD8+, une fois cross-présenté par des cellules dendritiques. Le test est réalisé avec des doses croissantes de peptide OVA 257-264 (SIINFEKL) comme contrôle positif.
Conclusion : Ce test a démontré que les cellules dendritiques utilisées issues de la lignée MutuDC étaient capables de réaliser la cross-présentation d'un antigène tumoral en présence d'un adjuvant. D'autre part, ce test a démontré l'activation de la lignée cellulaire wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 B3Z de lymphocytes tueurs en présence de ces cellules dendritiques.
L'activation des B3Z
a été matérialisée par la production de beta-galactosidase, de manière proportionnelle à
la quantité d'antigène initialement fournie aux cellules dendritiques.
5 Exemple 5: Mesure de l'activation des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques par présentation de l'antigène OVA1 par des cellules dendritiques, ledit antigène OVA1 étant exprimé à la paroi des levures perméabilisées ou non perméabilisées Les conditions expérimentales de l'exemple 4 sont applicables à l'exemple 5.
La condition qui diffère réside dans l'utilisation de levures génétiquement modifiées pour exprimer un 10 antigène à leur paroi, perméabilisées ou non perméabilisées.
Les levures sauvages, ou des levures génétiquement modifiées présentant l'antigène OVA1 dans le cytosol ou des levures génétiquement modifiées présentant l'antigène OVA1 à leur paroi, perméabilisées ou non perméabilisées, ont été mises en culture avec les cellules de la lignée MutuDC pendant 5h au ratio 60:1 (MOI 60, pour Multiplicity of 15 infection). Les lymphocytes de la lignée B3Z ont ensuite été ajoutés.
La perméabilisation a été réalisée comme décrite précédemment en soumettant les levures à un traitement par du PFA 0,5% pendant 10 minutes, à un lavage au PBS, puis à
un traitement à l'éthanol (50% éthanol, 50% PBS) pendant 15 minutes, un nouveau lavage au PBS, avant d'être mises en co-culture avec les MutuDC. Une synergie est 20 apparue pour les levures perméabilisées qui expriment l'antigène à leur surface (Figure 9), améliorant significativement l'activation des lymphocytes. Comme le montre la Figure 9, les levures génétiquement modifiées présentant l'antigène à leur paroi induisent une plus forte activation des lymphocytes T CD8+ que les levures présentant l'antigène dans leur cytosol. Par ailleurs, la perméabilisation n'a pas eu d'effet sur les levures qui 25 produisent l'antigène OVA1 dans le cytosol. En revanche, les levures perméabilisées qui expriment l'antigène OVA1 à leur paroi améliorent significativement l'activation des lymphocytes T CD8+, comparées aux levures non perméabilisées, avec une augmentation de l'activation comprise entre 33% et 255% par les levures perméabilisées en comparaison avec les levures non perméabilisées.
30 Conclusion : Ce test de cross-présentation a démontré que les levures génétiquement modifiées et perméabilisées activent très significativement les lymphocytes tueurs lorsque ces levures expriment l'antigène OVA à leur paroi, en comparaison avec les levures non perméabilisées qui expriment également l'antigène OVA à la paroi.

wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 Exemple 6 : Mesure de la croissance d'une tumeur de mélanome et du taux de survie chez la souris Une mesure de la croissance d'un mélanome a été effectuée sur des souris recevant des levures perméabilisées présentant l'antigène OVA1 à la paroi, couplé au fragment d'anticorps scFv anti-DEC205.
Des souris femelles C57BL/6 âgées de 6 et 8 semaines, ont été maintenues et traitées en accord avec le Comité de Bioéthique de l'Académie des sciences Polonaise.
La lignée de cellules de mélanome M05 (B16-0VA, obtenue du Pr O. Lare, Institut Curie, Paris V) a été cultivée dans du RPMI + Glutamax + 10% SVF + 50 pM 2-mercaptoethanol + Strep/Pen + 2 mg/mL G418 + 60 pg/mL hygromycine B à 37 C et 5% de CO2. La lignée M05 est une lignée B16 de mélanome, transfectée avec l'ovalbumine (OVA).
Les souris ont été immunisées par voie intrapéritonéale 7 jours avant le challenge tumoral, puis par voie sous cutanée, 3 jours avant le challenge tumoral et 3 jours après le challenge tumoral, avec une dose unique de 1 Y.U. à chaque injection dans 100 pL de PBS. Lors du challenge tumoral, les souris ont reçu 1x105 M05 par voie sous cutanée dans un volume de 100 pL de PBS. Le contrôle sont des souris immunisées par des levures sauvages dites "wild-type" (WT). 5 souris ont été utilisées par groupe expérimental. Le volume tumoral a été évalué avec la formule (a*a*b)/2, où "a"
est l'axe tumoral le plus court, "b" l'axe tumoral le plus long, en millimètres. Les souris moribondes ou dont la tumeur excédait 1500 mm3 ont été sacrifiées.
14 jours après le challenge tumoral, les souris immunisées par les levures perméabilisées exprimant DEC205-OVA1-SED présentaient un volume tumoral moyen de 43,1 nrwri3, versus un volume tumoral moyen de 162,5 mm3 pour les souris immunisées par les levures sauvages dites Wild-Type (WT), soit un volume tumoral inférieur par 3,77 fois en moyenne (Figure 10). Les barres d'erreurs représentent l'écart type du volume tumoral moyen par groupe expérimental.
20 jours après le challenge tumoral, 80% des souris immunisées par les levures perméabilisées exprimant DEC205-OVA1-SED avaient survécu, versus 20% des souris immunisées par les levures sauvages dites Wild-Type (WT) (Figure 11).
Conclusion : La vaccination des souris avec les levures perméabilisées qui présentent l'antigène OVA1 fusionné au polypeptide de ciblage des cellules dendritiques scFv DEC205 a permis une diminution de la croissance tumorale significative et une augmentation de la survie significative des souris, en comparaison avec les souris vaccinées avec des levures sauvages.

wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 Exemple 7 : Préparation de levures immunothérapeutiques exprimant à leur paroi les antigènes de tumeurs AH1-A5, TRP1. TRP2 ou OVA1-TRP1-TRP2 La levure Saccharomyces cerevislae INVSC1 (Life Technologies SAS), une levure quadruple auxotrophe (URA, TRP, HIS, LEU), a été utilisée. La levure a été
génétiquement modifiée pour exprimer un ou plusieurs antigène(s) de tumeur (AH1-A5, TRP1, TRP2 ou OVA1-TRP1-TRP2) avec un polypeptide d'ancrage, un polypeptide d'adressage, et un polypeptide de ciblage après transformation avec les plasmides décrits à l'Exemple 1 par la méthode Lithium Acétate.
Pour la sélection des levures recombinantes, un milieu sélectif sans les acides aminés URA
ou TRP a été utilisé. Les levures recombinantes ont d'abord été cultivées à 30 C jusqu'en phase stationnaire dans un milieu sélectif comprenant : 20g/L glucose, 6,7 g/L
du milieu yeast nitrogen base sans acides aminés , 1,85 g/L du milieu sélectif Yeast synthetic drop-out medium without Uracil and tryptophan . Le milieu Yeast synthetic drop-out medium without Uracil and tryptophan est composé de:
- 76 mg de chacun des acides aminés suivants : Alanine, Arginine, Asparagine, Aspartic acid, Cysteine ,Glutamic acid, Glutamine, Glycine, Histidine, myo-Inositol, Isoleucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Proline, Serine, Threonine, Tyrosine, Valine - 380 mg de Leucine - 18 mg d'Adénine - 8 mg d'acide p-Aminobenzoïque.
Les levures recombinantes ont ensuite été centrifugées pendant 5 minutes à
4000 rpm, lavées dans du PBS (Phosphate Buffer Saline), puis resuspendues dans 20g/L
galactose, 6,7 g/L du milieu yeast nitrogen base sans acides aminés et 1,85 g/L du milieu sélectif Yeast synthetic drop-out medium without Uracil and tryptophan . Les levures ont été
placées en culture à 30 C pendant 48h pour l'induction de l'expression des protéines recombinantes par le galactose.
Les levures recombinantes ont ensuite été centrifugées pendant 5 minutes à
4000 rpm, lavées dans du PBS (Phosphate Buffer Saline) et ont ensuite été traitées de la façon suivante:
a) Resuspension dans un mélange 50% éthanol 50% eau v/v pendant 25 minutes et encore lavage au PBS (Perméabilisation à l'éthanol) ;
b) Resuspension dans un mélange 50% isopropanol 50% eau v/v pendant 25 minutes et encore lavage au PBS (Perméabilisation à l'isopropanol) ;

wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 C) Resuspension dans une solution 2% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 10 minutes, lavage dans du PBS, puis resuspension dans un mélange 50%
éthanol 50% eau v/v pendant 25 minutes et encore lavage au PBS (Fixation au PFA puis perméabilisation à l'éthanol) ;
d) Resuspension dans une solution 2% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 10 minutes, lavage dans du PBS, puis resuspension dans un mélange 50%
isopropanol 50% eau v/v pendant 25 minutes et encore lavage au PBS
(Fixation au PFA puis perméabilisation à l'isopropanol) ; ou e) Resuspension dans un mélange 50% éthanol 50% eau v/v pendant 25 minutes et encore lavage au PBS, puis resuspension dans une solution 2% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 10 minutes et encore lavage au PBS
(Perméabilisation à l'éthanol puis fixation au PFA).
Les antigènes de tumeur qui ont été utilisés dans les constructions sont :
- AH1A5 (modification de GP70 423-431) : l'antigène AH-1 (SPSYVYHQF, SEQ ID
NO : 20) non muté est l'antigène immunodominant H-2Ld dérivé de gp70 423-431, qui provoque une réponse CD8+ contre la lignée murine de cancer colorectal CT26 (Enhanced Antigen-Specific Antitumor Immunity with Altered Peptide Ligands that Stabilize the MHC-Peptide-TCR Complex, Slansky et al, Immunity, Vol.
13, 529-538, October, 2000). Gp70 est silencieux dans la plupart des tissus normaux chez la souris. Malgré l'induction de CD8+, l'antigène natif AH-1 ne permet pas l'immunisation contre la tumeur CT26 à cause d'une faible affinité
de cet épitope pour le TCR. On utilise donc un peptide cryptique d'AH-1 (modification de GP70 423-431) qui permet d'augmenter son affinité pour le TCR et d'immuniser la souris par la voie CMHI. L'antigène de tumeur qui a été utilisé dans cet exemple est le peptide cryptique de séquence SPSYAYHQF (SEQ ID NO : 15) (AH1A5).
- TRP2 (180-188) : La Tyrosinase related protein 2 (TRP2) est une protéine impliquée dans la pigmentation des mélanocytes qui joue un rôle dans la progression du mélanome. L'antigène de tumeur qui a été utilisé dans cet exemple est le peptide cryptique de séquence SVYDFFVWL (SEQ ID NO : 17) (TRP2).
- TRP1 (455-463) : La Tyrosinase related protein 1 (TRP1), aussi connue comme glycoprotéine gp75 (Tyrp1/gp75), est une protéine impliquée dans la pigmentation des mélanocytes qui joue un rôle dans la progression du mélanome. L'antigène de tumeur qui a été utilisé dans cet exemple est le peptide cryptique de séquence TAPDNLGYM (SEQ ID NO : 16) (TRP1).

