CA2656545A1

CA2656545A1 - Process for extracting lipids from marine sources producing an extract rich in omega-3 phospholipids

Info

Publication number: CA2656545A1
Application number: CA 2656545
Authority: CA
Inventors: Adrien Beaudoin
Original assignee: BIOFLASH INC.
Priority date: 2009-02-26
Filing date: 2009-02-26
Publication date: 2010-08-26

Abstract

Nous avons développé un système d'extraction des lipides à partir des oeufs de hareng. Il s'agit d'un procédé en une seule étape qui génère deux phases : une phase supérieure enrichie en solvants , appelée phase supérieure et une phase aqueuse pauvre en matières liposolubles. La phase supérieure est constituée d'un système ternaire qui extrait à la fois les lipides neutres et les lipides polaires. Ce système ternaire est généré par la combinaison d'un solvant apolaire et un solvant polaire dans des proportions qui ont été
préalablement testées et optimisées. Il s'agit d'un mélange à volume égal d'acétate d'éthyle et d'acétone que l'on sature avec une solution d'acide citrique à 5 % dont le pH a été ajusté à 4,5 avec de l'hydroxide de sodium. Nous ajoutons au solvant de l'orizanol à 0,1%. Le solvant apolaire de la phase supérieure étant peu miscible avec l'eau fait en sorte que cette phase contient très peu d'eau. Nos expériences ont montré que la phase supérieure se distille relativement bien sous vide partiel. Ce qui permet d'obtenir un extrait semi-visqueux . Le rendement que nous avons obtenu est légèrement inférieur à celui obtenu avec la méthode classique de Bligh et Dyer avec le chloroforme: méthanol.
Nous avons noté que le matériel choisi garde une certaine consistance lorsque nous travaillons à
pH acide (5 et moins) ce qui facilite la filtration. Nous avons aussi qu'un pH
acide du mélange ternaire cause un noircissement de l'huile (oxydation). A partir de pH 4,5 et à pH plus élevé ce phénomène est beaucoup moins prononcé. Nous avons aussi introduit un agent chélateur dans la phase aqueuse, ce qui devrait réduire la présence des métaux lourds dans les lipides de l'extrait.
Comme antioxydant nous ajoutons un extrait d'huile de riz. On pourrait utiliser d'autres antioxydants tels que des caroténoides (astaxanthine, leucopène , vitamine E
et autres antioxydants) Comme agent chélateur on pourrait faire appel à une résine échangeuse de cations ou encore à
des extraits de protéines de petit lait.
Une personne familière avec l'art pourrait appliquer cette méthode à toute biomasse terrestre ou marine. We have developed a lipid extraction system from the eggs of herring. This is a one-step process that generates two phases: a higher phase enriched in solvents, called the upper phase and an aqueous phase poor in Contents soluble. The upper phase consists of a ternary system that extracts both neutral lipids and polar lipids. This ternary system is generated by the combination of a apolar solvent and a polar solvent in proportions that have been previously tested and optimized. It is a mixture of equal volume of ethyl acetate and of acetone that is saturated with a 5% citric acid solution whose pH was adjusted to 4.5 with the hydroxide of sodium. We add to the solvent 0.1% orizanol. The apolar solvent of the sentence superior being poorly miscible with water makes this phase contains very little water. our experiments have shown that the upper phase is distilled relatively well under partial vacuum. This which makes it possible to obtain a semi-viscous extract. The yield we have got is slightly lower than that obtained with the classic method of Bligh and Dyer with the chloroform: methanol.
We noted that the chosen material has a certain consistency when we work at acid pH (5 and below) which facilitates filtration. We also have a pH
acid of the mixture ternary causes blackening of the oil (oxidation). From pH 4,5 and at higher pH this phenomenon is much less pronounced. We have also introduced an agent chelator in the aqueous phase, which should reduce the presence of heavy metals in lipids of the extract.
As an antioxidant we add an extract of rice oil. We could use others antioxidants such as carotenoids (astaxanthin, leucopene, vitamin E
and others antioxidants) As a chelating agent, a resin exchange agent could be used.
cations or at whey protein extracts.
A person familiar with art could apply this method to any terrestrial biomass or Marine.

Description

MÉTHODES EXPÉRIMENTALES

Sauf indication contraire le matériel provenant du poisson est congelé Le matériel est broyé au hache-viande avec ouvertures de 1/8 pouce. Le matériel haché est pesé et plongé dans les solvants à température de la pièce. Après une période minimale de trente minutes d'agitation lorsque l'échantillon peut sédimenter, on le laisse sédimenter durant une quinzaine de minutes .
Le solvant est décanté et la suspension est soit filtrée ou centrifugée durant 3 min à 1000g . Le volume d'extrait est mesuré. Pour déterminer la teneur en lipides 3 échantillons de 10ml sont prélevés et évaporés au four à 90 *C . Nous faisons la moyenne.
Pour la séparation des diverses classes de lipides polaires. Des échantillons sont déposés sur des plaques de silica gel G et séchés. La migration des lipides est réalisée dans une chambre à
chromatographie par un mélange de solvants Chlor : Methanol : eau :Acide acétique dans un rapport de 65 :25 : 3 : 4 Lorsque la migration est complétée les spots de lipides sont révélés à l'iode après avoir séché la plaque au préalable RÉSULTATS
20 nov 2008 Test de partition de lipides dans un système ternaire.
-l1er essai Pour extraire les lipides nous avons opté pour un système ternaire ethyl acetate : acetone saline 8 :2 :1 De l'huile végétale est ajoutée 0,2 ml Après saturation on voit que toute la coloration des lipides se trouve dans la phase supérieure.
10,1 ml et la phase aqueuse 0,9 ml 2ième essai Pour un mélange 7ml acetate éthyle ; 3 ml acétone avec 2 ml de saline + 0,2 ml d'huile végétale EXPERIMENTAL METHODS

Unless otherwise specified, material from fish is frozen.
material is ground to meat grinder with 1/8 inch openings. The chopped material is weighed and immersed in the solvents at room temperature. After a minimum period of thirty minutes of agitation when the sample can sediment, it is allowed to sediment during a fifteen minutes.
The solvent is decanted and the suspension is either filtered or centrifuged during 3 min to 1000g. The extract volume is measured. To determine the lipid content 3 10ml samples are removed and evaporated in the oven at 90 ° C. We are averaging.
For the separation of the various classes of polar lipids. Some samples are deposited on plates of silica gel G and dried. The migration of lipids is carried out in a room to chromatography with a mixture of solvents Chlor: Methanol: water: Acetic acid in a ratio of 65: 25: 3: 4 When the migration is completed the lipid spots are revealed with iodine after drying plate beforehand RESULTS
Nov 20, 2008 Testing lipid partitioning in a ternary system.
- 1st test To extract lipids we opted for a ternary system ethyl acetate: acetone saline 8: 2: 1 Vegetable oil is added 0.2 ml After saturation we see that all the lipid staining is in the upper phase.
10.1 ml and the aqueous phase 0.9 ml 2nd test For a mixture 7ml ethyl acetate; 3 ml acetone with 2 ml of saline + 0.2 ml vegetable oil

2,2 ml phase aqueuse 9,8 ml de phase supérieure Tous les lipides vont dans la phase supérieure. 2.2 ml aqueous phase 9.8 ml of higher phase All lipids go into the higher phase.