Un linker G4S a été placé entre le polypeptide d'ancrage et l'antigène de tumeur. Ce linker est une chaine d'acides aminés, composée de 4 glycines consécutives et d'une sérine. Un linker G4S a également été placé entre chacun des antigènes de la levure exprimant les antigènes OVA1-TRP1-TRP2. Un tag protéique, le c-myc, a également été ajouté
entre le .. polypeptide d'ancrage et l'antigène de tumeur pour permettre la détection des complexes à la surface des levures. Un polypeptide de ciblage ScFv anti-DEC205 a également été
ajouté, ainsi qu'un peptide signal de sécrétion supplémentaire en N-terminal polypeptide de ciblage ScFv anti-DEC205 en utilisant le polypeptide d'adressage codé par la séquence nucléique prepro alpha factor leader peptide issue de la phéromone de levure .. Mf(alpha)1p (SEQ ID N 12).
Quatre types de levures génétiquement modifiées ont ainsi été obtenus:
1) Une levure qui exprime à sa paroi la protéine de fusion [scFv DEC205]-[G4S]-[AH1A5]-[C-MYCHG4SHSED1P] (Figure 12) ;
2) Une levure qui exprime à sa paroi la protéine de fusion [scFv DEC205]-[G4S]-[TRP1]-[C-MYCHG4SHSED1P] (Figure 13) ;
3) Une levure qui exprime à sa paroi la protéine de fusion [scFv DEC205]-[G4S]-[TRP2]-[C-MYCHG4SHSED1P] (Figure 14) ; et 4) Une levure qui exprime à sa paroi la protéine de fusion [scFv DEC205]-[G4S]-[TRP2]-[G4SHOVA1MG4SHTRP1]-[C-MYC]-[G4SMSED1P] (Figure 15).
Exemple 8 : Contrôle de l'expression des protéines de fusion à la surface des levures Les quatre types de levures génétiquement modifiées obtenues à l'Exemple 7, exprimant les antigènes de tumeur AH1A5, TRP1, TRP2 ou OVA1-TRP1-TRP2 ont été testées en .. cytométrie pour confirmer qu'elles expriment bien les antigènes de tumeur à
leur paroi.
Après l'induction des levures dans le galactose, les levures à une concentration de 1.107 cellules par mL ont été suspendues dans une solution de PFA à 2% pendant 10 minutes.
Les levures ont ensuite été lavées dans du PBS contenant 1% de BSA. Après lavage, elles ont été mises en culture pendant 1h à température ambiante avec un anticorps primaire anti-c-myc au ratio de 1:100 (Anticorps primaire murin IgG2a, MA1-16637, ThermoFisher). Après 3 lavages au PBS contenant 1% de BSA, les levures ont été

incubées pendant 1h à température ambiante avec un anticorps secondaire anti-IgG2a au ratio de 1:50 (Anticorps secondaire murin IgG2a, 31863, ThermoFisher) et ont été
passées en cytométrie de flux spectrale dans le canal préférentiel PE.

wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 L'anticorps anti-c-myc permet de détecter par cytométrie de flux spectrale les levures qui expriment à la paroi chacune des protéines de fusion. Dans les conditions expérimentales testées, l'anticorps de marquage de la protéine de fusion ne pouvait pas pénétrer à
l'intérieur des levures, ce qui a permis de mettre en évidence les antigènes orientés vers 5 .. le milieu extérieur de la levure et non vers le périplasme de la levure.
Les résultats pour les quatre types de levures génétiquement modifiées sont présentés à
la Figure 16 :
- Figure 16A: 34% des levures expriment la protéine de fusion [scFv DEC205]-[G4SHAH1A5MC-MYCHG4SHSED1PJ à leur paroi ;
10 - Figure 16B: 15% des levures expriment la protéine de fusion [scFv DEC205]-[G4SHTRP2MG4SHOVA1MG4SHTRP1]-[C-MYC]-[G4SHSED1P] à leur paroi ;
- Figure 16C: 9% des levures expriment la protéine de fusion [scFv DEC205]-[G4S]-[TRP2]-[C-MYC]-[G4SHSED1P] à leur paroi ;
- Figure 16D: 13 A3 des levures expriment la protéine de fusion [scFv DEC205]-15 [G4S]-[TRP1HC-MYCHG4SHSED1P] à leur paroi.
Les figures montrent l'expression des antigènes de tumeur AH1A5, TRP1, TRP2 et TRP1-TRP2 à la paroi des levures obtenues à l'Exemple 7.
Conclusion :
20 La cytométrie de flux spectrale a démontré d'une part l'ancrage effectif des protéines de fusion comportant un antigène de tumeur à la paroi des levures et d'autre part l'ancrage effectif d'une protéine de fusion comportant plusieurs antigènes de tumeur à
la paroi des levures.
25 Exemple 9 : Test de caractérisation d'une levure perméabilisée Le test de caractérisation d'une levure perméabilisée utilise une enzyme naturellement présente dans le cytosol de la levure, l'alkaline phosphatase. Son substrat, le p-nitrophenylphosphate (pNPP), prend une couleur jaune lisible par l'absorbance à 405 nm après hydrolyse, proportionnellement à l'activité enzymatique (A rapid method for 30 determination of acid phosphatase activity of whole yeast cells, Galabova et al, Aine 2008, Letters in Applied Microbiology 16(3):161 - 163). Lorsque la levure a été
perméabilisée, le substrat pNPP entre dans la levure et est hydrolysé par l'alkaline phosphatase, ce qui génère un signal d'absorbance à 405 nm. Une levure qui n'a pas été
perméabilisée n'est pas perméable au pNPP.

wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 Les levures sauvages S. cerevistae ont été cultivées dans un milieu complet pour levure jusqu'à saturation à 30 C sous agitation 250 RPM en Erlenmeyer. Les levures ont été
récoltées par centrifugation à 3000g pendant 5 minutes puis lavées une fois au PBS, et resuspendues dans du PBS à densité optique DO=1 à 600 nm. Différents échantillons de .. levures ont alors subi les traitements suivants :
- Vivantes : aucun traitement ;
- PFA: fixation dans une solution de PFA 2% pendant 10 minutes (PFA) ;
- PFA + éthanol : fixation dans une solution de PFA 2% pendant 10 minutes, lavage au PBS puis perméabilisation dans une solution d'éthanol 50% v/v pendant 25 minutes ;
- Ethanol + PFA: perméabilisation dans une solution d'éthanol 50% v/v pendant minutes , lavage au PBS puis fixation dans une solution de PFA 2% pendant 10 minutes ;
- PFA + isopropanol : fixation dans une solution de PFA 2% pendant 10 minutes, lavage au PBS puis perméabilisation dans une solution d'isopropanol 50% v/v pendant 25 minutes ;
- Isopropanol : perméabilisation dans une solution d'isopropanol 50% v/v pendant minutes ;
- Ethanol: perméabilisées dans une solution d'ethanol 50% v/v pendant 25 20 minutes ; ou - UV: irradiation deux fois à 999 3/cm2 avec homogénéisation entre les deux irradiations dans un HL-2000 HybriLinker permettant de faire de l'UV cross-linking.
100 pL de solution des différents échantillons de levures traités comme décrit ci-dessus ont été prélevés et mélangés avec 150 uL de solution de p-nitrophenylphosphate (P7998 25 SIGMA - Alkaline Phosphatase Yellow (pNPP) Liquid Substrate System for ELISA). Le mélange a été incubé 30 minutes à température ambiante. La réaction a été
stoppée au bout de 30 minutes avec 35 pL de NaOH 3M. Les levures ont été centrifugées 5 minutes à
4000 RPM, puis 100 pL de surnageant a été prélevé pour lecture de son absorbance à
405 nm. Le blanc utilisé était le pNPP seul.
Les résultats sont présentés aux figures 17 et 18.
Conclusion : Le test a confirmé que le traitement avec l'isopropanol ou l'éthanol a permis de perméabiliser les levures la, avec et sans fixation au PFA. Le test a également montré
qu'une irradiation aux UV ou une fixation au PFA n'a pas permis de perméabiliser les levures.

wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 Exemple 10 : mesure de l'activation des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques avec une levure présentant à sa paroi l'antigène OVA1 et ayant subi différents traitements de perméabilisation.
La mesure de l'activation des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques a été réalisée à
l'aide d'un test colorimétrique utilisant le beta-galactosidase et un de ses substrats, le CPRG
(Chlorophenol red-beta-galactopyranoside) comme décrit à l'Exemple 4.
Matériel: des cellules dendritiques, des lymphocytes T CD8+ et une levure génétiquement modifiée non-perméabilisées qui expriment à sa paroi un antigène.
Les cellules dendritiques utilisées étaient des cellules dendritiques murines issues de la lignée MutuDC (obtenus de l'Université de Lausanne). Cette lignée provient de cellules dendritiques CD8a spléniques immortalisés qui conservent la capacité de cross-présenter un antigène et d'activer les lymphocytes tueurs (LT). Les cellules de la lignée MutuDC ont été cultivées dans un milieu RPMI 1640 supplémenté par 10% FCS, HEPES, 50 pM 2-mercaptoethanol, 50 U/ml pénicilline, et 50 pg/ml streptomycine, à 37 C avec 5% de CO2.
Les lymphocytes T CD8+ utilisés provenaient de l'hybridome B3Z. L'hybridome B3Z, une lignée spécifique pour le peptide OVA 257-264 (SIINFEKL, SEQ ID NO : 21), a été offerte par l'Institut Curie (Paris V). Ces cellules ont la particularité de produire de la beta galactosidase sous contrôle d'un promoteur IL2 (Inter-leukine 2). Les cellules B3Z ont été
cultivées dans un milieu RPMI 1640 supplémenté par 10% FCS, du Glutamax, HEPES, 50 pM 2-mercaptoethanol, 50 U/ml pénicilline, et 50 pg/ml streptomycine, à 37 C
avec 5%
de CO2. Les cellules dendritiques ont été réparties à raison de 100 000 cellules par puit dans des plaques 96 puits à fond rond.
La levure génétiquement modifiée non-perméabilisée exprimaient l'antigène OVA1 à sa paroi fusionnée au scFv DEC205 (scFv DEC205-0VA1-SED) et a été préparée selon l'exemple 2 (Figure 4). Cette levure a subi les traitements suivants :
- Vivantes : aucun traitement ;
- PFA: fixation dans une solution de PFA 2% pendant 10 minutes (PFA) ;
- PFA + éthanol : fixation dans une solution de PFA 2% pendant 10 minutes, lavage au PBS puis perméabilisation dans une solution d'éthanol 50% v/v pendant 25 minutes ;
- Ethanol + PFA: perméabilisation dans une solution d'éthanol 50% v/v pendant minutes , lavage au PBS puis fixation dans une solution de PFA 2% pendant 10 minutes ;

wo 2018/185431 PCT/FR2018/050837 - PFA + isopropanol : fixation dans une solution de PFA 2% pendant 10 minutes, lavage au PBS puis perméabilisation dans une solution d'isopropanol 50% v/v pendant 25 minutes ;
- Isopropanol : perméabilisation dans une solution d'isopropanol 50% v/v pendant 25 minutes ;
- Ethanol: perméabilisées dans une solution d'ethanol 50% v/v pendant 25 minutes ; ou - UV: irradiation deux fois à 999 J/cm2 avec homogénéisation entre les deux irradiations dans un HL-2000 HybriLinker permettant de faire de l'UV cross-linking.
puis mises en culture avec les cellules de la lignée MutuDC pendant 5h au ratio 30:1 (MOI
30, pour Multiplicity of infection), Ensuite, les lymphocytes de la lignée B3Z ont été ajoutés à raison de 100 000 par puit pendant 18h à 37 C et 5% de CO2. Les plaques ont été ensuite lavées et l'activité de la bêta-galactosidase produite par les lymphocytes T CD8+ a été mesurée après addition de 120 pL de tampon de lyse (qui contient du PBS, 9 mM MgCl2, 0.125% NP40 et 0.15 mM
chlorophenol red-beta-galactopyranoside). Après le changement de couleur vers le rouge, l'absorbance dans le rouge à 575 nm a été lue en utilisant un lecteur de plaque ClarioStar.
Les résultats sont présentés à la Figure 19.
Conclusion: Ce test de cross-présentation a montré que les levures perméabilisées (inactivées ou pas) ont été capables d'activer significativement les lymphocytes tueurs.
L'activation obtenue avec les levures perméabilisées a été bien supérieure à
l'activation obtenue avec les levures non-perméabilisée (PFA ou UV). Il convient notamment de noter que les levures traitées aux UV n'ont pas été capables d'activer les lymphocytes tueurs, comme pour les levures n'ayant subi aucun traitement (Vivantes).