3`ème essai Pour un mélange 6 acetate éthyle ; 4 ml acétone avec 2 ml de saline + 0,2 ml d'huile végétale 2,4 phase aqueuse 9,6 ml phase supérieure une phase intermédiaire apparaît (solubilité des lipides neutres réduite) Extraction de lipides de poissons avec la combinaison de solvants Date espèces ethyl acetate:acétone recu ération Chlor meth Matière 28-nov Maquereau 100 et O 17.5 18,2 80 et 20 19 70 et 30 19,4 03-déc flétan tête 64 et 36 16% 14 3 pour 1 04-déc oeufs hareng 78 et 22 0,4 2,3 2 pour 1 O et 100 1,44 8 dec flétan 18,1 dec oeufs de hareng 50 et 50 4 2 pour 1 O et 100 2,8 2 pour 1 12 dec maquereau filets 50 et 50 16,75 16,1 2 pour 1 14 dec maquereau 50 et 50 froid 16,9 12,5? 2 pour 1 50 et 50 chaud 18,9 2 pour 1 16 dec maquereau 50 et 50 + citrate 12,9 13,2 2 pour 1 50 et 50 pH 0,8 12,8 2 pour 1 21 janv oeufs de hareng 50 et 50 +HCI 3,9 3,4 3 pour l 50 et 50 -HCI 3,2 10 fev oeufs de hareng 50 et 50 + HCI -0 3,3 -16% 3,6 3 pour 1 50 et 50 + HCI+O 3,8'-16%

11 fev oeufs de hareng 50 et 50 pH 2 5,2 3 pour 1 50 et 50 pH 3 5,1 3 pour 1 50 et 50 pH 4 3,9 3 pour 1 50 et 50 pH 5 3,8 3 pour l 50 et 50 pH 6 4,2 3 pour 1 50 et 50 pH 7 4 3 pour 1 50 et 50 pH 10 4,7 3 pour 1 50 et 50 eau 5,1 3 pour 1 19 fev oeufs de hareng 50 et 50 pH 4,5+0 3,57 3,8 3 pour 1 fev oeufs de hareng 50 et 50 citr pH4,5 3,27 3 pour 1 21 fev oeufs de hareng Extrait du 20 fev 6,5 3 r I

Description des conditions expérimentales et commentaires 28 nov. Comme le maquereau contient surtout des lipides neutres l'acétate d'éthyle seule est très efficace. L'augmentation avec acetone est attribuable à la présence de phospholipides non extraits par acétate d'éthyle 3rd test For an ethyl acetate mixture; 4 ml acetone with 2 ml of saline + 0.2 ml vegetable oil 2,4 aqueous phase 9.6 ml higher phase an intermediate phase appears (solubility of neutral lipids reduced) Extraction of fish lipids with the combination of solvents Date species ethyl acetate: acetone recovered Chlor meth Material 28-Nov Mackerel 100 and O 17.5 18.2 80 and 20 19 70 and 30 19.4 03-Dec halibut head 64 and 36 16% 14 3 for 1 04-Dec Herring Eggs 78 and 22 0.4 2,3 2 for 1 O and 100 1.44 8th of halibut 18.1 dec 50 herring eggs and 50 4 2 for 1 O and 100 2.8 2 for 1 12 dec mackerel nets 50 and 50 16.75 16.1 2 for 1 14 mackerel 50 and 50 cold 16.9 12.5? 2 for 1 50 and 50 hot 18.9 2 for 1 16 mackerel 50 and 50 + citrate 12.9 13.2 2 for 1 50 and 50 pH 0.8 12.8 2 for 1 Jan 21 herring eggs 50 and 50 + HCI 3.9 3.4 3 for the 50 and 50 -HCI 3,2 10 fev 50 herring eggs and 50 + HCI -0 3,3 -16% 3,6 3 for 1 50 and 50 + HCI + O 3,8'-16%

11 few herring eggs 50 and 50 pH 2 5,2 3 for 1 50 and 50 pH 3 5,1 3 for 1 50 and 50 pH 4 3.9 3 for 1 50 and 50 pH 5 3.8 3 for the 50 and 50 pH 6 4.2 3 for 1 50 and 50 pH 7 4 3 for 1 50 and 50 pH 4.7 3 for 1 50 and 50 water 5.1 3 for 1 19 fev herring eggs 50 and 50 pH 4.5 + 0 3.57 3.8 3 for 1 fev herring eggs 50 and 50 citr pH4,5 3,27 3 for 1 21 fev herring eggs Excerpt from 20 feb 6,5 3 r I

Description of the experimental conditions and comments Nov. 28 As mackerel contains mostly neutral lipids acetate of ethyl alone is very effective. The increase with acetone is attributable to the presence of phospholipids not ethyl acetate extracts

4 dec L'extraction des oeufs de hareng est très faible parce que l'acétate d'éthyle ne solubilise pas bien les lipides polaires dec Le rendement de 4 % est très satisfaisant, par contre l'acétone seule semble moins efficace 2,8%

14 dec L'extraction des lipides de poisson peut se faire à chaud ou a froid.
Les valeurs sont supérieures à chaud i.e. température de la pièce 21 janv. Influence du pH de la solution aqueuse sur le rendement. A pH acide on a des valeurs plus élevées 3,9 vs 3,2%. A pH neutre les oeufs prennent un aspect laiteux. de plus on note une coloration brune ambrée qui s'accentuem lorsque les échantillons sont séchés 10 fev . Si l'on met dans le mileieu d'extraction de l'orizanol (O) un antioxydant la coloration diminue légèrement,. Le rendement apparemment plus élevé doit être corrigé
pour tenir compte du lipide ajouté. Malgré cela il reste plus élevé.De plus comme l'indique le chiffre 16% nous avons ré-extrait les lipides obtenus par notre procédé et nous selon la méthode de Bligh et Dyer les résultats obtenus sont 16% plus bas ce qui indique que notre méthode extrait des ingrédient s qui ne seraient pas lipidiques. Il faut donc réduire le rendement de 16%.

11 fev L'influence du pH de la solution aqueuse sur le rendement et la couleur a été mesuré.
Le rendement semble plus élevé à pH acide et dans l'eau A pH supérieur à 6 le matériel devient laiteux alors qu'a pH acide les matériel est floconneux et se sépare bien de la solution. Encore une fois la coloration apparaît à pH
3,0 ou moins 19 fev Ici on a changé le ratio solvant matière première 2 :1 pour 3 :1 .
L'extraction fonctionne aussi bien.

fev Cette expérience consistait à vérifier si l'on pouvait charger davantage le solvant. On prenait un extrait pour ré-extraire de la nouvelle matière première. On peut voir que le deuxième extrait donne une valeur double du premier extrait .

AUTRES RÉSULTATS

Viscosité Nous avons noté qu'après évaporation des solvants l'extrait prenait un aspect semi-visqueux. Pour corriger cet aspect nous avons ajouté à la préparation des esters éthylés concentrés en DHA et EPA fournis par Ocean Nutrition, Halifax Canada. Le mélange est devenu fluide à Température de la pièce .La quantité ajoutée était de 10% du poids Adsorption de l'extrait de lipides de hareng sur support solide.
L'extrait lipidique a été suspendu dans l'éthanol et de la poudre de cellulose microcristalline Avicel -100 a été mélangé dans un ratio de 2 :1 poids poudre : poids lipides.
L'éthanol a été
évaporé à 55 *C Le mélange résultant est homogène et de coloration jaune pâle sans odeur de rancissement après 10 jours. On pourrait ajouter plus de cellulose et au besoin un antioxydant.
Figure 1 Influence de l'acidité de la phase aqueuse sur la coloration de l'extrait.

Ce procédé d'extraction peut s'appliquer à tous les animaux marins et les micro-algues . 4 dec The extraction of herring eggs is very low because the acetate of ethyl does not solubilise not good polar lipids dec The yield of 4% is very satisfactory, but acetone alone seems less effective 2.8%

14 dec The extraction of fish lipids can be done hot or cold.
The values are higher than hot ie room temperature Jan. 21 Influence of the pH of the aqueous solution on yield. At acidic pH
we have values higher 3.9 vs 3.2%. At neutral pH the eggs take on a milky appearance. of the more we note a amber brown color which becomes more pronounced when samples are dried Feb. 10 If one puts in the middle of extraction of orizanol (O) a antioxidant staining decreases slightly ,. The apparently higher yield must be corrected to take into account lipid added. Even so, it remains higher.
figure 16% we have re-extracted the lipids obtained by our process and we according to the Bligh and Dyer method the results obtained are 16% lower, which indicates that our method extract of the ingredients which would not be lipidic. We must reduce the yield by 16%.