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation d'une levure immunothérapeutique, ledit procédé
comprenant les étapes de :
a) obtenir une levure génétiquement modifiée qui exprime à sa paroi un ou plusieurs antigène(s) de tumeur et éventuellement un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques ;
b) perméabiliser la levure génétiquement modifiée afin d'obtenir une levure immunothérapeutique, éventuellement inactiver la levure avant ou après l'étape de perméabilisation.

2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape a) est : obtenir une levure génétiquement modifiée qui exprime à sa paroi une ou plusieurs protéines de fusion de formule (Ia) :
[protéine ou polypeptide de ciblage des cellules dendritiques]n-[antigène de tumeur]x-[linker peptidique]m-[polypeptide ou protéine d'ancrage à la paroi de la levure génétiquement modifiée] (Ia) ;
n est égal à 0 ou 1, m est égal à 0 ou 1, et x est un entier allant de 1 à
300, de préférence allant de 1 à 50.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'étape a) comprend les étapes de :
a1) introduire dans une levure un ou plusieurs vecteur(s) comprenant chacun une séquence nucléique de formule (lIa) ou (IIb) :
[séquence nucléique codant un polypeptide d'adressage à la paroi de la levure génétiquement modifiée]-[séquence nucléique codant un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques]n-[séquence nucléique codant un antigène de tumeur]x-[séquence nucléique codant un linker peptidique]m-[séquence nucléique codant un polypeptide ou une protéine d'ancrage à la paroi de la levure génétiquement modifiée] (IIa), n est égal à 0 ou 1, m est égal à
0 ou 1, et x est un entier allant de 1 à 300, de préférence allant de 1 à 50 ;
[séquence nucléique codant un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques]n-[séquence nucléique codant un antigène de tumeur]x-[séquence nucléique codant un linker peptidique]m-[séquence nucléique codant un polypeptide ou une protéine d'ancrage à la paroi de la levure génétiquement modifiée]-[séquence nucléique codant un polypeptide d'adressage à la paroi de la levure génétiquement modifiée] (llb), n est égal à 0 ou 1, m est égal à 0 ou 1, et x est un entier allant de 1 à 300, de préférence allant de 1 à 50 ;
afin d'obtenir une levure génétiquement modifiée capable d'exprimer à sa paroi une ou plusieurs protéine(s) de fusion de formule (Ia) :
[protéine ou polypeptide de ciblage des cellules dendritiques]dantigène de tumeurlx-[linker peptidique]m-[polypeptide ou protéine d'ancrage à la paroi de la levure génétiquement modifiée] (Ia), n est égal à 0 ou 1, m est égal à 0 ou 1, et x est un entier allant de 1 à 300, de préférence allant de 1 à 50 ; et a2) cultiver la levure génétiquement modifiée dans des conditions adaptées pour l'expression de la ou des protéine(s) de fusion à la paroi de la levure génétiquement modifiée.

4. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la levure est choisie parmi le genre Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Ogataea. ou Candida, de préférence le genre Saccharomyces, de préférence la levure est Saccharomyces cerevisiae.

5. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, dans lequel le polypeptide ou la protéine d'ancrage est un polypeptide ou une protéine de levure exprimé au niveau de la paroi des levures, de préférence choisi parmi Aga2p ou Sedlp.

6. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la levure génétiquement modifiée est perméabilisée avec un mélange eau/éthanol.

7. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le polypeptide ou la protéine de ciblage des cellules dendritiques est choisi parmi un anticorps capable de se lier spécifiquement à la protéine DEC205, un fragment d'anticorps capable de se lier spécifiquement à la protéine DEC205, l'activateur du plasminogène (PLA) de la bactérie Yersinia pestis ou une séquence dérivée de l'activateur du plasminogène (PLA) de la bactérie Yersinia pestis.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le ou les antigène(s) de tumeur sont/est choisi(s) parmi Melan-A, Tyrosinase, gp100, MAGEA1, MAGEA10, MAGEA11, MAGEA12, MAGEA2, MAGEA2B, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA8, MAGEA9, MAGEB1; MAGEB10, MAGEB16, MAGEB18, MAGEB2, MAGEB3, MAGEB4, MAGEB5, MAGEB6, MAGEB6B, New York Esophageal 1 antigène (NY-ESO-1), MAGEC1, MAGEC2, L-antigène (LAGE), TRP-1, TRP-2, P53, KRAS, CEA, WT1, MUC1, SART3, SURVIVIN 2B, RNF43/TOMM34, TGFBRII, HER2/neu, BRAF, PI3K, APC, BAX, beta2-microglobuline, télomérase ou NRAS.

9. Levure immunothérapeutique susceptible d'être obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.

10. Levure immunothérapeutique génétiquement modifiée et perméabilisée qui exprime à
sa paroi :
(iii) un ou plusieurs antigène(s) de tumeur, de préférence choisi(s) parmi Melan-A, Tyrosinase, gp100, MAGEA1, MAGEA10, MAGEA11, MAGEA12, MAGEA2, MAGEA2B, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA8, MAGEA9, MAGEB1;
MAGEB10, MAGEB16, MAGEB18, MAGEB2, MAGEB3, MAGEB4, MAGEB5, MAGEB6, MAGEB6B, New York Esophageal 1 antigène (NY-ESO-1), MAGEC1, MAGEC2, L-antigène (LAGE), TRP-1, TRP-2, P53, KRAS, CEA, WT1, MUC1, SART3, SURVIVIN 2B, RNF43/T0MM34, TGFBRII, HER2/neu, BRAF, PI3K, APC, BAX, beta2-microglobuline, télomérase ou NRAS ; et (iv) éventuellement un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques.

11. Levure selon la revendication 10, qui exprime à sa paroi une protéine de fusion de formule (Ia) :
[protéine ou polypeptide de ciblage des cellules dendritiques],dantigène de tumeur],-[linker peptidique]re[polypeptide ou protéine d'ancrage à la paroi de la levure génétiquement modifiée] (Ia) ;
n est égal à 0 ou 1, m est égal à 0 ou 1, et x est un entier allant de 1 à
300, de préférence allant de 1 à 50.

12. Levure selon l'une des revendications 10 ou 11, dans laquelle le polypeptide ou la protéine de ciblage des cellules dendritiques est choisi parmi un anticorps capable de se lier spécifiquement à la protéine DEC205, un fragment d'anticorps capable de se lier spécifiquement à la protéine DEC205, l'activateur du plasminogène (PLA) de la bactérie Yersinia pestis, ou une séquence dérivée de l'activateur du plasminogène (PLA) de la bactérie Yersinia pestis.

13. Composition immunothérapeutique comprenant une levure selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

14. Composition immunothérapeutique selon la revendication 13, comprenant en outre un agent thérapeutique.

15. Levure selon l'une quelconque des revendications 9 à 12 ou composition selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14 pour son utilisation comme médicament.

16. Levure selon l'une quelconque des revendications 9 à 12 ou composition selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14 pour son utilisation dans le traitement ou la prévention du cancer.

17. Levure selon l'une quelconque des revendications 9 à 12 ou composition selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14 pour son utilisation dans le traitement ou la prévention du cancer selon la revendication 16, caractérisé en ce que le cancer est un cancer solide, de préférence le mélanome ou le cancer du côlon.