11 fev Influence of pH of aqueous solution on yield and color has been measured.
The yield seems higher at acidic pH and in water At a pH above 6 the material becomes milky whereas acidic pH
material is flaky and separates well from the solution. Once again the color appears at pH
3.0 or less 19 fev Here we changed the raw material solvent ratio 2: 1 to 3: 1.
Extraction works as well.

fev This experiment was to check if we could load more the solvent. We took an extract to re-extract from the new raw material. We can see that the second extract gives a double value of the first excerpt.

OTHER RESULTS

Viscosity We noted that after evaporation of the solvents the extract took a semi-viscous. To correct this aspect we have added to the preparation of ethyl esters DHA and EPA concentrates supplied by Ocean Nutrition, Halifax Canada. The mixture is became fluid at Room temperature .The amount added was 10% of the weight Adsorption of herring lipid extract on solid support.
The lipid extract was suspended in ethanol and cellulose powder microcrystalline Avicel -100 was mixed in a ratio of 2: 1 weight powder: fat weight.
Ethanol has been evaporated at 55 ° C The resulting mixture is homogeneous and pale yellow in color without smell rancidity after 10 days. We could add more cellulose and at need an antioxidant.
Figure 1 Influence of the acidity of the aqueous phase on the color of the extract.

This extraction process can be applied to all marine animals and micro-algae.

Claims

1.-A method for extracting lipids from marine animals using a combination of a polar organic solvent and a non-polar organic solvent to obtain the various classes of phospholipids.

2. The process of claim 1 wherein the lipids are extracted from fish

3. The process of claim 1 wherein the non-polar solvent used is a acylated organic acid

4. The process of claim 3 wherein the acylated solvent is ethyl acetate

5. The process of claim 1 wherein the polar solvent is a ketone

6. The process of claim 5 wherein the polar solvent is acetone

7. The process of claim 1 wherein a combination of the polar solvent and solvent not polarization is found in proportions varying from 10 to 90% of the total volume

8. The process of claim 7, wherein acetone and ethyl acetate are find in Variable proportions, ideally in a volume ratio, volume of 1 to 1

9. The process of claim 1, wherein the selected fabric is finely ground.
meat grinder preferably at a low temperature

The process of claim 1 wherein the comminuted material is extracted by the combination of solvents for a period of time sufficient to extract lipids 5 minutes and more preferably 30 minutes or more.

11. The process of claim 1 wherein the extract is separated from the material solid by sedimentation, centrifugation, filtration

12. The process of claim 1, wherein the solvents of the extract are separated by evaporation, distillation or by membrane filtration.

13. The process of claim 1 wherein a lipid composition is obtained.
of fish

The process of claim 13 wherein the composition is obtained from fish rich in lipids such as salmon herring, mackerel halibut, anchovies, cod, tuna

15. The process of claim 13 wherein pesticides and cholesterol are eliminated by short-path distillation at high temperature

16. The process of claim 1 wherein the heavy metals are chelated by addition of an agent chelator such as citric acid or EDTA (ethylenediamine tetraacetate)

17. The process of claim 1 or the citric acid chelating agent is added to a final concentration of 2.0% based on the water content of the material extracted.

18. The process of claim 1 wherein an antioxidant is added to a concentration sufficient to reduce lipid oxidation.

19 .- The process of claim 1 wherein the antioxidant agent is the orizanol

20. The process of claim 19 wherein the orizanol is added to a concentration 0.05% and more the weight / volume of the solvents used for extraction.

21. The process of claim 1 wherein the volume ratio of solvents per relative to the fresh weight is from 1 to 1 and more ideally 3 to 1

22. A composition obtained according to the process described in claim including phospholipids and neutral lipids of marine origin.

23. The use of this process for the extraction of lipids from sources other than fish (seaweed, microalgae, squid and crustacean octopus, mammals sailors.